ES2285211T3 - Sondas de acido nucleico y cebadores de amplio intervalo de regiones en los genes de la topoisomerasa, y metodos en los que se usan. - Google Patents
Sondas de acido nucleico y cebadores de amplio intervalo de regiones en los genes de la topoisomerasa, y metodos en los que se usan. Download PDFInfo
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Abstract
Un método de diagnóstico para detectar e identificar especies bacterianas que causan infecciones a partir de una muestra clínica, caracterizado porque a) amplifica un ADN aislado de dicha muestra clínica usando una mezcla de cebadores de ADN que comprende secuencias que hibridan con las secuencias que se originan a partir de regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas, especialmente gyrB/parE, de especies bacterianas que causan dichas infecciones, comprendiendo dichas secuencias las SEC ID Nº 76 y 77 o con secuencias complementarias de las mismas. b) pone en contacto el ADN amplificado con una combinación deseada de secuencias de sonda oligonucleotídica que hibrida en condiciones de hibridación normal con regiones hipervariables situadas cerca de dichas regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas, especialmente gyrB/parE, de especies bacterianas que causan dichas infecciones, siendo dichas secuencias específicas de especie bacteriana en dichas condiciones de hibridación, y c) detecta la formación de un posible complejo de hibridación.
Description
Sondas de ácido nucleico y cebadores de amplio
intervalo de regiones en los genes de la topoisomerasa, y métodos en
los que se usan.
La invención se refiere a sondas de ácido
nucleico y a cebadores de amplio intervalo que son útiles en la
identificación de especies bacterianas y el diagnóstico de
infecciones bacterianas. Especialmente, la invención se refiere a
sondas de ácido nucleico específicas que se originan a partir de
regiones hipervariables situadas cerca de las secuencias
conservadas de los genes de la topoisomerasa de bacterias que causan
infecciones. La invención también se refiere a cebadores de amplio
intervalo que se originan a partir de las regiones conservadas de
genes de la topoisomerasa. Además, la invención se refiere al uso de
estas sondas de ácido nucleico y cebadores de amplio intervalo en
el diagnóstico de infecciones bacterianas así como a métodos de
diagnóstico en los que se usan estas sondas de ácido nucleico y
cebadores de amplio intervalo.
Las infecciones del tracto respiratorio son la
causa más común de las visitas al médico. En Finlandia, se
diagnostican anualmente aproximadamente 13 casos de neumonía por
1000 habitantes. La sinusitis maxilar aguda y la otitis se
diagnostican incluso más frecuentemente. Por ejemplo, se estima que
la otitis representa anualmente aproximadamente 200.000 casos en
Finlandia (principalmente diagnosticado en niños). Las infecciones
del tracto respiratorio cargan el sistema de asistencia sanitaria y
causan gastos significativos a la sociedad. Los costes exactos
atribuibles a infecciones del tracto respiratorio son difíciles de
calcular, porque la mayoría de estos costes constan de los llamados
costes indirectos, tales como ausencia del trabajo (Rautakorpi et
al., Scandinavian Journal of Infectious Diseases.
33(12): 920-6, 2001, Infektiotaudit, ed.
Eskola, Houvinen ja Valtonen 1998). En el mundo, las infecciones
del tracto respiratorio son responsables de la muerte de millones
de personas, principalmente niños.
Además de los virus, las infecciones del tracto
respiratorio están causadas por una diversidad de especies
bacterianas: Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo
A) es un agente causante importante de la tonsilitis. El riesgo de
complicaciones graves, tales como abscesos peritonsilares, está
conectado a tonsilitis no tratada. Además, las secuencias de la
tonsilitis causada por S. pyogenes incluyen fiebre reumática
y glomerulonefritis que son enfermedades graves, incluso fatales.
Los agentes causantes más importantes de la neumonía en pacientes
externos son Streptococcus pneumoniae (neumococos),
Mycoplasma pneumoniae, y Chlamydia pneumoniae de las
que los neumococos es el patógeno más común y grave que causa
neumonía. Especies bacterianas que causan neumonía menos frecuentes
son Legionella pneumophila y Coxiella bumetti.
Mycobacterium tuberculosis, por otro lado, causa tuberculosis
pulmonar. Además, la neumonía causada por especies raras de
Mycobacterium y Nocardia se diagnostica en pacientes
inmunodeficientes. Además de neumococos, los agentes causantes de
la sinusitis maxilar y la inflamación del oído medio (otitis media)
incluyen Haemophilus influenzae y Moraxella
catarrhalis. Alloicoccus otitidis también causa
otitis, aunque menos frecuentemente.
Actualmente el diagnóstico de infecciones
bacterianas del tracto respiratorio se basa principalmente en el
ensayo de cultivo bacteriano. El ensayo de cultivo bacteriano es,
sin embargo, relativamente lento, y los métodos de diagnósticos
basados en cultivo habitualmente dan resultados solamente días, a
veces hasta semanas después del muestreo. Además, el cultivo de
bacterias no siempre es satisfactorio en condiciones de laboratorio.
Esto puede ser una consecuencia del hecho de que el método de
cultivo usado no sea aplicable para la especie bacteriana en
cuestión o el hecho de que el paciente haya recibido terapia
antimicrobiana antes de que se haya tomado la muestra. En el
diagnóstico de la faringitis, los métodos rápidos basados en la
detección de antígenos son buenos métodos suplementarios al ensayo
de cultivo bacteriano, pero funcionan solamente con una cantidad
limitada de patógenos (estreptococos del grupo A). En el diagnóstico
de algunas infecciones bacterianas (por ejemplo, C.
pneumoniae y M. pneumoniae) también pueden usarse
métodos serológicos, pero estos métodos dan resultados solamente
después de varias semanas desde la aparición de la infección. Por
tanto, no hay ayuda en el tratamiento agudo de un paciente.
Los métodos moleculares basados en la
amplificación e hibridación de ácidos nucleicos intentan resolver
los problemas mencionados anteriormente del ensayo de cultivo
bacteriano. Con la ayuda de estos métodos el patógeno se detecta e
identifica simultáneamente, produciendo un diagnóstico más rápido y
obviando la necesidad de ensayos de cultivo adicionales. Además,
los antibióticos no interfieren con los métodos moleculares a tal
grado como con los ensayos de cultivo.
Un método molecular usado en el diagnóstico de
bacterias es la llamada PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
de amplio intervalo que se basa en el uso de cebadores de amplio
intervalo. Actualmente los métodos de PCR de amplio intervalo más
comunes se basan en el uso de cebadores que reconocen secuencias de
ADN conservadas de genes cromosómicos bacterianos que codifican ARN
ribosómico (ADNr/ARNr 16S o ADNr/ARNr 23S). En la identificación de
bacterias basada en PCR de amplio intervalo la etapa de
identificación real se realiza clonando y secuenciando el producto
de PCR amplificado. (Véase por ejemplo, el documento
EP-B1 613 502, la Patente de Estados Unidos Nº
6.001.564 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie
0020055101).
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\global\parskip0.900000\baselineskip
El método de PCR bacteriana de amplio intervalo
se ha aplicado en algún grado al diagnóstico de bacterias clínicas,
aunque es más adecuado para la identificación de especies
bacterianas y fúngicas de aislados de cultivo, y para este
propósito también se han desarrollado ensayos comerciales, tales
como MicroSeq (Applied Biosystems). Sin embargo, estos ensayos no
se usan ampliamente, porque la secuenciación de productos de PCR
consume mucho tiempo y es muy laboriosa. Además, los propios ensayos
y el equipo necesario, tales como instrumentos de secuenciación,
son caros, y la realización de los ensayos requiere personal
especialmente cualificado. Además, en infecciones polimicrobianas
pueden necesitarse experimentos de clonación extensiva.
Otro método usado en algún grado en el
diagnóstico de bacterias es PCR múltiple, que se basa en el uso de
varios oligonucleótidos específicos combinados en una mezcla de
reacción. Hendolin et al. (Journal of Clinical Microbiology,
35: 11, 1997) usaron el método de PCR múltiple cuando identificaban
patógenos que causan otitis media.
Aunque el procedimiento de PCR múltiple es
relativamente sensible y rápido, tiene algunas desventajas. Se sabe
que fragmentos de ADN más cortos se amplifican de forma más eficaz
que fragmentos de ADN más largos. Por lo tanto, si la misma muestra
incluye dos especies bacterianas diferentes, el ADN bacteriano del
fragmento más corto probablemente se amplificará de forma más
eficaz, lo que afecta a la sensibilidad del procedimiento. Además,
con PCR múltiple es posible identificar solamente unas pocas
bacterias simultáneamente, porque es prácticamente imposible
diseñar por ejemplo más de una docena de pares de cebadores
específicos para que sean funcionales en las mismas condiciones de
PCR. Por lo tanto, no es aplicable la PCR múltiple, por ejemplo,
para el diagnóstico de, por ejemplo, infecciones del tracto
respiratorio en las que se conocen más de diez patógenos
clínicamente importantes.
Las bacterias de la llama flora normal también
pueden causar problemas en el diagnóstico microbiano basado en PCR
múltiple. Se ha mapeado completamente el genoma de solamente una
docena de especies bacterianas y la mayoría de estas especies
bacterianas son agentes causantes de enfermedad conocidos. Por
tanto, hay muy poca información acerca de las bacterias de la flora
normal y sus secuencias de ADN. Esto es por lo que es casi
imposible el diseño de cebadores de PCR específicos de especie y el
diagnóstico bacteriano basado solamente en amplificación por
PCR.
El uso de ARN ribosómico también incluye algunos
inconvenientes. Es difícil distinguir las especies bacterianas
relacionadas entre sí con la ayuda de molécula de ARNr, porque las
secuencias de estas moléculas no contienen suficientes regiones
variables cuando se comparan entre sí. E incluso si pueden
encontrarse diferencias entre diversas especies bacterianas, estos
sitios variables generalmente están divididos en la molécula de ARNr
completa (por ejemplo, la longitud del ARNr 16S es de
aproximadamente 1500 nucleótidos), que limita el uso de métodos
moleculares para el diagnóstico. En la práctica, las especies
bacterianas relacionadas por tanto pueden distinguirse entre sí
solamente secuenciando el gen codificante de ARNr completo. Sin
embargo, incluso este enfoque no es siempre suficiente para
distinguir especies bacterianas entre sí.
El propósito de la presente invención es
proporcionar herramientas y métodos, que sean útiles en el
diagnóstico bacteriano de enfermedades infecciosas, especialmente
las que causan infecciones del tracto respiratorio, pero que
carecen de los inconvenientes de diagnóstico bacteriano descritos
anteriormente. En particular, el propósito de la invención es
proporcionar nuevas herramientas y métodos, que sean útiles en el
diagnóstico bacteriano basado en métodos moleculares, siendo las
herramientas y métodos sensibles, eficaces, y específicos de
especie, y siendo capaces de identificar solamente la especie
bacteriana deseada. Un propósito adicional de la invención es
proporcionar métodos, por los que sea posible diagnosticar bacterias
infecciosas, especialmente las que causan infecciones del tracto
respiratorio, sustancialmente más rápido que lo previamente posible,
por lo que puede prescribirse una terapia antimicrobiana correcta y
eficaz al paciente en una fase más temprana de la infección de modo
que se acorte la duración de la infección y el riesgo de
complicaciones potencialmente dañinas, incluso amenazantes de la
vida.
La presente invención proporciona sondas
oligonucleotídicas específicas de especie bacteriana que se originan
a partir de regiones hipervariables situadas cerca de regiones
conservadas de genes que codifican las topoisomerasas,
especialmente los genes gyrB/parE, difiriendo estas
regiones hipervariables en las secuencias básicas
significativamente en diversas especies bacterianas. Con estas
sondas específicas de especie bacteriana puede detectarse e
identificarse simultáneamente el genoma de múltiples bacterias que
causan infección.
La invención también proporciona cebadores de
amplio intervalo que se originan a partir de las regiones
conservadas de genes que codifican las topoisomerasas,
especialmente los genes gyrB/parE, y que amplifican de forma
eficaz ADN de bacterias que causan infección incluso de muestras
clínicas, que incluyen grandes cantidades de ADN extraño (no
bacteriano).
Además, la presente invención proporciona
métodos simples, rápidos, sensibles y específicos que superan los
inconvenientes de la técnica anterior. Con estos métodos pueden
identificarse y diagnosticarse de forma fiable especies bacterianas
clínicamente importantes a partir de muestras clínicas o cultivos
bacterianos.
La presente invención se refiere a secuencias de
sondas oligonucleotídicas que hibridan en condiciones de
hibridación normales con secuencias de regiones hipervariables
situadas cerca de las secuencias conservadas de genes de la
topoisomerasa de bacterias que causan infecciones, especialmente
infecciones del tracto respiratorio, y comprenden una cualquiera de
las secuencias identificadas con la SEC ID Nº 1 a 69, y/o secuencias
inversas o complementarias de las mismas, o fragmentos funcionales
de las mismas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de especies bacterianas que causan
infecciones, especialmente infecciones del tracto respiratorio,
incluyen Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,
Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria
gonorrhoeae, Escherichia coli, Moraxella catarrhalis, Legionella
pneumophila, y Fusobacterium necrophorum, y ejemplos de
genes que codifican la topoisomerasa son el gen que codifica las
proteínas gyrB y parE.
Preferiblemente, la longitud de la secuencia de
sonda oligonucleotídica de la invención es de 15-30
nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 30 y mucho más
preferiblemente de 21 a 25 nucleótidos.
La presente invención también se refiere al uso
de las secuencias de sonda oligonucleotídica mencionadas
anteriormente en la detección, identificación, o clasificación de
especies bacterianas.
La presente invención se refiere adicionalmente
a una mezcla de sondas oligonucleotídicas, que comprende cualquier
combinación, y preferiblemente todas las secuencias identificadas
con la SEC ID Nº 1 a 69, y/o sus secuencias inversas o
complementarias, o fragmentos funcionales de las secuencias
mencionadas anteriormente. En una realización preferida, la mezcla
deseada de sondas se ha unido a un soporte sólido. Preferiblemente,
se ha unido una mezcla de sondas oligonucleotídicas que comprende
todas las secuencias identificadas con la SEC ID Nº 1 a 69, y/o sus
secuencias inversas o complementarias, en un soporte sólido.
La presente invención se refiere adicionalmente
a una nueva mezcla de cebadores de ADN que comprende secuencias que
hibridan con las secuencias de regiones conservadas de genes que
codifican topoisomerasas, especialmente con los genes que codifican
las proteínas gyrB y/o parE de bacterias que causan infecciones del
tracto respiratorio, y que comprenden secuencias identificadas con
la SEC ID Nº 76 ó 77 o sus fragmentos funcionales. La presente
invención también se refiere al uso de la mezcla de cebadores
mencionada anteriormente en la amplificación de genes de
topoisomerasa, especialmente genes que codifican las proteínas
gyrB y parE.
Además, la presente invención se refiere a un
método de diagnóstico para detectar e identificar bacterias que
causan infecciones del tracto respiratorio en una muestra clínica,
que comprende
a) amplificar ADN aislado de la muestra clínica
usando la mezcla de cebadores mencionada anteriormente,
b) poner en contacto el ADN amplificado con una
combinación deseada de las sondas mencionadas anteriormente en
condiciones de hibridación, y
c) detectar la formación de un posible complejo
de hibridación.
Una realización preferida del método de la
invención comprende amplificar el ADN aislado de la muestra clínica
por reacción en cadena de la polimerasa, y poner en contacto el ADN
amplificado con las sondas oligonucleotídicas específicas de
especie bacteriana unidas al soporte sólido.
En una realización preferida del método de la
invención, se usa un nucleótido marcado adecuadamente en la
amplificación del ADN aislado de la muestra clínica para generar una
cadena diana detectable.
En otra realización preferida del método de la
invención, el ADN diana amplificado y posiblemente marcado se pone
en contacto con un soporte sólido, preferiblemente con vidrio
tratado en el que se han unido todas las sondas oligonucleotídicas
específicas de especie de la invención que tienen secuencias
identificadas con la SEC ID Nº 1 a 69 y/o sus secuencias inversas o
complementarias.
En una realización preferida adicional del
método de la invención, el ADN diana amplificado y posiblemente
marcado se pone en contacto con un soporte sólido, preferiblemente
con vidrio tratado, en el que se han unido las sondas específicas
de la invención de una bacteria especificada o unas pocas bacterias
especificadas que causan infecciones del tracto respiratorio,
teniendo dichas sondas oligonucleotídicas específicas secuencias
correspondientes identificadas con la SEC ID Nº 1 a 7, 8 a 14, 15 a
16, 17 a 20, 21 a 25, 26 a 29, 30 a 33, 34 a 38, 39 a 42, 43 a 47,
48 a 50, 51 a 55, 56 a 60, 61 a 65, y 66 a 69 de la Tabla 4A y 4B
y/o sus secuencias inversas o complementarias de las mismas, o
cualquier combinación adecuada de las mismas.
La presente invención se refiere adicionalmente
a un kit de diagnóstico para su uso en el diagnóstico de bacterias
causantes de infección, especialmente las que causan infecciones del
tracto respiratorio, que comprende
a) una mezcla de cebador de ADN de la invención
como se ha definido anteriormente,
b) una mezcla de secuencias de sonda
oligonucleotídica específicas de especie bacteriana, opcionalmente
unidas a un soporte sólido de la invención como se ha definido
anteriormente,
c) secuencias de sondas de control positivo y
opcionalmente negativo, y opcionalmente
d) reactivos necesarios en las etapas de
amplificación, hibridación, purificación, lavado y/o detección.
La Figura 1 muestra ejemplos de regiones del gen
gyrB hipervariables que están limitadas por las secuencias
conservadas (Haemophilus influenzae y Moraxella
catarrhalis). Las regiones conservadas se han marcado con
recuadros en gris, y funcionan como sitios de hibridación de
cebadores gyrB/parE de amplio intervalo. La región
hipervariable, a partir de la que se han diseñado sondas específicas
de especie bacteriana, está entre estas secuencias conservadas
(sitios subrayados).
La Figura 2 muestra un ejemplo de los resultados
de una hibridación sobre la superficie de la microserie. El ADN
amplificado del gen gyrB aislado de un aislado de cultivo de
S. aureus se usó como cepa diana (producto de PCR marcado
con Cy-5-dCTP asimétrico). El
portaobjetos de vidrio contenía cuatro sondas oligonucleotídicas de
gyrB específicas (Tabla 4A: sondas oligonucleotídicas 21 a
24) que se unían todas específicamente a la cepa diana, S.
aureus. Además, los 5 oligonucleótidos de control positivo
dieron una señal detectable. La cepa diana, S. aureus no se
unió a otras sondas oligonucleotídicas en el portaobjetos de
vidrio.
La Figura 3 muestra los resultados de
amplificación por PCR del Ejemplo 7, en el que se compararon
cebadores conocidos descritos como específicos para
Streptococcus pneumoniae en el ensayo de especies bacterianas
del género Streptococcus y se compararon cebadores conocidos
descritos como específicos para Moraxella catarrhalis en el
ensayo de especies bacterianas del género Moraxella. Los
resultados muestran, sin embargo, que los cebadores en cuestión no
son específicos de especie, sino que también amplifican las
bacterias de la flora normal.
La presente invención se basa en estudios, que
intentaron encontrar alternativas más específicas para el uso de
ARN ribosómico en el diagnóstico de bacterias causantes de
infección. El estudio se centró en otros genes que son vitales para
las bacterias. Las proteínas topoisomerasas girasa B (gyrB o
topoisomerasa II) y parE (la otra subunidad de la
topoisomerasa IV) son moléculas importantes para las bacterias,
porque son necesarias en el empaquetamiento del ADN. Ciertos
fragmentos de la secuencia de ADN de estas moléculas han
permanecido casi inalterables, es decir, conservados, durante la
evolución. En este contexto las expresiones "una región
conservada" o "regiones conservadas" se refieren a una
región o regiones de genes o proteínas de topoisomerasa, cuya
secuencia nucleotídica o equivalentemente la secuencia de
aminoácidos ha permanecido casi inalterable entre diferentes
especies bacterias que causan infecciones del tracto respiratorio.
Habitualmente, estas regiones conservadas son las regiones más
importantes para el funcionamiento de la proteína. Las moléculas
gyrB/parE no están, sin embargo, tan conservadas como las
moléculas de ARN ribosómico. Como las moléculas en cuestión son
proteínas, los genes que codifican estas proteínas incluyen más
diferencias a nivel de ácido nucleico, debido a la naturaleza de su
código genético, que los genes que codifican moléculas de ARN
estructural (por ejemplo, moléculas de ARNr 16S). Las moléculas
gyrB/parE como conjunto no han permanecido tan inalterables
como las moléculas de ARN estructural durante la evolución: pueden
encontrarse fragmentos de ADN cortos en moléculas gyrB/parE
donde las diferencias entre diversas especies bacterianas grandes
(incluyendo especies bacterianas estrechamente relacionadas) son
tan grandes que estas secuencias de ADN pueden considerarse
específicas de especie. Estas secuencias son secuencias
hipervariables, que en el contexto se refieren a secuencias de ADN
de los genes de topoisomerasa que difieren en la secuencia de bases
nucleotídicas entre diferentes bacterias a un grado que produce
especificidad de especie bacteriana y que están situadas cerca de
las secuencias conservadas de los genes de topoisomerasa y
opcionalmente limitadas o marcadas por las secuencias
conservadas.
Las características mencionadas anteriormente se
utilizaron en el diseño de oligonucleótidos específicos de especie
para las cepas bacterianas. En el diseño de sondas específicas de
especie (oligonucleótidos) (Tablas 4A y 4B) se usó una estrategia
de planificación basada en la alineación. Los genes gyrB y
parE de especies bacterianas diana se alinearon con los genes
correspondientes de las bacterias de referencia. Las secuencias se
obtuvieron de la base de datos pública de secuencias EMBL o, en
casos en los que dichas secuencias no estaban disponibles en bases
de datos públicas, se produjeron por clonación de los fragmentos de
la secuencia del gen gyrB/parE a partir de las especies
bacterianas. Las secuencias se produjeron amplificando el fragmento
de ADN de gyrB/parE deseado a partir de aislados de cultivo
bacteriano. El fragmento de secuencia de ADN deseado después se
clonó y se secuenció. En la Figura 1 se presenta un ejemplo de la
región del gen gyrB hipervariable de dos especies
bacterianas, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis,
que está unida por regiones génicas conservadas. Se han marcado las
regiones conservadas con recuadros en gris, y funcionan como sitios
de hibridación de cebadores de gyrB/parE de amplio intervalo.
La región hipervariable, para la que se han diseñado sondas
específicas de especie, está entre estas secuencias conservadas
(sitios subrayados).
La alineación de las secuencias se realizó con
el programa BioEdit y el algoritmo de alineación ClustalW. La
secuencia consenso de las alineaciones se calculó y se identificaron
manualmente las regiones adecuadamente conservadas. Estas regiones
se refieren a fragmentos de secuencia que están conservados en los
genes de la especie bacteriana diana pero no se encuentran, al
menos completamente, en los genes de las especies bacterianas de
referencia. Las secuencias oligonucleotídicas con la longitud
adecuada (por ejemplo, 21-25 nucleótidos) se
seleccionaron entre estas áreas para análisis de comparación. Las
secuencias oligonucleotídicas seleccionadas se compararon con la
base de datos de secuencias procariotas EMBL usando el programa del
algoritmo FastA. Las secuencias oligonucleotídicas que tienen al
menos dos faltas de coincidencia cuando se comparan con las
secuencias de gyrB/parE de especies bacterianas no diana se
eligieron para análisis adicionales. Se calcularon las temperaturas
de fusión (Tm) de los oligonucleótidos y se examinó la formación de
estructuras de horquilla. Los oligonucleótidos sin estructuras
secundarias fuertes y con Tm mayores de 45ºC se seleccionaron para
el ensayo de especificidad. La especificidad de las sondas
oligonucleotídicas se ensayó en condiciones de laboratorio tanto
con muestras de ADN puro aisladas de diversas especies bacterianas
(Ejemplo 3, Tabla 3) como con muestras clínicas de pacientes
(Ejemplo 6, Tabla 5).
Las sondas oligonucleotídicas de la presente
invención comprenden las secuencias identificadas con la SEC ID Nº
1 a 69, o sus secuencias inversas o complementarias. Pueden ser de
diferente longitud, y solamente la especificidad de especie deseada
y la funcionalidad de estas sondas oligonucleotídicas determinan su
longitud adecuada en reacciones de hibridación. La longitud de las
sondas oligonucleotídicas es generalmente de 15 a 30,
preferiblemente de 20 a 30 y más preferiblemente de 21 a 25
nucleótidos. Además, las sondas pueden modificarse de diferentes
modos (por ejemplo, pueden incluirse nucleótidos modificados, tales
como inosina). Además, pueden unirse diversos compuestos o grupos
químicos (por ejemplo, grupos amino) u otras moléculas, tales como
marcadores necesarios para la detección, a las sondas, o pueden
estar completamente sin modificar. Las secuencias de las sondas
específicas de especie bacteriana preferidas y sus especificidades
se presentan en las Tablas 4A y 4B, y tienen secuencias
identificadas con la SEC ID Nº 1 a 69. Naturalmente, son igual de
adecuadas secuencias inversas y complementarias de estas secuencias
oligonucleotídicas, como es obvio para los especialistas en la
técnica. Asimismo, son útiles fragmentos funcionales de las
secuencias oligonucleotídicas mencionadas previamente como sondas
con la condición de que la especificidad de especie permanezca
inalterable.
Para diseñar los cebadores de PCR, se alinean
secuencias de aminoácidos de proteínas gyrB de especies
bacterianas seleccionadas entre diferentes grupos filogenéticos
(Tabla 2) con el programa BioEdit usando el algoritmo de alineación
ClustalW. En estudios de alineación se encontraron muchas regiones
conservadas y se tomaron como punto de partida para el diseño de
cebadores de amplio intervalo. La proteína parE está
relacionada con la proteína gyrB, y las regiones conservadas
mencionadas anteriormente pueden encontrarse en estos dos genes en
ciertas especies bacterianas (bacterias
gram-positivas). Las secuencias de aminoácidos
conservadas se tradujeron de forma inversa a las secuencias de
ácido nucleico correspondiente. Dependiendo de la naturaleza del
código genético había varias regiones degeneradas en las secuencias
cebadoras. En base a las secuencias conservadas se diseñaron varios
pares de cebadores y se ensayaron en laboratorio (ensayo de
especificidad y sensibilidad). En base a los ensayos de laboratorio
se concluyó que la amplificación de ADN bacteriano puro es exitosa
con algunos pares de cebadores, y que los genes gyrB/parE de
todas las bacterias pueden amplificarse con estos cebadores. Los
cebadores en cuestión actúan de este modo como cebadores universales
o de amplio intervalo para las bacterias.
Uno de los pares de cebadores demostró tener
sensibilidad superior en comparación con los otros, y se ensayaron
muestras clínicas con este par de cebadores. Sin embargo, resultó
que el ADN bacteriano no puede amplificarse con este par de
cebadores a partir de muestras clínicas que contienen grandes
cantidades de ADN humano. Por esta razón se volvió a diseñar el par
de cebadores, y se buscaron nuevas alternativas de cebador, en
términos de degeneración, que amplificarían por un lado el ADN de
muestras clínicas, y por otro lado también retendrían una elevada
especificidad de modo que pudieran amplificarse las proteínas
gyrB/parE de todas las bacterias que causan infecciones del
tracto respiratorio. Se presenta un par de cebadores funcional en la
Tabla 1. Con este par de cebadores, pueden amplificarse todos los
genes gyrB/parE de bacterias que están filogenéticamente
distantes entre sí (Tabla 3) incluso en presencia de grandes
cantidades de ADN humano.
\vskip1.000000\baselineskip
En las secuencias de los cebadores:
W representa la base A o T,
K representa la base G o T,
Y representa la base C o T,
H representa la base A o C o T,
R representa la base A o G, y
D representa la base A o G o T.
Las mezclas de cebadores, que constan de varias
alternativas de cebador diferentes, están de este modo afectadas.
Por ejemplo, en el caso del cebador gB1F la mezcla incluye
cebadores, en los que W representa A (adenina) o T (timina).
De acuerdo con la invención, pueden usarse
sondas específicas para la identificación de patógenos causantes de
infección, especialmente bacterias que causan infecciones del tracto
respiratorio, en cualquier método adecuado, por el que pueda
demostrarse la hibridación. Estos métodos son bien conocidos entre
los especialistas en la técnica y pueden realizarse tanto en
solución como en un soporte sólido que una ADN, tal como en membrana
de nitrocelulosa o nylon, o en vidrio.
En una realización preferida del método de la
invención, la identificación bacteriana se realiza usando la
tecnología de microserie de ADN. En este contexto, una microserie de
ADN o un chip de ADN se refiere a un pequeño sustrato en el que se
han unido secuencias de ácido nucleico conocidas en un orden
predeterminado. Si los fragmentos de ácido nucleico unidos a la
microserie con más cortos de 100 pares de bases (generalmente
aproximadamente 20-30 pares de bases), la microserie
se llama una serie de oligonucleótidos.
En el método de la presente invención la muestra
a analizar puede ser un cultivo bacteriano, un fragmento tisular,
una muestra de secreción, tal como una muestra de esputo o
cepillado, una muestra de sangre, u otra muestra adecuada, obtenida
de un paciente que se sospecha que padece una enfermedad infecciosa.
Especialmente la muestra a analizar es una muestra de secreción
adecuada para aplicaciones de diagnóstico clínico.
El ADN se aísla de la muestra a analizar con
cualquier método convencional, tal como con kits de aislamiento de
ADN comerciales (por ejemplo, High Pure PCR Template Preparation
Kit, Roche; NucleoSpin, BD Biosciences Clontech; o QlAamp DNA
Mini-kit, Qiagen) o con extracción tradicional con
fenol-cloroformo o disolventes orgánicos
equivalentes, de forma manual o con dispositivos especiales que son
adecuados para realizar el aislamiento de ADN. Los kits comerciales
se usan preferiblemente a causa de su disponibilidad general,
rapidez, y repetibilidad.
En el método de la presente invención los
reactivos usados en la amplificación de ADN pueden ser cualquier
reactivo que se use convencionalmente para la amplificación de ADN,
y son bien conocidos entre los especialistas en la técnica. Los
reactivos adecuados y rentables, que están disponibles en el
mercado, incluyen diferentes tipos de ADN polimerasas Taq y
tampones para las mismas (por ejemplo, AmpliTaqGOLD, AmpliTaqLD,
DyNAzyme, TaqPlus Precision, y HotStartTaq), nucleótidos o mezclas
preparadas de nucleótidos (por ejemplo, Sigma, Applied Biosystems,
Amersham Biosystems), MgCl_{2} (por lo que generalmente se usa un
producto del fabricante de la Taq polimerasa), y
Cy5-dCTP (por ejemplo, NEN LifeSciences, Amersham
Biosciences).
En el método de la presente invención puede
realizarse la clonación con cualquier método conocido
convencionalmente, por ejemplo usando kits de clonación disponibles
en el mercado (por ejemplo, Qiagen PCR Cloning Kit, QIAGEN o TOPO
TA Cloning Kit, Invitrogen). La secuenciación de los productos de
clonación puede realizarse con cualquier secuenciador adecuado para
este propósito (por ejemplo, Applied Biosystems modelo 373A, 377, o
3100, o Bio-Rad Sequi-Gen GT), o
los productos pueden secuenciarse manualmente. Las secuencias pueden
analizarse manualmente o con programas de análisis de secuencia
diseñados para este propósito (por ejemplo, Applied Biosystems
Sequencer o Vector NTI Suite Versión 7, InforMax).
El equipo usado para la amplificación también
puede ser cualquier dispositivo adecuado (por ejemplo, T1
Thermocycler, Biometra, o GenAmp PCR system 2700, Applied
Biosystems). Pueden usarse prácticamente todos los dispositivos y
equipos adecuados para la amplificación de ADN, y la amplificación
también puede realizarse manualmente transfiriendo tubos de
reacción de una temperatura a otra. Además, la amplificación puede
realizarse directamente en una microserie de ADN.
La purificación del producto de PCR puede
realizarse con cualquier método convencional (por ejemplo, High
Pure PCR Product Purification Kit, Roche; MicroSpin
S-400, o S-300 HR Columns, Amersham
Biosciences; o QIAquick
PCR-purification-Kit, Qiagen) o
usando extracción con un disolvente orgánico. El producto de
amplificación también puede usarse para la reacción de hibridación
como tal sin ninguna etapa de purificación o extracción
adicional.
Para formar una cadena diana monocatenaria puede
usarse cualquier método de digestión conocido. Estos métodos
incluyen, por ejemplo, PCR asimétrica, tratamiento con exonucleasa,
o síntesis de una cadena diana monocatenaria directamente sobre la
superficie de la microserie (por ejemplo, matriXarray, Roche Applied
Science). La invención también comprende aplicaciones en las que
puede usarse un producto de PCR bicatenario en la reacción de
hibridación. En el contexto de la presente invención la PCR
asimétrica es el método preferido para generar una cadena diana
monocatenaria.
En el método de la presente invención puede
usarse cualquier marcador adecuado para producir una cadena diana
marcada. Los marcadores adecuados incluyen marcadores fluorescentes
(por ejemplo, Cy5, Cy3, Cy2, TexasRed, FITC, Alexa 488, TMR,
FluorX, ROX, TET, HEX), marcadores radiactivos (por ejemplo,
^{32}P, ^{33}P, ^{33}S), y marcadores quimioluminiscentes
(por ejemplo, HiLight Single-Color Kit). En la
presente invención se prefiere el marcador fluorescente
Cy5-dCTP (Amersham Biosciences). La invención
también comprende las aplicaciones en las que no se necesita
marcador, tales como aquellas en las que la detección de ácidos
nucleicos se basa en impulsos eléctricos (por ejemplo, el Motorola
eSensor).
Cuando la hibridación tiene lugar en un soporte
sólido, las sondas usadas en hibridación pueden unirse sobre la
superficie del soporte sólido por unión covalente o no covalente.
Como alternativa, pueden usarse otros métodos químicos,
electroquímicos o equivalentes de unión. El sustrato o soporte, en
el que se unen las sondas, puede estar fabricado de vidrio,
plástico, metal, nylon, nitrocelulosa, poliacrilamida, sílice, o una
combinación de estos materiales, y el tamaño del sustrato puede
variar de un par de milímetros a unos pocos centímetros. La
superficie del sustrato usado puede tratarse con aminosilano o
cualquier otro tratamiento de superficie adecuado, tal como
epoxisilano, o como alternativa un sustrato que no requiera ningún
tratamiento de superficie diferente. Un sustrato preferido para las
sondas oligonucleotídicas es un portaobjetos de vidrio de
microscopio tratado con aminosilano (por ejemplo, Genorama, Asper
Biotech Ltd., Estonia).
Las sondas pueden depositarse en la superficie
del soporte de microserie con cualquier equipo de formación de
series disponible en el mercado que sea adecuado para este propósito
(por ejemplo, Qarray-mini arraying system, Lucidea
Array Spotter, OmniGrid, o GeneMachines arrayer), o pueden
pipetearse manualmente sobre la superficie. Como alternativa, las
sondas pueden sintetizarse directamente sobre la superficie usando
fotolitografía.
La mezcla de hibridación usada en hibridación
puede ser diferente en su composición de la que se ha presentado
posteriormente en los Ejemplos de prácticos, por ejemplo, la
composición salina y/o la concentración pueden variar (por ejemplo,
2-4xSSC o SSPE), o pueden usarse soluciones de
hibridación disponibles en el mercado (por ejemplo, ArrayHyb,
Sigma). Además, pueden usarse aditivos desnaturalizantes o
estabilizantes (por ejemplo, formamida, DMSO, es decir
dimetilsulfóxido) o sustancias que disminuyan la unión no específica
(por ejemplo, BSA, es decir albúmina de suero bovino, o ssADN, es
decir, ADN de esperma de salmón) en la mezcla de hibridación. La
hibridación puede realizarse en diversas temperaturas de hibridación
(generalmente entre 40-70ºC), y el tiempo necesario
para realizar la hibridación puede variar, dependiendo de la
aplicación, de unos pocos minutos a un día. En lugar de un baño de
agua, la hibridación puede realizarse, por ejemplo, en una
incubadora o en un dispositivo de hibridación especial (por
ejemplo, GeneTAC HybStation o Lucidea Slidepro Hybridizer). Las
etapas de lavado después de la hibridación pueden variar en su
duración, volumen, temperatura y en la composición de la solución
de lavado, y por lo tanto pueden diferir del método ejemplificado.
Las etapas de lavado de los portaobjetos de microserie también
pueden realizarse con un dispositivo diferente. En algunos casos no
es necesaria una etapa de lavado, porque el portaobjetos de
microserie puede analizarse inmediatamente después de la
hibridación. En un método preferido un baño de agua a +57ºC es una
condición de hibridación adecuada. Los portaobjetos de vidrio se
hibridaron durante 12-16 horas en estas
condiciones.
Pueden analizarse microseries o chips con
cualquier equipo o lector aplicable para este propósito (por
ejemplo, GeneTAC UC4, GenePix Personal 4100A, o Agilent DNA
Microarray Scanner). Si la cadena diana se ha marcado con un
marcador fluorescente, también puede realizarse el análisis, por
ejemplo, con un microscopio de fluorescencia. Si se ha usado un
marcador radiactivo, el chip o membrana puede analizarse con
autorradiografía. Si se ha realizado hibridación en la superficie
de una microserie electrónica y el análisis por tanto se basa en
detección electrónica, la microserie puede analizarse con un equipo
especial diseñado para este propósito.
Se ha mapeado completamente el genoma de
solamente una docena de especies bacterianas, y la mayoría de estas
especies bacterianas son patógenos conocidos. Por tanto, hay muy
poca información acerca de la flora bacteriana normal y las
secuencias de ADN de estas especies bacterianas. Por lo tanto, es
casi imposible el diseño de cebadores de PCR específicos de especie
bacteriana y el diagnóstico bacteriano basado solamente en la
amplificación por PCR.
El método de la presente invención no sufre
otros problemas de la técnica anterior. La etapa de amplificación
del método de la presente invención es muy sensible y se amplificó
de forma eficaz una cierta región génica (gyrB/parE) de
especies bacterianas filogenéticamente diferentes con cebadores de
amplio intervalo de la invención independientemente de si las
especies bacterianas eran gram-negativas o
gram-positivas (Tabla 3). Además, el producto de
PCR es corto (aproximadamente 300 pares de bases), que mejoran la
eficacia de la reacción de amplificación.
Las sondas específicas de especie bacteriana se
han diseñado para la región del gen gyrB/parE que es
considerablemente más variable que por ejemplo la región del gen de
ARNr 16S, que se ha usado previamente en diagnóstico bacteriano.
Aunque las especies bacterianas de la flora normal también se
amplifican de forma eficaz con cebadores de amplio intervalo usados
en el presente método, no suceden reacciones de falso positivo,
porque las sondas de la invención son muy específicas de especie
bacteriana e identifican solamente las bacterias para las que se
han diseñado. Cuando se hibrida la cadena diana amplificada de los
aislados de cultivo de Streptococcus pneumoniae en un
portaobjetos de vidrio, la cadena diana hibridará solamente con
sondas específicas para Streptococcus pneumoniae y con
controles positivos. Por otro lado, cuando se hibrida la cadena
diana amplificada de bacterias de flora normal, por ejemplo,
Streptococcus mitis, el producto no se unirá a ninguna sonda
del patógeno; en este caso solamente las sondas de control positivo
emitirán una señal (Ejemplo 7, Tabla 6). Todas las sondas
oligonucleotídicas específicas de la presente invención se ensayaron
de forma cruzada con diversas especies bacterianas, incluyendo
muchas especies bacterianas que pertenecen a la flora normal, y no
se descubrió que tuvieran lugar reacciones cruzadas (Figura 2, Tabla
6). Por tanto, el método de la presente invención es
considerablemente más sensible y específico que los métodos
descritos previamente de tipo similar.
El kit de diagnóstico de la invención puede
usarse en el diagnóstico de bacterias que causan infección,
especialmente las que causan infecciones del tracto respiratorio.
El kit comprende la mezcla de cebador de ADN de la invención
definido anteriormente con detalle, cualquier mezcla adecuada y
deseada de secuencias de sonda oligonucleotídica específica de
especie bacteriana, opcionalmente unidas en un soporte sólido de la
invención como se ha definido anteriormente con detalle, secuencias
de sonda de control positivo y opcionalmente negativo adecuadas, y
opcionalmente reactivos necesarios en las etapas de amplificación,
hibridación, purificación, lavado, y/o detección como se ha
analizado con detalle anteriormente. Un kit de diagnóstico preferido
de la invención contiene una mezcla de cebador de ADN que comprende
secuencias identificadas con la SEC ID Nº 76 y 77, un chip que
contiene las secuencias apropiadas oligonucleotídicas identificadas
con la SEC ID Nº 1 a 69 unidas a los mismos, controles positivos y
opcionalmente negativos, y opcionalmente los reactivos necesarios
para realizar el método de la invención. A continuación, la
invención se ilustra de forma más precisa con los Ejemplos. Cuando
se describe el método, se ha hecho referencia a diferentes equipos,
materiales, temperaturas, compuestos químicos o equivalentes usados
en esta aplicación. Estos pueden variarse de forma natural de un
modo adecuado en diferentes aplicaciones de la invención. Por lo
tanto, la presente invención y sus realizaciones no se limitan a los
ejemplos descritos a continuación.
Para el diseño de cebadores de PCR, se alinearon
secuencias de aminoácidos de las proteínas gyrB (GyrB) y su
proteína par relacionada ParE de diversas especies bacterias de
diferentes grupos filogenéticos (Tabla 2) con el programa BioEdit
usando el algoritmo de alineación ClustalW. Se encontraron varias
regiones génicas conservadas en la alineación de GyrB. También se
encontraron las mismas regiones conservadas del gen parE de
las especies bacterianas gram-positivas
estudiadas.
Estas secuencias de aminoácidos conservadas se
usaron como punto de partida en el diseño de cebadores de amplio
intervalo. En primer lugar se tradujeron de forma inversa en las
secuencias de ácido nucleico correspondientes. A causa de la
naturaleza del código genético se observaron varios sitios
degenerados en estas secuencias de ácido nucleico. Después de esto,
en base a las secuencias conservadas, se sintetizaron diversos pares
de cebadores (solicitados de Sigma-Genosys,
Inglaterra, www.sigma-genosys.co.uk) y se
ensayaron para la especificidad y sensibilidad. Se ensayó la
especificidad amplificando ADN aislado de especies bacterianas
presentadas en la Tabla 4 usando el método descrito a continuación
en el Ejemplo 4. Se determinó la sensibilidad del par de cebadores
analizando la concentración más pequeña de ADN aislado de un aislado
de cultivo de H. influenzae que podría amplificarse y
detectarse con diferentes pares de cebadores usando el método de
amplificación e identificación descrito a continuación en el
Ejemplo 4.
En base a estos resultados de ensayo, se observó
que la amplificación de ADN bacteriano puro era exitosa para
algunos pares de cebadores, y con estos cebadores podrían
amplificarse los genes gyrB/parE de todas las
especies bacterianas estudiadas. Estos cebadores funcionaban por lo
tanto como cebadores de amplio intervalo para las bacterias. La
sensibilidad de los cebadores varío, y el par de cebadores con la
sensibilidad mayor se usó para estudiar las muestras clínicas
(muestras de otitis media). Sin embargo, se descubrió que este par
de cebadores no era suficientemente sensible, porque no era capaz de
amplificar el ADN bacteriano de muestras clínicas que contenían
grandes cantidades de ADN humano.
Por esta razón se sintetizaron nuevos pares de
cebadores que variaban en términos de degeneración (solicitados de
Sigma-Genosys, Inglaterra,
www.sigma-genosys.co.uk). Se estudió la
especificidad y sensibilidad por el método descrito previamente,
tanto con ADN bacteriano puro como con ADN aislado de muestras
clínicas (Tabla 5). Un par de cebadores de funcionamiento era la
mezcla de cebadores, que contiene las secuencias
CGTCCWGGKATGTAYATHGG (SEC ID Nº 76) y
CCHACRCCRTGWAAWCCDCC (SEC ID Nº 77),
que llamaron gB1F (mezcla de cebador directo) y
gB2R (mezcla de cebador inverso), respectivamente (Tabla 1), en los
que
W representa la base A o T,
K representa la base G o T,
Y representa la base C o T,
H representa la base A o C o T,
R representa la base A o G, y
D representa la base A o G o T
Las secuencias conservadas de la primera parte
de los genes gyrB y/o parE de todas las especies
bacterianas estudiadas se identificaron con esta mezcla de
cebadores. Ésta amplifica ADN de muestra clínicas, y tiene
especificidad suficientemente amplia conservada, posibilitando de
este modo la amplificación de los genes gyrB/parE de
todas las especies bacterianas que causan infecciones del tracto
respiratorio (véanse los Ejemplos 6 y 7). En particular, esta
mezcla de cebadores puede usarse para amplificar los genes
gyrB/parE de bacterias (Tabla 3) que están filogenéticamente
lejos entre sí incluso en una situación en la que la muestra
incluye grandes cantidades de ADN humano.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron secuencias gyrB de las
especies bacterianas Moraxella catarrhalis, Fusobacterium
necrophorum, Legionella pneumophila, Streptococcus mitis,
Streptococcus oralis, y Haemophilus parainfluenzae que
no están disponibles en bases de datos de secuencias públicas de
acuerdo con el método general descrito a continuación para diseñar
sondas oligonucleotídicas de la invención.
Primero se aísla el ADN de aislados de cultivo
bacteriano usando el QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Alemania). Cuando
se ha aislado el ADN, se amplifica la cadena diana deseada para
clonación usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
simétrica (convencional). En la primera etapa de amplificación, se
prepara la mezcla de reacción mezclando el ADN aislado de la
muestra, los cebadores bacterianos de amplio intervalo (Ejemplo 1),
y los demás componentes necesarios en la etapa de amplificación. Por
tanto, la mezcla de reacción (25 \mul) usada en la PCR de
clonación contiene 20 pmol de mezcla de cebador gB2R, 20 pmol de
mezcla de cebador gB1F, 200 \muM de cada dATP, dGTP, dTTP y dCTP
(Sigma USA), tampón de PCR Hot Start Taq 1 x (Qiagen, Alemania),
que incluye MgCl_{2} para conseguir una concentración final de 2,8
mM, DMSO al 7,5% (Amersham Pharmacia Biotech, USA), 2,5 U de ADN
polimerasa Hot Start Taq (Qiagen, Alemania) y 2,5 \mul de ADN
aislado.
La PCR de clonación se realiza en un
termociclador GenAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems) usando el
siguiente programa: una etapa de desnaturalización de 15 minutos a
95ºC, 40 ciclos de 1 minutos a 95ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minuto a
72ºC, y finalmente una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC.
Después de que haya realizado la PCR, se verifica el éxito de la
amplificación por electroforesis en gel usando un gel de agarosa el
2% que contiene bromuro de etidio.
La clonación se realiza inmediatamente después
de PCR usando un kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, USA). La
mezcla de reacción para la clonación contiene 4 \mul del producto
de PCR, 1 \mul de una solución salina (NaCl 1,2 M, MgCl_{2}
0,06 M) y 1 \mul de vector TOPO
(pCR-4-TOPO), que se mezclan juntos
en un tubo eppendorf. La mezcla se incuba durante 5 minutos a
temperatura ambiente, después de lo cual se transfiere la solución
en hielo. Después de que se realice esta transformación química, en
la que se transforman 2 \mul de mezcla de clonación enfriada en
50 \mul de células de E. coli TOPO10 competentes. Las
células transformadas se incuban durante 10 minutos en hielo. En la
siguiente fase, se realiza un tratamiento de choque por calor. El
tubo que contiene las células se transfiere a un baño de agua a 42ºC
durante 30 segundos. Después de esto el tubo se transfiere
inmediatamente en hielo y se añaden 250 \mul de medio SOC a
temperatura ambiente (triptona al 2%, extracto de levadura al 0,5%,
NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa
20 mM). El tubo se agita horizontalmente (200 rpm) a 37ºC durante 1
hora. Después de esto se extienden 20 \mul de mezcla de clonación
en una placa LB selectiva precalentada
(Luria-Bertani, triptona al 10%, extracto de
levadura al 0,5%, NaCl al 1,0%, L-agar al 1,5%
diluido en agua, pH 7), que contiene 5 g/ml de ampicilina. La placa
se incuba durante una noche a 37ºC. Al siguiente día, se eligen 10
colonias de la placa y se realiza la PCR de secuenciación.
La mezcla de reacción (50 \mul) para la PCR de
secuenciación contiene 0,4 pmoles de cebador inverso M13
(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') y cebador
directo M13 (5'-GTAAACGACGGCCAG) (proporcionados por
el kit), 150 \muM de cada dATP, dGTP, dTTP y dCTP (Sigma, USA),
tampón de PCR Hot Start Taq 1 x (Qiagen, Alemania), 1 U de ADN
polimerasa Hot Start Taq (Qiagen, Alemania). Para la reacción de
amplificación, se transfiere una pequeña parte de la colonia
bacteriana con la ayuda de una varilla de muestra al tubo de
reacción de PCR.
La PCR de secuenciación se realiza en un
termociclador GenAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems) usando el
siguiente programa: una etapa de desnaturalización de 15 minutos a
95ºC, 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, 1 minuto a
72ºC, y finalmente una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC.
Después de que se haya realizado la PCR, se verifica el éxito de la
amplificación por electroforesis en gel usando un gel de agarosa al
2% que contiene bromuro de etidio. Después de esto, se purifica el
producto de PCR retirando los cebadores, nucleótidos, tampón y
enzima polimerasa adicionales con un kit de purificación QIAquick
PCR (Qiagen, Alemania).
Después de la etapa de purificación se secuencia
el fragmento insertado en el vector. Una mezcla de reacción de 12
\mul para la etapa de secuenciación contiene 100 ng de producto de
PCR y 5 pmol de cada cebador inverso M13 o directo M13. La
secuenciación se realiza por un kit BigDye Terminador Versión 3.0 y
un ABIPRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Las
secuencias se analizan con el programa Vector NTI Suite Versión 7
(InforMax, USA).
Con el método general descrito anteriormente se
produjeron secuencias gyrB para las siguientes especies
bacterianas: Moraxella catarrhalis, Fusobacterium necrophorum,
Legionella pneumophila, Streptococcus, mitis, Streptococcus
oralis, y Haemophilus parainfluenzae (SEC ID Nº 70 a
75).
En el diseño de oligonucleótidos específicos de
especie bacteriana, es decir, sondas, se usó una estrategia de
planificación basada en la alineación. Se alinearon los genes
gyrB y parE de especies bacterianas diana con genes
correspondientes de unas pocas bacterias de referencia (especies
bacterianas estrechamente relacionadas). Por ejemplo, se alineó el
gen gyrB de Streptococcus pneumoniae con los genes
gyrB de Streptococcus pyogenes, Streptococcus mitis,
Streptococcus oralis, Micoplasma hominis, Staphylococcus
aureus, y Fusobacterium necrophorum. S. oralis y
S. mitis están estrechamente relacionadas con S.
pneumoniae. Por lo tanto, los oligonucleótidos diseñados para
S. pneumoniae no deben reaccionar con estas bacterias de la
flora normal. Se obtuvieron secuencias de la base de datos de
secuencias pública EMBL o se produjeron por clonación como se ha
descrito en el Ejemplo 2.
La alineación de la secuencias se realizó con el
programa BioEdit usando el algoritmo de alineación ClustalW. Se
calculó la secuencia consenso de las alineaciones y se identificaron
manualmente las regiones adecuadamente conservadas. Estas regiones
se refieren a fragmentos de secuencia que están conservadas en los
genes de las especies bacterianas diana y que no se encuentran al
menos completamente en los genes de las bacterias de referencia.
Las secuencias oligonucleotídicas con la longitud adecuada (21 - 25
nucleótidos) se seleccionaron entre estas áreas para análisis de
comparación. Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas se
compararon con la base de datos de secuencias procariotas EMBL
usando el programa del algoritmo FastA. Las secuencias
oligonucleotídicas que tienen al menos dos faltas de coincidencia
cuando se comparan con secuencias gyrB/parE de bacterias no
diana se eligieron para análisis adicionales. Se determinó la
temperatura de fusión teórica (Tm) para los oligonucleótidos y se
estudió la formación de estructuras secundarias. Se calculó la Tm
(ºC) con la ecuación
81,5 + 16,6 log
[Na]+0,41(%GC) - 0,61 (%for)
500/N
en la que Na es la concentración de
cationes monovalentes (se usa 50 M en los cálculos), %GC es la
proporción de guanina y citosina, %for es la concentración de
formamida (se usa 0% en los cálculos) y N es la longitud del
oligonucleótido. Se estudió la formación de estructuras secundarias
usando un programa proporcionado por Sigma-Genosys.
El programa puede usarse con la ayuda de un navegador de red en la
dirección de Internet
http://www.sigma-genosys.co.uk/oligos/grameset.html
(calculadora/calculadora básica). Los oligonucleótidos que no
formaron fuertes estructuras secundarias y cuya temperatura Tm era
al menos 45ºC se eligieron para el ensayo de especificidad
experimental.
Se sintetizaron sondas oligonucleotídicas y se
modificaron simultáneamente desde el extremo 5' (oligos modificados
en NH_{2}) (Sigma-Genosys, Inglaterra). Se ensayó
la especificidad de las sondas en el laboratorio con muestras de
ADN aisladas de diferentes especies bacterianas (Tabla 3) y de
muestras de pacientes (Tabla 5) como se describe en los Ejemplos 4
y 5. De las sondas ensayadas, se seleccionaron las que funcionaron
mejor y tuvieron la mayor especificidad. Se presentan las
secuencias y especificidad de las sondas específicas de especie
bacteriana en las Tabla 4A y 4B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se amplificaron los ADN aislados de cultivo
bacteriano o muestras clínicas de pacientes usando el método
convencional descrito a continuación.
Se aísla el ADN de la muestra a analizar (un
cultivo bacteriano o una muestra clínica de paciente) usando el
QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Alemania). Cuando se ha aislado el ADN,
se amplifica la cadena diana deseada usando la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) asimétrica. En la primera fase de la
amplificación, se prepara una solución de reacción mezclando junto
el ADN aislado de muestras, mezclas de cebadores gB1F y gB2R de
amplio intervalo (Ejemplo 1), y otros componentes necesarios en la
amplificación.
La mezcla de reacción de PCR contiene 32 pmol de
mezcla de cebador gB2R, 8 pmol de mezcla de cebador gB1F, 200
\mum de cada dATP, dGTP y dTTP así como dCTP 140 \muM (Sigma,
USA), tampón de PCR Hot Start Taq 1 x (Qiagen, Alemania), en el que
se ha añadido MgCl_{2} de modo que la concentración final sea 2,8
mM, 25 nmol de Cy5-AP3-dCTP
(Amersham Pharmacia Biotech, USA), DMSO al 7,5% (Amersham Pharmacia
Biotech, USA), 2,5 U de ADN polimerasa Hot Start Taq (Qiagen,
Alemania), y 2,5 \mul de ADN aislado en un volumen total de 25
\mul.
La PCR se realiza usando el termociclador GenAmp
PCR system 2700 (Applied Biosystems, USA). Se usa el siguiente
programa de PCR: una etapa de desnaturalización de 15 minutos a
95ºC, 40 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minuto 72ºC,
y finalmente una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC. Después de
que se haya realizado la PCR, se verifica el éxito de la
amplificación por electroforesis en gel usando un gel de agarosa al
2% que contiene bromuro de etidio. Después de esto se purifica el
producto de PCR marcado con Cy5 retirando los cebadores,
nucleótidos, tampón y enzima polimerasa adicionales con un kit de
purificación QIAquick (Qiagen, Alemania).
Se disolvieron sondas oligonucleotídicas
aminadas en el extremo 5' (diseñadas se acuerdo con el Ejemplo 3)
en tampón carbonato sódico 400 mM (pH 9,0) a una concentración final
de 50 \muM. Las sondas se unieron covalentemente en los
portaobjetos de microscopio recubiertos con aminosilano (Genorama,
Asper Biotech Ltd., Estonia). Se realizó la transferencia de las
sondas a los portaobjetos de vidrio con un robot desarrollado para
este propósito (OmniGrid, GeneMachines, USA) y pins (Telechem SMP3,
USA). El tamaño medio del área de sonda aplicada era 120 \mum.
Además, se aplicaron cebadores de control positivo aminados en el
extremo 5' en los portaobjetos de vidrio. Después de la aplicación
los portaobjetos de microserie se mantuvieron en vapor de amoniaco
durante 1 hora para unir las sondas a los portaobjetos. Después del
tratamiento con amoniaco se lavaron tres veces con agua estéril y
se secaron.
A continuación, se hibridó la cadena diana
marcada con Cy5 (fabricada de acuerdo con el Ejemplo 4) al
portaobjetos de microscopio donde se habían unido las sondas. La
mezcla de reacción de hibridación contenía aproximadamente
200-300 ng de cadena diana, 20 x SSC (1 \mul de 20
x SSC contiene 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato sódico, el pH
está ajustado a 7,0 con HCl; la concentración final es 3,4x),
dodecil sulfato sódico al 20% (SDS) (una concentración final del
0,3%), y agua estéril para que el volumen de la mezcla de reacción
fuera 37 \mul. Primero se desnaturalizó la mezcla a 95ºC durante
3 minutos. Después de esto se transfirieron inmediatamente los
tubos a hielo. Después de que se hubiera enfriado la mezcla, se
pipeteó en el cubreobjetos que se había colocado contra el
portaobjetos de vidrio en el que se habían unido las sondas. El
portaobjetos de microserie se colocó en el interior de la cámara de
hibridación (Arraylt, TeleChem International, USA) y se cerró
herméticamente la cámara. Finalmente, se sumergió la cámara de
hibridación en un baño agua. Los portaobjetos de microserie se
hibridaron a 57ºC durante 12 - 16 horas.
Después de la hibridación se lavaron los
portaobjetos de microserie en tres soluciones de lavado diferentes
para retirar el ADN no hibridado. Las etapas de lavado se realizaron
del siguiente modo: solución de SDS al 0,1% durante 5 minutos a
57ºC, en SDS al 0,1%, solución de lavado 0,5xSSC durante 5 minutos a
temperatura ambiente, y en 0,06xSSC durante 5 minutos a temperatura
ambiente.
Después de que se hubieran secado los
portaobjetos de vidrio, se analizaron con un escáner de microserie
(Agilent DNA Microarray Scanner, Agilent, USA). Si la cadena diana
marcada con Cy5 se había unido a una o varias sondas, estas manchas
emitían una señal fluorescente. Además, las sondas de control
positivo también daban una señal fluorescente.
Se presenta un ejemplo de un resultado de
hibridación en la Figura 2. Se usó un fragmento de ADN de
gyrB (un producto de PCR marcado con Cy5 asimétrico) aislado
de un aislado de cultivo de Staphylococcus aureus como
cadena diana. Este portaobjetos de ejemplo incluía cuatro
oligonucleótidos gyrB que son específicos para
Staphylococcus aureus (Tabla 4B: oligonucleótidos 22 - 25).
Todos ellos se unieron específicamente a la cadena diana de
Staphylococcus aureus y dieron un señal fluorescente. Además,
los cinco oligonucleótidos de control positivo dieron una señal
fluorescente.
Se aisló el ADN de muestras clínicas obtenidas
de pacientes que padecen infecciones del tracto respiratorio y se
amplificaron usando el método descrito en el Ejemplo 4. Se ensayaron
las muestras usando el portaobjetos de microserie (descrito en el
Ejemplo 5) en el que se unieron las sondas y los oligonucleótidos de
control positivo (enumerados en la Tabla 4A y 4B). Las mismas
muestras también se analizaron con el método basado en PCR de
amplio intervalo, como se ha descrito anteriormente en Nikkari et
al. (Emerging Infectious Disease, vol. 8, nº 2, 2002, s. 188 -
194) y Kotilainen et al. (Journal of Clinical Microbiology,
vol. 36, nº 8, 1998, s. 2205 - 2209).
Se usaron cebadores de amplio intervalo que se
originan a partir del área del gen de ARNr 16S en el método de PCR
bacteriana de amplio intervalo. Se llamaron cebadores fD1 mod y
16S1RR-B en publicaciones anteriores. El producto
de PCR se clonó y secuenció. La secuencia de ADN se comparó con
bases de datos de secuencia públicas (GenBank) y de este modo se
identificó la especie bacteriana. Los resultados se presentan en la
Tabla 5.
Como puede observarse a partir de la Tabla 5,
los resultados obtenidos con el método de la invención son
completamente idénticos cuando se comparan con el método de PCR de
amplio intervalo convencional. El método definido por la presente
invención es sustancialmente más rápido de realizar, ya que los
resultados están disponibles en aproximadamente un día. Por otro
lado, lleva aproximadamente una semana de media realizar la PCR
bacteriana de amplio intervalo incluyendo las etapas de clonación y
secuenciación que consumen mucho tiempo. En comparación con el
ensayo de cultivo, tanto el método de la presente invención como la
PCR bacteriana de amplio intervalo resultaron ser tan sensibles
como el cultivo e incluso más sensibles en algunos casos.
La identificación de múltiples patógenos
bacterianos se altera por las bacterias de la flora normal. La
presencia de estas bacterias es necesaria para la salud de un
organismo humano, y se ha estimado que cientos de bacterias
diferentes pertenecen a la flora normal humana. Por tanto, las
bacterias de la flora normal pueden en muchos casos alterar los
diagnósticos bacterianos.
La especificidad del método de la presente
invención, en el que se usan sondas oligonucleotídicas
gyrB/parE específicas, se estudió con respecto a la flora
normal Simultáneamente, se comparó el método con un método de PCR
múltiple donde se usa una mezcla de cebadores de amplio intervalo y
específicos de especie para la amplificación.
Se aisló el ADN de aislado de cultivo de las
bacterias de la flora normal Streptococcus mitis, Streptococcus
oralis, Moraxella caviae, y Moraxella cuniculi. Después
de esto, se amplificó el ADN aislado usando el método descrito en
el Ejemplo 4 y se ensayó usando el portaobjetos de microserie
(descrito en el Ejemplo 5), en el que se habían unido sondas
específicas (presentadas en la Tabla 4A y 4B). Para comparación, se
sintetizaron cebadores de PCR específicos descritos en la
publicación de Hendolin et al. (Journal of Clinical
Microbiology, 35: 11, 1997) y se realizó una variante de la PCR
múltiple usando el método descrito en esta publicación. En esta
variante del método de PCR múltiple convencional se usa el cebador
de amplio intervalo que se origina a partir de la región génica
conservada de ARNr 16S como un cebador de PCR y se usa la mezcla de
cebadores que consta de cuatro cebadores específicos de especie
diferentes como otro cebador de PCR. Las especies bacterianas a
diagnosticar con este cebador fueron Alloiococcus otiditis,
Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, y
Streptococcus pneumoniae. Se diseñaron cebadores específicos
de especie de modo que el producto de PCR amplificado difiera en
longitud dependiendo de qué especie bacteriana se haya aislado. Los
resultados se presentan en la Tabla 6.
Los resultados demuestran que con el método de
la presente invención en el que se usan sondas oligonucleotídicas
específicas, sólo se identifican específicamente las especies
bacterianas deseadas. En su lugar, los cebadores específicos
definidos por el método conocido y el método de PCR múltiple no
pueden distinguir las bacterias deseadas de las bacterias estudias
de la flora normal, y por tanto no son suficientemente específicos
(Figura 3).
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> MoBiDiag Oy
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sondas de ácido nucleico, cebadores
de amplio espectro y métodos en los que se usan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2022264FI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcaaaagaa ggtcttcacc atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccatattca agtttttatt gag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagatga ttcgattact gtt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgagaccgt ctttacagtc ctt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttttgcctc tcatattaaa gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctttattga agcagataat tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttgaaaca gtttttacag tct
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcttcatc atctagtcta tga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttgtagac wacagcattg acg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccatggca gsttattgct cta
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattgatgt tsgcatttta gag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtattgtc wtcgtagata atg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttattgctct aggattgatg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcattttaga gsacgggggt att
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaactaac ccttaaagac aact
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaacagtg tttacggtac tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgataattc tgtatcggtg caa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcagaagtt attatgactg tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgataact cttataaagt atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgataccgatg aeggtactgg tttg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgtgggaa attgtcgata ata
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaagttgtt attgaaaaag ataac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattaaagt aacggataac gga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtcgaagt tattttaact gttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacttcaga gagaggtttg cac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas aeruginosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaatcagca tcaccatcca tac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas aeruginosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacggatga gtcgatcact gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas aeruginosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgacaaca cctacaaggt gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas aeruginosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacaccgacg atggcaccgg tctg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcgacaaca acagctacaa aat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatggtgtt tgaagtattg gac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacaaaatca cggtaacgat aca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacaacaaca gctacaaaat etc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptattcgaggt ggtagataac gct
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcacgccga taactctgtc tct
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgccgataac tctgtctctg tac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgataact cctataaagt gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacacggatg acggcaccgg tctg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctgccgag gttattatga cgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgataatt catacaaagt atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtggatatc caccctgaag aag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataccgatga tggtacaggc ttg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgataatt cctacaaggt atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcagccgaa gtcatcatga cag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtagatatt cataaagaag aag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacagatga tggaaccggt ttg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagatgatgg aaccggtttg cat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fusobacterium necrophorum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacatcagc caggggatta cat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fusobacterium necrophorum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattccag tagacataca tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fusobacterium necrophorum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaaatgat aactataaag tgtc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtaacgaa atagatgtaa caa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaagataat ggacgtggta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaccgac agtcgaagtt atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactgataa acggggatta catc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacaaggcg gctataaaac ttc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggagatgat attaaggttg tta
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcagtgtgg cagatagcgg acg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattcccac cgttcaagtt att
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacagatgc tacgggattg cac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcagggtg gctacaaaac gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtgatcgt attgatgtaa cta
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaacggtte aagaccatgg acg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattccaac tgttgaggtt atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaccgatgg cgctggtctt cat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcaaggtg gctataagac atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctaatact attgccgttg ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataactgtta gtgacaacgg tcg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatttctac gattgacacc gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgataacgatt cttataagat tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fusobacterium necrophorum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus mitis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (288).. (288)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus oralis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus
parainfluenzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> w es a o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> k es g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> y es c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> h es a, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtccwggka tgtayathgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) .. (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> h es a, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r es a o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r es a o, g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> w es a o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> w es a o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> d es a, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcchacrccrt gwaawccdcc
\hfill20
Claims (19)
1. Un método de diagnóstico para detectar e
identificar especies bacterianas que causan infecciones a partir de
una muestra clínica, caracterizado porque
a) amplifica un ADN aislado de dicha muestra
clínica usando una mezcla de cebadores de ADN que comprende
secuencias que hibridan con las secuencias que se originan a partir
de regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas,
especialmente gyrB/parE, de especies bacterianas que causan
dichas infecciones, comprendiendo dichas secuencias las SEC ID Nº
76 y 77 o con secuencias complementarias de las mismas.
b) pone en contacto el ADN amplificado con una
combinación deseada de secuencias de sonda oligonucleotídica que
hibrida en condiciones de hibridación normal con regiones
hipervariables situadas cerca de dichas regiones conservadas de
genes que codifican topoisomerasas, especialmente gyrB/parE,
de especies bacterianas que causan dichas infecciones, siendo
dichas secuencias específicas de especie bacteriana en dichas
condiciones de hibridación, y
c) detecta la formación de un posible complejo
de hibridación.
2. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque dichas especies
bacterianas que causan infecciones son especies bacterianas que
causan infecciones del tracto respiratorio.
3. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha región
hipervariable es la región hipervariable del gen que codifica la
proteína gyrB y/o parE de una especie bacteriana
seleccionada entre Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes, Chlamydia pneumoniae, Micoplasma pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria
gonorrhoeae, Escherichia coli, Moraxella catarrhalis, Legionella
pneumophila, y Fusobacterium necrophorum.
4. El método de diagnóstico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque la longitud de la secuencias de sonda oligonucleotídica
usadas en la etapa b) es de 15 - 30, más preferiblemente 20 - 30, y
mucho más preferiblemente de 21 - 25 nucleótidos.
5. El método de diagnóstico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque dicha combinación de secuencias de sonda oligonucleotídica
comprende todo o parte de las SEC ID Nº 1 a 69, y/o secuencias
complementarias de las mismas.
6. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque dicha combinación de
secuencias de sonda oligonucleotídica comprende todas las SEC ID Nº
1 a 69.
7. El método de diagnóstico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado
porque dicha combinación de secuencias de sonda oligonucleotídica
está unida en un soporte sólido.
8. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el ADN aislado de la
muestra clínica en la etapa a) se amplifica usando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y el ADN amplificado en la etapa b)
se pone en contacto con sondas oligonucleotídicas específicas de
especie bacteriana unidas en un soporte sólido.
9. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 7 u 8, caracterizado porque dicho soporte
sólido es vidrio tratado.
10. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque se usan nucleótidos
marcados adecuadamente en la amplificación de ADN aislado de una
muestra clínica en la etapa a) para generar una cadena diana
detectable.
11. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 10, caracterizado porque el ADN diana
amplificado y opcionalmente marcado en la etapa b) se pone en
contacto con un soporte sólido, en el que se han unido todas las
sondas oligonucleotídicas específicas de especie bacteriana SEC ID
Nº 1 a 69 y/o secuencias complementarias de las mismas.
12. El método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 10, caracterizado porque el ADN diana
amplificado y opcionalmente marcado en la etapa b) se pone en
contacto con un soporte sólido en el que se han unido las
secuencias de sonda oligonucleotídica que detectan una especie
bacteriana específica o unas pocas especies bacterianas
especificadas que causan infecciones, seleccionándose dichas
secuencias entre las SEC ID Nº 1 a 4 y 61 a 65 de Streptococcus
pneumoniae, 5 a 7 y 56 a 60 de Streptococcus pyogenes, 8
a 14 de Chlamydia pneumoniae, 15 a 16 y 66 a 69 de
Mycoplasma pneumoniae, 17 a 20 de Haemophilus
influenzae, 21 a 25 y 51 a 55 de Staphylococcus aureus,
26 a 29 de Pseudomonas aeruginosa, 30 y 33 de Neisseria
gonorrhoeae, 34 a 38 de Escherichia coli, 39 a 42 de
Moraxella catarrhalis, 43 a 47 de Legionella
pneumophila y 48 y 50 de Fusobacterium necrophorum, y/o
secuencias complementarias de las mismas.
13. El método de diagnóstico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-12,
caracterizado porque se usa la tecnología de microserie en
la etapa c).
14. Una mezcla de cebador de ADN,
caracterizado porque comprende secuencias que hibridan con
secuencias de las regiones conservadas de genes que codifican
topoisomerasas, especialmente las proteínas gyrB y/o
parE de especies bacterianas que causan infecciones,
especialmente especies bacterianas que causan infecciones del
tracto respiratorio, comprendiendo dicha mezcla las SEC ID Nº 76 y
77 y/o secuencias invertidas o complementarias de las mismas.
15. Una secuencia oligonucleotídica útil en el
diagnóstico de especies bacterianas que causan infección,
caracterizada porque hibrida en condiciones de hibridación
normales con una secuencia de una región hipervariable que es
específica de especie bacteriana y está situada cerca de las
regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas,
especialmente las proteínas gyrB y/o parE, siendo
dicha secuencia oligonucleotídica una de las SEC ID Nº 1 a 69 y/o
secuencias complementarias de las mismas.
16. La combinación de secuencias de sonda
oligonucleotídica útil en el diagnóstico de especies bacterianas
que causan infección, caracterizada porque comprende
cualquier combinación de las SEC ID Nº 1 a 69 y/o secuencias
complementarias de las mismas.
17. La combinación de sondas oligonucleotídicas
de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizada porque
comprende todas las SEC ID Nº 1 a 69.
18. El uso de la combinación de sondas
oligonucleotídicas de acuerdo con la reivindicación 16 ó 18 para la
detección, identificación o clasificación de especies bacterianas
que causan infección.
19. Un kit de diagnóstico para su uso en el
diagnóstico de bacterias que causan infección, especialmente las
causan infecciones del tracto respiratorio, caracterizado
porque comprende
a) una mezcla de cebadores de ADN que comprende
secuencias que hibridan con secuencias de las regiones conservadas
de genes que codifican topoisomerasa, especialmente las proteínas
gyrB y/o parE de especies bacterianas que causan infecciones,
especialmente especies bacterianas que causan infecciones del tracto
respiratorio, comprendiendo dicha mezcla las SEC ID Nº 76 y 77 y/o
secuencias complementarias de las mismas de la invención como se ha
definido anteriormente,
b) una combinación de secuencias de sonda
oligonucleotídica específicas de especie bacteriana, opcionalmente
unidas en un soporte sólido, que comprende cualquier combinación de
las SEC ID Nº 1 a 69 y/o secuencias inversas o complementarias de
las mismas,
c) secuencias de sonda de control positivo y
opcionalmente negativo, y opcionalmente
d) reactivos necesarios en las etapas de
amplificación, hibridación, purificación, lavado y/o detección.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| FI20022064 | 2002-11-19 | ||
| FI20022064A FI113549B (fi) | 2002-11-19 | 2002-11-19 | Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos |
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Family Applications (1)
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