ES2287287T3 - Secuencia del gen rpob de la bacteria tropheryma whippelii y oligonucleotido para el diagnostico molecular de la enfermedad de whipple. - Google Patents
Secuencia del gen rpob de la bacteria tropheryma whippelii y oligonucleotido para el diagnostico molecular de la enfermedad de whipple. Download PDFInfo
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Abstract
Secuencia total del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelli, caracterizada porque está constituida por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9.
Description
Secuencia del gen rpoB de la bacteria
Tropheryma whippelli y oligonucleótido para el diagnóstico
molecular de la enfermedad de Whipple.
La presente invención se refiere al campo del
diagnóstico. Más precisamente, la invención se refiere al
diagnóstico molecular de la enfermedad de Whipple mediante las
técnicas de detección y/o de amplificación y secuenciado con ayuda
de sondas o de iniciadores oligonucleotídicos, y a su aplicación en
la búsqueda de la presencia o a la identificación de bacterias de
la especie Tropheryma whippelii.
La enfermedad de Whipple es una enfermedad que
se presenta en formas variadas. La forma más clásica es la de una
fiebre con una diarrea crónica que provoca un adelgazamiento, pero
también es una enfermedad que es susceptible de ocasionar daños
articulares crónicos, daños cerebrales acompañados de demencia,
daños oftalmológicos con uveitis y también un daño cardíaco, en
particular una endocarditis de hemocultivo negativo. Desde su
descripción en 1907, Whipple evoca la existencia de una bacteria
asociada a la "lipodistrofia intestinal" delante de la
observación de numerosos microorganismos después de la coloración
argéntica de un ganglio mesentérico [Whipple GH (1907) Bull. John
Hopkins Hosp. 18: 328]. La puesta en evidencia del carácter PAS (del
inglés "periodic acid Schiff") positivo no específico de esta
bacteria, y después las observaciones por microscopía electrónica
han confirmado la presencia de una especie bacteriana intracelular
de estructura Gram positiva [Chears et al. (1961)
Gastroenterology 41: 1296]. La herramienta molecular universal 16S
ARNr ha permitido confirmar esta hipótesis precisando la taxonomía
filogénica de esta nueva especie bacteriana, y asignándole el
nombre provisional de Tropheryma whippelii para evocar la
noción de mala absorción intestinal y rendir honores al descubridor
de la afección [Relman D. et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:
293]. El secuenciado directo de 721 bases de un fragmento
amplificado a partir de una biopsia del intestino delgado de un
paciente [Wilson KH et al. (1991) Lancet 338: 474], después a
partir de un ganglio de otro paciente [Wilson KH et al.
(1992) ASM News 58: 318] confirma la originalidad de la especie
bacteriana asociada a la enfermedad de Whipple. El secuenciado por
Relman et al. (op. citado) de 1321 bases que representan el
90% del gen 16S ADNr sobre una muestra, y un fragmento de 284 bases
en otros cuatro pacientes ha permitido confirmar que la especie
bacteriana asociada a la enfermedad de Whipple representaba una
nueva especie, precisar su posición taxonómica en el filum de los
actinomicetos, es decir de las bacterias de estructura Gram positiva
con un alto contenido de guanosina más citosina, que representa un
nueva ramificación relativamente cercana a dos especies conocidas
en la patología humana, Actinomyces pyogenes y
Rothia dentocariosa.
El gen rpoB codifica una de la
subunidades de la ARN polimerasa bacteriana y constituye un
marcador genético que permite la detección específica de la
bacteria de la especie Tropheryma whippelii.
Según Lazcano et al. [J. Mol. Evol.
(1988) 27: 365-376], las ARN polimerasas son
divididas en dos grupos según su origen, uno constituido por las
ARN polimerasas virales ARN- o ADN- dependientes, y el otro
constituido por las ARN polimerasas ADN- dependientes de origen
eucariota o procariota (arceobacterias y eubacterias). Las ARN
polimerasas ADN-dependientes eubacterianas se
caracterizan por una constitución multinumérica simple y conservada
llamada "core enzyme", representada por
\alpha\beta\beta', o "holoenzima" representada por
\alpha\beta\beta'\sigma [Yura y Ishihama, Ann. Rev. Genet.
(1979) 13: 59-97]. Numerosos trabajos han puesto en
evidencia la funcionalidad, en el seno del complejo enzimático
multinumérico, de la subunidad \beta de la ARN polimerasa
eubacteriana. Las ARN polimerasas arceobacterianas y eucariota
presentan, por su parte, una estructura más compleja que puede
alcanzar una decena, incluso una treintena de subunidades [Pühlet
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 88: 4569-
4573].
4573].
Los genes que codifican las diferentes
subunidades \alpha\beta\beta'\sigma de la ARN polimerasa
ADN-dependiente en las eubacterias, respectivamente
los genes rpoA, rpoB, rpoC, rpoD, son clasificados en
diferentes grupos que comprenden los genes que codifican para unas
proteínas constitutivas de unas subunidades ribosómicas o para
unas enzimas implicadas en la replicación y la reparación del genoma
[Yura y Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13:
59-97]. Algunos autores han mostrado que las
secuencias de los genes rpoB y rpoC podían ser
utilizadas a fin de construir unos árboles filogenéticos (Rowland
et al. Biochem. Soc. Trans (1992) 21: 40S) permitiendo
separar las diferentes ramificaciones y subramificaciones entre los
reinos vivientes.
El diagnóstico de la enfermedad se realiza
actualmente mediante la observación, después de la coloración, de
frotis microscópicos obtenidos de la biopsia o por amplificación y
secuenciado de la herramienta gen universal 16S ARNr (Relman et
al., op. citado).
Sin embargo, el gen 16S es un gen medianamente
discriminante para la identificación de las bacterias. Además, es
necesario disponer de varias dianas moleculares de identificación de
las bacterias, en particular para paliar los problemas de
contaminación molecular.
Por otra parte, esta bacteria ha sido aislada y
cultivada por primera vez en unos sistemas celulares en el
laboratorio de los inventores [Raoult D. et al. (2000) N.
Engl. J. Med. 342:620 y WO 00/58440] a partir de la válvula
cardiaca extraída de un paciente que presenta una endocarditis con
hemocultivo negativo (cepa Twist).
\newpage
Los inventores ya han descrito en el documento
WO-A-00/58440 un fragmento de 612
bases del gen rpoB de la bacteria Thropheryma
whippelii que corresponde a la SEC ID nº 3 a partir de la que
habían determinado dos secuencias nucleotídicas específicas del gen
rpoB de la bacteria Thropheryma whippelii que se
pueden utilizar como iniciadores de amplificación específicos y
sondas de detección específicas de la especie Thropheryma
whippelii.
Sin embargo las técnicas descritas en el
documento WO-A-00/58440 no habían
permitido en cambio obtener la secuencia completa del gen
rpoB de Thropheryma whippelii.
Un objetivo de la presente invención es
suministrar unos fragmentos adicionales del gen rpoB, en
particular la secuencia completa del gen rpoB de
Thropheryma whippelii; todavía más particularmente, unas
secuencias que presentan una mayor especificidad de detección que
las secuencias extraídas de los fragmentos SEC ID nº 3 descritas en
el documento WO-A-00/58440.
Varias tentativas para alargar las secuencia SEC
ID nº 3 con unos iniciadores consensuados producidos por el gen
rpoB de otras bacterias y unos iniciadores específicos
desarrollados por los inventores (SEC ID nº 13, 15 y 17) sólo han
permitido alargar la secuencia hasta la obtención de la secuencia
SEC ID nº 4 de 2750 Pb descrita continuación, pero no han
permitido obtener después la secuencia completa del gen. Los
inventores han desarrollado una serie de iniciadores específicos
para aplicar la técnica denominada "marcha sobre el genoma"
("Genome walker" descrita en Siebert et al Nucleic Acids
Research 23: 1087-1088, 1995) a partir de la
determinación de una serie de iniciadores de amplificación
específica, a saber los iniciadores de amplificación identificados
a continuación como SEC ID nº 5 a 8. Estos diferentes iniciadores de
amplificación han permitido poco a poco obtener unos fragmentos
cada vez más extensos a partir de la SEC ID nº 4, hasta obtener la
secuencia completa SEC ID
nº 9.
nº 9.
La presente invención tiene por lo tanto como
objeto la secuencia completa del gen rpoB de la bacteria
Thropheryma whippelii constituida por la secuencia SEC ID nº
9. La secuencia completa del gen rpoB ha sido determinada
por la combinación de dos técnicas, la amplificación enzimática y el
secuenciado automático directo con unos iniciadores consensuados
entre un gran número de otras bacterias, de género y especies
diferentes por un lado; y por secuenciado automático directo a
partir de los productos de amplificación obtenidos después de la
aplicación de la técnica Genome Walker (marcha sobre el genoma) al
ADN extraído de la primera cepa Twist de Thropheryma
whippelii, por otro lado. Esta última técnica consiste en
marchar a lo largo del gen a partir de un primer fragmento conocido
realizando un banco parcial del ADN cromosómico de la bacteria
estudiada. Esta técnica, que será descrita más adelante, requiere
una cantidad de ADN cromosómico bacteriano que sólo puede ser
obtenido después de la extracción de dicho ADN a partir de un
cultivo bacteriano puro y supone por lo tanto la disponibilidad de
un aislado en cultivo. Es la disponibilidad de este aislado y la
determinación de los diferentes iniciadores de amplificación SEC ID
nº 5 a 8 a partir de la SEC ID nº 4 los que han permitido la
aplicación con éxito de la técnica de marcha sobre el genoma para la
determinación de la secuencia competa del gen rpoB en una
cepa Twist de la bacteria Thropheryma whippelii.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
asimismo a unas secuencias de ácidos nucléicos de la especie
Thropheryma whippelii, cuya secuencia nucleotídica está
comprendida en la SEC ID nº 9 del gen rpoB de dicha bacteria
apuntada más arriba y no comprendida por entero en la SEC ID nº 3, o
una secuencia complementaria de dicha secuencia nucleotídica.
En efecto, a partir de la secuencia completa SEC
ID nº 9, los inventores han determinado una secuencia SEC ID nº 10
de una especificidad mayor con respecto al gen rpoB de la
Thropheryma whippelii fuera de la zona correspondiente a la
SEC ID nº 3, a partir de la que han podido determinar dos secuencias
particulares específicas que enmarcan un fragmento de
aproximadamente 500 pares de bases, a saber las secuencias SEC ID
nº 11 y 12 que confieren una fiabilidad óptima para la detección
específica de la bacteria Thropheryma whippelii por
amplificación y secuenciado del producto de amplificación o por
hibridación como sonda de detección.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es un oligonucleótido monocatenario seleccionado de entre los
oligonucleótidos que tienen una secuencia de al menos 10 motivos
nucleotídicos consecutivos incluida en una secuencia seleccionada
de entre:
- -
- la secuencia SEC ID nº 9 y no enteramente comprendida en la secuencia SEC ID nº 3 y preferentemente no comprendida en la SEC ID nº 3, y
- -
- preferentemente una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12, y
- -
- las secuencias complementarias de estos oligonucleótidos.
Un oligonucleótido más particularmente preferido
tiene una secuencia seleccionada de entre las secuencias completas
SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias.
\newpage
La presente invención tiene asimismo por objeto
un oligonucleótido que presenta una secuencia seleccionada de
entre:
- -
- las secuencias de al menos 10 nucleótiodos consecutivos incluidas en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 5 a 8 y SEC ID nº17, y sus secuencias complementarias, y
- -
- preferentemente, dichas secuencias SEC ID nº 5 a 8 y SEC ID nº 17 completas y sus secuencias complementarias.
En particular los oligonucleótidos según la
presente invención poseen al menos 10 motivos nucleotídicos tales
como los descritos anteriormente y a lo sumo 100, preferentemente a
lo sumo 50 motivos. Más particularmente, un oligonucleótido según
la presente invención posee preferentemente de 12 a 35 motivos, mas
preferentemente aún de 18 a 22.
Las secuencias nucleotídicas según la invención
pueden ser preparadas por síntesis química utilizando las técnicas
sobradamente conocidas por el experto en la materia y que son
descritas por ejemplo en el artículo de Itakura K. et al.
[(1984) Annu. Rev. Biochem. 53; 323].
Una primera aplicación de un oligonucleótido
según la invención es su utilización como sonda de especie para la
detección, en una muestra biológica, de bacterias de las especie
Thropheryma whippelii. En la continuación de la descripción,
una sonda de la invención de este tipo será denominada sonda de
especie.
Preferentemente, una sonda de especie según la
invención está constituida por un oligonucleótido seleccionado de
entre:
- -
- los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluida en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº11 y SEC ID nº12, y sus secuencias complementarias, y
- -
- los oligonucleótidos que tienen unas secuencias nucleotídicas seleccionadas de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12, y sus secuencias complementarias.
Las sondas según la invención pueden ser
utilizadas, con fines de diagnóstico, en la búsqueda de la presencia
o de la ausencia de un ácido nucleico diana en una muestra, según
todas las técnicas de hibridación conocidas y en particular las
técnicas de depósito puntual sobre filtro, denominadas
"DOT-BLOT" [Maniatis et al. (1982)
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], las técnicas de
transferencia del ADN denominadas"SOUTHERN BLOT" [Southerm E.
M., J. Mol. Biol. (1975) 98:503], las técnicas de transferencia de
ARN denominadas "NORTHERM BLOT" o las técnicas denominadas
"sándwich", con una sonda de captura y/o una sonda de
detección, siendo capaces dichas sondas de hibridarse con dos
regiones diferentes del ácido nucleico diana, y siendo al menos una
de dichas sondas (generalmente la sonda de detección) capaz de
hibridarse con una región de la diana que es específica de la
especie, entendiéndose que la sonda de captura y la sonda de
detección deben tener secuencias nucleotídicas al menos
parcialmente
diferentes.
diferentes.
Se puede obtener el ácido nucleico que se ha de
detectar (diana) después de una amplificación clásica, es decir
dando el ADN, obtenido después de la amplificación por PCR, o del
ARN, obtenido después de una amplificación transcripcional por TAM,
NASBA, 3SR, etc... En el caso de la detección de una diana del tipo
ácido nucleico de doble rama, conviene proceder a la
desnaturalización de éste último antes de realizar el procedimiento
de detección. El ácido nucleico diana puede ser obtenido por
extracción según los métodos conocidos de los ácidos nucleicos de
una muestra a examinar. Se puede realizar la desnaturalización de un
ácido nucleico de doble rama mediante los métodos conocidos de
desnaturalización química, física o enzimática, y en particular por
calentamiento a una temperatura apropiada, superior a 80ºC.
Para realizar las técnicas de hibridación
citadas anteriormente, y en particular las técnicas "sándwich",
se inmoviliza una sonda de la invención, denominada sonda de
captura sobre un soporte sólido, y se marca otra sonda de la
invención, denominada sonda de detección, con un agente marcador.
Los ejemplos de soporte y de agente marcador son tales como los
definidos anteriormente.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de determinación de la presencia o de la ausencia de una bacteria
Tropheryma whippelii, en una muestra que contiene o es
susceptible de contener ácidos nucleicos de al menos una bacteria
de este tipo, que comprende las etapas que consisten en poner en
contacto dicha muestra con al menos una sonda de especie de la
invención, y en determinar a continuación de forma conocida en sí
misma la formación o la ausencia de formación de un complejo de
hibridación entre dicha sonda y el ácido nucleico de la
muestra.
muestra.
Ejemplos de detección de formación o de ausencia
de formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda y el
ácido nucleico comprenden las técnicas
"DOT-BLOT","SOUTHERN BLOT" y
"sándwich".
\newpage
Según una realización particular de este
procedimiento, para la determinación de la presencia o de la
ausencia de una especie Tropheryma whippelii, se utilizan
varias sondas de especie de la invención, entendiéndose que dichas
sondas son capaces de hibridarse con una regiones que no se
superponen de un ácido nucleico que corresponde al gen rpoB
de Tropheryma whippelii.
De forma ventajosa, se inmoviliza una sonda de
especie sobre un soporte sólido, y se marca una segunda sonda por
un agente marcador, denominado sonda de detección, no siendo
necesariamente ésta una sonda de especie.
Otra aplicación de un oligonucleótido de la
invención es su utilización como iniciador nucleotídico que se
puede utilizar en la síntesis de un ácido nucleico de Tropheryma
whippelii en presencia de una polimerasa mediante un
procedimiento conocido en sí mismo, en particular en unos métodos de
amplificación que utilizan una síntesis de este tipo en presencia
de una polimerasa (PCR, RT-PCR, etc.). En
particular, se puede utilizar un iniciador de la invención para
la transcripción inversa específica de una secuencia de ARN
mensajero de Tropheryma whippelii para obtener la secuencia
de ADN complementaria correspondiente. Una transcripción de este
tipo puede constituir el primer estadio de la técnica
RT-PCR, siendo el siguiente estadio la amplificación
por PCR del ADN complementario obtenido. También se pueden utilizar
iniciadores de la invención para la amplificación específica por
reacción de polimerización en cadena de la secuencia total del ADN
del gen rpoB de Tropheryma whippelii.
Según un caso particular, dicho iniciador, que
comprende un oligonucleótido de la invención, comprende además la
secuencia sentido o antisentido de un promotor reconocido por una
ARN polimerasa (promotores T7, T3, SP6 por ejemplo [Studier FW, BA
Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113]: dichos iniciadores se pueden
utilizar en unos procedimientos de amplificación de ácido nucleico
que hacen intervenir una etapa de transcripción, tales como, por
ejemplo, las técnicas NASBA o 3SR [Van Gemen B. et al.
Abstract MA 1091, 7th Internacional Conference on AIDS (1991)
Florence, Italy].
Mas particularmente, un objeto de la invención
es un iniciador nucleotídico que se puede utilizar para el
secuenciado total o parcial del gen rpoB de una cepa
cualquiera de Tropheryma whippelii, preferentemente una
secuencia específica del gen rpoB de Tropheryma
whippelii. En particular, el iniciador nucleotídico se puede
utilizar para el secuenciado de un ácido nucleico amplificado. El
secuenciado es la obtención de la secuencia total o parcial del gen
rpoB por un procedimiento conocido en sí mismo, una
polimerización abortiva que utiliza los
di-desoxinucleótidos [Sanger F., Coulson AR (1975)
J. Mol. Biol. 94:441] o hibridaciones múltiples que utilizan los
chips de
ADN.
ADN.
Preferentemente, en una utilización como
iniciador para el secuenciado de una secuencia específica del gen
rpoB de Tropheryma whippelii, se utiliza un
oligonucleótido que está constituido por:
- -
- los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº11 y SEC ID nº12, y sus secuencias complementarias, y
- -
- los oligonucleótidos que tienen unas secuencias nucleotídicas seleccionadas de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12, y sus secuencias complementarias.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
asimismo un procedimiento de determinación de la presencia o de la
ausencia de una bacteria Thropheryma whippelii en una muestra
que contiene, o es susceptible de contener unos ácidos nucléicos de
al menos una bacteria de este tipo, caracterizado porque se realiza
una amplificación del ADN de la muestra con ayuda de dos
iniciadores según la invención y se compara la secuencia obtenida
con la secuencia SEC ID nº 9.
Más particularmente, se compara la secuencia del
producto de amplificación obtenido realizando previamente su
secuenciado.
Preferentemente, se realiza una amplificación
del ADN de la muestra con ayuda de los dos iniciadores SEC ID nº 11
y 12 y se compara la secuencia obtenida con la secuencia SEC ID nº
10.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de la siguiente exposición, dividida en dos
ejemplos, que se refieren a unos experimentos realizados con el
objetivo de realizar la invención y que son dados a título
puramente ilustrativo y explicativo.
La figura nº 1 representa las posiciones de los
iniciadores específicos y consensuales utilizados para la
determinación de los fragmentos sucesivos del gen completo
rpoB de la especie bacteriana Thropheryma
whippelii.
La figura nº 2 representa la visualización de
los productos de amplificación obtenidos con ayuda de los
iniciadores SEC ID nº 11 y 12 visualizados por coloración con
bromuro de etidio y después electroforesis sobre gel de agarosa del
ejemplo 2.
\newpage
Diferentes términos, utilizados en la
descripción y las reivindicaciones, son definidos a
continuación:
- -
- por "ácido nucleico extraído de bacterias" se debe entender o bien el ácido nucleico total, o bien el ADN genómico, o bien los ARN mensajeros; o bien el ADN obtenido a partir de la transcripción inversa de los ARN mensajeros; o bien los ARN ribosómicos;
- -
- un "fragmento nucleotídico" o un "oligonucleótido" son dos términos sinónimos que designan un encadenamiento de motivos nucleotídicos caracterizado por una secuencia informativa de ácidos nucleicos naturales (o eventualmente modificados) y susceptibles de hibridarse, como los ácidos nucléicos naturales, con un fragmento nucleotídico complementario o sensiblemente complementario, en unas condiciones predeterminadas de astringencia estricta. El encadenamiento puede contener unos motivos nucleotídicos con una estructura diferente a la de los ácidos nucléicos naturales. Un fragmento nucleotídico (o oligonucleotídico) puede contener por ejemplo hasta 100 motivos nucleotídicos. Contiene generalmente 10, en particular al menos 12 motivos nucleotídicos y puede ser obtenido a partir de una molécula de ácido nucleico natural y/o por recombinación genética y/o por síntesis química,
- -
- un motivo nucleotídico es derivado de un monómero que puede ser un nucleótido natural de un ácido nucleico cuyos elementos constitutivos son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada seleccionada de entre la adenina, la guanina, el uracilo, la citosina, la timina; o bien el monómero es un nucleótido modificado en uno al menos de los tres elementos constitutivos anteriores; como ejemplo, la modificación puede intervenir o bien a nivel de las bases, con unas bases modificadas tales como la inosina, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5-desoxiuridina o cualquier otra base modificada capaz de hibridación, o bien a nivel del azúcar, por ejemplo el reemplazo de al menos una desoxirribosa por una poliamida [Nielsen PE et al., Science (1991) 254; 1497-1500], o bien incluso a nivel del grupo fosfato, por ejemplo por reemplazo mediante ésteres seleccionados en particular de entre los difosfatos, los alquilfosfonatos y los fosforotioatos,
- -
- por "hibridación" se debe entender el proceso durante el cual, en unas condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, que tienen unas secuencias suficientemente complementarias, son susceptibles de asociarse mediante unos enlaces hidrógeno estables y específicos, para formar una doble rama. Las condiciones de hibridación son determinadas por la "astringencia", es decir por el rigor de las condiciones operatorias. La hibridación es tanto más específica cuanto mayor es la astringencia bajo la que ésta se realiza. La astringencia es función en particular de la composición en bases de un duplex sonda/diana, así como del grado de desaparejamiento entre dos ácidos nucléicos. La astringencia también puede ser función de unos parámetros de la reacción de hibridación, tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. La astringencia de las condiciones en las que una reacción de hibridación debe ser realizada, depende en particular de las sondas utilizadas. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas eventualmente en cada caso mediante experimentos de rutina. Por lo general, según la longitud de las sondas utilizadas, la temperatura para la reacción de hibridación se sitúa entre aproximadamente 20 y 65ºC, en particular entre 35ºC y 65ºC en una solución salina con una concentración de aproximadamente 0,8 a 1 M,
- -
- una "sonda" es un fragmento nucleotídico que comprende por ejemplo de 10 a 100 motivos nucleotídicos, en particular de 12 a 35 motivos nucleotídicos, que posee una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para formar un complejo de hibridación con un ácido nucleico que tiene, en este caso, una secuencia nucleotídica incluida o bien en un ARN mensajero, o bien en un ADN obtenido por transcripción inversa de dicho ARN mensajero, producto de la transcripción; se puede utilizar una sonda con fines de diagnóstico (en particular sondas de captura o de detección) o con fines terapéuticos,
- -
- una "sonda de captura" es inmovilizada o inmovilizable sobre un soporte sólido mediante cualquier medio apropiado, por ejemplo por covalencia, por adsorción, o por síntesis directa sobre un sólido. Algunos ejemplos de soportes comprenden las placas de microtitulación y los chips de ADN, o unas partículas magnéticas, como las descritas en el documento WO 6 A-99/35500,
- -
- una "sonda de detección" puede ser marcada mediante un agente marcador escogido por ejemplo entre los isótopos radioactivos, las enzimas, en particular las enzimas susceptibles de actuar sobre un sustrato cromógeno, fluorígeno o luminiscente (en particular la peroxidasa o una fosfatasa alcalina), los compuestos químicos cromóforos, los compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes, los análogos de las bases nucleotídicas y los ligandos tales como la biotina,
- -
- una "sonda de especie" es una sonda que permite la identificación de la especie de una bacteria,
- -
- un "iniciador" es una secuencia que comprende por ejemplo de 10 a 100 motivos nucleotídicos y que posee una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo en una técnica de amplificación tal como la PCR, en un procedimiento de secuenciado, en un método de transcripción, etc.
Ejemplo
1
Se ha determinado la secuencia completa del gen
rpoB de Tropheryma whippelii mediante la combinación
sucesiva de dos técnicas, la amplificación enzimática y el
secuenciado directo automático que utiliza en una primera etapa
unos iniciadores conseso y a continuación en una segunda etapa la
marcha sobre el gen mediante la técnica de "Genome
Walker".
\vskip1.000000\baselineskip
Se han determinado los iniciadores consensuados
que han permitido la obtención de un primer fragmento de la
secuencia Tropheryma whippelii a partir de la comparación de
las secuencias rpoB de Bacillus subtilis, Bartonella
henselae, Borrelia burgdorferi, Buchnera aphidicola, Chlamydia
peneumoniae, Chlamydia trachomatis, Coxiella bumetii, Escherichia
coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella
pneumophila, Mycobacterium leprae, Mycobacterium smegmatis,
Mycobactyerium tuberculosis, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma
genitalium, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis,
Pseudomonas putida, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi,
Samanolla enterica Typhimurium, Spiroplasma citri, Staphylococcus
aureus, Synechocystis spp., Thermotoga maritima, Treponema pallidum
y el Human Granulocytic Ehrlichiosis agent. Estas secuencias han
sido escogidas por la alineación de las secuencias del ADN del gen
rpoB de estas otras bacterias diferentes y seleccionando
las que estaban mas conservadas con la hipótesis de que también
estaban presentes en el gen rpoB de Tropheryma
whippelii. Los iniciadores utilizados tenían como secuencia:
- SEC ID nº1 = 5'-TIA TGG GII CIA AIA TGC A- 3' (posición 1967-1985)
- SEC ID nº2 = 5'-GCC CAI CAT TCC ATI TCI CC- 3' (posición 3198-3217, inversa), en las que I representa la inopina.
La numeración de las posiciones mencionadas
anteriormente y las que se mencionarán a continuación corresponden
a unas posiciones sobre la secuencia completa SEC ID nº9.
Estos iniciadores han permitido la amplificación
y después el secuenciado de un fragmento de 1400 pares de bases de
las cuales 612 pares han sido secuenciados con ayuda de los
iniciadores SEC ID nº1 y SEC ID nº2 y corresponde a la SEC ID nº 3
(posiciones 2063-2673) cuya secuencia es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El secuenciado de este primer fragmento F1 ha
permitido determinar unos iniciadores específicos de amplificación
que, combinados en unas reacciones de amplificación PCR con unos
iniciadores consensuales degenerados, han permitido alargar la
secuencia SEC ID nº 3 sobre sus extremos 3' y 5' y han permitido
obtener otros tres fragmentos que cabalgan F2, F3 y F4 para una
longitud total de 2.750 pares de bases que corresponden a SEC ID
nº4. Se indican la posición de los iniciadores y de los fragmentos
en la figura nº1. El fragmento F3 (posiciones 1248 a 2163) ha sido
obtenido mediante la aplicación de los iniciadores SEC ID nº13
(iniciador específico; posiciones 2145 a 2188):
5'-CGG AAA CAT CCC CCA CAAT- 3' y SEC ID nº14
(iniciador consensuado; posiciones 1248 a 1264):
5'-ACC GAC GAT ATC GAC CA- 3'; el fragmento F2
(posiciones 2592 a 3229) ha sido obtenido mediante la aplicación de
los iniciadores SEC ID nº 15 (iniciador específico; posiciones 2592
a 2610): 5'-TTG GTA AGG TGA CCC CAA A- 3' y SEC ID
nº 16 (iniciador consensuado: posiciones 3213 a 3229)
:5'-GGT AAA GCG CAG TTC GG- 3'; el fragmento F4
(posiciones 484 a 1331) ha sido obtenido mediante la aplicación de
los iniciadores SEC ID nº17 ((iniciador específico; posiciones 1315
a 1331): 5'-CCA GCC CGG AGC TGG TT- 3' y SEC ID nº
18 (iniciador consensuado: posiciones 484 a 498)
:5'-TTT CAT TTG CCA AGC- 3';
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes tentativas para alargar esta
secuencia mediante la técnica de los iniciadores consensuados han
fracasado seguidamente no permitiendo proseguir el secuenciado del
gen según esta aproximación. En particular se han testado sin éxito
los siguientes iniciadores consensuados seleccionados de entre las
secuencias mejor conservadas de los genes rpoB de otras
bacterias filogenéticamente cercanas a la Tropheryma whippelii;
Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium
tuberculosis, Bacillus licheniformis y Salmonella enterica
Typhimurium: Balichtf: 5' -GGT AAA GCG CAG TTC
GG-3' (SEC ID nº19);Balich 460f: 5' -GTC ATT CCA
AAC CGT GG-3' (SEC ID nº20);Balich37f: 5' -CTA TGC
ACG CAT TAG CGA-3' (SEC ID nº21); Myco12F: 5'
-GAA CCG CTT GAG GTT C-3' (SEC ID nº22);
Myco43F: 5' -ACC TTC ATC ATC AAC GG-3' (SEC
ID nº23); Myco8R: 5' -GAT TCG TTG CGG
GACA-3' (SEC ID nº24).
\vskip1.000000\baselineskip
Este fracaso, que se produce sobre la cepa
Tropheryma whippelii en cultivo explica que habría sido
imposible obtener a fortiori la totalidad de la secuencia
del gen rpoB del Tropheryma whippelii a partir de
unas muestras clínicas que contienen la bacteria Tropheryma
whippelii. Se ha aplicado una segunda técnica denominada de
"marcha sobre el genoma" seguidamente con la finalidad de
completar la secuencia de Tropheryma whippelii rpoB en la
dirección 3' y en la dirección 5'. Esta técnica ha sido descrita
[(1995) Siebert et al. Nucl. Acids Res. 23:
1087-1088] y consiste en realizar un banco del ADN
genómico de la bacteria y después amplificar unos fragmentos de
este banco con ayuda de unos iniciadores universales independientes
de la secuencia buscada y de unos iniciadores específicos de la
secuencia buscada. Después de haber extraído una gran cantidad de
ADN (del orden de un microgramo) purificado a partir de la cepa
bacteriana Tropheryma whippelii Twist descrita en el
documento WO 00/58440, el ADN bacteriano es fragmentado por
digestión enzimática con ayuda de endonucleasas de restricción y
los fragmentos así obtenidos son unidos por uno de sus dos extremos
a unos oligonucleótidos sintéticos, denominados adaptadores
suministrados en un estuche comercializado (Genome Walker kit®,
Clontech Laboratories, Palo Alto, California). Unos oligonucleótidos
complementarios de unos adaptadores, también suministrados en el
mismo estuche de laboratorio, constituyen entonces unos iniciadores
de amplificación para la técnica de amplificación para la técnica de
amplificación enzimática en cadena ("polymerase Chain
reaction", PCR). Estos oligonucleótidos constituyen por lo tanto
unos iniciadores universales que son utilizados en esta técnica
independientemente de la secuencia del ADN bacteriano estudiado. Con
la finalidad de realizar las reacciones de PCR, un segundo
oligonucleótido debe ser incorporado como iniciador de
amplificación en las reacciones PCR. Este oligonucleótido iniciador
debe responder a varios criterios y la determinación de su
secuencia constituye por lo tanto un aspecto de la invención: (1) la
secuencia de este oligonucleótido es complementaria de la SEC ID nº
4 (2) este oligonucleótido está posicionado a una cincuentena de
bases del extremo de la SEC ID nº 4 (3) este oligonucleótido tiene
una longitud superior a 20 bases. La utilización de un primer
nucleótido que presenta estas características que corresponden a la
secuencia SEC ID nº5 = 5'-CTT ATC TCG CCC GTA TCA
TG-3' (posición 627-646, inversa) ha
permitido obtener un fragmento F6 (posición 146 a 646) de 500
pares de bases. Sobre la base de la secuencia obtenida de esta
forma, la utilización de un segundo oligonucleótido específico que
corresponde a la secuencia SEC ID nº 6 = 5'- CCA GTC AAA ACT ATC
GAG CTG CAA A-3' (posición 307-331,
inversa) ha permitido la amplificación de un fragmento F8 de 1.100
pares de bases que contiene el extremo 3' del gen rpoB (posiciones 1
a 331) y que se extienden corriente abajo de este extremo. Por otra
parte, sobre la base de la secuencia SEC ID nº 4, se ha alargado la
secuencia SEC ID nº4 en el sentido 5' mediante la utilización de un
oligonucleótido SEC ID nº 7: 5' TTC TCT ATG ATG GCC GCA C- 3'
(posición 3168-3187) de un fragmento F5 (posiciones
3168 a 3668) de 500 pares de bases. Finalmente, sobre la base de
este último fragmento, se ha determinado un oligonucleótido
específico de secuencia SEC ID nº 8: 5'-GCA GCG CTT
CGG AGA GAT GGA G-3' (posición
3357-3379) que ha permitido obtener un fragmento F7
de 1500 pares de bases que contiene el extremo 5' del gen
rpoB (posiciones 3357 a 3657) y que se extiende más allá de
este extremo. Esta técnica de marcha sobre el genoma supone la
obtención de una gran cantidad de ADN cromosómico de Tropheryma
whippelii y su aplicación ha sido posible mediante la obtención
de la cepa Twist de la bacteria Tropheryma whippelii y la
extracción en gran cantidad de ADN a partir de dicha cepa. La
obtención de una cepa aislada y cultivada de Tropheryma
whippelii era necesaria para la determinación de la secuencia
integra de rpoB en la bacteria Tropheryma
whippelii.
La amplificación del banco genómico con ayuda de
poligonucleótidos SEC ID nº 5 a SEC ID nº 8 ha permitido alargar en
los sentidos 3' y 5' la secuencia SEC ID nº 4 con la finalidad de
obtener la secuencia completa del gen rpoB de Tropheryma
whippelii cepa Twist. La secuencia completa del gen rpoB de
Tropheryma whippelii obtenida por aplicación de estas
técnicas de amplificación consensual y de marcha sobre el genoma
depositada en el GenBank como número de acceso (accession number)
AF243072, corresponde a la SEC ID nº 9.En total, esta secuencia SEC
ID nº 9 ha sido obtenida según el esquema de la figura nº 1 que
precisa la posición de los iniciadores consensuales y unos
fragmentos sucesivos obtenidos:
En la secuencia SEC ID nº 9 representada a
continuación, la secuencia SEC ID nº4 está subrayada, y la secuencia
en negrita son por orden:
- SEC ID nº 6 (secuencia complementaria),
- SEC ID nº 5 (secuencia complementaria),
- SEC ID nº 11 (secuencia idéntica),
- SEC ID nº 12 (secuencia complementaria),
- SEC ID nº 7 (secuencia idéntica),
- SEC ID nº 8 (secuencia idéntica),
Esta secuencia mide 3.657 pares de bases y
presenta un contenido en citosina más guanosina de 50,4%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se han determinado dos iniciadores específicos a
partir de la secuencia ID nº 9 de manera que encuadren de forma
específica un fragmento de 507 pares de bases del gen rpoB
de Tropheryma whippelii de secuencia SEC ID nº 10 = 5'-
TTGAGCGCACGCCGGAAAAAAACAGTGAAAAGGATCTTTTTTCGGGCAGAATAATCCCCGCTCGCGGTG
CTTGGCTAGAATTCGAAGTTGACAGGCATGACCAGCTTGGCGTTAGGGTTGACAGGAAGCGCAGGCAGC
CGGTTATTTTCTTTCTGAGAGCAATTGGCATGACTGATGATGAGATCAGGGATGCATTTGGCGAGTTTGAA
CAATAAGCGTCCAGCACGAAAAGAATATTGGGCTGTCCAGAGATGACGCGCTCCGGGAAATATACCGTCG
CGTTCGTCCGGGGGAGCAGGCATCGGCTGAGGCTGGGCGTGCACTCTTAGAGAATTTTTACTTTACCAGC
AGACGTTTTGACCTGCAAGGGTTGGAAGGTACAAAGTAAATCGCAAACTCGGTGTTGATGTTGATCCAAC
TCGGATGGTTCTTACGAGGTCGGATATTATCGCAACAATTCGTTATCTCGCGGCCTTGCATCTCGGTTTCTC
CGAGGTTGCGGTGC - 3'
CTTGGCTAGAATTCGAAGTTGACAGGCATGACCAGCTTGGCGTTAGGGTTGACAGGAAGCGCAGGCAGC
CGGTTATTTTCTTTCTGAGAGCAATTGGCATGACTGATGATGAGATCAGGGATGCATTTGGCGAGTTTGAA
CAATAAGCGTCCAGCACGAAAAGAATATTGGGCTGTCCAGAGATGACGCGCTCCGGGAAATATACCGTCG
CGTTCGTCCGGGGGAGCAGGCATCGGCTGAGGCTGGGCGTGCACTCTTAGAGAATTTTTACTTTACCAGC
AGACGTTTTGACCTGCAAGGGTTGGAAGGTACAAAGTAAATCGCAAACTCGGTGTTGATGTTGATCCAAC
TCGGATGGTTCTTACGAGGTCGGATATTATCGCAACAATTCGTTATCTCGCGGCCTTGCATCTCGGTTTCTC
CGAGGTTGCGGTGC - 3'
Se ha realizado in situ la determinación
de estos dos iniciadores SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 con el fin de
respetar las limitaciones propias de los iniciadores de
identificación molecular. El enunciado de estas limitaciones forma
parte integrante del proceso inventivo por lo que no está disponible
en la actualidad en la bibliografía científica: (1) longitud de
18-22 pares de bases (2) secuencias de los dos
iniciadores que presentan un temperatura de fusíón próxima (3)
secuencias de los dos iniciadores que no permiten la autohibridación
ni la complementariedad (4) secuencia enmarcada por estos dos
iniciadores específicos de la bacteria Tropheryma
whippelii; esta condición es verificada después del alineación
de la SEC ID nº 9 con el conjunto de las secuencias de los genes
bacterianos rpoB disponibles en los bancos de datos
informáticos; (5) secuencia enmarcada por estos dos iniciadores que
presentan una longitud óptima de aproximadamente 500 pares de bases;
esta longitud óptima que corresponde a un compromiso entre la
búsqueda de una zona de identificación lo más larga posible que
permita por lo tanto la mayor discriminación posible entre una
secuencia cualquiera salida de la SEC ID nº 9 y el conjunto de
secuencias rpoB bacterianas homologas conocidas y la búsqueda
de una zona de identificación lo mas corta posible con la finalidad
de aumentar lo mas posible la sensibilidad de detección molecular.
Es en efecto conocido que existe una relación inversa entre la
sensibilidad de detección y la longitud de la secuencia de ADN
bacteriano a detectar en una muestra. Finalmente, el tamaño de 500
pares de bases corresponde a la longitud media de la secuencia
obtenida después de un paso sobre un secuenciador automático
disponible actualmente. Estos dos iniciadores están localizados
respectivamente en la posición 713-745 y
1181-1200 de la secuencia SEC ID nº 9 del gen
rpoB de la bacteria Tropheryma whippelii. La
secuencia de estos dos iniciadores es la siguiente:
- SEC ID nº 11= 5'-TTG AGC GCA CGC CGG AAA AA-3'
- SEC ID nº 12= 5'-GCA CCG CAA CCT CGG AGA AA-3'. (iniciador inverso complementario)
La región del gen rpoB de la bacteria
Tropheryma whippelii enmarcada por estos dos iniciadores,
región denominada SEC ID nº 10 (posición 713-1200)
presenta el mayor nivel de discriminación, a saber un porcentaje de
homología inferior a 70% con respecto a las otras regiones del mismo
gen, incluso con respecto a la región SEC ID nº 3 que presenta un
porcentaje de homología de 75 a 85%.
Es importante mantener la proporción de
discriminación lo más alta posible con la finalidad de tener en
cuenta el margen de error introducido durante las manipulaciones de
las muestras en la práctica de laboratorio de diagnóstico y que
resultan de los errores de amplificación cometidos por las
polimerasas termoestables, en particular la Taq polimerasa y
de los errores de secuenciado. Los errores introducidos de esta
forma son del orden del 0,5%.
El gen rpoB ha sido amplificado mediante
la técnica PCR que utiliza 35 ciclos de amplificación que comprenden
cada uno una de las fases de desnaturalización de 94ºC durante 30
segundos, una fase de hibridación de los iniciadores SEC ID nº11 y
12 a 58ºC durante 30 segundos y una fase de elongación a 72ºC
durante 60 segundos. El producto de amplificación es visualizado
después de la coloración mediante bromuro de etidio (Figura 2). Las
bacterias control: Mycobacterium avium, Mycobacterium
tuberculosis, Nocardia otitidiscaviarium, Escherichia coli,
Staphyloccocus epidermidis, Corynebacterium amycolatum no han
sido amplificadas por los oligonucleótidos iniciadores SEC ID nº 11
y 12, demostrando la especificidad de estos iniciadores sobre unas
especies bacterianas filogenéticamente próximas de la Tropheryma
whippelii. Esta técnica ha sido aplicada a la detección de la
presencia o de la ausencia del gen rpoB de Tropheryma
whippelii en diez biopsias de yeyuno obtenidas de diez
pacientes diferentes de las que tres biopsias habían mostrado
contener anteriormente ADN de Tropheryma whippelii de forma
independiente y de las que siete se habían mostrado exentas del ADN
de Tropheryma whippelii. Se ha aplicado de forma ciega esta
técnica después del codificado de las diez muestras, no conociendo
los experimentadores los códigos y no conociendo por lo tanto la
calidad de las muestras trabajadas. Esta técnica ha permitido
detectar el 100% de los verdaderos positivos y el 100% de los
verdaderos negativos. Los productos de amplificación obtenidos para
las tres biopsias positivas han sido secuenciados y las tres
secuencias obtenidas tenían 100% de homología con la SEC ID nº
10.
En la figura 2 están representados los productos
de amplificación PCR obtenidos a partir de diez biopsias de yeyuno
tomadas de unos pacientes que presentan una enfermedad de Whipple
confirmada (columnas D, I y K) y que no presentan una enfermedad de
Whipple (columnas C, E, F, G, H, J y L.). Las columnas A y N
representan el marcador de peso molecular, las columnas B y M
corresponden a los testigos de amplificación negativos (agua
estéril). Los productos de amplificación son obtenidos después de
incorporar los iniciadores SEC ID nº 11 y nº 12 según la invención
y son visualizados por coloración con bromuro de etidio después de
la electroforesis sobre gel de agarosa.
<110> Université de la Méditerranée
(Aix-Marseille II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencia del gen rpoB de la
bacteria Tropheryma whippelii y oligonucleótido para el
diagnóstico molecular de la enfermedad de Whipple
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> H52439-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptnatgggnnc naanatgca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccancatt ccatntcncc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 610
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tropheryma whippelii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2750
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<212> ADN
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<213> Tropheryma whippelii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipcttatcacgc ccgtatcatg
\hfill20
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<210> 6
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipccagtcaaaa ctatcgagct gcaaa
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctctatga tggccgcac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagcgcttc ggagagatgg ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3761
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tropheryma whippelii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 507
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tropheryma whippelii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgagcgcac gccggaaaaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaccgcaac ctcggagaaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaaacatc ccccacaat
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgacgata tcgacca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggtaaggt gaccccaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaaagcgc agttcgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
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<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagcccgga gctggtt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttcatttgc caagc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaaagcgc agttcgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcattccaa accgtgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgcacgc attagcga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaccgcttg aggttc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccttcatca tcaacgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattcgttgc gggaca
\hfill16
Claims (14)
1. Secuencia total del gen rpoB de la
bacteria Tropheryma whippelli, caracterizada porque
está constituida por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9.
2. Oligonucleótido cuya secuencia nucleotídica
consiste en una secuencia del gen rpoB de la bacteria
Tropheryma whippelli de al menos 10 nucleótidos, comprendida
en la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9 y no comprendida en su
integridad en la secuencia SEC ID nº 3 o una secuencia
complementaria de dicha secuencia.
3. Oligonucleótido cuya secuencia es una
secuencia específica de la bacteria Tropheryma whippelli, que
comprende una secuencia del gen rpoB de la bacteria
Tropheryma whippelli de al menos 10 nucleótidos, comprendida
en la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9 y no comprendida en su
integridad en la secuencia SEC ID nº 3 o una secuencia
complementaria de dicha secuencia.
4. Oligonucleótido según la reivindicación 2 ó
3, caracterizado porque presenta una secuencia nucleotídica
de al menos 10 motivos nucleotídicos consecutivos, incluida en una
de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus
secuencias complementarias.
5. Oligonucleótido según la reivindicación 2 ó
3, caracterizado porque presenta una secuencia seleccionada
de entre:
- las secuencias de al menos 10 nucleótidos
consecutivos incluidos en una secuencia seleccionada de entre las
secuencias SEC ID nº 5 a 8, y SEC ID nº 17 y sus secuencias
complementarias.
6. Oligonucleótido según la reivindicación 4 ó
5, caracterizado porque presenta una secuencia seleccionada
de entre las secuencias completas SEC ID nº 5 a 8, y SEC ID nº 11,
12 y 17 y sus secuencias complementarias.
7. Sonda para la detección, en una muestra
biológica, de bacterias de la especie Tropheryma whippelli,
caracterizada porque comprende un oligonucleótido según una
de las reivindicaciones 2 a 6.
8. Sonda según la reivindicación 7,
caracterizada porque está constituida por un oligonucleótido
seleccionado de entre:
- -
- los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias, y
- -
- los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias.
9. Procedimiento para determinar la presencia
o la ausencia de una bacteria de la especie Tropheryma
whippelli en una muestra que contiene o es susceptible de
contener ácidos nucléicos de al menos una bacteria de este tipo,
caracterizado porque se pone en contacto dicha muestra con al
menos una sonda según una de las reivindicaciones 7 u 8, y se
determina a continuación la formación o la ausencia de formación de
un complejo de hibridación entre dicha sonda y el ácido nucleico de
la muestra.
10. Iniciador nucleotídico que se puede utilizar
para la síntesis de una secuencia específica del gen rpoB de
Tropheryma whippelii en presencia de una polimerasa,
caracterizado porque comprende un oligonucleótido según una
de las reivindicaciones 2 a 6.
11. Iniciador según la reivindicación 10,
caracterizado porque está constituido por un oligonucleótido
seleccionado de entre:
- -
- los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias, y
- -
- los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias.
12. Procedimiento para determinar de la
presencia o de la ausencia de una bacteria de la especie
Tropheryma whippelii en una muestra que contiene, o es
susceptible de contener, ácidos nucléicos de al menos una bacteria
de este tipo, caracterizado porque se realiza una
amplificación del ADN de la muestra con ayuda de dos iniciadores
según una de las reivindicaciones 10 u 11 y se compara la secuencia
obtenida con la secuencia SEC ID
nº 9.
nº 9.
\newpage
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque se compara la secuencia del producto de
amplificación obtenido realizando previamente su secuenciado.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, caracterizado porque se realiza una amplificación del ADN
de la muestra con ayuda de los dos iniciadores SEC ID nº 11 y 12 y
se compara la secuencia obtenida con la secuencia SEC ID nº 10.
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