ES2285521T3

ES2285521T3 - Composiciones de goma de mascar que comprenden monatina y procedimientos para la preparacion de las mismas.

Info

Publication number: ES2285521T3
Application number: ES04781075T
Authority: ES
Inventors: Paula M. Hicks; Timothy W. Abraham; Douglas C. Cameron; Melanie J. Goulson; Michael G. Lindley; Sara C. Mcfarlan; James R. Millis; John Rosazza; Lishan Zhao; David P. Weiner
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2004-08-16
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2024-08-16
Also published as: AU2004264949A1; KR20060066090A; US20050170041A1; BRPI0413581A; WO2005016022A1; JP2007502117A; AU2004264949B2; CN1852661B; MXPA06001663A; KR101194132B1; DE602004006141D1; EP1653810A1; JP2012095663A; EP1653810B1; ATE360370T1; DE602004006141T2; CN1852661A

Abstract

Composición de goma de mascar que comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende monatina o una sal de la misma.

Description

Composiciones de goma de mascar que comprenden monatina y procedimientos para la preparación de las mismas.

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el derecho de la solicitud de la patente provisional US nº 60/495.191 presentada el 14 de agosto de 2003.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas composiciones de goma de mascar, incluyendo las gomas funcionales o las gomas de globo, que comprenden monatina y a los procedimientos para preparar dichas composiciones. La presente invención se refiere asimismo a las composiciones de goma de mascar que comprenden un estereoisómero específico de monatina, a las mezclas específicas de estereoisómeros de monatina y/o a la monatina producida mediante una ruta biosintética in vivo (p. ej., dentro de las células) o in vitro.

Antecedentes

La utilización de edulcorantes de alta densidad sin calorías está aumentando debido a la inquietud por la salud a raíz de la obesidad en la infancia, la diabetes de tipo II y las enfermedades relacionadas. Por lo tanto, existe una demanda de edulcorantes que presentan un dulzor significativamente mayor que el de los edulcorantes convencionales, como por ejemplo un azúcar granulado (sacarosa). Muchos edulcorantes de alta intensidad contienen sabores desagradables y/o propiedades de dulzor inesperadas y/o menos deseables. Al intentar superar estos problemas, la industria continúa dirigiendo una investigación significativa a los inhibidores de amargor, a las tecnologías de enmascaramiento de sabores raros y a las mezclas de edulcorantes para conseguir unas propiedades de dulzor similares a la sacarosa.

La monatina (ácido 2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-aminoglutárico) es un edulcorante natural, de alta intensidad procedente de la planta Sclerochiton ilicifolius, que se encuentra en la región Transvaal de Sudáfrica. Monatina no contiene carbohidrato ni azúcar, y casi ninguna caloría, a diferencia de la sacarosa o de otros edulcorantes nutritivos a igual dulzor.

Sumario

La presente invención se refiere a composiciones de goma de mascar que contienen monatina (ácido 2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-aminoglutárico - también conocido como ácido 4-amino-2-hidroxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-pentanodioico, o alternativamente, basadas en un sistema de numeración alternativo, ácido 4-hidroxi-4-(3-indolilmetil)glutámico), compuesto que presenta la fórmula:

1

La monatina es un edulcorante natural, de alta intensidad. La monatina tiene cuatro formas estereoisoméricas: 2R, 4R ("estereoisómero R,R" o "R,R monatina"), 2S, 4S ("estereoisómero S,S" o "S,S" monatina), 2R, 4S ("estereoisómero R,S" o "R,S" monatina), y 2S, 4R ("estereoisómero S,R" o "S,R" monatina). Tal como se utiliza en la presente memoria, a menos que se indique de otra manera, "monatina" se refiere a los cuatro estereoisómeros de monatina, así como a algunas mezclas de cualquier combinación de estereoisómeros de monatina (p. ej., una mezcla de los estereoisómeros R,R y S,S de monatina).

La monatina presenta una calidad de dulzor excelente. La monatina presenta unas características de sabor que son tan nítidas o más nítidas que las de otros conocidos edulcorantes de alta intensidad. La curva de respuesta a la dosis de monatina es más lineal, y por lo tanto más similar a la sacarosa que la de otros edulcorantes de alta intensidad, como por ejemplo la sacarina. Las excelentes características de dulzor de la monatina hacen deseable a la monatina para su utilización en las composiciones de goma de mascar, edulcorantes de sobremesa, alimentos, bebidas y otros productos.

Diferentes estereoisómeros de monatina, incluyendo los estereoisómeros R,R y S,S, presentan potencial en la industria de edulcorantes, ya sea como ingredientes por separado o en mezclas. La monatina y las mezclas de estereoisómeros de monatina con otros edulcorantes, se cree que tienen características de sabor superiores y/o cualidades físicas, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad. Por ejemplo, la monatina es más estable que el aspartamo (conocido también como "APM"), tiene un sabor más nítido que la sacarina, y un estereoisómero (R,R monatina) es más dulce que la sacaralosa. Asimismo, los edulcorantes de monatina no presentan el regusto amargo asociado a la sacarina, o los regustos metálico, ácido, astringente o ardiente para la garganta de algunos otros edulcorantes muy potentes. Además, los edulcorantes de monatina no presentan el regusto a regaliz asociado a determinados edulcorantes naturales, tales como la esteveosida y la glicirrizina.

Además, a diferencia de los edulcorantes de aspartamo, los edulcorantes de monatina no requieren prevención para la fenilalanina para los pacientes con fenilcetonuria. Asimismo, es de esperar que la monatina no sea cariógena (es decir, no favorezca la caída de los dientes) porque no contiene carbohidratos fermentables. También es de esperar que monatina no produzca una caída por debajo de pH \sim5,7 (que puede ser perjudicial para los dientes) cuando se mezcla con la saliva, medido en una prueba de descenso de pH. Debido a su intenso dulzor, el estereoisómero R,R en particular sería económicamente competitivo en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de goma de mascar que incluye una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble incluye monatina, como por ejemplo R,R, S,S, R,S o S,R monatina o una mezcla de diferentes estereoisómeros. En una forma de realización, la parte de la base de goma comprende entre el 3 y el 50% en peso de un elastómero; entre el 0,5 y el 25% en peso de un suavizante; entre el 2 y el 30% en peso de un emulsionante; entre el 5 y el 75% en peso de una resina; y entre el 0 y el 20% en peso de un relleno. La expresión "% en peso" significa porcentaje en peso. Por ejemplo, 1% en peso se refiere a un gramo por cada 100 gramos, o 10 gramos por cada 1 kg. En otra forma de realización, la parte de la base de goma puede ser del 15 al 30% en peso de la composición. En otras formas de realización, el elastómero puede seleccionarse de entre un caucho natural, una goma natural, una goma biodegradable, un elastómero sintético y una combinación de los mismos.

Por ejemplo, el caucho natural puede seleccionarse de entre látex ahumado, látex líquido y guayule. La goma natural y/o biodegradable puede seleccionarse de entre, por ejemplo, jelutong, perillo, sorva, massaranduba balata, massaranduba chocolate, níspero, rosindinha, goma de mascar, gutta hang kang, arabinogalactano, guar, xantano y gomas de proteínas, tales como gluten y zeína. El término "natural" significa que existe o se forma en la naturaleza. El término "biodegradable" significa capaz de pudrirse o descomponerse mediante la acción de procesos o agentes biológicos, tales como por organismos vivos. En algunas formas de realización, la goma biodegradable es menos pegajosa o nada pegajosa. El elastómero sintético puede seleccionarse de entre, por ejemplo, copolímeros de butadieno-estireno, copolímeros de isobutileno-isopreno, polibutadieno, poliisobutileno y elastómeros poliméricos de vinilo.

En algunas formas de realización, un suavizante (conocido también como plastificante) puede incluir uno o más de entre sebo, sebo hidrogenado, aceites vegetales hidrogenados, aceites vegetales parcialmente hidrogenados, manteca de cacao, monoestearato de glicerol, triacetato de glicerol, lecitina, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, monoglicéridos acetilados, ácidos grasos, jarabes, tales como jarabes de poliol (p. ej., jarabe de maltitol, jarabe de glicerol y glicerol) y jarabes de poliol mezclados, y una combinación de los mismos. En otras formas de realización, el relleno puede ser uno o más de entre lecitina, inulina, polidextrina, carbonato cálcico, carbonato de magnesio, silicato de magnesio, caliza molida, silicato de aluminio, talco, arcilla, alúmina, dióxido de titanio y fosfato cálcico. En otras formas de realización, el emulsionante puede ser monoestearato de glicerol, lecitina, ácido poliglicerol polirricinoleico o estearato de magnesio. En otras formas de realización, la resina puede ser un éster de colofonia, una resina terpénica, acetato de polivinal, alcohol polivinílico, acetato etilenvinílico o copolímero de acetato de vinilo y laurato de vinilo. En otras formas de realización, el éster de colofonia puede ser un éster de glicerol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster de glicerol de colofonia polimerizada, un éster de glicerol de colofonia parcialmente dimerizada, un éster de glicerol de colofonia, un éster de pentaeritritol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster metílico de colofonia o un éster metílico de colofonia parcialmente hidrogenada.

En las formas de realización, el emulsionante y el suavizante, el emulsionante y el relleno y el suavizante y el relleno pueden ser compuestos diferentes.

En otras formas de realización, la parte soluble puede incluir además un edulcorante de carga, p. ej., un edulcorante de maíz, sacarosa, dextrosa, azúcar invertido, dextrina, fructosa, levulosa, sólidos del jarabe de maíz, galactosa, trehalosa, isomaltulosa o combinaciones de los mismos. Alternativamente, la parte soluble puede incluir además un edulcorante de alta intensidad o un carbohidrato glucémico inferior (es decir, uno menos glucémico que la sacarosa). Por ejemplo, el edulcorante de alta intensidad o el carbohidrato glucémico inferior pueden seleccionarse de entre sorbitol (incluyendo el sorbitol amorfo y cristalino), manitol, maltitol, hidrolizados de almidón hidrogenado, xilitol, alitamo, taumatina, sacaralosa, aspartamo, acesulfamo K, una dihidrochalcona, sacarina, neotamo, un ciclamato, esteviósido, mogrósido, tagatosa, eritritol, isomalta, lactitol, glicirrizina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazzeína, curculina, miraculina y pentadina.

Alternativamente, la parte soluble puede incluir además un agente aromatizante. Por ejemplo, el agente aromatizante puede ser un aceite esencial o una esencia sintética, o una combinación de los mismos. El aceite esencial puede ser, por ejemplo, aceite de menta, aceite de hierbabuena o aceite de gaulteria. Alternativamente, el agente aromatizante puede ser, por ejemplo, un agente aromatizante de frutas (p. ej., aceite de naranja, aceite de limón, de plátano, de cerezas, de manzana, de piña, de uva, de fresa, tutti-frutti, de sandía o combinaciones de los mismos).

En determinadas formas de realización, la presente invención proporciona formulaciones de goma de mascar que comprenden el estereoisómero R,R de monatina, el estereoisómero S,S de monatina y/o una mezcla de estereoisómeros de monatina. Se puede proporcionar monatina, como por ejemplo en una mezcla de estereoisómeros, en forma sólida (p. ej., liofilizada, cristalina, amorfa y/o en polvo) y en forma líquida. En una forma de realización, las composiciones de goma de mascar comprenden monatina o una sal de la misma en una cantidad que proporciona un dulzor comparable al dulzor proporcionado por la cantidad de sacarosa (y/o otros carbohidratos) presentada en las composiciones de goma de mascar. "Un dulzor comparable" significa que un evaluador organoléptico, por término medio, determinará que el dulzor presentado en una primera composición está comprendido dentro del intervalo entre el 80% y el 120% del dulzor presentado por una segunda composición. En otra forma de realización, una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma en una cantidad que proporciona aumento de dulzor de larga duración. "Dulzor de larga duración potenciado" significa un dulzor potenciado a lo largo del tiempo en comparación con el dulzor proporcionado a lo largo del tiempo por aspartamo o sacaralosa en composiciones de goma de mascar similares.

En una forma de realización, el estereoisómero R,R de monatina está comprendido aproximadamente entre el 0,009 y aproximadamente el 0,1% en peso de la composición (p. ej., entre aproximadamente 0,015 y aproximadamente 0,025 en peso de la composición). En otra forma de realización, el estereoisómero S,S de monatina está comprendido aproximadamente entre el 0,1 y aproximadamente el 1,1% en peso de la composición (p. ej., entre aproximadamente 0,15 y aproximadamente 0,88 en peso de la composición). En otras formas de realización, la parte soluble incluye una mezcla del estereoisómero S,S de monatina y acesulfamo K (p. ej., entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,1% en peso de monatina y entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,3% en peso de acesulfamo K. En otras formas de realización, la monatina está encapsulada, ya sea sola o en combinación con otras sustancias.

El término "aproximadamente" comprende el intervalo de error experimental que se produce en cualquier medición. A menos que se indique de otra manera, todas las cifras de la medición se supone que presentan la palabra "aproximadamente" delante de ellas incluso si la palabra "aproximadamente" no se utiliza expresamente. "Encapsulado" significa ocluido o mantenido dentro de una cubierta o microcápsula, donde, por ejemplo, la microcápsula protege la(s) sustancia(s) ocluida(s), permitiéndola(s) liberarse más lentamente en la goma de mascar.

En determinadas formas de realización, la parte soluble puede incluir además un edulcorante de carga, un edulcorante de alta intensidad o un carbonato glucémico inferior y un agente aromatizante. En otras formas de realización, la parte soluble puede incluir una mezcla de monatina y un ciclamato. En otras formas de realización edulcorantes múltiples (incluyendo a monatina), así como mezclas de edulcorante (incluyendo a monatina)/esencia, pueden encapsularse y procesarse conjuntamente y secarse conjuntamente.

En algunas formas de realización, las composiciones de goma de mascar comprenden monatina que está constituida esencialmente por S,S o R,R monatina. En otras formas de realización, las composiciones contienen en su mayor parte S,S o R,R monatina. "En su mayor parte" significa que de los estereoisómeros de monatina presentes en la composición, la monatina contiene más del 90% de un estereoisómero determinado. En algunas formas de realización, las composiciones están sustancialmente exentas de monatina S,S o R,R. "Sustancialmente exento" significa que de los estereoisómeros de monatina presentes en la composición, la composición contiene menos del 2% del estereoisómero específico. Además o alternativamente, cuando se utiliza para describir la monatina producida en una ruta biosintética, "sustancialmente exento" comprende la cantidad de un estereoisómero (p. ej., S,S monatina) producida como subproducto en una ruta biosintética que conllevan enzimas quirales específicas (p. ej., D-aminoácido deshidrogenasas o D-aminoácido aminotransferasa) y/o sustratos quirales específicos (p. ej., el que tiene un carbono en la estereoconfiguración R) para producir un estereoisómero específico diferente (p. ej., R,R monatina).

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de goma de mascar, que incluye una mezcla de monatina enriquecida estereoisoméricamente producida en una ruta biosintética. "Mezcla de monatina" enriquecida estereoisoméricamente significa que la mezcla contiene más de un estereoisómero de monatina y por lo menos el 60% de estereroisómeros de monatina en la mezcla es un estereoisómero determinado, como por ejemplo R,R, S,S, S,R o R,S. En otras formas de realización, la mezcla contiene más del 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% de estereoisómero específico de monatina. En otra forma de realización, la composición de goma de mascar de globo comprende una R,R o S,S monatina enriquecida estereoisoméricamente. R,R monatina "enriquecida estereoisoméricamente" significa que la monatina comprende por lo menos el 60% de monatina R,R. S,S monatina "enriquecida estereoisoméricamente" significa que la monatina comprende por lo menos el 60% de monatina S,S. En otras formas de realización, monatina "enriquecida estereoisoméricamente" comprende más del 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% de R,R o S,S monatina.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de preparación de una composición de goma de mascar. El procedimiento incluye producir biosintéticamente monatina ya sea in vivo o in vitro. Una "ruta biosintética" comprende por lo menos una etapa de conversión biológica. En algunas formas de realización, la ruta biosintética es un procedimiento multietapa y por lo menos una etapa es una etapa de conversión biológica. En otras formas de realización, la ruta biosintética es un procedimiento multietapa que implica las etapas de conversión tanto biológica como química. En ambas formas de realización, la monatina producida es una mezcla de monatina enriquecida estereoisoméricamente.

En otro aspecto de la presente invención, existen varias rutas biosintéticas para preparar monatina a partir de sustancias seleccionadas de entre glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, así como indol-3-piruvato y ácido 2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (conocido también como "precursor de monatina", "MP" o la forma alfa-ceto de monatina). Ejemplos de ruta biosintética para producir o preparar monatina o sus intermedios se dan a conocer en las Fig. 1 a 3 y 11 a 13, que muestran potenciales productos intermedios y productos finales en casillas. Por ejemplo, en estas series de reacciones se produce una conversión de un producto en otro, como por ejemplo glucosa en triptófano, triptófano en indol-3-piruvato, indol-3-piruvato en MP, MP en monatina, o ácido indol-3-láctico (indol-lactato) en indol-3-piruvato.

Estas conversiones dentro de las rutas biosintéticas pueden facilitarse mediante conversiones químicas y/o biológicas. El término "convertir" se refiere a la utilización de medios químicos o por lo menos de un polipéptido en una reacción para cambiar un primer producto intermedio en un segundo producto intermedio. Las conversiones pueden tener lugar in vivo o in vitro. La expresión "conversión química" se refiere a la reacción que no está activamente facilitada por un polipéptido. La expresión "conversión biológica" se refiere a la reacción que está activamente facilitada por uno o más polipéptidos. Cuando se utilizan conversiones biológicas, los polipéptidos y/o las células pueden inmovilizarse sobre soporte como por ejemplo mediante enlace químico en soportes de polímero. La conversión puede realizarse utilizando cualquier reactor conocido por un experto en la materia, por ejemplo en un reactor discontinuo o continuo.

Ejemplos de polipéptidos, y sus secuencias de codificación, que pueden utilizarse para realizar conversiones biológicas se presentan en las Figs. 1 a 3 y 11 a 13. Los polipéptidos que presentan una o más mutaciones puntuales que permiten modificar la especificidad de sustrato y/o la actividad de los polipéptidos, pueden utilizarse para preparar monatina. Las células aisladas y recombinantes que expresan dichos polipéptidos pueden utilizarse para producir monatina. Estas células pueden ser cualquier célula, como por ejemplo una célula vegetal, animal, bacteriana, de levadura, de algas, archeal o de hongos.

Por ejemplo, las células productoras de monatina pueden incluir una o más (como por ejemplo dos o más, o tres o más) de las siguientes actividades: triptófano aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática) aminotransferasa (EC 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (EC 2.6.1.28), sustrato múltiple aminotransferasa (EC 2.6.1-), aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), L-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.2), triptófano oxidasa (sin número EC, Hadar et al., J. Bacteriol. 125:1096-1104, 1976 y Furuya et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:1486-93, 2000), D-triptófano aminotransferasa (Kohiba y Mito, Proceedings of the 8^{th} Internacional Symposium on Vitamin B_{6} and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japón 1990), D-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.3), D-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.21), sintetasa/liasa (EC 4.1.3.-), como por ejemplo 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16) o 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.17) y/o sintetasa/liasa (4.1.2.-).

En otro ejemplo, las células pueden incluir uno o más (como por ejemplo dos o más, o tres o más) de las siguientes actividades: indol-lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (EC 1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.111), lactato oxidasa (EC 1.1.3.-), sintasa/liasa (4.1.3.-) como por ejemplo 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16) o 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.17), sintasa/liasa (4.1.2.-), triptófano aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática) aminotransferasa (EC 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (EC 2.6.1.28), sustrato múltiple aminotransferasa (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), D-triptófano aminotransferasa, D-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.99.1) y/o D-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.21).

Además, las células pueden incluir uno o más (como por ejemplo dos o más, o tres o más) de las siguientes actividades: triptófano aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática) aminotransferasa (EC 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (EC 2.6.1.28), sustrato múltiple aminotransferasa (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), L-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.2), triptófano oxidasa, D-triptófano aminotransferasa, D-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.3), D-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.21), indollactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenillactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (EC 1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.111), lactato oxidasa (EC 1.1.3.-), sintasa/liasa (EC 4.1.3.-), como por ejemplo 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16) o 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.17) y/o sintasa/liasa (4.1.2.-).

Como ejemplo adicional, las células pueden incluir una o más de las siguientes actividades de aldolasa: KHG aldolasa, ProA aldolasa, KDPG aldolasa y/o los polipéptidos relacionados (KDPH), transcarboxibenzalpiruvato hidratasa-aldolasa, 4-(2-carboxifenil)-2-oxobut-3-enoato aldolasa, trans-O-hidroxibencilidenpiruvato hidratasa-aldolasa, 3-hidroxi-aspartato aldolasa, benzoína aldolasa, dihidroneopterina aldolasa, L-treo-3-fenilserina benzaldehído-liasa (fenilserina aldolasa), 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, 1,2-dihidroxibencil-piruvato aldolasa, y/o 2-hidroxibenzalpiruvato aldolasa.

La monatina puede producirse por procedimientos que incluyen poner en contacto el triptófano y el ácido indol-3-láctico con un primer polipéptido, en el que el primer polipéptido convierte el triptófano y/o el ácido indol-3-láctico en indol-3-piruvato (la forma D o L de triptófano o el ácido indol-3-láctico puede utilizarse como sustrato que se convierte en indol-3-piruvato; un experto en la materia apreciará que los polipéptidos seleccionados para esta etapa presenten teóricamente la especificidad apropiada), poner en contacto el indol-3-piruvato resultante con un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido convierte el indol-3-piruvato en ácido 2-hidroxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (MP) y poner en contacto el MP con un tercer polipéptido, en el que el tercer polipéptido convierte el MP en monatina. Ejemplos de polipéptidos que pueden utilizarse para estas conversiones se muestran en las Figs.
2 y 3.

La producción de monatina en una ruta biosintética mediante una o más conversiones biológicas proporciona determinadas ventajas. Por ejemplo, utilizando polipéptidos específicos y/o determinados sustratos en la ruta biosintética, se puede producir una mezcla enriquecida en un estereoisómero específico, y/o producir una mezcla de monatina que está sustancialmente exenta de uno o más estereoisómeros.

Una composición de monatina puede incluir impurezas como consecuencia del procedimiento utilizado para la síntesis de monatina. Las composiciones de monatina producidas por procedimientos de síntesis puros (es decir, sin implicar por lo menos una conversión biológica) contendrán impurezas diferentes a las composiciones de monatina producidas por una ruta biosintética. Por ejemplo, basándose en las materias primas utilizadas, las composiciones de monatina producidas por métodos puramente sintéticos pueden incluir contaminantes petroquímicos, tóxicos y/o otros contaminantes peligrosos inapropiados para el consumo humano. Ejemplos de dichos contaminantes son las materias químicas peligrosas, tales como LDA, hidrógeno-Pd/C, diazometano, KCN, reactivo de Grignard y Na/Hg. Por otra parte, es de esperar que una composición de monatina producida por una ruta biosintética pueda contener impurezas comestibles o potables, pero no debe contener material petroquímico, tóxico y/u otro material
peligroso.

Es de esperar que un procedimiento para producir monatina en una ruta biosintética mediante una o más conversiones biológicas produzca menos contaminantes tóxicos o peligrosos y/o pueda producir un porcentaje mayor de un estereoisómero determinado, en comparación con los métodos de síntesis pura. Por ejemplo, es de esperar que al preparar monatina utilizando D-aminoácido deshidrogenasas, D-alanina (aspartato) aminotransferasas, D-aromático aminotransferasa o D-metionina aminotransferasas, se pueda obtener por lo menos el 60% de monatina R,R y menos del 40% de S,S, S,R y/o R,S monatina. Asimismo es de esperar, por ejemplo, que al preparar monatina utilizando las D-enzimas mencionadas anteriormente, así como por lo menos un sustrato (p. ej., el precursor de monatina) que tiene un carbono en la estereoconfiguración R, se puede obtener por lo menos el 95% de R,R monatina y menos del 5% de S,S, S,R y/o R,S monatina. En cambio, es de esperar que al preparar monatina por medios puramente sintéticos, se obtiene aproximadamente del 25% al 50% del estereoisómero deseado.

En una forma de realización, un procedimiento para producir monatina mediante una ruta biosintética, por ejemplo, que implican una o más conversiones biológicas, no produce contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos. "Contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos" significa cualquier material que sea petroquímico, tóxico, peligroso y/o si no inapropiado para el consumo humano, incluyendo los contaminantes proporcionados como materia prima o creados al producir monatina por procedimientos puramente sintéticos. En otra forma de realización, un procedimiento para producir monatina mediante una ruta biosintética, por ejemplo, que implican una o más conversiones biológicas, produce uno o más compuestos o materiales que se ajustan para la comida o la bebida de seres humanos, o si no son seguros para el consumo humano. Ejemplos de materiales comestibles o potables incluyen la monatina, triptófano, piruvato, glutamato, otros aminoácidos, así como otros compuestos o materiales que están presentes de forma natural en el cuerpo.

En una forma de realización, una composición de goma de mascar que comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende monatina o una sal de la misma. En otra forma de realización, la parte soluble comprende además un sabor cítrico. En otra forma de realización, la parte soluble comprende además un sabor cítrico en la que la monatina o una sal de la misma está presente en una cantidad que aumenta el sabor proporcionado por el sabor cítrico. En otras formas de realización, la parte soluble comprende además un ciclamato y/o eritritol.

En otras formas de realización, una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma contiene menos calorías y carbohidratos que la misma cantidad de la composición de goma de mascar que contiene sacarosa en lugar de la monatina o de una sal de la misma. En otra forma de realización, la composición de goma de mascar comprende monatina o la sal de la misma, y no es cariógena. En otra forma de realización, la composición de goma de mascar comprende monatina o la sal de la misma presente en una cantidad que proporciona un dulzor prolongado y un sabor no enmascarado o aumentado, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad, tales como aspartamo o sacaralosa, sustituidos por monatina en la composición de goma de mascar.

En otra forma de realización, un procedimiento para preparar una composición de goma de mascar edulcorado con monatina que tiene aumentado el dulzor de larga duración proporcionado por la monatina, comprende las etapas siguientes: (a) producir monatina o una sal de la misma mediante una ruta biosintética; (b) combinar la monatina o la sal de la misma con otros ingredientes; y (c) formar la composición de goma de mascar. En otra forma de realización, una composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma, en la que la monatina o la sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona un dulzor de larga duración potenciado. En una forma de realización, una composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma presente en una cantidad que proporciona un dulzor prolongado en comparación con aspartamo o sacaralosa.

En otra forma de realización, una composición de goma de mascar comprende desde aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,1% en peso de monatina o de una sal de la misma. Por ejemplo, la composición de goma de mascar puede comprender más de aproximadamente el 0,25% en peso a aproximadamente 1,1% en peso de monatina o de una sal de la misma. En otra forma de realización, una composición de goma de mascar comprende desde aproximadamente 0,009 a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma. Por ejemplo, la composición de goma de mascar puede comprender desde aproximadamente el 0,015% a aproximadamente el 0,025% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma. Por ejemplo, la composición de goma de mascar puede comprender desde más de aproximadamente el 0,25% en peso hasta aproximadamente el 1,1% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma, o comprende desde aproximadamente el 0,15 hasta aproximadamente el 0,88% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma, o comprende más de aproximadamente el 0,25% en peso hasta aproximadamente el 0,88% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma. En otra forma de realización, una composición de goma de mascar comprende desde aproximadamente 0 a aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma, y desde aproximadamente 0 a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma.

En otras formas de realización, una composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma que está sustancialmente exenta de S,S monatina o de una sal de la misma, o está sustancialmente exenta de R,R monatina o una sal de la misma. En otras formas de realización, la composición de goma de mascar comprende aproximadamente 0,1% en peso o menos de R,R monatina o de una sal de la misma, y está sustancialmente exenta de S,S, S,R o R,S monatina o una sal de la misma. En otras formas de realización, la composición de goma de mascar comprende aproximadamente 1,1% en peso o menos de S,S monatina o de una sal de la misma, y está sustancialmente exenta de R,R, S,R o R,S monatina o una sal de la misma.

En otras formas de realización, una composición de goma de mascar consiste esencialmente en R,R monatina o una sal de la misma, o consiste esencialmente en S,S monatina o una sal de la misma. En otras formas de realización, una composición de goma de mascar comprende una R,R monatina enriquecida estereoisoméricamente o una sal de la misma, o una S,S monatina enriquecida estereoisoméricamente o una sal de la misma. En una forma de realización, una monatina o una sal de la misma comprende por lo menos el 95% de R,R monatina o una sal de la misma, o por lo menos el 95% de S,S monatina o de una sal de la misma.

En una forma de realización, una composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma producida en una ruta biosintética. En una forma de realización, una composición de goma de mascar comprende una parte de base de goma y una parte soluble que comprende monatina o una sal de la misma, en la que todos los componentes de las partes son naturales. En otra forma de realización, una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma es biodegradable. La composición de goma de mascar biodegradable puede comprender, por ejemplo, ácido láctico, copolímeros, proteínas, jelutong, perillo, sorva, massaranduba balata, massaranduba chocolate, níspero, rosindinha, goma de mascar, gutta hang kang, arabinogalactano, guar, xantano o una combinación de los mismos.

En otras formas de realización, una composición de goma de mascar comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende una mezcla de monatina enriquecida estereoisoméricamente, y en la que la mezcla de monatina es producida mediante una ruta biosintética. En otra forma de realización, la ruta biosintética consiste en una serie de reacciones multietapa y por lo menos una etapa de la serie de reacciones multietapa es una conversión química. En otras formas de realización, la mezcla de monatina es en su mayor parte R,R monatina o una sal de la misma, o es en su mayor parte S,S monatina o una sal de la misma. En otras formas de realización, una composición de goma de mascar comprende una parte de base de goma de mascar y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende una composición de monatina producida en una ruta biosintética, y en la que la composición de monatina no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos. En otras formas de realización, la composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma producida en una ruta biosintética y aislada de la célula recombinante, y en la que la célula recombinante no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos.

En determinadas formas de realización, una composición de goma de mascar comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte de base de goma comprende del 3 al 50% en peso de un elastómero; 0,5 al 25% en peso de un suavizante; 2 al 30% en peso de un emulsionante; 5 al 75% en peso de una resina y 0 al 20% en peso de un relleno. En algunas formas de realización, el elastómero se selecciona de entre el grupo constituido por un caucho natural, una goma natural y un elastómero sintético. En algunas formas de realización, el caucho natural se selecciona de entre el grupo constituido por látex ahumado, látex líquido y guayule. En algunas formas de realización, la goma natural se selecciona de entre el grupo constituido por jelutong, perillo, sorva, massaranduba balata, massaranduba chocolate, níspero, rosindinha, goma de mascar y gutta hang kang. En algunas formas de realización, el elastómero sintético se selecciona de entre el grupo constituido por copolímeros de butadieno-estireno, copolímeros de isobutileno-isopreno, elastómeros poliméricos de polibutadieno, poliisobutileno y vinilo.

En algunas formas de realización, el suavizante comprende uno o más de entre sebo, sebo hidrogenado, aceites vegetales hidrogenados, aceites vegetales parcialmente hidrogenados, manteca de cacao, monoestearato de glicerol, triacetato de glicerol, lecitina, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, monoglicéridos acetilados y ácidos grasos. En algunas formas de realización, el relleno comprende una o más de entre lecitina, inulina, polidextrina, carbonato cálcico, carbonato de magnesio, silicato de magnesio, caliza molida, silicato de aluminio, talco, arcilla, alúmina, dióxido de titanio y fosfato cálcico. En algunas formas de realización, el emulsionante es monoestearato de glicerol, lecitina, ácido poliglicerol polirricinoleico o estearato de magnesio. En algunas formas de realización, la resina es un éster de colofonia, una resina terpénica, acetato de polivinal, alcohol polivinílico, acetato etilenvinílico o copolímero de acetato de vinilo y laurato de vinilo. En algunas formas de realización, el éster de colofonia es un éster de glicerol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster de glicerol de colofonia polimerizada, un éster de glicerol de colofonia parcialmente dimerizada, un éster de glicerol de colofonia, un éster de pentaeritritol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster metílico de colofonia o un éster metílico de colofonia parcialmente hidrogenada. En una forma de realización, el emulsionante y el suavizante son compuestos diferentes. En otra forma de realización, el emulsionante y el relleno son compuestos diferentes. En otra forma de realización, el suavizante y el relleno son compuestos diferentes.

En una forma de realización, la parte soluble comprende además un edulcorante de carga. El edulcorante de carga puede ser, por ejemplo, un edulcorante de maíz, sacarosa, dextrosa, azúcar invertido, dextrina, fructosa, levulosa, sólidos del jarabe de maíz, galactosa, trehalosa, isomaltulosa o combinaciones de los mismos. En una forma de realización, la parte soluble puede comprender además un edulcorante de alta intensidad o un carbohidrato glucémico inferior. El edulcorante de alta intensidad o el carbohidrato glucémico inferior puede ser, por ejemplo, sorbitol, manitol, maltitol, hidrolizados de almidón hidrogenado, xilitol, alitamo, taumatina, sacaralosa, aspartamo, acesulfamo K, una dihidrochalcona, sacarina, neotamo, un ciclamato, esteviósido, mogrósido, tagatosa, eritritol, isomalta, lactitol, glicirrizina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazzeína, curculina, miraculina y pentadina.

En una forma de realización, la parte soluble comprende además un agente aromatizante. El agente aromatizante puede ser, por ejemplo, un aceite esencial, un agente aromatizante de frutas, una esencia sintética, o una combinación de los mismos. El aceite esencial puede ser, por ejemplo, aceite de menta, aceite de hierbabuena o aceite de gaulteria. En una forma de realización, el agente aromatizante de frutas comprende extracto, esencia o aceite de limón, lima, naranja, mandarina, pomelo, cidra, kumquat, plátano, cerezas, manzana, piña, uvas, fresa, tutti-frutti, sandía o combinaciones de los mismos.

En una forma de realización, una composición de goma de mascar comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende una mezcla de R,R y S,S monatina o de una sal de la misma. En otras formas de realización, la parte soluble comprende una mezcla de monatina o de una sal de la misma y de acesulfamo K. En determinadas formas de realización, una composición de goma de mascar comprende desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o una sal de la misma y desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,3% en peso de acesulfamo K, o comprende desde más de aproximadamente 0,25% en peso a aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o una sal de la misma y desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,3% en peso de acesulfamo K. En otras formas de realización, una composición de goma de mascar comprende desde aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,7% en peso de S,S monatina o una sal de la misma y desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,2% en peso de acesulfamo K, o comprende desde aproximadamente 0,009% en peso a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o una sal de la misma y desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,3% en peso de acesulfamo K.

En una forma de realización, una composición de goma de mascar comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende monatina o una sal de la misma que está encapsulada. En algunas formas de realización, la parte de base de goma comprende el 15 al 30% en peso de la composición. En otras formas de realización, la parte soluble comprende además un edulcorante de carga, un edulcorante de alta intensidad o un carbohidrato glucémico inferior y un agente aromatizante.

En una forma de realización, un procedimiento de preparación de una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma comprende la producción de monatina o de una sal de la misma a partir de por lo menos un sustrato seleccionado de entre glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, indol-3-piruvato y precursor de monatina. En determinadas formas de realización, el procedimiento comprende combinar la monatina o la sal de la misma con por lo menos otro ingrediente que no sea monatina o la sal de la misma. En determinadas formas de realización, la composición de goma de mascar puede ser por el procedimiento que comprende desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o una sal de la misma, y desde aproximadamente 0 a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma. En determinadas formas de realización, la composición de goma de mascar se prepara por el método que comprende desde más de aproximadamente 0,25% en peso a aproximadamente 1,1% en peso de monatina o de una sal de la misma.

En otra forma de realización, un procedimiento para preparar una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma comprende producir monatina o una sal de la misma mediante una ruta biosintética. En otra forma de realización, un procedimiento para preparar una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma comprende producir monatina o una sal de la misma utilizando por lo menos una conversión biológica.

En una forma de realización, un procedimiento para preparar una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende: (a) producir monatina o una sal de la misma en una ruta biosintética en una célula recombinante; (b) aislar la composición de monatina de la célula recombinante, en la que la composición de monatina está constituida por monatina o una sal de la misma y otro material comestible o potable. En otra forma de realización, una composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma y por lo menos otro ingrediente seleccionado de entre eritritol, trehalosa, sorbitol, manitol, maltitol, xilitol, alitamo, taumatina, sacaralosa, aspartamo, acesulfamo K, una dihidrochalcona, sacarina, neotamo, un ciclamato, esteviósido, mogrósido, tagatosa, isomalta, lactitol, glicirrizina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazzeína, curculina, miraculina y pentadina.

En una forma de realización, un procedimiento de preparación de una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina en una ruta biosintética, y en la que la composición de monatina no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos. En otra forma de realización, un procedimiento para preparar una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina a partir de un sustrato en una serie de reacciones multietapa, en la que una o más etapas en la serie de reacciones multietapa consiste en una conversión biológica, y en la que la composición de monatina no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos.

En una forma de realización, un método de preparación de una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina en una ruta biosintética, y en la que la composición de monatina está constituida por monatina o una sal de la misma y otro material comestible o potable. En otra forma de realización, un procedimiento para preparar una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina a partir de un sustrato en una serie de reacciones multietapa, en la que una o más etapas en la serie de reacciones multietapa es una conversión biológica, y en la que la composición de monatina está constituida por monatina o una sal de la misma y otro material comestible o potable.

Resulta evidente para cualquier experto en la materia a partir de lo dado a conocer en la presente memoria que las formas de realización específicas de la presente invención pueden referirse a uno o a una combinación de los aspectos indicados anteriormente, así como a otros aspectos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 presenta la serie de reacciones bioquímicas utilizadas para producir monatina y/o indol-3-piruvato. Una serie de reacciones produce indol-3-piruvato a través de triptófano, mientras que otra produce indol-3-piruvato mediante ácido indol-3-láctico. La monatina se produce después mediante un producto intermedio MP.

Los compuestos mostrados en las casillas son sustratos y productos producidos en la ruta biosintética. Las composiciones junto a las flechas son cofactores o reactivos que pueden utilizarse durante la conversión de un sustrato en un producto. El cofactor o reactivo utilizado dependerá del polipéptido utilizado para la etapa específica de la ruta biosintética. El cofactor PLP (piridoxal 5'-fosfato) puede catalizar reacciones independientes de un polipéptido, y por consiguiente, proporcionar simplemente PLP puede permitir la evolución del sustrato al producto.

La Fig. 2 es un diagrama más detallado de la ruta biosintética que utiliza el producto intermedio MP. Los sustratos para cada etapa en las series de reacciones se presentan en casillas. Los polipéptidos que permiten la conversión entre sustratos están listados junto a las flechas entre los sustratos. Cada polipéptido está descrito por su denominación vulgar y un número (EC) de clase enzimático.

La Fig. 3 es un diagrama más detallado de la ruta biosintética de la conversión del ácido indol-3-láctico en indol-3-piruvato. Los sustratos se presentan en casillas y los polipéptidos que permiten la conversión entre sustratos están listados junto a las flechas entre los sustratos. Cada polipéptido está descrito por su denominación vulgar y un número de EC.

La Fig. 4 presenta una posible reacción para preparar MP por métodos químicos.

Las Figs. 5A y 5B son cromatogramas que presentan la identificación por LC/MS de monatina producida enzimáticamente.

La Fig. 6 es un espectro de masas con electroatomización de monatina sintetizada enzimáticamente.

Las Figs. 7A y 7B son cromatogramas de los análisis iónicos de los metabolitos por LC/MS/MS de monatina producidos en una mezcla enzimática.

La Fig. 8 es un cromatograma que presenta la medición de masas de alta resolución de monatina producida enzimáticamente.

Las Figs. 9A a 9C son cromatogramas que presentan la separación quiral de (A) R-triptófano, (B) S-triptófano y (C) monatina producida enzimáticamente.

La Fig. 10 es un diagrama de barras que presenta la cantidad relativa de monatina producida en células bacterianas después de la producción de IPTG. El (-) indica una falta de adición de sustrato (no se añadió triptófano ni piruvato).

Las Figs. 11 a 12 son diagramas esquemáticos que presentan las series de reacciones utilizadas para aumentar el rendimiento de la monatina producida a partir de triptófano o indol-3-piruvato.

La Fig. 13 es un diagrama esquemático que presenta una serie de reacciones que puede utilizarse para aumentar el rendimiento de la monatina producida a partir de triptófano o indol-3-piruvato.

La Fig. 14 presenta una curva de respuesta a la dosis obtenida con un estereoisómero R,R de monatina.

La Fig. 15 presenta una curva de respuesta a la dosis obtenida con una mezcla estereoisomérica R,R/S,S de monatina.

La Fig. 16 compara la curva de respuesta a la dosis obtenida con una mezcla de estereoisómeros R,R/S,S de monatina con una curva de respuesta a la dosis obtenida con sacarina.

La Fig. 17 presenta la cromatografía en fase inversa de patrones de monatina producida sintéticamente.

La Fig. 18 presenta la cromatografía quiral de patrones de monatina.

Descripción detallada Visión general de las rutas biosintéticas para la producción de monatina

Las explicaciones siguientes de términos y procedimientos se proporcionan para describir mejor la presente exposición y para ayudar a los expertos en la materia en la puesta en práctica de la presente exposición. Tal como se utiliza en la presente memoria, "incluyendo" significa "comprendiendo". Además, las formas en singular "un" o "una" o "el" o "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dictamine claramente de otro modo. Tal como se utiliza en la presente memoria, "goma de mascar" se refiere a todos los tipos de goma de mascar, incluyendo las gomas funcionales y la goma de globo. "Goma funcional" se refiere a una goma de mascar que comprende por lo menos un componente funcional o medicinal. Por ejemplo, las gomas funcionales pueden administrar medicación, como por ejemplo nicotina, aspirina o medicación para enfermedades de viaje (p. ej., dimenhidrinato), o nutrientes (p. ej., vitaminas y/o minerales), o componentes cosméticos (p. ej., blanqueador de dientes y/o ingredientes para refrescar el aliento).

Como se muestra en las Figs. 1 a 3 y 11 a 13, pueden utilizarse muchas rutas biosintéticas para producir monatina o sus productos intermedios como por ejemplo indol-3-piruvato o MP. Para la conversión de cada sustrato (p. ej., glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, indol-3-piruvato y MP) para cada producto (p. ej., triptófano, indol-3-piruvato, MP y monatina) pueden utilizarse varios polipéptidos diferentes. Además, estas reacciones pueden llevarse a cabo in vivo, in vitro, o mediante una combinación de reacciones in vivo y reacciones in vitro, tales como las reacciones in vitro que incluyen reacciones químicas no enzimáticas. Por consiguiente, las Figs. 1 a 3 y 11 a 13 son a título de ejemplo, y presentan múltiples series de reacciones diferentes que pueden utilizarse para obtener los productos deseados.

Glucosa a triptófano

Muchos organismos pueden sintetizar triptófano a partir de glucosa. El/los montaje(s) que contienen el/los
gen(es) necesarios para producir monatina, MP y/o indol-3-piruvato a partir de glucosa y/o triptófano pueden clonarse en dichos organismos. En la presente memoria se demuestra que el triptófano puede convertirse en monatina.

En otros ejemplos, un organismo puede modificarse genéticamente utilizando polipéptidos conocidos para producir triptófano, o sobreproducir triptófano. Por ejemplo, la patente U.S. nº 4.371.614 describe una cepa de E. coli transformada con un plásmido que contiene un operón de triptófano natural.

Los títulos máximos de triptófano dados a conocer en la patente U.S. nº 4.371.614 son aproximadamente 230 ppm. Asimismo, el documento WO 8701130 describe una cepa de E. coli que se ha modificado genéticamente para producir triptófano y trata del aumento de la producción fermentativa de L-triptófano. Los expertos en la materia podrán apreciar que los organismos capaces de producir triptófano a partir de glucosa son también capaces de utilizar otras fuentes de carbono y energía que pueden convertirse en glucosa o fructosa-6-fosfato, con similares resultados. Las fuentes de carbono y energía a título de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, fructosa, almidón, celulosa o glicerol.

Triptófano en indol-3-piruvato

Pueden utilizarse varios polipéptidos para convertir triptófano en indol-3-piruvato.

Los polipéptidos a título de ejemplo incluyen, sin limitación, miembros de las clases enzimáticas (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 y 2.6.1.21. Estas clases incluyen, sin limitación, los polipéptidos denominados triptófano aminotransferasa (denominado también L-fenilalanina-2-oxoglutarato amino-transferasa, triptófano-aminotransferasa, 5-hidroxitriptófano-cetoglutárico transaminasa, hidroxitriptófano aminotransferasa, L-triptófano aminotransferasa, L-triptófano transaminasa y L-triptófano:2-oxoglutarato aminotransferasa) que convierten el L-triptófano y el 2-oxoglutarato en indol-3-piruvato y L-glutamato; D-triptófano aminotransferasa que convierte D-triptófano y un 2-oxo ácido en indol-3-piruvato y un aminoácido; triptófano deshidrogenasa (denominado también NAD(P)-L-triptófano deshidrogenasa, L-triptófano deshidrogenasa, L-Trp-deshidrogenasa, TDH y L-triptófano:NAD(P) oxidorreductasa (desaminación)) que convierte L-triptófano y NAD(P) en indol-3-piruvato y NH_{3} y NAD(P)H; D-aminoácido deshidrogenasa, que convierte los D-aminoácidos y FAD en indol-3-piruvato y NH_{3} y FADH_{2}; triptófano-fenilpiruvato transaminasa (denominado también L-triptófano-\alpha-cetoisocaproato aminotransferasa y L-triptófano:fenilpiruvato aminotransferasa) que convierte L-triptófano y fenilpiruvato en indol-3-piruvato y L-fenilalanina; L-aminoácido oxidasa (denominado también ophio-aminoácido oxidasa y L-aminoácido:oxígeno oxidorreductasa (desaminación)) que convierte un L-aminoácido y H_{2}O y O_{2} en un 2-oxo ácido y NH_{3} y H_{2}O_{2}; D-aminoácido oxidasa (denominado también ophio-aminoácido oxidasa y D-aminoácido:oxígeno oxidorreductasa (desaminación)) que convierte un D-aminoácido y H_{2}O y O_{2} en un 2-oxo ácido y NH_{3} y H_{2}O_{2}; y triptófano oxidasa que convierte L-triptófano y H_{2}O y O_{2} en indol-3-piruvato y NH_{3} y H_{2}O_{2}. Estas clases también contienen tirosina (aromática) aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, D-aminoácido (o D-alanina) aminotransferasa y (sustrato múltiple) aminotransferasa amplia que tiene múltiples actividades de aminotransferasa, algunas de las cuales pueden convertir el triptófano y un 2-oxo ácido en indol-3-piruvato y un aminoácido.

En el Ejemplo 1 a continuación se describen once miembros de la clase aminotransferasa que tienen dicha actividad, incluyendo una nueva aminotransferasa presentada en las SEC. ID. nº: 11 y nº: 12. Por lo tanto, esta exposición proporciona secuencias aisladas de ácido nucleico y aminoácido que tienen por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o incluso por lo menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias indicadas en las SEC. ID. nº: 11 y nº: 12, respectivamente. Asimismo están comprendidos en esta exposición los fragmentos y fusiones de las secuencias indicadas en SEC. ID. nº: 11 y nº: 12 que codifican un polipéptido que presenta actividad de aminotransferasa o que conservan actividad de aminotransferasa. Ejemplos de fragmentos incluyen, pero no se limitan a, por lo menos 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 ó 1.000 nucleótidos contiguos de la SEC. ID. nº: 11 o por lo menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la SEC. ID. nº: 12. Las secuencias expuestas (y las variantes, fragmentos y fusiones de las mismas) pueden formar parte de un vector. El vector se puede utilizar para transformar células huésped, produciendo de este modo células recombinantes que pueden producir indol-3-piruvato a partir de triptófano, y en algunos ejemplos pueden producir además MP y/o monatina.

Las L-aminoácido oxidasas (1.4.3.2) son conocidas, y las secuencias pueden aislarse a partir de varias fuentes diferentes, tales como Vipera lebetine (sp P81375), Ophiophagus hannah (sp P81383), Agkistrodon rhodostoma
(spP81382), Crotalus atrox (sp P56742), Burkholderia cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Mus musculus, Pseudomonas syringae y Rhodococcus str. Además, las triptófano oxidasas están descritas en la bibliografía y pueden aislarse, por ejemplo, de Coprinus sp. SF-1, calabaza china con la enfermedad de la raíz de bastón, Arabidopsis thaliana e hígado de mamífero. En el Ejemplo 3 se expone a continuación un miembro de la clase L-aminoácido oxidasa que puede convertir triptófano en indol-3-piruvato, así como fuentes alternativas para la clonación molecular. Muchos genes de D-aminoácido oxidasa están disponibles en las bases de datos para clonación molecular.

Las triptófano deshidrogenasas son conocidas, y pueden aislarse, por ejemplo, de la espinaca (Pisum sativum, Prosopis juliflora, guisante, mezquite, trigo, maíz, tomate, tabaco, Chromabacterium violaceum y Lactobacilli. Se conocen muchas secuencias génicas de D-aminoácido deshidrogenasa.

Como se muestra en las Figs. 11 a 13, si una aminoácido oxidasa, como por ejemplo triptófano oxidasa, se utiliza para convertir triptófano en indol-3-piruvato, puede añadirse catalasa para reducir o incluso eliminar la presencia de peróxido de hidrógeno.

Indol-3-lactato en indol-3-piruvato

La reacción que convierte el indol-3-lactato en indol-3-piruvato puede estar catalizada por una variedad de polipéptidos, tales como los miembros de las clases de polipéptidos 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.-, o 1.1.1.111. La clase 1.1.1.110 de polipéptidos incluye las indol-lactato deshidrogenasas (denominadas también ácido indol-láctico:NAD^{+} oxidorreductasa). Las clases 1.1.1.27, 1.1.1.28 y 1.1.2.3 incluyen las lactato deshidrogenasas (denominadas también ácido láctico deshidrogenasas, lactato:NAD^{+} oxidorreductasa). La clase 1.1.1.222 contiene (R)-4-hidroxifenillactato deshidrogenasa (denominada también D-aromático lactato deshidrogenasa, R-aromático lactato deshidrogenasa y R-3-(4-hidroxifenil)lactato:NAD(P)^{+} 2-oxidorreductasa) y la clase 1.1.1.237 contiene 3-(4-hidroxifenilpiruvato)reductasa (denominada también hidroxifenilpiruvato reductasa y 4-hidroxifenillactato:NAD^{+} oxidorreductasa). La clase 1.1.3.- contiene lactato oxidasas y la clase 1.1.1.111 contiene (3-imidazol-5-il)lactato deshidrogenasas (denominadas también (S)-3-(imidazol-5-il)lactato:NAD(P)^{+} oxidorreductasa). Es probable que varios de los polipéptidos en estas clases permitan la producción de indol-3-piruvato a partir del ácido indol-3-láctico. En el Ejemplo 2 se proporcionan ejemplos de esta conversión.

Pueden utilizarse también reacciones químicas para convertir el ácido indol-3-láctico en indol-3-piruvato. Dichas reacciones químicas incluyen una etapa de oxidación que puede realizarse utilizando varios métodos, por ejemplo: oxidación con aire utilizando un catalizador B2 (China Chemical Reporter, vol. 13, nº 28, pág. 18(1), 2002), permanganato diluido y perclorato, o peróxido de hidrógeno en presencia de catalizadores metálicos.

Indol-3-piruvato en 2-hidroxi ácido 2-(indol-3ilmetil)-4-cetoglutárico (MP)

Pueden utilizarse varios polipéptidos conocidos para convertir indol-3-piruvato en MP. Las clases de polipéptidos a título de ejemplo incluyen 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 y 4.1.2.-. Estas clases incluyen las sintasas/liasas carbono-carbono, tales como las aldolasas que catalizan la condensación de dos sustratos de ácido carboxílico. La clase de polipéptido EC 4.1.3.- son sintasas/liasas que forman enlaces carbono-carbono utilizando sustratos oxo-ácido (como por ejemplo indol-3-piruvato) como electrófilo, mientras que EC 4.1.2.- son sintasas/liasas que forman enlaces carbono-carbono utilizando sustratos de aldehído (como por ejemplo benzaldehído) como electrófilo.

Por ejemplo, el polipéptido descrito en la patente EP 1045-029 (EC 4.1.3.16, 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato-liasa denominada también 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-oxo-4-hidroxiglutarato aldolasa o KHG aldolasa) convierte el ácido glioxílico y el piruvato en el ácido 4-hidroxi-2-cetoglutárico, y el polipéptido 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.17, denominada también 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato-liasa o ProA aldolasa), condensa dos cetoácidos tales como dos piruvatos en 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato. Las reacciones que utilizan estas liasas están descritas en la presente memoria.

Las Figs. 1 y 2 y 11 a 13 presentan diagramas esquemáticos de estas reacciones en las que una molécula de 3 carbonos (C3) se combina con indol-3-piruvato. Muchos miembros de EC 4.1.2.- y 4.1.3.-, particularmente los polipéptidos que utilizan PLP, pueden utilizar moléculas C3 que son aminoácidos tales como serina, cisteína y alanina, o derivados de los mismos. Las condensaciones aldólicas catalizadas por representantes de EC 4.1.2.- y 4.1.3.- requieren que la molécula de tres carbonos de esta serie de reacciones sea piruvato o un derivado de piruvato. Sin embargo, otros compuestos pueden servir como fuente de carbono C3 y convertirse en piruvato. La alanina puede ser transaminada por muchas transaminasas que utilizan PLP, incluyendo muchas de las mencionadas anteriormente, para dar piruvato. El piruvato y amoniaco pueden obtenerse por reacciones de beta-eliminación (tales como las catalizadas por triptofanasa o \beta-tirosinasa) de L-serina, L-cisteína y derivados de serina y cisteína con grupos salientes suficientes, tales como O-metil-L-serina, O-bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-bencilcisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina y 3-cloro-L-alanina. El aspartato puede servir como fuente de piruvato en las reacciones de beta-liasa mediadas por PLP tales como las catalizadas por triptofanasa (EC 4.1.99.1) y/o \beta-tirosinasa (EC 4.1.99.2, denominada también tirosina-fenol liasa). La velocidad de las reacciones de beta-liasa puede aumentarse realizando la mutagénesis dirigida al sitio en los polipéptidos (4.1.99.1-2) como describe Mouratou et al. (J. Biol. Chem. 274:1320-5, 1999) y en el Ejemplo 8. Estas modificaciones permiten a los polipéptidos aceptar sustratos de aminoácidos dicarboxílicos. El lactato puede servir también como fuente de piruvato, y se oxida a piruvato mediante la adición de lactato deshidrogenasa y un cofactor oxidado o lactato oxidasa y oxígeno. Ejemplos de estas reacciones se describen a continuación. Por ejemplo, como se muestra en la Fig. 2 y Figs. 11 a 13, ProA aldolasa puede ponerse en contacto con indol-3-piruvato cuando se utiliza piruvato como molécula C3.

La MP puede generarse también utilizando reacciones químicas, tales como las condensaciones aldólicas proporcionadas en el Ejemplo 5.

MP en monatina

La conversión de MP en monatina puede estar catalizada por una o más de las siguientes: triptófano aminotransferasa (2.6.1.27), triptófano deshidrogenasas (1.4.1.19), D-aminoácido deshidrogenasas (1.4.99.1), glutamato deshidrogenasas (1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptófano-fenilpiruvato transaminasas (2.6.1.28) o más generalmente miembros de la familia aminotransferasa (2.6.1.-) tales como aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), tirosina (aromática) aminotransferasa (2.6.1.5), D-triptófano aminotransferasa o D-alanina (2.6.1.21) aminotransferasa (Fig. 2). A continuación se describen (Ejemplo 1) once miembros de la clase aminotransferasa, incluyendo un nuevo miembro de la clase mostrada en las SEC. ID. nº: 11 y nº: 12, y en el Ejemplo 7 se proporcionan las reacciones que demuestran la actividad de las enzimas aminotransferasa y deshidrogenasa.

Esta reacción puede también llevarse a cabo utilizando reacciones químicas. La aminación del fetoácido (MP) se lleva a cabo por aminación reductora utilizando amoniaco y cianoborohidruro sódico.

Las Figs. 11 a 13 presentan polipéptidos adicionales que pueden utilizarse para convertir MP en monatina, así como para proporcionar rendimientos potenciados de monatina a partir de indol-3-piruvato o de triptófano. Por ejemplo, si se utiliza aspartato como donante de amino puede utilizarse, la aspartato aminotransferasa para convertir el aspartato en oxaloacetato (Fig. 11). El oxaloacetato se convierte en piruvato y dióxido de carbono mediante una descarboxilasa, como por ejemplo la oxaloacetato descarboxilasa (Fig. 11). Además, si se utiliza la lisina como donante de amino, puede utilizarse la lisina epsilon aminotransferasa para convertir la lisina en alisina (Fig. 12). La alisina se convierte espontáneamente en 6-carboxilato de 1-piperideína (Fig. 12). Si se utiliza un polipéptido capaz de catalizar las reacciones de aminación reductora (p. ej., glutamato deshidrogenasa) para convertir MP en monatina, puede utilizarse un polipéptido que puede reciclar NAD(P)H y/o producir un producto volátil (Fig. 13), como por ejemplo formato deshidrogenasa.

Consideraciones adicionales en el diseño de la ruta biosintética

Dependiendo de qué polipéptidos se utilicen para generar indol-3-piruvato, MP y/o monatina, pueden proporcionarse cofactores, sustratos y/o polipéptidos adicionales para la producción de células que aumenten la formación del producto. Además, puede diseñarse una modificación genética para aumentar la producción de productos tales como indol-3-piruvato, MP y/o monatina. Asimismo, puede optimizarse una célula huésped utilizada para la producción de monatina.

Eliminación de peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) es un producto que, si se genera, puede ser dañino para la producción de células, polipéptidos o productos (p. ej., productos intermedios) producidos. La aminoácido oxidasa descrita anteriormente genera H_{2}O_{2} como producto. Por consiguiente, si se utiliza aminoácido oxidasa, el H_{2}O_{2} resultante puede eliminarse o disminuir sus concentraciones para reducir el daño potencial a la célula o producto.

Pueden utilizarse catalasas para reducir la concentración de H_{2}O_{2} en la célula (Figs. 11 a 13). La producción de células puede expresar un gen o la secuencia de ADNc que codifica una catalasa (F 1.11.1.6), que cataliza la descomposición de peróxido de hidrógeno en agua y gas oxígeno. Por ejemplo, puede expresarse una catalasa en un vector transfectado en la célula en producción. Ejemplos de catalasas que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a: tr|Q9EV50 (Staphylococcus pilosus), tr|Q9KBE8 (Bacillus halodurans), tr|Q9URJ7 (Candida albicans), tr|P77948 (Streptomyces coelicolor), tr|Q9RBJ5 (Xanthomonas campestris) (n^{os} de registro SwissProt). Los reactores biocatalíticos que utilizan L-aminoácido oxidasa, D-aminoácido oxidasa o triptófano oxidasa pueden contener también un polipéptido de catalasa.

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Modulación de la disponibilidad de piridoxal-5'-fosfato (PLP)

Como se muestra en la Fig. 1, el PLP puede utilizarse en una o más de las etapas de la biosíntesis descritas en la presente memoria. La concentración de PLP puede complementarse de modo que el PLP no sea una limitación en la eficacia global de la reacción.

La ruta biosintética para la vitamina B_{6} (precursor del PLP) ha sido totalmente estudiada en E. coli, y algunas de las proteínas han sido cristalizadas (Laber et al., FEBS Letters, 449:45-8, 1999). Dos de los genes (epd o gapB y serC) se requieren en otras series de reacciones metabólicas, mientras que tres genes (pdxA, pdxB y pdxJ) son únicos para la biosíntesis del fosfato de piridoxal. Uno de los materiales de partida en la serie de reacciones de E. coli es el 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXP). La síntesis de este precursor procedente de los metabolitos centrales de los carbonos 2 y 3 comunes está catalizada por el polipéptido 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintetasa (DXS). El otro precursor es un derivado de treonina formado a partir del azúcar de 4 carbonos, 4-fosfato de D-eritrosa. Los genes requeridos para la conversión del fosfo-4-hidroxil-L treoina (HTP) son epd, pdxB y serC. La última reacción para la formación del PLP es una condensación intramolecular completa y la reacción de cierre del anillo entre DXP y HTP, catalizada por los productos génicos de pdxA y pdxJ.

Si PLP se convierte en un nutriente limitativo durante la fermentación para producir monatina, la expresión aumentada de uno o más de los genes de la serie de reacciones en una célula huésped de producción puede utilizarse para aumentar el rendimiento de monatina. Un organismo hospedador puede contener múltiples copias de sus genes de la serie de reacciones naturales o copias de genes no naturales de la serie de reacciones pueden incorporarse en el genoma del organismo. Además, copias múltiples de los genes de rescate de la serie de reacciones pueden clonarse en un organismo hospedador.

Una serie de reacciones de rescate que se conserva en todos los organismos recicla varios derivados de la vitamina B_{6} a la forma PLP activa. Los polipéptidos implicados en esta serie de reacciones son pdxK cinasa, pdxH oxidasa y pdxY cinasa. La sobreexpresión de uno o más de estos genes puede aumentar la disponibilidad de PLP.

Las concentraciones de vitamina B_{6} pueden elevarse por eliminación o represión de la regulación metabólica de los genes naturales de la ruta biosintética en el organismo hospedador. El PLP reprime los polipéptidos implicados en la biosíntesis del derivado de treonina precursor en la cepa 238-7 de la bacteria Flavobacterium sp. Esta cepa bacteriana, liberada del control metabólico, sobreproduce derivados de piridoxal y puede excretar hasta 20 mg/l de PLP. La manipulación genética del organismo hospedador que produce monatina de manera similar permitirá el aumento de la producción de PLP sin sobreexpresión de los genes de la ruta biosintética.

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Utilización de amonio

Las reacciones de triptofanasa pueden conducirse hacia la dirección de la síntesis (producción de triptófano a partir de indol) haciendo al amoniaco más disponible o por eliminación de agua. Las reacciones reductoras de aminación, tales como las catalizadas por glutamato deshidrogenasa, pueden también conducirse hacia delante mediante un exceso de amonio.

El amoniaco puede estar disponible en forma de sales del carbonato amónico o fosfato amónico en un sistema tamponado por carbonato o fosfato. El amoniaco puede también proporcionarse en forma de piruvato amónico o formato amónico. Alternativamente, puede suministrarse amoniaco si la reacción esta acoplada con una reacción que genera amoniaco, como por ejemplo glutamato deshidrogenasa o triptófano deshidrogenasa. El amoniaco puede generarse por adición de los sustratos naturales de EC 4.1.99.- (tirosina o triptófano), que se hidrolizarán a fenol o indol, piruvato y NH_{3}. Esto también permite un aumento de rendimiento de producto sintético sobre la cantidad de equilibrio normal permitiendo a la enzima hidrolizar su sustrato preferido.

Eliminación de los productos y subproductos

La conversión de triptófano en indol-3-piruvato mediante una triptófano aminotransferasa puede afectar desfavorablemente la velocidad de producción de indol-3-piruvato porque la reacción produce glutamato y requiere el cosustrato 2-oxoglutarato (\alpha-cetoglutarato). El glutamato puede producir la inhibición de la aminotransferasa, y la reacción puede consumir grandes cantidades del cosustrato. Además, grandes concentraciones de glutamato pueden ser perjudiciales para los procesos de separación corriente abajo.

El polipéptido glutamato deshidrogenasa (GLDH) convierte el glutamato en 2-oxoglutarato, reciclando de este modo el cosustrato en la reacción catalizado por triptófano aminotransferasa. GLDH también genera equivalentes reductores (NADH o NADPH) que pueden utilizarse para generar energía para la célula (ATP) en condiciones aerobias. La utilización de glutamato por GLDH reduce también la formación del subproducto. Además, la reacción genera amoniaco, que puede servir como fuente de nitrógeno para la célula o como sustrato en una aminación reductora para la etapa final mostrada en la Fig. 1. Por consiguiente, una producción de células que sobreexprese un polipéptido GLDH puede utilizarse para aumentar el rendimiento y reducir el coste del medio y/o los procesos de separación.

En la serie de reacciones de triptófano a monatina, el donante amino de la etapa tres (p. ej., glutamato o aspartato) puede volver a convertir el receptor amino requerido para la etapa 1 (p. ej., 2-oxo-glutarato u oxaloacetato), si se utiliza una aminotransferasa procedente de las clases de enzimas apropiadas. La utilización de dos transaminasas por separado para esta serie de reacciones, en las que el sustrato de una transaminasa no inhibe competitivamente la actividad de la otra transaminasa, puede aumentar la eficacia de esta serie de reacciones.

Muchas de las reacciones en las series de reacciones descritas son reversibles y pueden, por consiguiente, alcanzar un equilibrio entre sustratos y productos. El rendimiento de la serie de reacciones puede aumentarse mediante la eliminación continua de los productos en los polipéptidos. Por ejemplo, la secreción de monatina en el caldo de fermentación que utiliza una permeasa u otra proteína transportadora, o la cristalización selectiva de monatina de una corriente del reactor biocatalítico con reciclo simultáneo de sustratos aumentará el rendimiento de la reacción.

La eliminación de los subproductos por reacciones enzimáticas adicionales o por sustitución de grupos donantes amino es otra manera de aumentar el rendimiento de la reacción. En el Ejemplo 13 se exponen varios ejemplos y se muestran en las Figs. 11 a 13. Por ejemplo, puede producirse un subproducto que no esté disponible para reaccionar en la dirección inversa, ya sea por cambio de fase (evaporación) o por conversión espontánea en un producto final no reactivo, como por ejemplo dióxido de carbono.

Modulación de los grupos del sustrato

El grupo indol puede modularse aumentando la producción de precursores de triptófano y/o alterando las series de reacciones catabólicas que implican al indol-3-piruvato y/o al triptófano. Por ejemplo, la producción del ácido indol-3-acético a partir del indol-3-piruvato puede reducirse o eliminarse funcionalmente eliminando el gen que codifica EC 4.1.1.74 en la célula huésped. La producción de indol a partir de triptófano puede reducirse o eliminarse funcionalmente eliminando el gen que codifica EC 4.1.1.99 en la célula huésped. Alternativamente, puede utilizarse un exceso de indol como sustrato en un proceso in vitro o in vivo en combinación con cantidades crecientes del gen que codifica a EC 4.1.99.1 (Kawasaki et al., J. Ferm. and Bioeng., 82:604-6, 1996). Además, pueden realizarse modificaciones genéticas para aumentar la concentración de productos intermedios tales como D-eritrosa-4-fosfato y chorismato.

La producción de triptófano está regulada en la mayoría de los organismos. Un mecanismo es por inhibición de la retroalimentación de determinadas enzimas en la serie de reacciones; a medida que las concentraciones de triptófano aumentan, la velocidad de producción del triptófano disminuye. Por lo tanto, al utilizar una célula huésped modificada genéticamente para producir monatina mediante un producto intermedio de triptófano, puede utilizarse un organismo que no sea sensible a las concentraciones de triptófano. Por ejemplo, una cepa de Catharanthus roseus que sea resistente a la inhibición del crecimiento por varios análogos de triptófano se seleccionó por exposición repetida a altas concentraciones de 5-metiltriptófano (Schallenberg y Berlin, Z Naturforsch 34:541-5, 1979). La actividad resultante de la triptófano sintetasa de la cepa se efectuó menos por inhibición de la producción, probablemente debido a mutaciones en el gen. Asimismo, puede optimizarse una célula huésped utilizada para la producción de monatina.

La producción de triptófano puede optimizarse utilizando la evolución dirigida para desarrollar polipéptidos que sean menos sensibles a la inhibición del producto. Por ejemplo, puede realizarse cribado en placas que no contengan triptófano en el medio, pero con altas concentraciones de análogos de triptófano no metabolizables. Las patentes U.S. nº 5.756.345; nº 4.742.007 y nº 4.371.614 describen los procedimientos utilizados para aumentar la productividad del triptófano en un organismo de fermentación. La última etapa de la biosíntesis del triptófano es la adición de serina a indol; por consiguiente la disponibilidad de serina puede aumentarse o incrementar la producción de triptófano.

La cantidad de monatina producida por un organismo de fermentación puede aumentarse incrementando la cantidad de piruvato producida por el organismo hospedador. Determinadas levaduras, tales como Trichosporon cutaneum (Wang et al., Lett. Appl. Microbiol. 35:338-42, 2002) y Torulopsis glabrata (Li et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:451-9, 2001) sobreproducen piruvato y pueden utilizarse para practicar los métodos dados a conocer en la presente memoria. Además, pueden realizarse modificaciones genéticas a organismos para favorecer la producción de ácido pirúvico, tales como aquellas en la cepa W1485lip2 de E. coli (Kawasaki et al., J. Ferm. and Bioeng. 82:604-6, 1996).

Control de quiralidad

Las características de sabor de monatina pueden alterarse controlando su estereoquímica (quiralidad). Por ejemplo, pueden ser deseables diferentes estereoisómeros de monatina en diferentes mezclas de concentraciones para diferentes sistemas de alimento. Puede controlarse la quiralidad mediante una combinación de pH y polipéptidos.

2

La racemización en la posición C-4 de monatina (véase la molécula numerada anterior) puede tener lugar por desprotonación y reprotonación del carbono alfa, lo que puede ocurrir por un desplazamiento en el pH o por reacción con el cofactor PLP unido a una enzima como por ejemplo una racemasa o libre en la solución. En un microorganismo, es improbable que el pH se desplace lo suficiente para producir racemización, aunque el PLP sea abundante. Los procedimientos para controlar la quiralidad con polipéptidos dependen de la vía biosintética utilizada para la producción de monatina.

Cuando se forma monatina utilizando la serie de reacciones mostradas en la Fig. 2, puede considerarse lo siguiente. En una reacción biocatalítica, la quiralidad del carbono 2 puede determinarse mediante una enzima que convierte el indol-3-piruvato en MP. Múltiples enzimas (p. ej., procedentes de EC 4.1.2.- y 4.1.3.-) pueden convertir el indol-3-piruvato en MP, de este modo, la enzima que forma el estereoisómero deseado puede seleccionarse. Alternativamente, la enantioespecificidad de la enzima que convierte el indol-3-piruvato en MP puede modificarse mediante la utilización de la evolución directa, o anticuerpos catalíticos pueden modificarse genéticamente para catalizar la reacción deseada. Una vez se produce MP (ya sea enzimáticamente o por condensación química), el grupo amino puede añadirse estereoespecíficamente utilizando una transaminasa, tales como las descritas en la presente memoria. La configuración R o S del carbono 4 puede generarse dependiendo de si se utiliza una D- o L- ácido aromático aminotransferasa. La mayoría de las aminotransferasas son específicas para el estereoisómero L; sin embargo, D-triptófano aminotransferasas existen en determinadas plantas (Kohiba y Mito, Proceedings of the 8th Internacional Symposium on Vitamin B_{6} and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japón 1990). Además, se han identificado las D-alanina aminotransferasas (2.6.1.21), D-metionina-piruvato aminotransferasas (2.6.1.41) y tanto (R)-amino-2-metilpropanoato aminotransferasa (2.6.2.61) como (S)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferasa (2.6.1.22). Determinadas aminotransferasas pueden aceptar únicamente el sustrato para esta reacción con una configuración específica en el carbono C2. Por consiguiente, incluso si la conversión de MP no es estereoespecífica, la estereoquímica del producto final puede controlarse mediante la selección apropiada de una transaminasa. Como las reacciones son reversibles, la MP sin reaccionar (estereoisómero no deseado) pueden volver a reciclarse a sus constituyentes, y puede volver a formarse una mezcla racémica de MP.

Sustratos activadores

Los sustratos fosforilados, tales como el fosfoenolpiruvato (PEP), pueden utilizarse en las reacciones dadas a conocer en la presente memoria. Los sustratos fosforilados pueden ser energéticamente más favorables y, por lo tanto, pueden utilizarse para aumentar las velocidades y/o rendimientos de la reacción. En las condensaciones aldólicas, la adición de un grupo fosfato estabiliza el tautómero enol del sustrato nucleófilo, haciéndolo más reactivo. En otras reacciones, un sustrato fosforilado puede proporcionar un grupo saliente mejor. Asimismo, los sustratos pueden ser activados por conversión a derivados de CoA o a derivados de pirofosfato.

Utilización de monatina en una composición de goma de mascar

El estereoisómero S,S de monatina es aproximadamente entre 50 y 200 veces más dulce que la sacarosa en peso. El estereoisómero R,R de monatina es aproximadamente entre 2000 y 2400 veces más dulce que la sacarosa en peso. El dulzor de la monatina se calcula utilizando evaluadores sensitivos experimentados en un procedimiento de comparación de dulzor, en el que una solución más dulce de prueba se iguala por intensidad de dulzor frente a una serie de soluciones de referencia.

Específicamente, se puede evaluar el dulzor de un edulcorante en comparación con sacarosa utilizando un panel de evaluadores sensitivos entrenados con experiencia en el procedimiento de estimación de dulzor. Todas las muestras (en los mismos tampones) se sirven por duplicado a una temperatura de 22ºC \pm 1ºC). Las soluciones de la muestra pueden prepararse, por ejemplo, utilizando un tampón que comprende ácido cítrico al 0,16% (v/p) y citrato sódico al 0,02% (v/p) a \simpH 3,0. Las soluciones de ensayo, codificadas con códigos de números aleatorios de 3 dígitos, se presentan individualmente a los panelistas, en orden aleatorio. Se proporcionan asimismo patrones de referencia de sacarosa, que oscilan entre 2,0 y 10,0% de sacarosa (p/v), aumentando en escalones de 0,5% (p/v) de sacarosa. Se pide a los panelistas que estimen el dulzor comparando el dulzor de la solución de ensayo con los patrones de sacarosa. Esto se realiza tomando 3 sorbos de la solución de ensayo, seguidos de un sorbo de agua, seguido de 3 sorbos de patrón de sacarosa seguido de un sorbo de agua, etc. Los panelistas estiman el dulzor con una cifra decimal, p. ej., 6,8, 8,5. Se impone un periodo de descanso de cinco minutos entre la evaluación de las soluciones de ensayo. Se pide también a los panelistas que se enjuaguen bien y coman una galleta para reducir cualquier efecto potencial sobrante.

El índice equivalente de sacarosa (SEV) (p. ej., % de sacarosa), determinado por el panel de evaluadores sensitivos entrenados, se representa en función de la concentración de monatina para obtener una curva de respuesta a la dosis. La curva polinómica ajustada se aplica a la curva de respuesta a la dosis y se utiliza para calcular la intensidad o potencia de dulzor en un punto determinado, p. ej., 8% de SEV, dividiendo el índice equivalente de sacarosa (SEV) por la concentración de monatina (p. ej., % de monatina). Véase p. ej., la Fig. 15 (curva de respuesta a la dosis de R,R/S,S monatina); Fig. 14 (curva de respuesta a la dosis de R,R monatina).

La monatina es soluble en soluciones acuosas en concentraciones que son apropiadas para el consumo. Varias mezclas de estereoisómeros de monatina pueden ser cualitativamente mejores en determinadas matrices, o en mezcla con otros edulcorantes. Las mezclas de monatina con otros edulcorantes pueden utilizarse para maximizar la intensidad y/o propiedades de dulzor, y minimizar el coste. La monatina puede utilizarse en combinación con otros edulcorantes y/o otros ingredientes para generar una propiedad temporal similar a la sacarosa o para otras utilidades.

Por ejemplo, la monatina puede mezclarse con otros edulcorantes nutritivos y no nutritivos para conseguir propiedades de sabor determinadas u objetivos calóricos. De este modo las composiciones de edulcorante pueden incluir combinaciones de monatina con uno o más de los siguientes tipos de edulcorante: (1) alcoholes de azúcar (tales como eritritol, sorbitol, maltitol, manitol, lactitol, xilitol, isomalta, jarabes poco glucémicos, etc.); (2) otros edulcorantes de alta intensidad (tales como aspartamo, sacaralosa, sacarina, acesulfamo-K, esteviósido, ciclamato, neotamo, taumatina, alitamo, dihidrochalcona, monelina, glicirricina, mogrósido, filodulcina, mabinlina, brazzeína, circulina, pentadina, etc.) y (3) edulcorantes nutritivos (tales como sacarosa, tagatosa, azúcar invertido, fructosa, jarabe de maíz, jarabe de maíz rico en fructosa (HFCS), glucosa/dextrosa, trehalosa, isomaltulosa, etc.). La monatina puede utilizarse en mezclas tales como modificador de sabor para suprimir el regusto, potenciar otros sabores tales como limón o mejorar la característica de sabor temporal. Los datos también indican que monatina es cuantitativamente sinérgica con los ciclamatos (que se utilizan en Europa), pero no se observó sinergia cuantitativa significativa con edulcorantes de aspartamo, sacarina, acesulfamo-K, sacaralosa o de carbohidratos.

Debido a que la monatina no es un carbohidrato, puede utilizarse la monatina para disminuir el contenido en carbohidratos en las composiciones de goma de mascar. En una forma de realización, una cantidad (p. ej., una barra) de una composición de goma de mascar con monatina contiene menos calorías y carbohidratos que la misma cantidad de una composición de goma de mascar que contiene azúcar (p. ej., sacarosa o jarabe de maíz con alto contenido en fructosa). En otras formas de realización, las composiciones de goma de mascar que comprenden monatina (p. ej., que comprenden monatina y uno o más carbohidratos) proporcionan un regusto, sabor y dulzor a lo largo del tiempo que es comparable al proporcionado por composiciones de goma de mascar similares que contienen solamente carbohidratos como edulcorante. En una forma de realización, una cantidad de una composición de goma de mascar que comprende monatina contiene menos calorías y carbohidratos que la misma cantidad de una composición de goma de mascar que contiene sacarosa en lugar de monatina.

La monatina es estable en forma anhidra, y tiene una característica de sabor deseable sola o cuando se mezcla con carbohidratos. No parece que se descomponga irreversiblemente, sino que más bien forma lactonas y/o lactamas a pH bajos (en tampones acuosos) y alcanza un equilibrio. Puede racemizarse en la posición 4 solamente durante el tiempo en solución, pero típicamente esto se produce a pH altos. En general, la estabilidad de monatina es comparable o mejor que la del aspartamo y las características de sabor de monatina son comparables o mejor que las de otros edulcorantes de calidad, tales como aspartamo, alitamo y sacaralosa. La monatina no tiene el regusto indeseable asociado a algunos otros edulcorantes de alta intensidad tales como sacarina y esteviósido.

En determinadas formas de realización, las composiciones de goma de mascar de la invención comprenden una parte de base de goma y una parte soluble que incluye monatina. El término "soluble" en la expresión "parte soluble" significa que esta parte puede disolverse en la boca y/o en la saliva. La parte de base de goma se conserva en la boca durante la masticación mientras que la parte soluble se disipa con una fracción del sabor durante el tiempo que dura la masticación. En algunas formas de realización, la parte soluble contiene componentes adicionales tales como aromatizantes, colorantes, otros edulcorantes y/o un revestimiento.

Algunas formas de realización de goma de mascar azucarado comprenden un recubrimiento que es sacarosa. En otras formas de realización, las composiciones de goma de mascar se formulan de modo que se consideran sin azúcar. Determinadas formas de realización de goma de mascar exento de azúcar comprenden un recubrimiento (en forma de jarabe o cristalina) que es sorbital, maltitol, isomalta, xilitol o eritritol. Opcionalmente las composiciones de goma de mascar pueden comprender un recubrimiento que es un aromatizante, un fruto liofilizado y/o un colorante.

En determinadas formas de realización, la monatina está presente en una cantidad que comprende entre 0,001 y 1,1% en peso de la composición de goma de mascar (p. ej., entre 0,009 y 1% en peso, 0,01 y 0,3% en peso, 0,01 y 0,04% en peso ó 0,02 y 0,1% en peso), incluyendo cualquier valor determinado comprendido en este intervalo (p. ej., 0,001% en peso, 0,005% en peso, 0,01% en peso, 0,015% en peso, 0,02% en peso ó 0,025% en peso de la composición de goma de mascar). La monatina puede ser un estereoisómero determinado o una mezcla de diferentes estereoisómeros. Por ejemplo, de 0,009 a 0,1% en peso (p. ej., de 0,015 a 0,025% en peso) del estereoisómero R,R de monatina o de 0,1 a 1,1% en peso (p. ej., de 0,15 a 0,88% en peso) del estereoisómero S,S de monatina puede utilizarse en una composición de goma de mascar.

Base de goma

La composición de la base de goma determina típicamente si la goma se considera goma de mascar, goma de globo o una goma funcional. En determinadas formas de realización, la base de goma es inerte y no nutritiva y se prepara a partir de combinaciones de los siguientes componentes: elastómeros, suavizantes (plastificantes), emulsionantes, resina y rellenos.

Los ingredientes en las composiciones generalmente se consideran de calidad alimentaria, generalmente reconocidos como seguros (GRAS) y/o son aprobados por la U.S. Food and Drug Aministration (FDA). Los elastómeros proporcionan la naturaleza elástica, adherente a las gomas, y pueden incluir, por ejemplo, uno o más cauchos naturales (p. ej., látex ahumado, látex líquido y guayule), gomas naturales o elastómeros sintéticos. En algunas formas de realización incluyen jelutong, perillo, sorva, massaranduba balata, massaranduba chocolate, níspero, rosindinha, goma de mascar y gutta hang kang. Por ejemplo, la goma de mascar es una goma natural particularmente útil. En otras formas de realización, los elastómeros sintéticos incluyen copolímeros de butadieno-estireno, copolímeros de isobutileno-isopreno, elastómeros poliméricos de polibutadieno, poliisobutileno y vinilo. En determinadas formas de realización, un elastómero está presente en una base de goma en una cantidad comprendida en el intervalo entre el 3 y el 7% en peso (p. ej., entre el 3 y el 60% en peso, 3 y 50% en peso, 5 y 45% en peso, 10 y 50% en peso, 15 y 45% en peso o 20 y 40% en peso de la base de goma), incluyendo cualquier valor específico comprendido dentro del intervalo (p. ej., 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ó 65% en peso).

Las resinas pueden utilizarse para variar la consistencia de la base de goma y ayudar a suavizar el componente elastómero de la base de goma. Ejemplos no limitativos de resinas adecuadas incluyen una o más de las siguientes: un éster de colofonia, una resina terpénica como por ejemplo la resina terpénica de \alpha-pineno, \beta-pineno y/o d-limoneno, acetato de polivinal, alcohol polivinílico, acetato de vinil etileno y copolímero de acetato vinílico y laurato vinílico. En determinadas formas de realización, un éster de colofonia puede ser un éster de glicerol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster de glicerol de colofonia polimerizada, un éster de glicerol de colofonia parcialmente dimerizada, un éster de glicerol de colofonia, un éster de pentaeritrol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster metílico de colofonia, un éster metílico de colofonia parcialmente hidrogenada. En algunas formas de realización, la resina está presente en una cantidad que oscila entre aproximadamente el 5 y el 75% en peso de base de goma, incluyendo cualquier valor determinado dentro de este intervalo. Por ejemplo, la resina puede presentarse en una cantidad comprendida entre aproximadamente 5 y 45% en peso, 10 y 75% en peso, 10 y 30% en peso, 15 y 60% en peso o 20 y 50% en peso de base de goma.

Pueden utilizarse suavizantes (conocidos también como plastificantes) para modificar la facilidad de mascado y/o el regusto de la composición de goma de mascar. En determinadas formas de realización, los suavizantes incluyen aceites, grasas, ceras y emulsionantes. Los ejemplos no limitativos que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, sebo, sebo hidrogenado, manteca, aceites vegetales hidrogenados o parcialmente hidrogenados tales como de soja, canola, semillas de algodón, girasol, palma, coco, maíz, cártamo, o aceite de cáscara de palma, manteca de cacao, monoestearato de glicerol, triacetato de glicerol, abietato de glicerol, lecitina, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, monoglicéridos acetilados y ácidos grasos libres. Las ceras utilizadas habitualmente incluyen, por ejemplo, ceras de polipropileno/polietileno/Fisher-Tropsch, parafina, ceras microcristalinas y naturales tales como candelilla, cera de abejas y carnauba. Las ceras microcristalinas, especialmente las que presentan con un alto grado de cristalinidad, también pueden considerarse que incorporan agentes o modificadores de textura. En determinadas formas de realización, algunos jarabes de maíz, tales como Globe, proporcionan suavidez de la base de goma antes de la mezcla con otros azúcares, y para cuerpo y humectabilidad. En otras formas de realización, los suavizantes se presentan en una cantidad que oscila entre aproximadamente 0,5 y 30% en peso (p. ej., 0,5 y 25% en peso, 0,5 y 15% en peso, o entre 1 y 7% en peso) de la base de goma, incluyendo cualquier valor específico dentro del intervalo.

Los emulsionantes ayudan a formar una dispersión uniforme de fases no solubles/solubles y también pueden tener propiedades plastificantes. En determinadas formas de realización, los emulsionantes adecuados incluyen monoestearato de glicerol (GMS), lecitina (fosfatidilcolina), ácido poliglicerol poliglicinoleico (PPGR), mono y diglicéridos de ácidos grasos, diestearato de glicerol, triacetina, monoglicérido acetilado, triacetato de glicerol y estearato de magnesio. En otras formas de realización, los emulsionantes pueden estar presentes en una cantidad comprendida 1 y 30% en peso de una base de goma, p. ej., entre 2 y 30% en peso, 3 y 20% en peso o 5 y 15% en peso de la base de goma, incluyendo cualquier valor específico dentro del intervalo (p. ej., 5, 10, 15, 20 ó 25% en peso).

Además, la composición de goma de mascar puede incluir opcionalmente adyuvantes o rellenos en la base de goma y/o la fracción soluble de la composición. Los adyuvantes o rellenos adecuados incluyen, por ejemplo, lecitina, inulina, polidextrina, carbonato cálcico, carbonato de magnesio, silicato de magnesio, caliza molida, hidróxido de aluminio, silicato de aluminio, talco, arcilla, alúmina, dióxido de titanio y fosfato cálcico. En determinadas formas de realización, puede utilizarse lecitina como relleno inerte, para disminuir la cantidad de pegajosidad. En otras formas de realización, pueden también utilizarse copolímeros de ácido láctico, proteínas (como por ejemplo gluten y/o zeína) y/o guar para crear una goma que sea más fácilmente biodegradable. En otras formas de realización, pueden estar presentes adyuvantes o rellenos en una cantidad que oscile hasta el 20% en peso de la base de goma (p. ej., 1 al 20% en peso, 1 al 15% en peso, 1 al 10% en peso, 2 al 18% en peso o 5 al 15% en peso de la base de goma), incluyendo cualquier valor específico dentro del intervalo.

Asimismo, pueden añadirse también opcionalmente agentes colorantes y blanqueadores a la composición de goma de mascar, y pueden incluirse, por ejemplo, lacas de tipo FD&C, extractos de frutos y vegetales, dióxido de titanio, aminoácidos modificados térmicamente, polvo de cacao o mezclas de los mismos. En determinadas formas de realización, los agentes colorantes y blanqueadores pueden estar presentes en una cantidad que oscila entre 0 y 5% en peso (p. ej., entre 0 y 1% en peso) de la base de goma, incluyendo cualquier valor específico dentro del intervalo.

Los componentes adicionales de la base de goma pueden incluir opcionalmente uno o más antioxidantes o conservantes, tales como hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), tocoferoles, \beta carotenos, galato de propilo y acidulantes (p. ej., vitamina C). En determinadas formas de realización, los antioxidantes o conservantes pueden estar comprendidos entre 0 y 0,2% en peso de la base de goma (p. ej., entre 0 y aproximadamente 0,05% en peso, entre 0 y 0,08% en peso, 0,05% en peso o 0,1% en peso).

En algunas formas de realización, una fracción de la base de goma de una composición incluye entre el 3 y el 50% en peso de un elastómero, entre el 0,5 y el 25% en peso de un suavizante, entre el 2 y el 30% en peso de un emulsionante, entre el 5 y el 75% en peso de una resina y entre el 0 y el 20% en peso de un relleno, siendo el % en peso total de la fracción de base de goma 100. La base de goma puede incluir, por ejemplo, 30% en peso de resina terpénica, 15% en peso de aceite vegetal hidrogenado (p. ej., aceite de semillas de maíz hidrogenado), 2% en peso de lecitina, 2,5% en peso de poliisobutileno, 27% en peso de acetato de polivinilo; 12,45% en peso de carbonato cálcico, 11% en peso de copolímero de isobutileno-isopreno y 0,05% en peso de BHT.

En determinadas formas de realización, la fracción de la base de goma puede estar comprendida entre aproximadamente 5 y 95% en peso de la composición de goma de mascar, siendo el % en peso total de la composición 100. Por ejemplo, la base de goma puede estar comprendida entre aproximadamente 5 y 80% en peso, entre 10 y 50% en peso, entre 15 y 30% en peso o entre aproximadamente 20 y 35% en peso de la composición de goma de mascar.

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Fracción soluble

En algunas formas de realización de la invención, la fracción soluble de la goma de mascar incluye, además de monatina, edulcorantes de carga, suavizantes, edulcorantes de alta intensidad, agentes aromatizantes, agentes colorantes, adyuvantes, rellenos, componentes de una goma funcional (p. ej., nicotina) o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, pueden utilizarse edulcorantes de carga para proporcionar cuerpo o viscosidad así como para proporcionar un nivel deseado de dulzor. En determinadas formas de realización, los edulcorantes de carga incluyen tanto componentes azucarados como no azucarados y carbohidratos glucémicos inferiores y están constituidos entre aproximadamente 5 y 95% en peso de la composición de goma de mascar (por ejemplo, entre 20 y 80% en peso o 30 y 60% en peso) de la goma de mascar. En otras formas de realización, los edulcorantes azucarados incluyen sacarosa, dextrosa (p. ej. dextrosa de cerelosa), maltosa, dextrina, azúcar invertido anhidro, fructosa, jarabe de maíz rico en fructosa, levulosa, galactosa, sólidos de jarabe de maíz, y similares, solos o en combinación. Los edulcorantes sin azúcar y los componentes de carbohidratos glucérmicos inferiores pueden incluir, pero no se limitan a, tagatosa y alcoholes azucarados tales como sorbitol, manitol, xilitol, lactol, eritritol, maltitol, hidrolizados de almidón hidrogenado, isomalta, trehalosa, y similares, solos o en combinación.

En determinadas formas de realización, las composiciones de goma de mascar con monatina comprenden otros edulcorantes de alta intensidad y/o edulcorantes sin azúcar. Numerosos edulcorantes de alta intensidad son por lo menos 20 veces más dulces que la sacarosa. Éstos incluyen, pero no se limitan a, sacaralosa, aspartamo, sales de acesulfamo (por ejemplo, acesulfamo-K), alitamo, sacarina y sus sales, ácido ciclámico y sus sales, glicirricina, dihidrochalconas (p. ej., neohesperidina dihidrochalcona), taumatina, monelina, neotamo, esteviósido (extraído de las hojas de Stevia rebaudiana), mogrósido (extraído del fruto de Lo Han Guo), filodulcina (extraída de las hojas de Hydrangea macrophylla, aproximadamente 400 a 600 veces más dulce que la sacarosa), mabinlina, brazzeína, pentadina, y similares, solos o en combinación. En algunas formas de realización, el intervalo de los edulcorantes de alta intensidad oscila entre 0,001 y 5% en peso de la composición de goma de mascar (p. ej. 0,009 a 1% en peso de la composición de goma de mascar), incluyendo cualquier valor determinado dentro del intervalo. Por ejemplo, edulcorantes de alta intensidad tales como alitamo (2.000 veces más dulce que la sacarosa, 2.000 \times sacarosa) y taumatina (1.600-3.000 \times sacarosa) pueden estar presentes entre aproximadamente 0,02 y 0,10% en peso de la composición de goma de mascar; aspartamo y compuestos similares (200 \times sacarosa) pueden estar presentes entre aproximadamente 0,1 y 0,3% en peso de la composición de goma de mascar. En otras formas de realización, la monatina y un edulcorante de alta intensidad como por ejemplo el ciclamato o el acesulfamo K pueden utilizarse en una composición de goma de mascar. Por ejemplo, entre 0,05 y 0,7% en peso de monatina (p. ej., el estereoisómero S,S de monatina) y entre 0,01 y 0,2% en peso de acesulfamo K pueden utilizarse en una composición de goma de mascar.

En determinadas formas de realización, pueden utilizarse también potenciadores de dulzor, que solamente son dulces en presencia de otros compuestos como ácidos, en una composición de goma de mascar. Ejemplos no limitativos de potenciadores de dulzor incluyen la curculina y la miraculina (100 \times sacarosa).

En otras formas de realización, las soluciones acuosas de edulcorante tales como las que contienen sorbitol, hidrolizados de almidón hidrolizado, jarabe de maíz, jarabe de poliol (p, jarabe de maltitol), o combinaciones de las mismas, pueden utilizarse también como suavizantes y agentes aglutinantes en la composición de la goma.

En otras formas de realización, las composiciones de goma de mascar con monatina comprenden agentes aromatizantes, incluyendo las esencias naturales o artificiales y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los agentes aromatizantes pueden estar presentes en una cantidad comprendida dentro del intervalo entre aproximadamente 0,1 y 15% en peso de la composición de goma de mascar (p. ej., entre 0,1 y 10% en peso, 0,2 y 5% en peso o 0,5 y 3% en peso de la composición de goma de mascar). En determinadas formas de realización, el agente aromatizante es un aceite esencial, como por ejemplo el aceite procedente de una planta o de un fruto, aceite de menta, aceite de hierbabuena, otros aceites de menta, aceite de clavo, aceite de canela, aceite de gaulteria, laurel, tomillo, hoja de cedro, nuez moscada, pimienta inglesa, salvia, macis, almendras, anís y similares). En otras formas de realización, el agente aromatizante es un extracto vegetal o una esencia de frutos tales como de manzana, plátano, sandía, pera, melocotón, uvas, fresa, frambuesa, cerezas, ciruela, piña y albaricoque, o una combinación de aromatizantes de frutas (p. ej., tutti fruti). En otras formas de realización, el agente aromatizante es un sabor cítrico, como por ejemplo un extracto, esencia o aceite de limón, lima, naranja, mandarina, uvas, limón o quinoto. En las formas de realización, estos agentes aromatizantes pueden utilizarse en forma líquida o sólida y pueden utilizarse individualmente o en mezcla.

Los ingredientes opcionales, tales como agentes colorantes, emulsionantes, agentes farmacéuticos (p. ej., nicotina, aspirina, dimenhidrinato, cafeína) o nutrientes (p. ej., calcio o vitaminas), también pueden incluirse sen la goma de mascar. Los agentes colorantes y emulsionantes están descritos anteriormente.

En determinadas formas de realización, uno o más de los componentes de la composición de goma de mascar pueden estar encapsulados. Por ejemplo, la monatina y/o otros edulcorantes de alta intensidad, agentes colorantes y/o agentes aromatizantes pueden estar encapsulados. La encapsulación de monatina y/o de otros edulcorantes de alta intensidad puede potenciar la intensidad del dulzor por adelantado, prolongar la duración del dulzor y mejorar la protección y estabilidad del edulcorante. La encapsulación puede proteger también los agentes aromatizantes. Véase, por ejemplo, las patentes U.S. nº 4.981.698, nº 5.004.595 y nº 5.266.335 para los métodos de encapsulación de dichos componentes.

Cualquier composición de goma de mascar puede incluir monatina. En algunas formas de realización, las composiciones de goma de mascar incluyen aproximadamente entre el 17 y el 23% de base de goma de mascar (p. ej. 20% en peso), entre el 55 y el 65% en peso de edulcorante de carga (p. ej., 60% en peso), entre el 15 y el 21% en peso de jarabe de glucosa (p. ej., 18% en peso), entre el 0,05 y el 0,15% en peso de esencia (p. ej., 0,1% en peso) y entre el 0,05 y el 0,15% en peso de otros aditivos (p. ej., 0,1% en peso). En una forma de realización, la composición de goma de mascar contiene aproximadamente el 20% en peso de base de goma de mascar, aproximadamente el 3% en peso de glicerina, aproximadamente el 8% en peso de glucosa, aproximadamente el 0,5% en peso de lecitina, aproximadamente el 1% de aromatizante de frutas (p. ej., fresa), aproximadamente el 0,07% en peso de colorante (p. ej., colorante rojo), aproximadamente el 47% en peso de azúcar, aproximadamente el 20% en peso de inulina o de carga de polidextrina, aproximadamente el 0,15% en peso de acesulfamo K y 0,5% en peso de S,S monatina. En determinadas formas de realización, la R,R monatina puede utilizarse en lugar de la mezcla acesulfamo K/S,S monatina sustituyendo aproximadamente el 0,02% en peso de monatina y el resto puede rellenarse con azúcar o relleno de carga.

En otra forma de realización, la composición de goma de mascar sin azúcar incluye aproximadamente entre el 21 y 27% en peso (p. ej., 24,5% en peso) de una base de goma de mascar sin azúcar, aproximadamente entre el 13 y 19% en peso (p. ej., 16,1% en peso) de una solución de sorbitol, aproximadamente entre 0,05 y 2,0% en peso (p. ej., 1,5% en peso) de un agente aromatizante como por ejemplo una esencia de menta, aproximadamente entre el 2 y el 3,5% en peso (p. ej., 2,8% en peso) de glicerina y aproximadamente entre 0,009 y 1,1% en peso de monatina, dependiendo de la mezcla de estereoisómeros de monatina que se utilicen, y entre aproximadamente 50 y 60% en peso (p. ej., 55% en peso) de polvo de sorbitol.

Preparación de composiciones de goma de mascar

Pueden prepararse composiciones de goma de mascar utilizando las técnicas conocidas. En general, la goma de mascar puede prepararse añadiendo sucesivamente varios ingredientes de goma de mascar a cualquier mezclador disponible comercialmente conocido en la materia (p. ej., un mezclador de cuchilla Sigma). Véase, por ejemplo, las patentes U.S. nº 5.334.397 y nº 5.800.848. Una vez los ingredientes se han mezclado intensamente, la masa de goma de mascar puede descargarse del mezclador y dar forma en las formas deseadas como por ejemplo laminando en hojas y cortando en barras, extruyendo en trozos o moldeando en gránulos o comprimidos. Son posibles una variedad de formas de gomas de mascar y gomas de globo, incluyendo barras, trozos, comprimidos, cargas en el centro, bolas, formas de frutas, formas de cigarrillo, monedas, gomas de mascar tubulares y gomas de mascar en polvo comprimido.

En una forma de realización, la base de goma de mascar se derrite en primer lugar (p. ej., a una temperatura que oscila entre 80 y 125ºC) y se añade al mezclador en marcha. Alternativamente, la base puede derretirse en el propio mezclador. En este momento puede añadirse también colorante. A continuación puede añadirse un suavizante junto con el jarabe y una fracción del agente de carga. Las fracciones adicionales de los agentes de carga pueden añadirse a continuación al mezclador. En determinadas formas de realización, los ingredientes de sabor se añaden a la mezcla de goma de mascar cerca del final del proceso de mezclado. Pueden prepararse gomas de mascar de manera continua o discontinua. Puede utilizarse almidón de maíz o talco para pulverizar los productos de goma de mascar antes del envasado.

Las pruebas organolépticas evalúan el sabor y la textura de las composiciones de goma de mascar y/o sus componentes, como por ejemplo un recubrimiento. Ejemplos de pruebas organolépticas incluyen las pruebas de clasificación oral y las pruebas triangulares. En las pruebas de clasificación oral, las composiciones de goma de mascar que tienen algunas formulaciones, pero que comprenden diferentes edulcorantes, son evaluadas en paralelo por tres o más panelistas. Los panelistas clasifican la intensidad del dulzor de cada composición. En las pruebas triangulares, se administra a tres o más panelistas tres muestras de composiciones de goma de mascar, en las que dos muestras tienen la misma formulación y una tercera muestra de referencia/comparación tiene una formulación diferente. Se pide a los panelistas que determinen cuál de las formulaciones tiene dulzor u otras características organolépticas que la diferencian de las otras dos.

Es de esperar que la goma de mascar que contiene monatina, en comparación con las gomas de mascar que contienen otros edulcorantes, presente dulzor más duradero mientras que al masticar, una mayor duración en la goma de mascar, mayor estabilidad al calor y al ácido, así como mejores características de sabor y ventajas de comercialización.

Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación y expresión de triptófano aminotransferasas

Este ejemplo describe los métodos que se utilizan para clonar las triptófano aminotransferasa, que pueden utilizarse para convertir el triptófano en indol-3-piruvato.

Visión de conjunto experimental

Se clonaron once genes que codifican aminotransferasas en E. coli. Estos genes eran D-alanina aminotransferasa de Bacillus subtilis (dat, nº de registro Y14082.1 en Genbank 28.622 a 29.470 bp y nº de registro NP_388848.1 en Genbank, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), tirosina aminotransferasa de Sinorhizobium meliloti (denominada también Rhizobium meliloti) (tatA, SEC. ID. nº: 1 y nº: 2, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), tirosina aminotransferasa de la cepa 2.4.1 de Rhodobacter sphaeroides (tatA impuesta por homología, SEC. ID. nº: 3 y nº: 4, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), tirosina aminotransferasa de 35053 de R. sphaeroides (impuesta por homología, SEC. ID. nº: 5 y nº: 6, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aminotransferasa de amplio sustrato de Leishmania major (bsat, impuesta por homología a fragmentos peptídicos de L. mexicana, SEC. ID. nº: 7 y nº: 8, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aminotransferasa aromática de Bacillus subtilis (araT, impuesta por homología, SEC. ID. nº: 9 y nº: 10, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aminotransferasa aromática de Lactobacillus amylovorus (araT impuesta por homología, SEC. ID. nº: 11 y nº: 12, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aminotransferasa de sustrato múltiple de 35053 de R. sphaeroides (impuesta por homología, SEC. ID. nº: 13 y nº: 14, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aminotransferasa de sustrato múltiple de la cepa 2.4.1 de Rhodobacter sphaeroides (msa impuesta por homología, nº de registro en Genbank AAAE01000093.1, 14743 a 16155 bp y nº de registro en Genbank ZP00005082.1, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aspartato aminotransferasa de Escherichia coli (apsC, nº de registro en Genbank AE000195.1, 2755 a 1565 bp y nº de registro en Genbank AAC74014.1, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) y tirosina aminotransferasa de E. coli (tyrB, SEC. ID. nº: 31 y nº: 32, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente). Se clonaron los genes, se expresaron y se determinó su actividad en la conversión de triptófano a indol-3-piruvato, junto con enzimas disponibles comercialmente. Los once clones presentaban actividad.

Identificación de cepas bacterianas que pueden contener polipéptidos con la actividad deseada

Ninguno de los genes de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) se diseñaron como triptófano aminotransferasas. Sin embargo, se han identificado los organismos que presentan esta actividad enzimática. La actividad de L-triptófano aminotransferasa (TAT) se ha medido en extractos celulares o de proteínas purificadas de las siguientes fuentes: cepa rizobacteriana de Festuca octoflora, mitocondrias y citosol de guisante, células de la hiel de la corona del girasol, Rhizobium leguminosarum biovar trifoli, Erwinia herbicola pv gypsophilae, Pseudomonas syringae pv. savastanoi, Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum y brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii, cerebro de rata, hígado de rata, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas fluorescens CHA0, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, plantones de trigo, cebada, Phaseolus aureus (judía mung), Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Leishmania sp., maíz, brotes de tomate, plantas de guisante, tabaco, cerdo, Clostridium sporogenes y Streptomyces griseus.

Ejemplo 2

Conversión de indol-3-lactato en indol-3-piruvato

Tal como se muestra en las Figs. 1 y 3, el ácido indol-3-láctico puede utilizarse para producir indol-3-piruvato. La conversión entre el ácido láctico y el piruvato es una reacción reversible, ya que es la conversión entre indol-3-piruvato e indol-3-lactato. La oxidación de indol-lactato se siguió de forma típica debido a la gran cantidad de antecedentes a 340 nm del indol-3-piruvato.

La mezcla patrón de análisis contenía fosfato potásico 100 mM, pH 8,0, NAD^{+} 0,3 mM, 7 unidades de lactato deshidrogenasa (LDH) (Sigma-L2395, St. Louis, MO) y sustrato 2 mM en 0,1 ml. El análisis se realizó por duplicado en una placa de microvaloración transparente a UV, utilizando un lector de placas Molecular Devices SpectraMax Plus. Se mezclaron el polipéptido y el tampón y se pipetearon en pocillos que contenían el ácido indol-3-láctico y NAD^{+} y se leyó la absorbancia a 340 nm de cada pocillo a intervalos de 9 segundos después de un breve mezclado. Se mantuvo la reacción a 25ºC durante 5 minutos. Al aumento en la absorbancia a 340 nm sigue la producción de NADH procedente del NAD^{+}. Se hicieron referencias negativas por separado sin NAD^{+} y sin sustrato. D-LDH de Leuconostoc mesenteroides (nº de catálogo L2395 de Sigma) parecía presentar más actividad con los sustratos derivados de indol que lo hacía L-LDH de Bacillus stearothermophilus (número L5275 de catálogo de
Sigma).

Se utilizaron métodos similares con el ácido D-láctico y NAD^{+} o NADH y piruvato, sustratos naturales de polipéptidos D-LDH. La V_{máx} para la reducción del piruvato fue de 100 a 1.000 veces mayor que la V_{máx} para la oxidación de lactato. La V_{máx} para la reacción de oxidación del ácido indol-3-láctico con L-LDH fue aproximadamente un quinto de la que contiene ácido láctico. La presencia de indol-3-piruvato se midió también siguiendo el cambio en la absorbancia a 327 (derivado de enol-borato) utilizando tampón de borato sódico 50 mM que contiene EDTA 0,5 mM y arseniato sódico 0,5 mM. Se observaron cambios de absorbancia, pequeños, pero repetibles, en comparación con las referencias negativas tanto para polipéptidos L como D-LDH.

Además, las lactato deshidrogenasas de amplia especificidad (enzimas con actividad asociada a EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 y/o EC 1.1.2.3) pueden clonarse y utilizarse para preparar indol-3-piruvato a partir de ácido indol-3-láctico. Las fuentes de deshidrogenasas de amplia especificidad incluyen E. coli, Neisseria gonorrhoeae y Lactobacillus plantarum.

Alternativamente, puede producirse indol-3-piruvato que contiene indol-3-lactato con extractos celulares de Clostridium sporogenes que contiene una indol lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.110); o extractos celulares de Trypanosoma cruzi epimastigotes que contienen p-hidroxifenilactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.222) conocida por tener actividad sobre indol-3-piruvato; o Pseudomonas acidovorans o extractos celulares de E. coli, que contienen una lactato de imidazol-5-ilo deshidrogenasa (EC 1.1.1.111); o Coleus blumei, que contiene una hidroxifenilpiruvato reductasa (EC 1.1.1.237); o Candida maltosa que contiene lactato D-aromático deshidrogenasa (EC 1.1.1.222). Las referencias que describen dichas actividades incluyen, Nowicki et al. (FEMS Microbiol. Lett. 71:119-24, 1992), Jean y Demos (Canadian J. Microbiol. 14 1968, Coote y Hassall (Biochem. J. 111:237-9, 1969), Cortese et al. (C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 162 390-5, 1968), Petersen y Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci. 43 501-4, 1988) y Bhatnagar et al. (J. Gen Microbiol. 135:353-60, 1989). Además, una lactato oxidasa como por ejemplo una de Pseudomonas sp. (Gu et al. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic: 18:299-305, 2002), puede utilizarse para la oxidación del ácido indol-3-láctico a indol-3-piruvato.

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Ejemplo 3

Conversión de L-triptófano en indol-3-piruvato utilizando L-aminoácido oxidasa

Este ejemplo describe los métodos utilizados para convertir triptófano en indol-3-piruvato mediante una oxidasa (EC 1.4.3.2), como alternativa a la utilización de triptófano aminotransferasa como se describe en el Ejemplo 1. Se purificó la L-aminoácido oxidasa procedente de Crotalus durissus (Sigma, St. Louis, MO, nº A-2805 de catálogo). Los números de registro de las L-aminoácido oxidasas para la clonación molecular incluyen: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, O93364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 y Z48565.

Las reacciones se realizaron en tubos de microcentrifugadora en un volumen total de 1 ml, se incubaron durante 10 minutos agitando a 37ºC. La mezcla de reacción contenía L-triptófano 5 mM, tampón de fosfato sódico 100 mM pH 6,6, arseniato sódico 0,5 mM, EDTA 0,5 mM, tetraborato sódico 25 mM, 0,016 mg de catalasa (83 U, Sigma C-3515), 0,008 mg de FAD (Sigma) y 0,005 a 0,125 unidades de L-aminoácido oxidasa. Las referencias negativas contenían todas componentes excepto triptófano, y los blancos contenían todos componentes excepto la oxidasa. Se utilizó catalasa para eliminar el peróxido de hidrógeno formado durante la desaminación oxidativa. Se utilizaron tetraborato y arseniato sódicos para estabilizar la forma enol-borato del indol-3-piruvato, que presenta una absorbancia máxima a 327 nm. Se prepararon patrones de indol-3-piruvato a concentraciones de 0,1 a 1 mM en la mezcla de
reacción.

La L-aminoácido oxidasa adquirida tenía una actividad específica de 540 \mug de indol-3-piruvato formado por minuto por mg de proteína. Éste es el mismo orden de magnitud que la actividad específica de las enzimas de triptófano aminotransferasa.

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Ejemplo 4

Conversión de indol-3-piruvato en ácido 2-hidroxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico con una aldolasa

Este ejemplo describe los procedimientos que pueden utilizarse para convertir el indol-3-piruvato en MP utilizando una aldolasa (liasa) (Fig. 2). Las condensaciones aldólicas son reacciones que forman enlaces carbono-carbono entre el carbono \beta del aldehído o cetona y el carbono carbonilo de otro aldehído o cetona. Se forma un carbanión en el carbono adyacente al grupo carbonilo de un sustrato, y sirve como nucleófilo para atacar el carbono carbonilo del segundo sustrato (carbono electrófilo). Más frecuentemente, el sustrato electrófilo es un aldehído, de modo que la mayoría de las aldolasas están comprendidas en la categoría EC 4.1.2.-. Con mucha frecuencia, el sustrato nucleófilo es el piruvato. Es menos frecuente que las aldolasas catalicen la condensación entre los dos cetoácidos o dos
aldehídos.

Sin embargo, se han identificado aldolasas que catalizan la condensación de dos ácidos carboxílicos. Por ejemplo, la patente EP 1045-029 describe la producción de ácido L-4-hidroxi-2-cetoglutárico procedente del ácido glioxílico y piruvato utilizando un cultivo de Pseudomonas (EC 4.1.3.16). Además, la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasa, EC 4.1.3.17) puede catalizar la condensación de dos cetoácidos. Por consiguiente, se utilizaron polipéptidos de aldolasa similares para catalizar la condensación de indol-3-piruvato con piruvato.

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Clonación

Las 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasas (ProA aldolasa, EC 4.1.3.17) y la 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato liasa (KHG aldolasa, EC 4.1.3.16) catalizan reacciones muy similares a la reacción de la aldolasa de la Fig. 2. Se diseñaron cebadores con prolongaciones compatibles para el vector pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI).

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Resultados de la actividad con los productos del gen proA

Tanto los montajes del gen proA de C. testosteroni como los del gen SMc00502 de S. meliloti tenían grandes niveles de expresión cuando se inducían con IPTG. Las proteínas recombinantes eran muy solubles, como se determinó por análisis SDS-PAGE de la proteína total y muestras del extracto celular. El producto del gen de C. testosteroni se purificó hasta >95% de pureza. Debido al rendimiento del producto del gen de S. meliloti era muy bajo después de la purificación por afinidad utilizando el cartucho His-Bind, se utilizó extracto celular para los análisis
enzimáticos.

Ambas aldolasas recombinantes catalizaron la formación de MP a partir del indol-3-piruvato y piruvato. Para la actividad enzimática se requería la presencia tanto del magnesio divalente como del fosfato potásico. Ningún producto era apreciable cuando el indol-3-piruvato, el piruvato o el fosfato potásico estaban ausentes. Se formó también una pequeña cantidad del producto en ausencia de la enzima (típicamente de un orden de magnitud inferior a cuando la enzima estaba presente).

El pico del producto eluyó de la columna C18 en fase inversa algo después del patrón indol-3-piruvato, el espectro de masas de este pico presentaba un ión precursor producido por colisiones ([M+H]^{+}) de 292,1, el ión precursor esperado para el producto MP. Los fragmentos derivados principales presentes en el espectro de masas incluían los que presentan m/z=158 (ión 1H-indol-3-carbaldehído carbonio), 168 (ión 3-buta-1,3-dienil-1H-indol carbonio), 274 (292 - H_{2}O), 256 (292 - 2 H_{2}O), 238 (292 - 3 H_{2}O), 228 (292 - CH_{4}O_{3}) y 204 (pérdida de piruvato). El producto también presentaba un espectro UV característico de otros compuestos que contienen indol como por ejemplo triptófano, con la \lambda_{máx} de 279 a 280 y un pequeño lomo a aproximadamente 290 nm.

La cantidad de MP producida por la aldolasa de C. testosteroni aumentó con un incremento en la temperatura de reacción desde la temperatura ambiente hasta 37ºC, de la cantidad de sustrato y de la cantidad de magnesio. La actividad sintética de la enzima se redujo al aumentar el pH, el producto máximo observado fue a pH 7. Basándose en los patrones de triptófano, la cantidad de MP producida en un análisis estándar que utiliza 20 mg de proteína purificada fue aproximadamente de 10 a 40 \mug por 1 ml de reacción.

Debido al alto grado de homología de las secuencias de codificación de la aldolasa de ProA de S. meliloti y C. testosteroni, con otros genes descritos anteriormente, es de esperar que todos los productos génicos recombinantes puedan catalizar esta reacción. Además, es de esperar que las aldolasas que tienen treonina (T) en las posiciones 59 y 87, arginina (R) en la 119, aspartato (D) en la 120 e histidina (H) en las 31 y 71 (referidas al sistema de numeración de C. testosteroni) presenten similar actividad.

Resultados de la actividad con los productos del gen khg

Tanto los montajes del gen khg de B. subtilis como los de E. coli presentaban altos niveles de expresión de la proteína cuando se producían con IPTG, mientras que el khg de S. meliloti presentaba un nivel inferior de expresión. Las proteínas recombinantes eran muy solubles, según se interpretó por el análisis SDS-PAGE de las proteínas y extractos celulares totales. Los productos del gen khg de B. subtilis y E. coli se purificaron hasta >95% de pureza; el rendimiento del producto del gen de S. meliloti no fue tan alto tras la purificación por afinidad utilizando un cartucho His-Bind.

No existen pruebas de que para la actividad de esta enzima se necesiten el magnesio y el fosfato. Sin embargo, la bibliografía informa que se realizan análisis en tampón de fosfato sódico, y la enzima supuestamente es bifuncional y presenta actividad en los sustratos fosforilados como por ejemplo el 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato (KDPG). Se realizó el análisis enzimático como se describió anteriormente, y en algunos casos se omitió el fosfato. Los resultados indican que las aldolasas KHG recombinantes produjeron MP, pero no fueron tan activas como las aldolasas de ProA. En algunos casos el nivel de MP producido por KHG fue casi idéntico a la cantidad producida por magnesio y fosfato solos. El fosfato no parece aumentar las actividades de KHG. La enzima de Bacillus presentó la mayor actividad, aproximadamente del 20 al 25% de actividad mayor que la del magnesio y fosfato solos, tal como se determina por SRM (véase el Ejemplo 10). La enzima de Sinorhizobium presentó la menor cantidad de actividad, que puede estar asociada a los problemas de plegamiento y solubilidad observados en la expresión. Las tres enzimas presentaban el glutamato con punto activo (posición 43 en el sistema de numeración de B. subtilis) así como la lisina requerida para la formación de la base de Shiff con piruvato (posición 130); sin embargo, la enzima de B. subtilis contiene una treonina en la posición 47, un resto de punto activo, mejor que la arginina. La KHG de B. subtilis es más pequeña y parece estar en un grupo distinto de las enzimas de S. melitoti y E. coli, con otras enzimas que presentan la treonina con punto activo. Las diferencias en el punto activo pueden ser la razón de la actividad aumentada de la enzima de B. subtilis.

Mejora de actividad de aldolasa

Los anticuerpos catalíticos pueden ser tan eficaces como las aldolasas naturales, aceptan una amplia gama de sustratos y pueden utilizarse para catalizar la reacción mostrada en la Fig. 2.

Las aldolasas pueden mejorarse también por evolución dirigida, por ejemplo como se describió anteriormente para la aldolasa KDPG (muy homóloga a KHG descrita anteriormente) desarrollada por mezcla de ADN y PCR propensa a error para eliminar el requisito del fosfato e invertir la enantioselectividad. Los polipéptidos de la aldolasa KDPG son útiles en reacciones bioquímicas ya que son muy específicos para el sustrato donante (en la presente memoria, piruvato), pero son relativamente flexibles con respecto al sustrato receptor (es decir, indol-3-piruvato) (Koeller y Wong, Nature 409:232-9, 2001). La aldolasa KHG presenta actividad para la condensación del piruvato con numerosos ácidos carboxílicos. Las versiones de mamífero de la aldolasa KHG se cree que tienen especificidad más amplia que las versiones bacterianas, incluyendo la actividad mayor sobre 2-oxoglutarato de 4-hidroxi-4-metilo y la aceptación de ambos estereoisómeros de 4-hidroxi-2-cetoglutarato. Las fuentes bacterianas parecen tener una preferencia de 10 veces para el estereoisómero R. Existen casi 100 homólogos de KHG disponibles en las bases de datos genómicas, y se ha demostrado actividad en Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli, y tejidos de mamífero. Estas enzimas pueden utilizarse como punto de partida para ajustar la enantioespecificidad que se desea para la producción de monatina.

Las aldolasas que utilizan piruvato y otro sustrato que es un cetoácido y/o tiene un grupo hidrófobo voluminoso como indol pueden "desarrollarse" para adaptar la especificidad, velocidad y selectividad del polipéptido. Además de las aldolasas de KHG y ProA demostradas en la presente memoria, los ejemplos de estas enzimas incluyen, pero no se limitan a: aldolasa de KDPG y polipéptidos relacionados (KDPH); transcarboxibenzalpiruvato hidratasa aldolasa de Nocardioides st; 4-(2-carboxifenil)-2-oxobut-3-enoato aldolasa (2'-carboxibenzalpiruvato aldolasa) que condensa piruvato y 2-carboxibenzaldehído (sustrato que contiene anillo aromático); trans-O-hidroxibencilidenpiruvato hidratasa-aldolasa de Pseudomonas putida y Sphingomonas aromaticivorans, que también utiliza piruvato y un aldehído que contiene aromáticos como sustrato; 3-hidroxiaspartato aldolasa (eritro-3-hidroxi-L-aspartato glioxilato liasa), que utiliza 2-oxoácidos como sustratos y se cree que está en el organismo Micrococcus denitrificans; benzoín aldolasa (benzaldehído liasa), que utiliza sustratos que contienen grupos bencilo; dihidroneopterin aldolasa; L-treo-3-fenilserina benzaldehído-liasa (fenilserina aldolasa) que condensa glicina con benzaldehído; 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa; 1,2-dihidroxibenzilpiruvato aldolasa; y 2-hidroxibenzalpiruvato aldolasa.

Un polipéptido que presenta la actividad deseada puede seleccionarse mediante el cribado de los clones de interés utilizando los procedimientos siguientes. Los auxótrofos de triptófano se transforman con vectores que llevan los clones de interés en una casete de expresión y se cultivan en un medio que contiene pequeñas cantidades de monatina o MP. Dado que las reacciones de las aminotransferasas y la aldolasa son reversibles, las células pueden producir triptófano a partir de una mezcla racémica de monatina. Asimismo, pueden identificarse los organismos (tanto recombinantes como naturales) por su capacidad para utilizar MP o monatina como fuente de carbono y de energía. Una fuente de aldolasas diana consiste en los bancos de expresión de varias cepas de Pseudomonas y rizobacterias. Las pseudomónadas tienen muchas series de reacciones catabólicas raras para la degradación de moléculas aromáticas y también contienen muchas aldolasas. Dado que las rizobacterias contienen aldolasas, son conocidas por desarrollarse en la rizoesfera vegetal, y tienen muchos de los genes descritos para la construcción de una ruta biosintética de monatina.

Ejemplo 5

Síntesis química del precursor de monatina

El Ejemplo 4 describía un método de utilización de una aldolasa para convertir el indol-3-piruvato en MP. Este ejemplo describe un método alternativo de sintetizar MP químicamente. MP puede formarse utilizando una condensación tipo aldólica pura (Fig. 4). En resumen, una reacción de tipo aldol típica implica la generación de un carbanión del éster piruvato utilizando una base fuerte, como por ejemplo LDA (diisopropilamida de litio), hexametildisilazano de litio o butil litio. El carbanión que se genera reacciona con el indol-piruvato para formar el producto acoplado.

Los grupos protectores que pueden utilizarse para proteger el nitrógeno del indol incluyen, pero no se limitan a: t-butiloxicarbonilo (Boc) y benciloxicarbonilo (Cbz). Los grupos de bloqueo para los ácidos carboxílicos incluyen, pero no se limitan a, ésteres de alquilo (por ejemplo, ésteres metílicos, etílicos, bencílicos). Cuando se utiliza dichos grupos protectores, no es posible controlar la estereoquímica del producto que se forma. Sin embargo, si R2 y/o R3 son grupos protectores quirales (Fig. 4), tales como (S)-2-butanol, mentol o una amina quiral, esto puede favorecer la formación de un enantiómero MP sobre el otro.

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Ejemplo 6

Conversión de triptófano o indol-3-piruvato en monatina

En un procedimiento in vitro que utiliza dos enzimas, una aminotransferasa y una aldolasa, se produjo monatina a partir de triptófano y piruvato. En la primera etapa el alfa-cetoglutarato fue el receptor y el grupo amino del triptófano en una reacción de transaminación que genera indol-3-piruvato y glutamato. Una aldolasa catalizó la segunda reacción en la que el piruvato se hizo reaccionar con indol-3-piruvato, en presencia de Mg^{2+} y fosfato, generando el derivado alfa-ceto de monatina (MP), ácido 2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico. La transferencia del grupo amino del glutarato formado en la primera reacción produjo el producto deseado, monatina. La purificación y caracterización del producto demostró que el estereoisómero formado era la S,S-monatina. Los sustratos, enzimas y condiciones alternativos se describen también como mejoras que se realizaron en este procedimiento.

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Enzimas

La aldolasa, 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasa (ProA aldolasa, gen proA) (EC 4.1.3.17) de Comamonas testosteroni se clonó, expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 4. Las 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato liasas (KHG aldolasas) (EC 4.1.3.16) procedentes de B. subtilis, E. coli y S. meliloti se clonaron, expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 4.

Las aminotransferasas utilizadas junto con las aldolasas para producir monatina eran L-aspartato aminotransferasa codificada por el gen aspC de E. coli, la tirosina aminotransferasa codificada por el gen tyrB de E. coli, la enzima TatA de S. meliloti, la aminotransferasa de amplio sustrato codificada por el gen bsat de L. major, o la glutamicoxaloacético transaminasa de corazón de cerdo (tipo IIa). La clonación, expresión y purificación de las proteínas no de mamífero se describen en el Ejemplo 1. La glutamicoxaloacético transaminasa del corazón de cerdo (tipo IIa) se adquirió en Sigma (nº G7005).

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Procedimiento que utiliza ProA aldolasa y L-aspartato aminotransferasa

La mezcla de reacción contenía acetato amónico 50 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 4 mM, fosfato potásico 3 mM, fosfato de piridoxal 0,05 mM, piruvato amónico 100 mM, triptófano 50 mM, alfa-cetoglutarato 10 mM, 160 mg de aldolasa ProA de C. testosteroni recombinante (extracto celular impurificado, \sim30% de aldolasa), 233 mg de L-aspartato aminotransferasa de E. coli recombinante (extracto celular impurificado, \sim40% de aminotransferasa) en un litro. Todos los componentes excepto las enzimas se mezclaron y se incubaron a 30ºC hasta que se disolvió el triptófano. Se añadieron a continuación las enzimas y se incubó la solución de reacción a 30ºC con agitación suave (100 rpm) durante 3,5 horas. 0,5 y 1 hora después de la adición de las enzimas, se añadieron alícuotas de triptófano sólido (500 mmoles de cada una) a la reacción. Todo el triptófano añadido no se disolvió, pero la concentración se mantuvo a 50 mM o superior. Después de 3,5 horas, se filtró el triptófano sólido. El análisis de la mezcla de reacción por LC/MS utilizando una cantidad definida de triptófano como patrón demostró que la concentración de triptófano en la solución era de 60,5 mM y la concentración de monatina era de 5,81 mM (1,05 g).

Se utilizaron los procedimientos siguientes para purificar el producto final. El noventa por ciento de la solución transparente se aplicó a una columna de resina AG50W-X8 de BioRad (225 ml; capacidad de enlace de 1,7 meq/ml). Se lavó la columna con agua, recogiendo las fracciones de 300 ml, hasta que la absorbancia a 280 nm fue <5% de la primera fracción de flujo a través. Se eluyó a continuación la columna con acetato amónico 1 M, pH 8,4, recogiendo 4 fracciones de 300 ml. Las 4 fracciones contenían monatina y se evaporaron hasta 105 ml utilizando un roto-evaporador con un baño de agua tibia. Se formó un precipitado a medida que se reducía el volumen y se filtró durante el proceso de evaporación.

El análisis de las fracciones de la columna por LC/MS demostró que el 99% del triptófano y la monatina estaban unidos a la columna. El precipitado que se formó durante el proceso de evaporación contenía >97% de triptófano y <2% de monatina. La relación de triptófano a producto en el sobrenadante fue aproximadamente 2:1.

El sobrenadante (7 ml) se aplicó a una columna de 100 ml de DEAE Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) previamente convertida a la forma acetato lavando con 0,5 l de NaOH 1 M, 0,2 l de agua, 1,0 l de acetato amónico 1,0 M, pH 8,4, y 0,5 l de agua. El sobrenadante se cargó a razón de <2 ml/min y se lavó la columna con agua a razón de 3 a 4 ml/min hasta que la absorbancia a 280 nm fue \sim0. Se eluyó la monatina con acetato amónico 100 mM, pH 8,4, recogiendo 4 fracciones de 100 ml.

El análisis de las fracciones demostró que la relación de triptófano a monatina en las fracciones de flujo a través fue de 85:15 y la relación en las fracciones de eluyente fue 7:93. Suponiendo el coeficiente de extinción a 280 nm de monatina es el mismo que el del triptófano, las fracciones de eluyente contenían 0,146 mmoles de producto. La extrapolación a la reacción de 1 l total produciría \sim2,4 mmoles (\sim710 mg) de monatina, para una recuperación del 68%.

Las fracciones de eluyente de la columna DEAE Sepharose se evaporaron hasta <20 ml. Una alícuota del producto se purificó más por aplicación a una columna de preparación C_{8} en fase inversa utilizando las mismas condiciones cromatográficas que las descritas en el Ejemplo 10 para la caracterización de monatina a escala analítica. Se empleó el programa informático Waters Fractionlynx^{TM} para activar la recogida automática de la fracción de monatina basada en la detección de la m/z = 293 ión. La fracción de la columna C_{8} con el ión molecular protonado correspondiente de monatina se recogió, se evaporó a sequedad y a continuación se disolvió en un pequeño volumen de agua. Esta fracción se utilizó para la caracterización del producto.

El producto resultante se caracterizó usando los procedimientos siguientes.

Espectroscopia UV/visible. Se realizaron mediciones espectroscópicas UV/visible de monatina producida enzimáticamente utilizando un espectrofotómetro UV/visible Cary 100 Bio. El producto purificado, disuelto en agua, presentó un máximo de absorción a 280 nm con un resalte a 288 nm, características típicas de los compuestos que contienen indol.

Análisis de LC/MS. Se realizaron análisis de las mezclas de monatina procedente de las reacciones bioquímicas in vitro como se describe en el Ejemplo 10. En la Fig. 5 se ilustra un análisis de LC/MS típico de monatina en una mezcla sintética enzimática in vitro. El panel inferior de la Fig. 5 ilustra un cromatograma iónico seleccionado para el ión molecular protonado de monatina a m/z = 293. Esta identificación de monatina en la mezcla fue corroborada por el espectro de masas ilustrado en la Fig. 6. El análisis del producto purificado por LC/MS presentaba un solo pico con un ión molecular de 293 y absorbancia a 280 nm. El espectro de masas fue idéntico al mostrado en la
Fig. 6.

Análisis de MS/MS. Los experimentos del ión derivado por LC/MS/MS, como se describe en el Ejemplo 10, se realizaron también en monatina. Un espectro de masas del ión derivado de monatina se ilustra en la Fig. 7. Se realizaron asignaciones estructurales de tanteo de todos los fragmentos de iones marcados en la Fig. 7. Éstos incluyen fragmentos de iones de m/z = 275 (293 - H_{2}O), 257 (293 - (2 \times H_{2}O)), 230 (275-COOH), 212 (257-COOH), 168 (ión carbonio de 3-buta-1,3-dienil-1H-indol), 158 (ión carbonio de 1H-indol-3-carbaldehído), 144 (ión carbonio de 3-etil-1H-indol), 130 (ión carbonio de 3-metilen-1H-indol) y 118 (ión carbonio de indol). Muchos de éstos son iguales a los obtenidos para MP (Ejemplo 4), como es de esperar si proceden de la fracción indol de la molécula. Algunos son 1 unidad de masa mayores que los observados para MP, debido a la presencia de un grupo amino en lugar de una
cetona.

Medición de la masa exacta de monatina. La Fig. 8 ilustra el espectro de masas obtenido para la monatina purificada empleando un espectrómetro de masas de cuadrupolo híbrido/tiempo de vuelo Q-Star de Applied Biosystems-Perkin Elmer. La masa medida para la monatina protonada utilizando triptófano como patrón de calibración de masa interno fue 293,1144. La masa calculada de la monatina protonada, basada en la composición elemental C_{14}H_{17}N_{2}O_{5} es 293,1137. Éste es un error de medición de la masa inferior a 2 partes por millón (ppm), que proporciona pruebas concluyentes de la composición elemental de la monatina producida enzimáticamente.

Espectroscopia RMN. Se realizaron experimentos por RMN en un instrumento de 500 MHz de Varian Inova. Se disolvió la muestra de monatina (\sim3 mg) en 0,5 ml de D_{2}O. Inicialmente, se utilizó el disolvente (D_{2}O) como referencia interna a 4,78 ppm. Como el pico para el agua era grande, se realizó la RMN de ^{1}H con supresión del pico para el agua. Posteriormente, debido a la amplitud del pico de agua, se utilizó el protón del C-2 de monatina como pico de referencia y se fijó en el valor publicado de 7,192 ppm.

Para la RMN de ^{13}C, la serie inicial de varios cientos de exploraciones indicó que la muestra estaba demasiado diluida para obtener un espectro adecuado de ^{13}C en el tiempo asignado. Por lo tanto, se realizó un experimento de coherencia cuántica múltiple heteronuclear (HMQC), que permitió la correlación de los hidrógenos y los carbonos a los que están unidos, y que proporcionó también información sobre los desplazamientos químicos de los
carbonos.

En las Tablas 1 y 2 se presenta un resumen de los datos de ^{1}H y HMQC. Por comparación con los valores publicados, los datos de la RMN indicaron que la monatina producida enzimáticamente era (S,S), (R,R) o una mezcla de ambos.

Análisis quiral por LC/MS. Para demostrar que la monatina producida in vitro era un estereoisómero, y no una mezcla de los enantiómeros (R,R) y (S,S) se realizaron análisis por LC/MS quiral utilizando la instrumentación descrita en el Ejemplo 10.

Se realizaron separaciones por LC quiral utilizando una columna de cromatografía quiral Chirobiotic T (Advanced Separations Technology) a temperatura ambiente. La separación y detección, basadas en los protocolos publicados del suministrador, se optimizaron para los estereoisómeros R- (D) y S- (L) del triptófano. La fase móvil de LC consistía en A) agua que contiene 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético; B) metanol que contiene 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético. La elución fue isocrática a 70% de A y 30% de B. El caudal fue de 1,0 ml/min y la absorbancia de PDA se controló entre 200 nm y 400 nm. Los parámetros instrumentales utilizados para el análisis por LC/MS quiral de triptófano y monatina son idénticos a los descritos en el Ejemplo 10 para el análisis LC/MS. Se utilizó la recogida de los espectros de masas para la zona m/z 150-400. Los cromatogramas iónicos seleccionados para los iones moleculares protonados ([M + H]^{+} = 205 tanto para R- como para S- triptófano y [M + H]^{+} = 293 para monatina) permitió la identificación directa de estos analitos en las mezclas.

Los cromatogramas de R- y S-triptófano y monatina, separados por la cromatografía quiral y controlados por MS, se presentan en la Fig. 9. El único pico en el cromatograma de monatina indica que el compuesto es un estereoisómero, con un tiempo de retención casi idéntico al del S-triptófano.

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TABLA 1 Datos de RMN de ^{1}H

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TABLA 2 Datos de RMN de ^{13}C (del espectro HMQC)

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Polarimetría. Se midió la rotación óptica en un polarímetro Rudolph Autopol III. Se preparó la monatina como una solución de 14,6 mg/ml en agua. La rotación específica ([\alpha]_{D}^{20}) esperada para S,S monatina (forma salina) es -49,6 para una solución de 1 g/ml en agua (Vleggaar et al.). La [\alpha]_{D}^{20} observada fue -28,1 para la monatina purificada, producida enzimáticamente lo que indica que era el estereoisómero S,S.

Mejoras

Se optimizaron las condiciones de reacción, que incluyen las concentraciones de reactivo y de enzima, y se produjeron rendimientos de 5 a 10 mg/ml utilizando la mezcla reactiva siguiente: acetato amónico 50 mM pH 8,3, MgCl_{2} 2 mM, piruvato 200 mM (sal sódica o amónica), alfa-cetoglutarato 5 mM (sal sódica), fosfato de piridoxal 0,05 mM, agua desaireada para conseguir un volumen final de 1 ml después de la adición de las enzimas, fosfato potásico 3 mM, 50 \mug/ml de ProA aldolasa recombinante (extracto celular; concentración de proteína total de 167 \mug/ml), 1.000 \mug/ml de L-aspartato aminotransferasa codificada por el gen aspC de E. coli (extracto celular; concentración de proteína total de 2.500 \mug/ml) y triptófano sólido para proporcionar una concentración >60 mM (saturado; algo no disuelta durante la reacción). Se incubó la mezcla a 30ºC durante 4 horas con agitación suave o mezclado.

Sustituciones

La concentración de alfa-cetoglutarato puede reducirse hasta 1 mM y enriquecerse con aspartato 9 mM con un rendimiento equivalente de monatina. Pueden utilizarse receptores alternativos de aminoácidos en la primera etapa, como por ejemplo oxaloacetato.

Cuando se utilizó aminotransferasa de amplio sustrato de L. major recombinante en lugar de la L-aspartato aminotransferasa de E. coli, se consiguieron rendimientos similares de monatina. Sin embargo, un segundo producto no identificado (3 al 10% del producto principal) con una masa molecular de 292 se detectó también por análisis LC/MS. Se produjeron concentraciones de monatina de 0,1 a 0,5 mg/ml cuando la enzima codificada por tyrB de E. coli, la enzima codificada por tat A de S. meliloti o la glutámico-oxaloacético transaminasa del corazón de cerdo (tipo IIa) se añadió como aminotransferasa. Cuando la reacción parte de indol-3-piruvato, puede realizarse una aminación reductora durante la última etapa con glutamato deshidrogenasa y NADH (como en el Ejemplo 7).

Se utilizaron también KHG aldolasas de B. subtilis, E. coli y S. meliloti con la L-aspartato aminotransferasa de E. coli para producir monatina enzimáticamente. Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción: NH_{4}-OAc 50 mM pH 8,3, MgCl_{2} 2 mM, piruvato 200 mM, glutamato 5 mM, fosfato de piridoxal 0,05 mM, agua desaireada para conseguir un volumen total de 0,5 ml tras la adición de las enzimas, fosfato potásico 3 mM, 20 \mug/ml de KHG aldolasa (purificada) de B. subtilis recombinante, aprox. 400 \mug/ml de L-aspartato aminotransferasa (AspC) no purificada de E. coli procedente del extracto celular e indol-3-piruvato 12 mM. Las reacciones se incubaron a 30ºC durante 30 minutos con agitación. La cantidad de monatina producida utilizando la enzima de B. subtilis fue de 80 ng/ml y aumentó al aumentar las cantidades de aldolasa. Si el indol-3-piruvato y el glutamato se sustituyen por cantidades de saturación de triptófano y alfa-cetoglutarato 5 mM, la producción de monatina aumentaba a 360 ng/ml. Las reacciones se repitieron con 300 \mug/ml de cada una de las tres enzimas KHG en Tris 50 mM pH 8,3, con cantidades de saturación de triptófano y se dejó continuar durante una hora para aumentar la detección. La enzima de Bacillus tenía la actividad mayor como en el Ejemplo 4, produciendo aproximadamente 4.000 ng/ml de monatina. La KHG de E. coli produjo 3.000 ng/ml de monatina y la enzima de S. meliloti produjo 2.300 ng/ml.

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Ejemplo 7

Interconversión entre MP y monatina

La aminación de MP para formar monatina puede ser catalizada por aminotransferasas tales como las identificadas en los Ejemplos 1 y 6, o por deshidrogenasas que requieren un cofactor reductor como por ejemplo NADH o NADPH. Estas reacciones son reversibles y pueden medirse en ambas direcciones. La direccionabilidad, cuando se utiliza una enzima deshidrogenasa, pueden controlarse en gran medida por la concentración de sales amónicas.

Actividad de deshidrogenasa. La desaminación oxidativa de monatina fue controlada siguiendo el aumento de absorbancia a 340 nm como NAD(P)^{+} se convirtió en NAD(P)H más cromóforo. Se produjo monatina enzimáticamente y se purificó como se describe en el Ejemplo 6.

Una mezcla analítica típica contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 a 8,9, NAD^{+} o NADP^{+} 0,33 mM, 2 a 22 unidades de glutamato deshidrogenasa (Sigma) y sustrato 10 a 15 mM en 0,2 ml. Este análisis se realizó por duplicado en una placa de microvaloración transparente a UV, en un lector de placas SpectraMax Plus de Molecular Devices. Una mezcla de la enzima, tampón y NAD(P)^{+} se pipeteó en los pocillos que contenían el sustrato y se controló el aumento de absorbancia a 340 nm a intervalos de 10 segundos después de mezclado breve. Se incubó la reacción a 25ºC durante 10 minutos. Se realizaron controles negativos sin adición de sustrato, y se utilizó glutamato como referencia positiva. La glutamato deshidrogenasa de tipo III de hígado bovino (Sigma nº G-7882) catalizó la conversión de monatina a precursor de monatina a una velocidad de conversión aproximadamente de una centésima de la tasa de conversión de glutamato a alfa-cetoglutarato.

Actividad de transaminación. Se realizaron ensayos con monatina aminotransferasa con la aspartato aminotransferasa (AspC) de E. coli, la tirosina aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de amplio sustrato (BSAT) de L. major y las dos glutamato-oxaloacetato aminotransferasas porcinas comercialmente disponibles descritas en el Ejemplo 1. Tanto el oxaloacetato como el alfa-cetoglutarato se analizaron como receptor de amino. La mezcla de análisis contenía (en 0,5 ml) Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, PLP 0,05 mM, amino receptor 5 mM, monatina 5 mM y 25 \mug de aminotransferasa. Estos ensayos se incubaron a 30ºC durante 30 minutos, y se interrumpieron las reacciones mediante la adición de 0,5 ml de alcohol isopropílico. Se controló la pérdida de monatina por LC/MS (Ejemplo 10). La cantidad mayor de actividad fue indicada con un BSAT de L. major con oxaloacetato como receptor de amino, seguido por la misma enzima con alfa-cetoglutarato como aminoreceptor. La actividad relativa con oxaloacetato fue: BSAT>AspC>porcino tipo IIa>porcino tipo I=TyrB. La actividad relativa con alfa-cetoglutarato fue: BSAT>AspC>porcino tipo I>porcino tipo IIa>TyrB.

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Ejemplo 8

Producción de monatina a partir de triptófano y fuentes de C3 distintas de piruvato

Como se describió anteriormente en el Ejemplo 6, el indol-3-piruvato o el triptófano pueden convertirse en monatina utilizando piruvato como molécula de C3. Sin embargo, en algunas circunstancias, el piruvato puede no ser una materia prima deseable. Por ejemplo, el piruvato puede ser más caro que otras fuentes de carbono C3, o puede tener efectos desfavorables en las fermentaciones si se añade al medio. La alanina puede ser transaminada por muchas enzimas PLP para producir piruvato.

Las enzimas de tipo triptofanasa realizan reacciones de beta-eliminación a velocidades más rápidas que otras enzimas PLP tales como las aminotransferasas. Las enzimas de esta clase (4.1.99.-) pueden producir amoniaco y piruvato procedente de aminoácidos tales como L-serina, L-cisteína y derivados de serina y cisteína con grupos salientes adecuados tales como O-metil-L-serina, O-bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-bencilcisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina, 3-cloro-L-alanina.

Los procedimientos para producir monatina utilizando polipéptidos EC 4.1.99.- pueden mejorarse mediante la mutación de la \beta-tirosinasa (TPL) o triptofanasa según el procedimiento de Mouratou et al. (J. Biol. Chem. 274:1320-5, 1999). Mouratou et al. describen la capacidad para convertir la \beta-tirosinasa en un aminoácido dicarboxílico \beta-liasa, que no se ha descrito que se produzca en la naturaleza. El cambio de especificidad se realizó conviertiendo la valina (V) 283 en arginina (R) y la arginina (R) 100 en treonina (T). Estos cambios de aminoácido permiten a la liasa aceptar un aminoácido dicarboxílico para la reacción de desaminación hidrolítica (como por ejemplo aspartato). El aspartato, por lo tanto, puede también utilizarse como fuente de piruvato para las reacciones de condensación aldólica ulteriores.

Además, las células o los reactores enzimáticos pueden suministrarse con lactato y una enzima que convierte lactato en piruvato. Ejemplos de enzimas capaces de catalizar esta reacción incluyen la lactato deshidrogenasa y la lactato oxidasa.

La mezcla de reacción estaba constituida por Tris-Cl 50 mM pH 8,3, MgCl_{2} 2 mM, fuente de carbono C3 200 mM, sal sódica del alfa-cetoglutarato 5 mM, fosfato de piridoxal 0,05 mM, agua desaireada para conseguir un volumen final de 0,5 ml tras la adición de las enzimas, fosfato potásico 3 mM pH 7,5, 25 \mug de ProA aldolasa de C. testosteroni recombinante en bruto tal como se prepara en el Ejemplo 4, 500 \mug de L-aspartato aminotransferasa (AspC) 500 \mug como se prepara en el Ejemplo 1 y triptófano sólido para proporcionar una concentración >60 mM (saturado; algo sin disolver durante la reacción). La mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 30 minutos con mezcla. Se aportaron serina, alanina y aspartato como fuentes de 3 carbonos. Se realizaron los análisis con y sin enzimas PLP secundarias (purificadas) capaces de realizar las reacciones de beta-eliminación y con beta-liasa (triptofanasa (TNA), triptofanasa mutante doble, \beta-tirosinasa (TPL)). Los resultados se muestran en la Tabla 3:

TABLA 3 Producción de monatina utilizando fuentes de carbono C3 alternativas

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La monatina producida a partir de alanina y serina como fuentes de 3 carbonos se verificó mediante análisis por LC/MS/MS de exploración del derivado, y era idéntica a la monatina caracterizada producida en el Ejemplo 6. La alanina fue la mejor alternativa probada, y fue transaminada por la enzima AspC. La cantidad de monatina producida se aumentó mediante la adición de la triptofanasa, que es capaz de transaminación como actividad secundaria. La cantidad de monatina producida con serina como fuente de carbono dobló casi la adición de las enzimas triptofanasa, aun cuando solamente una quinta parte de la cantidad de triptofanasa se añadió en comparación con la aminotransferasa. AspC es capaz de alguna cantidad de actividad de beta-eliminación sola. Los resultados con aspartato indican que la actividad de triptofanasa sobre el aspartato no aumenta con las mismas mutaciones dirigidas al sitio como se sugirió anteriormente para la beta-tirosinasa. Es de esperar que la beta-tirosinasa mutante tenga mayor actividad para la producción de monatina.

Ejemplo 9

Síntesis química de monatina

La adición de alanina al ácido indol-3-pirúvico produce monatina, y esta reacción puede realizarse por síntesis con un reactivo de Grignard u organolítico.

Por ejemplo, a la 3-cloro- o 3-bromo-alanina que se ha bloqueado de manera apropiada en los grupos carboxilo y amino, se añade magnesio en condiciones anhidras. A continuación se añade indol-3-piruvato (bloqueado de forma apropiada) para formar el producto acoplado seguido de eliminación de los grupos protectores para formar monatina. Los grupos protectores que son particularmente útiles incluyen THP (éter tetrahidropiranílico) que se une y se elimina fácilmente.

Ejemplo 10

Detección de triptófano, monatina y MP

Este ejemplo describe los procedimientos utilizados para detectar la presencia de monatina, o su precursor el ácido 2-hidroxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico.

Análisis LC/MS

Se realizaron análisis de las mezclas de monatina, MP y/o triptófano procedentes de las reacciones bioquímicas in vitro o in vivo utilizando un instrumento de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de micromasa de Waters (LC/MS/MS) que incluía un cromatógrafo de líquidos Waters 2690 con un monitor de absorbancia Photo-Diode Array (PDA) de Waters 996 colocado en serie entre el cromatógrafo y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo de Micromass Quattro Ultima. Se realizaron separaciones por LC utilizando una columna de cromatografía en fase inversa C_{18} de Supelco Discovery, 2,1 mm \times 150 mm, o una columna de cromatografía en fase inversa de C_{8} de Xterra MS, 2,1 mm \times 250 mm, a temperatura ambiente. La fase móvil de LC estaba constituida por A) agua conteniendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético y B) metanol conteniendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoro-
acético.

El gradiente de elución fue lineal desde el 5% de B hasta 35% de B, 0 a 9 min, lineal desde 35% de B hasta 90% de B, 9 a 16 min, isocrático en el 90% de B, 16 a 20 min, lineal desde el 90% de B hasta 5% de B, 20 a 22 min, con un periodo de reequilibrado de 10 min entre las series. El caudal fue de 0,25 ml/min y la absorbancia por PDA se controló desde 200 nm hasta 400 nm. Todos los parámetros de la ESI-MS se optimizaron y seleccionaron basándose en la generación de iones moleculares protonados ([M + H]^{+}) de los analitos de interés, y la producción de iones del fragmento característicos.

Se utilizaron los parámetros instrumentales siguientes para el análisis por LC/MS de monatina: capilar: 3,5 kV; cono: 40 V; hex 1: 20 V; abertura: 0 V; hex 2: 0 V; temperatura de la fuente: 100ºC; temperatura de desolvatación: 350ºC; gas de desolvatación: 500 l/h; gas del cono: 50 l/h; baja resolución de masas (Q1): 15,0; alta resolución de masas (Q1): 15,0; energía iónica: 0,2; entrada: 50 V; energía de colisión: 2; salida: 50 V; baja resolución de masas (Q2): 15; alta resolución de masas (Q2): 15; energía iónica (Q2): 3,5; multiplicador: 650. Las incertidumbres para las relaciones masa/relleno (m/z) descritas y las masas moleculares son \pm 0,01%. La detección inicial de la forma alfa-cetoácido de monatina (MP) y monatina en las mezclas fue realizada mediante control por LC/MS con recogida de los espectros de masas para la zona m/z 150-400. Los cromatogramas iónicos seleccionados para los iones moleculares protonados ([M + H]^{+} = 292 para MP, [M + H]^{+} = 293 para monatina) permitieron la identificación directa de estos analitos en las mezclas.

Análisis por MS/MS

Se realizaron experimentos del ión derivado por LC/MS/MS en monatina de la manera siguiente. Un análisis del ión derivado implica la transmisión del ión precursor (p. ej., m/z = 293 para monatina) de interés procedente del primer analizador de masas (Q1) en la celda de colisión del espectrómetro de masas, en la que se introduce argón y se disocia químicamente el precursor en iones (derivados) del fragmento. Estos iones del fragmento se detectan a continuación con el segundo analizador de masas (Q2) y pueden utilizarse para corroborar la asignación estructural del precursor. Se caracterizó triptófano y se cuantificó de la misma manera por transmisión y fragmentación de m/z = 205.

Se utilizaron los parámetros instrumentales siguientes para el análisis por LC/MS/MS de monatina: capilar: 3,5 kV; cono: 40 V; hex 1: 20 V; abertura: 0 V; hex 2: 0 V; temperatura de la fuente: 100ºC; temperatura de desolvatación: 350ºC; gas de desolvatación: 500 l/h; gas del cono: 50 l/h; baja resolución de masas (Q1): 13,0; alta resolución de masas (Q1): 13,0; energía iónica: 0,2; entrada: -5 V; energía de colisión: 14; salida: 1,4 V; baja resolución de masas (Q2): 15; alta resolución de masas (Q2): 15; energía iónica (Q2): 3,5; multiplicador: 650.

Determinación de alta resolución de monatina y triptófano

Se realizaron análisis de alta resolución (<5 min/muestra) de mezclas de monatina y triptófano procedentes de reacciones in vitro o in vivo utilizando la instrumentación descrita anteriormente, y los mismos parámetros descritos para LC/MS/MS. Se realizaron separaciones por LC utilizando una columna Chirobiotic T de 4,6 mm \times 50 mm de Advanced Separation Technologies a temperatura ambiente. La fase móvil de LC estaba constituida por A) agua que contenía 0,25% de ácido acético; B) metanol que contenía 0,25% de ácido acético. La elución isocrática fue a 50% de B, 0 a 5 min. El caudal fue de 0,6 ml/min. Todos los parámetros del sistema ESI-MS/MS se optimizaron y seleccionaron basándose en la generación óptima en la fuente del ión molecular protonado de triptófano y del patrón interno ^{2}H_{5}-triptófano, así como la producción inducida por colisión de iones del fragmento específico de aminoácido para experimentos de control de reacción múltiple (MRM). Se utilizaron los siguientes parámetros instrumentales para el análisis por LC/MS/MS de monatina y triptófano en modo de control de reacción múltiple (mrm) del ión positivo: capilar: 3,5 kV; cono: 40 V; hex 1: 15 V; abertura: 1 V; hex 2: 0 V; temperatura de la fuente: 100ºC; temperatura de desolvatación: 350ºC; gas de desolvatación: 500 l/h; gas del cono: 40 l/h; baja resolución de masas (Q1): 12,0; alta resolución de masas (Q1): 12,0; energía iónica: 0,2; entrada: -5 V; energía de colisión: 14; salida: 1 V; baja resolución de masas (Q2): 15; alta resolución de masas (Q2): 15; energía iónica (Q2): 0,5; multiplicador: 650. Parámetros de MRM: desfase intercanales: 0,03 s; desfase interexploración: 0,03 s; tiempo de parada: 0,05 s.

Medición exacta de masas de monatina

Se realizó el análisis por MS de alta resolución utilizando un espectrómetro de masas de cuadrupolo híbrido/tiempo de vuelo de Q-Star de Applied Biosystems-Perkin Elmer. La masa medida para la monatina protonada utilizó triptófano como patrón interno para la calibración de masas. La masa calculada de la monatina protonada, basada en la composición elemental C_{14}H_{17}N_{2}O_{5} es 293,1137. La monatina producida utilizando el procedimiento biocatalítico descrito en el Ejemplo A presentaba una masa medida de 293,1144. Éste es un error de medición de la masa inferior a 2 partes por millón (ppm) que proporciona pruebas concluyentes de la composición elemental de la monatina producida por vía enzimática.

Ejemplo 11

Producción de monatina en bacterias

Este ejemplo describe los procedimientos utilizados para producir monatina en células de E. coli. Un experto en la materia entenderá que pueden utilizarse procedimientos similares para producir monatina en otras células bacterianas. Además, pueden utilizarse los vectores que contienen otros genes en la serie de reacciones de síntesis de monatina (Fig. 2).

Se preparó de la forma siguiente medio de Trp-1 + glucosa, un medio mínimo que ha sido utilizado para aumentar la producción de triptófano en las células de E. coli (Zeman et al. Folia Microbiol. 35:200-4, 1990). A 700 ml de agua nanopura se añadieron los reactivos siguientes: 2 g de (NH_{4})_{2}SO_{4} 13,6 g de KH_{2}PO_{4}, 0,2 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O y 0,5 mg de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O. El pH se ajustó a 7,0, se aumentó el volumen hasta 850 ml y se esterilizó el medio en autoclave. Se preparó aparte una solución de glucosa al 50% y se filtró y esterilizó. Se añadieron cuarenta ml al medio básico para un volumen final de 1 l.

Se preparó una solución de 10 g/l de L-triptófano en fosfato sódico 0,1 M pH 7 y se filtró y esterilizó. Se añadió típicamente el volumen de un décimo a cultivos como se especifica a continuación. Se preparó también una solución de piruvato sódico al 10% y se filtró y esterilizó. Se utilizó típicamente una alícuota de 10 ml para un litro de cultivo. Se prepararon soluciones madre de ampicilina (100 mg/ml), kanamicina (25 mg/ml) y de IPTG (840 mM), se filtraron y esterilizaron y se guardaron a -20ºC antes de su utilización. Se utilizó Tween 20 (polioxietileno 20-monolaurato de Sorbitan) a una concentración final de 0,2% (vol/vol). Se utilizó ampicilina a concentraciones no letales, típicamente a una concentración final de 1 a 10 \mug/ml.

Se prepararon placas recientes de BL21(DE3) de E. coli::proA/pET 30 Xa/LIC de C. testosteroni (descrito en el Ejemplo 4) en medio LB que contenía 50 \mug/ml de kanamicina. Se inocularon cultivos de toda la noche (5 ml) procedentes de una sola colonia y se cultivaron a 30ºC en medio LB con kanamicina. Se utilizó típicamente un inóculo 1 a 50 para inducción en medio trp-1 + glucosa. Se añadió antibiótico reciente hasta una concentración final de 50 mg/l. Se cultivaron matraces agitados a 37ºC antes de la inducción.

Se tomaron muestras de células cada hora hasta obtener una D.O._{600} entre 0,35 y 0,8. Las células se indujeron a continuación con IPTG 0,1 mM y se redujo la temperatura a 34ºC. Se recogieron muestras (1 ml) antes de la inducción (punto de tiempo cero) y se centrifugaron a 5.000 \times g. Se congeló el sobrenadante a -20ºC para análisis LC/MS. Cuatro horas después de la inducción, se recogió otra muestra de 1 ml y se centrifugó para separar el caldo de cultivo del sedimento celular. Se añadieron triptófano, piruvato sódico, ampicilina y Tween como se describió anteriormente.

Se cultivaron las células durante 48 horas tras la inducción, y se tomó otra muestra de 1 ml y se preparó como anteriormente. A las 48 horas, se añadió otra alícuota de triptófano y de piruvato. El volumen de cultivo completo se centrifugó después de aproximadamente 70 horas de cultivo (tras la inducción), durante 20 minutos a 4ºC y 3.500 rpm. Se decantó el sobrenadante y tanto el caldo de cultivo como las células se congelaron a -80ºC. Las fracciones de caldo de cultivo se filtraron y analizaron por LC/MS. Se controlaron las alturas y áreas de los picos [M+H]^{+} = 293 como se describe en el Ejemplo 10. El nivel de fondo del medio se sustrajo. Se normalizaron también los datos del cultivo celular representando la altura del pico [M+H]^{+} = 293 dividido por la densidad óptica del cultivo a 600 nm.

Se produjeron concentraciones mayores de monatina cuando se añadieron piruvato, ampicilina y Tween 4 horas después de la inducción mejor que en la inducción. Otros aditivos tales como PLP, fosfato adicional o MgCl_{2} adicional no aumentaron la producción de monatina. Se obtuvieron títulos mayores de monatina cuando se utilizó triptófano en lugar de indol-3-piruvato, y cuando se añadió triptófano después de la inducción mejor que en la inoculación o en la inducción. Antes de la inducción y 4 horas después de la inducción (en el momento de la adición del sustrato), no hubo típicamente ninguna concentración detectable de monatina en el caldo de cultivo de fermentación o en los extractos celulares. Se hicieron referencias negativas utilizando células con vector pET30a solamente, así como cultivos donde no se añadieron triptófano y piruvato. Una exploración con MS precursor demostró que el compuesto con (m+1)/z = 293 no procedía de moléculas mayores, y las exploraciones derivadas (realizadas como en el Ejemplo 10) fueron similares a la monatina preparada in vitro.

Se estudió el efecto de Tween utilizando concentraciones de 0, 0,2% (vol/vol) y 0,6% final de Tween-20. La cantidad mayor de monatina producida por los matraces en agitación fue en Tween al 0,2%. Se varió la concentración de ampicilina entre 0 y 10 \mug/ml. La cantidad de monatina en el caldo de cultivo celular aumentó rápidamente (2,5 \times) entre 0 y 1 \mug/ml, y aumentó 1,3 \times cuando la concentración de ampicilina se aumentó de 1 a 10 \mug/ml.

En la Fig. 10 se muestra un experimento a lo largo del tiempo que presenta resultados típicos. La cantidad de monatina segregada en el caldo de cultivo celular aumentó, aun cuando los valores están normalizados para el caldo de cultivo celular. Utilizando el coeficiente de extinción molar del triptófano, se estimó que la cantidad de monatina en el caldo de cultivo era inferior a 10 \mug/ml. Se repitió el mismo experimento con las células que contenían el vector sin inserto proA. Muchas de las cifras fueron negativas, lo que indica que la altura del pico en m/z=293 era inferior en estos cultivos que en el medio solo (Fig. 10). Las cifras eran regularmente inferiores cuando el triptófano y el piruvato estaban ausentes, lo que demuestra que la producción de monatina es el resultado de una reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa.

La producción in vivo de monatina en las células bacterianas se repitió en experimentos en matraz de 800 ml en agitación y en fermentadores. Una muestra de 250 ml de monatina (en caldo de cultivo exento de células) se purificó por cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía líquida en fase inversa de preparación. Esta muestra se evaporó, y se sometió a análisis de masas de alta resolución (descrito en el Ejemplo 6). La MS de alta resolución indicó que el metabolito que se está produciendo es monatina.

Los análisis in vitro indican que la aminotransferasa necesita estar presente a concentraciones mayores que la aldolasa (véase el Ejemplo 6), por lo tanto la aspartato aminotransferasa de E. coli se sobreexpresó en combinación con el gen de aldolasa para aumentar la cantidad de monatina producida. Se diseñaron cebadores para introducir proA de C. testosteroni en un operón con aspC/pET30 Xa/LIC, de la forma siguiente: cebador 5': ACTCGGATCCGAAGGAGA
TATACATATGTACGAACTGGGACT (SEC. ID. nº: 67) y cebador 3': CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTT
CAGGC (SEC. ID. nº: 68). El cebador 5' contiene la secuencia BamHI, el cebador 3' contiene la secuencia SalI para clonación. Se realizó la PCR como se describe en el Ejemplo 4 y se purificó el gel. El montaje aspC/pET30 Xa/LIC se digirió con BamHI y SalI, a medida que era el producto de PCR. Se purificaron las digestas utilizando una columna de rotación Qiagen. El producto de PCR proA se ligó al vector utilizando el kit de ligadura de ADN rápida de Roche (Indianápolis, IN) según las instrucciones de fabricante. Se hicieron transformaciones químicas utilizando Novablues Singles (Novagen) como se describe en el Ejemplo 1. Se cultivaron colonias en medio LB que contenía 50 mg/l de kanamicina y se purificó el ADN del plásmido utilizando el kit spin miniprep de Qiagen. Los clones se identificaron por análisis de la digesta de restricción y se confirmó la secuencia por Seqwright (Houston, TX). Se subclonaron los montajes en BLR(DE3), BLR(DE3)pLysS, BL21(DE3) y BL21(DE3)pLysS (Novagen). El montaje proA/pET30 Xa/LIC se transformó también en BL21(DE3)pLysS.

Las comparaciones iniciales de las muestras del matraz en agitación de BLR(DE3) en condiciones estándar descritas anteriormente demostraron que la adición del segundo gen (aspC) mejoraba la cantidad de monatina producida en siete veces. Para acelerar el cultivo, se utilizaron cepas huésped derivadas de BL21(DE3). Los clones proA y los dos clones de operón del gen se produjeron en medio Trp-1 como anteriormente, los hospedadores pLysS tenían también cloranfenicol (34 mg/l) añadido al medio. Se realizaron experimentos en matraz en agitación con y sin la adición de 0,2% de Tween-20 y 1 mg/l de ampicilina. La cantidad de monatina en el caldo de cultivo se calculó utilizando como patrón monatina purificada producida in vitro. Se realizaron análisis de SRM como se describe en el Ejemplo 10. Se tomaron muestras de células a las cero, 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas de cultivo.

Los resultados se presentan en la Tabla 4 para las cantidades máximas producidas en los caldos de cultivo. En la mayoría de los casos, el montaje de dos genes dio valores mayores que el montaje de proA solo. Las cepas pLysS, que deberían tener envolturas celulares más fugaces, tenían concentraciones mayores de monatina segregada, aun cuando estas cepas se desarrollan típicamente a una velocidad más lenta. Las adiciones de Tween y ampicilina fueron beneficiosas.

TABLA 4 Cantidad de monatina producida por bacterias E. coli

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Ejemplo 12

Producción de monatina en levaduras

Este ejemplo describe los métodos utilizados para producir monatina en células eucarióticas. Un experto en la materia entenderá que pueden utilizarse métodos similares para producir monatina en cualquier célula de interés. Además, pueden utilizarse otros genes (p. ej., los listados en la Fig. 2) además de los descritos en este ejemplo o como alternativa a ellos.

Se utilizó el sistema vector de etiquetado del epítopo de levadura pESC (Stratagene, La Jolla, CA) para clonar y expresar los genes aspC de E. coli y proA de C. testosteroni en Saccharomyces cerevisiae. Los vectores pESC contienen tanto los activadores GAL1 como el GAL10 en cadenas opuestas, con dos puntos de clonación múltiple distintos, permitiendo la expresión de dos genes a la vez. El vector pESC-His contiene también el gen His3 para la complementación de la auxotrofía de histidina en el hospedador (YPH500). Los activadores GAL1 y GAL10 vuelven a ser reprimidos por la glucosa y producidos por la galactosa; una secuencia Kozak se utiliza para la expresión óptima en levaduras. Los plásmidos pESC son vectores lanzadera, que permiten que el montaje inicial se haga en E. coli (con el gen bla para selección); sin embargo, ninguna de las secuencias de unión del ribosoma bacteriano están presentes en las secuencias de clonación múltiples.

Se diseñaron los cebadores siguientes para clonación en pESC-His (las secuencias de restricción están subrayadas, la secuencia Kozak está en negrita): aspC (BamHI/SalI), GAL1: 5'-CGCGGATCC ATAATGGTTGAGAACATTAC
CG-3' (SEC. ID. nº: 69) y 5'-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEC. ID. nº: 70). proA (EcoRI/
NotI), GAL10: 5'-CCGGAATTC ATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3' (SEC. ID. nº: 71) y 5'-GAATGCGGCCGC
TTAGTCAATATATTTCAGGCC-3' (SEC. ID. nº: 72).

El segundo codón para ambas proteínas maduras se cambió de un aminoácido aromático a valina debido a la introducción de la secuencia Kozak. Se ampliaron los genes de interés utilizando ADN de minipreparación pET30 Xa/LIC procedente de los clones descritos en los Ejemplos 1 y 4 como plantilla. Se realizó la PCR utilizando un termociclador de gradiente Eppendorf Master cycler y el siguiente protocolo para una reacción de 50 \mul: 1,0 \mul de plantilla, 1,0 \muM de cada cebador, 0,4 mM para cada dNTP, 3,5 U de polimerasa Expand High Fidelity (Roche, Indianápolis, IN) y tampón 1\times Expand^{TM} con Mg. El programa del termociclador utilizado constaba de un comienzo en caliente a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 29 repeticiones de las etapas siguientes: 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 1 minuto 45 segundos y 72ºC durante 2 minutos 15 segundos. Después de las 29 repeticiones la muestra se mantuvo a 72ºC durante 10 minutos y a continuación se guardó a 4ºC. Los productos de la PCR se purificaron por separación en un gel de 1% de TAE-agarosa seguido de recuperación utilizando un kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Valencia, CA).

El ADN del vector pESC-His (2,7 \mug) se digirió con BamHI/SalI y gel purificado como anteriormente. El producto de PCR aspC se digirió con BamHI/SalI y se purificó con una columna de purificación por PCR QIAquick. Se realizaron ligaduras con el kit de ligadura de ADN rápido de Roche siguiendo los protocolos del fabricante. Se electroporaron ligaduras desaladas en 40 \mul de células competentes DH10B de Electromax (Invitrogen) en una cubeta disponible de Biorad de 0,2 cm utilizando un Gene Pulser II de Biorad con controlador de pulsaciones positivo según las instrucciones del fabricante. Después de 1 hora de recuperación en 1 ml de medio SOC, los transformantes se colocaron en placas en medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Las preparaciones de ADN del plásmido para los clones se hicieron utilizando kits Spin Miniprep de QIAprep. El ADN del plásmido se cribó por digesta de restricción y se secuenció (Seqwright) para verificación utilizando los cebadores diseñados para el vector.

El clon aspC/pESC-His se digirió con EcoRI y NotI, a medida que era el producto de PCR proA. Se purificó el ADN como anteriormente y se ligó como anteriormente. El montaje de dos genes se transformó en células DH10B y se identificó por secuenciado de la digesta de restricción y del ADN.

El montaje se transformó en la cepa YPH500 de S. cerevisiae utilizando el kit de transformación S.c. EasyComp^{TM} (Invitrogen). Las reacciones de transformación se colocaron en placas en un medio mínimo SC-His (manual de pYES2 de Invitrogen) que contiene 2% de glucosa. Se cribaron colonias de levaduras individuas para la presencia de los genes proA y aspC por PCR de colonias utilizando los cebadores de PCR anteriores. Las células sedimentadas (2 \mul) se pusieron en suspensión en 20 \mul de tampón Y-Lisis (Zymo Research) que contenía 1 \mul de zimolasa y se calentó a 37ºC durante 10 minutos. Cuatro \mul de esta suspensión se utilizaron a continuación en 50 \mul de una reacción de PCR utilizando una mezcla de reacción de PCR y el programa descrito anteriormente.

Se cultivaron cinco ml de cultivos durante la noche en SC-His + glucosa a 30ºC y 225 rpm. Las células se ajustaron gradualmente para desarrollarse en rafinosa a fin de minimizar el periodo íntimo antes de la inducción con galactosa. Después de aproximadamente 12 horas de cultivo, se hicieron mediciones de absorbancia a 600 nm y un volumen apropiado de células se centrifugó y se volvió a poner en suspensión para dar una D.O. de 0,4 en el medio SC-His reciente. Se utilizaron las siguientes fuentes de carbono sucesivamente: 1% de rafinosa + 1% de glucosa, 0,5% de glucosa + 1,5% de rafinosa, 2% de rafinosa y finalmente 1% de rafinosa + 2% de galactosa para la inducción.

Después de aproximadamente 16 horas de cultivo en el medio de inducción, los cultivos de 50 ml se dividieron en cultivos de 25 ml y los siguientes se añadieron solamente a uno de los duplicados: (concentraciones finales) 1 g/l de L-triptófano, fosfato sódico 5 mM pH 7,1, 1 g/l de piruvato sódico y MgCl_{2} 1 mM. Las muestras de caldos de cultivo y de sedimentos celulares del medio no de inducción, y de los cultivos de 16 horas antes de la adición de los sustratos para la serie de reacciones de monatina, se guardaron como referencias negativas. Además, los montajes que contienen únicamente un gen aspC funcional (y un gen proA truncado) se utilizaron como otra referencia negativa. Se dejó desarrollar las células durante un total de 69 horas después de la inducción. Ocasionalmente las células de levadura se produjeron a una D.O. inferior y solamente se cultivaron durante 4 horas antes de la adición de triptófano y piruvato. Sin embargo, estos sustratos de monatina parecen inhibir el crecimiento y la adición a D.O. mayor fue más eficaz.

Los sedimentos celulares de los cultivos se lisaron con 5 ml de YeastBuster^{TM} + 50 \mul de THP (Novagen) por gramo (peso húmedo) de células siguiendo los protocolos del fabricante, con adición de inhibidores de proteasa y benzoasa nucleasa como se describió en los ejemplos anteriores. El caldo de cultivo y los extractos celulares se filtraron y analizaron por SRM como se describe en el Ejemplo 10. Utilizando este método, no se detectó monatina en las muestras de caldo de cultivo, lo que indica que las células no pudieron segregar monatina en estas condiciones. La fuerza del motivo de protones puede ser insuficiente en estas condiciones o los transportadores de aminoácido generales pueden estar saturados con triptófano. La expresión proteica no fue a un nivel que permitiera la detección de cambios utilizando SDS-PAGE.

La monatina fue detectable (aproximadamente 60 ng/ml) transitoriamente en extractos celulares del cultivo con dos genes funcionales, cuando se añadieron triptófano y piruvato al medio. No se detectó monatina en ninguno de los extractos celulares con referencia negativa. Los análisis in vitro de monatina se realizaron por duplicado con 4,4 mg/ml de proteína completa (aproximadamente el doble de lo que se utiliza típicamente para los extractos celulares de E. coli) utilizando el análisis optimizado descrito en el Ejemplo 6. Se realizaron otros análisis con adición de 32 \mug/ml de ProA aldolasa de C. testosteroni o 400 \mug/ml de AspC aminotransferasa, para determinar qué enzima era limitativa en el extracto celular. Se realizaron controles negativos sin adición de enzima, o adición de solamente AspC aminotransferasa (la condensación alcohólica puede producirse en alguna medida sin enzima). Se realizaron controles positivos con enzimas parcialmente puras (30 a 40%) utilizando 16 \mug/ml de aldolasa y 400 \mug/ml de aminotransferasa.

Se analizaron los resultados in vitro por SRM. El análisis de los extractos celulares demostró que el triptófano era transportado eficientemente a las células cuando se añadía al medio después de la inducción, produciendo concentraciones de triptófano dos órdenes de magnitud superiores a aquellas en las que no se añadió nada de triptófano. Los resultados para los análisis de monatina in vitro se presentan en la Tabla 5 (las cifras indican ng/ml).

TABLA 5 Producción de monatina con extractos celulares de levadura

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Se obtuvieron resultados positivos con los extractos celulares del montaje completo de dos genes con y sin sustrato añadido al medio de cultivo. Estos resultados, en comparación con las referencias positivas, indican que las enzimas se expresaron a concentraciones próximas al 1% de proteína completa en levadura. La cantidad de monatina producida cuando el extracto celular del montaje aspC (con proA truncado) se analizó con aldolasa y fue significativamente mayor que cuando los extractos celulares se analizaron solos, e indica que la AspC aminotransferasa recombinante comprende aproximadamente entre 1 y 2% de la proteína completa de levadura. Los extractos celulares de cultivos no inducidos presentaban una pequeña cantidad de actividad cuando se analizaban con aldolasa debido a la presencia de aminotransferasas naturales en las células. Cuando se analizaba con AspC aminotransferasa, la actividad de los extractos procedentes de células no inducidas aumentaba hasta la cantidad de monatina producida por la referencia negativa con AspC (aprox. 200 ng/ml). En cambio, la actividad observada al analizar el montaje de dos genes, el extracto celular aumenta más cuando se enriquece la aminotransferasa que cuando se añade aldolasa. Dado que ambos genes deberían expresarse al mismo nivel, esto indica que la cantidad de monatina producida se maximiza cuando el nivel de aminotransferasa es mayor que el de aldolasa, de acuerdo con los resultados mostrados en el Ejemplo 6.

La adición de piruvato y triptófano no solamente inhibe el crecimiento celular, sino que también aparentemente inhibe la expresión de la proteína. La adición del plásmido pESC-Trp puede utilizarse para corregir la auxotrofía del triptófano de las células huésped YPH500, para proporcionar un medio de suministrar triptófano con pocos efectos sobre el crecimiento, expresión y secreción.

Ejemplo 13

Mejora de los procesos enzimáticos utilizando reacciones acopladas

En teoría, si no se producen reacciones secundarias o degradación de los sustratos o productos intermedios, la cantidad máxima de producto formado a partir de la reacción enzimática ilustrada en la Fig. 1 es directamente proporcional a las constantes de equilibrio de cada reacción, y las concentraciones de triptófano y piruvato. El triptófano no es un sustrato muy soluble, y aparecen concentraciones de piruvato superiores a 200 mM que tienen un efecto negativo sobre el rendimiento (véase el Ejemplo 6).

Teóricamente, la concentración de monatina se maximiza con respecto a los sustratos, a fin de aumentar el coste de separación. Las separaciones físicas pueden realizarse de modo que la monatina se elimine de la mezcla de reacción, evitando que se produzcan reacciones inversas. Las materias primas y catalizadores pueden regenerarse a continuación. Debido a la similitud de tamaño, relleno e hidrofobia de monatina con varios de los reactivos y productos intermedios, las separaciones físicas serán difíciles a menos que exista mucha afinidad por la monatina (como por ejemplo una técnica de cromatografía por afinidad). Sin embargo, las reacciones de monatina pueden acoplarse a otras reacciones de modo que el equilibrio del sistema esté desplazado hacia la producción de monatina. Los siguientes son ejemplos de procedimientos para mejorar el rendimiento de monatina obtenido a partir de triptófano o indol-3-piruvato.

Reacciones acopladas utilizando oxaloacetato descarboxilasa (EC 4.1.1.3)

La Fig. 11 es una ilustración de la reacción. Se utilizan triptófano oxidasa y catalasa para llevar la reacción en la dirección de la producción de indol-3-piruvato. Se utiliza catalasa en exceso de modo que el peróxido de hidrógeno no esté disponible para reaccionar en la dirección inversa o para dañar las enzimas o productos intermedios. El oxígeno se regenera durante la reacción con catalasa. Alternativamente, puede utilizarse como sustrato indol-3-piruvato.

Se utiliza aspartato como donante de amino para la aminación de MP y se utiliza una aspartato aminotransferasa. En teoría, una aminotransferasa que tiene una especificidad baja para la reacción de triptófano/indol-3-piruvato en comparación con la reacción de MP a monatina se utiliza de modo que el aspartato no se utiliza para volver a aminar el indol-3-piruvato. Puede añadirse oxaloacetato descarboxilasa (procedente de Pseudomonas sp.) para convertir el oxaloacetato en piruvato y dióxido de carbono. Dado que el CO_{2} es volátil, no está disponible para la reacción con las enzimas, disminuyendo o incluso evitando las reacciones inversas. El piruvato producido en esta etapa puede también utilizarse en la reacción de condensación aldólica. Pueden utilizarse otras enzimas descarboxilasas, y se conocen homólogos que existen en Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglubus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroides fragilis, varies especies de Bordetella, Campylobacter jejuni, Chlorobium tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Magnetococcus MC-1, Mannheimia haemolytica, Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurella multocida Pm70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, varias especies de Pseudomonas, varias especies de Pyrococcus, Rhodococcus, varias especies de Salmonella, varias especies de Streptococcus, Thermochromatium tepidum, Thermotoga maritima, Treponema pallidum y varias especies de Vibrio.

Se realizaron análisis de triptófano aminotransferasa con la aspartato aminotransferasa (AspC) de E. coli, la tirosina aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de amplio sustrato (BSAT) de L. major, y las dos glutamato-oxaloacetato aminotransferasas porcinas comercialmente disponibles como se describe en el Ejemplo 1. Tanto el oxaloacetato como alfa-cetoglutarato se analizaron como receptor amino. Se comparó la proporción de actividad utilizando monatina (Ejemplo 7) frente a la actividad utilizando triptófano, para determinar qué enzima presentaba la mayor especificidad para la reacción de monatina aminotransferasa. Estos resultados indicaron que la enzima con mayor especificidad para la reacción de monatina frente a la reacción con triptófano es la glutamato-oxaloacetato aminotransferasa porcina de tipo II-A, GOAT (Sigma G7005). Esta especificidad era independiente del receptor amino que se utilizase. Por consiguiente, esta enzima se utilizó en las reacciones acopladas con oxaloacetato descarboxilasa.

Una reacción típica que parte de indol-3-piruvato incluía (concentraciones finales) Tris-Cl 50 mM pH 7,3, indol-3-piruvato 6 mM, piruvato sódico 6 mM, aspartato 6 mM, PLP 0,05 mM, fosfato potásico 3 mM, MgCl_{2} 3 mM, 25 \mug/ml de aminotransferasa, 50 \mug/ml de ProA aldolasa de C. testosteroni y 3 unidades/ml de descarboxilasa (Sigma O4878). Se dejaron continuar las reacciones durante 1 hora a 26ºC. En algunos casos, se omitió la descarboxilasa o se sustituyó el aspartato por alfa-cetoglutarato (como referencias negativas). Las enzimas aminotransferasa descritas anteriormente se analizaron también en lugar de GOAT para confirmar los experimentos de especificidad iniciales. Se filtraron las muestras y se analizaron por LC/MS como se describe en el Ejemplo 10. Los resultados demuestran que la enzima GOAT produjo la mayor cantidad de monatina por mg de proteína, con la menor cantidad de triptófano producido como subproducto. Además, existió un beneficio de 2 a 3 veces el que tiene la enzima descarboxilasa añadida. La enzima AspC de E. coli produjo también grandes cantidades de monatina en comparación con otras aminotransferasas.

La producción de monatina aumentó: 1) añadiendo periódicamente adiciones 2 mM de indol-piruvato, piruvato y aspartato (cada media hora a una hora), 2) realizando las reacciones en un medio anaerobio o con tampones desgasificados, 3) permitiendo que las reacciones continúen durante la noche, y 4) utilizando descarboxilasa recién preparada que no ha sido congelada y descongelada múltiples veces. La descarboxilasa se inhibió por concentraciones de piruvato mayores de 12 mM. A concentraciones de indol-3-piruvato superiores a 4 mM, se aceleraron las reacciones secundarias con indol-3-piruvato. La cantidad de indol-3-piruvato utilizada en la reacción pudo aumentarse si la cantidad de aldolasa también se incrementaba. Grandes concentraciones de fosfato (50 mM) y de aspartato (50 mM) se observó que eran inhibidoras de la enzima descarboxilasa. La cantidad de enzima descarboxilasa añadida pudo reducirse hasta 0,5 U/ml sin disminuir la producción de monatina en una reacción de una hora. La cantidad de monatina producida aumentó cuando la temperatura aumentaba desde 26ºC a 30ºC y desde 30ºC a 37ºC; sin embargo, a 37ºC también se aceleraron las reacciones secundarias de indol-3-piruvato. La cantidad de monatina producida aumentaba al aumentar el pH desde 7 a 7,3 y era relativamente estable desde pH 7,3 a 8,3.

Una reacción típica que parte de triptófano incluía (concentraciones finales) Tris-Cl 50 mM pH 7,3, triptófano 20 mM, aspartato 6 mM, piruvato sódico 6 mM, PLP 0,05 mM, fosfato potásico 3 mM, MgCl_{2} 3 mM, 25 \mug/ml de aminotransferasa, 50 \mug/ml de ProA aldolasa de C. testosteroni, 4 unidades/ml de descarboxilasa, 5 a 200 mU/ml de L-aminoácido oxidasa (Sigma A-2805), 168 U/ml de catalasa (Sigma C-3515) y 0,008 mg de FAD. Las reacciones se realizaron durante 30 minutos a 30ºC. Se observaron mejoras con la adición de descarboxilasa. La cantidad mayor de monatina se produjo cuando se utilizaron 50 mU/ml de oxidasa. Las mejoras fueron similares a las observadas cuando se utilizó indol-3-piruvato como sustrato. Además, la cantidad de monatina producida aumentaba cuando 1) la concentración de triptófano era baja (es decir, inferior a la K_{m} de la enzima aminotransferasa y por lo tanto incapaz de competir con MP en el punto activo), y 2) la proporción de oxidasa a aldolasa y aminotransferasa se mantuvo a una concentración de modo que el indol-3-piruvato no pudo acumularse.

Si se parte de indol-3-piruvato o triptófano, la cantidad de monatina producida en los ensayos con tiempos de incubación de 1 a 2 horas aumento cuando se utilizaban 2 a 4 veces las cantidades de todas las enzimas mientras se mantenía la misma proporción de enzima. Utilizando uno de los dos sustratos, se consiguieron concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml de monatina. La cantidad de triptófano producido si se parte de indol-piruvato fue típicamente inferior al 20% de la cantidad de producto, lo que muestra la ventaja de utilizar reacciones acopladas. Con la optimización adicional y el control de las concentraciones de los productos intermedios y de las reacciones secundarias, la productividad y rendimiento pueden mejorarse en gran medida.

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Reacciones acopladas utilizando lisina epsilon aminotransferasa (EC 2.6.1.36)

La lisina epsilon aminotransferasa (L-lisina-6-transaminasa) se encuentra en varios organismos, incluyendo Rhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis y Streptomyces. Es utilizada por microorganismos como primera etapa en la producción de algunos antibióticos de beta-lactama (Rius y Demain, J. Microbiol. Biotech., 7:95-100, 1997). Esta enzima convierte la lisina en L-2-aminoadipato 6-semialdehído (alisina), mediante una transaminación mediada por PLP de la C-6 de lisina, utilizando alfa-cetoglutarato como receptor amino. La alisina es inestable y experimenta espontáneamente una deshidratación intramolecular para formar una molécula cíclica de 6-carboxilato de 1-piperideína. Esta inhibe eficazmente cualquier reacción inversa que ocurra. El esquema de reacción se representa en la Fig. 12. Puede utilizarse también una enzima alternativa, la lisina-piruvato 6-transaminasa (EC 2.6.1.71).

Una reacción típica contenía en 1 ml: Tris-HCl 50 mM pH 7,3, indol-3-piruvato 20 mM, PLP 0,05 mM, fosfato potásico 6 mM pH 8,2-piruvato sódico 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, lisina 50 mM, 100 \mug de aminotransferasa (lisina epsilon aminotransferasa LAT-101, BioCatalytics Pasadena, CA), y 200 \mug de ProA aldolasa de C. testosteroni. La cantidad de monatina producida aumentaba al aumentar las concentraciones de piruvato. La cantidad máxima utilizando estas condiciones de reacción (en piruvato 50 mM) era 10 veces menor que cuando se observó con las reacciones acopladas utilizando oxaloacetato descarboxilasa (aproximadamente 0,1 mg/ml).

Un pico con [M+H]^{+} = 293 eluyó en el tiempo esperado para monatina y el espectro de masas contenía varios de los mismos fragmentos observados con otros procesos enzimáticos. Un segundo pico con la proporción masa a relleno correcto (293) eluyó ligeramente antes que el que se observa típicamente para la S,S monatina producida en el Ejemplo 6, y puede indicar la presencia de otro estereoisómero de monatina. Esta enzima produjo muy poco triptófano. Sin embargo, es probable alguna actividad sobre el piruvato (que produce alanina como subproducto). Asimismo, la enzima es conocida por ser inestable. Pueden hacerse mejoras realizando experimentos de evolución directa para aumentar la estabilidad, reducir la actividad con piruvato y aumentar la actividad con MP. Estas reacciones pueden también acoplarse a L-aminoácido oxidasa/catalasa como se describió anteriormente.

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Otras reacciones acopladas

Otra reacción de acoplamiento que puede mejorar el rendimiento de monatina procedente de triptófano o indol-piruvato se muestra en la Fig. 13. La formiato deshidrogenasa (EC 1.2.1.2 ó 1.2.1.43) es una enzima habitual. Algunas formiato deshidrogenasas requieren NADH mientras que otras pueden utilizar NADPH. La glutamato deshidrogenasa catalizó la interconversión entre el precursor de monatina y monatina en los ejemplos anteriores, utilizando tampones a base de amonio. La presencia de formiato amónico y formiato deshidrogenasa es un sistema eficaz para la regeneración de cofactores, y la producción de dióxido de carbono es una manera eficaz de reducir la velocidad de las reacciones inversas (Bommarius et al., Biocatalysis 10:37, 1994 y Galkin et al. Appl. Environ. Microbiol. 63:4651-6, 1997). Además, pueden disolverse grandes cantidades de formiato amónico en el tampón de reacción. El rendimiento de monatina producido por las reacciones de glutamato deshidrogenasa (o las afinaciones reductoras similares) puede mejorarse mediante la adición de formiato deshidrogenasa y formiato amónico.

Otros procedimientos pueden utilizarse para conducir el equilibrio hacia la producción de monatina. Por ejemplo, si se utiliza aminopropano como donante de aminoácido en la conversión de MP a monatina con una omega-aminoácido aminotransferasa (EC 2.6.1.18) como por ejemplo los descritos en las patentes U.S. nº 5.360.724 y nº 5.300.437, uno de los productos resultantes sería acetona, un producto más volátil que el sustrato, aminopropano. La temperatura puede elevarse periódicamente durante cortos periodos para expandir la acetona, aliviando de este modo el equilibrio. La acetona tiene un punto de ebullición de 47ºC, una temperatura que probablemente degrada los productos intermedios si se utiliza durante cortos periodos de tiempo. La mayoría de las aminotransferasas que presentan actividad sobre alfa-cetoglutarato tienen también actividad sobre el precursor de monatina. Asimismo, si se utiliza una glioxalato/aminoácido aromático transferasa (EC 2.6.1.60) con glicina como donante de amino, se produce glioxilato que es relativamente inestable y tiene un punto de ebullición muy reducido en comparación con la
glicina.

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Ejemplo 14

Se prepara una composición de goma de mascar aromatizado con fresa utilizando los ingredientes listados en la Tabla 6. El estereoisómero R,R de monatina puede ser sustituido por acesulfamo K y el estereoisómero S,S de monatina.

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TABLA 6

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La base de goma de mascar es 30% de resina terpénica, 15% de aceite de semillas de algodón hidrogenado, 2% de lecitina, 2,5% de poliisobutileno, 27% de acetato de polivinilo, 12,45% de carbonato cálcico, 11% de copolímero de isobutileno-isopreno y 0,05% de BHT.

La base de goma de mascar se precalienta, se añade a un mezclador de cuchilla en sigma, y se mezcla hasta que es suave y flexible. La solución de sorbitol y glicerina se calienta a 50ºC y se añade al mezclador junto con los restantes ingredientes. Una vez la mezcla termina, se lamina la goma de mascar hasta un espesor de 1,5 mm, se pulveriza con talco, se corta y se envuelve.

Es de esperar que el sabor a fresa esté menos enmascarado y que el dulzor permanezca más tiempo en la composición de goma de mascar que contiene monatina, en comparación con composiciones de goma de mascar similares que contienen edulcorantes de alta intensidad distintos de monatina.

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Ejemplo 15

Formulaciones de goma de mascar que comprenden monatina y procedimiento de preparación de las mismas

A continuación hay varios ejemplos de formulaciones de composiciones de goma de mascar que comprenden monatina, así como un ejemplo de procedimiento para tratar las composiciones.

Formulación A

: 200 g de base de goma

: 340 g de sorbitol en polvo (Cerestar P16616)

: 7 g de yeso

: 3,6 de jarabe de maltitol (Cerestar 16303 concentrado hasta 80 brix)

: 2 g de mentol

: 1,5 g de S,S monatina

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Formulación B

: 200 g de base de goma

: 340 g de sorbitol en polvo (Cerestar P16616)

: 7 g de yeso

: 3,6 de jarabe de maltitol (Cerestar 16303 concentrado hasta 80 brix)

: 2 g de mentol

: 0,05 g de R,R monatina

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Formulación C

: 200 g de base de goma

: 340 g de sorbitol en polvo (Cerestar P16616)

: 7 g de yeso

: 3,6 de jarabe de maltitol (Cerestar 16303 concentrado hasta 80 brix)

: 2 g de mentol

: 0,038 g de S,S monatina

: 0,038 g de R,R monatina

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Formulación D

: 320 g de base de goma

: 400 g de sorbitol en polvo (Cerestar P16616)

: 100 de jarabe de maltitol (Cerestar 16303)

: 40 g de manitol (Cerestar 16700)

: 10 g de isomalta

: 14 g de mentol

: 18 g de esencia de menta

: 1 g de S,S monatina

: 1 g de acesulfamo K

: 0,075 g de R,R monatina

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Formulación E

: 200 g de base de goma

: 400 g de sorbitol (cristalino),

: 46 de jarabe de maltitol (80% ds)

: añadir esencia de cereza al 2% + R,R monatina al 0,02%

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Formulación F

: 211 g de base de goma sin azúcar

: 420 g de sorbitol (cristalino)

: 14 g de glicerol

: añadir esencia al 2% + S,S monatina al 0,2% + R,R monatina al 0,015%

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Formulación G

: 270 g de base de goma

: 340 g de sorbitol

: 34 g de jarabe de sorbitol (70% ds)

: añadir esencia al 2% + S,S monatina al 0,15% + R,R monatina al 0,005%

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Formulación H

: 300 g de base de goma

: 550 g de eritritol

: 100 de jarabe de maltitol

: 49,5 g de glicerina

: 0,5 g de S,S de monatina

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Cómo se procesa la goma:

La base de goma se procesa por extrusión y se coloca en un baño de agua para enfriar y solidificar. Los gránulos de aproximadamente 1/2 cm por 1/2 cm se almacenan hasta la utilización ulterior. Los gránulos se mezclan utilizando un mezclador Z (gran cizallamiento) y se alcanzan temperaturas de hasta 60ºC, ablandando la mezcla. Se añade talco si no está ya en la base de goma. El edulcorante cristalino (p. ej., sorbitol) y el suavizante/plastificante (p. ej., sorbitol líquido), maltitol líquido o glicerol) se añaden paso a paso de modo alternativo mientras se mezcla, para impedir que el motor del mezclador se sobrecaliente. Se añaden y mezclan esencias, colorantes y edulcorantes. Se extrae la mezcla del mezclador, un tamaño de lote típico es de varios cientos de kilogramos. Se presiona la mezcla mediante un extrusor que homogeiniza y forma la goma. Las láminas se aplanan y cortan, y las piezas se empaquetan para barras de goma de mascar o se recubren para gomas de mascar en gránulos.

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Ejemplo 16

Formulación y procedimiento de preparación de goma de mascar sin azúcar Ejemplo de formulación

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9

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Procedimiento de preparación del ejemplo

1.: Precalentar la base de goma en el microondas, añadir a continuación al mezclador de cuchillas en Z y mezclar hasta que se ablande y se pliegue.

2.: Calentar la solución de sorbitol y glicerina en el microondas a 50ºC.

3.: Añadir todos los ingredientes restantes a la cuchilla en Z. Mezclar durante 20 minutos, comprobar la temperatura de la mezcla cada 5 minutos.

4.: Una vez terminada la mezcla sacar la goma del mezclador y laminarla hasta un espesor de 1,5 mm. Pulverizar con talco, cortar y envolver.

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Ejemplo 17

Evaluación de monatina

Se evaluaron formulaciones de monatina, incluyendo la R,R monatina o combinaciones de R,R monatina/eritritol en comparación con otros edulcorantes conocidos (aspartamo y sacaralosa) en té con hielo. Los parámetros organolépticos clave evaluados incluían la calidad del dulzor, el regusto, sabor amargo y su regusto. La evaluación cualitativa se ha realizado.

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Formulaciones del producto - Té con hielo

Se desarrolló una formulación de té con hielo para evaluar el rendimiento de edulcorante (Tabla 7).

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TABLA 7 Formulación de té con hielo

10

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Se añadieron edulcorantes al té en las concentraciones siguientes:

	Aspartamo	0,0450% (p/v)
	Sacaralosa	0,0170% (p/v)
	R,R monatina	0,0030, 0,0035, 0,0040% (p/v) más 1 g de maltodextrina
	R,R monatina/eritritol	0,0030, 0,0035, 0,0040% (p/v) más 1 g de eritritol

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Evaluación organoléptica

La evaluación de las bebidas de té con hielo se realizó por un panel (n = 6) de evaluadores organolépticos experimentados. Los resultados de estas evaluaciones se resumen en la Tabla 8.

TABLA 8 Evaluación organoléptica de té (tamaño del servicio 200 ml)

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11

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Exposición

La monatina aportó ventajas de eficacia imprevistas, incluyendo ventajas organolépticas claras, en las formulaciones con edulcorante. En el té con hielo, y específicamente en el té ácido acidificado (es decir, con limón), la monatina potenció las notas de sabor a limón. Esta ventaja fue más potenciada mediante la adición de bajas concentraciones de eritritol, que eran capaces de equilibrar y perfeccionar el sabor y activar el dulzor al principio. En las bebidas, como por ejemplo el té, la monatina aportada mejoró las propiedades organolépticas (p. ej., menos regusto, menos gustos extraños) y/o características mejoradas de solubilidad y estabilidad. La monatina utilizada para edulcorar el té con hielo contiene aproximadamente 0 calorías, en comparación con las 32 calorías en 2 cucharillas de té (\sim8 g) de sacarosa utilizada para endulzar el té con hielo.

Es de esperar que en las composiciones de goma de mascar, como en las bebidas, la monatina presente aumento de sabores cítricos, así como proporcione características de tiempo/intensidad más favorables de dulzor, en comparación con el aspartamo o la sacaralosa. Además es de esperar que en las composiciones de goma de mascar, una mezcla de monatina y eritritol potencie más los sabores cítricos y proporcione más características de dulzor favorables, en comparación con el aspartamo o la sacaralosa.

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Ejemplo 18

Evaluación de monatina en la goma de mascar Introducción

Cada una de las gomas de mascar dulcoradas con monatina, aspartamo y sacaralosa se prepararon en formato de goma de mascar en barra con sabor a menta. Las gomas de mascar se prepararon para que fueran de igual dulzor y se evaluó la cualidad del sabor dulce y la intensidad en el tiempo de liberación de dulzor.

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Formulaciones de goma de mascar y preparación

Las formulaciones utilizadas en esta evaluación se presentan en la Tabla 9. Se adoptó un procedimiento habitual de preparación para las tres formulaciones de goma de mascar descritas.

TABLA 9 Formulaciones de goma de mascar

12

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El procedimiento de preparación de la goma de mascar fue de la manera siguiente:

\bullet: Precalentar la base de goma de mascar entre 40 y 45ºC y a continuación se añade al mezclador de cuchilla Z y se mezcla

\bullet: Tamizar el sorbitol en polvo

\bullet: Retirar una parte del sorbitol, dispersar el edulcorante en esta parte y mezclar intensamente

\bullet: Volver a mezclar edulcorante/sorbitol hasta que quede una masa de sorbitol en polvo y mezclar intensamente

\bullet: Mezclar licasina y glicerol en un cazo y precalentar a 50ºC

\bullet: Añadir sorbitol en polvo al mezclador de cuchilla en Z que contiene la base de goma

\bullet: Añadir licasina/glicerol y esencia al mezclador de cuchilla en Z y mezclar durante 20 minutos

\bullet: Retirar la goma de mascar del mezclador con cuchilla en Z

\bullet: Laminar hasta un espesor de 1, 5 mm utilizando un rodillo mecánico

\bullet: Pulverizar con talco en la proporción de 3 g de talco a 100 g de goma de mascar

\bullet: Cortar en barras que miden 19 mm \times 73 mm

\bullet: Envolver cada una de las barras en papel de aluminio

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Evaluación organoléptica

Las composiciones de goma de mascar fueron evaluadas por un panel de asesores organolépticos entrenados (n = 4) todos muy experimentados en la evaluación organoléptica formal de gomas de mascar, incluyendo una evaluación de parámetros tiempo/intensidad. Se evaluaron las características cualitativas y temporales del sabor y dulzor de la goma de mascar.

Los resultados de las evaluaciones se presentan en la Tabla 10. En estas evaluaciones, la monatina proporcionó ventajas organolépticas claras en las composiciones de goma de mascar, donde un equilibrio claro entre el dulzor y el sabor permitió a ambos ser percibidos con ventajas organolépticas máximas. Las características de tiempo/intensidad para el dulzor por monatina fueron también claramente muy superiores a las del aspartamo o la sacaralosa. El dulzor fue percibido durante un tiempo significativamente mayor al consumir la goma de mascar edulcorado con
monatina.

13

Ejemplo 19

Curva de respuesta a la dosis de dulzor de monatina y sacarina

Se evaluó el dulzor de la monatina y la sacarina utilizando 20 evaluadores organolépticos entrenados, que emiten juicios por duplicado. Se prepararon soluciones de ensayo y referencia en tampón cítrico/citrato a pH 3,2. Véase la Fig. 16. La respuesta más lineal de R,R/S,S monatina, en comparación con sacarina, es coherente con el aporte de un carácter de sabor más parecido al azúcar. La estabilización anterior 10% SEV indica ausencia/bajos niveles de "mezcla que suprime" sabores extraños y regustos. La forma de la curva de respuesta a la dosis de monatina es similar a la de aspartamo, sacaralosa y alitamo, todos los cuales son edulcorantes de "calidad".

Con R,R/S,S monatina como único edulcorante en el sistema modelo (pH 3,2), se observaron las características siguientes: (1) ligera disminución del comienzo del sabor dulce; (2) la disminución del sabor dulce fue muy rápida; (3) ligero regusto "parecido al del aspartamo", regusto ligeramente dulce, sin amargor en el regusto; y (4) sensación de enfriamiento residual en los sistemas sin sabor.

Ejemplo 20

Estabilidad de monatina a pH 3 sin aumentar las temperaturas

Una muestra de monatina sintética se sometió a pH 3 a temperaturas de 25ºC, 50ºC y 100ºC. A temperatura ambiente y pH 3, se observó un 14% de pérdida de monatina durante un periodo de 48 horas. Esta pérdida se atribuyó a la formación de lactona. A 50ºC y pH 3, se observó una pérdida del 23% de monatina durante un periodo de 48 horas. Esta pérdida fue atribuida a la formación de lactona y al desarrollo de un compuesto desconocido después de aproximadamente 15,5 minutos. A 100ºC y pH 3, casi toda la monatina se perdió después de 24 horas. El componente detectable principal fue uno desconocido a los 15,5 minutos.

Ejemplo 21

Estabilidad organoléptica de monatina y aspartamo a pH 2,5, 3,0, 4,0 a 40ºC

Se controló la estabilidad organoléptica de soluciones de monatina preparadas a pH 2,5, 3,0 y 4,0 y se almacenaron a 40ºC durante 100 días. La pérdida de dulzor de estas soluciones se comparó con las pérdidas de dulzor de las soluciones de aspartamo preparadas y almacenadas en idénticas condiciones.

La estabilidad organoléptica de monatina (8% de SEV, \sim55 ppm, mezcla sintética que contiene aproximadamente 96% del par enantiomérico 2R,4R/2S,4S y 4% del par enantiomérico 2R,4S/2S,4R en tampones de fosfato/citrato con un pH de 2,5, 3,0 y 4,0 se examinó después del almacenamiento a 40ºC. Se comparó la estabilidad de la monatina con la del aspartamo (400 ppm) en los mismos tampones. Se prepararon tres soluciones de referencia de sacarosa en los mismos tampones de fosfato/citrato como soluciones de monatina y aspartamo. Todas las soluciones preparadas se almacenaron a la oscuridad.

Composiciones de los tampones:: pH 2,5 ácido fosfórico (solución al 75%) 0,127% (p/v)

\quad: citrato trisódico monohidratado al 0,005% (p/v)

\quad: pH 3,0 ácido fosfórico (solución al 75%) 0,092% (p/v)

\quad: citrato trisódico monohidratado al 0,031% (p/v)

\quad: pH 4,0 ácido fosfórico (solución al 75%) 0,071% (p/v)

\quad: citrato trisódico monohidratado al 0,047% (p/v)

El dulzor de cada edulcorante en comparación con sacarosa fue evaluado por duplicado por un panel (n = 8) de evaluadores organolépticos entrenados experimentados en el procedimiento de estimación del dulzor. Todas las muestras (en los mismos tampones) se sirvieron por duplicado a una temperatura de 22ºC \pm 1ºC. Las soluciones (de prueba) de monatina, codificadas con códigos de cifras aleatorias de 3 dígitos se presentaron a cada uno de los panelistas, en orden aleatorio. Se proporcionaron también patrones de referencia de sacarosa, que oscilaban entre 4,0 y 10,0% (p/v) de sacarosa, que aumenta en las etapas de sacarosa al 0,5% (p/v). Se pidió a los panelistas que estimasen el dulzor comparando el dulzor de la solución de prueba con los patrones de sacarosa. Esto se realizó tomando 3 sorbos de la solución de prueba, seguido de un sorbo de agua, seguido de 3 sorbos de patrón de sacarosa, seguido de un sorbo de agua, etc. Se alentó a los panelistas que estimasen el dulzor con una cifra decimal (p. ej., 6,8, 8,5). Se impuso un periodo de descanso de cinco minutos entre la evaluación de las soluciones de la prueba. Se pidió también a los pane-
listas que se enjuagasen bien y comiesen una galleta para reducir cualquiera de los efectos potenciales de lo anterior.

Las Tablas 11 y 12 presentan los resultados de los estudios de estabilidad en los tampones de fosfato y citrato. A cada pH después de un almacenamiento de 100 días a 40ºC en la oscuridad, el porcentaje de retención de dulzor de monatina fue mayor que el retenido con aspartamo. A pH 4,0, la pérdida de dulzor de la solución de monatina parecía casi haberse estabilizado ya que había muy poco cambio en la intensidad de dulzor medida entre los días 17 y 100, mientras que la solución de aspartamo continuó perdiendo dulzor.

TABLA 11 Estabilidad organoléptica de monatina: Dulzor después de 100 días de almacenamiento a 40ºC

14

15

16

TABLA 12 Estabilidad: Cantidad de dulzor que queda después de 100 días de almacenamiento al pH indicado a 40ºC

17

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Los respectivos tampones fueron eficaces para mantener el pH, como se observa en la Tabla 13.

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TABLA 13

18

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Si se supone una reacción de descomposición de pseudo-primer orden, un gráfico de log_{n} porcentaje de retención frente al tiempo (log_{n}% RTN v. t) permite la estimación de la vida media (t1/2) y la velocidad constante (k) de pérdida de dulzor en cualquier conjunto de condiciones dadas. Al actuar de este modo, la cinética de la pérdida de dulzor de monatina y aspartamo puede resumirse de la forma siguiente en la Tabla 14.

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TABLA 14

19

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A cada pH después de un almacenamiento de 100 días a 40ºC, el porcentaje de retención de dulzor de monatina es mayor que el retenido del aspartamo. A pH 4,0, la pérdida de dulzor de la solución de monatina parece casi haberse estabilizado ya que existe se modifica poco la intensidad de dulzor medida entre los días 17 y 100, mientras que la solución de aspartamo continúa perdiendo dulzor.

Las estimaciones de la vida media de monatina y aspartamo indican que el dulzor procedente de monatina se pierde a una velocidad más lenta que el del aspartamo. las estimaciones de la vida media para el dulzor de monatina a pH 2,5, 3,0 y 4,0 fueron de 65 días, 115 días y 230 días, respectivamente. Las estimaciones de la vida media del aspartamo fueron de 55 días, 75 días y 140 días en las mismas condiciones.

Por lo tanto, en condiciones ácidas y almacenamiento a 40ºC, la monatina aporta un dulzor más estable que el aspartamo.

Ejemplo 22

Cromatografía de los estereoisómeros de monatina

Preparación de la muestra - Se colocaron en un tubo de microcentrifugadora aproximadamente entre 50 y 75 \mug del material liofilizado. A esto se añadió 1,0 ml de metanol calidad HPLC. La solución se agitó intensamente durante 30 minutos, se centrifugó y se separó una alícuota del sobrenadante para análisis.

HPLC en fase inversa - Se realizó la cromatografía de dos picos distintos del diastereómero (R,R/S,S y R,S/S,R) utilizando una columna de HPLC de 2,1 \times 250 mm Xterra^{TM} MS C_{8} 5 \mum (Waters Corporation). La detección se realizó utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadripolo Ultima^{TM} de Micromass. Se administró a la fase móvil el gradiente siguiente:

101

HPLC quiral - Se realizó la cromatografía de dos estereoisómeros distintos de monatina (R,R y S,S) utilizando una columna de HPLC de 250 \times 4,6 mm Chirobiotic T (Advanced Separations Technologies, Inc.). La detección se realizó utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadripolo Ultima^{TM} de Micromass. La fase móvil estaba constituida por metanol con 0,2% de ácido acético y 0,05% de hidróxido amónico.

Espectrometría de masas (MS/MS) - Se detectó la presencia de monatina por un experimento de Control de reacción seleccionado (SRM). El ión molecular protonado de monatina ([M + H]^{+}) tiene una m/z=293,3. La fragmentación de este ión molecular produce un ión significativo a m/z=257,3 que surge de las múltiples deshidrataciones del ión molecular. Esta transición se ha demostrado que es muy específica para monatina y se seleccionó como la transición (293,3 a 257,3) para el control durante el experimento por SRM. Este método de detección se utilizó tanto en fase inversa como en las separaciones quirales de monatina.

Resultados - Las muestras patrón de R,S/S,R y S,S/R,R se evaluaron por HPLC en fase inversa. Se prepararon muestras por derivación y resolución enzimática. Los cromatogramas para las soluciones patrón se presentan en la Fig. 17. Después de los análisis en fase inversa, se realizó la cromatografía quiral para evaluar los estereoisómeros específicos presentes en las muestras. La cromatografía quiral de las soluciones patrón de S,S y R,R monatina se presentan en la Fig. 18.

Ejemplo 23

Estabilidad de monatina a alta temperatura (80ºC) y pH neutro

Se utilizó una solución de 100 mililitros de 75 ppm de monatina a pH 7 como solución patrón. La muestra de monatina sintética contenía aproximadamente 96% del par enantiomérico 2R,4R/2S,4S y 4% del par enantiomérico 2R,4S/2S,4R. Se incubaron las muestras a 80ºC y pH 7 durante el experimento y se retiraron las muestras a las 0, 1, 2, 3, 4 horas y a los 1, 2, 4, 7, 14, 21 y 35 días. Todas las condiciones experimentales se hicieron por duplicado.

Separación y cuantificación utilizando LC-MS que emplea cromatografía en fase inversa - Se creó una curva de respuesta para ambos picos del diastereómero detectados de la monatina sintética. Un intervalo entre 5 y 150 ppm se agrupó con el patrón sintético de monatina disuelto en agua DI. La separación de los dos picos del diastereómero se realizó utilizando una columna de HPLC de 3,9 \times 150 mm Novapak C18 (Waters Corporation). Se utilizaron detectores de ultravioleta-visible (UV) y del espectrómetro de masas (MS) en serie para detección y cuantificación. La monatina y su pico de lactona presentan cada uno un UV_{máx} a 279 nm que ayuda a la detección exacta. La cuantificación se realizó obteniendo el barrido por control iónico seleccionado (SIM) de 293,3 m/z y 275,3 m/z en modo electroatomización iónica positiva.

Resultados - A pH neutro, el grado de degradación de monatina se determinó que era insignificante aun después de 7 a 35 días. La desaparición de monatina a lo largo del tiempo depende mucho del pH ya que los subproductos principales son la ciclación y posiblemente niveles muy pequeños de racemización. Durante el experimento a 80ºC y pH 7, no se detectó ningún cambio en la concentración de RR/SS monatina racémica o en las lactonas de la misma dentro de los límites de precisión proporcionados utilizando LC-MS para cuantificación. Debido a la estabilidad térmica de monatina a pH neutro, es de esperar que la monatina tenga una estabilidad adecuada para las temperaturas de tratamiento de la goma de mascar, y tiene un periodo de conservación más prolongado en las composiciones de goma de mascar, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad, como por ejemplo el aspartamo.

En vista a las muchas formas de realización posibles a las que pueden aplicarse los principios de esta exposición, debe apreciarse que las formas de realización ilustradas son únicamente ejemplos específicos de la exposición y no limitativos del alcance de la exposición.

<110> CARGILL, INC.

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<120> COMPOSICIONES DE GOMA DE MASCAR QUE COMPRENDEN MONATINA Y PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACIÓN DE LAS MISMAS

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<130> 023829-0361

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<140> PCT/US2004/026330

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<141> 2004-08-16

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<150> 60/495,191

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<151> 2003-08-14

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<160> 74

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 1170

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<212> ADN

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<213> Sinorhizobium meliloti

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<400> 1

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20

\newpage

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<210> 2

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<211> 389

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<212> PRT

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<213> Sinorhizobium meliloti

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<400> 2

21

22

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<210> 3

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<211> 1260

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<212> ADN

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<213> Rhodobacter sphaeroides

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<400> 3

23

230

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<210> 4

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<211> 419

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<212> PRT

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<213> Rhodobacter sphaeroides

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<400> 4

25

26

27

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<210> 5

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<211> 1260

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<212> ADN

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<213> Rhodobacter sphaeroides

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<400> 5

28

29

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<210> 6

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<211> 419

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<212> PRT

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<213> Rhodobacter sphaeroides

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<400> 6

30

31

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<210> 7

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<211> 1239

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<212> ADN

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<213> Leishmania major

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<400> 7

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32

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<210> 8

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<211> 412

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<212> PRT

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<213> Leishmania major

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<400> 8

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33

34

35

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<210> 9

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<211> 1182

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<212> ADN

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<213> Bacillus subtilis

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<400> 9

36

360

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<210> 10

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<211> 393

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<212> PRT

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<213> Bacillus subtilis

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<400> 10

38

39

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<210> 11

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<211> 1176

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<212> ADN

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<213> Lactobacillus amylovorus

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<400> 11

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40

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<210> 12

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<211> 391

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<212> PRT

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<213> Lactobacillus amylovorus

\newpage

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<400> 12

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41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1413

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> R. sphaeroides

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 470

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> R. sphaeroides

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgaa ggttttagtc aatgg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta tgaaatgcta gcagcct

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgtt cgacgccctc gcccg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca gagactggtg aacttgc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgga acatttgctg aatcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta aacgccgttg tttatcg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgcg cgagcctctt gccct

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta ttcgtcctct tgtaaaa

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgcg ctctacgacg gctcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca gccgcgcagc accttgg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgtt tgagaacatt accgc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta cagcactgcc acaatcg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 397

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcgtgtt tcaaaaagtt gacgc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta catcaccgca gcaaacg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgga gtccaaagtc gttga

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta cacttggaaa acagcct

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgaa aaactggaaa acaag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Citrobacter freundii

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtagacgcgg actaactctt tggcagaag

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 684

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> C. testosteroni

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> C. testosteroni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcca taatggttga gaacattacc g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtattgagg gtcgc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 74

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17

Claims

1. Composición de goma de mascar que comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende monatina o una sal de la misma.

2. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la cantidad de la composición contiene menos calorías y carbohidratos que la misma cantidad de la composición de goma de mascar que contiene sacarosa en lugar de monatina o de una sal de la misma.

3. Composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma, en la que la monatina o una sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona un dulzor prolongado y un sabor no enmascarado o potenciado, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad sustituidos por monatina o una sal de la misma en la goma de mascar.

4. Composición de goma de mascar según la reivindicación 3, en la que se seleccionan otros edulcorantes de alta intensidad de entre aspartamo y sacaralosa.

5. Procedimiento para preparar una composición de goma de mascar edulcorada con monatina que presenta un dulzor de larga duración potenciado proporcionado por la monatina o una sal de la misma, que comprende las etapas siguientes:

(a): producir monatina o una sal de la misma a través de una ruta biosintética;

(b): combinar la monatina o una sal de la misma con otros ingredientes; y

(c): formar la composición de goma de mascar.

6. Composición de goma de mascar comprende monatina o una sal de la misma, en la que la monatina o una sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona un dulzor de larga duración potenciado.

7. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona un dulzor prolongado en comparación con el aspartamo o la sacaralo-
sa.

8. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además un sabor cítrico.

9. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además un sabor cítrico, y en la que la monatina o una sal de la misma está presente en una cantidad que potencia el sabor proporcionado por el sabor cítrico.

10. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,1% en peso de monatina o de una sal de la misma.

11. Composición de goma de mascar según la reivindicación 10, en la que la composición está sustancialmente exenta de S,S monatina o de una sal de la misma.

12. Composición de goma de mascar según la reivindicación 10, en la que la composición está sustancialmente exenta de R,R monatina o de una sal de la misma.

13. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,009 a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma.

14. Composición de goma de mascar según la reivindicación 13, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,015 a aproximadamente 0,25% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma.

15. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma.

16. Composición de goma de mascar según la reivindicación 15, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,88% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma.

17. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0 a aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma y desde aproximadamente 0 a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma.

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18. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición comprende aproximadamente 0,1% en peso o menos de R,R monatina o de una sal de la misma y en la que la monatina o una sal de la misma está sustancialmente exenta de S,S, S,R o R,S monatina o de una sal de la misma.

19. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición comprende aproximadamente 1,1% en peso o menos de S,S monatina o de una sal de la misma y en la que la monatina o una sal de la misma está sustancialmente exenta de R,R, S,R o R,S monatina o de una sal de la misma.

20. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma está constituida sustancialmente por R,R monatina o una sal de la misma.

21. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma está constituida sustancialmente por S,S monatina o una sal de la misma.

22. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma es una R,R monatina enriquecida estereoisoméricamente o una sal de la misma.

23. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma es una S,S monatina enriquecida estereoisoméricamente o una sal de la misma.

24. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma comprende por lo menos 95% de R,R monatina o una sal de la misma.

25. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma comprende por lo menos 95% de S,S monatina o una sal de la misma.

26. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma se produce en una ruta biosintética.

27. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además un ciclamato.

28. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además eritritol.

29. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que todos los componentes de las partes son naturales.

30. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición es biodegradable.

31. Composición de goma de mascar según la reivindicación 30, en la que la composición comprende un componente seleccionado de entre copolímeros de ácido láctico, proteínas, jelutong, perillo, sorva, massaranduba balata, massaranduba chocolate, níspero, rosindinha, goma de mascar, gutta hang kang, arabinogalactano, guar, xantano y una combinación de los mismos.

32. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la composición es no cariógena.

33. Composición de goma de mascar que comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende una mezcla de monatina enriquecida estereoisoméricamente, en la que la mezcla de monatina es producida mediante una ruta biosintética.

34. Composición de goma de mascar según la reivindicación 33, en la que la ruta biosintética consiste en una ruta multietapa y por lo menos una etapa de la ruta multietapa es una conversión química.

35. Composición de goma de mascar según la reivindicación 33, en la que la mezcla es en su mayor parte R,R monatina o una sal de la misma.

36. Composición de goma de mascar según la reivindicación 33, en la que la mezcla es en su mayor parte S,S monatina o una sal de la misma.

37. Composición de goma de mascar que comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende una composición de monatina producida en una ruta biosintética, y en la que la composición de monatina no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos.

38. Composición de goma de mascar que comprende una parte de base de goma y una parte soluble, en la que la parte soluble comprende monatina o una sal de la misma, en la que la monatina o una sal de la misma es producida en una ruta biosintética y se aísla a partir de una célula recombinante, y en la que la célula recombinante no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos.

39. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte de base de goma comprende 3 a 50% en peso de un elastómero; 0,5 a 25% en peso de un suavizante; 2 a 30% en peso de un emulsionante; 5 a 75% en peso de una resina y 0 a 20% en peso de un relleno.

40. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que el elastómero se selecciona de entre el grupo constituido por un caucho natural, una goma natural y un elastómero sintético.

41. Composición de goma de mascar según la reivindicación 40, en la que el caucho natural se selecciona de entre el grupo constituido por látex ahumado, látex líquido y guayule.

42. Composición de goma de mascar según la reivindicación 40, en la que la goma natural se selecciona de entre el grupo constituido por jelutong, perillo, sorva, massaranduba balata, massaranduba chocolate, níspero, rosindinha, goma de mascar y gutta hang kang.

43. Composición de goma de mascar según la reivindicación 40, en la que el elastómero sintético se selecciona de entre el grupo constituido por copolímeros de butadieno-estireno, copolímeros de isobutileno-isopreno, elastómeros poliméricos de polibutadieno, poliisobutileno y vinilo.

44. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que el suavizante comprende uno o más de entre sebo, sebo hidrogenado, aceites vegetales hidrogenados, aceites vegetales parcialmente hidrogenados, manteca de cacao, monoestearato de glicerol, triacetato de glicerol, lecitina, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, monoglicéridos acetilados y ácidos grasos.

45. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que el relleno comprende una o más de entre lecitina, inulina, polidextrina, carbonato cálcico, carbonato de magnesio, silicato de magnesio, caliza molida, silicato de aluminio, talco, arcilla, alúmina, dióxido de titanio y fosfato cálcico.

46. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que el emulsionante es monoestearato de glicerol, lecitina, ácido poliglicerol polirricinoleico o estearato de magnesio.

47. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que la resina es un éster de colofonia, una resina terpénica, acetato de polivinal, alcohol polivinílico, acetato etilenvinílico o copolímero de acetato de vinilo-laurato de vinilo.

48. Composición de goma de mascar según la reivindicación 47, en la que el éster de colofonia es un éster de glicerol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster de glicerol de colofonia polimerizada, un éster de glicerol de colofonia parcialmente dimerizada, un éster de glicerol de colofonia, un éster de pentaeritritol de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster metílico de colofonia o un éster metílico de colofonia parcialmente hidroge-
nada.

49. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que el emulsionante y el suavizante son compuestos diferentes.

50. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que el emulsionante y el relleno son compuestos diferentes.

51. Composición de goma de mascar según la reivindicación 39, en la que el suavizante y el relleno son compuestos diferentes.

52. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además un edulcorante de carga.

53. Composición de goma de mascar según la reivindicación 52, en la que un edulcorante de carga es un edulcorante de maíz, sacarosa, dextrosa, azúcar invertido, dextrina, fructosa, levulosa, sólidos del jarabe de maíz, galactosa, trehalosa, isomaltulosa o una combinación de los mismos.

54. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además un edulcorante de alta intensidad o un carbohidrato glucémico inferior.

55. Composición de goma de mascar según la reivindicación 54, en la que el edulcorante de alta intensidad o el carbohidrato glucémico inferior se selecciona de entre sorbitol, manitol, maltitol, hidrolizados de almidón hidrogenado, xilitol, alitamo, taumatina, sacaralosa, aspartamo, acesulfamo K, una dihidrochalcona, sacarina, neotamo, un ciclamato, esteviósido, mogrósido, tagatosa, eritritol, isomalta, lactitol, glicirrizina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazzeína, curculina, miraculina y pentadina.

56. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además un agente aromatizante.

57. Composición de goma de mascar según la reivindicación 56, en la que el agente aromatizante es un aceite esencial, un agente aromatizante de frutas, un sabor sintético, o una combinación de los mismos.

58. Composición de goma de mascar según la reivindicación 57, en la que el aceite esencial es aceite de menta, aceite de hierbabuena o aceite de gaulteria.

59. Composición de goma de mascar según la reivindicación 57, en la que el agente aromatizante es un aceite aromatizante de frutas.

60. Composición de goma de mascar según la reivindicación 59, en la que el agente aromatizante de frutas comprende extracto, esencia o aceite de limón, lima, naranja, mandarina, pomelo, cidra, kumquat, plátano, cereza, manzana, piña, uva, fresa, tutti-frutti, sandía o combinaciones de los mismos.

61. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma es una mezcla de R,R y S,S monatina o de una sal de las mismas.

62. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende una mezcla de monatina o de una sal de la misma y acesulfamo K.

63. Composición de goma de mascar según la reivindicación 62, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o una sal de la misma y desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,3% en peso de acesulfamo K.

64. Composición de goma de mascar según la reivindicación 62, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,7% en peso de S,S monatina o una sal de la misma y desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,2% en peso de acesulfamo K.

65. Composición de goma de mascar según la reivindicación 62, en la que la composición comprende desde aproximadamente 0,009 a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o una sal de la misma y desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,3% en peso de acesulfamo K.

66. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la monatina o una sal de la misma está encapsulada.

67. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte de base de goma comprende del 15 al 30% en peso de la composición.

68. Composición de goma de mascar según la reivindicación 1, en la que la parte soluble comprende además un edulcorante de carga, un edulcorante de alta intensidad o un carbohidrato glucémico inferior y un agente aromati-
zante.

69. Procedimiento para la preparación de una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma, en el que el procedimiento comprende la producción de monatina o de una sal de la misma a partir de por lo menos un sustrato seleccionado de entre glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, indol-3-piruvato y el precursor de la monatina.

70. Procedimiento para la preparación de una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma, en el que el procedimiento comprende la producción de monatina o de una sal de la misma a través de una ruta biosintética.

71. Procedimiento para la preparación de una composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma, en el que el procedimiento comprende la producción de monatina o de una sal de la misma utilizando por lo menos una conversión biológica.

72. Procedimiento según la reivindicación 69, en el que el procedimiento comprende además combinar la monatina o una sal de la misma con por lo menos otro ingrediente que no sea monatina o una sal de la misma.

73. Procedimiento según la reivindicación 72, en el que la composición de goma de mascar comprende desde aproximadamente 0 a aproximadamente 1,1% en peso de S,S monatina o de una sal de la misma, y desde aproximadamente 0 a aproximadamente 0,1% en peso de R,R monatina o de una sal de la misma.

74. Procedimiento para la preparación de una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina, en el que el procedimiento comprende: (a) producir monatina o una sal de la misma en una ruta biosintética en una célula recombinante; (b) aislar la composición de monatina de la célula recombinante, en el que la composición de monatina está constituida por monatina o una sal de la misma y otro material comestible o
potable.

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75. Composición de goma de mascar que comprende monatina o una sal de la misma y por lo menos otro ingrediente seleccionado de entre eritritol, trehalosa, sorbitol, manitol, maltitol, xilitol, alitamo, taumatina, sacaralosa, aspartamo, acesulfamo K, una dihidrochalcona, sacarina, neotamo, un ciclamato, esteviósido, mogrósido, tagatosa, isomalta, lactitol, glicirrizina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazzeína, curculina, miraculina y pentadina.