BRPI0609878A2 - polipeptìdeos e vias biossintéticas para a produção de monatina e seus precursores - Google Patents

polipeptìdeos e vias biossintéticas para a produção de monatina e seus precursores Download PDF

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Abstract

POLIPEPTìDEOS E VIAS BIOSSINTéTICAS PARA A PRODUçãO DE MONATINA E SEUS PRECURSORES. A presente invenção refere-se a métodos e composições que podem ser usados para fazer monatina a partir de glicose, triptofano, ácido indol-3-Iático, indol-3-piruvato e ácido 2-hid róxi-2-(indol-3-ilmetila)-4- cetoglutárico. Métodos também são descritos para a produção de intermediários de ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico e indol-3-piruvato. As composições fornecidas incluem moléculas de ácido nucléico, polipeptideos, estruturas químicas e células. Métodos incluem processos in vitro e in vivo, e os métodos in vitro incluem reações químicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ-DEOS E VIAS BIOSSINTÉTICAS PARA A PRODUÇÃO DE MONATINA ESEUS PRECURSORES".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a polipeptídeos e vias biossintéti-cas que são úteis na produção de indol-3-piruvato, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico (MP) e/ou monatina.
Técnica Antecedente
Indol piruvato
lndol-3-piruvato é um forte antioxidante que se acredita que con-trabalance o estresse oxidativo nos tecidos com altas concentrações de oxi-gênio (Politi et ai "Recent advances in Tryptophan Research", editado por G.A. Filippini et ai Plenum Press, New York, 1996, pp 291-8). Indol piruvatotambém é um intermediário em um via para produzir ácido indolacético (IA-A), o hormônio do crescimento de planta primário auxina (fator promotor docrescimento difusível). IAA é ativo em quantidades de submicrogramas emum faixa de processos fisiológicos incluindo dominância apical, tropismos,alongamento de broto, indução de divisão celular cambial e iniciação de raiz.Auxinas sintéticas são usadas na horticultura para induzir o enraizamento epara promover a forma e desenvolvimento da fruta. Em altas concentrações,as auxinas sintéticas são herbicidas eficazes contra plantas de folhas largas.Auxinas naturais produzidas por fermentação podem ser consideradas maispropícias sob um ponto de vista ambiental do que herbicidas quimicamenteproduzidos. Reguladores do crescimento tiveram vendas mundiais em 1999de 0,4 bilhão de libras (1,4 bilhão de dólares americanos).
Alguns exemplos de patentes no ácido indolacético e em seusderivados incluem: Patente Americana N- 5.843.782 Micropropagation ofrose plants, auxin used in culture médium e Patente Americana N95.952.231, Micropropagation of rose plants.
Além de utilidades relacionadas com plantas, o ácido indolacéti-co é útila em aplicações farmacêuticas. Por exemplo, a Patente AmericanaNQ 5.173.497, "Method of preparing alpha-oxopyrrolo[2,3-B]indole acetic a-cids and derivatives", propõe o uso desses compostos no tratamento de di-minuição da capacidade de memorização, tal como aquela associada com adoença de Alzheimer e a demência senila. O mecanismo proposto na Paten-te Americana N- 5.173.497 é que esses compostos inibem o polipeptídeoacetilcolinesterase e aumentam o nível de acetilcolina no cérebro.
lndol-3-carbinol é produzido a partir do ácido indol-3-acético poroxidação catalisada por peroxidase, e pode ser facilmente convertido emdiindolilmetano. Ambos os compostos são reportados por eliminar toxinas epromover a produção de hormônios benéficos para a saúde das mulheres.
Derivados do triptofano
D-triptofano clorado foi identificado como um adoçante não-nutritivo, e há um interesse crescente em procurar outros derivados damesma forma. Monatina é um adoçante natural que é semelhante na com-posição ao aminoácido triptofano. Ele pode ser extraído do córtex das raízesdo arbusto sul-africano, Sclerochiton ilicifolius, e tem uma promessa na in-dústria de alimentos e de bebidas como um adoçante de alta intensidade.Alguns exemplos de patentes da monatina incluem: Patente Americana NQ5994559, Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener, Patente
Americana N9 4975298, 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indolecompounds, Patente Americana N- 5128164, Composition for human con-sumption containing 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indolecompounds; e a Patente Americana NQ 5128482, Process for the productionof 3-1 (1 -amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) indole.
Alguns dos precursores da monatina descritos aqui também po-dem ser úteis como adoçantes sintéticos ou como intermediários na síntesedos derivados de monatina.
BREVE RESUMO DA INVENÇÃO
A descrição fornece várias vias biossintéticas para fazer monati-na a partir de glicose, triptofano, ácido indol-3-lático e/ou através de precur-sores da monatina tais como indol-3-piruvato e ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico. Seqüências de polipeptídeos e de ácido nucléicoque podem ser usadas para fazer monatina, indol-3-piruvato e ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico são descritas. Num esforço paraser conciso, onde são identificados constantemente intermediários/produtosna especificação e reivindicações (por exemplo, monatina ou precursor demonatina) como sendo formados, o termo "e/ou sais seus" deve ser entendi-do como estando incluídos onde aplicável. Em outras palavras, por exemplo,a frase "indol-3-piruvato é convertido no precursor de monatina" deve serentendida para ler "ácido indol-3-pirúvico é convertido no precursor de mo-natina e/ou seus sais". Uma pessoa normalmente versada, de fato, poderiaperceber que sob as condições reacionais mostradas os sais dos intermediá-rios/produtos estão, de fato, presentes ou também presentes.
Monatina pode ser produzida pela reação de uma mistura rea-cional que inclui um ou mais substratos adequados e um ou mais polipeptí-deos selecionados. Substratos adequados podem incluir, mas não estão li-mitados, a glicose, triptpfano, ácido indol-3-lático, precursores da monatina(tais como indol-3-piruvato e ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico) e suas misturas. Substratos adequados que estão presentesna mistura reacional para produzir monatina podem ser adicionados à mistu-ra reacional e/ou podem ser produzidos in situ na mistura reacional. Os poli-peptídeos selecionados podem ser adicionados à mistura reacional e/ou po-dem ser produzidos por microrganismos presentes na mistura reacional (porexemplo, pela fermentação da mistura reacional com um microrganismo queexpressa o polipeptídeo selecionado).
Monatina pode ser produzida através do indol-3-piruvato, ácido2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico (precursor de monatina, MP, aforma alfa-ceto da monatina), ácido indol-3-lático, triptofano e/ou glicose(FIGURA 1). Métodos de produção ou para fazer monatina ou seus interme-diários mostrados nas figuras 1-3 e 11-13 que envolvem a conversão de umsubstrato num primeiro produto, e a seguir a conversão do primeiro produtonum segundo produto, e assim por diante, até que o produto final desejadoseja criado, são descritos.
As figuras 1-3 e 11-13 mostram produtos intermediários potenci-ais e produtos finais em caixas. Por exemplo, uma conversão de um produtoem outro, tal como de glicose em triptofano, triptofano em indol-3-piruvato,indol-3-piruvato em MP, PM em monatina ou ácido indol-3-lático (indol-lactato) em indol-3-piruvato) pode ser efetuada pelo uso desses métodos.Essas conversões podem ser facilitadas química ou biologicamente. O termo"converte" se refere ao uso ou de formas químicas ou polipeptídeos em umreação a qual altera um primeiro intermediário num segundo intermediário. Otermo "conversão química" se refere às reações que não são ativamentefacilitadas por polipeptídeos. O termo "conversão biológica" se refere às rea-ções que são ativamente facilitadas por polipeptídeos (por exemplo, enzi-mas). Conversões podem ocorrer in vitro ou in vivo (por exemplo, pela fer-mentação de um caldo nutriente com um microrganismo adequado). Quandoconversões biológicas são usadas, os polipeptídeos e/ou células podem serimobilizados em suportes, tais como por ligação química em suportes poli-méricos. A conversão pode ser realizada usando qualquer reator conhecidopor uma pessoa normalmente versada na técnica, por exemplo, num reatorem batelada ou contínuo.
Também são fornecidos métodos que incluem o contato de um primei-ro polipeptídeo com um substrato e fazer um primeiro produto, e a seguir ocontato do primeiro produto criado com um segundo polipeptídeo e a criaçãode um segundo produto, e a seguir o contato do segundo produto criado comum terceiro polipeptídeo e a criação de um terceiro produto, por exemplomonatina. Os polipeptídeos usados e os produtos produzidos estão mostra-dos nas figuras 1-3 e 11-13.
Polipeptídeos, e suas seqüências codificadoras, que podem serusados para efetuar as conversões mostradas nas figuras 1-3 e 11-23, sãodescritos. Em alguns exemplos, polipeptídeos com um ou mais pontos demutação que permitem a especificidade do substrato e/ou atividade dos poli-peptídeos a serem modificados, são usados para fazer monatina.
Células isoladas e recombinantes que produzem monatina sãodescritas. Essas células podem ser qualquer célula, tal como uma célula ve-getal, animal, bacteriana, de levedura, de alga, "de archaea" ou fúngica. Es-sas células podem ser usadas para sintetizar monatina por fermentação deum meio nutriente que inclui a célula. O meio nutriente pode incluir qualquermolécula adequada para sintetizar monatina incluindo, mas sem se limitar, aglicose, triptofano, ácido indol-3-lático e/ou precursores da monatina taiscomo indol-3-piruvato e ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutártico.
Num exemplo particular, as células descritas incluem uma oumais das seguintes atividades, por exemplo, duas ou mais ou três ou maisdas seguintes atividades: triptofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), tirosina(aromática) aminotransferase (EC 2.6.1.5), aminotransferase de substratomúltiplo (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), triptofano de-sidrogenase (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato transaminase (EC2.6.1.28), L-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.2), triptofano oxidase (sem núme-ro EC, Hadar era/., J. Bacteriol 125:1096-1104, 1976 e Furuya era/., BiosciBiotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), D-aminoácido desidrogenase (EC1.4.99.1), D-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.3), D-alanina aminotransferase(EC 2.6.1.21), sintase/liase (EC 4.1.3.-), tal como 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17) ou 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase (EC4.1.3.16), sintase/liase (4.1.2.-), D-triptofano aminotransferase (Kohiba e Mi-to, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Car-bonyl Catalysis, Osaka, Japão 1990), aminotransferase de cadeia ramificada(BCAT, EC 2.6.1.42), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20), glutamatodesidrogenase (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) e leucina (cadeia ramificada)desidrogenase (EC 1.4.1.9).
Em outro exemplo, células incluem uma ou mais, por exemploduas ou mais, ou três ou mais das seguintes atividades: indolelactato desi-drogenase (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenila-lactato desidrogenase (EC1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato redutase (EC 1.1.1.237), lactato desi-drogenase (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-ila)lactato desidro-genase (EC 1.1.1.111), lactato oxidase (EC 1.1.3.-), sintase/liase (4.1.3.-), talcomo 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17) ou 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.16), sintase/liase (4.1.2.-), triptofano desi-drogenase (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato transaminase (EC 2.6.1.28),triptofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática) aminotransfe-rase (EC 2.6.1.5), aminotransferase de substrato múltiplo (EC 2.6.1.-), aspar-tato aminotransferase (EC 2.6.1.1), aminotransferase de cadeia ramificada(BCAT, EC 2.6.1.42), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20), glutamatodesidrogenase (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), leucina (cadeia ramificada) de-sidrogenase (EC 1.4.1.9), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1), D-triptofano aminotransferase, e/ou D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21).
Além disso, as células descritas podem incluir uma ou mais dasseguintes atividades, por exemplo, duas ou mais ou três ou mais das seguin-tes atividades: triptofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática)aminotransferase (EC 2.6.1.5), aminotransferase de substrato múltiplo (EC2.6.1.-), aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), triptofano desidrogenase(EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato transaminase (EC 2.6.1.28), L-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.2), triptofano oxidase (sem número EC), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidase (EC1.4.3.3), D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21), indolelactato desidroge-nase (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenila-lactato desidrogenase (EC 1.1.1.222),3-(4)-hidroxifenilpiruvato redutase (EC 1.1.1.237), lactato desidrogenase (EC1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-ila) lactato desidrogenase (EC1.1.1.111), lactato oxidase (EC 1.1.3.-), sintase/liase (4.1.3.-) tal como 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17) ou 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.16), sintase/liase (4.1.2.-), aminotransferasede cadeia ramificada (BCAT, EC 2.6.1.42), glutamato desidrogenase (EC1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20), leucina(cadeia ramificada) desidrogenase (EC 1.4.1.9) e/ou triptofano aminotransfe-rase.
Monatina pode ser produzida por um método que inclui o contatode triptofano e/ou ácido indol-3-lático com um primeiro polipeptídeo, em queo primeiro polipeptídeo converte triptofano e/ou ácido indol-3-lático em indol-3-piruvato (seja na forma D ou L do triptofano ou ácido indol-3-lático podeser usado como o substrato que é convertido em indol-3-piruvato; uma pes-soa versada na técnica irá perceber que os polipeptídeos escolhidos paraesse etapa exibem idealmente a especificidade apropriada), o contato doindol-3-piruvato resultante com um segundo polipeptídeo, em que o segundopolipeptídeo converte o indol-3-piruvato em ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico (MP), e o contato de MP com um terceiro polipeptí-deo, em que o terceiro polipeptídeo converte MP em monatina. Polipeptí-deos exemplares que podem ser usados para essas conversões estão mos©trados nas figuras 2 e 3.
Outro aspecto da invenção proporciona composições tais comode MP, células que contêm pelo menos dois polipeptídeos, ou algumas ve-zes pelo menos três ou pelo menos quatro polipeptídeos, que são codifica-dos em pelo menos uma seqüência de ácidos nucléicos exógena.
Esses e outros aspectos da descrição são aparentes a partir daseguinte descrição detalhada e dos exemplos ilustrativos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
A Figura 1 mostra as vias biossintéticas usadas para produzirmonatina e/ou indol-3-piruvato. Uma via produz indol-3-piruvato através dotriptofano, enquanto que a outra produz indol-3-piruvato através do ácidoindol-3-lático. Monatina é subseqüentemente produzida através de um in-termediário do ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico (MP).
Compostos mostrados nas caixas são substratos e produtosproduzidos nas vias biossintéticas.
Composições adjacentes às setas são co-fatores, ou reagentesque podem ser usados durante a conversão de um substrato em um produ-to. O co-fator ou reagente usado irá depender do polipeptídeo usado para aetapa particular da via biossintética. O cofator PLP (piridoxal-5'-fosfato) podecatalisar reações independentemente de um polipeptídeo e, dessa forma, omero fornecimento de PLP pode permitir a progressão de substrato paraproduto.
A figura 2 é um diagrama mais detalhado da via biossintéticaque utiliza o intermediário MP. Os substratos para cada etapa nas vias estãomostrados nas caixas. Os polipeptídeos que permitem a conversão entresubstratos estão listados adjacentes às setas entre os substratos. Cada poli-peptídeo é descrito por seu nome comum e um número de classe enzimática(EC).
A figura 3 mostra um diagrama mais detalhado da via biossinté-tica da conversão de ácido indol-3-lático em indol-3-piruvato. Os substratosestão mostrados nas caixas, e os polipeptídeos que permitem a conversãoentre os substratos estão listados adjacentes à seta entre os substratos. Ca-da polipeptídeo é descrito por seu nome comum e um número de classe enzimática (EC).
Figura 4 mostra uma reação possível para fazer MP através demeios químicos.
As Figuras 5A e 5B são cromatogramas mostrando a identifica-ção CL/EM de monatina produzida enzimaticamente.
As Figura 6 é um espectro de massa de eletropulverização(electrospray) de monatina enzimaticamente sintetizada.
As Figuras 7 A e 7B mostram cromatogramas da análise do pro-duto de íons íon derivado CL/EM/EM de monatina produzida em um misturaenzimática.
A Figura 8 é um cromatograma mostrando a medição de massade alta resolução da monatina produzida enzimaticamente.
As Figuras 9A-9C são cromatogramas mostrando a separaçãoquiral de (A) R-triptofano, (B) S-triptofano e (C) monatina produzida enzima-ticamente.
A Figura 10 é um gráfico de barras mostrando a quantidade rela-tiva de monatina produzida em células bacterianas após a indução por IPTG.O (-) indica uma falta de adição de substrato (nem triptofano e nem piruvatofoi adicionado).
As Figuras 11-12 são diagramas esquemáticos mostrando viasusadas para aumentar o rendimento de monatina produzida a partir de tripto-fano ou indol-3-piruvato.
A Figura 13 é um diagrama esquemático mostrando uma via aqual pode ser usada para aumentar o rendimento de monatina produzida apartir de triptofano ou indol-3-piruvato.Listagens de seqüências
As seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos listadas nalistagem de seqüência associada estão mostradas usando abreviações deletras padronizadas para bases de nucleotídeo, e código de três letras paraaminoácidos. Somente um filamento de cada seqüência de ácido nucléicoestá mostrado, mas o filamento complementar é entendido como estandoincluído por qualquer referência ao filamento apresentado.
SEQ ID NOS: 1 e 2 mostram as seqüências de ácido nucléico ede aminoácidos de uma aminotransferase de Sinorhizobium meliloti, respec-tivamente (gene tatA, chamado de tirosina aminotransferase ou aminotrans-ferase aromática na literatura).
SEQ ID NOS: 3 e 4 mostram as seqüências de ácido nucléico ede aminoácidos de uma tirosina aminotransferase de Rhodobacter sphaeroi-des (2.4.1), respectivamente (por homologia com tatA (SEQ ID NOS: 1 e 2),prevista como sendo uma "aspartato aminotransferase" por programa decomputador genômico).
SEQ ID NOS: 5 e 6 mostram as seqüências de ácido nucléico ede aminoácidos de uma aminotransferase de Rhodobacter sphaeroides(35053), respectivamente (nova, clone baseado na seqüência 2.4.1 SEQ IDNOS 3 e 4).
SEQ ID NOS: 7 e 8 mostram as seqüências de ácido nucléico ede aminoácidos de uma aminotransferase de substrato amplo (bsat) de Lei-shmania major, respectivamente.
SEQ ID NOS: 9 e 10 mostram as seqüências de ácido nucléico ede aminoácidos de uma aminotransferase aromática (araT) de Bacillus subti-lis, respectivamente.
SEQ ID NOS: 11 e 12 mostram as novas seqüências de ácidonucléico e de aminoácidos de uma aminotransferase aromática (araT) deLactobacillus amylovorus, respectivamente (por homologia identificada comouma aminotransferase aromática).
SEQ ID NOS: 13 e 14 mostram as seqüências de ácido nucléicoe de aminoácidos de uma aminotransferase de substrato múltiplo (msa) deR. sphaeroides (35053), respectivamente (identificada como uma amino-transferase de substrato múltiplo por homologia com o N9 de Acesso AAA-E01000093.1, pb 14743-16155 e N9 de Acesso. ZP00005082.1).
SEQ ID NOS: 15-16 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência de D-alanina aminotransferase (dat) de B. subtilis.
SEQ ID NOS: 17-18 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência tatA de S. meliloti.
SEQ ID NOS: 19-20 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência araT da aminotransferase de B. subtilis.
SEQ ID NOS: 21 e 22 mostram iniciadores usados para clonaras seqüências de aminotransferase de substrato múltiplo de Rhodobactersphaeroides (2.4.1 e 35053).
SEQ ID NOS: 23 - 24 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência bsat de Leishmania major.
SEQ ID NOS: 25 - 26 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência araT de Lactobacillus amylovorus.
SEQ ID NOS: 27 - 28 mostram iniciadores usados para clonaras seqüências tatA de R. sphaeroides (tanto a 2.4.1 quanto a 35053).
SEQ ID NOS: 29 - 30 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência aspC de E. coli (seqüência de gene do N9 de Acesso GenbankAE000195.1, seqüência de proteína N9 de Acesso Genbank AAC74014.1).
SEQ ID NOS: 31 e 32 mostram as seqüências de ácido nucléicoe de aminoácidos da aminotransferase aromática (tyrB) de E. coli, respecti-vamente. :
SEQ ID NOS: 33 - 34 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência tyrB de E. coli.
SEQ ID NOS: 35 - 40 mostram iniciadores usados para clonarpolipeptídeos com atividade 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase (KHG) (EC4.1.3.16).
SEQ ID NOS: 41 e 42 mostram as seqüências de ácido nucléicoda triptofanase (tna) de E. coli e de tirosina fenol-liase (tpl) de Citrobacterfreundii, codificando as proteínas P00913 (Gl: 401195) e P31013 (Gl:401201), respectivamente.
SEQ ID NOS: 43 - 46 mostram iniciadores usados para clonarpolipeptídeos da triptofanase e polipeptídeos da (3-tirosinase (tirosina fenol-liase).
SEQ ID NOS: 47 - 54 mostram iniciadores usados para modifi-car polipeptídeos da triptofanase e polipeptídeos da p-tirosinase.
SEQ ID NOS: 55 - 64 mostram iniciadores usados para clonarpolipeptídeos com atividade 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (EC4.1.3.17).
SEQ ID NOS: 65 e 66 mostram as seqüências de ácido nucléicoe de aminoácidos da 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (proA) de C.testosteroni, respectivamente.
SEQ ID NOS: 67 - 68 mostram iniciadores usados para clonar4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (proA) de C. testosteroni num ope-ron com aspC de E. coli em pET30 Xa/LIC.
SEQ ID NOS: 69 - 72 mostram iniciadores usados para clonaraspC de E. colie proA de C. testosteroni em pESC-his.
SEQ ID NOS: 73 - 74 mostram seqüências adicionadas à ex-tremidade 5' dos iniciadores usados para clonar os genes aqui descritos.
SEQ ID NOS: 75 e 76 mostram as seqüências de ácido nucléicoe de aminoácidos do gene HEX e do produto de gene (número de acessoNCBI 1AHF_A Gl:1127190) (seqüência de aminoácido aminotransferaseHEXAspC), respectivamente.
SEQ ID NOS: 77 - 78 mostram iniciadores usados para clonar aaspartato aminotransferase de E. coli (aspC) ou a seqüência de gene da a-minotransferase aspC modificada (HEX).
SEQ ID NOS: 79 - 80 mostram iniciadores usados para clonar atirosina aminotransferase de E. coli (tyrb).
SEQ ID NOS: 81 - 82 mostram iniciadores usados para clonar ogene khg de Z. mobilis (ATCC 29191).
SEQ ID NOS: 83 e 84 mostram as seqüências de ácido nucléicoe de aminoácidos do gene khg de Z mobilis (No. de Acesso: AE008692.1Gl:56542470) e o produto do gene (No. de Acesso: AAV89621.1Gl:56543467), respectivamente.
SEQ ID NOS: 85 - 86 mostram iniciadores usados para clonar aseqüência de gene yfdZ de E. coli depositada no NCBI como G 1:48994873bases 2496317-2495079, codificando a proteína Gl: 1788722 (proteína IDAAC75438.1).
SEQ ID NOS: 87 e 88 mostram as seqüências de ácido nucléicoe de aminoácidos de uma aldolase do biovar viciae rhiz23g02-p1k_1009_341 de Rhizobium leguminosarum (Sanger Institute), respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE VÁRIAS MODALIDADES
Abreviação e termos
As seguintes explicações dos termos e métodos são fornecidaspara melhor descrever a presente descrição e para guiar as pessoas nor-malmente versadas na técnica na prática da presente descrição. Conformeaqui utilizado, "incluindo" significa "compreendendo". Além disso, as formassingulares "um" ou "uma" ou "o" incluem referências no plural, a não ser queo contexto claramente diga o contrário. Por exemplo, referência a "compre-endendo uma proteína" inclui uma ou uma pluralidade de tais proteínas, ereferência a "compreendendo a célula" inclui referência a uma ou mais célu-las e seus equivalentes conhecidos por aqueles indivíduos versados na téc-nica, e assim por diante. O termo "cerca de" engloba a faixa de erro experi-mental que ocorre em qualquer medição. A não ser que seja estabelecido deoutra forma, todos os números de medições são presumidos por ter a pala-vra "cerca de" na frente deles, mesmo se a palavra "cerca de" não for ex-pressamente usada.
A não ser que tenha sido explicado de outra forma, todos ostermos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conformecomumente entendido por uma pessoa normalmente versada na técnica, àqual essa descrição pertence. Embora métodos e materiais similares ou e-quivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testa-gem da presente descrição, métodos e materiais adequados são descritosabaixo. Os materiais, métodos e exemplos são somente ilustrativos e nãopretendem ser limitantes. Outras características e vantagens da descriçãosão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.
CDNA (DNA complementar): um pedaço de DNA sem segmen-tos internos, não-codificantes (íntrons) e seqüências regulatórias as quaisdeterminam a transcrição. CDNA pode ser sintetizado no laboratório portranscrição reversa a partir do RNA mensageiro extraído das células.
Substituição conservativa: uma substituição de um aminoáci-do por outro aminoácido num polipeptídeo, cuja substituição tem pouco ounenhum impacto na atividade do polipeptídeo. A substituição é consideradaconservativa independentemente se a troca de aminoácidos aparenta forestrutural ou funcionalmente similar. Por exemplo, idealmente, um polipeptí-deo de triptofano aminotransferase incluindo uma ou mais substituições con-servativas retém a atividade da triptofano aminotransferase. Um polipeptídeopode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservativaspela manipulação da seqüência de nucleotídeos que codifica aquele polipep-tídeo usando, por exemplo, procedimentos padronizados tais como mutagê-nese direcionada a sítio ou PCR ou outros métodos conhecidos por aquelesindivíduos da técnica.
Exemplos não-limitativos de aminoácidos os quais podem sersubstituídos por um aminoácido original em um proteína e os quais podemser considerados como substituições conservativas caso haja pouco ou ne-nhum impacto na atividade do polipeptídeo incluem: Ala substituído com serou thr; arg substituído com gln, his ou lys/ asn substituído com glu, gln, lys,his, asp; asp substituído com asn, glu ou gln; cys substituído com ser ou ala;gln substituído com asn, glu, lys, his, asp ou arg; glu substituído com asn,gln, lys ou asp; gly substituído com pro; his substituído com asn, lys, gln, arg,tyr; ile substituído com leu, met, vai, phe; leu substituído com ile, met, vai,phe; lys substituído com asn, glu, gln, his, arg; met substituído com ile, leu,vai, phe; phe substituído com trp, tyr, met, ile ou leu; ser substituído com thr,ala; thr substituído com ser ou ala; trp substituído com phe, tyr; tyr substituí-do com his, phe ou trp; e vai substituído com met, ile, leu.Informações adicionais acerca de substituições conservativaspodem ser encontradas em, dentre outros locais, Ben-Bassat et ai, {J. Bac-teriol. 169:751-7, 1987), 0'Regan et ai, {Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Tothet ai, (Protein Sei. 3:240-7, 1994), Hochuli et ai, (Bk/Technology 6:1321-5,1988), WO 00/67796 (Curd et ai) e em textos padrão de genética e biologiamolecular.
Derivado: para propósitos do relatório descritivo e das reivindi-cações, uma substância é "derivada" de um organismo ou fonte se qualquerum ou mais das seguintes for verdadeiro: 1) a substância está presente noorganismo/fonte; 2) a substância é removida do hospedeiro natural; ou 3) asubstância é removida do hospedeiro natural e é desenvolvida, por exemplo,por mutagênese.
Produzindo enzimaticamente: A frase "produzindo enzimati-camente" ou frases similares, tais como "produzido enzimaticamente" ou"enzimaticamente sintetizado" se refere à produção de produto (tal comomonatina) usando pelo menos um polipeptídeo, seja in vitro (por exemplo, notubo de teste ou reator usando um ou mais polipeptídeos) ou in vivo (por e-xemplo, em um célula inteira ou reação de fermentação). Enquanto "produ-zindo enzimaticamente" um produto não exclui o uso de reagentes químicosou reações, ele inclui o uso de pelo menos um polipeptídeo que facilita pelomenos uma reação na produção daquele produto.
Exógeno: O termo "exógeno", conforme aqui utilizado com refe-rência a ácido nucléico e uma célula particular se refere a qualquer ácidonucléico que não se origine daquela célula particular conforme encontradana natureza. Conseqüentemente, ácido nucléico de ocorrência não-natural éconsiderado como sendo exógeno para uma célula uma vez introduzido nacélula. Ácido nucléico que é de ocorrência natural também pode ser exógenoa uma célula particular. Por exemplo, um cromossomo inteiro isolado de umacélula ou pessoa X é um ácido nucléico exógeno em relação a uma célula depessoa Y uma vez que aquele cromossomo é introduzido na célula Y.
Funcionalmente equivalente: Com uma função equivalente. Nocontexto de uma enzima, moléculas funcionalmente equivalentes incluemdiferentes moléculas que retêm a função da enzima. Por exemplo, equiva-lentes funcionais podem ser fornecidos por alterações de seqüências em umseqüência enzimática, em que o peptídeo com uma ou mais alterações deseqüência retém a função do peptídeo inalterado, de forma que ele retémsua atividade enzimática. Num exemplo particular, um equivalente funcionalde triptofano aminotransferase retém a capacidade de converter triptofanoem indol-3-piruvato.
Exemplos de alterações de seqüência incluem, mas não estãolimitadas, a anulações, mutações, alterações de estrutura, inserções e subs-tituições conservativas. Num exemplo, um dado polipeptídeo se liga a umanticorpo, e um equivalente funcional é um polipeptídeo que se liga aomesmo anticorpo. Conseqüentemente, um equivalente funcional inclui peptí-deos que têm a mesma especificidade de ligação que um polipeptídeo, eque pode ser usado como um reagente no lugar do polipeptídeo. Num e-xemplo, um equivalente funcional inclui um polipeptídeo em que a seqüênciade ligação é descontínua, em que o anticorpo se liga a um epitopo linear.Conseqüentemente, se a seqüência do peptídeo for MPELANDLGL (amino-ácidos 1-10 da SEQ ID NO: 12) um equivalente funcional inclui epitoposdescontínuos, que podem aparecer como se segue (** = qualquer quantida-de de aminoácidos intervenientes): NH2 -**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH. Nesse exemplo, o polipeptídeo é funcionalmente equivalente aosaminoácidos 1-10 da SEQ ID NO: 12 se a estrutura tridimensional do poli-peptídeo for tal que ela possa se ligar a um anticorpo monoclonal que seligue aos aminoácidos 1-10 da SEQ ID NO: 12).
Hibridização: O termo "hibridização", conforme aqui utilizado,se refere a um método e testagem para a complementaridade na seqüênciade nucleotídeos de duas moléculas de ácido nucléico, baseando-se na ca-pacidade do RNA e/ou DNA de filamento único complementar de formar umamolécula "duplex". Técnicas de hibridização de ácido nucléico podem serusadas para obter um ácido nucléico isolado no escopo da descrição. Re-sumidamente, qualquer ácido nucléico com alguma homologia a uma se-qüência estabelecida na SEQ ID NO: 11 pode ser usado como uma sondapara identificar um ácido nucleico similar por hibridização sob condições deestringência moderada a elevada. Uma vez identificado, o ácido nucleicopode ser, a seguir, purificado, seqüenciado e analisado para determinar seele está dentro do escopo da presente descrição.
Hibridização pode ser feita por análise Southern ou Northern pa-ra identificar uma seqüência de DNA ou de RNA, respectivamente, que hi-bridiza em um sonda. A sonda pode ser marcada com uma biotina, digoxi-genina, um polipeptídeo ou um radioisótopo, tal como 32P. O DNA ou RNA aser analisado pode ser separado por eletroforese num gel de ágarose oupoliacrilamida, transferido para nitrocelulose, náilon ou outra membrana a-dequada, e hibridizado com a sonda usando técnicas padronizadas bem-conhecidas na técnica, tais como aquelas descritas nas seções 7.39-7.52 deSambrook et al., (1989) Molecular Cloning, segunda edição, Cold SpringHarbor Laboratory, Plainview, NY. Tipicamente, uma sonda é pelo menoscerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, uma sonda corres-pondendo a uma seqüência de 20 nucleotídeos contíguos estabelecida naSEQ ID NO: 11 pode ser usada para identificar um ácido nucleico idêntico ousimilar. Além disso, sondas mais longas ou mais curtas do que 20 nucleotí-deos podem ser usadas.
A descrição também fornece seqüências de ácido nucleico iso-ladas que são pelo menos cerca de 12 bases de comprimento (por exemplo,pelo menos cerca de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100,250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, ou 5000 bases de comprimen-to) e hibridizam, sob condições de hibridização, ao filamento sentido ou anti-sentido do ácido nucleico com a seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 11.As condições de hibridização podem ser condições de hibridização modera-da ou altamente estringentes.
Para o propósito dessa descrição, condições de hibridizaçãomoderadamente estringentes significa que a hibridização é efetuada a cercade 42°C em um solução de hibridização contendo KP04 25 mM (pH 7,4), 5xSSC, solução de Denhart 5X, DNA de esperma de salmão submetido ao ul-tra-som, 50 |ig/mL desnaturado, 50% de formamida, 10% de sulfato de dex-trano e 1 - 15 ng/mL de sonda (cerca de 5 x 107 cpm/uxj), enquanto que aslavagens são efetuadas em cerca de 50°C com uma solução de lavagemcontendo 2x SSC e 0,1% de dodecilsulfato de sódio.
Condições de hibridização altamente estringentes significam quea hibridização é efetuada a cerca de 42°C em um solução de hibridizaçãocontendo KP04 25 mM (pH 7,4), 5x SSC, 5x solução de Denhart, DNA deesperma de salmão submetido ao ultra-som, 50 ng/mL desnaturado, 50% deformamida, 10% de sulfato de dextrano e 1 - 15 ng/mL de sonda (cerca de 5x 107 cpm/jig), enquanto que as lavagens são efetuadas a cerca de 65°Ccom uma solução de lavagem contendo 0,2 x SSC e 0,1% de dodecilsulfatode sódio.
Isolado: O termo "isolado", conforme aqui utilizado, se refere aqualquer substância removida de seu hospedeiro natural; a substância nãoprecisa ser purificada. Por exemplo, "ácido nucléico isolado" se refere a umácido nucléico de ocorrência natural que não está imediatamente contíguocom ambas as seqüências com as quais ele é imediatamente contíguo (umna extremidade 5' e um na extremidade 3') no genoma de ocorrência naturaldo organismo a partir do qual ele é derivado. Por exemplo, um ácido nucléi-co isolado pode ser, sem limitação, uma molécula de DNA recombinante dequalquer comprimento, com a condição de que uma das seqüências de áci-do nucléico normalmente encontradas flanqueando imediatamente aquelamolécula de DNA recombinante num genoma de ocorrência natural é remo-vida ou ausente. Dessa forma, um ácido nucléico isolado inclui, sem limita-ção, um DNA recombinante que existe como uma molécula separada (porexemplo, um fragmento de DNA genômico ou CDNA produzido por PCR outratamento com endonuclease de restrição) independente de outras seqüên-cias, assim como DNA recombinante que é incorporado no vetor, um plas-mídeo de replicação autônoma, um vírus (por exemplo, um retrovírus, ade-novírus ou herpes vírus), ou no DNA genômico de um procarioto ou eucario-to. Alem disso, um ácido nucléico isolado pode incluir uma molécula de DNArecombinante que é parte de um híbrido ou de uma seqüência de ácido nu-cléico de fusão.O termo "isolado", conforme aqui utilizado com referência ao á-cido nucleico, também inclui qualquer ácido nucleico de ocorrência não-natural, uma vez que seqüências de ácido nucleico de ocorrência não-natural não são encontradas na natureza e não têm seqüências imediata-mente contíguas num genoma de ocorrência natural. Por exemplo, ácidonucleico de ocorrência não-natural, tal como um ácido nucleico projetado, éconsiderado como sendo ácido nucleico isolado. Ácido nucleico projetadopode ser feito usando técnicas de clonagem molecular comum ou de síntesede ácido nucleico química. Ácido nucleico de ocorrência não-natural isoladopode ser independente de outras seqüências, ou incorporado num vetor, umplasmídeo de replicação autônoma, um vírus (por exemplo, um retrovírus,adenovírus ou herpes vírus), ou o DNA genômico de um procarioto ou euca-rioto. Alem disso, um ácido nucleico de ocorrência não-natural pode incluiruma molécula de ácido nucleico que é parte de um híbrido ou de uma se-qüência de ácido nucleico de fusão.
Um ácido nucleico existente entre centenas a milhões de outrasmoléculas de ácido nucleico em, por exemplo, CDNA ou bibliotecas genômi-cas, ou fatias de gel contendo um digesto de restrição de DNA genômiconão é para ser considerado como um ácido nucleico isolado.
Ácido nucleico: O termo "ácido nucleico", conforme aqui utili-zado, engloba tanto RNA quanto DNA incluindo, sem limitação, CDNA, DNAgenômico e DNA sintético (por exemplo, quimicamente sintetizado). O ácidonucleico pode ser de filamento duplo ou de filamento único. Onde é de fila-mento único, o ácido nucleico pode ser o filamento sentido ou o filamentoanti-sentido. Além disso, ácido nucleico pode ser circular ou linear.
Operavelmente ligado: Uma primeira seqüência de ácido nu-cleico é "operavelmente ligada" com uma segunda seqüência de ácido nu-cleico sempre que a primeira seqüência de ácido nucleico é colocada em umrelação funcional com a segunda seqüência de ácido nucleico. Por exemplo,um promotor é operavelmente ligado com uma seqüência codificante se opromotor afetar a transcrição da seqüência codificadora. Geralmente, se-qüências de DNA operavelmente ligadas são contíguas e, onde necessáriojuntar duas regiões codificadoras de polipeptídeo, no mesmo quadro de leitu-ra.
Modificações peptídicas: A presente descrição inclui enzimas,assim como suas modalidades sintéticas. Além disso, análogos (moléculasorgânicas não-peptídicas), derivados (moléculas peptídicas quimicamentefuncionalizadas obtidas a partir das seqüências peptídicas descritas) e vari-antes (homólogos) com a atividade enzimática desejada podem ser utiliza-dos nos métodos aqui descritos. Os peptídeos aqui descritos incluem umaseqüência de aminoácidos, que podem ser ou L- e/ou D-aminoácidos, deocorrência natural ou de outra forma.
Peptídeos podem ser modificados por uma variedade de técni-cas químicas para produzir derivados com essencialmente a mesma ativida-de que os peptídeos não-modificados, e opcionalmente com outras proprie-dades desejáveis. Por exemplo, grupos de ácido carboxílico da proteína,sejam carbóxi-terminais ou de cadeia lateral, podem ser fornecidos na formade um sal de um cátion farmaceuticamente aceitável ou esterificados paraformar um éster C1-C16, ou convertidos a uma amida de fórmula NR1R2 emque R1 e R2 são cada um independentemente H ou alquila C1-C16, oucombinados para formar um anel heterocíclico, tal como um anel de 5 ou 6membros. Grupos amino do peptídeo, sejam amino-terminais ou de cadeialateral, podem estar na forma de um sal de adição de ácido farmaceutica-mente aceitável, tal como de HCI, HBr, acético, benzóico, toluenossulfônico,maléico, tartárico e outros sais orgânicos, ou podem ser modificados paraalquila ou dialquilamino C1-C16 ou ainda convertidos para uma amida.
Grupos hidroxila das cadeias laterais peptídicas podem ser con-vertidos em alcóxi C1-C16 ou num éster C1-C16 usando técnicas bem-reconhecidas. Anéis fenila e fenólico das cadeias laterais peptídicas podemser substituídos com um ou mais átomos de halogênio, tais como F, Cl, Brou I, ou com alquila C1-C16, alcóxi C1-C16, ácidos carboxílicos e seus éste-
res, ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Grupos metileno das cadeias late-rais peptídicas podem ser estendidos para alquilenos C2-C4 homólogos.Tióis podem ser protegidos com qualquer um de uma variedade de gruposprotetores bem-reconhecidos, tais como grupos acetamida. Os indivíduosversados na técnica também irão reconhecer métodos para introduzir estru-turas cíclicas nos peptídeos dessa descrição para selecionar e fornecer res-trições conformacionais à estrutura que resulta em um estabilidade aumen-tada. Por exemplo, uma cisteína C- ou N-terminal pode ser adicionada aopeptídeo, de forma que quando oxidado o peptídeo contém uma ligação dis-sulfeto, gerando um peptídeo cíclico. Outros métodos de ciclização de peptí-deos incluem a formação de tioésteres e de ésteres e amidas carboxila- eamino-terminais.
Modalidades peptidomiméticas e organomiméticas também es-tão dentro do escopo da presente descrição, por meio da qual o arranjo tri-dimensional dos constituintes químicos de tais peptido- e organomiméticosmimetizam o arranjo tridimensional da estrutura principal peptídica e o com-ponente das cadeias laterais de aminoácidos, resultando em tais peptido- eorganomiméticos das proteínas dessa descrição com atividade enzimáticadetectável. Para aplicações de modelagem computadorizada, um farmacófo-ro é uma definição idealizada, tridimensional dos requerimentos estruturaispara atividade biológica. Peptido- e organomiméticos podem ser projetadospara se adaptar a cada farmacóforo com programa de computador de mode-lagem computadorizada atual (usando o projeto de fármacos auxiliado porcomputador ou CADD). Ver Walters, "Computer-Assisted Modeling ofDrugs", em Klegerman & Groves (eds.), Pharmaceutical Biotechnology,1993, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-74 e Cáp. 102 em Mun-son (ed.), Principies of Pharmacology, 1995, Chapman & Hall, para descri-ções de técnicas usadas no CADD. Também incluídos dentro do escopo dadescrição estão os miméticos preparados usando tais técnicas. Num exem-plo, um mimético mimetiza a atividade enzimática gerada por uma enzima ouuma variante, fragmento ou fusão sua.
ProA aldolase: Embora "ProA" e/ou "ProA aldolase" historica-mente sejam usadas para identificar somente a 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase derivada de Comamonas testosteroni, aqui o termo"ProA" e/ou "ProA aldolase" são usados para significar qualquer polipeptídeocom atividade de 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase, a não ser queseja estabelecido de outra forma. Exemplos adequados de ProA ou de ProAaldolase incluem ProA de C. testosteroni (SEQ ID NO: 66) e ProA de Sino-rhizobium meliloti (No. de Acesso NCBI: CAC46344), ou enzimas que apre-sentem homologia à ProA de C. testosteroni (SEQ ID NO: 66) e/ou ProA deSinorhizobium meliloti (No. de Acesso NCBI: CAC46344). Por exemplo, en-zimas adequadas podem ter pelo menos cerca de 40%, 50%, 60%, 70%,80%, 90%, 95%, e/ou 99% de identidade de seqüência com ProA de C. tes-tosteroni (SEQ ID NO: 66) e/ou ProA de Sinorhizobium meliloti (No. de A-cesso NCBI: CAC46344).
Sondas e iniciadores: Sondas e iniciadores de ácido nucléicopodem ser preparados prontamente baseando-se nas seqüências de amino-ácidos e nas seqüências de ácido nucléico aqui fornecidas. Uma "sonda"inclui um ácido nucléico isolado contendo um marcador detectável ou umamolécula repórter. Marcadores exemplares incluem, mas não estão limita-das, a isótopos radioativos, ligantes, agentes quimiluminescentes e polipep-tídeos. Métodos para marcação e orientação na escolha dos marcadoresapropriados para vários propósitos estão discutidos em, por exemplo, Sam-brook era/, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2- ed., vol. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, e Au-subel et ai. (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing eWiley-lnterscience, New York (com atualizações periódicas), 1987.
"Iniciadores" são tipicamente moléculas de ácido nucléico comdez ou mais nucleotídeos (por exemplo, moléculas de ácido nucléico comentre cerca de 10 nucleotídeos e cerca de 100 nucleotídeos). Um iniciadorpode ser anelado a um filamento de ácido nucléico alvo complementar porhibridizaçao de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e ofilamento de ácido nucléico alvo, e a seguir estendido ao longo do filamentode ácido nucléico alvo, por exemplo, por um polipeptídeo de DNA polimera-se. Pares de iniciadores podem ser usados para a amplificação de uma se-qüência de ácido nucléico, por exemplo, pela reação em cadeia da polimera-se (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucléico conhecidosna técnica.
Métodos para preparar e usar sondas e iniciadores estão descri-tos, por exemplo, em referências tais como Sambrook et ai (ed.), MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2- ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Labora-tory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel et ai (ed.), Current Pro-tocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley-lnterscience, NewYork (com atualizações periódicas), 1987; e Innis et ai (eds.), PCR Proto-cols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego,1990. Pares de iniciador de PCR podem ser derivados de uma seqüênciaconhecida, por exemplo, pelo uso de programas de computador tencionadospara aquele propósito tais como Primer (Versão 0.5, © 1991, Whitehead Ins-titute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Uma pessoa versada natécnica irá perceber que a especificidade de uma sonda ou iniciador particu-lar aumenta com o comprimento, mas que uma sonda ou iniciador pode va-riar em tamanho a partir de uma seqüência de comprimento completo atéseqüências tão curtas como cinco nucleotídeos consecutivos. Dessa forma,por exemplo, um iniciador de 20 nucleotídeos consecutivos pode anelar comum alvo com uma especificidade maior do que um iniciador correspondentede somente 15 nucleotídeos. Dessa forma, para obter uma maior especifici-dade, sondas e iniciadores podem ser selecionados que compreendam, porexemplo, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300,350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050,1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650,1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300,2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900,3000, 3050,3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550,3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200,4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800,4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450,ou mais nucleotídeos consecutivos.
Promotor: um arranjo de seqüências de controle de ácido nu-cléico as quais direcionam a transcrição de um ácido nucléico. Um promotorinclui seqüências de ácido nucléico necessárias próximas do sítio de inicia-ção de transcrição, tais como, no caso de um promotor de uma polimerasetipo II, um elemento TATA. Um promotor pode incluir elementos intensifica-dores ou repressores distais os quais podem estar localizados tão longequanto vários milhares de pares de base a partir do sítio de início de trans-crição.
Purificado: o termo "purificado", conforme aqui utilizado, nãorequer pureza absoluta, mas, ao contrário, é tencionado como um termo re-lativo. Dessa forma, por exemplo, uma preparação de polipeptídeo ou ácidonucléico purificada pode ser uma na qual o referido polipeptídeo ou ácidonucléico está em um concentração mais elevada do que o polipeptídeo ouácido nucléico poderia estar no seu ambiente natural num organismo ou emum concentração mais elevada do que no ambiente a partir do qual ele foiremovido.
Recombinante: Um ácido nucléico "recombinante" é um com (1)uma seqüência que não é de ocorrência natural no organismo no qual ele éexpresso ou (2) uma seqüência feita por uma combinação artificial de duasseqüências diferentemente separadas, mais curtas. Essa combinação artifi-cial é geralmente conseguida por síntese química ou, mais comumente, pelamanipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exem-plo, por técnicas de engenharia genética. "Recombinante" também é usadopara descrever moléculas de ácido nucléico que foram artificialmente mani-puladas, mas que contêm as mesmas seqüências regulatórias e regiões co-dificadoras que são encontradas no organismo a partir do qual o ácido nu-cléico foi isolado.
Identidade de seqüência: a similaridade entre seqüências deaminoácidos é expressa em termos da similaridade entre as seqüências, deoutra forma referida como identidade de seqüência. A identidade de seqüên-cia é freqüentemente medida em termos de identidade de porcentagem (ousimilaridade ou homologia); quanto mais elevada a porcentagem, mais simi-lares são as duas seqüências. Homólogos ou variantes de um peptídeo, talcomo SEQ ID NO: 12, possuem um grau relativamente alto de identidade deseqüência quando alinhados usando métodos padronizados.
Métodos de alinhamento de seqüências para comparação sãobem-conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamentoestão descritos em: Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Nee-dleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-53, 1970; Pearson e Lipman, Proc.A/aí/. Acad. Sei. U.S.A. 85: 2444-8, 1988; Higgins e Sharp, Gene 73: 237-44,1988; Higgins e Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet et al., Nucleic AcidsResearch 16:10881-90, 1988; e Altschul et al., Nature Genet. 6:119-29,1994.
A Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básica NCBI(BLAST®) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) é disponível a partirde várias fontes, incluindo o Centro Nacional para Informação de Biotecno-logia (National Center for Biotechnology Information) (NCBI,, Betesda,MD) e na internet, para uso juntamente com os programas de análise de se-qüência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx.
Variantes de um peptídeo são tipicamente caracterizadas porpossuir pelo menos 50% de identidade de seqüência contada no comprimen-to total do alinhamento com a seqüência de aminoácidos usando o NCBIBlast 2.0, blastp com intervalo para predefinidos predefinidos. Para compa-rações de seqüências de aminoácidos de mais do que 30 aminoácidos, afunção de seqüências Blast 2 é empregada usando a matriz BLOSUM62predefinida estabelecida para predefinidos predefinidos, (custo de existênciade intervalo de 11, e um custo de intervalo por resíduo de 1). Ao alinhar pep-tídeos curtos (menos do que cerca de 30 aminoácidos), o alinhamento é efe-tuado usando a função das seqüências Blast 2, empregando a matrizPAM30 estabelecida para predefinidos predefinidos (penalidades de interva-lo aberto 9, de intervalo de extensão 1). Proteínas com similaridade aindamaior em relação às seqüências de referência mostrarão identidades deporcentagem crescentes quando avaliadas por esse método, tais como pelomenos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mesmopelo menos 99% de identidade de seqüência. Quando menos do que a se-qüência inteira está sendo comparada para a identidade de seqüência, ho-mólogos e variantes irão tipicamente possuir pelo menos 80% de identidadede seqüência sobre janelas curtas de 10-20 aminoácidos, e podem possuiridentidades de seqüência de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos95% ou 98% dependendo da sua similaridade em relação à seqüência dereferência. Métodos para determinar a identidade de seqüência em relação atais janelas curtas estão descritos no website que é mantido pelo Centro Na-cional para Informação de Biotecnologia em Betesda, Maryland. Uma pes-soa versada na técnica irá perceber que essas faixas de identidade de se-qüências são fornecidas somente para orientação; é completamente possí-vel que homólogos altamente significativos possam ser obtidos que caiamfora das faixas fornecidas.
Métodos similares podem ser usados para determinar a identi-dade de seqüência porcentual de uma seqüência de ácido nucléico. Numexemplo particular, uma seqüência homóloga está alinhada com uma se-qüência natural, e a quantidade de parelhamentos é determinada pela con-tagem da quantidade de posições onde um nucleotídeo idêntico ou resíduode aminoácido é apresentado em ambas as seqüências. A identidade deseqüência porcentual é determinada pela divisão da quantidade de parelha-mentos seja pelo comprimento da seqüência estabelecida na seqüência i-dentificada (por exemplo, SEQ ID NO: 11) ou por um comprimento articulado(por exemplo, 100 nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos consecutivos apartir de uma seqüência estabelecida em um seqüência identificada), segui-do pela multiplicação do valor resultante por 100. Por exemplo, uma seqüên-cia de ácido nucléico que tenha 1166 parelhamentos quando alinhada com aseqüência estabelecida na SEQ ID NO: 11 é 75,0 por cento idêntica à se-qüência estabelecida na SEQ ID NO: 11 (isto é, 1166 -r 1554 * 100 = 75,0).
É notado que o valor de identidade de seqüência porcentual é arredondadoaté o décimo mais próximo. Por exemplo, 75,11, 75,12, 75,13 e 75,14 sãoarredondados para baixo até 75,1, enquanto que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18e 75,19 são arredondados para cima até 75,2. Também é notado que o valorde extensão irá sempre ser um número inteiro. Em outro exemplo, uma se-qüência alvo contendo uma região de 20 nucleotídeos que se alinha com 20nucleotídeos consecutivos a partir de uma seqüência identificada como sesegue contém uma região que compartilha 75 por cento de identidade deseqüência com aquela seqüência identificada (isto é, 15 -=- 20 * 100 = 75).
1 20
seqüência alvo aggtcgtgtactgtcagtca
I II III IIII llll Iseqüência identificada ::acgtggtgaactgccagtga
Agente de ligação específico: um agente que é capaz de se ligarespecificamente a qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos. Exemplosincluem, mas não estão limitados, a anticorpos policlonais, anticorpos mono-clonais (incluindo anticorpos monoclonais humanizados) e fragmentos deanticorpos monoclonais tais como fragmentos FAb, F(ab')2 e Fv, assim comoqualquer outro agente capaz de se ligar especificamente a um epitopo detais polipeptídeos.
Anticorpos dos polipeptídeos aqui fornecidos (ou fragmentos,variantes ou fusões suas) podem ser usados para purificar ou identificar taispolipeptídeos. As seqüências de aminoácidos e de ácido nucléicos aqui for-necidas permitem a produção de agentes de ligação baseados em anticorpoespecíficos que reconhecem os polipeptídeos aqui descritos.
Anticorpos monoclonal ou policlonal podem ser produzidos paraos polipeptídeos, porções dos polipeptídeos ou variantes suas. Otimamente,anticorpos promovidos contra um ou mais epitopos num polipeptídeo antíge-no irão detectar especificamente aquele polipeptídeo. Isto é, anticorpos pro-movidos contra um polipeptídeo particular poderão reconhecer e se ligar à-quele polipeptídeo particular, e poderiam não reconhecer substancialmenteou se ligar a outros polipeptídeos. A determinação de que um anticorpo seliga especificamente a um polipeptídeo particular é feita por qualquer uma deuma variedade de métodos de imunoensaio padronizados; por exemplo,Western blotting (ver, por exemplo, Sambrook et ai (ed.), Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2ê ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Para determinar que uma dada preparação de anticorpo (tal co-mo uma preparação produzida num camundongo contra um polipeptídeocom a seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 12) detectaespecificamente o polipeptídeo apropriado (por exemplo, um polipeptídeocom a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 12) por Wes-tern blotting, a proteína celular total pode ser extraída das células e separa-da por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS.
A proteína celular total separada pode, a seguir, ser transferidapara uma membrana (por exemplo, nitrocelulose) e a preparação de anticor-po incubada com a membrana. Depois de lavar a membrana para removeranticorpos não-especificamente ligados, a presença de anticorpos especifi-camente ligados pode ser detectada usando um anticorpo secundário apro-priado (por exemplo, um anticorpo anticamundongo) conjugado com um po-lipeptídeo tal como fosfatase alcalina, uma vez que a aplicação de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/azul nitro de tetrazólio resulta na produção de umcomposto corado densamente de azul pela fosfatase alcalina imunolocaliza-da.
Polipeptídeos substancialmente puros adequados para usocomo um imunógeno podem ser obtidos a partir de células transfectadas,células transformadas ou células do tipo selvagem. Concentrações depolipeptídeo na preparação final podem ser ajustadas, por exemplo, porconcentração num dispositivo de filtragem Amicon, até um nível de algunsmicrogramas por mililitro. Além disso, polipeptídeos variando em tamanho depolipeptídeos de comprimento total até polipeptídeos com tão poucos quantonove resíduos de aminoácidos podem ser utilizados como imunógenos. Taispolipeptídeos podem ser produzidos em cultura celular, podem serquimicamente sintetizados usando métodos padronizados ou podem serobtidos por clivagem de grandes polipeptídeos em polipeptídeos menoresque podem ser purificados. Polipeptídeos com tão poucos quanto noveresíduos de aminoácidos de comprimento podem ser imunogênicos quandoapresentados a um sistema imune no contexto de uma molécula docomplexo principal de histocompatibilidade (MHC) tal como uma molécula deMHC classe I ou MHC classe II. Concordantemente, polipeptídeos com pelomenos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800,900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350ou mais resíduos de aminoacidos consecutivos de qualquer seqüência deaminoacidos aqui descrita podem ser usados como imunógenos para produ-zir anticorpos.
Anticorpos monoclonais para qualquer um dos polipeptídeos a-qui descritos podem ser preparados a partir de hibridomas de murinos deacordo com o método clássico de Kohler & Milstein (Nature 256:495-7, 1975)ou um método derivado seu.
Anti-soros policlonais contendo anticorpos em relação aos epito-pos heterogêneos de qualquer polipeptídeo aqui descoberto podem ser pre-parados pela imunização de animais adequados com o polipeptídeo (oufragmento seu), o qual pode ser não-modificado ou modificado para aumen-tar a imunogenicidade. Um protocolo de imunização efetivo para coelhospode ser encontrado em Vaitukaitis et ai (J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-91,1971).
Fragmentos de anticorpo podem ser usados no lugar de anticor-pos inteiros e podem ser prontamente expressos em células hospedeirasprocarióticas. Métodos para fazer e usar porções imunologicamente eficazesde anticorpos monoclonais, também referidos como "fragmentos de anticor-po", são bem-conhecidos e incluem aqueles descritos em Better & Horowitz(Methods Enzymol. 178:476-96,198,9), Glockshuber et al. {Biochemistry29:1362-7,1990), Patente Americana N9 5.648.237 ("Expression of Functio-nal Antibody Fragments"), Patente Americana N- 4.946.778 ("Single Poly-peptide Chain Binding Molecules"), Patente Americana N9 5.455.030 ("Im-munotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules") e referên-cias citadas ali.
Aminotransferase estereoinversora: Uma "aminotransferaseestereoinversora" é um polipeptídeo capaz de produzir preferencial ou sele-tivamente um produto de aminoácido quiral (tal como monatina) enquantousa um substrato de quiralidade oposta como o doador amino. Por exemplo,uma aminotransferase estereoinversora pode ser uma D-fenilglicina amino-transferase (também chamada de D-hidroxifenilglicina aminotransferase) quepreferível ou seletivamente usa L-glutamato como um substrato para produ-zir R,R-monatina. Exemplos não-limitantes de aminotransferases estereoin-versoras incluem D-metionina aminotransferase (EC 2.6.1.41) e enzimascom atividade D-fenilglicina aminotransferase ou atividade D-4-hidroxifenilglicina aminotransferase.
Transformado: uma célula "transformada" é uma célula na qualuma molécula de ácido nucléico foi introduzida, por exemplo, por técnicas debiologia molecular. Transformação engloba todas as técnicas pelas quaisuma molécula de ácido nucléico pode ser introduzida em tal célula incluindo,sem limitação, transfecção com um vetor viral, conjugação, transformaçãocom um vetor de plasmídeo e introdução de um DNA nu por eletroporação,lipofecção e aceleração por canhão de partículas.
Variantes, fragmentos ou proteínas de fusão: as proteínasdescritas incluem variantes, fragmentos e fusões suas. Seqüências de DNA(por exemplo, SEQ ID NO: 11) as quais codificam uma proteína (por exem-plo, SEQ ID NO: 12), proteína de fusão, ou um fragmento ou variante deuma proteína, podem ser projetadas para permitir que a proteína seja ex-pressa em células eucarióticas, bactérias, insetos e/ou plantas. Para obter aexpressão, a seqüência de DNA pode ser alterada e operavelmente ligada aoutras seqüências regulatórias. O produto final, o qual contém as seqüênciasregulatórias e a proteína, é referido como um vetor. Esse vetor pode ser in-troduzido em células eucarióticas, de bactérias, insetos e/ou vegetais. Umavez entro da célula, o vetor permite que a proteína seja produzida.
Uma proteína de fusão incluindo uma proteína, tal como umatriptofano aminotransferase (ou variante, polimorfismo, mutante ou fragmen-to seu), por exemplo a SEQ ID NO: 12, ligada a outras seqüências de ami-noácidos que não inibem a atividade desejada da proteína, por exemplo acapacidade de converter triptofano a indol-3-piruvato. Num exemplo, as ou-tras seqüências de aminoácidos não são maiores do que cerca de 10, 12,15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos de comprimento.Uma pessoa normalmente versada na técnica perceberá queuma seqüência de DNA pode ser alterada de diversas formas sem afetar aatividade biológica da proteína codificada. Por exemplo, PCR pode ser usa-do para produzir variações na seqüência de DNA a qual codifica uma proteí-na. Tais variantes podem ser variantes otimizadas para preferência de códonem um célula hospedeira usada para expressar a proteína, ou outras altera-ções de seqüência que facilitam a expressão.
Vetor: uma molécula de ácido nucléico tal como introduzida emum célula, produzindo dessa forma uma célula transformada. Um vetor podeincluir seqüências de ácido nucléico que permitem que ela replique na célu-la, tal como uma origem de replicação. Um vetor também pode incluir um oumais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhe-cidos na técnica.
Resumo das vias biossintéticas
Conforme mostrado nas figuras 1-3 e 11-13, muitas vias biossin-téticas podem ser usadas para produzir monatina ou seus intermediários taiscomo indol-3-piruvato ou MP. Para a conversão de cada substrato (glicose,triptofano, ácido indol-3-lático, indol-3-piruvato e MP) a cada produto (tripto-fano, indol-3-piruvato, MP e monatina) vários polipeptídeos diferentes podemser usados. Além disso, essas reações podem ser executadas in vivo, in vi-tro ou através de uma combinação de reações in vivo e reações in vitro, taiscomo reações in vitro que incluem reações químicas não-enzimáticas. Con-seqüentemente, as figuras 1-3 e 11-13 são exemplares, e mostram múltiplasvias diferentes que podem ser usadas para obter produtos desejados.
Glicose a triptofano
Muitos organismos podem sintetizar triptofano a partir de glicose.O(s) constructo(s) contendo esse(s) gene(s) necessários para produzir mo-natina, MP e/ou indol-3-piruvato a partir de glicose e/ou triptofano pode serclonado em tais organismos. É aqui mostrado que triptofano pode ser con-vertido em monatina.
Em outros exemplos, um organismo é projetado usando polipep-tídeos conhecidos para produzir triptofano, ou superproduzir triptofano. Porexemplo, a Patente Americana Nõ 4.371.614 (aqui incorporada por referên-cia) descreve uma cepa de E. coli transformada com um plasmídeo conten-do um operon de triptofano do tipo selvagem.
Títulos máximos de triptofano descobertos na Patente America-na N9 4.371.614 são de cerca de 230 ppm. Similarmente, WO 8701130 (aquiincorporada por referência) descreve uma cepa de E. coli que foi genetica-mente modificada para produzir triptofano e discute a produção fermentativacrescente de L-triptofano. Os indivíduos versados na técnica irão reconhecerque os organismos capazes de produzir triptofano a partir de glicose sãotambém capazes de utilizar outras fontes de carbono e energia que podemser convertidas em glicose ou frutose-6-fosfato, com resultados similares.Fontes de carbono e energia exemplares incluem, mas não estão limitadas,a sacarose, frutose, amido, celulose ou glicerol.
Triptofano a indol-3-piruvato
Vários polipeptídeos podem ser usados para converter triptofanoa indol-3-piruvato. Polipeptídeos exemplares incluem membros das classesde enzimas (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3,2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 e 2.6.1.21. Essas classes incluem polipeptídeos no-meados triptofano aminotransferase (também nomeada L-fenilalanina-2-oxoglutarato aminotransferase, triptofano transaminase, 5-hidroxitriptofano-cetoglutárico transaminase, hidroxitriptofano aminotransferase, L-triptofanoaminotransferase, L-triptofano transaminase e L-triptofano:2-oxoglutaratoaminotransferase) os quais convertem L-triptofano e 2-oxoglutarato em indol-3-piruvato e L-glutamato; D-triptofano aminotransferase, o qual converte D-triptofano e um 2-oxoácido em indol-3-piruvato e um aminoácido; triptofanodesidrogenase (também nomeado NAD(P)-L-triptofano desidrogenase, L-triptofano desidrogenase, L-Trp-desidrogenase, TDH e L-triptofano:NAD(P)oxidorredutase (desaminante)) o qual converte L-triptofano e NAD(P) emindol-3-piruvato e NH3 e NAD(P)H; D-aminoácido desidrogenase, o qualconverte D-aminoácidos e FAD em indol-3-piruvato e NH3 e FADH2; triptofa-no-fenilpiruvato transaminase (também nomeada L-triptofano-oc-cetoisocaproato aminotransferase e L-triptofano:fenilpiruvato aminotransfe-rase) o qual converte L-triptofano e fenilpiruvato em indol-3-piruvato e L-fenilalanina; L-aminoácido oxidase (também nomeada ofio-aminoácido oxi-dase e L-aminoácido:oxigênio oxidorredutase (desaminante)) o qual conver-te um L-aminoácido e H20 e 02 num 2-oxoácido e NH3 e H202; D-aminoácido oxidase (também nomeado ophio-aminoácido oxidase e D-aminoácido:oxigênio oxidorredutase (desaminante)) o qual converte um D-aminoácido e H20 e 02 num 2-oxoácido e NH3 e H202; e triptofano oxidase,a qual converte L-triptofano e H20 e 02 em indol-3-piruvato e NH3 e H202.
Essas classes também contêm tirosina (aromática) aminotransferase, aspar-tato aminotransferase, D-aminoácido (ou D-alanina) aminotransferase e a-minotransferase ampla (múltiplos substratos) as quais têm múltiplas ativida-des de aminotransferase, algumas das quais podem converter triptofano e 2-oxoácido em indol-3-piruvato e num aminoácido.
Onze membros da classe aminotransferase que têm tal atividadeestão descritos abaixo no Exemplo 1, incluindo uma nova aminotransferasemostrada nas SEQ ID NOS: 11 e 12. Conseqüentemente, essa descriçãoproporciona seqüências de proteína e ácido nucléico isoladas com pelo me-nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de seqüências em relação àsSEQ ID NOS: 11 e 12. Também englobados por essa descrição estão frag-mentos e fusões das SEQ ID NOS: 11 e 12 que retêm a atividade amino-transferase ou codificam uma proteína com atividade de aminotransferase.Fragmentos exemplares incluem, mas não estão limitados, a pelo menos 10,12, 15, 20,25, 50, 100, 200, 500, ou 1000 nucleotídeos contíguos da SEQ IDNO: 11 ou pelo menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 ou 350 ami-noácidos contíguos da SEQ ID NO: 12. As seqüências descritas (e variantes,fragmentos e fusões suas) podem ser parte de um vetor. O vetor pode serusado para transformar células hospedeiras, produzindo dessa forma célulasrecombinantes as quais podem produzir indol-3-piruvato a partir de triptofa-no, e em alguns exemplos podem ainda produzir MP e/ou monatina.
L-aminoácido oxidases (1.4.3.2) são conhecidas, e seqüênciaspodem ser isoladas a partir de várias diferentes fontes, tais como Vipera le-betine (sp P81375), Ophiophagus hannah (sp P81383), Agkistrodon rhodos-toma (spP81382), Crotalus atrox (sp P56742), Burkholderia cepacia, Arabi-dopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Musmusculus, Pseudomonas syringae, e Rhodococcus str. Além disso, triptofanooxidases são descritas na literatura e podem ser isoladas, por exemplo, apartir do repolho chinês SF-1 de Coprinus sp com club root disease, Arabi-dopsis thaliana e fígado de mamífero. Um membro da classe L-aminoácidooxidase que pode converter triptofano em indol-3-piruvato é discutido abaixono Exemplo 5, assim como fontes alternativas para clonagem molecular.
Muitos genes da D-aminoácido oxidase estão disponíveis em bancos de da-dos para clonagem molecular.
Triptofano desidrogenases são conhecidas, e podem ser isola-das, por exemplo, a partir de espinafre, Pisum sativum, Prosopis juliflora,ervilha, "mesquites" (variedade de arbustos da família das leguminosas),trigo, milho, tomate, tabaco, Chromobacterium violaceum e Lactobacilli. Mui-tas seqüências de genes da D-aminoácido desidrogenase são conhecidas.
U.S. 5.728.555 descreveu fenilalanina desaminases (EC 3.5.1.-)as quais também podem converter triptofano em indol-3-piruvato e amôniona presença de água. Essas enzimas de especificidade ampla podem serisoladas a partir de microrganismos Proteus, tais como Proteus myxofaciens,Proteus mirabilis, Proteus vulgaris e Proteus morganii, e genes correspon-dentes foram clonados e seqüenciados. Ver, por exemplo, desaminase deProteus vulgaris (número de acesso de proteína: BAA90864.1 Gl:7007412;número de acesso de gene: AB030003.1 Gl:7007411); desaminase de Pro-teus mirabilis (número de acesso de proteína: AAA86752.1 Gl:1015426; nú-mero de acesso de gene: U35383.1 GM015425). Providencia e Morganellatambém contêm L-desaminases que podem converter triptofano em indol-3-piruvato. Ver H. Drechsel, A. Thieken, R. Reissbrodt, G. Jung, e G. Winkel-mann. J. Bacteriol., 175: 2727-2733 (1993).
Conforme mostrado nas figuras 11-13, se uma aminoácido oxi-dase, tal como triptofano oxidase, é usada para converter triptofano em in-dol-3-piruvato, catalase pode ser adicionada para reduzir ou mesmo eliminara presença de peróxido de hidrogênio.
lndol-3-lactato em indol-3-piruvato
A reação que converte indol-3-lactato em indol-3-piruvato podeser catalisada por uma variedade de polipeptídeos, tais como membros dasclasses 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.-, ou1.1.1.111 de polipeptídeos. A classe 1.1.1.110 de polipeptídeos inclui indole-lactato desidrogenases (também nomeadas ácido indolelático:NAD+ oxidor-redutase). As classes 1.1.1.27, 1.1.1.28 e 1.1.2.3 incluem lactato desidroge-nases (também nomeadas ácido lático desidrogenases, lactato:NAD+ oxidor-redutase). A classe 1.1.1.222 contém (R)-4-hidroxifenila-lactato desidroge-nase (também nomeada lactato desidrogenase D-aromática), lactato desi-drogenase R-aromática e R-3-(4-hidroxifenila)lactato:NAD(P)+ 2-oxidorredutase) e a classe 1.1.1.237 contém 3-(4-hidroxifenilpiruvato)redutase (também nomeada hidroxifenilpiruvato redutasee 4-hidroxifenila-lactato:NAD+ oxidorredutase). A classe 1.1.3.- contém lacta-to oxidases, e classe 1.1.1.111 contém (3-imidazol-5-ila)lactato desidrogena-ses (também nomeadas (S)-3-(imidazol-5-ila)lactato:NAD(P)+ oxidorreduta-se). É provável que vários dos polipeptídeos nessas classes permitam aprodução de indol-3-piruvato a partir de ácido indol-3-lático. Exemplos dessaconversão são fornecidos no Exemplo 4.
Reações químicas também podem ser usadas para converterácido indol-3-lático em indol-3-piruvato. Tais reações químicas incluem umaetapa de oxidação que pode ser efetuado usando vários métodos, por e-xemplo: oxidação pelo ar usando um catalisador B2 (China Chemical Repor-ter, v 13, n 28, p 18 (1), 2002), permanganato e perclorato diluído ou peróxi-do de hidrogênio na presença de catalisadores metálicos.
Indol-3-piruvato a ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico (MP)
Vários polipeptídeos conhecidos podem ser usados para conver-ter indol-3-piruvato em MP. Classes de polipeptídeo exemplares incluem4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17, e 4.1.2.-. Essas classes incluem sintases/liasescarbono-carbono, tais como aldolases que catalisam a condensação de doissubstratos de ácido carboxílico. Classe de peptídeo EC 4.1.3.- são sinta-ses/liases que formam ligações carbono-carbono utilizando substratos oxo-ácido (tais como indo-3-piruvato) como o eletrófilo, enquanto que EC 4.1.2.-são sintases/liases que formam ligações carbono-carbono utilizando substra-tos de aldeído (tal como benzaldeído) como o eletrófilo.
Por exemplo, o polipeptídeo descrito na EP 1045-029 (EC4.1.3.16, 4-hidróxi-2-oxoglutarato glioxilato-liase, também chamado 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase, 2-oxo-4-hidroxiglutarato aldolase ou KHGaldolase) converte ácido glioxílico e piruvato em ácido 4-hidróxi-2-cetoglutárico, e o polipeptídeo 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (EC4.1.3.17, também chamado de 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato piruvato lia-se ou ProA aldolase) condensa dois cetoácidos tais como dois piruvatos em4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato. Reações utilizando essas liases estãodescritas aqui.
As figuras 1 -2 e 11-13 mostram diagramas esquemáticos dessasreações nas quais uma molécula de 3 carbonos (C3) é combinada com in-dol-3-piruvato. Muitos membros da EC 4.1.2.- e 4.1.3.-, particularmente poli-peptídeos utilizando PLP, podem utilizar moléculas C3 que são aminoácidostais como serina, cisteína e alanina, ou seus derivados. Condensações aldó-licas catalisadas por representantes de EC 4.1.2.- e 4.1.3.- requerem a mo-lécula de três carbonos (isto é, fonte de carbono C3) dessa via para ser piru-vato ou um derivado de piruvato. Entretanto, outros compostos podem servircomo uma fonte de carbono C3 e podem ser convertidos em piruvato. Alani-na pode ser transaminada por muitas transaminases utilizando PLP, incluin-do muitas daquelas mencionadas acima, para produzir piruvato. Piruvato eamônia podem ser obtidas por reações de beta-eliminação (tais como aque-las catalisadas pela triptofanase ou (3-tirosinase) da L-serina, L-cisteína ederivados de serina e cisteína com grupos de saída suficientes, tais como O-metila-L-serina, O-benzila-L-serina, S-metilcisteína, S-benzilcisteína, S-alquila-L-cisteína, O-acila-L-serina e 3-cloro-L-alanina. Aspartato pode servircomo uma fonte de piruvato em reações de beta-liase mediadas por PLP,tais como aquelas catalisadas pela triptofanase (EC 4.1.99.1) e/ou p-tirosinase (EC 4.1.99.2, também chamada de tirosina-fenol liase). A taxa dereações de beta-liase pode ser aumentada pela efetuação de mutagênesedirecionada a sítio nos polipeptídeos (4.1.99.1-2) conforme descrito por Mou-ratou et ai (J. Biol. Chem 274:1320-5, 1999) e no Exemplo 18. Essas modifi-cações permitem que os polipeptídeos aceitem substratos de aminoácidosdicarboxílicos. Lactato também pode servir como uma fonte de piruvato, e éoxidado a piruvato pela adição de lactato desidrogenase e um cofator oxida-do ou lactato oxidase e oxigênio. Exemplos dessas reações estão descritasabaixo. Por exemplo, conforme mostrado na FIGURA 2 e nas figuras 11-13,ProA aldolase pode entrar em contato com indol-3-piruvato quando piruvatoé usado como a molécula C3.
O MP também pode ser gerado usando reações químicas, taiscomo as condensações aldólicas fornecidas no Exemplo 8.
MP a monatina
Conversão de MP em monatina pode ser catalisada por uma oumais de: triptofano aminotransferases (2.6.1.27), triptofano desidrogenases(1.4.1.19), D-aminoácido desidrogenases (1.4.99.1), glutamato desidrogena-ses (1.4.1.2-4), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20), leucina (de cadeiaramificada) desidrogenase (EC 1.4.1.9), triptofano-fenilpiruvato transamina-ses (2.6.1.28) ou, de um modo mais geral, membros da família aminotransfe-rase (2.6.1.-), tais como aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), tirosina(aromática) aminotransferase (2.6.1.5), D-triptofano aminotransferase, D-alanina aminotransferase (2.6.1.21) (FIGURA 2) e aminotransferase de ca-deia ramificada (BCAT, EC 2.6.1.42). Onze membros da classe de amino-transferase estão descritos abaixo (Exemplo 1), incluindo um novo membroda classe mostrado nas SEQ ID NOS: 11 e 12, e reações demonstrando aatividade das enzimas aminotransferase e desidrogenase são fornecidas noExemplo 15.
Essa reação também pode ser efetuada usando reações quími-cas. Aminação do cetoácido (MP) é efetuada por aminação redutiva usandoamônia e cianoboroidreto de sódio.
AS figuras 11-13 mostram polipeptídeos adicionais que podemser usados para converter MP em monatina, assim como proporcionar ren-dimentos aumentados de monatina a partir de indol-3-piruvato ou triptofano.Por exemplo, se aspartato é usado como o doador de amino, aspartato ami-notransferase pode ser usada para converter o aspartato em oxaloacetato(FIGURA 11). O oxaloacetato é convertido em piruvato e dióxido de carbonopor uma descarboxilase, tal como oxaloacetato descarboxilase (FIGURA 11)e 2-oxoglutarato descarboxilase (EC 4.1.1.71). Além disso, se lisina for usa-da como o doador amino, lisina épsilon aminotransferase (EC 2.6.1.36) podeser usada para converter a lisina em alisina (FIGURA 12). A alisina é espon-taneamente convertida em 1-piperideína-6-carboxilato (FIGURA 12). Umprocesso análogo àquele mostrado na FIGURA 12 usa ornitina ô-aminotransferase (EC 2.6.1.13) no lugar de lisina épsilon aminotransferase,e ornitina serve como o doador amino. Se um polipeptídeo capaz de catali-sar as reações de aminação redutiva (por exemplo, glutamato desidrogena-se) é usado para converter MP em monatina, um polipeptídeo que pode re-ciclar NAD(P)H e/ou produzir um produto volátila (FIGURA 13) pode ser u-sado, tal como formiato desidrogenase.
Considerações adicionais no esquema das vias biossintéticasDependendo de quais polipeptídeos são usados para gerar in-dol-3-piruvato, MP e/ou monatina, cofatores, substratos e/ou polipeptídeosadicionais podem ser fornecidos para a produção celular para aumentar aformação de produto.
Remoção de peróxido de hidrogênio
Peróxido de hidrogênio (H202) é um produto que, se gerado, po-de ser tóxico para as células de produção e pode danificar os polipeptídeosou intermediários produzidos. A L-aminoácido oxidase descrita acima geraH2O2 como produto. Conseqüentemente, se a L-aminoácido oxidase for u-sada, o H2O2 resultante pode ser removido ou seus níveis reduzidos parareduzir a injúria potencial para a célula ou produto.
Catalases podem ser usadas para reduzir o nível de H202 nacélula (figuras 11-13). A produção de células pode exprimir um seqüência deCDNA ou gene que codifique uma catalase (EC 1.11.1.6) a qual catalise adecomposição de peróxido de hidrogênio em água e gás oxigênio. Por e-xemplo, uma catalase pode ser expressa a partir de um vetor transfectadona célula da produção. Exemplos de catalases que podem ser usadas paraincluir, porém não estão limitadas, a: tr|Q9EV50 (Staphylococcus xylosus),tr|Q9KBE8 (Bacillus halodurans), tr|Q9URJ7 (Cândida albicans), tr|P77948(Streptomyces coelicolor), tr|Q9RBJ5 (Xanthomonas campestris) (Nos. deAcesso SwissProt). Reatores biocatalíticos utilizando L-aminoácido oxidase,D-aminoácido oxidase ou triptofano oxidase também podem conter um poli-peptídeo de catalase.
Modulação da disponibilidade de PLP (piridoxal-5'-fosfato)
Conforme mostrado na FIGURA 1, PLP pode ser utilizado emuma ou mais das etapas biossintéticos aqui descritos. A concentração dePLP pode ser suplementada de forma que o PLP não se torne uma limitaçãona eficiência global da reação.
A via biossintética para a vitamina B6 (a precursora do PLP) foicompletamente estudada em E. coli e algumas das proteínas foram cristali-zadas (Laber et ai, FEBS Letters, 449:45-8, 1999). Dois dos genes (epd ougapB e serC) são necessários em outras vias metabólicas, enquanto quetrês genes (pdxA, pdxB, e pdxJ) são únicos para a biossíntese do piridoxalfosfato. Um dos materiais de partida na via da E. colié a 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato (DXP). A síntese desse precursor a partir de metabólitos de 2 e 3carbonos centrais comuns é catalisada pelo polipeptídeo 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (DSX). O outro precursor é um derivado de treoni-na formado a partir de açúcar de 4 carbonos, D-eritrose-4-fosfato. Os genesnecessários para a conversão em fosfo-4-hidroxila-L-treonina (HTP) sãoepd, pdxB, e serC. A última reação para a formação do PLP é uma conden-sação intramolecular complexa e uma reação de fechamento de anel entreDXP e HTP, catalisada pelos produtos do gene de pdxA e pdxJ.
Se PLP se tornar um nutriente limitante durante a fermentaçãopara produzir monatina, a expressão aumentada de um ou mais dos genesda via em um célula hospedeira de produção pode ser usada para aumentaro rendimento de monatina. Um organismo hospedeiro pode conter múltiplascópias de seus genes da via natural, genes ou cópias de genes da via não-natural podem ser incorporados no genoma do organismo. Adicionalmente,múltiplas cópias dos genes da via de recuperação podem ser clonadas noorganismo hospedeiro.
Uma via de recuperação que é conservada em todos os orga-nismos recicla os vários derivados da vitamina B6 na forma de PLP ativa. Ospolipeptídeos envolvidos nessa via são a pdxK quinase, pdxH oxidase epdxY quinase. A superexpressão de um ou mais desses genes pode aumen-tar a disponibilidade de PLP.
Os níveis de vitamina B6 podem ser elevados por eliminação ourepressão da regulação metabólica dos genes da via biossintética natural noorganismo hospedeiro. PP reprime polipeptídeos envolvidos na biossíntesedo derivado de treonina precursor na cepa de bactéria 238-7 de Flavobacte-rium sp. Essa cepa bacteriana, livre de controle metabólico, superproduzderivados de piridoxal e pode excretar até 20 mg/L de PLP. Manipulaçãogenética do organismo hospedeiro produzindo monatina de uma forma simi-lar irá permitir a produção aumentada de PLP sem a superexpressão dosgenes da via biossintética.
Utilização de amônio
Reações da triptofanase podem ser direcionadas para a direçãosintética (produção de triptofano a partir de indol) tornando a amônia maisdisponível ou pela remoção de água. As reações de aminação redutiva, taiscomo aquelas catalisadas pela glutamato desidrogenase, podem tambémser direcionadas por um excesso de amônia.
Amônia pode se tornar disponível como um sal de carbonato deamônio ou fosfato de amônio num sistema tamponado com carbonato oufosfato. Amônia também pode ser fornecida como piruvato de amônio ouformiato de amônio. Alternativamente, amônia pode ser fornecida se a rea-ção for acoplada com uma reação que gere amônia, tal como glutamato de-sidrogenase, triptofano desidrogenase ou desidrogenase de cadeia ramifica-da. Amônia pode ser gerada pela adição dos substratos naturais de EC4.1.99.- (tirosina ou triptofano), os quais serão hidrolisados em fenol ou indol,piruvato e NH3. Isso também permitirá um rendimento aumentado do produtosintético em relação à quantidade de equilíbrio normal através da permissãode que a enzima hidrolise seu substrato preferido.
Remoção de produtos e subprodutos
A conversão de triptofano em indol-3-piruvato através de umatriptofano aminotransferase pode, adversamente, afetar a taxa de produçãode indol-3-piruvato porque a reação produz glutamato e requer o co-substrato 2-oxoglutarato (a-cetoglutarato). Glutamato pode causar a inibiçãoda aminotransferase, e a reação irá consumir grandes quantidades do co-substrato. Além disso, altas concentrações de glutamato são prejudiciais aosprocessos de separação a jusante.
O polipeptídeo glutamato desidrogenase (GLDH) converte glu-tamato em 2-oxoglutarato, reciclando dessa forma o co-substrato na reaçãocatalisada pela triptofano aminotransferase. GLDH também gera equivalen-tes reduzidos (NADH ou NADPH) que podem ser usados para gerar energiapara a célula (ATP) sob condições aeróbicas. A utilização de glutamato porGLDH também reduz a formação de subprodutos. Adicionalmente, a reaçãogera amônia, a qual pode servir como uma fonte de nitrogênio para a célulaou como um substrato em um aminação redutiva para a etapa final mostradona FIGURA 1. Conseqüentemente, uma célula de produção que superex-presse um polipeptídeo GLDH pode ser usada para aumentar o rendimentoe reduzir o custo de meio e/ou processos de separação.
Na via de triptofano a monatina, o doador amino da etapa três(por exemplo, glutamato ou aspartato) pode ser convertido de volta para oaceptor amino requerido para a etapa 1 (por exemplo, 2-oxoglutarato ou oxa-loacetato) se uma aminotransferase das classes de enzima apropriadas forusada. O uso de duas transaminases separadas para essa via, na qual osubstrato da transaminase não inibe competitivamente a atividade da outratransaminase, pode aumentar a eficiência dessa via.
Muitas das reações nas vias descritas são reversíveis e irão,conseqüentemente, alcançar um equilíbrio entre substratos e produtos. Orendimento da via pode ser aumentado pela remoção contínua dos produtosdos polipeptídeos. Por exemplo, a secreção de monatina no caldo de fer-mentação pelo uso de uma permease ou outra proteína de transporte, ou acristalização seletiva de monatina a partir de um fluxo reator biocatalíticocom reciclagem concomitante de substratos irá aumentar o rendimento dareação.
A remoção de subprodutos por reações enzimáticas adicionaisou por substituição de grupos doadores amino é outra forma de aumentar orendimento da reação. Vários exemplos são discutidos no Exemplo 21 emostrados nas figuras 11-13. Idealmente, um subproduto é produzido que éindisponível para reagir na direção reversa, seja por mudança de fase (eva-poração) ou por conversão espontânea para um produto final não-reativo, talcomo dióxido de carbono.
Modulação do pool de substrato
O pool de indol pode ser modulado pelo aumento da produçãode precursores de triptofano e/ou alteração de vias catabólicas envolvendoindol-3-piruvato e/ou triptofano. Por exemplo, a produção de ácido indol-3-acético a partir de indol-3-piruvato pode ser reduzida ou eliminada pela anu-lação funcional do gene que codifica para a EC 4.1.1.74 na célula hospedei-ra. A produção de indol a partir de triptofano pode ser reduzida ou eliminadapela anulação funcional do gene que codifica para a EC 4.1.99.1 na célulahospedeira. Alternativamente, um excesso de indol pode ser utilizado comoum substrato num processo in vitro ou in vivo juntamente com quantidadescrescentes do gene que codifica para a EC 4.1.99.1 (Kawasaki et ai, J.Ferm. and Bioeng., 82:604-6, 1996). Modificações genéticas podem ser fei-tas para aumentar o nível de intermediários, tais como D-eritrose-4-fosfato ecorismato.
A produção de triptofano é regulada na maioria dos organismos.Um mecanismo é através da inibição da retroalimentação de certas enzimasna via; uma vez que os níveis de triptofano aumentam, a taxa de produçãode triptofano diminui. Conseqüentemente, ao usar uma célula hospedeiraprojetada para produzir monatina através de um intermediário de triptofano,um organismo pode ser usado que não seja sensível às concentrações detriptofano. Por exemplo, uma cepa de Catharanthus roseus que é resistenteà inibição do crescimento por vários análogos de triptofano foi selecionadapela exposição repetida a altas concentrações de 5-metiltriptofano (Schal-lenberg e Berlin, Z Naturforsch 34:541-5, 1979). A atividade da triptofanosintase resultante da cepa foi menos produzida pela inibição do produto,provavelmente devido a mutações no gene. Similarmente, uma célula hos-pedeira usada para a produção de monatina pode ser otimizada.
A produção de triptofano pode ser otimizada através do uso daevolução direcionada para desenvolver polipeptídeos que são menos sensí-veis à inibição do produto. Por exemplo, a varredura pode ser efetuada emplacas sem conter triptofano no meio, mas com altos níveis de análogos detriptofano não-metabolizáveis. Patentes Americanas Nos. 5.756.345;4.742.007; e4 .371.614 descrevem métodos usados para aumentar aprodutividade de triptofano num organismo fermentador. O última etapa dabiossíntese de triptofano é a adição de serina ao indol; conseqüentemente, adisponibilidade da serina pode ser aumentada para aumentar a produção detriptofano.
A quantidade de monatina produzida por um organismo fermen-tador pode ser aumentada pelo aumento da quantidade de piruvato produzi-do pelo organismo hospedeiro. Certas leveduras, tais como Trichosporoncutaneum (Wang et ai, Lett. Appl. Microbiol. 35:338-42, 2002) e Torulopsisglabrata (Li et ai, Appl Microbiol. Biotechnol. 57:451-9, 2001) superprodu-zem piruvato e podem ser usadas para praticar os métodos aqui descritos.
Além disso, modificações genéticas podem ser feitas para organismos parapromover a produção de ácido pirúvico, tais como aquelas na cepa de E. coliW1485//p2(Kawasaki et ai, J. Ferm. and Bioeng. 82:604-6, 1996).
Controlando a quiralidade
O perfila de sabor da monatina pode ser alterado pelo controleda estereoquímica (quiralidade) da molécula. Por exemplo, diferentes isôme-ros de monatina podem ser desejados em diferentes misturas de concentra-ções para diferentes sistemas de alimentos. A quiralidade pode ser controla-da através de uma combinação de pH e polipeptídeos.<formula>formula see original document page 44</formula>
Racemização na posição C-4 da monatina (ver molécula nume-rada acima) pode ocorrer por desprotonação e reprotonação do carbono al-fa, a qual pode ocorrer por uma alteração no pH ou pela reação com o cofa-tor PLP. Num microrganismo, é improvável que o pH mude suficientementepara causar a racemização, mas o PLP é abundante. Métodos para controlara quiralidade com polipeptídeós dependem da via biossintética utilizada paraa produção de monatina.
Quando monatina é formada usando a via mostrada na FIGURA2, o seguinte pode ser considerado. Em um reação biocatalítica, a quiralida-de do carbono-2 é determinada pela enzima que converte indol-3-piruvatoem MP. Enzimas múltiplas (por exemplo, da EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) podem con-verter indol-3-piruvato em MP, dessa forma, uma pessoa pode escolher aenzima que forma o isômero desejado. Alternativamente, a enantioespecifi-cidade da enzima que converte indol-3-piruvato em MP pode ser modificadaatravés do uso de evolução direcionada ou anticorpos catalíticos podem serprojetados para catalisar a reação desejada. Um vez que o MP é produzido(seja enzimaticamente ou por condensação química), o grupo amino podeser adicionado estereoespecificamente usando uma transaminase, tais comoaquelas aqui descritas. Qualquer uma das configurações R ou S do carbono4 pode ser gerada, dependendo se uma aminotransferase de ácido D- ou L-aromático for usada. A maioria das aminotransferases são específicas parao isômero L-, entretanto as D-triptofano aminotransferases existem em cer-tas plantas (Kohiba e Mito, Proceedings of the 8th International Symposiumon Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japão 1990). Além disso, D-alanina aminotransferases (2.6.1.21), D-metionina-piruvato aminotransfera-ses (2.6.1.41) e tanto (R)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferase(2.6.1.61) e (S)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferase (2.6.1.22) fo-ram identificadas. Certas aminotransferases podem somente aceitar o subs-trato para essa reação com uma configuração particular no carbono C2.
Conseqüentemente, mesmo se a conversão ao MP não for estereoespecífi-ca, a estereoquímica do produto final pode ser controlada através da seleçãoapropriada de uma transaminase. Uma vez que as reações são reversíveis,o MP não-reagido (isômero indesejado) pode ser reciclado de volta paraseus constituintes e uma mistura racêmica de MP pode ser melhorada.
Ativação de substratos
Substratos fosforilados, tais como fosfoenolpiruvato (PEP) po-dem ser usados nas reações aqui descritas. Substratos fosforilados podemser mais energeticamente favoráveis e, conseqüentemente, podem ser usa-dos para aumentar as taxas e/ou rendimentos reacionais. Nas condensa-ções aldólicas, a adição de um grupo fosfato estabiliza o tautômero enol dosubstrato nucleofílico, tornando-o mais reativo. Em outras reações, um subs-trato fosforilado geralmente proporciona um melhor grupo de saída. Similar-mente, substratos podem ser ativados pela conversão em derivados de CoAou derivados de pirofosfato.
Modalidades ilustrativas
Em um modalidade, monatina ou um sal seu pode ser produzidapor um método que inclua o uso de uma aminotransferase, tal como HE-XAspC aminotransferase (No. de Acesso NCBI: 1AHF_A Gl:1127190). Porexemplo, HEXAspC aminotransferase pode ser usada para facilitar pelo me-nos uma reação na qual a reação envolva um substrato selecionado de trip-tofano, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico e uma combinaçãodestes.
Em outra modalidade, monatina ou um sal seu pode ser produ-zida por um método que inclui o uso de uma aminotransferase de cadeiaramificada (BCAT) (EC 2.6.1.42) e/ou uma desidrogenase de cadeia ramifi-cada (EC 1.4.1.9). Por exemplo, a aminotransferase de cadeia ramificadae/ou uma desidrogenase de cadeia ramificada pode ser usada para facilitaruma reação do ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico. Amino-transferases de cadeia ramificada adequadas (BCAT) (EC 2.6.1.42) podemincluir AT-102 ou AT-104. Desidrogenases de cadeia ramificada adequadas(EC 1.4.1.9) podem incluir AADH-110.
Em outra modalidade, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico ou um sal seu pode ser produzido por um método que inclui ouso de uma aldolase, tal como KHG aldolase. KHG aldolases adequadaspodem incluir KHG aldolase de Z. mobilis (No. de Acesso: AAV89621.1G 1:56543467) e/ou um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de ami-noácidos que seja pelo menos cerca de 90% idêntica à KHG aldolase de Zmobilis (No. de Acesso: AAV89621.1 Gl:56543467) e que tenha atividade deKHG aldolase de Z mobilis. Em algumas modalidades, aldolases adequadaspodem incluir polipeptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidosque seja pelo menos cerca de 95% idêntica ou pelo menos cerca de 99%idêntica à KHG aldolase de Z. mobilis (No. de Acesso: AAV89621.1Gl:56543467), onde o polipeptídeo tem atividade de KHG aldolase de Z.mobilis. A aldolase selecionada pode ser usada para facilitar uma reaçãoenvolvendo um substrato para a síntese de ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico, tal como indol-3-piruvato.
Em outras modalidades, monatina ou um sal seu podem serproduzidos por um método que inclui o uso de uma aldolase para facilitar areação envolvendo um substrato para a síntese de monatina, no qual maisde 60% da monatina produzida na reação é um estereoisômero R,R da mo-natina. Aldolases adequadas para a reação podem incluir KHG aldolase (EC4.1.3.16) e substratos adequados para a reação podem incluir indol-3-piruvato.
Em outras modalidades, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico pode ser produzido por um método que inclui a reação de umamistura reacional adequada, a mistura incluindo: (a) um substrato adequado,tal como triptofano; (b) um primeiro polipeptídeo escolhido dentre HEXAspCaminotransferase (No. de Acesso NCBI: 1AHF_A Gl:1127190), YfdZ (No. deAcesso NCBI AAC75438.1) e uma combinação desses; e (c) um segundopolipeptídeo escolhido dentre KHG aldolase (EG 4.1.3.16), ProA aldolase(EC 4.1.3.17) e uma combinação desses. Onde o substrato inclui triptofano,o triptofano pode incluir D-triptofano, L-triptofano e uma mistura desses. Otriptofano pode ser adicionado à mistura reacional e/ou produzido in situ pelareação de substratos adequados (por exemplo, glicose e serina). Em algu-mas modalidades, o triptofano inclui D-triptofano. A KHG aldolase pode in-cluir KHG aldolase de Z. mobilis (No. de Acesso: AAV8621.1 Gl:56543467)e/ou um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos queseja pelo menos cerca de 90% idêntica à KHG aldolase de Z. mobilis (No. deAcesso: AAV89621.1 Gl:56543467) e com atividade de KHG aldolase de Z.mobilis. Em algumas modalidades, aldolases adequadas podem incluir poli-peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos que seja pelomenos 95% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à KHG aldolasede Z. mobilis (No. de Acesso: AAV89621.1 GI.56543467), onde o polipeptí-deo tem atividade de KHG aldolase de Z. mobilis. Em algumas modalidades,a ProA aldolase pode incluir uma ProA aldolase de C. testosteroni, umaProA aldolase de S. meliloti e uma combinação destas. Os polipeptídeosselecionados podem ser adicionados à mistura reacional e/ou expressos pormicrorganismos presentes na mistura reacional. Por exemplo, a mistura rea-cional pode incluir um meio nutriente, por meio do qual os polipeptídeos se-lecionados são produzidos pela fermentação do meio nutriente com um mi-crorganismo adequado que expresse o polipeptídeo.
Em outras modalidades, monatina ou um sal seu podem serproduzidas pela reação de uma mistura reacional que inclui: (a) um substratoadequado tal como ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico); e (b)um polipeptídeo escolhido de YfdZ (No. de Acesso NCBI AAC75438.1), HE-XAspC aminotransferase (No. de Acesso NCBI: 1 AHF_A Gl:1127190), umaaminotransferase de cadeia ramificada (BCAT) (EC 2.6.1.42), uma desidro-genase de cadeia ramificada (EC 1.4.1.9) e uma combinação destas. Ácido2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico pode ser adicionado à misturareacional e/ou pode ser sintetizado in situ. Por exemplo, a mistura reacionalpode ainda incluir (c) indol-3-piruvato; e (d) um segundo polipeptídeo que écapaz de converter indol-3-piruvato e uma fonte de carbono C3 em ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico. O indol-3-piruvato pode ser adi-cionado à mistura reacional e/ou pode ser sintetizado in situ a partir de subs-tratos adequados. Os polipeptídeos selecionados podem ser adicionados àmistura reacional e/ou podem ser expressos por microrganismos presentesna mistura reacional. Por exemplo, a mistura reacional pode incluir um meionutriente que é fermentado com um microrganismo que expressa um oumais dos polipeptídeos selecionados. Em algumas modalidades, a misturareacional pode incluir um extrato de células não-purificado, tal como um ex-trato de células que inclui YfdZ (No. de Acesso NCBI AAC75438.1), HE-XAspC aminotransferase (No. de Acesso NCBI: 1 AHF_A Gl:1127190), ouum combinação destas.
Em algumas modalidades, monatina ou um sal seu pode serproduzida pela reação de uma mistura reacional que inclui: (a) um substratoadequado tal como ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico; e (b)um polipeptídeo escolhido dentre AT-101, AT-102, AT-103, AT-104, AADH-102, AADH-110, AADH-112, AADH-113 e uma combinação destes. Em al-gumas modalidades, o polipeptídeo selecionado pode ser AT-103. A monati-na ou sal seu produzido pelo método pode ser predominantemente o estere-oisômero R,R da monatina. Por exemplo, em algumas modalidades, pelomenos cerca de 65% da monatina produzida no método pode ser um este-reoisômero R,R da monatina.
Em outras modalidades, monatina ou um sal seu pode ser pro-duzida a partir de um substrato (tal como triptofano e/ou indol-3-piruvato)pela produção enzimática de uma composição de monatina, na qual pelomenos cerca e 80% da monatina ou sal seu presente na composição de mo-natina é um estereoisômero R,R da monatina. Em modalidades adequadasdo método, pelo menos cerca de 84% da monatina ou sal seu presente nacomposição de monatina é um estereoisômero R,R da monatina. Substratosadequados podem incluir triptofano, o qual pode incluir D-triptofano, L-triptofano e uma mistura destes. Em algumas modalidades, o substrato sele-cionado é D-triptofano. O método pode incluir o fornecimento de uma ProAaldolase (EC 4.1.3.17). Por exemplo, uma ProA aldolase (EC 4.1.3.17) podeser fornecida para facilitar a conversão de indol-3-piruvato em ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico. Em algumas modalidades, o mé-todo pode incluir o fornecimento de uma transaminase tal como AT-103 (D-transaminase). Por exemplo, AT-103 (D-transaminase) pode ser fornecidapara facilitar a conversão de ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico em monatina.
Em outras modalidades, monatina ou um sal seu podem serproduzidos por um método que inclui a reação de uma mistura reacional, amistura incluindo: (a) um substrato selecionado de triptofano, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico e uma combinação destes; e (b) um poli-peptídeo AspC de E. coli (No. de Acesso NCBI AAC74014.1). O polipeptídeoAspC de E. coli (No. de Acesso NCBI AAC74014.1) pode incluir pelo menosuma substituição em um posição de aminoácido escolhida das posições 39,41, 47, 69, 109, 297 e uma combinação dessas, nas quais a numeração dasposições dos aminoácidos é baseada num sistema de numeração de aspar-tato aminotransferase citosólica de porco. Em modalidades adequadas, opolipeptídeo AspC de E. coli pode ter atividade de aspartato aminotransfera-se. O polipeptídeo AspC de E. coli pode incluir pelo menos uma das seguin-tes substituições: uma substituição de Vai 39 para Leu; uma substituição deLys 41 pra Tyr; uma substituição de Thr 47 para Me; uma substituição de Asn69 para Leu; uma substituição de Thr 109 para Ser; uma substituição de Asn297 para Ser; e combinações suas. O substrato pode ser adicionado à mis-tura reacional e/ou produzido in situ a partir de substratos adequados. O po-lipeptídeo AspC de E. coli pode ser adicionado à mistura reacional e/ou ex-presso por um microrganismo presente na mistura reacional (por exemplo,pela fermentação da mistura reacional, a qual pode incluir um meio nutriente,com um microrganismo que expresse o polipeptídeo AspC de E. coli).
Em outras modalidades, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico ou um sal seu pode ser produzido pela reação de uma misturareacional, a mistura incluindo: (a) um substrato tal como indol-3-piruvato; e(b) uma aldolase adequada. Por exemplo, a aldolase pode ser escolhida apartir de Bradyrhizobium japonicum str. USDA 110 (No. de Acesso NCBI:Gl:27378953); Sphingomonas {Pseudomonas) paucimobilis (No. de AcessoNCBI: Gl: 19918963); Yersinia pestis KIM (No. de Acesso NCBI:Gl:21956715); Ralstonia metallidurans CH34 (No. de Acesso NCBI:Gl:48767386); Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 (No. de Acesso NCBI:Gl:51594436); biovar viciae rhiz23g02-p1k_1009_341 de fíhizobium legumi-nosarum (SEQ ID NO: 88); Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444(Sphingomonas aromaticivorans F199) (No. de Acesso NCBI: Gl:48849026);
Pseudomonas putida KT2440 (No. de Acesso NCBI: Gl:24984081); Magne-tospirillum magnetotacticum MS-1 (No. de Acesso NCBI: Gl:46200890);Rhodopseudomonas palustris CGA009 (No. de Acesso NCBI: Gl:39937756);Xanthomonas campestris ATCC-33913 (No. de Acesso NCBI: Gl:21115297);Xanthomonas axonopodis citri 306 (No. de Acesso NCBI: Gl:21110581); S-treptomyces avermitilis MA-4680 (No. de Acesso NCBI: Gl:29828159); euma combinação destes. O substrato (por exemplo, indol-3-piruvato) podeser adicionado na mistura reacional e/ou pode ser produzido in situ a partirde substratos adequados. A aldolase pode ser adicionada à mistura reacio-nal e/ou pode ser expressa por um microrganismo presente na mistura rea-cional (por exemplo, pela fermentação da mistura reacional, a qual pode in-cluir um meio nutriente, com um microrganismo que expressa uma aldolaseselecionada).
Em outras modalidades, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico ou um sal seu pode ser produzido pela reação de uma misturareacional, a mistura incluindo: (a) um substrato tal como indol-3-piruvato; e(b) uma aldolase adequada. Por exemplo, aldolases adequadas podemcompreender uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos cerca de49% idêntica à ProA de C. testosteroni (SEQ ID NO: 66) ou uma seqüênciade aminoácidos que seja pelo menos cerca de 56% idêntica à ProA de Sino-rhizobium meliloti (No. de Acesso NCBI: CAC46344), onde a aldolase tematividade 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato liase. Em algumas modalidadesadequadas, as aldolases podem compreender uma seqüência de aminoáci-dos que seja pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e/ou 99%idêntica à ProA de C. testosteroni (SEQ ID NO: 66) e/ou uma seqüência deaminoácidos que seja pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e/ou99% idêntica à ProA de Sinorhizobium meliloti (No. de Acesso NCBI:CAC46344), onde a aldolase tem atividade 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutaratoliase. Em algumas modalidades, a aldolase compreende uma seqüência deaminoácidos que é pelo menos cerca de 60% idêntica à ProA de C. testoste-roni (SEQ ID NO: 66). Em outras modalidades, a aldolase compreende umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70% idêntica à ProAde C. testosteroni (SEQ ID NO: 66). O substrato (por exemplo, indol-3-piruvato) pode ser adicionado à mistura reacional e/ou produzido in situ apartir de substratos adequados na mistura reacional. A aldolase pode seradicionada à mistura reacional e/ou pode ser expressa por um microrganis-mo presente na mistura reacional (por exemplo, por fermentação da misturareacional, a qual pode incluir um meio nutriente, com um microrganismo queexpressa uma aldolase selecionada).
Em outras modalidades, monatina ou um sal seu pode ser pro-duzida por um método que inclui a reação de uma mistura reacional, a mistu-ra incluindo: (a) um substrato tal como triptofano: e uma desaminase ade-quada (EC 3.5.1.-). Em algumas modalidades, a desaminase é derivada apartir de um microrganismo escolhido de: Proteus spp., Providencia spp.,Morganella spp., ou combinações destes. Desaminases adequadas podemincluir desaminases derivadas de Proteus spp. incluindo, mas sem se limitar,a Proteus myxofaciens, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus morganii,e combinações destes. O triptofano pode ser adicionado à mistura reacionale/ou pode ser produzido in situ a partir de substratos adequados. A desami-nase pode ser adicionada à mistura reacional e/ou pode ser expressa porum microrganismo presente na mistura reacional (por exemplo, pela fermen-tação da mistura reacional, a qual pode incluir um meio nutriente, com ummicrorganismo que expressa uma desaminase selecionada).
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Clonagem e expressão de triptofano aminotransferasesEsse exemplo descreve métodos que foram usados para clonartriptofano aminotransferases, as quais podem ser usadas para converter trip-tofano em indol-3-piruvato. Os genes foram clonados no vetor pET 30Xa/LIC para gerar proteínas de fusão com sinalizadores HIS6 /sinalizadoresT7 N-terminais cliváveis. As proteínas resultantes foram purificadas usandocromatografia de afinidade com metal imobilizado.Visão Geral Experimental
Onze genes que codificam aminotranserases foram clonados emE. coli. Esses genes foram D-alanina aminotransferase de Bacillus subtilis(dat, Ne de Acesso Genbank Y14082.1 pb 28622-29470 e N5 de AcessoGenbank NP_388848.1, seqüência de ácido nucléico e seqüência de amino-ácido, respectivamente), Sinorhizobium meliloti (também chamado de Rhi-zobium meliloti) tirosina aminotransferase (tatA, SEQ ID NOS: 1 e 2, se-qüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente),tirosina aminotransferase de cepa de Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 (tatAdeclarada por homologia, SEQ ID NOS: 3 e 4, seqüência de ácido nucléico eseqüência de aminoácido, respectivamente), tirosina aminotransferase de R.sphaeroides 35053 (declarada por homologia, SEQ ID NOS: 5 e 6, seqüên-cia de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), amino-transferase de substrato amplo de Leishmania major (bsat, declarada porhomologia aos fragmentos de peptídeos de L. mexicana, SEQ ID NOS: 7 e8, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamen-te), aminotransferase aromática de Bacillus subtilis (araT, declarada por ho-mologia, SEQ ID NOS: 9 e 10, seqüência de ácido nucléico e seqüência deaminoácido, respectivamente), aminotransferase aromática de Lactobacillusamylovorus (araT declarada por homologia, SEQ ID NOS: 11 e 12, seqüên-cia de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), amino-transferase de substrato múltiplo 35053 de R. sphaeroides) (declarada porhomologia, SEQ ID NOS: 13 e 14, seqüência de ácido nucléico e seqüênciade aminoácido, respectivamente), aminotransferase de substrato múltiplo dacepa 2.4.1 de Rhodobacter sphaeroides (msa declarada por homologia, N9de Acesso Genbank AAAE01000093.1, pb 14743-16155 e N9 de AcessoGenbank ZP00005082.1, seqüência de ácido nucléico e seqüência de ami-noácido, respectivamente), aspartato aminotransferase de Escherichia coli(aspC, N- de Acesso Genbank AE000195.1 pb 2755-1565 e N9 de AcessoGenbank AAC74014.1, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoá-cido, respectivamente), e tirosina aminotransferase de E. coli (tyrB, SEQ IDNOS: 31 e 32, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, res-pectivamente).
Os genes foram clonados, expressos e testados para a atividadena conversão de triptofano em indol-3-piruvato, juntamente com enzimascomercialmente disponíveis. Todos os onze clones tinham atividade.
Identificação de cepas de bactérias que podem conter polipeptí-deos com a atividade desejada
Nenhum gene no banco de dados do NCBI (National Center forBiotechnology Information) foram designados como triptofano aminotransfe-rases. Entretanto, organismos com essa atividade enzimática foram identifi-cados. Atividade da L-triptofano aminotransferase (TAT) foi medida nos ex-tratos de células ou a partir de proteína purificada a partir das seguintes fon-tes: Rizobactérias isoladas de Festuca octoflora, citosol e mitocôndria deervilha, células do fel da coroa de girassol, biovar trifoli de Rhizobium legu-minosarum, pv de gypsophilae de Erwinia herbicola, pv. savastanoi dePseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum &brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobi-um elkanii, Cândida maltosa, Azotobacter vinelandii, cérebro de rato, fígadode rato, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas fluorescens CHÃO, Lactococ-eus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, mudas de trigo, ce-vada, Phaseolus aureus (feijão mung), Saccharomyces uvarum (carlsber-gensis), Leishmania sp., milho, brotos de tomate, plantas de ervilha, tabaco,porco, Clostridium sporogenes, e Streptomyces griseus.
Isolamento de DNA genômico para clonagem
S. meliloti (número ATCC 9930) cresceu em meio TY a 25°C, pH7,2. Células cresceram até uma densidade ótica a 600 nm (OD60o) de 1,85 eum inóculo de 2% foi usado para preparações de DNA genômico. O kit Qia-gen Genomic tip 20/G (Valência, CA) foi usado para o isolamento de DNAgenômico.
Bacillus subtilis 6051 (ATCC) cresceu a 30°C no Caldo NutrienteBereto (Difco; Detroit, Ml). O protocolo 20/G do Qiagen Genomic tip foi usa-do para isolar o DNA genômico com as seguintes alterações: as concentra-ções da proteinase K e da lisosima foram duplicadas e os tempos de incuba-ção foram aumentados 2-3 vezes.
DNA genômico de Leishmania major ATCC 50122 foi fornecidopela IDI, Inc. (Quebec, Canadá) em tampão TE pH 8,0, 17 ng/|iL.
Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 (fornecido pelo professor SamKaplan, Universidade do Texas, Houston), R. sphaeroides 35053 (númeroATCC) e DNA genômico de L. amylovorus foi preparado por extração comfenol padrão. As células foram colhidas na fase log tardia, ressuspensas emtampão TEN (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCI 100 mM) e lisadaspela adição de laurilsarcosina de sódio 0,024 ml_ por ml_ de suspensão celu-lar. Depois de extrair pelo menos três vezes com um volume igual de fenolsaturado com tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM), a soluçãode DNA foi extraída uma vez com clorofórmio:octanol 9:1 e três vezes comclorofórmio. O DNA foi precipitado pela adição de 0,1 volume de acetato desódio 3 M, pH 6,8 e 2 volumes de etanol. O precipitado foi coletado por cen-trifugação e lavado uma vez com etanol 70%. Finalmente, o DNA foi dissol-vido em água destilada 0,10 mL.
DNA genômico de Escherichia coli foi isolado da cepa DH10B(Invitrogen) e preparado usando o kit Qiagen Genomic-tip® (500/G). A partirde 30 mL dessa cepa crescida em LB até uma OD65o de 1,87, 0,3 mg deDNA purificado foi obtido. O DNA purificado foi dissolvido em tampão de elu-ição Qiagen (EB) em um concentração de 0,37 \iq/\iL.
Protocolo de reação em cadeia da polimerase
Os iniciadores foram projetados com projeções compatíveis parao vetor pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, Wl). O vetor pET tem uma proje-ção de filamento único de 12 bases no lado 5' do sítio Xa/LIC e uma proje-ção de filamento único de 15 bases no lado 3' do sítio Xa/LIC. O plasmídeo éprojetado para clonagem independente de ligação, com His N-terminal e si-nalizadores-S e um sinalizador His C-terminal opcional. O sítio de reconhe-cimento da protease Xa (IEGR) é colocado diretamente em frente do códonde início do gene de interesse, de forma que os sinalizadores da proteína defusão possam ser removidos.
As seguintes seqüências foram adicionadas às extremidades 5'das seqüências específicas do organismo ao projetar iniciadores: iniciador"forward", 5' GGTATTGAGGGTCGC (SEQ ID NO: 73); iniciador reverso: 5'AGAGGAGAGTTAGAGCC (SEQ ID NO: 74).
Iniciadores dat de Bacillus subtilis
Expressão N: GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCA-ATGG-3' e expressão C: 5'-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3' (SEQ ID NOS:15e16).
Iniciadores tatA de Sinorhizobium meliloti:
Expressão N: 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGTTC-GACGCCCTCGCCCG e expressão C: 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTCA-GAGACTGGTGAACTTGC (SEQ ID NOS: 17 e 18).
Iniciadores araT de Bacillus subtilis:
Expressão N: 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGA-
ATCC e expressão C: 5'-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG (SEQ ID NOS: 19e20).
msa de Rhodobacter sphaeroides (tanto 2.4.1 quanto 35053):
Expressão N: 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGCGC-GAGCCTCTTGCCCT e expressão C: 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCT-CAGCCGGGGAAGCTCCGGG (SEQ ID NOS: 21 e 22).
bsat de Leishmania major
Expressão N: 5'-
GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT e expressão C: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC (SEQ ID NOS: 23e24).araT de Lactobacillus amylovorus:
Expressão N: 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTA-ATGA e expressão C: 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTG-TAAAA (SEQ ID NOS: 25 e 26).
tatA de Rhodobacter sphaeroides (tanto cepas 2.4.1 quanto35053):
Expressão N:
5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC e expres-são C: 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG (SEQID NOS: 27 e 28).
asp C de Escherichia coli:
Expressão N:
5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3' e expres-são C: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQID NOS: 29 e 30).
tyrB de Escherichia coli: Expressão N:5'-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC e expressãoC: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3' (SEQ IDNOS: 33 e 34).
O gene derivado de S. meliloti {tatA) foi amplificado usando oseguinte protocolo de PCR: Em 50 (J.L de reação 0,1 - 0,5 jig de matriz, 1,5|liM de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Expand High FidelityPolymerase (Roche, Indianápolis, IN) e 1X de tampão Expand® com Mg fo-ram usados. O programa termociclizador usado incluiu um início quente a96°C por 5 minutos, seguido por 29 repetições das seguintes etapas: 94°Cpor 30 segundos, 55°C por 2 minutos e 72°C por 2,5 minutos. Depois das 29repetições a amostra foi mantida a 72°C por 10 minutos e, a seguir, estoca-da a 4°C. Esse protocolo de PCR produziu um produto de 1199 pb.
As seqüências dos genes derivados de R. sphaeroides (msa etatA), araT de L. amylovorus e araT de Bacillus foram amplificadas usando oseguinte protocolo de PCR. Em 50 uL de reação 0,1 - 0,5 jxg de matriz, 1,5jiM de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de polimerase de HighFidelity Expand e 1X de tampão Expand com Mg foram adicionados. Oprograma termociclizador usado incluiu um início quente a 96°C por 5 minu-tos, seguido por 29 repetições das seguintes etapas: 94°C por 30 segundos,40 - 60°C por 1 minuto, 45 segundos (termociclizador de gradiente) e 72°Cpor 2 minutos, 15 segundos. Depois das 29 repetições a amostra foi mantidaa 72°C por 10 minutos e, a seguir, estocada a 4°C.
Para cada gene msa de R. sphaeroides, as temperaturas de a-nelamento de 42°C e 48°C produziram múltiplos produtos, menos uma ban-da distinta em aproximadamente 1464 pb. Para araT de L. amylovorus, astemperaturas de anelamento de 42°C, 48°C, e 56°C produziram produtosindividuais com bandas intensas a 1173 pb. Para araT de B. subtilis, as tem-peraturas de anelamento de 40°C, 45°C, 50°C, 55°C geraram produtos in-tensos individuais (1173 pb) a partir tanto do DNA genômico quanto das co-lônias. Para bsat de L. major, a temperatura de anelamento de 55°C produ-ziu o produto mais limpo (1239 pb). Para os genes tatA de Rhodobacter, astemperaturas de anelamento de 50 - 55°C produziram produtos limpos notamanho correto (1260 pb). Tanto para os genes de E. coli quanto para ogene dat de B. subtilis, uma temperatura de anelamento de 55 - 60°C foi u-sada, e o tempo de anelamento foi encurtado para 45 segundos. Produtoslimpos dos tamanhos corretos foram obtidos (aproximadamente 1,3 Kb paraos genes de E. coli, 850 pb para o gene dat).
Clonagem
Os produtos de PCR foram purificados com gel a partir de géisde ágarose-0,8 ou 1% de TAE usando o kit de extração de gel Qiagen (Va-lencia, CA). Os produtos de PCR foram quantificados por comparação compadrões num gel de ágarose, e a seguir tratados com DNA polimerase T4seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante para a Clonagem In-dependente de Ligação (Novagen, Madison, Wl).
Resumidamente, aproximadamente 0,2 pmol de produto de PCRpurificado foi tratado com 1 U de DNA polimerase T4 na presença de dGTPpor 30 minutos a 22°C. A polimerase remove bases sucessivas das extremi-dades 3' do produto de PCR. Quando a polimerase encontra um resíduo deguanina, a atividade 5' para a 3' da polimerase da enzima contrabalança aatividade da exonuclease para prevenir eficientemente a excisão adicional.Isso cria projeções de filamento único que são compatíveis com o vetor pETXa/LIC. A polimerase é inativada pela incubação a 75°C por 20 minutos.
O vetor e inserção tratada foram anelados conforme recomen-dado pela Novagen. Aproximadamente 0,02 pmol de inserção tratada e 0,01pmol de vetor foram incubados por 5 minutos a 22°C, EDTA 6,25 mM (con-centração final) foi adicionado e a incubação a 22°C foi repetida. A reaçãode anelação (1 uL) foi adicionada a células competentes individuais Nova-Blue® (Novagen, Madison, Wl) e incubada em gelo por 5 minutos. Depois damistura, as células foram transformadas por choque com calor por 30 se-gundos a 42°C. As células foram colocadas em gelo por 2 minutos e deixa-das recuperar em 250 jllL de SOC em temperatura ambiente por 30 minutosa 37°C com agitação a 225 rpm. As células foram plaqueadas em placas LBcontendo canamicina (25 - 50 ng/mL).
DNA de plasmídeo foi purificado usando o spin miniprep kit daQiagen e testado para as inserções corretas por digestão de restrição comXhol e Xbal. As seqüências de plasmídeos que aparentaram ter a inserçãocorreta foram verificadas por seqüenciamento de DNA de terminação de ca-deia dideóxi.
SEQ ID NOS: 1-14 e 31-32 mostram seqüências de nucleotídeoe de aminoácido correspondentes das aminotransferases recombinantes,quaisquer alterações das seqüências do GenBank foram ou silenciosas ousubstituições conservativas geradas na seqüência de proteína. SEQ ID Nos:11 e 12 são seqüências novas.
Expressão de gene e ensaios
DNA de plasmídeo, verificado por análise de seqüência, foi sub-clonado nos hospedeiros de expressão de E. coli BLR (DE3) ou BL21 (DE3)(Novagen, Madison, Wl). As culturas cresceram e os plasmídeos foram iso-lados usando o miniprep kit da Qiagen, e analisados por digestão de restri-ção para confirmar a identidade.
A indução foi inicialmente efetuada com araT de L. amylovorus,araT de B. subtilis e tatA de S. meliloti tanto em células BLR(DE3) quantoBL21(DE3). Um estudo de curso de tempo foi efetuado com culturas cresci-das em LB contendo canamicina (30 mg/L) até uma OD6oo de 0,5 - 0,8 e in-duzidas com IPTG 1 mM (isopropiltiogalactosídeo) e amostradas em 0, 1,2e 4 horas após a indução. As células a partir de 2,0 ml_ foram ressuspensasem 0,10 ml_ de Tris-HCI 120 mM, pH 6,8 contendo dodecilsulfato de sódio10%, 2-mercaptoetanol 10% e glicerol 20%, aquecidas a 95°C por 10 min eesfriadas, e diluídas com H2O 0,10 ml_. Alíquotas dessas amostras de prote-ína celular total foram analisadas por SDS-PAGE usando um gel de gradien-te 4 - 15%. Não houve diferenças significativas na quantidade de proteínaexpressa entre a indução de 2 horas e a de 4 horas, nem entre as célulasBLR(DE3) e BL21(DE3).
Extratos de células também foram preparados a partir de amos-tras de 4 horas pela suspensão de péletes de células a partir de 2 ml_ decultura em 0,25 ml_ de reagente Novagen BugBuster® contendo 0,25 fiL debenzonase nuclease, incubando em temperatura ambiente por 20 minutoscom agitação branda e centrifugando a 16.000 x g para remover os fragmen-tos celulares. Os sobrenadantes (extratos de célula) foram carregados emgéis de gradiente 4 -15% para análise das proteínas solúveis celulares.
Os três clones (araT de L. amylovorus (SEQ ID NOS: 11 e 12),araT de B. subtilis (SEQ ID NOS: 9 e 10) e tatA de S. meliloti (SEQ ID NOS:1 e 2) mostraram proteínas solúveis que corresponderam ao tamanho corre-to (aproximadamente 45 KDa). O produto do gene araT de B. subtilis foi su-perexpresso no nível mais elevado e/ou foi mais solúvel do que os outrosdois produtos de gene.
Em métodos de expressão subseqüentes, DNA de plasmídeo declones positivos foi subclonado em BL21 (DE3) devido às melhores caracte-rísticas de crescimento desse hospedeiro. A indução foi repetida usandoIPTG 1 mM com culturas crescidas em LB contendo canamicina a 50 mg/L,induzindo quando a OD60o alcançou aproximadamente 0,8. Células foramcoletadas depois de 4 horas de crescimento a 37°C, centrifugadas a 3000rpm por 10 minutos (4°C), lavadas com tampão TEGGP (Tris-HCI 50 mM(pH 7,0), EDTA 0,5 mM, glutationa 100 mg/L, glicerol 5%, com coquetel ini-bidor de protease completo da Roche) e congeladas instantaneamente emetanol a -80°C.
As amostras foram ressuspensas em 5 ml_/g de peso de célulaúmida de reagente BugBuster® (Novagen) contendo 5 uL/mL do grupo decoquetel inibidor de protease Ng3 (Calbiochem-Novabiochem Corp., São Di-ego, CA) e 1 u.L/ml_ de benzonase nuclease. As amostras foram incubadasem temperatura ambiente por 20 minutos num agitador orbital. Fragmentosde células insolúveis foram removidos por centrifugação a 16.000 x g por 20minutos a 4°C.
Os extratos de células foram analisados por SDS-PAGE e avali-ados para a atividade da triptofano aminotransferase pelo acompanhamentoda produção de ácido indol-pirúvico usando o seguinte protocolo. Reaçõesde um ml_ foram executadas em tetraborato de sódio 50 mM (pH 8,5), EDTA0,5 mM, arsenato de sódio 0,5 mM, piridoxal fosfato 50 (iM, a-cetoglutarato 5mM e L-triptofano 5 mM. As reações foram iniciadas pela adição de extratoslivres de células ou enzima purificada e foram incubadas por 30 minutos a30°C. TCA 20% (200 uL) foi adicionado para parar a reação, e a proteínaprecipitada foi removida por centrifugação. A absorvância a 327 nm foi me-dida e comparada com uma curva padrão de indol-3-piruvato recentementepreparado no tampão de ensaio. Reações de controle sem o substrato tripto-fano ou usando extratos livres de células de clones transformados compET30a sozinho também foram efetuadas.
Devido aos antecedentes das aminotransferases de E. coli natu-rais nos extratos de células, as proteínas de fusão recombinantes cada umacontendo uma proteína aminotransferase fundida com o sinalizadorHISe/sinalizador S amino-terminal pET30 foram purificadas usando cromato-grafia de afinidade com metal imobilizado com cartuchos His-bind seguindoos protocolos do fabricante (Novagen, Madison, Wl). A seqüência sinalizado-ra de His6 das proteínas de fusão se liga aos cátions divalentes Ni2+ imobili-zados na resina His-Bind baseada em IDA. As frações eluentes foram des-salinizadas em colunas PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) eeluídas em Tris 50 mM, pH 7,0. Proteínas purificadas foram analisadas porSDS-PAGE e ensaiadas para a atividade da aminotransferase.
Os resultados da indução a 37°C com IPTG 1 mM (4 horas) de-monstraram que ambos os clones de tatA de R. sphaeroides, bsat de L. ma-jor, tatA de S. meliloti e aspC de E. coli tiveram níveis significativos de ativi-dade da triptofano aminotransferase. A proteína araT de B. subtilis foi super-expressa e solúvel, mas mostrou pouca atividade enzimática. O produto dogene araT de L. amylovorus aparentou ser solúvel no extrato celular, mas apurificação usando um cartucho His-Bind resultou somente em pequenasquantidades de proteína com o peso molecular correto. Os produtos do genemsa foram insolúveis e experimentos de expressão adicionais foram efetua-dos a 24°C para minimizar a formação de corpos de inclusão. Várias con-centrações de IPTG entre 10 |a.M e 1 mM foram usadas para maximizar aquantidade de proteína solúvel.
Tabela 1 lista as atividades específicas medidas em microgra-mas de indol-3-piruvato (I3P) formado por miligrama de proteína por minuto.Em alguns casos, quantidades muito pequenas de proteína recombinantemostraram altos níveis de atividade acima da faixa linear eficaz do ensaio.Nesses casos, um ">" precede o número de atividade específico.
Tabela 1
<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>Um alinhamento comparando todas as proteínas recombinantesclonadas ilustra que não há muitas áreas altamente conservadas entre asseqüências araT, tatA, bsat, e msa. Um alinhamento de proteínas recombi-nantes da mais alta atividade: homólogos do produto do gene tatA de Rho-dobacter, aminotransferase de substrato amplo de L. major e a tirosina ami-notransferase de Sinorhizobium meliloti mostraram várias regiões conserva-das, entretanto elas são somente 30 - 43% idênticas no nível de proteína. Adisponibilidade da aminotransferase D-específica (D-alanina) de faixa amplapode ser útila na produção de outros estereoisômeros da monatina (ver e-xemplos 9-15).
EXEMPLO 2
Esse exemplo descreve métodos que foram usados para sub-clonar e analisar uma versão modificada do gene aspC de E. coli, HEX, clo-nado no vetor pET30 Xa/LIC. O produto desse gene carrega 6 mutaçõespara o seu sítio ativo e foi racionalmente projetado para ter uma atividadeaminotransferase aumentada com aminoácidos aromáticos, baseando-se nahomologia para a (tirosina) aminotransferase aromática TyrB de E. coli. Duasdessas posições (Thr 109 e Asn 297; sistema de numeração de aspartatoaminotransferase citosólica de porco (AAT)) são invariáveis em todas as en-zimas aspartato aminotransferase conhecidas, mas foram modificadas paramimetizar a seqüência TyrB de E. coli (Ser 109 e Ser 297). As outras quatroposições (Vai 39, Lys 41, Thr 47 e Asn 69) alinham-se na área do sítio ativode AspC de E. coli e são substituídas por aminoácidos com mais cadeiaslaterais hidrofóbicas encontradas na TyrB (Leu 39, Tyr 41, He 47, e Leu 69).
Clonagem
O gene HEX clonado na pUC19 foi fornecido pelo professor JFKirsch (Departamento de Biologia Molecular e Celular, Universidade da Cali-fórnia, Berkeley, Berkeley, CA 94720-3206) e usado como o matriz para aclonagem do gene em pET30 Xa/LIC. Ver James J. Onuffer e Jack F. Kirsch,Redesign of the substrate specificity of Escherichia coli aspartate amino-transferase to that of Escherichia coli tyrosine aminotransferase by homologymodeling and site-directed mutagenesis, Protein Science, 4: 1750-1757(1995).
Os iniciadores projetados para clonar o gene aspC de E. coli novetor pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, Wl) descrito no exemplo 1 (SEQ IDNos: 29 e 30) foram usados para subclonar o gene HEX no mesmo vetor. Oseguinte protocolo de PCR foi usado para amplificação do gene: em 50 ulde reação, 50 ng de matriz de DNA, 1,0 u,M de cada iniciador, 0,2 mM decada dNTP, 1 U de pfuUltra HF polimerase (Stratagene), 2,1 U de Polimera-se Expand High Fidelity® (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) e1x de tampão Expand® com Mg foram adicionados. O programa termocicli-zador utilizou um início quente de 94°C por 5 minutos; seguido por 10 ciclosde etapa de desnaturação a 94°C (30 seg), uma etapa de anelamento a50°C (1 min) e uma etapa de extensão a 72°C (1 min 30 seg); 15 ciclos deuma etapa desnaturante a 94°C (30 seg), uma etapa de anelamento a 55°C(1 min) e uma etapa de extensão a 72°C (1 min 30 seg) que aumentou 5 segpor ciclo; 10 ciclos de uma etapa desnaturante a 94°C (30 seg), uma etapade anelamento a 55°C (1 min) e uma etapa de extensão a 72°C (2 min 45seg); e finalmente uma etapa de finalização a 72°C (7 min). O DNA amplifi-cado foi purificado a partir de um gel de ágarose a 1% usando um kit de ex-tração de gel QIAquick da Qiagen (Valencia, CA). O produto de PCR foiquantificado pela medição da absorvância a 260 nm, tratado com DNA poli-merase T4 e anelado com o vetor seguindo os protocolos recomendadospelo fabricante para Clonagem Independente de Ligação (Novagen, Madi-son, Wl) e descrito anteriormente no Exemplo 1.
A transformação da reação de anelação no DH10B eletrocompe-tente foi efetuada sob condições padronizadas usando uma cubeta de 0,1cm e um sistema Bio-Rad Gene Pulser II conforme descrito no manual deeletroporação Bio-Rad. Clones contendo o gene HEX foram identificadospela análise de restrição e confirmados pelo seqüenciamento de DNA. SEQID Nos: 75 e 76 mostram seqüências de nucleotídeo e dos aminoácidos cor-respondentes do gene HEX e do produto do gene (HEXAspC aminotransfe-rase, também chamada de proteína HEX). Ver também o número de acessoNCBI 1AHF_A Gl:1127190 (seqüência de aminoácido).Expressão de gene e ensaios
DNA de plasmídeo (verificado por análise seqüencial) foi subclo-nado no hospedeiro de expressão BL21(DE3) (Novagen). As culturas cres-ceram em meio LB com 50 mg/L de canamicina e os plasmídeos foram iso-lados usando um kit de minipreparação de plasmídeo rotatório Qiagen, esubseqüentemente analisados por digestão de restrição para confirmar aidentidade. Experimentos de indução foram executados com o constructoBL21 (DE3) crescido em meio LB contendo 50 mg/L de canamicina a 37°C.
A expressão da proteína foi induzida usando IPTG 0,2 mM depois que aOD6oo alcançou aproximadamente 0,6. As células cresceram por 4 horas a30°C e colhidas por centrifugação. As células foram, a seguir, lisadas usan-do o reagente BugBuster® (Novagen) contendo 1 |iL/mL de benzonase nu-clease, 5 |iL/mL de grupo III de coquetel inibidor de protease Cabiochem e0,33 nL/10 mL de r-lisosima seguindo o protocolo recomendado pela Nova-gen. Depois da incubação a 25°C por 15 minutos com agitação cuidadosa,os fragmentos celulares foram peletizados por centrifugação a 21.000 x gpor 20 min a 4°C. O sobrenadante (extrato sem células) foi analisado porSDS-PAGE em géis de gradiente de 4 - 15% (Bio-Rad) para detectar os ní-veis de proteína solúvel da proteína de fusão recombinante. O nível de ex-pressão foi alto (aproximadamente 30 - 40% da proteína solúvel) e seme-lhante àquele observado para a proteína aspC aminotransferase.
A proteína HIS6-HEX foi purificada do extrato celular (preparadoconforme descrito acima) usando cromatografia de afinidade com metal imo-bilizado com cartuchos His-Bind 900 seguindo o protocolo do fabricante (No-vagen, Madison, Wl). (A seqüência de His6-sinalizador da proteína HIS6-HEX se liga aos cátions de Ni2+ divalentes imobilizados na resina His-Bindbaseada em IDA). As frações do eluente foram dessalinizadas em colunasPD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e eluídas em Tris-HCI 50mM, pH 7,0. A proteína purificada foi analisada por SDS-PAGE para a pure-za e a quantidade de proteína nas frações de purificação foi determinadausando o ensaio Pierce BCA com albumina de soro bovino como o padrão.
A proteína HIS6-HEX purificada e os extratos de células não-purificados foram analisados para a atividade da triptofano aminotransferaseusando o seguinte protocolo: a mistura reacional continha, em 1,0 ml_, tetra-borato de sódio 50 mM, pH 8,5, alfa-cetoglutarato 5 mM, piridoxal fosfato0,05 mM, arsenato de sódio 0,5 mM, EDTA 0,5 mM e enzima. Todos oscomponentes, exceto a enzima, foram misturados juntos, a enzima foi adi-cionada para iniciar a reação e a solução reacional foi incubada a 30°C por30 min. A reação foi interrompida pela adição de 0,2 ml_ de ácido tricloroacé-tico 20%, a mistura foi centrifugada a 21.000 rpm e o sobrenadante límpidofoi cuidadosamente removido. A absorvancia do sobrenadante foi medida a327 nm (máximo de absorvancia para indol-3-piruvato). Todas as reaçõescorreram em duplicata. Para comparação, as aminotransferases HIS6-tyrb eHIS6-aspC descritas no Exemplo 1 também foram analisadas usando omesmo protocolo. Os resultados estão mostrados na Tabela 2. Absorvanciaa 327 é proporcionalà concentração de indol-3-piruvato e pode ser usadapara determinar as atividades relativas de várias enzimas para um experi-mento particular.
Tabela 2
<table>table see original document page 66</column></row><table>
Os resultados listados na Tabela 2 mostram que a aminotransfe-rase HEXAspC tem aproximadamente uma atividade 40% maior para o trip-tofano do que a proteína AspC quando enzimas purificadas são usadas noensaio. O aumento na atividade é significativamente menor quando os extra-tos celulares são a fonte das enzimas. Isso pode ser devido à atividade inter-ferente das proteínas naturais da cepa de E. coli do hospedeiro. O produtodo gene TyrB é menos estável do que a proteína AspC e sua falta de estabi-lidade pode ser refletida no baixo nível de atividade observado para essaenzima. Além disso, o sinalizador de fusão His pode interferir com a corretaconformação da proteína e afetar adversamente sua atividade, ver os dadosabaixo. A atividade aumentada do mutante HEX da AspC no triptofano podeexplicar a melhoria nas quantidades de monatina formadas ao usar essaenzima conforme descrito abaixo nos Exemplos 9-10 (Tabelas 6 - 7). O mu-tante HEX da AspC é a enzima ótima para a produção de S,S-monatina nasreações com ProA aldolase de C. testosteroni.
EXEMPLO 3
Esse exemplo descreve métodos que foram usados para sub-clonar, expressar e analisar genes da aspC, tyrB e HEX aminotransferase eprodutos dos genes que foram construídos sem sinalizadores HISô amino-terminais. A atividade da aminotransferase foi medida seguindo a formaçãodo coproduto da reação, glutamato, por HPLC conforme descrito no Exemplo18.
Clonagem
Os seguintes iniciadores foram projetados para clonar os genesaspC, tyrB e HEX de E. coli no vetor pET30a (Novagen, Madison, Wl) (osmesmos iniciadores foram usados para aspC e HEX):
Iniciadores aspC/HEX:Expressão N:
5'-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3'(SEQ ID NO: 77);Expressão C:
5'-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQ ID NO:78);
79);
iniciadores tyrB:
Expressão N:
5'-GCGGCGCATATGGTGTTTCAAAAAGTTGACGC-3' (SEQ ID NO:Expressão C:
5'-CCAATAGGATCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3' (SEQ ID NO:80).
Um códon de início ATG foi adicionado em relação à seqüência codificante da tyrB para compatibilidade com a enzima de restrição e para níveis de expressão mais elevados. O seguinte protocolo de PCR foi usa-5 do para amplificação do gene: em 100 nL de reação, 50 ng de matriz de DNA, 1,0 uM de cada iniciador, 0,2 mM de cada dNTP, 1 U Pfu Turbo Poly-merase (Stratagene; LaJolla, CA) e 1 x de tampão Pfu clonado foram adicionados. O programa termociclizador utilizou um início quente de 94°C por 5 minutos, seguido por 25 ciclos de uma etapa desnaturante a 94°C (30 seg), uma etapa de anelação a 55°C (1 min) e uma etapa de extensão a 72°C (2 min) e finalmente uma etapa de finalização a 72°C (7 min). O DNA amplificado foi purificado usando um kit de purificação de PCR QIAquick® da Qia-gen (Valencia, CA). O DNA purificado e o DNA de plasmídeo purificado (pET30 purificado usando um kit de minipreparação de rotação QIAprep® da Qiagen) foi digerido com Ndel e BamHI de acordo com as instruções do fabricante (NEB; Beverly, MA). A digestão do vetor pET30a com Ndel remove a região de sinalização-HiS6 aminoterminal. O DNA digerido foi purificado a partir de um gel de ágarose de 1% usando um kit de extração de gel QIAquick® Qiagen (Valencia, CA). O produto de DNA de plasmídeo foi quantifi-cado pela medição da absorvância a 260 nm, e ligado usando um kit de ligação Quick Ligation (NEB). O DNA ligado foi transformado em células TOP10F' quimicamente competentes (Invitrogen; Carlsbad, CA). Clones com uma inserção foram identificados correndo DNA de plasmídeo purificado num gel de ágarose a 1%. Clones com uma inserção foram confirmados porseqüenciamento de DNA.
Expressão de gene e ensaios
DNA de plasmídeo (verificado por análise de seqüência) foi sub-clonado no hospedeiro de expressão BL21(DE3) (Novagen). As culturas cresceram em meio LB com 50 mg/L de canamicina. Experimentos de indução foram executados com o constructo BL21(DE3) crescido em meio LB contendo 50 mg/L de canamicina a 37°C. A expressão da proteína foi induzida usando IPTG 0,1 mM depois de a OD6oo alcançar aproximadamente 0,5.As células cresceram por 4 horas a 30°C e foram colhidas por centrifugação. As células foram, a seguir, lisadas usando o reagente BugBuster® (Novagen) contendo 1 uL/ml_ de benzonase nuclease, 5 ul/rnL do grupo III de coquetel inibidor de protease Calbiochem e 0,33 JlíL/10 ml_ de r-lisosima, seguindo o protocolo recomendado pela Novagen. Depois da incubação a 25°C por 15 min com agitação cuidadosa, os fragmentos celulares foram peletizados por centrifugação a 21.000 x g por 20 min a 4°C. O sobrenadante (extrato livre de célula) foi analisado por SDS-PAGE em géis de gradiente de 4 - 15% (Bio-Rad) para detectar níveis de proteína solúveis da proteína de fusão recombinante. O nível de expressão foi alto (aproximadamente 25 - 40% da proteína solúvel total) para todas as 3 proteínas e similar àquele observado para os constructos sinalizados com HIS6 pET30 correspondentes.
As proteínas AspC e TyrB não-sinalizadas foram ensaiadas para a atividade da triptofano aminotransferase usando o seguinte protocolo. A formação do coproduto da reação, glutamato, foi medida usando o método de detecção de fluorescência por HPLC descrito no Exemplo 18 ao invés da medição de formação do indol-3-piruvato conforme descrito acima no Exemplo 1. Nessa reação, triptofano reage estequiometricamente com o alfa-cetoglutarato para gerar indol-3-piruvato e glutamato. Glutamato é mais es-tável em solução aquosa do que o indol-3-piruvato e, dessa forma, essa medição pode produzir uma media mais acurada da atividade enzimática. A mistura reacional continha, em 1,0 ml_, Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, alfa-cetoglutarato 0,5 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, triptofano 5 mM e enzima. Todos os componentes, exceto a enzima, foram misturados juntos, a enzimafoi adicionada para iniciar a reação e a solução reacional foi incubada a 30°C por 60 min. A reação foi interrompida pela adição de 0,15 ml_ de ácido tricloroacético 20%, a mistura foi centrifugada a 21.000 rpm e o sobrenadante límpido foi cuidadosamente removido.
Os resultados (corrigidos para níveis de fundo de glutamato e para a diluição a partir da adição de ácido tri-cloroacético para precipitar as proteínas) estão mostrados na Tabela 3.Tabela 3
<table>table see original document page 70</column></row><table>
Esse resultado é surpreendente, uma vez que outros pesquisa-
dores observaram que a TyrB aminotransferase exibe uma atividade mais elevada com triptofano como o substrato do que AspC (Hayashi et al (1993) Biochemistry 32:12229-1239). O nível baixo não-esperado de atividade pode ser devido à instabilidade da proteína. Entretanto, o nível de atividade encontrado com a proteína TyrB não-identificada é consideravelmente mais elevado do que aquele visto com a versão sinalizada acima (ver Tabela 1). Devido ao fato do triptofano reagir estequiometricamente com alfa-cetoglutarato para gerar indol-3-piruvato e glutamato na reação da aminotransferase, a concentração de indol-3-piruvato formado (conforme mostrado na Tabela 1) e a concentração de glutamato formado (conforme mostrado na Tabela 3) refletem a mesma atividade. Entretanto, glutamato é mais estável em solução aquosa do que indol-3-piruvato e, dessa forma, sua medida po-de proporcionar uma medida mais acurada da atividade enzimática. A atividade relativa (ou proporção) de TyrB em relação ao AspC usando qualquer um dos métodos de detecção deve produzir o mesmo número, e é claro que a versão sinalizada de TyrB tem menos atividade no triptofano em comparação com o AspC sinalizado, enquanto que o TyrB não-sinalizado tem apro-ximadamente a mesma atividade que o AspC não-sinalizado.
EXEMPLO 4
Conversão de indol-3-lactato em indol-3-piruvato
Conforme mostrado nas figuras 1 e 3, ácido indol-3-lático pode ser usado para produzir indol-3-piruvato. A conversão entre ácido lático e piruvato é uma reação reversível, como é a conversão entre indol-3-piruvato e in-dol-3-lactato. A oxidação de indol-3-lactato foi tipicamente seguida devido à grande quantidade de fundo a 340 nm de indol-3-piruvato.
A mistura do ensaio padrão continha fosfato de potássio 100 mM, pH 8,0, NAD+ 0,3 mM, 7 unidades lactato desidrogenase (LDH) (Sigma-L2395,St. Louis, MO) e substrato 2 mM em 0,1 ml_. O ensaio foi efetuado em duplicata em um placa de microtitulação UV-transparente usando um leitor de placa SpectraMax Plus da Molecular Devices. Polipeptídeo e tampão foram misturados e pipetados em cavidades contendo o ácido indol-3-lático e NAD+ e a absorvância a 340 nm de cada cavidade foi lida em intervalos de 9 segundos depois de uma breve mistura. A reação foi mantida a 25°C por 5 minutos. O aumento na absorvância a 340 nm segue a produção de NADH a partir de NAD+. Controles negativos separados foram efetuados sem NAD+ e sem substrato. D-LDH de Leuconostoc mesenteroides (número de catálogo Sigma L2395) aparentou exibir mais atividade com substratos derivados do indol do que a L-DLH de Bacillus stearothermophilus (número de catálogo Sigma L5275).
Métodos similares foram utilizados com ácido D-lático e NAD+ ou NADH e piruvato, os substratos naturais dos polipeptídeos da D-LDH. AVmax para a redução de piruvato foi de 100 - 1000 vezes maior do que a Vmax para a oxidação de lactato. A Vmax para a reação de oxidação do indol-3-lático com D-LDH foi de aproximadamente um quinto daquela do ácido láti-co. A presença de indol-3-piruvato também foi medida seguindo a alteração na absorvância a 327 (o derivado de enol-borato) usando tampão de boratode sódio 50 mM contendo EDTA 0,5 mM e arsenato de sódio 0,5 mM. Alterações pequenas, porém repetíveis da absorvância foram observadas, em comparação com os controles negativos tanto para os polipeptídeos L quanto D-LDH.
Adicionalmente, lactato desidrogenases de ampla especificidade (enzimas com atividade associada com EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 e/ou EC 1.1.2.3) podem ser clonadas e usadas para fazer indol-3-piruvato a partir de ácido indol-3-lático. Fontes de desidrogenases de ampla especificidade incluem E. coli, Neisseria gonorrhoeae, e Lactobacillus plantarum.
Alternativamente, indol-3-piruvato pode ser produzido pelo contato de indol-3-lactato com extratos celulares de Clostridium sporogenes, os quais contêm uma indolelactato desidrogenase (EC 1.1.1.110); ou extratos celulares de Trypanosoma cruzi epimastigotes os quais contêm p-hidroxifenila-lactato desidrogenase (EC 1.1.1.222) conhecida por ter atividade no indol-3-piruvato; ou extratos celulares de Pseudomonas acidovorans ou E. coli, os quais contêm uma imidazolila lactato desidrogenase (EC 1.1.1.111); ou Coleus blumei, o qual contém uma hidroxifenilpiruvato reduta-5 se (EC 1.1.1.237); ou Cândida maltosa, a qual contém uma lactato desidrogenase D-aromática (EC 1.1.1.222). Referências descrevendo tais atividades incluem Nowicki et al. (FEMS Microbiol Lett 71:119-24, 1992), Jean e DeMoss {Canadian J. Microbiol. 14 1968, Coote e Hassall (Biochem. J. 111: 237-9, 1969), Cortese et al. {CR. Seances Soe. Biol. Fila. 162 390-5, 1968), Petersen e Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci. 43 501-4, 1988), e Bhatná-gar et al. {J. Gen Microbiol 135:353-60, 1989). Além disso, uma lactato oxi-dase tal como uma da Pseudomonas sp (Gu et al. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic: 18:299-305, 2002), pode ser utilizada para oxidação de indol-3-lático para indol-3-piruvato.
EXEMPLO 5
Conversão de L-triptofano em indol-3-piruvato utilizando a L-aminoácido oxidase
Esse exemplo descreve métodos usados para converter triptofa-no em indol-3-piruvato através de uma oxidase (EC 1.4.3.2) como uma alternativa ao uso de uma triptofano aminotransferase conforme descrito no E-xemplo 1. L-aminoácido oxidase foi purificada a partir de Crotalus durissus (Sigma, St. Louis, MO, número de catálogo A-2805). Os números de acesso das L-aminoácido oxidases para clonagem molecular incluem: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202,S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 e Z48565.
Reações foram efetuadas em tubos de microcentrífuga num volume total de 1 mL, incubada por 10 minutos durante a agitação a 37°C. A mistura reacional continha L-triptofano 5 mM, tampão de fosfato de sódio100 mM pH 6,6, arsenato de sódio 0,5 mM, EDTA 0,5 mM, tetraborato de sódio 25 mM, 0,016 mg de catalase (83 U, Sigma C-3515), 0,008 mg de FAD (Sigma) e 0,005 - 0,125 unidades de L-aminoácido oxidase. Controles nega-tivos continham todos os componentes exceto triptofano, e brancos continham todos os componentes exceto a oxidase. Catalase foi usada para remover o peróxido de hidrogênio formado durante a desaminação oxidativa. O arsenato e tetraborato de sódio foram usados para estabilizar a forma e-nol-borato do indol-3-piruvato, a qual mostra um máximo de absorvância a 327 nm. Padrões de indol-3-piruvato foram preparados em concentrações de 0,1-1 mM na mistura reacional.
A L-aminoácido oxidase comprada tinha uma atividade específica de 540 |ig de indol-3-piruvato formado por minuto por mg de proteína.
Essa é a mesma ordem de magnitude que a atividade específica das enzimas triptofano aminotransferase. EXEMPLO 6
Conversão de D-triptofano em indol-3-piruvato utilizando D-aminoácido oxidase
Esse exemplo descreve métodos usados para converter D-triptofano em indol-3-piruvato através de uma oxidase (EC 1.4.3.3) como uma alternativa para usar L-triptofano como o substrato de partida para a reação. D-aminoácido oxidase foi comprada da BioCatalytics (Pasadena, CA, catalog AOD-101).
Reações foram efetuadas em tubos de microcentrífuga num volume total de 1 ml_ e foram incubadas por 20 minutos durante a agitação a 30°C. A mistura reacional continha L-triptofano 5 mM, tampão de tetraborato de sódio 50 mM pH 8, arsenato de sódio 0,5 mM, EDTA 0,5 mM, 25,5 |iL de catalase de grau técnico (1000 U, BioCatalytics CAT-101), 0,008 mg de FAD(Sigma) e aproximadamente 10 mg de preparação bruta de D-aminoácido oxidase. A preparação de D-aminoácido oxidase continha uma grande quantidade de material insolúvel. Controles negativos continham todos os componentes, exceto a oxidase. Amostras correram em duplicata.
As amostras foram giradas para remover fragmentos e o sobrenadante foi diluído 10 vezes antes das medições de absorvância a 327 nm. As amostras diluídas tinham absorvancias entre 0,789 - 0,926, enquanto que os controles negativos (não-diluídos) tinham ODs de 0,418 e 0,416. Confor-me esperado, D-oxidases de ampla especificidade podem ser usadas para converter eficientemente D-triptofano em indol-3-piruvato.
EXEMPLO 7
Convertendo indol-3-piruvato em ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico com uma aldolase
Esse exemplo descreve métodos que podem ser usados para converter indol-3-piruvato no precursor da monatina ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico (MP) usando uma aldolase (liase) (FIGURA 2). Condensações aldólicas são reações que formam ligações carbono-carbono entre o carbono p de um aldeido ou cetona e o carbono carbonila de outro aldeido ou cetona. Um carbânion é formado no carbono adjacente ao grupo carbonila de um substrato, e serve como um nucleófilo atacando o carbono carbonila do segundo substrato (o carbono eletrofílico). Mais comumente, o substrato eletrofílico é um aldeido, de forma que a maioria das aldolasescaem na categoria da EC 4.1.2.-. Muito comumente, o substrato nucleofílico é piruvato. É menos comum para as aldolases catalisar a condensação entre dois cetoácidos ou dois aldeídos.
Entretanto, aldolases que catalisam a condensação de dois ácidos carboxílicos foram identificadas. Por exemplo, EP 1045-029 descreve a produção de ácido L-4-hidróxi-2-cetoglutárico a partir de ácido glioxílico e piruvato usando uma cultura de Pseudomonas (EC 4.1.3.16). Além disso, 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato aldolase (4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato piruvato liase, EC 4.1.3.17) pode catalisar a condensação de dois cetoácidos. Conseqüentemente, polipeptídeos de aldolase similares foram usadospara catalisar a condensação do indol-3-piruvato com o piruvato. A atividade ou enantioespecificidade dessas enzimas pode ser modificada para a produção de um estereoisômero específico da monatina.
Clonagem
4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato piruvato liases (por exemplo, ProA aldolase, EC 4.1.3.17) e 4-hidróxi-2-oxoglutarato liases (por exemplo, KHG aldolase, EC 4.1.3.16) catalisam reações muito semelhantes à reação da aldolase da FIGURA 2. Iniciadores foram projetados com projeções com-patíveis para o vetor pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, Wl). O projeto desses iniciadores está descrito acima no Exemplo 1.
Os seguintes iniciadores foram projetados para a clonagem do pET30 Xa/LIC:
1. Gene proA de Pseudomonas straminea (Pseudomonas ochraceaeNGJI) (No. de Acesso Genbank 12964663 Versão: 12964663) e gene proA de Comamonas testosteroni (SEQ ID NOS: 65-66, seqüência de ácido nu-cléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), "forward" 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3' e reversa 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3' (SEQ ID Nos: 55 e 56).
2. Gene SMc00502 de Sinorhizobium meliloti (homólogo ao pro-A, Nos. de Acesso Genbank: 15074579 e CAC46344, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente)"forward" 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3' e reversa 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3' (SEQ ID NOS: 61 e 62).
3. Gene fldZ de Sphingomonas sp. LB126 (No. de Acesso Genbank: 7573247 Versão: 7573247, codifica para uma acila transferase putati-va) "forward" 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3'e reversa 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3' (SEQ ID NOS: 57 e 58).
4. Gene pcmE de Arthrobacter keyseri (No. de Acesso Genbank: AF331043 Versão: AF331043.1, codifica para uma oxalocitramalato aldola-se). "forward" 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3' e reverso 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3' (SEQ ID NOS: 59 e 60).5. Gene YPO0082 da cepa C092 de Yersinia pestis (No. de A-cesso Genbank: 15978115 versão: 15978115 codifica para uma possível transferase).
"forward"
5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3' ereverso 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3' (SEQ ID NOS: 63 e 64).
6. Gene khg de Bacillus subtilis (Nos. de Acesso Genbank ■Z99115.1 Gl:2634478, 126711-127301 e CAB14127.1, seqüência de ácidonucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), "forward"
5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3' e reverso 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3' (SEQ ID NOS: 35 e 36).
7. Gene khg de E. coli (Nos. de Acesso Genbank .AE000279.11331-1972 e AAC74920.1, seqüência de ácido nucléico e de aminoácido, respectivamente).
"forward"
5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3'e reverso 5,-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3' (SEQ
ID NOS: 37 e 38).
8. Gene khg de S. meliloti (Nos. de Acesso Genbank
AL591792.1 Gl:15075850, 65353-64673 e CAC47463.1, seqüência de ácidonucléico e de aminoácido, respectivamente).
"forward"
5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3'e
reverso 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3' (SEQ
ID NOS: 39 e 40).
DNAs genômicos dos organismos descritos em 1-2 e 6-8 acima foram purificados usando o protocolo Qiagen Genomic -tip (Valencia, CA).
Usando técnicas similares, o DNA genômico dos organismos descritos em 3-5 pode ser purificado.Pseudomonas straminea (ATCC 33636) cresceu a 30°C em caldo nutriente e meio de hidroxibenzoato. Comamonas testosteroni (ATCC 49249) cresceu a 26°C em caldo nutriente e meio de hidroxibenzoato. S-phingomonas sp. LB126 (Flemish Institute for Technological Research, VITO, B-2400 Mol, Bélgica) cresceu de acordo com o método descrito por Wat-tiau et al. (Research in Microbiol. 152:861-72, 2001). Arthrobacter keyseri (Gulf Ecology Division, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, Gulf Breeze, FL 32561, EUA) cresceu de acordo com o protocolo descrito por Eaton (J. Bacteriol. 183:3689-3703, 2001). Sinorhizobium meliloti 1021 (ATCC 51124) cresceu a 26°C em meio TY ATCC e em meio de hidroxibenzoato. Cepa de Yersinia pestis C092 (ATCC) cresceu a 26°C em meio ATCC 739 de ágar sangue Horse. Bacillus subtilis 6051 (ATCC) cresceu a 30°C em caldo nutriente Be-reto (Difco; Detroit, Ml). DNA genômico de E. coli foi isolado da cepa DH10B(Invitrogen) conforme descrito no Exemplo 1.
Os protocolos de PCR, clonagem e varredura descritos no E-xemplo 1 foram usados para clonar as seqüências proA de S. meliloti e de C. testosteroni, assim como as seqüências khg de E. coli, B. subtilis e S. meliloti. Os mesmos métodos podem ser usdos para clonar as outras seqüências descritas acima. Para o gene proA de C. testosteroni, as condições de ane-lamento e extensão para o PCR foram 40 - 60°C por 1 minuto, 45 segundos (termociclizador de gradiente) e 72°C por 2 minutos, 15 segundos.
Clones positivos foram seqüenciados usando seqüenciamento de terminação da cadeia dideóxi (Seqwright, Houston, TX) com sinalizador S e iniciadores terminadores T7 (Novagen) e iniciadores internos da Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA).
Ensaios de expressão e atividade
DNA de plasmídeo (verificado por análise de seqüência) foi sub-clonado no hospedeiro de expressão BL21(DE3) (Novagen). As culturas cresceram em meio LB com 50 mg/L de canamicina, os plasmídeos isolados usando um kit de minipreparação de plasmídeo giratório Qiagen e subseqüentemente analisados por digestão de restrição para confirmar a identida-de. Experimentos de indução foram feitos com os constructos BL21(DE3) crescidos em meio LB contendo 50 mg/L de canamicina a 37°C. A proteína de expressão foi induzida usando IPTG 0,1 mM depois de a OD6oo ter alcançado aproximadamente 0,6. As células cresceram por 4 horas a 30°C e coletadas por centrifugação. As células foram, a seguir, lisadas usando o rea-gente BugBuster® (Novagen) e as proteínas recombinantes His-sinalizador foram purificadas usando cartuchos His-Bind conforme descrito acima (E-xemplo 1). Proteínas purificadas foram dessalinizadas em colunas descartáveis PD-10 e eluídas em tampão Tris-HCI 50 mM, pH7,3 com MgCI2 2 mM.
As proteínas foram analisadas por SDS-PAGE em géis de gradiente 4 - 15% para detectar níveis de proteína solúvel no PM previsto da proteína de fusão recombinante.
As proteínas foram ensaiadas para atividade usando indol-3-piruvato e piruvato de sódio como substratos. A mistura de ensaio continhaTris-HCI 100 mM (pH 7 - pH 8,9), MgCI2 0-8 mM, fosfato de potássio 3 mM (pH 8) e 6 mM de cada substrato em 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de quantidades variadas de polipeptídeo (por exemplo, de 10 a 100 jug) e foi incubada a 25°C - 37°C por 30 minutos, filtrada e a seguir congelada a -80°C.
Resultados de atividade com produtos de gene proA
Ambos os constructos do gene SMc00502 de S. meliloti e proA de C. testosteroni tiveram altos níveis de expressão quando induzidos com IPTG. As proteínas recombinantes foram altamente solúveis, conforme determinado por análise de SDS-PAGE de proteína total e amostras de extrato celular. O produto de gene de C. Testosteroni foi purificado até > 95% de pureza. Devido ao rendimento do produto de gene de S. Meliloti ter sido muito baixo depois da purificação por afinidade usando um cartucho de His-bind, o extrato celular foi usado para os ensaios enzimáticos.
Ambas as aldolases recombinantes catalisaram a formação deMP a partir de indol-3-piruvato e piruvato. A presença tanto de magnésio divalente quanto de fosfato de potássio foram necessárias para a atividade enzimática. Nenhum produto foi aparente quando indol-3-piruvato, piruvatoou fosfato de potássio estava ausente. Uma pequena quantidade do produto também foi formada na ausência de enzima (tipicamente uma ordem de magnitude a menos do que quando a enzima estava presente).
Usando o método de CL/EM descrito no Exemplo 18, o pico de produto eluiu a partir da coluna C18 de fase reversa levemente mais tarde do que o padrão de indol-3-piruvato, o espectro de massa desse pico mostrou um íon de origem induzido por colisão ([M+H]+) de 292,1, o íon de origem esperado para o produto MP. Os principais fragmentos do produto carregado da reação de um íon precursor fragmentos derivados presentes no espectro de massa incluíram aqueles com m/z = 158 (íon carbônio 1 H-indol-3-carbaldeído), 168 (íon carbônio 3-buta-1,3-dienila-1H-indol), 274 (292 -H20), 256 (292 - 2 H20), 238 (292 - 3 H20), 228 (292 - CH403) e 204 (perda de piruvato). O produto também exibiu um espectro de UV característico dos outros compostos contendo indol tais como triptofano, com o Xmax de 279-280 e um pequeno ombro em aproximadamente 290 nm.
A quantidade de MP produzida pela aldolase de C. Testosteroni aumentou com um aumento na temperatura reacional da temperatura ambiente até 37°C, quantidade de substrato e quantidade de magnésio. A atividade sintética da enzima diminuiu com o aumento do pH, o máximo de produto observado foi em pH 7. Baseando-se nos padrões de triptofano, a quantidade de MP produzida sob um ensaio padrão usando 20 |ig de proteína purificada foi de aproximadamente 10 - 40 \ig por um ml_ de reação.
Devido ao alto grau de homologia das seqüências codificadoras de aldolase proA de S. melilotie C. Testosteroni com os outros genes descritos acima, é esperado que todos os produtos de genes recombinantes possam catalisar essa reação. Além disso, é esperado que as aldolases que têm treonina (T) nas posições 59 e 87, arginina (R) na 119, aspartato (D) na 120 e histidina (H) na 31 e 71 (baseando-se no sistema de numeração da C. testosteroni) terão atividades similares. Homólogos adicionais foram seqüenciados e depositados no NCBI. Seus genes puderam ser clonados e espera-se que os produtos dos genes correspondentes tenham atividade similar. Números de identificação, assim como identidade porcentual em re-lação à proteína proA de C. Testosteroni e a identidade porcentual em relação à proteína ProA de S. Meliloti são fornecidos abaixo como exemplos de genes e proteínas que são esperados por ter atividade aldolase similar: Fonte de aldolase: Bradyrhizobium japonicum str. USDA 110 (proteína blr3842)
gene: NC_004463.1:4260815..4261498 proteína: Gl:27378953 (NP_770482.1) identidade porcentual em relação à ProA de C. testosteroni: 63 identidade porcentual em relação à ProA de S. meliloti: 63 Fonte de aldolase: Sphingomonas (Pseudomonas) paucimobilis gene: Gl:19918959 (AB073227.1:3738..4424) proteína: Gl: 19918963 (BAB88738.1)
identidade porcentual em relação à ProA de C. testosteroni: 65 identidade porcentual em relação à ProA de S. meliloti: 64 Fonte de aldolase: Yersinia pestis KIM
gene: AE013606.1 Gl:21956705 proteína: AAM83650.1 Gl:21956715
identidade porcentual em relação à ProA de C. testosteroni: 56
identidade porcentual em relação à ProA de S. meliloti: 57
Fonte de aldolase: CH34 de Ralstonia metallidurans
gene: NZ_AAAI02000016.1 GL48767334
proteína: ZP_00271743.1 G 1:48767386
identidade porcentual em relação à ProA de C. testosteroni: 60
identidade porcentual em relação à ProA de S. meliloti: 57 25 Fonte de aldolase: IP 32953 de Yersinia pseudotuberculosis
gene: NC_006155.1 Gl:51594359
proteína: YP_068627.1 Gl:51594436
identidade porcentual em relação à ProA de C. testosteroni: 56 identidade porcentual em relação à ProA de S. meliloti: 57 30 Fonte de aldolase: biovar viciae rhiz23g02-p1k_1009_341 de Rhizobium le-guminosarum (Sanger Institute) Gene:ATGGGCATCGTCGTACAGAACATACCACGGGGGGAAGCTGATGTGATC GACAGGCTCGCCAAATCAGGCGTCGCGACGGTCCACGAAGCCCAGGG GCGCAAAGGCATGCTCGCCAGCCATATGAGACCAATCTATTCAGGTGC GCAGATCGCCGGCTCCGCCATTACGATCTCCGCACCGCCCGGTGATAA CTGGATGATCCATGTGGCGATCGAGCAGATCCAGGCCGGCGACATCCT GGTGCTTTCGCCGACCTCGCCCTGTGACAACGGTTATTTCGGCGACCT GCTTGCCACCTCGGCGCGGGCGCGAGGTTGCCGCGGCCTTGTCATCG ACGCCGGTGTCCGCGATATCAGGGATCTGACCCAGATGCAGTTCCCCG TGTGGTCCAAGGCCGTGTCCGCGCAGGGGACCGTCAAGGAAACGCTCGGTTCGGTCAACGTTCCGATCGTCTGCGCTGGCGCCTTCATCGAAGCC GGCGACATCATCGTCGCCGACGACGACGGGGTGTGCGTGGTGAAGCT CAACGCGGCCGAGGAGGTTCTGACTGCTGCCGAGAACCGTGTGGCGA ACGAGGAGGCCAAGCGGCAACGCCTCGCCGCCGGCGAACTCGGGCTC GATATCTATGACATGCGGTCGAAGCTCCGGGAAAAGGGGCTTAAATATGTATGA (SEQ ID NO: 87) proteína:
MGIVVQNIPRAEADVIDRLAKSGVATVHEAQGRKGMLASHMRPIYSGAQIA GSAITISAPPGDNWMIHVAIEQIQAGDILVLSPTSPCDNGYFGDLLATSARARGCRGLVIDAGVRDIRDLTQMQFPVWSKAVSAQGTVKETLGSVNVPIVCAGA FIEAGDIIVADDDGVCVVKLNAAEEVLTAAENRVANEEAKRQRLAAGELGLD IYDMRSKLREKGLKYVW (SEQ ID NO: 88) identidade porcentual em relação à ProA de C. testosteroni: 58 identidade porcentual em relação à ProA de S. meliloti: 61 Fonte de aldolase: DSM 12444 de Novosphingobium aromaticivorans (F199 de Sphingomonas aromaticivorans contém o mesmo gene) gene: NZ_AAAV02000003.1 Gl:48848843 proteína: ZP_00303270.1 Gl:48849026 identidade porcentual em relação à ProA de C. testosteroni: 68 identidade porcentual em relação à ProA de S. meliloti: 63Fonte de aldolase: KT2440 de Pseudomonas putida Gene: AE016783.1 Gl:26557027 Proteína: AAN68126.1 Gl:24984081Identidade porcentual em relação a ProA de C. testosteroni ProA: 57
Identidade porcentual em relação a ProA de S. meliloti ProA: 60
Fonte de aldolase: MS-1 de Magnetospirillum magnetotacticum
gene: NZ_AAAP01003877.1 Gl:23016465
proteína: ZP_00056301.2 Gl:46200890
identidade porcentual em relação a ProA de C. testosteroni: 73
identidade porcentual em relação a ProA de S. meliloti ProA: 59
Fonte de aldolase: CGA009 de Rhodopseudomonas palustris
gene: NC_005296.1 Gl:39933080
proteína: NP_950032.1 GL39937756
identidade porcentual em relação a ProA de C. testosteroniProA: 74
identidade porcentual em relação a ProA de S. meliloti: 58
Fonte de aldolase: ATCC-33913 de Xanthomonas campestris
gene: AE012524.1 Gl:21115292
proteína: AAM43251.1 Gl:21115297
identidade porcentual em relação a ProA de C. testosteroni: 63
identidade porcentual em relação a ProA de S. meliloti: 64
Fonte de aldolase: citri 306 de Xanthomonas axonopodis
gene: AE012066.1 Gl:21110580
proteína: AAM38990.1 Gl:21110581
identidade porcentual em relação a ProA de C. testosteroni: 61
identidade porcentual em relação a ProA de S. meliloti: 62
Fonte de aldolase: MA-4680 de Streptomyces avermitilis
gene: NC_003155.3 GL57833846
proteína: NP_822793.1 Gl:29828159
identidade porcentual em relação a ProA de C. testosteroni: 49
identidade porcentual em relação a ProA de S. meliloti: 56
Resultados de atividade com os produtos de gene khg
Tanto os constructos de gene khg de B. subtilis e E. Coli tinham altos níveisde expressão de proteína quando induzidos com IPTG, enquanto que o khg de S. melilotiJ\nha um nível mais baixo de expressão. As proteínas recombi-nantes foram altamente solúveis, conforme julgado pela análise de SDS-PAGE de proteínas totais e extratos celulares. Os produtos do gene khg de B. subtilis e E. Coli foram purificados até > 95% de pureza; o rendimento do produto de gene de S. meliloti não foi tão alto depois da purificação por afinidade usando um cartucho His-Bind.
Não há evidências de que magnésio e fosfato sejam necessários para atividade para essa enzima. Entretanto, a literatura reporta a execução dos ensaios em tampão de fosfato de sódio, e a enzima é reportadamente bifuncio-nal e tem atividade nos substratos fosforilados tais como 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogluconato (KDPG). Os ensaios enzimáticos foram efetuados conformedescrito acima, e em alguns exemplos o fosfato foi omitido. Os resultados indicam que as KHG aldolases recombinantes produziram MP, mas não foram tão ativas quanto as ProA aldolases. Em alguns casos, o nível de MP produzido pela KHG foi quase idêntico à quantidade produzida por magnésio e fosfato sozinho. Fosfato não aparentou aumentar as atividades de KHG. Aenzima do Bacillus teve a atividade mais elevada, aproximadamente 20 -25% mais elevada do que o magnésio e fosfato sozinho, conforme determinado por CL/EM/EM (ver Exemplo 18). A enzima de Sinorhizobium teve a menor quantidade de atividade, a qual pode ser associada com problemas de dobragem e de solubilidade notados na expressão. Todas as três enzi-mas têm o sítio ativo de glutamato (posição 43 no sistema de numeração de B. Subtilis) assim como a lisina necessária para a formação da base de S-chiff com piruvato (posição 130); entretanto, a enzima de B. Subtilis contém uma treonina na posição 47, um resíduo de sítio ativo, ao invés de arginina. A KHG de B. Subtilis é menos e aparenta estar num grupo distinto das enzi-mas S. meliloti e E. Coli, com outras enzimas tendo o sítio ativo da treonina. As diferenças no sítio ativo podem ser a razão para a atividade aumentada da enzima B. Subtilis. Melhoria da atividade da aldolase
Anticorpos catalíticos podem ser tão eficientes quanto aldolases naturais, aceitam uma ampla faixa de substratos e podem ser usados para catalisar a reação mostrada na FIGURA 2.
Aldolases também podem ser melhoradas pela evolução direcionada, porexemplo, conforme anteriormente descrito para uma KDPG aldolase (altamente homóloga à KHG descrita acima) evoluída por embaralhamento de DNA e PCR propenso a erro para remover o requerimento por fosfato e para inverter a enantiosseletividade. Os polipeptídeos da KDPG aldolase são úteis em reações bioquímicas, uma vez que eles são altamente específicos para o substrato doador (aqui, piruvato), mas são relativamente flexíveis em relação ao substrato aceptor (isto é, indol-3-piruvato) (Koeller & Wong, Natu-re 409:232-239, 2001). KHG aldolase tem atividade para a condensação de piruvato com uma variedade de ácidos carboxílicos e aldeídos. Versões de mamíferos da KHG aldolase são consideradas como tendo uma enantioes-pecificidade mais ampla do que muitas versões bacterianas, incluindo uma atividade mais elevada no 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato e a aceitação de ambos os estereoisômeros do 4-hidróxi-2-cetoglutarato. A maioria das fontes bacterianas aparentam ter uma preferência de 10 vezes para uma configuração particular do produto de fusão.
Uma exceção é a enzima da bactéria Zymomonas mobilis a qual mostra menos seletividade ao substrato (aceitando uma ampla faixa de substratos) assim como requerimentos esteroquímicos de substrato relaxados, semelhante às enzimas isoladas de fontes de mamíferos, tais como fígado de rato (ref: Shelton et al (1996) J Am Chem Soe, 118(9):2117-2125. Há aproximadamente 100 homólogos de KHG disponíveis em bancos de dados genômicos, e atividade tem sido demonstrada em Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli e em tecidos animais. Essas enzimas podem ser usadas como um ponto de partida para adaptar a enantioespeci-ficidade que é desejada para a produção de monatina.
Aldolases que utilizam piruvato e outro substrato que é ou um cetoácido e/ou tem um grupo hidrofóbico volumoso como indol podem ser "evoluídas" para adaptar a especificidade, velocidade e seletividade do polipeptídeo. Além das KHG e ProA aldolases aqui demonstradas, exemplos dessas enzimas incluem, mas não estão limitados, a: KDPG aldolase e polipeptídeos relacionados (KDPH); transcarboxibenzalpiruvato hidratase-aldolase a partir de No-cardioides st; 4-(2-carboxifenila)-2-oxobut-3-enoato aldolase (2'-carboxibenzalpiruvato aldolase) a qual condensa piruvato e 2-carboxibenzaldeído (um substrato contendo anel aromático); trans-O-hidroxibenzilidenopiruvato hidratase-aldolase de Pseudomonas putida e S-phingomonas aromaticivorans, a qual também utiliza piruvato e um aldeído contendo aromático como substratos; 3-hidroxiaspartato aldolase (eritro-3-hidróxi-L-aspartatoglioxilatoliase), a qual usa 2-oxoácidos como os substratos e é considerada como estando no organismo Micrococcus denitrificans; benzoin aldolase (benzaldeído liase), a qual utiliza substratos contendo grupos benzila; diidroneopterina aldolase; L-treo-3-fenilserinabenzaldeído-liase (fenilserina aldolase), a qual condensa com benzaldeído; 4-hidróxi-2-oxovalerato aldolase; 1,2-diidroxibenzilpiruvato aldolase; e 2-hidroxibenzalpiruvato aldolase.
Usando ensaios similares àqueles descritos acima, e os métodos de detecção descritos no Exemplo 18, isocitrato liase, ácido N-acetilneuramínico sinase, citrato liase, triptofanase e certos mutantes, beta-tironase e certos mu-tantes, PLP, anticorpos de aldolase catai íticos, triptofano sintase(s) não aparentam converter de maneira detectável indol-3-piruvato em MP sob as condições testadas.
Um polipeptídeo com a atividade desejada pode ser selecionado pela varredura de clones de interesse usando os seguintes métodos. Auxotrofos de triptofano são transformados com vetores que carregam os clones de interesse num cassete de expressão e crescem num meio contendo pequenas quantidades de monatina ou MP. Uma vez que as reações das aminotrans-ferases e da aldolase são reversíveis, as células são capazes de produzir triptofano a partir de uma mistura racêmica de monatina. Similarmente, organismos (tanto recombinantes quanto de tipo selvagem) podem ser testados pela capacidade de utilizar MP ou monatina como uma fonte de carbono e energia. Uma fonte de aldolases alvo são as bibliotecas de expressão de várias cepas de Pseudomonas e rizobactérias. Pseudomonas têm muitas vias catabólicas incomuns para a degradação de moléculas aromáticas e elas também contêm muitas aldolases; enquanto as rizobactérias contêm aldolases, são conhecidas por crescer na rizosfera vegetal e têm muitos dosgenes descritos para a construção de uma via biossintética para a monatina. EXEMPLO 8
Síntese Química do Precursor de Monatina
Exemplo 7 descreveu um método de uso de uma aldolase para converter indol-3-piruvato no precursor de monatina ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico (MP). Esse exemplo descreve um método alternativo de sintetizar quimicamente MP.
MP pode ser formado usando uma condensação do tipo aldólica típica (FIGURA 4). Resumidamente, uma reação do tipo aldólica típica en-volve a geração de um carbânion do éster piruvato usando uma base forte, tal como LDA (diisopropilamida de lítio), hexametildisilazano de lítio ou buti-la-lítio. O carbânion que é gerado reage com o indol-piruvato para formar o produto acoplado.
Grupos protetores que podem ser usados para proteger o nitrogênio de indol incluem, mas não estão limitados, a: t-butiloxicarbonila (Boc) e benziloxicarbonila (Cbz). Grupos de bloqueio para os ácidos carboxílicos incluem, mas não estão limitados, a ésteres alquílicos (por exemplo, ésteres benzílicos, metilílicos, etílicos,). Quando tais grupos protetores são usados, não é possível controlar a estereoquímica do produto que é formado. Entretanto, se R2 e/ou R3 são grupos protetores quirais (FIGURA 4), tais como (S)-2-butanol, mentol ou uma amina quiral, isso pode favorecer a formação de um enantiômero MP em relação ao outro. EXEMPLO 9
Conversão de triptofano ou indol-3-piruvato em monatina
Um processo in vitro utilizando duas enzimas, uma aminotrans-ferase e uma aldolase, produziram monatina a partir de triptofano e piruvato. No primeira etapa, alfa-cetoglutarato foi o aceptor do grupo amino a partir de triptofano em um reação de transaminação gerando indol-3-piruvato e glu-tamato. Uma aldolase catalisou a segunda reação na qual piruvato reagiu com indol-3-piruvato, na presença de Mg2+ e fosfato, gerando um alfa-ceto derivado da monatina (MP), ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico. A transferência do grupo amino do glutamato formado na pri-meira reação produziu o produto desejado, monatina. A purificação e caracterização do produto estabeleceu que o isômero formado foi S,S-monatina. Substratos alternativos, enzimas e condições estão descritos assim como melhorias que foram feitas para esse processo.
Enzimas
A aldolase, 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato piruvato liase (proA aldolase, gene proA) (EC 4.1.3.17) de Comamonas testosteroni foi clonada, expressa e purificada conforme descrito no Exemplo 7. As 4-hidróxi-2-oxoglutarato glioxilato liases (KHG aldolases) (EC 4.1.3.16) de B. subtilis, E. oli, e S. meliloti foram clonadas, expressas e purificadas conforme descrito no Exemplo 7.
As aminotransferases usadas juntamente com as aldolases para produzir monatina foram a L-aspartato aminotransferase codificada pelo gene aspC de E. coli, a tirosina aminotransferase codificada pelo gene tyrB de . coli, a enzima TatA de S. meliloti, a aminotransferase de substrato amplo codificada pelo gene bsat de L major ou a transaminase glutâmico-oxaloacético de coração de porco (Tipo Ma). A clonagem, expressão e purificação das proteínas não-mamíferas estão descritas no Exemplo 1. A transaminase glutâmico-oxaloacético de coração de porco (tipo Ma) foi obtida da Sigma (Ne G7005).
Método usando a ProA aldolase e a L-aspartato aminotransferase
A mistura reacional continha acetato de amônio 50 mM, pH 8,0, MgCI2 4 mM, fosfato de potássio 3 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, piruvato de amônio 100 mM, triptofano 50 mM, alfa-cetoglutarato 10 mM, 160 mg de proA aldolase de C. testosteroni recombinante (extrato de célula não-purificado, -30% de aldolase), 233 mg de L-aspartato aminotransferase de E. coli recombinante (extrato de célula não-purificado, -40% de aminotransferase) em um litro. Todos os componentes, exceto as enzimas, foram mistu-rados juntos e incubados a 30°C até o triptofano dissolver. As enzimas foram, a seguir, adicionadas e a solução reacional foi incubada a 30°C com agitação suave (100 rpm) por 3,5 horas. A 0,5 e 1 hora depois da adição daenzimas, alíquotas de triptofano sólido (50 mmols cada) foram adicionadas à reação. Todo o triptofano adicionado não dissolveu, mas a concentração foi mantida a 50 mM ou mais. Depois de 3,5 horas, o triptofano sólido foi retirado por filtração. A análise da mistura reacional por CL/EM usando uma quantidade definida de triptofano como um padrão mostrou que a concentração de triptofano na solução foi de 60,5 mM e a concentração de monatina foi de 5,81 mM (1,05 g).
O seguintes métodos foram usados para purificar o produto final. Noventa por cento da solução límpida foi aplicada a uma coluna de resina AG50W-X8 BioRad (225 ml_; capacidade de ligação de 1,7 meq/mL). A coluna foi lavada com água, coletando frações de 300 ml_, até a absorvância a 280 nm ser de < 5% da primeira fração de fluxo contínuo. A coluna foi, a seguir, eluída com acetato de amônio 1 M, pH 8,4, coletando 4 frações de 300 ml_. Todas as 4 frações continham monatina e foram evaporadas até 105 mL 5 usando um rotaevaporador com um banho de água morna. Um precipitado se formou conforme o volume reduziu e foi removido por filtração durante o curso do processo de evaporação.
Análise das frações da coluna por CL/EM mostraram que 99% do triptofano e monatina se ligaram à coluna. O precipitado que se formoudurante o processo de evaporação continha >97% de triptofano e <2% de monatina. A proporção de triptofano em relação ao produto no sobrenadante foi de aproximadamente 2:1.
O sobrenadante (7 ml_) foi aplicado a uma coluna DEAE Sepha-rose de fluxo rápido de 100 mL (Amersham Biosciences) previamente con-vertida na forma de acetato pela lavagem com 0,5 L de NaOH 1 M, 0,2 L de água, 1,0 L de acetato de amônio 1,0 M, pH 8,4 e 0,5 L de água. O sobrenadante foi carregado em <2 mL/min e a coluna foi lavada com água a 3 - 4 mL/min até a absorvância a 280 nm ser ~0. Monatina foi eluída com acetato de amônio 100 mM, pH 8,4, coletando 4 frações de 100 mL.
Análise das frações mostrou que a proporção de triptofano emrelação à monatina nas frações de fluxo contínuo foi de 85:15 e a proporção nas frações eluentes foi de 7:93. Assumindo que o coeficiente de extinção a280 nm de monatina é o mesmo que o triptofano, as frações de eluente continham 0,146 mmol de produto. A extrapolação para a reação de 1L total poderia produzir -2,4 mmols (-710 mg) de monatina, para uma recuperação de 68%.
As frações de eluente da coluna DEAE Sepharose foram evaporadas até < 20 ml_. Uma alíquota do produto foi adicionalmente purificada pela aplicação a uma coluna de fase reversa preparativa C8 usando as mesmas condições cromatográficas que aquelas descritas no Exemplo 18 para a caracterização de monatina em escala analítica. O programa de computador Fractionlynx® da Waters foi empregado para disparar a coleta de fração automática da monatina baseando-se na detecção do m/z = 293 íon. A fração da coluna C8 com o correspondente íon molecular protonado para a monatina foi coletada, evaporada até a secura e, a seguir, dissolvida num pequeno volume de água. Essa fração foi usada para a caracterização do produto.
O produto resultante foi caracterizado usando os seguintes métodos.
Espectroscopia UV/visível. Medições espectroscópicas de UV/visível de monatina produzida enzimaticamente foram efetuadas usandoum espectrofotômetro de UV/visível Cary 100 Bio. O produto purificado, dissolvido em água, mostrou um máximo de absorção de 280 nm com um ombro a 288 nm, características típicas dos compostos contendo indol.
Análise de CL/EM. Análises de misturas para monatina derivada das reações bioquímicas in vitro foram executadas conforme descrito no Exemplo 18. Uma análise de CL/EM típica de monatina em um mistura sintética enzimática in vitro é ilustrada na FIGURA 5. O painel inferior da FIGURA 5 ilustra um cromatograma de íon selecionado para o íon molecular protonado de monatina em m/z = 293. Essa identificação da monatina na mistura foi corroborada pelo espectro de massa ilustrado na FIGURA 6. Análise do pro-duto purificado por CL/EM mostrou um único pico com um íon molecular de 293 e absorvância a 280 nm. O espectro de massa foi idêntico àquele mostrado na FIGURA 6.Análise de EM/EM. Experimentos de íon de produto carregado da reação de um íon precursor CL/EM/EM, conforme descritos no Exemplo 18, foram também efetuados na monatina. Um espectro de massas de produto carregado da reação de um íon precursor de monatina está ilustrado na FIGURA 7. Tentativas de designações estruturais de todos os íons de fragmentos marcados na FIGURA 7 foram feitas. Essas incluem os íons de fragmentos de m/z = 275 (293 - H20), 257 (293-(2 x H20)), 230 (275-COOH), 212 (257-COOH), 168 (íon carbônio 3-buta-1,3-dienila-1 H-indol), 158 (íon carbônio 1H-indol-3-carbaldeído), 144 (íon carbônio 3-etila-1H-indol), 130 (íon carbônio 3-metileno-1 H-indol) e 118 (íon carbônio indol). Muitos desses são os mesmos que aqueles obtidos para MP (Exemplo 7), conforme esperado se derivado da porção indol da molécula. Alguns são 1 unidade de massa maiores do que aqueles vistos para MP, devido à presença de um grupo amino ao invés de uma cetona. *
Medição de massa precisa da monatina. FIGURA 8 ilustra o espectro de massa obtido para a monatina purificada empregando um espec-trômetro de massa quadrupolo híbrido/tempo de vôo Q-Star da Applied Bi-osystems-Perkin Elmer. A massa medida para a monatina protonada usando triptofano como um padrão de calibração de massa interno foi de 293,1144.
A massa calculada de monatina protonada, baseando-se na composição elemental, C14H17N2O5, é 293,1137. Esse é um erro de medida de massa menor do que 2 partes por milhão (ppm), proporcionando evidência conclusiva da composição elemental de monatina produzida enzimaticamente.
Espectroscopia de RMN. Os experimentos de RMN foram efetuados num instrumento de 500 MHz Varian Inova. A amostra de monatina (~ 3 mg) foi dissolvida em 0,5 ml_ de D20. Inicialmente, o solvente (D20) foi usado como a referência interna a 4,78 ppm. Uma vez que o pico para a á-gua foi grande, o RMN-1H correu com supressão do pico para a água. Subseqüentemente, devido à largura do pico da água.o próton C-2 da monatina foi usado como o pico de referência, e estabelecido no valor publicado de 7,192 ppm,
Para RMN-13C, uma corrida inicial de várias centenas de varre-duras indicou que a amostra foi muito diluída para obter um espectro de 3C adequado no tempo designado. Conseqüentemente, um experimento de coerência quântico múltiplo heteronuclear (HMQC) foi efetuado, o qual capacitou a correlação dos hidrogênios e dos carbonos para os quais eles foram ligados, e também fornecendo informação das alterações químicas dos carbonos.
Um resumo dos dados de 1H e de HMQC é mostrado nas Tabelas 4 e 5. Pela comparação com os valores publicados, os dados de RMN indicaram que a monatina enzimaticamente produzida foi ou (S,S), (R,R) ou uma mistura de ambas.
Análise de CL/EM quiral. Para estabelecer que a monatina produzida in vitro foi um isômero, e não uma mistura dos enantiômeros (R,R) e (S,S), análises de CL/EM quiral foram executadas usando a instrumentação descria no Exemplo 18.
Separações de CL quiral foram feitas usando uma coluna decromatografia quiral Chirobiotic T (Advanced Separations Technology) em temperatura ambiente. Separação e detecção, baseando-se nos protocolos publicados do vendedor, foram otimizadas para os isômeros R-(D) e S-(L) do triptofano. A fase móvel da CL consistiu em A) água contendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoracético; B) metanol contendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoracéti-co. A eluição foi isocrática a 70% de A e 30% de B. A taxa de fluxo foi de 1,0 mL/min, e a absorvância PDA foi monitorada de 200 nm até 400 nm. Os pre-definidos instrumentais usados para CL/EM quiral de triptofano e monatina são idênticos àqueles descritos no Exemplo 18 para análise de CL/EM. A coleta de espectro de massa para a região m/z 150 - 400 foi utilizada. Os cromatogramas de íons selecionados para íons moleculares protonados ([M+H]+ = 205 tanto para o R- quanto para o S- triptofano e [M+H]+ = 293 para monatina) permitiram a identificação direta desses analitos nas misturas.
Os cromatogramas de R- e S- triptofano e monatina, separadospor cromatografia quiral e monitorados por EM, estão mostrados na FIGURA 9. O único pico no cromatograma de monatina indica que o composto é umisômero, com um tempo de retenção quase idêntico ao S-triptofano. Tabela 4
Dados de RMN 1H
<formula>formula see original document page 92</formula>
<table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table>
Vleggaar et ai (J. C. S. Perkin Trans. 1:3095-8, 1992)
Polarimetria. A rotação ótica foi medida num polarímetro Rudol-
ph Autopol III. A monatina foi preparada como uma solução 14,6 mg/mL em água. A rotação específica esperada ([a]D20) para a S,S monatina (forma de sal) é de -49,6 para uma solução 1g/ml_ em água (Vleggaar et ai). A [oc]D20 observada foi de -28,1 para a monatina enzimaticamente produzida e purificada, indicando que esse foi o isômero S,S. Melhorias
As condições reacionais, incluindo as concentrações de enzima e reagente, foram otimizadas e os rendimentos de 5 - 10 mg/mL foram produzidos usando a seguinte mistura reacional: acetato de amônio 50 mM pH 8,3, MgCI2 2 mM, piruvato 200 mM (sal de sódio ou amônio), alfa-cetoglutarato 5 mM (sal de sódio), piridoxal fosfato 0,05 mM, água desaera-da para alcançar um volume final de 1 ml_ depois da adição das enzimas, fosfato de potássio 3 mM, 50 ng/ml_ de ProA aldolase recombinante (extrato celular; concentração de proteína total de 167 u.g/mL), 1000 ng/ml_ de L-aspartato aminotransferase codificada pelo gene aspC de E. coli (extrato celular; concentração de proteína total de 2500 ^ig/mL e triptofano sólido para produzir uma concentração de >60 mM (saturado; certa quantidade não-dissolvida por toda a reação). A mistura foi incubada a 30°C por 4 horas com mistura ou agitação moderada. Substituições
A concentração de alfa-cetoglutarato pode ser reduzida para 1 mM e suplementada com 9 mM de aspartato com um rendimento equivalen-te de monatina. Aceptores de aminoácido alternativos podem ser utilizadosno primeira etapa, tal como oxaloacetato.
Quando a aminotransferase de substrato amplo de L major re-combinante foi usada no lugar da L-aspartato aminotransferase de E. coli,rendimentos similares de monatina foram alcançados. Entretanto, um se-gundo produto não-identificado (3 - 10% do produto principal) com umamassa molecular de 292 também foi detectado por análise de CL-EM. Con-centrações de monatina de 0,1 - 0,5 mg/mL foram produzidas quando a en-zima codificada tyrB de E. coli, a enzima codificada tat A de S. meliloti ou aglutâmico-oxaloacético transaminase de coração de porco (tipo lia) foi adi-cionada como a aminotransferase. Ao iniciar a reação a partir de indol-3-piruvato, uma aminação redutiva pode ser feita para o última etapa com aglutamato desidrogenase e NADH (como no Exemplo 15).
As KHG aldolases de B. subtilis, E. coli, e S. meliloti também fo-ram usadas com a L-aspartato aminotransferase de E. coli para produzirmonatina enzimaticamente. As seguintes condições reacionais foram usa-das: NH4-OAc 50 mM pH 8,3, MgCI2 2 mM, piruvato 200 mM, glutamato 5mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, água desaerada para alcançar um volumefinal de 0,5 ml_ depois da adição de enzimas, fosfato de potássio 3 mM, 20ug/mL de KHG aldolase de B. subtilis recombinante (purificada), ca. 400|ig/ml_ de L-aspartato aminotransferase de E. coli (AspC) não-purificada apartir de extrato celular e indol-3-piruvato 12 mM. As reações foram incuba-das a 30°C por 30 minutos com agitação. A quantidade de monatina produ-zida usando a enzima B. subtilis foi de 80 ng/mL, e aumentou com quantida-des crescentes de aldolase. Se indol-3-piruvato e glutamato foram substituí-dos por quantidades saturantes de triptofano e alfa-cetoglutarato 5 mM, aprodução de monatina foi aumentada até 360 ng/mL. Reações foram repeti-das com 30 |ig/mL cada das três enzimas KHG em Tris 50 mM pH 8,3, comquantidades saturantes de triptofano, e foram deixadas prosseguir por uma
hora para aumentar a detecção. A enzima Bacillus tinha a mais alta atividadecomo no Exemplo 7, produzindo aproximadamente 4000 ng/mL de monatina.
A KHG de E. coli produziu 3000 ng/ml de monatina, e a enzima de S. melilotiproduziu 2300 ng/mL.
EXEMPLO 10
Conversão de triptofano em monatina usando ProA aldolase eAspC, TyrB, ou HEXAspC aminotransferases com e sem sinalizadores HIS6aminoterminais.
O processo in vitro utilizando duas enzimas para produzir mona-tina a partir de triptofano, descrito no Exemplo 9, foi ainda examinado usan-do três aminotransferases construídas com e sem sinalizadores HIS6 amino-terminais.
Enzimas
O gene da aldolase proA de Comamonas testosteroni foi clona-do e expresso conforme descrito no Exemplo 7. O produto do gene desseconstructo de gene carrega o sinalizador HIS6 terminal do sistema pET30.
Os genes da aminotransferase aspC e tyrB construídos com osistema de sinalizador HIS6 pET30 aminoterminal foram clonados e expres-sos conforme descrito no Exemplo 1. O gene HEX construído com o sistemade sinalização HIS6 pET30 aminoterminal foi clonado e expresso conformedescrito no Exemplo 2. Versões não-sinalizadas dos três genes da amino-transferase foram clonadas e expressas conforme descrito no Exemplo 3.
Expressão do gene e ensaio de produção de monatina
Usando extratos de células contendo a proteína aminotransferase
Extratos de células contendo os produtos de gene proA, aspC,tyrB, e HEX foram preparados a partir de culturas crescidas em meio LB com50 mg/mL de canamicina. As proteínas foram induzidas pela adição de IPTG0,2 mM depois de a OD60o ter alcançado aproximadamente 0,5. As célulascresceram por 4 horas a 30°C depois da indução e coletadas por centrifuga-ção. As células lavadas foram lisadas usando reagente BugBuster® (Nova-gen) contendo 1 fiL/ml_ de benzonase nuclease, 5 |iL/ml_ do grupo III do co-quetel inibidor de protease Calbiochem e 0,33 fj.L/10 ml_ de r-Lisosima se-guindo o protocolo recomendado pela Novagen. Depois da incubação a25°C por 15 min com agitação moderada, os fragmentos celulares forampeletizados por centrifugação a 21.000 x g por 20 min a 4°C e o sobrenadan-te foi cuidadosamente removido (extrato celular).
A concentração de proteína foi estimada usando o kit de ensaiode proteína Pierce BCA num formiato de placa de 96 cavidades. O volumede ensaio total por cavidade foi de 200 Duzentos \xL de reagente funcio-nante foi adicionado a 10 u.L de solução de proteína em cada cavidade. Al-bumina de soro bovino (catálogo Pierce NQ23209) foi utilizado para a deter-minação da curva padrão (0 a 1,0 mg/mL). A absorvância das amostras epadrões do ensaio foram medidas a 562 nm.
A formação de monatina a partir de triptofano foi examinada u-sando enzimas não-purifiçadas. O nível de expressão para as duas proteí-nas foi alto no seguinte exemplo (30 a 40% da proteína solúvel total). Entre-tanto, outros extratos celulares também puderam ser usados, nos quais onível de expressão é mais baixo, por exemplo, de 5 a 30% da proteína solú-vel total, ou mais alto, por exemplo, mais alto do que 40% da proteína solú-vel total. A mistura reacional continha, em um ml_, 100 mM de acetato desódio, pH 8,0, MgCI2 4 mM, fosfato de potássio 3 mM, piridoxal fosfato 0,05mM, piruvato de sódio 200 mM, triptofano 50 mM, alfa-cetoglutarato 10 mM,112 u.g de ProA aldolase de C. testosteroni recombinante (extrato de célulasnão-purificado contendo -30% de aldolase (calculada como porcentagem daproteína solúvel total)) e ou 1000 |ig ou 10 |ig de aminotransferase recombi-nante (extrato de célula não-purificado contendo -40% de aminotransferase(calculada como porcentagem da proteína solúvel total)). O triptofano foi adi-cionado como um sólido. Todos os componentes, exceto as enzimas, forammisturados juntos e incubados a 30°C até o triptofano dissolver. As enzimasforam, a seguir, adicionadas e a solução reacional foi incubada a 30°C comagitação moderada por 1 h. As misturas reacionais foram analisadas para aformação de monatina por CL/EMEM MRM conforme descrito no Exemplo18. Tabela 6 lista a atividade das enzimas como a concentração de produtoformado na incubação de 1 h. Esses resultados mostram que não há dife-rença significativa entre a quantidade de monatina formada a partir de tripto-fano quando as aminotransferases AspC ou HEXAspC são fundidas com osinalizador HIS6 pET30 aminoterminal ou quando elas foram expressas co-mo as proteínas naturais. Ao contrário, a proteína TyrB sinalizada produzmenos produto em comparação com a proteína tyrB não-sinalizada. A TyrBnão-identificada produz aproximadamente 25 - 75% do nível de produto ob-servado nas misturas reacionais de aminotransferase AspC ou HEXAspC,dependendo da quantidade total de enzima aminotransferase adicionada.
Tabela 6
<table>table see original document page 97</column></row><table>
*abaixo do nível de detecção
Quando meio não-ótimo, concentrações indutoras ou tempos deindução foram utilizados, o nível de expressão da AspC ou ProA diminuiu(por exemplo, até aproximadamente 10 - 20% da proteína solúvel total).Nesses casos, quantidades adicionais de extratos celulares foram usadascom resultados equivalentes.
Usando proteínas aminotransferase purificadas
As aminotransferases foram purificadas a partir de extratos celu-lares dos constructos pET30 identificados (preparados conforme descritoacima) usando cromatografia de afinidade com metal imobilizado com cartu-chos His-Bind seguindo os protocolos do fabricante (Novagen, Madison, Wl).A seqüência de sinalização HISô das proteínas de fusão se ligam aos cátionsNi2+ equivalentes imobilizados em resina His-Bind baseada em IDA. As fra-ções de eluente foram dessalinizadas em colunas PD-10 (Amersham Biosci-ences, Piscataway, NJ) e eluídas em Tris-HCI 50 mM, pH 7,0. As proteínaspurificadas foram analisadas por SDS-PAGE para a pureza e a quantidadede proteína nas frações foi determinada usando o ensaio Pierce BCA comalbumina de soro bovino como padrão.
A formação de monatina a partir de triptofano foi examinada u-sando aminotransferase AspC, HEXAspC ou TyrB purificada e aldolase proAnão-purificada. A mistura reacional continha, em 0,5 ml_, Tris-HCI 50 mM, pH8,0, MgCI2 4 mM, fosfato de potássio 3 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, piru-vato de sódio 200 mM, triptofano -50 mM, alfa-cetoglutarato 5 mM, 165 jigde ProA aldolase de C. testosteroni recombinante (extrato de célula não-purificado contendo -30% de aldolase (calculada como a porcentagem dototal de proteína solúvel)) e ou 64 \lq ou 10 \ig de aminotransferase de E.coli recombinante purificada. O triptofano foi adicionado como um sólido.
Todos os componentes, exceto as enzimas, foram misturados juntamente eincubados a 30°C até o triptofano dissolver. As enzimas fora, a seguir, adi-cionadas e a solução reacional foi incubada a 30°C com agitação moderadapor 2 h. As misturas reacionais foram diluídas 10 vezes e analisadas quantoa formação de monatina por CL-EM/EM MRM conforme descrito no Exemplo18. Tabela 7 lista a atividade das enzimas como a concentração de produtoformado na incubação de 2 h.
Tabela 7
<table>table see original document page 98</column></row><table>
25 Os resultados da Tabela 7 mostram que com quantidades limi-tantes de aminotranferases purificadas e com um grande excesso da aldola-se (não-purificada), a reação da HEXAspC aminotransferase produz váriasvezes mais monatina do que a reação da AspC aminotransferase (escassa-mente mensurável vs 0,0879 g/L. Com concentrações de aminotransferasemaiores, o aumento é de cerca de 20%. Similarmente, entretanto, diferençasmenos notáveis foram observadas com as enzimas não-purificadas (ver Ta-bela 6).
O gene ProA aldolase de Comamonas testosteroni e o geneHEX da aspartato aminotransferase sem o sistema de sinalização HIS6 tam-bém foram clonados no derivado pET23a (Novagen) nos sítios Ndel e Xholda seqüência de clonagem múltipla. Extratos celulares desses constructosforam preparados a partir de culturas induzidas ou com IPTG ou com lactosee foram usados como a fonte de enzimas para a produção enzimática demonatina. As reações foram executadas em 50 mL usando um dos três tam-pões sulfonato (MOPS, ácido 3-(N-morfolio)propanossulfônico; HEPES, áci-do 4-(2-hidroxietila)poperazina-1-sulfônico; TAPS, ácido 2-hidróxi-1,1-bis(hidroximetila)etila)amino)-l-propanossulfônico) em um faixa de pH de 7,5a 8,9. As reações continham tampão 50 mM, MgCI2 2 mM, piruvato 200 mM,glutamato 5 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, água desaerada para alcançarum volume final de 50 mL depois da adição das enzimas, fosfato de potássio3 mM, 194 ng/mL de extrato de células ProA aldolase (contendo -50 ^ig/mLde aldolase) e ou 281 fig/mL ou 2810 u,g/m de extrato de células HEXAspCaminotransferase (contendo -50 ng/mL ou -500 |ig/mL de aminotransfera-se). Triptofano sólido (0,5 g) foi adicionado às misturas reacionais exatamen-te antes da adição das enzimas e em intervalos de tempo depois das rea-ções serem iniciadas. As reações foram agitadas em temperatura ambientee alíquotas foram retiradas para análise por CL-EM conforme descrito acima.Sob essas condições, o pH ótimo para a produção de monatina foi entre 8,2e 8,5. As enzimas continuaram a produzir monatina por vários dias depois deas reações serem iniciadas e produziram até 6 g/L de produto.
EXEMPLO 11
Esse exemplo descreve métodos que foram usados para clonare analisar a KHG aldolase de Zymomonas mobilis (ATCC 29191). Essa en-zima foi usada juntamente com uma aminotransferase para produzir monati-na a partir de triptofano.
Clonagem
O gene khg de Z. mobilis (ATCC 29191) foi clonado de uma ma-neira similar àquela descrita no Exemplo 2. O DNA genômico foi isolado u-sando o método de Mekalanos JJ, Duplication and amplification of toxin ge-nes in Vibrio cholerae, Cell 35:253-263 (1983).
Os seguintes iniciadores foram projetados para clonar o genekhg de Z. mobilis nos vetores pET30 e pET28 (Novagen, Madison, Wl).
Expressão N:
5'-GGCCGGCATATGCGTGATATCGATTCCGTAAT -3' (SEQ ID NO:81);
Expressão C:
5'-GGAATTCTCGAGTTAGGCAACAGCAGCGCG-3' (SEQ ID NO: 82).
O seguinte protocolo de PCR foi usado para a amplificação dogene: em 50 fil_ de reação, 200 ng de matriz de DNA, 1,6 jliM de cada inicia-dor, 0,4 mM de cada dNTP, 0,5 U de pfuUltra HF polimerase (Stratagene),2,8 U de polimerase Expand High Fidelity® (Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis, IN) e 1x de tampão Expand® com MgCI2 forma adicionados. Oprograma termociclizador usou um início quente de 94°C por 3 minutos; se-guido por 8 ciclos de uma etapa desnaturante a 94°C (30 seg), uma etapade anelação a 53°C (30 seg) e uma etapa de extensão a 72°C (1 min 30seg); 20 ciclos de uma etapa desnaturante a 94°C (30 seg), uma etapa deanelação a 59°C (30 seg) e uma etapa de extensão a 72°C (1 min 30 seg); efinalmente uma etapa de finalização a 72°C (7 min). O DNA amplificado foipurificado a partir de um gel de ágarose 1% usando um kit de extração degel QIAquick® da Qiagen (Valencia, CA). O DNA purificado e os DNAs deplasmídeo purificados (purificados usando um kit de minipreparação de rota-ção QIAprep® Qiagen) foram digeridos com Ndel e Xhol de acordo com asinstruções do fabricante (NEB; Beverly, MA). A digestão do vetor pET30acom Ndel remove a região de sinalização HIS6 aminoterminal. O DNA dige-rido foi purificado a partir de um gel de ágarose 1% usando um kit de extra-ção de gel QIAquick® da Qiagen (Valencia, CA). O produto de DNA purifica-do foi quantificado pela medição da absorvância a 260 nm, e ligado usandoum kit de ligação de DNA rápido (Roche). A transformação das reações deligação em DH10B eletrocompetente foi efetuada sob condições padroniza-das usando uma cubeta de 0,2 cm e um sistema Gene Pulser II da Bio-Radconforme descrito no manual de eletroporação da Bio-Rad. Clones contendoo gene khg foram identificados por análise de restrição e confirmados porseqüenciamento de DNA. SEQ ID NOS 83 e 84 mostram seqüências de nu-cleotídeo e as correspondentes de aminoácidos do gene khg e do produtodo gene.
Expressão do gene e ensaios
DNA de plasmídeo (verificado por análise de seqüência) foitransformado no hospedeiro de expressão BL21(DE3) de acordo com osprotocolos do fabricante (Novagen). As culturas cresceram em meio LB com50 mg/L de canamicina. Experimentos de indução foram executados com oconstructo BL21(DE3) crescido em meio LB contendo 50 mg/L de canamici-na a 37°C. A expressão de proteína foi induzida usando IPTG 0,2 mM depoisde a OD6oo alcançar aproximadamente 0,6. As células cresceram por 4 horasa 30°C e foram coletadas por centrifugação. As células foram, a seguir, usa-das usando reagente BugBuster® (Novagen) contendo 1 |a.L/mL de benzona-se nuciease, e 5 \i\JmL do grupo III de coquetel inibidor de protease Calbio-chem seguindo o protocolo recomendado da Novagen. O sobrenadante (ex-trato livre de células) foi analisado por SDS-PAGE em géis de gradiente 4 -15% (Bio-Rad) para detectar níveis de proteína solúveis da proteína de fu-são recombinante. A aldolase de Z mobolis foi expressa eficientemente emE. coli e contabilizada por aproximadamente 30% da proteína solúvel con-forme julgado num gel de poliacrilamida SDS.
A formação de monatina a partir de triptofano foi examinada u-sando enzimas não-purificadas. As misturas reacionais continham, em 1 mL,acetato de sódio 100 mM, pH 8,0, MgCI2 4 mM, fosfato de potássio 3 mM,piridoxal fosfato 0,05 mM, piruvato de sódio 100 mM, triptofano 50 mM, alfa-cetoglutarato 10 mM, 239 ug de HEXAspC aminotransferase recombinante(extrato de células não-purificado contendo -30-40% de aldolase (calculadacomo a porcentagem de proteína solúvel total)) e ou khg aldolase de Z mo-bilis recombinante (10 ou 100 ug de extrato de células não-purificado con-tendo -30% de aldolase (calculada como a porcentagem de proteína solúveltotal)) ou ProA aldolase (11,2 ou 112 yig de extrato de células não-purificadocontendo 30% de aldolase (calculada como a porcentagem de proteína solú-vel total)). O triptofano foi adicionado como um sólido. Todos os componen-tes, exceto as enzimas, foram misturados juntos e incubados a 30°C até otriptofano dissolver. As enzimas foram, a seguir, adicionadas e a soluçãoreacional foi incubada a 30°C com agitação moderada por 1 h ou 22 h. Asmisturas reacionais foram diluídas 10 vezes e analisadas para a formaçãode monatina por CL/EM/EM MRM conforme descrito no Exemplo 18. Tabela8 lista a atividade das enzimas como a concentração de produto formadonas incubações.
Tabela 8
<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table>
Os resultados listados na Tabela 8 mostram que a KHG aldolasede Z. mobilis está catalisando a formação de monatina, embora em baixosníveis em comparação com as reações nas quais a ProA aldolase está pre-sente. Conforme pode ser visto por comparação dos resultados nas fileiras 2e 4, quando uma concentração mais alta da KHG aldolase foi adicionada àreação, mais monatina foi formada. Dois picos com a assinatura de EM/EMde monatina foram observados nos cromatogramas CL/EM/EM a partir dasreações nas quais a KHG aldolase de Z. mobilis estava presente, sugerindoque mais de um isômero de monatina foi formado por essa enzima. Os resul-tados mostrados na Tabela 8 refletem a soma desses dois picos. As amos-tras de 24 horas do ensaio de Z. mobilis, quando analisadas usando técnicasquirais, mostraram que a maior parte da amostra foi S,S-monatina. Houve,entretanto, uma pequena quantidade de R,S-monatina indicando que a aldo-lase de Z mobilis é capaz de fazer o estereoisômero precursor de R-monatina (R-MP).
A KHG de Z. mobilis foi adicionalmente caracterizada por com-paração com o homólogo de E. coli descrito no Exemplo 7, assim como coma ProA aldolase. Os seguintes foram adicionados por 1 ml_ de mistura rea-cional: aproximadamente 60 ug de aldolase (fornecida nos extratos celula-res), MgCl2 4 mM, D-triptofano 50 mM, 0,5 mg de D-aminotransferase Bio-Catalytics (AT-103), piruvato de sódio 100 mM, tampão de fosfato de potás-sio 100 mM pH 7,5 ou tampão de acetato de sódio 100 mM pH 8, PLP 0,05mM, fosfato de potássio 3 mM (somente para as reações de acetato) e oc-cetoglutarato 10 mM. Experimentos correram em duplicata, com controlesnegativos nos quais nenhuma aldolase foi adicionada. As amostras foramincubadas de um dia para o outro (20 horas) a 30°C com agitação moderadae filtradas antes da análise de CL/EM/EM e derivatização FDAA. O pH vigen-te das amostras de acetato de sódio foi de aproximadamente 5, enquantoque o pH final para as amostras tamponadas com fosfato foi de aproxima-damente 7. Nenhuma das aldolases aparentou ter atividade significativa empH 5, a amostra contendo ProA aldolase foi levemente acima do controlenegativo, mas provavelmente não acima do erro experimental. No fosfato depotássio, a ProA aldolase produziu 73,4 ppm de monatina com uma propor-ção de R,R:S,R de 1,7:1. As KHG aldolases produziram 0,03 - 0,6 ppm demonatina, com proporções aproximadas de 2:1 - 4:1 para a produção deR,R:S,R.
EXEMPLO 12
Produção de S,S-monatina usando outra aspartato aminotransferase de E.coli
Uma aminotransferase PLP-dependente putativa com homologiapara tanto as aspartato aminotransferases quanto para as aminotransferasesaromáticas foi clonada a partir de MG1655 de E. coli e a proteína recombi-nante foi testada para atividade na produção de S,S-monatina. Iniciadoresforam projetados baseando-se na seqüência de gene yfdZ depositada noNCBI como Gl:48994873 bases 2496317-2495079, codificando para a prote-ínaGI:1788722(ID de proteína AAC75438.1).lniciador5':
TGA CCC TCT AGA TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG GCT GAC ACTCGC CCT GAA C (SEQ ID NO: 85)Iniciador 3':
TTC TCA AGC TTT TAT TCC GCG TTT TCG TGA ATA TGT TTG (SEQ IDNO: 86)
DNA genômico de MG 1655 foi preparado usando técnicas pa-dronizadas e 100 ng foi usado em um reação de PCR de 100 |iL a qual tam-bém continha 1x tampão rTth, acetato de magnésio 1 mM, 0,3 mM de cadadNTP, 0,75 |j,M de cada iniciador, 0,5 uL de Pfu polimerase (Stratagene) e 4unidades de rTth polimerase (Applied Biosystems). Oito rodadas de PCRutilizaram uma temperatura de anelamento de 56°C seguido por 22 rodadasde PCR usando uma temperatura de anelamento de 60°C. A etapa de ex-tensão foi feita a 68°C por dois minutos e 15 segundos. O produto de PCRfoi purificado por gel usando um lit de extração de gel QIAquick da Qiagen(Valencia, CA) e eluído em 50 |iL de tampão EB. O produto de PCR purifica-do e o vetor pTRC99a (Pharmacia Biotech) foram digeridos de um dia para ooutro a 37°C com Xba e Hind\\\ em 1x tampão NEB 2 mais BSA. O produtode digestão foi purificado usando um kit de purificação de PCR QIAquick®da Qiagen e eluído em 32 |iL de EB 0,5x. Ligações foram efetuadas usandoum kit de ligação Quick (NEB) e uma proporção de inserção:vetor de 6:1. Areação de ligação foi purificada usando um kit de purificação de PCR e ele-troporada em células DH10B competentes. Dois |iL foram plaqueados emplacas LB contendo 100 ng/ml_ de ampicilina. As colônias foram testadas porPCR usando iniciadores derivados do vetor pTRC99a. DNA de miniprepara-ção foi seqüenciado para confirmar a inserção correta no vetor.
As células cresceram em meio LB contendo ampicilina até umaOD de 0,4 e induzidas com IPTG 1 mM por 3 horas a 37°C. Extratos celula-res foram produzidos usando BugBuster® (Novagen) de acordo com os pro-tocolos do fabricante, e a concentração de proteína foi determinada usandoum ensaio de Pierce BCA com padrões de BSA de 0 - 2 mg/mL. A expres-são foi verificada por análise de SDS-PAGE de proteína solúvel e foi estima-do que a aminotransferase putativa (YfdZ) compreendeu aproximadamente10% da proteína solúvel.
O produto de gene yfdZ foi ensaiado em tampões tanto de ace-tato de sódio 100 mM quanto de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,5) para aprodução de monatina e comparado com a proteína HEXAspC preparadaconforme descrito no Exemplo 2. Cinqüenta |ig de aminotransferase não-purificada foi ensaiada em cada tampão com L-triptofano 20 mM, MgCI2 4mM, fosfato de potássio 3 mM (somente para tampão acetato), PLP 0,05mM, oc-cetoglutarato 10 mM, piruvato de sódio 100 mM e 50 jxg de ProA al-dolase (descrito no Exemplo 7) fornecido como extrato celular. O pH dasamostras de acetato tiveram que ser ajustados de 6 para 7,5 antes da adi-ção de enzimas. As amostras de 1 mM (corridas em duplicata) foram incu-badas com agitação moderada a 30°C por 1 hora. Controles negativos tam-bém foram feitos em cada tampão e não continham qualquer aminotransfe-rase diferente da que está presente nos extratos celulares da ProA aldolase.
Amostras foram filtradas e analisadas por CL/EM/EM (MRM) conforme des-crito no Exemplo 18. Depois da subtração das quantidades de fundo da mo-natina produzida (entre 410 - 469 ng/mL de monatina) descobriu-se que aHEXAspC aminotransferase produz 1285 ng/m de monatina em tampão fos-fato, enquanto que a proteína YfdZ produziu 426 ng/mL de monatina. Emtampão de acetato de sódio, a HEXAspC aminotransferase produziu 815ng/mL de monatina, enquanto que a aminotransferase putativa produziu 446ng/mL. Os resultados confirmam que o produto do gene yfdZ é, de fato, umaaminotransferase que se comporta semelhantemente à aspartato amino-transferase descrita no Exemplo 1, com atividade tanto para triptofano quan-to para monatina.EXEMPLO 13
Comparação da produção de monatina a partir de indol-3-piruvato usandouma biblioteca de transaminase comercialmente disponível
Uma biblioteca de transaminase foi comprada da BioCatalytics(Pasadena, CA) e as enzimas foram testadas quanto à produção de monati-na em reações acopladas usando a ProA aldolase de C. testosteroni. A bi-blioteca consistia de: AT-101, uma L-aminotransferase de amplo espectro;AT-102, uma L-transaminase de cadeia ramificada (isto é, uma aminotrans-ferase de cadeia ramificada (BCAT, EC 2.6.1.42)); AT-103, uma D-transaminase de amplo espectro; AT-104, uma L-transaminase de cadeiaramificada (isto é, uma aminotransferase de cadeia ramificada (BCAT, EC2.6.1.42)); AT-015, lisina-6-aminotransferase; e AT-106, uma L-transaminasede amplo espectro. Em reações com AT-103, D-glutamato foi usado como odoador de aminoácido. Para reações com AT-105, L-lisina foi usada como odoador amino. Todas as outras reações utilizaram L-glutamato como o co-substrato. Enzimas e componentes/substratos adicionais foram adicionadosdiretamente ao tampão reacional fornecido no kit, o qual continha tampão defosfato de potássio 100 mM pH 7,5, amino doador 100 mM e PLP 0,1 mM. Aum mL do tampão reacional foram adicionados: 4 mg de indol-3-piruvato, 20mg de piruvato, aproximadamente 50 fig de ProA fornecida num extrato ce-lular, 1 (iL de MgCfe 2 M e 2 mg de enzima aminotransferase a ser testada.Todas as reações foram efetuadas em duplicata, e uma reação de controlenegativo foi feita sem aminotransferase adicional adicionada. A produção defundo da monatina é devido às aminotransferases de E. coli naturais presen-tes no extrato celular da enzima ProA recombinante. As reações foram incu-badas de um dia para o outro a 30°C com agitação moderada (100 rpm). Asamostras foram filtradas e submetidas para análise de CL/EM/EM de fasereversa conforme descrito no Exemplo 18. Os resultados estão apresenta-dos abaixo:<table>table see original document page 108</column></row><table>
Aminotransferases AT-101, AT-102, AT-103 e AT-104 produzi-ram claramente mais monatina do que o controle negativo. AT-105 produziumenos monatina do que o controle negativo, presumivelmente porque lisinafoi utilizada como o doador amino, o qual não é adequado para as amino-transferases de E. coli naturais no extrato celular. Similarmente, uma pessoapoderia esperar que o fundo fosse mais baixo para as reações com AT-103,às quais foi fornecido D-glutamato. Os resultados foram adicionalmente ana-lisados para determinar as proporções de S,R/R,S versus R,R/S,S monatina,com base nas áreas dos picos das duas reuniões de estereoisômeros quese separam durante a separação cromatográfica. Da monatina total produzi-da, o controle negativo continha aproximadamente 99,7% de R,R/S,S mona-tina. AT-102 mostrou a próxima especificidade mais alta (89% de picoRR/SS) seguido por AT-101 e AT-104 (-80%). As reações utilizando a D-aminotransferase de ampla especificidade, AT-103, produziram 69% deR,R/S,S monatina em comparação com os isômeros misturados. Essa enzi-ma é homóloga à enzima DAT do Bacillus subtilis descrita no Exemplo 1, aqual é conhecida por ter uma ampla especificidade para D-aminoácidos e foidemonstrada no Exemplo 1 por aceitar D-triptofano como um substrato. Aná-lise quiral foi efetuada usando a metodologia descrita no Exemplo 18, a qualverificou que a D-aminotransferase estava fazendo R,R-monatina conformeesperado. Experimentação adicional com S,S monatina ou R,R-monatinacomo um substrato verificou que a enzima BioCatalytics é altamente seletivapara a configuração D, conforme esperado (resultados descritos no Exemplo15).
Para reduzir a quantidade de S,S-monatina ou R,S-monatinaproduzida como subprodutos nas reações acopladas com AT-103 (a D-transaminase de amplo espectro) e a ProA aldolase, a aldolase foi purificadausando cartuchos His-Bind, conforme descrito no Exemplo 1. A enzima puri-ficada não deve conter atividades de aminotransferase de tipo selvagem quepossam estar presentes nos extratos celulares. O eluente His-Bind foi dessa-linizado para remover imidazol usando colunas PD-10 (G25 Sephadex, A-mersham-Pharmacia) e foi eluído em Tris-CI 50 mM, pH 7. Experimentosforam executados em duplicata num volume de 1 ml_ e continha tampãoTris-CI 100 mM, pH 7,8, 50 jxg de ProA aldolase, 4 mg de indol-3-piruvato, 1ou 2 mg de D-aminotransferase, piruvato de sódio 200 mM, MgCI2 2 mM,fosfato de potássio 3 mM, PLP 0,1 mM e 14,7 mg de D-glutamato. Os tubosforam incubados a 30°C com agitação moderada. Pontos de tempo de duashoras foram tomados e congelados imediatamente a -20°C. O pH foi ajusta-do em duas horas de 5 até entre 7 - 8 usando NaOH, e os ensaios foramincubados de um dia para o outro. Amostras foram filtradas e analisadas pa-ra monatina conforme descrito no Exemplo 18. As amostras de duas horasnão continham quantidades detectàveis de monatina, provavelmente devidoao baixo pH. As amostras de um dia para o outro continham aproximada-mente 190 ng/mL de monatina quando 1 mg de D-aminotransferase foi usa-do, e aproximadamente 84% foi R,R-monatina e 16% foi S,R-monatina.Quando 2 mg de D-aminotransferase foram usados, 540 ng/mL de monatinafoi produzido, aproximadamente 71% foi R,R-monatina.
Experimentos similares foram conduzidos usando tampão deaminotransferase Biocatalytics, o qual continha fosfato de potássio 100 mMpH 7,5, PLP 0,1 mM e glutamato 100 mM. Indol-piruvato sólido e D-aminotransferase foram adicionados como acima. ProA aldolase (50 |ig),MgCI2 e piruvato 50 mM foram adicionados a partir de soluções estoque. Osensaios foram tratados como acima, embora nenhum ajuste de pH foi ne-cessário nesse caso. Um controle negativo foi feito com somente a enzimafornecida da BioCatalytics e tampão, o que não produziu qualquer monatina.Os resultados experimentais estão mostrados na Tabela 9.
Tabela 9
Produção de monatina a partir de indol-3-piruvato em tampão fosfato
<table>table see original document page 110</column></row><table>
A produção de monatina em tampão fosfato é claramente maisalta do que aquela em sistemas tamponados com Tris.
Para comparar as atividades da DAT de B. subtilis clonada doExemplo 1 com a enzima BioCatalytics ensaios adicionais foram feitos. Ogene dat de B. subtilis também foi subclonado para remover a sinalização deHis-6, conforme descrito para as aminotransferases AspC e HEXAspC noExemplo 1. Enzimas sinalizadas e não-sinalizadas foram produzidas emBL21(DE3), conforme descrito no Exemplo 1. Os extratos celulares foramfeitos e os ensaios de proteína total foram feitos para estimar a concentraçãode proteína conforme descrito anteriormente, reações de 1 ml_ duplicadasforam feitas, as quais continham: 500 \lq de D-aminotransferase, 50 |ig deProA aldolase, fosfato de potássio 100 mM pH 7,5, MgCI2 3 mM, 4 mg deindol-3-piruvato, piruvato de sódio 200 mM, 7,35 mg de D-glutamato (50 mM)e PLP 0,1 mM. Amostras foram incubadas a 30°C por 1 h, 2 h e de um diapara o outro, e foram filtradas para análise de CL/EM/EM. As amostras con-tinham somente os estereoisômeros S,R e R,R de monatina, conforme de-terminado pelo protocolo de derivação FDAA descrito no Exemplo 18. Osresultados estão resumidos na Tabela 10 abaixo. A % de RR foi determinadapor áreas de pico que foram separadas por cromatografia em fase reversa, ea composição das amostras de um dia para o outro foram ainda verificadaspela técnica de derivatização FDAA.Tabela 10
Comparação das enzimas D-aminotransferase
<table>table see original document page 111</column></row><table>
A remoção da sinalização HIS-6 aparentou ter melhorado a ati-vidade da D-aminotransferase de B. subtilis; entretanto, o homólogo da D-aminotransferase BioCatalytics claramente tinha a atividade mais alta. Elatambém apresentou maior especificidade de substrato para a R-MP. Temposde incubaçao aumentados aparentam reduzir o excesso enantiomerico daR.R-monatina que é produzido.
Outras D-aminoácido aminotransferases homólogas das espé-cies de Bacillus foram caracterizadas. A enzima YM-1 de Bacillus sp. foidescrição por ter especificidade de substrato similar à enzima de B. subtilis,e conseqüentemente se espera que essa enzima possa funcionar para aprodução de monatina. Adicionalmente, a B. YM-1 e B. subtilis foram de-monstradas como sendo enzimas mais específicas, e não têm uma especifi-cidade de substrato tão vasta quanto os homólogos de B. sphaericus e ou-tras espécies. Conseqüentemente, é esperado que todos os homólogos deBacillus serão ativos na via enzimática para a monatina. Ver K. Yonaha, H.Misono, T. Yamamoto, e K. Soda, JBC, 250: 6983-6989 (1975); K. Tanizawa,Y. Masu, S. Asano, H. Tanaka, e K. Soda, JBC, 264: 2445-2449 (1989). AT-103, uma enzima homóloga testada (acima) foi demonstrada por catalisar aprodução de monatina. Muitos genes são conhecidos que codificam as D-aminoácido aminotransferases nas espécies de Bacillus, incluindo B. anthra-eis, B. cereus, B. halodurans, B. licheniformis, B. sphaericus, B. stearother-mophilus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. YM-1/YM-2, Geobacillus sp., ther-mophilic sp., e Oceanobacillus sp.
EXEMPLO 14
Produção de monatina usando enzimas desidrogenase comercialmente disponíveis
Produção de monatina a partir de indol-3-piruvato e piruvato, u-sando enzimas aminoácido desidrogenase BioCatalytics acopladas com aProA aldolase de C. testosteroni, foi ensaiada sob as seguintes condições:6-7 mg/mL de enzima desidrogenase, 5 mg de NADH ou NADPH, 50 (xg dealdolase (não-purifiçada, ver Exemplo 7), tampão de fosfato de potássio 3mM, MgCfe 2 mM, 4 mg de indol-3-piruvato e 20 mg de piruvato foram adi-cionados a um mL de tampão reacional AADH (bicarbonato 100 mM, pH 9,5,NH4CI 200 mM). Controles negativos não continham a enzima aminoácidodesidrogenase. As amostras foram incubadas a 30°C a 100 rpm de um diapara o outro. Experimentos foram efetuados em duplicata. As desidrogena-ses testadas foram AADH-110, AADH-111, AADH-112 e AADH-113. AADH-110 e 111 foram definidas como enzimas de ampla especificidade, enquantoque a 112 e a 113 são glutamato desidrogenases. AADH-110 produzirammais monatina (conforme medido por CL/EM/EM) em comparação com oscontroles negativos, aproximadamente 0,36 |xg/ml_. A glutamato desidroge-nase que utiliza NADH, AADH-112, mostrou uma afinidade maior do que aglutamato desidrogenase que utiliza NADPH (AADH-113). AADH-111 nãoaparentou produzir mais monatina do que o controle negativo sob as condições ensaiadas.
EXEMPLO 15
Interconversão entre MP e monatina
A aminação de MP para formar monatina pode ser catalisada por a-minotransferases, ou por desidrogenases que requerem um co-fator redutortal como NADH ou NADPH. Ver os exemplos 1 e 9, 10, 12 - 14. Essas rea-ções são reversíveis e podem ser medidas em qualquer direção. A direcio-nalidade, quando usando uma enzima desidrogenase, pode ser amplamentecontrolada pela concentração dos sais de amônio.
Atividade da desidrogenase A desaminação oxidativa da mo-natina foi monitorada pelo acompanhamento do aumento na absorvância a340 nm uma vez que o NAD(P)+ foi convertido no NAD(P)H mais cromofóri-co. Monatina foi enzimaticamente produzida e purificada conforme descritono Exemplo 9.
Uma mistura de ensaio típico continha Tris-HCI 50 mM, pH 8,0 a8,9, NAD+ ou NADP+ 0,33 mM, 2 a 22 unidades de glutamato desidrogenase(Sigma) e 10 - 15 mM de substrato em 0,2 ml_. O ensaio foi efetuado em du-plicata em um placa de microtitulação UV-transparente, num leitor de placasSpectraMax Plus da Molecular Devices. Uma mistura de enzima, tampão eNAD(P)+ foram pipetadas em cavidades contendo o substrato e o aumentona absorvância a 340 nm foi monitorado em intervalos de 10 segundos de-pois de uma breve mistura. A reação foi incubada a 25°C por 10 minutos.
Controles negativos foram executados sem a adição de substrato, e gluta-mato foi utilizado como um controle positivo. A glutamato desidrogenase dotipo III do fígado bovino (Sigma NQ G-7882) catalisou a conversão da mona-tina em MP em um taxa de conversão de aproximadamente um centésimoda taxa de conversão de glutamato em alfa-cetoglutarato. Tentativas de pro-duzir monatina a partir de indol-3-piruvato utilizando glutamato desidrogena-ses resultaram na produção de quantidades detectáveis de triptofano, indi-cando que as glutamato desidrogenases, ou mutantes seus, poderiam serpotencialmente utilizados para a desaminação de triptofano ao invés de usaruma oxidase ou uma aminotransferase para essa etapa na via.
Atividade de transaminação. Ensaios de monatina aminotrans-ferase foram conduzidos com a aspartato aminotransferase (HIS6-AspC) deE. coli, a tirosina aminotransferase (HIS6-TyrB) de E. coli, a aminotransfera-se de substrato amplo (HIS6-BSAT) de L. major e as duas aminotransferasesglutamato-oxaloacetato de porco comercialmente disponíveis descritas noExemplo 1. Tanto o oxaloacetato quanto o alfa-cetoglutarato foram testadoscomo o aceptor amino. Essa mistura de ensaio continha (em 0,5 ml_) Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, PLP 0,05 mM, amino aceptor 5 mM, monatina 5 mM e25 u,g de aminotransferase. Os ensaios foram incubados a 30°C por 30 mi-nutos, e as reações foram interrompidas pela adição de 0,5 ml_ de álcoolisopropílico. A perda de monatina foi monitorada por CUEM ou CL/EM/EM(Exemplo 18). A maior quantidade de atividade foi notada com HIS6-BSATde L. major com oxaloacetato como o aceptor amino, seguido pela mesmaenzima com alfa-cetoglutarato como o aceptor amino. A atividade relativacom oxaloacetato foi: HIS6-BSAT > HISôAspC > tipo Na de suíno > tipo I desuíno = HIS6-TyrB. A atividade relativa com alfa-cetoglutarato foi: HIS6-BSAT> HISeAspC > tipo I de suíno > tipo lia de suíno = HIS6-TyrB.
Usando ensaios similares àqueles descritos acima, e os méto-dos de detecção descritos no Exemplo 18, duas enzimas, TatA de S. melilotie TatA de R. sphaeroides não aparentaram converter de forma detectávelmonatina em MP sob as condições testadas. Essa falta de atividade detec-tável, entretanto, pode ser devido ao fato de que MP é algumas vezes difícilade detectar porque é instável em solução aquosa. Em reações usando apro-ximadamente 50 u,g cada de ProA aldolase purificada e aminotransferase deS. meliloti purificada (sob condições similares às do Exemplo 9), triptofano epiruvato foram convertidos para 6 ppm de monatina em duas horas, e 40ppm de monatina em reações de um dia para o outro. A triptofano amino-transferase de R. sphaeroides produziu aproximadamente 10 vezes maismonatina, indicando uma atividade mais elevada na conversão de MP emmonatina.
A atividade da aminotransferase e a especificidade de substratodas proteínas TyrB e AspC não-sinalizadas também foram medidas seguin-do a formação do co-produto glutamato usando o protocolo descrito no E-xemplo 3 no qual S,S-monatina (5 mM) foi adicionada como o substrato aoinvés de triptofano. Nessa reação de aminotransferase, S,S-monatina reageestequiometricamente com o aceptor de amino alfa-cetoglutarato para for-mar MP e glutamato. Dessa forma, se 1 |a.mol de glutamato é formado, 1jimol de MP também deve ser formado. Os resultados estão listados na Ta-bela 11.Tabela 11
<table>table see original document page 115</column></row><table>
Comparação desses resultados com aqueles descritos no E-xemplo 3 indicam que a AspC tem uma preferência por substrato 6 vezesmaior para o triptofano em relação à S,S-monatina (328,2 (ig/ml_/54,3(ug/mL). TyrB, por outro lado, somente apresenta uma preferência de 1,5 vezpara o triptofano (310,1 ng/ml_/211,8 |ig/ml_) e apresenta substancialmentemais atividade do que a proteína AspC quando a monatina é o substrato.
Conversão de monatina em MP usando desidrogenases comer-cialmente disponíveis
Várias aminoácido desidrogenases da BioCatalytics (AADH-101-110) foram ensaiadas para a conversão de monatina em MP. Ensaios foramefetuados em tampão de bicarbonato de sódio 100 mM, pH 10,0, NAD+ 10 -20 mM, monatina 20 - 200 mM preparado conforme descrito no Exemplo 9, e20 mg/mL de enzima. As reações foram incubadas a 30 - 45°C por 2 horas,e a seguir 30°C por 16 horas. O progresso da reação foi monitorado peloacompanhamento das alterações da absorvância a 340 nm devido à produ-ção de NADH. Controles negativos foram feitos nos quais a enzima estavaausente, ou AADH-10 estava presente, mas ou NAD+ ou monatina foramomitidos. Controles positivos foram feitos usando AADH-101 com valina co-mo substrato. Embora baixa (~1- 4%) em comparação com os controles po-sitivos, AADH-102 (uma L-aminoácido desidrogenase aromática) e AADH-110 (uma L-aminoácido desidrogenase de cadeia ramificada de ampla espe-cificidade; EC 1.4.1.9) aparentaram ter alguma atividade na S,S-monatina epoderiam ser potencialmente evoluídas para melhorar a atividade num pro-cesso biocatalítico.A reação de aminação redutiva, a qual é o que é neces-sário para a produção de monatina a partir de MP, é tipicamente uma reaçãomuito mais rápida do que a reação de desaminação oxidativa que foi medidaaqui. MP não foi detectável por CL/EM; entretanto, ele foi descoberto comosendo instável e difícila de ensaiar.Conversão de monatina e a-KG em MP e glutamato usando a-minotransferases comercialmente disponíveis.
AT-101, AT-102, AT-103 e AT-104 foram compradas da BioCA-talytics (Pasadena, CA). AT-101 é uma L-transaminase de amplo espectro,AT-102 é uma aminotransferase de cadeia ramificada (EC 2.6.1.42), AT-103é uma D-aminotransferase de amplo espectro e AT-104 é uma aminotransfe-rase de cadeia ramificada (EC 2.6.1.42). Todas essas enzimas foram ativasna produção de monatina a partir de indol-piruvato e piruvato quando aco-pladas com a enzima aldolase (ver Exemplo 13). As enzimas foram testadaspara a atividade na S,S e R,R monatina que foi quimicamente produzida. Asreações forma efetuadas num volume total de 0,5 ml_, e corridas em duplica-ta. O ensaio continha Tris 50 mM pH 7,8, PLP 0,08 mM, a-cetoglutarato 10mM (a-KG), monatina 5 mM e 1 mg/mL de enzima aminotransferase. Contro-les negativos não continham a enzima aminotransferase. As amostras foramincubadas por 2 h a 30°C em agitação a 100 rpm. As amostras foram filtra-das e análise de CL/EM/EM foi feita para determinar os níveis de glutamato(conforme descrito no Exemplo 18). Os níveis de glutamato devem se corre-lacionar estequiometricamente com a produção de MP. Os controles negati-vos contêm algum nível de fundo de glutamato dos extratos de células daaldolase, assim como produção de glutamato a partir de aminotransferasesde E. Coli naturais. Quando R,R foi usado como o substrato reacional, o úni-co glutamato significativo produzido em comparação com o controle negativofoi pela D-transaminase (AT-103), aproximadamente 1,1 jig/mL foi detecta-do. AT-101 e AT-104 produziram levemente mais glutamato do que os con-troles negativos. A enzima D-transaminase não mostrou atividade detectávelna S,S-monatina. As aminotransferases são enantiosseletivas para o carbo-no quiral que contém a porção amino, conforme esperado. Todas as L-aminotransferases mostraram atividade na S,S-monatina. AT-101 produziu75 ng/ml_ de glutamato, AT-102 produziu 102 ng/mL de glutamato e AT-104produziu 64 jig/mL de glutamato.
Reações similares usando R,R-monatina 25 mM, fosfato de po-tássio 100 mM, pH 7,5, PLP 0,08 mM, a-cetoglutarato 50 mM e 4 mg/mL deenzima AT-103 produziu 0,145, 0,268, 0,391, e 0,593 mM de glutamato (de-terminado pelo método de fluorescência pós-coluna CL descrito no Exemplo18) em 1, 2, 3 e 19 h de incubação a 30°C. Fosfato aparenta ter aumentadoa atividade da D-aminotransferase em comparação com o tampão Tris-CI.
Em experimentos paralelos usando AspC 1 mg/mL e S,S-monatina comosubstrato, glutamato 0,11 - 0,18 mM foi formado durante o tempo de incuba-ção. O aumento na concentração de AspC para 2 mg/mL aumentou as con-centrações de glutamato para 1,2 mM em 4 horas de reação.
EXEMPLO 16
Produção de monatina a partir de triptofano e fontes de C3 diferentes de pi-ruvato
Conforme descrito acima no Exemplo 9, indol-3-piruvato ou trip-tofano podem ser convertidos em monatina usando piruvato como a molécu-la C3. Entretanto, em algumas circunstâncias, piruvato pode não ser umamatéria-prima desejável. Por exemplo piruvato pode ser mais despendiosodo que outras fontes de carbono C3, ou pode ter efeitos adversos nas fer-mentações caso adicionado ao meio. Alanina pode ser transaminada pormuitas enzimas PLP para produzir piruvato.
Enzimas do tipo triptofanase efetuam reações de beta-eliminação em taxas mais rápidas do que outras enzimas PLP tais como a-minotransferases. Enzimas dessa classe (4.1.99.-) podem produzir amônia epiruvato a partir de aminoácidos tais como L-serina, L-cisteína e derivadosde serina e cisteína com bons grupos de saída tais como O-metila-L-serina,O-benzila-L-serina, S-metilcisteína, S-benzilcisteína, S-alquila-L-cisteína, O-acila-L-serina, 3-cloro-L-alanina.
Processos para produzir monatina usando polipeptídeos EC4.1.99.- podem ser melhorados pela modificação da p-tirosinase (TPL) outriptofanase de acordo com o método de Mouratou et al. {J. Biol. Chem274:1320-5, 1999). Mouratou et al. descreve a capacidade de converter a p-tirosinase em um p-liase de aminoácido dicarboxílico, o qual não foi reporta-do por ocorrer na natureza. A alteração na especificidade foi efetuada pelaconversão de valina (V) 283 em arginina (R) e arginina (R) 100 em treonina(T). Essas alterações dos aminoácidos permitem que a liase aceite um ami-noácido dicarboxílico para a reação de desaminação hidrolítica (tal comoaspartato). Aspartato, conseqüentemente, também pode ser usado comouma fonte de piruvato para subseqüentes reações de condensação aldólica.
Adicionalmente, células ou reatores enzimáticos podem ser for-necidos com lactato e uma enzima que converta lactato em piruvato. Exem-plos de enzimas capazes de catalisar essa reação incluem lactato desidro-genase e lactato oxidase.
Isolamento de DNA genômico
Polipeptídeos da triptofanase foram anteriormente reportadosem, por exemplo, Mouratou et ai {JBC 274:1320-5, 1999). Para isolar genesque codificam polipeptídeos da triptofanase, DNA genômico de DH10B deE.coliforam usados como matriz para PCR conforme descrito no Exemplo 1.
O gene para a tirosina-fenol liase foi isolado a partir de C. freun-dii (número de catálogo ATCC 8090), designação ATCC 13316; NCTC 9750)e cresceu em ágar nutriente (Difco 0001) e em caldo nutriente (Difco 0003) a37°C até uma OD de 2,0. O DNA genômico foi purificado usando um kit100/G Genomic-tip® da Qiagen.
Amplificação por PCR das seqüências codificadoras
Iniciadores foram designados com projeções compatíveis para ovetor pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, Wl) conforme descrito acima no Exemplo 1.
tna de E. coli (SEQ ID NO: 41). Iniciador N-terminal para a clo-nagem de pET30 Xa/LIC: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTTAAA CAT CT-3' (SEQ ID NO: 43). Iniciador C-terminal para a clonagem depET30 Xa/LIC: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCT TTA AGTTTT G-3'(SEQ ID NO: 44).
tpl de C. freundii (SEQ ID NO: 42). Iniciador N-terminal para clo-nagem de pET30 Xa/LIC: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAAT-TATCCGGCAGAACC-3' (SEQ ID NO: 45). Iniciador C-terminal para a clo-nagem de pET30 Xa/LIC: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCTTAGATGTAAT-CAAAGCGTG-3' (SEQ ID NO: 46).O ciclizador térmico de gradiente 5531 Eppendorf Mastercycler®foi usado para todas as reações de PCR. Em 50 (iL foi adicionado 0,5 |ig dematriz (DNA genômico), 1,0 |j.M de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP,3,5 U de Polimerase de alta fidelidade Expand (Roche), 1x de tampão Ex-pand com Mg e DMSO 5% (concentração final). O programa de PCR termo-ciclizador usado foi o seguinte: 96°C de início quente (5 minutos), 94°C - 30segundos, 40 - 60°C - 1 minuto e 45 segundos, 72°C - 2 minutos e 15 se-gundos: 30 repetições. A etapa de polimerização final foi para 7 minutos, eas amostras foram, a seguir, estocadas a 4°C.
Clonagem
Procedimentos de clonagem e de identificação de clones positi-vos detalhados acima no Exemplo 1 foram usados para identificar os clonesapropriados.
Expressão de gene e ensaios de atividade
DNA de plasmídeo (verificado por análise de seqüência) foi sub-clonado no hospedeiro de expressão BL21(DE3) (Novagen). As culturascresceram em meio LB com 30 mg/L de canamicina, os plasmídeos foramisolados usando um kit de minipreparação Qiagen e analisados por digestãode restrição para confirmar a identidade.
Experimentos de indução foram feitos com o hospedeiro de ex-pressão BL21(DE3), os constructos cresceram em meio LB contendo 50mg/L de canamicina a 37°C. A expressão de proteína foi induzida usandoIPTG 0,1 mM depois de a OD6oo da cultura ter alcançado aproximadamente0,6. As células cresceram por 4 horas a 30°C e foram coletadas por centrifu-gação. As células foram, a seguir, lisadas em 5 mL/g de reagenteBugBuster® de peso celular úmido contendo 5 (iL/mL de coquetel inibidor deprotease grupo N-l11 (Calbiochem) e 1 (iL/mL de benzonase nuclease (Nova-gen) e as proteínas recombinantes sinalizadas com His foram purificadasusando os cartuchos His-Bind conforme descrito acima no Exemplo 1. Prote-ínas purificadas foram dessalinizadas em um coluna PD-10 (G25 Sephadex,Amersham Biosciences) e eluídas em tampão Tris-CI 100 mM, pH 8,0. Asproteínas forma analisadas por SDS-PAGE em géis de gradiente 4 - 15%para verificar os níveis de proteína solúvel com o PM previsto da proteína defusão recombinante.
Mutagênese
Alguns membros da classe de polipeptídeo 4.1.99.- (triptofanasee p-tirosinase) irão efetuar a reação da beta-liase com aspartato ou aminoá-cidos similares sem qualquer modificação. Entretanto, alguns membros daclasse podem precisar ser modificados para permitir o uso dos substratose/ou a criação do produto. Além disso, em alguns casos, polipeptídeos quepodem efetuar a conversão podem ser ainda otimizados por mutagênese.
Mutagênese direcionada a sítio foi efetuada baseando-se na a-nálise de estrutura 3D dos polipeptídeos de ligação a PLP. Dois exemplos dealteração de especificidade de substrato dos polipeptídeos estão mostradosabaixo.
Mutagênese da triptofanase: Exemplo 16A
O protocolo de mutagênese fornecido abaixo introduziu duasmutações pontuais na seqüência de aminoácido. A primeira mutação pontualalterou a arginina (R) na posição 103 para treonina (T) e a segunda mutaçãopontual alterou a valina (V) na posição 299 para arginina (R) (sistema denumeração para a proteína madura de E. coli). Experimentos de mutagêne-se foram efetuados por ATG Laboratories (Eden Prairie, MN). Mutações fo-ram introduzidas seqüencialmente por PCR dos fragmentos de genes e aremontagem dos fragmentos foi efetuada por PCR da mesma forma. Inicia-dores para converter arginina (R) 103 em treonina (T): 5'-CCAGGGCACCGGCGÇAGAGCAAATCTATATT-3' (SEQ ID NO: 47) e 5'-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3' (SEQ ID NO: 48).Iniciadores para converter valina (V) 299 em arginina (R):5'-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3' (SEQ ID NO: 49) e5'- CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3' (SEQ ID NO: 50).
Mutantes foram testados por digestão de restrição com Xba l/Hindlll e Sphl, e verificados por seqüenciamento.
Mutagênese de tirosina fenila liase (p-tirosinase): Exemplo 16BDuas mutações pontuais foram feitas na seqüência de aminoá-cidos da tirosina fenol liase. Essas mutações converteram arginina (R) naposição 100 em treonina (T) e valina (V) na posição 283 em arginina (R) (naseqüência de proteína madura de C. freundii).
Iniciadores para a conversão de R100T foram:5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3' (SEQ ID NO: 51) e5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3' (SEQ ID NO: 52).
Iniciadores para a conversão de V283R foram:5'-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3' (SEQ ID NO: 53) e5'- GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3' (SEQ ID NO: 54).
Os métodos descritos acima foram usados, e os clones foramtestados por digestão de Kpnl/Sacl e por digestão de BstXI. As seqüênciasforam verificadas pelo seqüenciamento de terminação da cadeia dideóxi.Proteína recombinante foi produzida conforme descrito acima para as enzi-mas do tipo selvagem.
A mistura reacional consistiu em Tris-CI pH 8,3 50 mM, MgCl2 2mM, fonte de carbono C3 200 mM, alfa-cetoglutarato 5 mM, sal de sódio,piridoxal fosfato 0,05 mM, água desaerada para alcançar um volume final de0,5 ml_ depois da adição das enzimas, fosfato de potássio 3 mM pH 7,5, 25|ig de ProA aldolase de C. testosteroni recombinante bruta, conforme prepa-rado no Exemplo 7, 500 |a.g de L-aspartato aminotransferase bruta (AspC)conforme preparado no Exemplo 1, e triptofano sólido para produzir umaconcentração de > 60 mM (saturado; certa quantidade não-dissolvida duran-te a reação). A mistura racional foi incubada a 30°C por 30 minutos com agi-tação. Serina, alanina e aspartato foram fornecidos como fontes de carbono-3. Ensaios foram efetuados com e sem enzimas PLP secundárias (purifica-das) capazes de efetuar as reações de beta-eliminação e de beta-liase (trip-tofanase (TNA), triptofanase mutante dupla, (3-tirosinase (TPL)). Os resulta-dos das análises de CL/EM das misturas reacionais estão mostrados na Ta-bela 12:TABELA 12
Produção de monatina utilizando fontes de carbono C3 alternativas
<table>table see original document page 122</column></row><table>
A monatina produzida a partir de alanina e serina como fontesde carbono 3 foi verificada por análise de varredura de "produtos carregadosda reação de um íon precursor" CL/EM/EM, e foi idêntica à monatina carac-terizada produzida no Exemplo 9. Alanina foi a melhor alternativa testada, efoi transaminada pela enzima AspC. A quantidade de monatina produzida foiaumentada pela adição da triptofanase, a qual tinha uma atividade secundá-ria de transaminação. A quantidade de monatina produzida com serina comofonte de carbono quase dobrou com a adição das enzimas triptofanase, em-bora somente um quinto da quantidade de triptofanase foi adicionada emcomparação com a aminotransferase. AspC é capaz de algum resultado deatividade de beta-eliminação sozinho. Os resultados com aspartato indicamque a atividade da triptofanase no aspartato não aumenta com as mesmasmutações direcionadas a sítio como anteriormente sugerido para a p-tirosinase. É esperado que a (3-tirosinase mutante terá uma maior atividadepara a produção de monatina.
EXEMPLO 17
Síntese química da monatina
A adição de alanina ao ácido indol-3-pirúvico produz monatina, eessa reação pode ser efetuada sinteticamente com um reagente de Grignardou de organolítio.
Por exemplo, à 3-cloro ou 3-bromoalanina, a qual foi apropria-damente bloqueada nos grupos amino e carboxila, é adicionado magnésiosob condições anidras, lndol-3-piruvato (apropriadamente bloqueado) é, aseguir, adicionado para formar o produto acoplado seguido pela remoçãodos grupos protetores para formar monatina. Grupos protetores que são par-ticularmente úteis incluem THP (éter tetraidropiranílico) o qual é facilmenteligado e removido.
EXEMPLO 18
Detecção de monatina, MP, triptofano e ácido glutâmico
Esse exemplo descreve métodos usados para detectar a pre-sença de monatina ou de seu precursor ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico, assim como triptofano e ácido glutâmico. Ele também descre-ve um método para a separação e detecção dos quatro estereoisômeros damonatina.
Análise de CL/EM da monatina, MP e triptofanoAnálises de misturas para monatina, MP e/ou triptofano deriva-dos de reações bioquímicas in vitro ou in vivo foram efetuadas usando uminstrumento de espectroscopia de massa em tandem com cromatografia lí-quida de micromassa da Waters (CL/EM/EM) incluindo um cromatógrafo lí-quido 2795 da Waters com um monitor de absorvancia de feixe de fotodiiodo996 da Waters (PDA) colocado em série entre o cromatógrafo e o espectrô-metro de massa de quadrupolo triplo Micromass Quatro Ultima. Separaçõesem CL foram feitas usando uma coluna de cromatografia de fase reversaXterra MS C8, 2,1 mm x 250 mm, ou uma coluna de cromatografia de fasereversa Supelco Discovery Ci8, 2,1 mm x 150 mm em temperatura ambienteou a 40°C. A fase móvel da CL consistiu em A) água contendo 0,05% (v/v)de ácido trifluoracético e B) metanol contendo 0,05% (v/v) de ácido trifluora-cético.
O gradiente de eluição foi linear de 5% de B para 35% de B, 0 -4 min, linear de 35% de B até 60% de B, 4 - 6,5 min, linear de 60% de B até90% de B, 6,5 - 7 min, isocrática em 90% de B 7 - 11 min, linear de 90% deB até 95% de B, 11 - 12 min, linear de 95% de B até 5% de B, 12-13 min,com um período de reequilíbrio de 5 min entre as corridas. A taxa de fluxo foide 0,25 mL/min, e a absorvância PDA foi monitorada de 200 nm até 400 nm.
Todos os predefinidos da ESI-EM foram otimizados e selecionados basean-do-se na geração de íons moleculares protonados ([M + H])+ dos analitos deinteresse, e a produção de fragmentos de íons característicos.
Os seguintes predefinidos instrumentais foram usados para aná-lise de CL/EM de monatina: Capilar: 3,5 KV; Cone: 40 V; Hex 1:20 V; Abertu-ra: 0 V; Hex 2:0 V; temperatura da fonte: 100°C; temperatura de dessolvata-ção: 350°C; gás de dessolvatação: 500 L/h; gás do cone: 50 L/h; resoluçãode massa baixa (Q1): 15,0; resolução de massa alta (Q1): 15,0; energia deíon: 0,2; entrada: 50 V; energia de colisão: 2; saída: 50 V; resolução de mas-sa baixa (Q2): 15; resolução de massa alta (Q2): 15; energia de íon (Q2):3,5; multiplicador: 650. Incertezas para as proporções de massa/carga repor-tados (m/z) e massas moleculares são de ± 0,01%. A detecção inicial daforma alfa-ceto ácido da monatina (MP) e monatina nas misturas foi efetuadapelo monitoramento com CL/EM com coleta de espectro de massa para aregião m/z 150 - 400. Cromatogramas de íons selecionados para íons mole-culares protonados ([M+H]+ = 292 para MP, [M+H]+ = 293 para a monatina,[M+H]+ = 205 para triptofano) permitiram a identificação direta desses anali-tos nas misturas. Métodos subseqüentes para detecção de monatina e MPusaram a metodologia CL/EM/EM de monitoramento de reação múltiplo(MRM) (ver abaixo).
Análise de CL/EM/EM para monatina
Experimentos de íon de produto carregado da reação de um íonprecursor de CL/EM/EM foram efetuados na monatina como se segue. Umaanálise de íon de produto carregado da reação de um íon precursor envolvea transmissão do íon de origem (por exemplo, m/z = 293 para monatina) deinteresse do primeiro analisador de massa (Q1) na célula de colisão do es-pectrômetro de massa, onde argônio é introduzido e dissocia quimicamenteo íon de origem nos íons de fragmento (produto carregado da reação de umíon precursor). Esses íons de fragmento são, a seguir, detectados com osegundo analisador de massa (Q2) e podem ser usados para corroborar aindicação estrutural do de origem. Triptofano foi caracterizado e quantificadoda mesma forma através da transmissão e fragmentação de m/z = 205.
Os seguintes predefinidos instrumentais foram usados para aná-lise de CL/EM/EM da monatina: Capilar: 3,5 KV; Cone: 40 V; Hex 1:20 V;Abertura: 0 V; Hex 2:0 V; temperatura da fonte: 100°C; temperatura de des-solvatação: 350°C; gás de dessolvatação: 500 L/h; gás do cone: 50 L/h; re-solução de massa baixa (Q1): 13,0; resolução de massa alta (Q1): 13,0; e-nergia de íon: 0,2; entrada: -5 V; energia de colisão: 14; saída: 1 V; resolu-ção de massa baixa (Q2): 15; resolução de massa alta (Q2): 15; energia deíon (Q2): 3,5; multiplicador: 650.
Monitoramento de reação múltiplo CL/EM/EM
Para aumentar a sensibilidade e seletividade da detecção demonatina, um método de CL/EM/EM empregando medições de MRM foi de-senvolvido. Separações de CL foram efetuadas conforme descrito em se-ções anteriores. Predefinidos instrumentais para ESI-EM/EM foram estabe-lecidos conforme descrito na seção anterior, exceto que ajustes de resoluçãode massa baixa e alta para Q1 e Q2 são estabelecidos para 12,0 para ma-ximizar a sensibilidade. Cinco transições específicas de "percusor para deri-vado" de monatina são usadas para detectar especificamente monatina nasreações in vitro e in vivo. As transições são 293,1 para 158,3, 293,1 para168,2, 293,1 para 211,2, 293,1 para 230,2 e 293,1 para 257,2.
Determinação de alta produtividade da monatina, triptofano eácido glutâmico (glutamato)
Análises de alta produtividade (< 5 min/amostra) de misturas demonatina, triptofano e/ou ácido glutâmico derivado de reações in vitro ou invivo foram executadas usando a instrumentação descrita acima, e os mes-mos predefinidos de EM conforme descritos para monitoramento de reaçãomúltiplo de CL/EM/EM. Separações por CL foram feitas usando uma colunaquirobiótica T de 4,6 mm x 50 mm (Advanced Separation Technologies Chi-robiotic T) em temperatura ambiente contendo 0,25% de ácido acético. Aeluição isocrática foi a 50% de B, 0 - 5 min. A taxa de fluxo foi de 0,6mL/min. Todos os predefinidos do sistema ESI-EM/EM foram otimizados eselecionados baseando-se na geração ótima na fonte dos íons molecularesprotonados de triptofano e monatina e o padrão interno 2H5-triptofano ou 2H3-ácido glutâmico, assim como a produção induzida por colisão de íons defragmento analito-específicos para experimentos de monitoramento de rea-ção múltiplo (204,7 para 146,4 para triptofano, 209,7 para 151,4 para 2H5-triptofano, 147,6 para 102,4 para ácido glutâmico, 150,6 para 105,4 para á-cido 2H3-glutâmico, transições monatina-específicas listadas na seção ante-rior).
Medição de massa precisa da monatina
Análise de EM de alta resolução foi executada usando um es-pectrômetro de massa de tempo de vôo/quadrupolo híbrido Q-Star da Appli-ed Biosystems-Perkin Elmer. A massa medida para a monatina protonadausou triptofano como um padrão de calibração de massa interno. A massacalculada da monatina protonada, baseando-se na composição elementalC14H17N2O5, é de 293,1137. Monatina produzida usando o processo biocata-lítico descrito no Exemplo 9 mostrou uma massa medida de 293,1144. Esseé um erro de medição de massa de menos do que 2 partes por 5 milhões(ppm), proporcionando evidência conclusiva da composição elemental damonatina produzida enzimaticamente.
Medição da monatina CL/EM/EM (MRM) quiral
A determinação da distribuição do estereoisômero de monatinaem reações in vitro e in vivo foi efetuada pela derivatização com 1 -flúor-2,4-dinitrofenila-5-L-alaninoamida (FDAA), seguido pela medição CL/EM/EMMRM em fase reversa.Derivatização de monatina com FDAA
Em 50 |iL de amostra ou padrão foi adicionado 200 |j,L de umasolução 1% de FDAA em acetona. Quarenta uL de bicarbonato de sódio 1,0M foi adicionado, e a mistura foi incubada por 1 h a 40°C com mistura ocasi-onal. A amostra foi removida e esfriada, e neutralizada com 20 fil_ de HCI 2,0M (mais HCI pode ser necessário para efetuar a neutralização de uma mistu-ra biológica tamponada). Depois de completa a degaseificação, as amostrasestavam prontas para análise por CL/EM/EM.
Monitoramento da reação múltiplo por CL/EM/EM para a deter-minação da distribuição do estereoisômero de monatina em reações in vivoe in vitro
As análises foram efetuadas usando a instrumentaçãoCL/EM/EM descrita nas seções anteriores. Separações de CL capazes deseparar todos os quatro estereoisômeros da monatina (especificamenteFDAA-monatina) foram efetuadas em um coluna de cromatografia de fasereversa C18 Phenomenex Luna (5 fim) a 40°C. A fase móvel da CL consistiaem A) água contendo 0,05% (massa/volume) de acetato de amônio e B)acetonitrila. O gradiente de eluição foi linear a partir de 2% de B até 34% deB, 0 - 33 min, linear de 34% de B até 90% de B, 33 - 34 min, isocrático em90% de B 34 - 44 min, e linear de 90% de B até 2% de B, 44 - 46 min, comum período de reequilíbrio de 16 minutos entre as corridas. A taxa de fluxofoi de 0,25 mL/min, e a absorvância do PDA foi monitorada de 200 nm a 400nm. Todos os predefinidos da ESI-EM foram otimizados e selecionados ba-seando-se na geração de íons moleculares protonados ([M + H]+) de FDAA-monatina, e na produção de íons de fragmento característicos.
Os seguintes predefinidos instrumentais foram usados para aanálise de CL/EM de monatina no modo ESI/EM de íon negativo: capilar: 2,0KV; cone: 25 V; Hex 1:10 V; Abertura: 0 V; Hex 2:0 V; temperatura da fonte:100°C; temperatura de dessolvatação: 350°C; gás de dessolvatação: 500L/h; gás do cone: 50 L/h; resolução de massa baixa (Q1): 12,0; resolução demassa alta (Q1): 12,0; energia de íon: 0,2; entrada: -5 V; energia de colisão:20; saída: 1 V; resolução de massa baixa (Q2): 12; resolução de massa alta(Q2): 12; energia de íon (Q2): 3,0; multiplicador: 650. Três transições de "paipara filha" FDAA-monatina específicas são usadas para detectar especifi-camente FDAA-monatina em reações in vitro e in vivo. As transições são de543,6 para 268,2, 543,6 para 499,2 e 543,6 para 525,2. Identificação dosestereoisômeros de FDAA-monatina é baseada no tempo de retenção cro-matográfica em comparação com estereoisômeros de monatina purificados,e em dados de espectro de massa.
Cromatografia líquida - detecção por fluorescência pós-colunade aminoácidos, incluindo glutamato
Cromatografia líquida com detecção por fluorescência pós-coluna para a determinação de ácido glutâmico em reações in vitro e in vivofoi efetuada num sistema 2690 LC da Waters ou equivalente combinado comum detector de fluorescência de varredura 474 da Waters, e num módulo dereação pós-coluna da Waters. Separações por CL foram efetuadas em umcoluna de troca tônica carregada com sódio de interação a 60°C. A fase mó-vel A era tampão Pickering Na 328 (Pickering Laboratories, Inc.; MountainView, CA). A fase móvel B foi o tampão Pickering Na 740. A eluição comgradiente foi de 0% de B até 100% de B, 0 - 20 min, isocrática em 100% deB, 20 - 30 min, e linear de 100% de B até 0% de B, 30 - 31 min, com um pe-ríodo de reequilíbrio de 20 min entre as corridas. A taxa de fluxo para a fasemóvel foi de 0,5 mL/min. A taxa de fluxo para a solução de derivatizaçãopós-coluna OPA foi de 0,5 mL/min. Os ajustes do detector de fluorescênciaforam EX 338 nm e Em 425 nm. Norleucina foi empregada como um padrãointerno para a análise. A identificação dos aminoácidos foi baseada nos da-dos dos tempos de retenção cromatográficos para os padrões purificados.
EXEMPLO 19
Produção de monatina em bactéria
Esse exemplo descreve métodos usados para produzir monatinaem células de E. coli. Uma pessoa versada na técnica irá entender que mé-todos similares podem ser usados para produzir monatina em outras célulasbacterianas. Além disso, vetores contendo outros genes na via de síntese damonatina (FIGURA 2) podem ser usados.Meio de Trp-1 + glicose, um meio mínimo que foi usado para aprodução aumentada de triptofano em células de E. coli (Zeman et al. FoliaMicrobiol. 35:200-4, 1990), foi preparado como se segue. Em 700 ml_ de á-gua nanopura os seguintes reagentes foram adicionados: 2 g de (NH4)2S04,13,6 g de KH2P04, 0,2 g de MgSO4«7H20, 0,01 g de CaCI2*2H20 e 0,5 mg deFeSO4*7H20. O pH foi ajustado para 7,0, o volume foi aumentado para 850ml_ e o meio foi autoclavado. Uma solução de glicose a 50% foi preparadaseparadamente, e filtrada de forma estérila. Quarenta ml_ foram adicionadosao meio base (850 ml_) para um volume final de 1 L.
Uma solução de L-triptofano 10 g/L foi preparada em fosfato desódio 0,1 M pH 7, e filtrada de forma estérila. Um décimo de volume foi tipi-camente adicionado às culturas conforme especificado abaixo. Uma soluçãode piruvato de sódio a 10% foi também preparada e filtrada de forma estéri-la. Uma alíquota de 10 mL foi tipicamente usada por litro de cultura. Esto-ques de ampicilina (100 mg/mL), canamicina (25 mg/mL) e IPTG (840 mM)foram preparados, filtrados de forma estérila e estocados a -20°C antes douso. Tween 20 (polioxietileno 20 - monolaurato de sorbitan) foi utilizado emum concentração final de 0,2% (vol/vol). Ampicilina foi usada em concentra-ções não-letais, tipicamente 1-10 ng/mL de concentração final.
Placas frescas de BL21(DE3) de E. coli: proA/pET 30 Xa/LIC deC. testosteroni (descrito no Exemplo 7) foram preparadas em meio LB con-tendo 50 u.g/mL de canamicina.
Culturas de um dia para o outro (5 mL) foram inoculadas a partirde uma única colônia e cresceram a 30°C em meio LB com canamicina. Ti-picamente um inóculo de 1 para 50 foi usado para indução em meio trp-1 +glicose. Antibiótico fresco foi adicionado até uma concentração final de 50mg/L. Frascos de agitação cresceram a 37°C antes da indução.
As células foram amostradas a cada hora até que uma OD6oo de0,35 - 0,8 fosse obtida. As células foram, a seguir, induzidas com IPTG 0,1mM, e a temperatura foi reduzida para 34°C. Amostras (1 mL) foram coleta-das antes da indução (ponto de tempo zero) e centrifugadas a 5000 x g. Osobrenadante foi congelado a -20°C para análise de CL/EM. quatro horasapós a indução, outra amostra de 1 ml_ foi coletada, e centrifugada para se-parar o caldo do pélete da célula. Triptofano, piruvato de sódio, ampicilina eTween foram adicionados conforme descrito acima.
As células cresceram por 48 horas após a indução, e outra a-mostra de 1 mL foi tomada e preparada conforme acima. Em 48 horas, outraalíquota de triptofano e piruvato foi adicionada. O volume de cultura total foicentrifugado depois de aproximadamente 70 horas de crescimento (pós-indução), por 20 minutos a 4°C e 3500 rpm. O sobrenadante foi decantado etanto o caldo quanto as células foram congelados a -80°C. Ambas as fraçõesforam filtradas e analisadas por CL/EM. As alturas e áreas dos picos de[M+H]+ = 293 foram monitoradas conforme descrito no Exemplo 18. O nívelde fundo do meio foi subtraído. Os dados também foram normalizados parao crescimento celular pela demaracação da altura do pico [M + H]+ = 293dividido pela densidade ótica da cultura a 600 nm.
Níveis mais altos de monatina foram produzidos quando piruva-to, ampicilina e Tween foram adicionados 4 horas depois da indução ao in-vés de na indução. Outros aditivos, tais como PLP, fosfato adicional ou Mg-CI2 adicional não aumentaram a produção de monatina. Títulos mais eleva-dos foram obtidos quando triptofano foi utilizado ao invés de indol-3-piruvato,e quando o triptofano foi adicionado depois da indução ao invés de na inocu-lação, ou na indução. Antes da indução, e 4 horas depois da indução (nomomento da adição de substrato), não houve tipicamente nível detectável demonatina no caldo de fermentação ou extratos celulares. Controles negati-vos foram feitos usando células somente com vetor pET30a, assim comoculturas onde triptofano e piruvato não foram adicionados. Uma varredura deEM da origem demonstrou que o composto com (m+1 )/z = 293 não foi deri-vado a partir de moléculas maiores, e que varreduras do produto carregadoda reação de um íon precursor (efetuadas como no Exemplo 18) foram se-melhantes à monatina feita in vitro.
O efeito de Tween foi estudado pelo uso de 0, 0,2% (vol/vol) e0,6% de concentrações finais de Tween-20. A quantidade mais alta de mo-natina produzida por frascos de agitação foi em Tween 0,2%. A concentra-ção de ampicilina variou entre 0 e 10 ng/mL A quantidade de monatina nocaldo celular aumentou rapidamente (2,5 X) entre 0 e 1 [ig/ml_, e aumentou1,3 X quando a concentração de ampicilina foi aumentada de 1 para 10uQ/ml_.
Um experimento de tempo de curso mostrando resultados típi-
cos está mostrado na FIGURA 10. A quantidade de monatina secretada nocaldo celular aumentou, mesmo quando os valores são normalizados para ocrescimento celular. Pelo uso do coeficiente de extinção molar do triptofano,a quantidade de monatina no caldo foi estimada como sendo menor do que10 ng/ml_. O mesmo experimento foi repetido com as células contendo vetorsem inserção de proA. Muitos dos números foram negativos, indicando quea altura do pico em m/z = 293 foi menor nessas culturas do que no meio so-zinho (FIGURA 10). Os números foram consistentemente mais baixos quan-do triptofano e piruvato estavam ausentes, demonstrando que a produção demonatina é um resultado de uma reação enzimática catalisada pela enzimaaldolase.
A produção in vivo de monatina em células bacterianas foi repe-tida em experimentos de frasco de agitação de 800 ml_ e em fermentadores.
Uma amostra de 250 ml_ de monatina (em caldo livre de célula) foi purificadapor cromatografia de troca iônica e por cromatografia líquida de fase reversapreparativa. Essa amostra foi evaporada e submetida para análise de massade alta resolução (descrita no Exemplo 9). O EM de alta resolução indicouque o metabólito sendo produzido é monatina.
Ensaios in vitro indicam que a aminotransferase precisa estarpresente em níveis mais altos do que a aldolase (ver Exemplo 9), conse-qüentemente a aspartato aminotransferase a partir de E. coli foi superex-pressa juntamente com o gene da aldolase para aumentar a quantidade demonatina produzida. Os iniciadores foram designados para introduzir proAde C. testosteroni num operon com aspC/pET30 Xa/LIC como se sejgue: ini-ciador 5': ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO: 67). e iniciador 3': CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTT-CAGGC (SEQ ID NO: 68). O iniciador 5' contém um sítio BamHI, o iniciador3' contém um sítio Sall para clonagem. PCR foi efetuado conforme descritono Exemplo 7 e purificado com gel. O constructo aspC/pET30 Xa/LIC foi di-gerido com BamHI e Sall, e foi o produto de PCR. Os digestos foram purifi-cados usando uma coluna de rotação Qiagen. O produto de PCR proA foiligado ao vetor usando o kit de ligação de DNA Rapid da Roche (Indianápo-lis, IN) de acordo com as instruções do fabricante. As transformações quími-cas foram feitas usando Novablues Singles (Novagen) conforme descrito noExemplo 1. As colônias cresceram em meio LB contendo 50 mg/L de cana-micina e DNA de plasmídeo foi purificado usando o kit de minipreparação derotação da Qiagen. Os clones formam testados por análise de digestão derestrição e a seqüência foi confirmada por Seqwright (Houston, TX). Osconstructos foram subclonados em BLR(DE3), BLR(DE3)pLysS, BL21(DE3)e BL21(DE3)pLysS (Novagen). o constructo proA/pET30 Xa/LIC também foitransformado em BL21(DE3)pLysS.
Comparações iniciais de amostras de frasco de agitaçãoBLR(DE3) sob as condições padrão descritas acima demonstraram que aadição do segundo gene (aspC) melhorou a quantidade de monatina produ-zida em sete vezes. Para acelerar o crescimento, cepas de hospedeiro deri-vadas de BÍ_21(DE3) foram usadas. Os clones de proA e os dois clones deoperon do gene foram induzidos no meio Trp-1 conforme acima, os hospe-deiros pLysS tinham cloranfenicol (34 mg/L) adicionado ao meio da mesmaforma. Experimentos de frasco de agitação foram efetuados com e sem aadição de Tween 20 0,2% e 1 mg/L de ampicilina. A quantidade de monatinano caldo foi calculada usando monatina purificada produzida in vitro comopadrão. Análises de SRM foram efetuadas conforme descrito no Exemplo18. Células foram amostradas em zero, 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 ho-ras e 96 horas de crescimento.
Os resultados estão apresentados na Tabela 13 para as quanti-dades máximas produzidas nos caldos de cultura. Na maioria dos exemplos,o constructo de dois genes forneceu valores mais elevados do que o cons-tructo proA sozinho. As cepas de pLysS, as quais têm envelopes de célulasmais vazados, tinham níveis mais altos de monatina secretada, mesmo seessas cepas tipicamente cresceram em um taxa mais lenta. As adições deTween e ampicilina foram benéficas.
Tabela 13
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EXEMPLO 20
Produção de monatina em levedura
Esse exemplo descreve métodos usados para produzir monatinaem células eucarióticas. Uma pessoa versada na técnica irá entender quemétodos similares podem ser usados para produzir monatina em qualquercélula de interesse. Além disso, outros genes podem ser usados (por exem-plo, aqueles listados na FIGURA 2) além de, ou alternativamente àquelesdescritos nesse exemplo.
O Sistema de Vetor de Sinalização de Epitopo de LevedurapESC (Stratagene, La Jolla, CA) foi usado para clonar e expressar os genesde aspC de E. coli e proA de C. testosteroni em Saccharomyces cerevisiae.Os vetores pESC contêm tanto o promotor GAL1 quanto o promotor GAL10em filamentos opostos, com dois sítios de clonagem múltiplos distintos, per-mitindo a expressão de dois genes ao mesmo tempo. O vetor pESC-Histambém contém o gene His3 para complementação da auxotrofia da histidi-na no hospedeiro (YPH500). Os promotores GAL1 e GAL10 são reprimidospela glicose e induzidos pela galactose; uma seqüência Kozak é utilizadapara a expressão ótima em leveduras. Os plasmídeos pESC são vetores dotipo ponte, permitindo que o constructo inicial seja feito em E. coli (com ogene bla para seleção); entretanto, nenhum sítio de ligação de ribossomabacteriano está presente em sítios de clonagem múltipla.
Os seguintes iniciadores foram projetados para clonagem empESC-His (sítios de restrição estão sublinhados, seqüência Kozak está emnegrito): aspC (BamH\/Sal\), GAL1:
5'-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3' (SEQ ID NO: 69) e 5'-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQ ID NO: 70). proA(EcoRUNoti), GAL10: 5'-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3' (SEQ ID NO: 71) e 5'-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3' (SEQ ID NO: 72).
O segundo códon para ambas as proteínas maduras foi alteradode um aminoácido aromático para valina devido à introdução da seqüênciaKozak. Os genes de interesse foram amplificados usando DNA minipreppET30 Xa/LIC a partir dos clones descritos no Exemplo 1 e no Exemplo 7como matriz. PCR foi efetuado usando um termociclizador de gradiente cicli-zador Eppendorf Master e o seguinte protocolo para uma reação de 50 [iL:1,0 ul de matriz, 1,0 jiM de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U depolimerase de alta fidelidade Expand (Roche, Indianapolis, IN) e tampão Ex-pand® 1X com Mg. O programa termociclizador usado consistiu em um inícioquente a 94°C por 5 minutos, seguido por 29 repetições das seguintes eta-pas: 94°C por 30 segundos, 50°C por 1 minuto e 45 segundos e 72°C por 2minutos e 15 segundos. Depois de 29 repetições a amostra foi mantida a72°C por 10 minutos e, a seguir, estocada a 4°C. Os produtos de PCR forampurificados pela separação num gel de TAE-ágarose 1% seguido pela recu-peração usando um kit de extração de gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA).
O DNA do vetor pESC-His (2,7 |ig) foi digerido com BamHI/Salle purificado com gel como acima. O produto de PCR aspC foi digerido comBamHI/Sall e purificado com uma coluna de purificação de PCR QIAquick.Ligações foram efetuadas com o kit de ligação de DNA Rapid da Roche se-guindo os protocolos do fabricante. As ligações dessalinizadas foram eletro-poradas em 40 nl_ de células competentes DH10B Electromax (Invitrogen)em um cubeta descartável Biorad de 0,2 cm usando um pulsador de geneBiorad II (Biorad Gene Pulser II) com controle de pulso positivo, de acordocom as instruções do fabricante. Depois de 1 hora de recuperação em 1 ml_de meio SOC, os transformantes foram plaqueados em meio LB contendo100 |ig/ml_ de ampicilina. Preparações de DNA de plasmídeo para clonesforam feitas usando kits de minipreparação de rotação QIAprep. DNA deplasmídeo foi testado por digestão de restrição, e seqüenciado (Seqweight)para a verificação usando iniciadores projetados para o vetor.
O clone aspC/pESC-His foi digerido com EcoRI e Notl, assimcomo foi o produto de PCR proA. DNA foi purificado como acima, e ligadocomo acima. O constructo de dois genes foi transformado em células DH10Be testado por digestão de restrição e seqüenciamento de DNA.
O constructo foi transformado na cepa de S. cerevisiae YPH500usando o kit de transformação S.c. EasyComp® (Invitrogen). As reações detransformação foram plaqueadas em meio mínimo SC-His (manual pYES2Invitrogen) contendo 2% de glicose. Colônias de levedura individuais foramtestadas para a presença dos genes proA e aspC por PCR da colônia usan-do os iniciadores de PCR acima. As células peletizadas (2 \iL) foram sus-pensas em 20 de tampão Y-lysis (Zymo Research) contendo 1 \xL de zi-molase e aquecidas a 37°C por 10 minutos. Quatro u.L dessa suspensão foi,então, usada em 50 fil_ de uma reação de PCR usando a mistura reacionalde PCR e o programa descrito acima.
Culturas de cinco ml_ cresceram de um dia para o outro em SC-His + glicose a 30°C e 225 rpm. As células foram gradualmente ajustadaspara crescer em rafinose para minimizar o período lag antes da indução comgalactose. Depois de aproximadamente 12 horas de crescimento, as medi-ções de absorvância a 600 nm foram tomadas, e um volume apropriado decélulas foi decantado por rotação e ressuspenso para produzir uma OD de0,4 no meio SC-His fresco. As seguintes fontes de carbono foram usadasseqüencialmente: 1% de rafinose + 1% de glicose, 0,5% de glicose + 1,5%de rafinose, 2% de rafinose e, finalmente, 1% de rafinose + 2% de galactosepara indução.
Depois de aproximadamente 16 horas de crescimento em meiode indução, as culturas de 50 ml_ foram divididas em culturas de 25 ml_ du-plicadas, e os seguintes forma adicionados a somente uma das duplicatas:(concentrações finais) 1 g/L de L-triptofano, fosfato de sódio 5 mM pH 7,1,piruvato de sódio 1 g/L, MgCI2 1 mM. Amostras de caldos e péletes de célu-las do meio sem indução, e das culturas de 16 horas antes da adição desubstratos para a via da monatina foram guardadas como controles negati-vos. Além disso, constructos contendo somente um gene aspC funcional (eum gene proA cortado) foram utilizados como outro controle negativo. Ascélulas foram deixadas crescer por um total de 69 horas após a indução.
Ocasionalmente, as células de levedura foram induzidas em um OD maisbaixa, e somente cresceram por 4 horas antes da adição de triptofano e pi-ruvato. Entretanto, esses substratos de monatina aparentam inibir o cresci-mento e a adição em um OD mais elevada foi mais eficaz.
Os péletes de células das culturas foram lisados com 5 mL deYeastBuster® + 50 uJ de THP (Novagen) por grama (peso úmido) de célulasseguindo os protocolos do fabricante, com a adição de inibidores da protea-se e benzonase nuclease conforme descrito em exemplos anteriores. O cal-do de cultura e os extratos celulares foram filtrados e analisados por SRMconforme descrito no Exemplo 18. Usando esse método, nenhuma monatinafoi detectada nas amostras de caldo, indicando que as células não podiamsecretar monatina sob essas condições. A força motriz do próton pode serinsuficiente sob essas condições ou os transportadores de aminoácidos ge-rais podem ser saturados com triptofano. A expressão de proteína não foinum nível que permitisse a detecção de alterações usando SDS-PAGE.
Monatina foi detectável (aproximadamente 60 ng/mL) transitori-amente nos extratos celulares da cultura com dois genes funcionais, quandotriptofano e piruvato foram adicionados ao meio. Monatina não foi detectadaem qualquer um dos extratos de célula de controle negativo. Ensaios in vitropara a monatina foram efetuados em duplicata com 4,4 mg/mL de proteínatotal (cerca do dobro do que é tipicamente usado para os extratos de célulasde E. coli) usando o ensaio otimizado descrito no Exemplo 9. Outros ensaiosforam efetuados com a adição ou de 32 |j,g/mL de ProA aldolase de C. tes-tosteroni ou 400 |j.g/mL de AspC aminotransferase, para determinar qual en-zima foi limitante no extrato celular. Controles negativos foram efetuadossem adição de enzima, ou a adição de somente AspC aminotransferase (acondensação aldólica pode ocorrer até certa extensão sem enzima). Contro-les positivos foram efetuados com enzimas parcialmente puras (30 - 40%),usando 16 u.g/mL de aldolase e 400 fig/mL de aminotransferase.
Resultados in vitro foram analisados por SRM. A análise dos ex-tratos celulares mostrou que triptofano foi eficientemente transportado paraas células quando ele foi adicionado ao meio pós-indução, resultando emníveis de triptofano duas ordens de magnitude mais elevados do que aque-les nos quais nenhum triptofano adicional foi adicionado. Os resultados paraa análise de monatina in vitro estão mostrados na Tabela 14 (números indi-cam ng/mL).
Tabela 14
Produção de monatina com extratos de células de levedura
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Resultados positivos foram obtidos com os extratos de célulasde constructo de dois genes completos com e sem substrato adicionado aomeio de crescimento. Esses resultados, em comparação com os controlespositivos, indicam que as enzimas foram expressas em níveis próximos de1% da proteína total em levedura. A quantidade de monatina produzidaquando o extrato de células do constructo aspC (com proA cortado) foi en-saiado com aldolase foi significativamente maior do que quando os extratosde células foram ensaiados sozinhos, e indica que a AspC aminotransferaserecombinante compreende aproximadamente 1 - 2% da proteína total delevedura. Os extratos de células de culturas não-induzidas tinham uma pe-quena quantidade de atividade quando ensaiados com aldolase devido àpresença de aminotransferases naturais nas células. Quando ensaiada comAspC aminotransferase, a atividade dos extratos de células não-induzidasaumentou para a quantidade de monatina produzida pelo controle negativocom AspC (ca. 200 ng/mL). Ao contrário, a atividade observada quando en-saiando o extrato de células do constructo de dois genes aumenta maisquando a aminotransferase é suplementada do que quando aldolase é adi-cionada. Uma vez que ambos os genes devem ser expressos no mesmonível, isso indica que a quantidade de monatina produzida é maximizadaquando o nível de aminotransferase é maior do que aquele da aldolase, emconcordância com os resultados mostrados no Exemplo 9.
A adição de piruvato e triptofano não somente inibe o crescimen-to celular, mas aparentemente inibe a expressão de proteína da mesma for-ma. A adição do plasmídeo pESC-Trp pode ser usada para corrigir a auxo-trofia do triptofano das células hospedeiras YPH500, para proporcionar umaforma de fornecer triptofano com menos efeitos no crescimento, expressão esecreção.
EXEMPLO 21
Melhoria dos processos enzimáticos usando reações acopladas
Em teoria, se nenhuma reação secundária ou degradação desubstratos ou intermediários ocorrer, a quantidade máxima de produto for-mado a partir da reação enzimática ilustrada na FIGURA 1 é diretamenteproporcional às constantes de equilíbrio de cada reação e às concentraçõesde triptofano e piruvato. Triptofano não é um substrato altamente solúvel econcentrações de piruvato maiores do que 200 mM aparentam ter um efeitonegativo no rendimento (ver Exemplo 9).
Idealmente, a concentração de monatina é maximizada em rela-ção aos substratos para diminuir o custo de separação. Separações físicaspodem ser efetuadas de forma que a monatina seja removida a partir da mis-tura reacional, prevenindo a ocorrência das reações reversas. As matérias-primas e os catalisadores podem, então, ser regenerados. Devido à similari-dade da monatina no tamanho, carga e hidrofobicidade com vários dos rea-gentes e intermediários, separações físicas serão difíceis, a não ser que e-xista uma grande quantidade de afinidade pela monatina (tal como técnicade cromatografia por afinidade). Entretanto, as reações de monatina podemser acopladas com outras reações, de forma que o equilíbrio do sistema sejamodificado para a produção de monatina. Os seguintes são exemplos deprocessos para melhorar o rendimento de monatina obtida a partir de tripto-fano ou indol-3-piruvato.
Reações acopladas usando oxaloacetato descarboxilase (EC4.1.1.3)
A FIGURA 11 é uma ilustração da via para produzir monatina naqual oxaloacetato descarboxilase é adicionada para remover o co-produtooxaloacetato formado durante a conversão de MP em monatina. Triptofanooxidase e catalase são utilizadas para direcionar a reação na direção daprodução de indol-3-piruvato. Catalase é usada em excesso de forma queperóxido de hidrogênio não esteja disponível para reagir na direção reversaou para danificar as enzimas ou intermediários. Oxigênio é regenerado du-rante a reação da catalase. Alternativamente, indol-3-piruvato pode ser usa-do como o substrato inicial.
Nessa via, aspartato é usado como o doador amino para a ami-nação de MP em um reação catalisada pela aspartato aminotransferase.
Idealmente, uma aminotransferase que tenha uma baixa especificidade paraa reação de triptofano/indol-3-piruvato em comparação com a reaçãoMP/monatina é usada de forma que o aspartato não aja como um doadoramino para reaminar o indol-3-piruvato. Oxaloacetato descarboxilase (dePseudomonas sp.) pode ser adicionada para converter o oxaloacetato empiruvato e dióxido de carbono. Uma vez que CO2 é volátila, ele não está dis-ponível para a reação com as enzimas, dessa forma diminuindo ou mesmoprevenindo as reações reversas. O piruvato produzido nesse etapa tambémpode servir como um substrato na reação de condensação aldólica paraformar MP. Outras enzimas descarboxilases podem ser usadas; homólogossão conhecidos por existir em Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aqui-fex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroidesfragilis, várias espécies de Bordetella, Campylobacter jejuni, Chlorobium te-pidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nu-cleatum, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, MagnetococcusMC-1, Mannheimia haemolytica, Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurellamultocida Pm70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, váriasespécies de Pseudomonas, várias espécies de Pyrococcus, Rhodococcus,várias espécies de Salmonella, várias espécies de Streptococcus, Thermoc-hromatium tepidum, Thermotoga marítima, Treponema pallidum, e váriasespécies de Vibrio.
Ensaios da triptofano aminotransferase foram efetuados comaspartato aminotransferase sinalizada com HIS6 (AspC) de E. coli, a tirosinaaminotransferase sinalizada com HIS6 (TyrB) de E. coli, a aminotransferasede substrato amplo sinalizada com HIS6 (BSAT) de L. major, e as duas glu-tamato-oxaloacetato aminotransferases de porco comercialmente disponí-veis conforme descrito no Exemplo 1. Tanto oxaloacetato quanto alfa-cetoglutarato foram testados como aceptores de amino. A proporção da ati-vidade usando monatina (Exemplo 15) contra a atividade usando triptofanofoi comparada para determinar qual enzima tinha a especificidade mais altapara a reação da monatina aminotransferase. Esses resultados indicaramque a enzima com a especificidade mais alta para a reação da monatinacontra a reação de triptofano é a glutamato-oxaloacetato aminotransferasetipo ll-A de porco, GOAT (Sigma NQG7005). Essa especificidade foi inde-pendente de qual aminoaceptor foi utilizado. Conseqüentemente, essa enzi-ma foi usada nas reações acopladas com a oxaloacetato descarboxilase.
Uma reação típica partindo de indol-3-piruvato continha (concen-trações finais) Tris-CI 50 mM pH 7,3, indol-3-piruvato 6 mM, piruvato de só-dio 6 mM, aspartato 6 mM, PLP 0,05 mM, fosfato de potássio 3 mM, MgCI2 3mM, aminotransferase 25 ng/mL, ProA aldolase de C. testosteroni 50 \ig/mLe 3 unidades/mL de descarboxilase (Sigma Ng 04878). As misturas reacio-nais foram incubadas por 1 hora a 26°C. Em alguns casos, a descarboxilasefoi omitida ou o aspartato foi substituído com alfa-cetoglutarato (como con-troles negativos). As enzimas aminotransferases descritas acima foram tam-bém testadas no lugar de GOAT para confirmar experimentos de especifici-dade iniciais. Amostras foram filtradas e analisadas por CL/EM conformedescrito no Exemplo 18. Os resultados demonstram que a enzima GOATproduziu a quantidade mais elevada de monatina por mg de proteína, com amenor quantidade de triptofano produzida como um subproduto. Além disso,houve um aumento de 2 - 3 vezes na formação de produto quando a enzimadescarboxilase foi adicionada. A enzima AspC de E. coli também produziuquantidades maiores de monatina em comparação com as outras amino-transferases.
A produção de monatina foi aumentada: 1) pela adição periódicade adições de 2 mM de indol-piruvato, piruvato e aspartato (a cada meia ho-ra à hora), 2) pela efetuação das reações num ambiente anaeróbico ou comtampões degaseificados, 3) deixando as reações procederem por várias ho-ras, e 4) pelo uso de descarboxilase recentemente preparada que não tenhasido congelada-descongelada múltiplas vezes. A descarboxilase foi inibidapor concentrações de piruvato maiores do que 12 mM. Em concentrações deindol-3piruvato maiores do que 4 mM, as reações secundárias com indol-3-piruvato foram aceleradas. A quantidade de indol-3-piruvato usada na rea-ção poderia ser aumentada se a quantidade de aldolase também fosse au-mentada. Altos níveis de fosfato (50 mM) e aspartato (50 mM) foram inibitó-rios à reação da enzima descarboxilase. A quantidade de enzima descarbo-xilase adicionada poderia ser reduzida para 0,5 U/mL sem decréscimo naprodução de monatina em um reação de uma hora. A quantidade de monati-na produzida aumentou quando a temperatura foi aumentada de 26°C até30°C e de 30°C até 37°C. Entretanto, a 37°C as reações secundárias de in-dol-3-piruvato também foram aceleradas. A quantidade de monatina produ-zida aumentou com o aumento do pH de 7 para 7,3 e foi relativamente está-vel do pH 7,3 - 8,3.
Uma reação típica começando com triptofano incluiu (concentra-ções finais) Tris-CI 50 mM pH 7,3, triptofano 20 mM, aspartato 6 mM, piruva-to de sódio 6 mM, PLP 0,05 mM, fosfato de potássio 3 mM, MgCI2 3 mM, 25ng/ml_ de aminotransferase, 50 fig/mL de ProA aldolase de C. testosteroni, 4unidades/mL de descarboxilase, 5 - 200 mU/mL de L-aminoácido oxidase(Sigma N9 A-2805), 168 U/mL de catalase (Sigma N9 C-3515) e 0,008 mg deFAD. As reações foram executadas por 30 minutos a 30°C. A melhoria foiobservada com a adição de descarboxilase. A maior quantidade de monatinafoi produzida quando 50 mU/mL de oxidase foi usada. Melhorias foram se-melhantes àquelas observadas quando indol-3-piruvato foi usado como osubstrato. Além disso, a quantidade de monatina produzida aumentou quan-do 1) o nível de triptofano foi baixo (isto é, em concentrações de triptofanoabaixo do Km da enzima aminotransferase e, conseqüentemente, menoscompetitivo com MP no sítio ativo da aminotransferase), e 2) a proporção deoxidase em relação à aldolase e aminotransferase foi mantida num nível talque indol-3-piruvato não poderia se acumular.
Seja partindo ou de indol-3-piruvato ou de triptofano, a quantida-de de monatina produzida nos ensaios com tempos de incubação de 1 - 2horas aumentou quando 2 - 4 vezes as quantidades de todas as enzimasforam usadas enquanto mantendo a mesma proporção de enzima. Usandoqualquer substrato, concentrações de aproximadamente 1 mg/mL de mona-tina foram alcançadas. A quantidade de triptofano produzida se partindo deindol-piruvato foi tipicamente menor do que 20% da quantidade de produto,mostrando o benefício de usar reações acopladas. Com otimização adicionale controle das concentrações de intermediários e reações laterais, a produti-vidade e rendimento podem ser ainda melhorados.
Em lugar do oxaloacetato, alfa-cetoglutarato pode ser utilizadocomo o aceptor amino, com a enzima 2-oxoglutarato descarboxilase (EC4.1.1.71). Nesse caso, succinato semi-aldeído e dióxido de carbono são pro-duzidos. É esperado também que esse esquema reacional previna a ocor-rência das reações reversas, mas não tenha o benefício de proporcionar pi-ruvato como um subproduto. Várias seqüências de genes são publicadasque codificam essa enzima.
Reações acopoladas usando lisina epsílon aminotransferase(EC 2.6.1.36)
Lisina epsílon aminotransferase (L-lisina-6-transaminase) é en-contrada em vários organismos, incluindo Rhodococcus, Mycobacterium,Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Cândida utilis, e Streptomyces. Elaé utilizada por organismos como o primeira etapa na produção de algunsantibióticos beta-lactâmicos (Rius and Demain, J. Microbiol. Biotech., 7:95-100, 1997). Essa enzima converte lisina em L-2-aminoadipato 6-semi-aldeido (alisina) por uma transaminação mediada por PLP do C-6 da lisinaquando alfa-cetoglutarato é o aceptor amino. Alisina é instável e sofre es-pontaneamente uma desidratação intramolecular para formar 1 -piperidina-6-carboxilato, uma molécula cíclica. Isso inibe eficazmente a ocorrência dequalquer reação reversa. O esquema reacional é descrito na FIGURA 12.
Alternativamente, lisina-piruvato 6-transaminase (EC 2.6.1.71) também podeser usada.
Uma reação típica continha em 1 ml_: Tris-HCI 50 mM pH 7,3,indol-3-piruvato 20 mM, PLP 0,05 mM, fosfato de potássio 6 mM pH 8, piru-vato de sódio 2 - 50 mM, MgCI2 1,5 mM, lisina 50 mM, 100 jxg de amino-transferase (lisina epsílon aminotransferase LAT-101, BioCatalytics Pasade-na, CA) e 200 ng de ProA aldolase de C. testosteroni. A quantidade de mo-natina produzida aumentou com as concentrações crescentes de piruvato. Aquantidade máxima usando essas condições reacionais (em piruvato 50mM) foi de 10 vezes menos do que aquela observada com reações acopla-das com oxaloacetato descarboxilase (aproximadamente 0,1 mg/mL).
Na análise de CL/EM das misturas reacionais, um pico com[M+H]+ = 293 eluiu no tempo esperado para a monatina e o espectro demassa continha vários dos mesmos fragmentos observados com os outrosprocessos enzimáticos. Um segundo pico com a proporção massa em rela-ção à carga correta (293) eluiu pouco antes do que o que é tipicamente es-perado para a S,S-monatina produzida no Exemplo 9, sugerindo a presençade outro isômero da monatina. Muito pouco triptofano foi produzido por essaenzima. Entretanto, essa enzima pode ser capaz de usar piruvato como umsubstrato (produzindo alanina como um subproduto). Também, a enzima éconhecida por ser instável). Melhorias podem ser feitas pela efetuação deexperimentos de evolução direcionados para aumentar a estabilidade, redu-zir a atividade com piruvato e aumentar a atividade com MP. Essas reaçõestambém podem ser acopladas com a L-aminoácido oxidase/catalase con-forme descrito acima.
Um processo análogo àquele mostrado na FIGURA 12 utilizaornitina ô-aminotransferase (EC 2.6.1.13) no lugar da lisina epsílon amino-transferase, e ornitina serve como o doador amino nesse caso. O produtoalfa-ceto, semi-aldeído do ácido L-glutâmico, cicliza espontaneamente paraformar A1-pirrolina-5-carboxilato. Esquemas reacionais alternativos usandoesses tipos de enzimas estão descritos em outros lugares para a produçãode preparação de aminoácido não-proteinogênico (T. Li, A. B. Kootstra, I.G.
Fotheringham, Organic Process Research & Development, 6: 533-538(2002)). Esses esquemas requerem a adição de outra aminotransferase comatividade mais alta para o aminoácido de interesse (tal como HEXAspC paramonatina) e glutamato.
Outras reações acopladas
Outra reação de acoplamento que pode melhorar o rendimentoda monatina a partir de triptofano ou indol-piruvato é mostrada na FIGURA13. Formiato desidrogenase (EC 1.2.1.2 ou 1.2.1.43) é uma enzima comum.Algumas formiato desidrogenases requerem NADH, enquanto outras podemutilizar NADPH. Glutamato desidrogenase foi demonstrada para catalisar ainterconversão entre MP e monatina em exemplos anteriores, usando tam-pões com base em amônio. A presença de formiato de amônio e de formiatodesidrogenase é um sistema eficiente para a regeneração de cofatores, e aprodução de dióxido de carbono é uma forma eficiente de diminuir a taxa dasreações reversas (Bommarius et aí., Biocatalysis 10:37, 1994 e Galkin era/.
Appl. Environ. Microbiol. 63:4651-6, 1997). Além disso, grandes quantidadesde formiato de amônio podem ser dissolvidas no tampão reacional. O rendi-mento de monatina produzida pelas reações da glutamato desidrogenase(ou aminações redutivas similares) poderia ser melhorado pela adição deformiato desidrogenase e de formiato de amônio.
Enzimas adequadas para catalisar aminações redutivas simila-res foram demonstradas nos Exemplos 14 e 15. Essas incluíram desidroge-nases de cadeia ramificada de ampla especificidade (EC 1.4.1.9) assim co-mo uma (fenilalanina) desidrogenase aromática (EC 1.4.1.20). É esperadoque a ampla especificidade das D-aminoácido desidrogenases (1.4.99.1)também pode ser utilizada para catalisar essa reação.
Outros processos podem ser usados para direcionar o equilíbriopara a produção de monatina. Por exemplo, se aminopropano servir como oaminoácido doador na conversão de MP em monatina em um reação catali-sada por uma ômega-aminoácido aminotransferase (EC 2.6.1.18), tais comoaquelas descritas pelas patentes americanas 5.360.724 e 5.300.437, um dosprodutos resultantes poderia ser acetona, um produto mais volátila do que osubstrato, aminopropano. A temperatura poderia ser aumentada periodica-mente por curtos períodos para volatilizar seletivamente a acetona, aliviandodessa forma o equilíbrio. Acetona tem um ponto de ebulição de 47°C, umatemperatura não provável de degradar os intermediários se usada por perío-dos curtos de tempo. A maioria das aminotransferases que podem utilizaralfa-cetoglutarato como um aceptor amino também têm atividade no MP.Similarmente, se uma glioxilato/aminoácido aromático aminotransferase (EC2.6.1.60) é usada com glicina como o doador amino, glioxilato é produzido.Esse produto é instável e tem um ponto de ebulição mais baixo do que aque-le da glicina.
EXEMPLO 22
Expressão recombinante
Com CDNA de enzima publicamente disponível e seqüências deaminoácidos, e as enzimas e seqüências aqui descritas, tais como SEQ IDNOS: 11 e12, assim como variantes, polimorfismos, mutantes, fragmentos efusões suas, a expressão e purificação de qualquer proteína, tal como umaenzima, por técnicas padrão de laboratório é capacitada. Uma pessoa ver-sada na técnica irá entender que enzimas e seus fragmentos podem serproduzidos de forma recombinante em qualquer célula ou organismo de inte-resse, e purificadas antes de usar, por exemplo, antes da produção da SEQID NO: 12 e seus derivados.
Métodos para produzir proteínas recombinantes são bem-conhecidos na técnica. Conseqüentemente, o escopo dessa descrição incluia expressão recombinante de qualquer proteína ou fragmento seu, tal comouma enzima. Por exemplo, ver a Patente Americana NQ 5.342.764 paraJohnson et al.; Patente Americana N9 5.846.819 para Pausch et al:, Patente Americana N9 5.876.969 para Fleer et aí. e Sambrook etal.{Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York,1989, Cáp. 17).
Resumidamente, seqüências de CDNA parciais, de comprimentototal ou variantes, as quais codificam para uma proteína ou peptídeo, podemser ligadas num vetor de expressão, tal como um vetor de expressão bacte-riano ou eucariótico. Proteínas e/ou peptídeos podem ser produzidos pelacolocação de um promotor a montante da seqüência de CDNA. Exemplos depromotores incluem, mas não estão limitados, a lac, trp, tac, trc, operadorprincipal e regiões promotoras do fago lâmbda, a região de controle da pro-teína de revestimento fd, os promotores inicial e tardio da SV40, promotoresderivados de polioma, adenovírus, retrovírus, baculovírus e vírus símio, opromotor para a 3-fosfoglicerato quinase, os promotores da fosfatase ácidade levedura, o promotor dos fatores de acasalamento MATalfa emparelha-mento alfa de levedura e combinações suas.
Vetores adequados para a produção de proteínas naturais intac-tas incluem pKC30 (Shimatake e Rosenberg, 1981, Nature 292:128),pKK177-3 (Amann e Brosius, 1985, Gene 40:183) e pET-3 (Studier e Moffatt,1986, J. Mol. Biol. 709:113). Uma seqüência de DNA pode ser transferidapara outros veículos de clonagem, tais como outros plasmídeos, bacteriófa-gos, cosmídeos, vírus animal e cromossomos artificiais de levedura (YACs)(Burke et al., 1987, Science 236:806-812). Esses vetores podem ser introdu-zidos em um variedade de hospedeiros incluindo células somáticas, e orga-nismos simples ou complexos, tais como bactérias, fungos (Timberlake eMarshall, 1989, Science 244:1313-1317), invertebrados, plantas (Gasser eFraley, 1989, Science 244A293), e mamíferos (Pursel etal., 1989, Science244:1281-1288), os quais são tornados transgênicos pela introdução doCDNA heterólogo.
Para expressão em células de mamíferos, uma seqüência deCDNA pode ser ligada a promotores heterólogos, tais como o vírus símioSV40, promotor no vetor pSV2 (Mulligan e Berg, 1981, Proc. A/aí/. Acad. Sei.USA 78:2072-6), e introduzida nas células, tais como células COS-1 de ma-caco (Gluzman, 1981, Ce//23:175-82), para alcançar a expressão temporá-ria ou de longa duração. A integração estável do construeto de gene quimé-rico pode ser mantida em células de mamíferos por seleção bioquímica, talcomo neomicina (Southern e Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 7:327-41) eácido micofenólico (Mulligan e Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA78:2072-6).
A transferência de DNA em um célula eucariótica, tal como deser humano ou de outro mamífero, é uma técnica convencional. Os vetoressão introduzidos nas células receptoras como DNA puro (transfecção), porexemplo, por precipitação com fosfato de cálcio (Graham e vander Eb, 1973,Virology 52:466) fosfato de estrôncio (Brash et al., 1987, Mol. Cell Biol.7:2013), eletroporação (Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841), lipofecção(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei USA 84:7413), DEAE dextrano(McCuthan et al., 1968, J. Natl. Câncer Inst. 47:351), microinjeção (Muelleret al., 1978, Cell 75:579), fusão de protoplasto (Schafner, 1980, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 77:2163-7), ou canhões disparadores de pélete (Klein et al.,1987, Nature 327:70).AIternativamente, o CDNA pode ser introduzido porinfecção com vetores virais, por exemplo retrovírus (Bernstein et al., 1985,Gen. Engrg. 7:235) tal como adenovírus (Ahmad et al., 1986, J. Virol.57:267) ou Herpes (Spaete et al., 1982, Cell 30:295).
Em vista das muitas modalidades possíveis para as quais osprincípios de nossa descrição podem ser aplicados, deve ser reconhecidoque as modalidades ilustradas são somente exemplos particulares da des-crição e não devem ser tomadas como uma limitação no escopo dessa des-crição. Ao contrário, o escopo da descrição está de acordo com as seguintesreivindicações. Dessa forma, reivindica-se nesta invenção tudo o que vemdentro do escopo e espírito dessas reivindicações.Listagem de seqüência
<110> CARGILL, INCORPORATEDHICKS, PAULA M.MCFARLAN, SARA C.
<120> POLIPEPTÍDEOS E VIAS BI OS SINTÉTICAS PARA A PRODUÇÃO DE MONATINA Ê SEUSPRECURSORES"
<130> 2464.008PC03
<150> 11/114,922.<151> 2005-04-26
<160> 91
<170> Patentln Ver. 3.3
<210> 1<211> 1170<212> DNA
<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 1
atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc 60aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc 120ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag 180gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa 240ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtcçagac gcccggcggc 300tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg 360ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc 420gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc 480gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg 540accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc 600ggcctgctgc cgctcgtcga tctcgcctat caggggttcg gccgcggcct cgaccaggat 660gtcgcgggcc tccggcatct tctcggcgtg gtcccggaag cgctcgtcgc ggtttcctgc 720tcgaagtcct tcgggcttta tcgcgagcgc gcgggcgcga tcttcgcgcg gaccagctcg 780actgcctcgg cggacagggt gcgctcaaac ctcgcgggcc tcgcacgcac cagctattcc 840atgccgccgg atcacggcgc agccgtcgtg cggacgatcc ttgacgaccc ggaactcagg 900cgcgactgga cggaggagct cgagacgatg cggctcagga tgacgggcct ccggcggtcg 960cttgccgagg gactccgcac ccgctggcag agcctcggcg cagtcgccga tcaggagggc 1020atgttctcca tgctgccgct ttccgaagcg gaggttatgc ggctcaggac cgagcacggc 1080atctatatgc cggcatccgg ccgcatcaac atcgccgggc tgaagacggc ggaagccgcc 1140gagattgccg gcaagttcac cagtctctga 1170<210> 2<211> 389<212> PRT
<213> Sinorhizobium meliloti<400> 2
Met Phe Asp Ala Leu Ala Arg Gln Ala Asp Asp Pro Leu Leu Phe Leu1 5 10 15
lie Gly Leu Phe Arg Lys Asp Glu Arg Pro Gly Lys Vai Asp Leu Gly20 25 30
Vai Gly Vai Tyr Arg Asp Glu Thr Gly Arg Thr Pro lie Phe Arg Ala35 40 45
Vai Lys Ala Ala Glu Lys Arg Leu Leu Glu Thr Gln Asp Ser Lys Ala50 55 60
Tyr lie Gly Pro Glu Gly Asp Leu Vai Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu65 70 75 80
Leu Vai Gly Gly Asp Thr lie Glu Arg Ser His Vai Ala Gly Vai Gln85 90 95
Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu lie Ala100 105 110
Arg Met Gly Gly Arg Gly lie Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn115 . 120 125
His Ala Pro lie Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp lie Ala Thr Tyr Asp130 135 140
Phe Phe Asp lie Pro Ser Gln Ser Vai lie Phe Asp Asn Leu Vai Ser145 150 ■ 155 160
Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Vai Leu Leu His Ala Ser165 170 175
Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Vai Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu180 185 190
lie Ala Ala Leu Vai Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Vai Asp Leu195 200 205
Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Vai Ala Gly Leu210
Arg His Leu Leu Gly225
Ser Lys Ser Phe Gly245
Arg Thr Ser Ser Thr260
Gly Leu Ala Arg Thr275
Vai Vai Arg Thr lie290
215
Vai Vai Pro Glu Ala Leu230 235
Leu Tyr Arg Glu Arg Ala250
Ala Ser Ala Asp Arg Vai265
Ser Tyr Ser Met Pro Pro280
Leu Asp Asp Pro Glu Leu295
220
Vai Ala Vai Ser Cys240
Gly Ala lie Phe Ala255
Arg Ser Asn Leu Ala270
Asp His Gly Ala Ala285
Arg Arg Asp Trp Thr300
Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser305 310 315 320
Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Vai Ala325 330 335
Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Vai340 345 350
Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly lie Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg355 360 365
lie Asn lie Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu lie Ala Gly370 375 380
Lys Phe Thr Ser Leu385
<210> 3<211> 1260<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides<400> 3
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg 240ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat 300gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc 360gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg 420cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa 480tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac 600ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc 660gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc 720gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg 780ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg 840atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg 1020acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc 1080ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag 1140cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg 1200ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga 1260<210> 4<211> 419<212> PRT
<213> Rhodobacter sphaeroides<400> 4
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr lie15 10 15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro20 25 30
Gln Pro Ala Asp Lys lie Leu Gln Leu lie Gln Met Phe Arg Glu Asp35 40 45
Ala Arg Ala Asp Lys lie Asp Leu Gly Vai Gly Vai Tyr Lys Asp Pro50 55 60
Thr Gly Leu Thr Pro Vai Met Arg Ala Vai Lys Ala Ala Glu Lys Arg65 70 75 80
Leu Trp Glu Vai Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Asp Glu85 90 95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu lie Leu Ala Gly Ala Vai100 105 110
Pro Ala Asp Arg Vai Ala Ser Vai Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala115 120 125Vai Arg Gln Ala Leu Glu Leu lie Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr130 135 140
Vai Trp lie Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser lie Vai Lys145 150 155 160
Tyr Leu Gly lie Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr165 170 175
Gly Ala Vai Asp Ala Glu Gly Met Met Glu Asp Leu Ala Gln Vai Lys180 185 190
Ala Gly Asp Vai Vai Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly195 200 205
Ala Asn Pro Asn Pro Vai Gln Trp Leu Ala lie Cys Glu Ser Leu Ala210 215 220
Arg Thr Gly Ala Vai Pro Leu lie Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly225 230 235 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg245 250 255
Leu Pro Glu Vai Leu lie Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly lie260 265 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly lie Leu lie Ala lie Gly Glu Ala Ala Gly275 280 285
Arg Gly Thr Vai Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr290 295 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Vai Thr Met lie Leu Glu305 310 315 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Vai Arg325 330 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala340 345 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Vai Ala Glu His Arg Gly Met355 360 365Phe Ser Arg Leu Gly lie Thr Pro Ala Glu Vai Glu Arg Leu Arg Thr370 375 380
Glu His Gly Vai Tyr Met Vai Gly Asp Ser Arg Leu Asn lie Ala Gly385 390 395 400
Leu Asn Arg Thr Thr Vai Pro Vai Leu Ala Arg Ala Vai Ala Lys Vai405 410 415
Leu Arg Gly
<210> 5<211> 1260<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 5
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggccgc cgagaagcgg 240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccggcgagcc cgcctacaat 300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcaggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc 360
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg 420
cccgaggcca ctgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa 480
tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540
gccgagggct tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac 600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccgtctgc 660
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ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgaac gggcatcctg 840
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cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg 1020.
acgctgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc 1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag 1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg 1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga 1260
<210> 6<211> 419<212> PRT
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 6Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr lie1 5 10 15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro20 25 30
Gln Pro Ala Asp Lys lie Leu Gln Leu lie Gln Met Phe Arg Glu Asp35 40 45
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Leu Trp Glu Vai Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Gly Glu85 90 95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu lie Leu Ala Gly Ala Vai100 105 110
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Tyr Leu Gly lie Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr165 170 175
Gly Ala Vai Asp Ala Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Ala Gln Vai Lys180 185 190
Ala Gly Asp Vai Vai Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly195 200 205
Ala Asn Pro Asn Pro Vai Gln Trp Leu Ala Vai Cys Glu Ser Leu Ala210 215 220
Arg Thr Gly Ala Vai Pro Leu lie Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly225 230 235 240Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg245 250 255
Leu Pro Glu Vai Leu lie Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly lie260 265 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly lie Leu lie Ala lie Gly Glu Ala Ala Gly275 280 285
Arg Gly Thr Vai Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr290 295 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Vai Thr Met lie Leu Glu305 310 315 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Vai Arg325 330 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala340 345 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Vai Ala Glu His Arg Gly Met355 360 365
Phe Ser Arg Leu Gly lie Thr Pro Ala Glu Vai Glu Arg Leu Arg Thr370 375 380
Glu His Gly Vai Tyr Met Vai Gly Asp Ser Arg Leu Asn lie Ala Gly385 390 395 400
Leu Asn Arg Thr Thr Vai Pro Vai Leu Ala Arg Ala Vai Ala Lys Vai405 410 415
Leu Arg Gly
<210> 7<211> 1239<212> DNA
<213> Leishmania major<400> 7
atgtccatgc aggcggccat gaccacggcg gagcgctggc agaagattca ggcacaagct 60cccgatgtca.tcttcgatct cgcaaaacgc gccgccgctg ccaagggccc caaggccaac 120ctcgtcattg gtgcctaccg cgacgagcag ggccgtccct atccgctacg cgtggtccgc 180aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catctcgggc 240taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag 300aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg 360ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc 420aaccactacg gcgtcgtgaa ggctgctggc tggaagaaca tctgcacgta cgcctactac 480gaccccaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg 540gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg 600caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc 660gactccgcct accaaggcta tgcgagcggc agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc 720ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt "cgttctccaa gaacatgggc 780ttgtacagcg agcgtgcagg cacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg 840gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac 900ggtgcccgct tagcccacct aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca 960gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgcgcc gcaccgtgta cgacgagctg 1020ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc 1080ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca 1140gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag 1200acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga 1239<210> 8<211> 412<212> PRT
<213> Leishmania major<400> 8
Met Ser Met Gln Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gln Lys lie15 10 15
Gln Ala Gln Ala Pro Asp Vai lie Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala20 25 30
Ala Ala Lys Gly Pro Lys Ala Asn Leu Vai lie Gly Ala Tyr Arg Asp35 40 45
Glu Gln Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Arg Vai Vai Arg Lys Ala Glu Gln50 -55 60
Leu Leu Leu Asp Met Asn Leu Asp Tyr Glu Tyr Leu Pro lie Ser Gly65 70 75 80
Tyr Gln Pro Phe lie Asp Glu Ala Vai Lys lie lie Tyr Gly Asn Thr85 90 95
Vai Glu Leu Glu Asn Leu Vai Ala Vai Gln Thr Leu Ser Gly Thr Gly100 105 110
Ala Vai Ser Leu Gly Ala Lys Leu Leu Thr Arg Vai Phe Asp Ala Glu115 120 125
Thr Thr Pro lie Tyr Leu Ser Asp Pro Thr Trp Pro Asn His Tyr Gly130 135 140
Vai Vai Lys Ala Ala Gly Trp Lys Asn lie Cys Thr Tyr Ala Tyr Tyr145 150 155 160
Asp Pro Lys Thr Vai Ser Leu Asn Phe Glu Gly Met Lys Lys Asp lie165 170 175
Leu Ala Ala Pro Asp Gly Ser Vai Phe lie Leu His Gln Cys Ala His180 185 190
Asn Pro Thr Gly Vai Asp Pro Ser Gln Glu Gln Trp Asn Glu lie Ala195 200 205
Ser Leu Met Leu Ala Lys His His Gln Vai Phe Phe Asp Ser Ala Tyr210 215 220
Gln Gly Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asp Ala Tyr Ala Ala Arg225 230 235 240
Leu Phe Ala Arg Arg Gly lie Glu Vai Leu Leu Ala Gln Ser Phe Ser245 250 255
Lys Asn Met Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu260 265 270
Leu Lys Asp Lys Thr Lys Arg Ala Asp Vai Lys Ser Vai Met Asp Ser275 280 285
Leu lie Arg Glu Glu Tyr Thr Cys Pro Pro Ala His Gly Ala Arg Leu290 295 300
Ala His Leu lie Leu Ser Asn Asn Glu Leu Arg Lys Glu Trp Glu Ala305 310 315 320
Glu Leu Ser Ala Met Ala Glu Arg lie Arg Thr Met Arg Arg Thr Vai325 330 335
Tyr Asp Glu Leu Leu Arg Leu Gln Thr Pro Gly Ser Trp Glu His Vai- 340 345 350
lie Asn Gln lie Gly Met Phe Ser Phe Leu Gly Leu Ser Lys Ala Gln355 360 365
Cys Glu Tyr Cys Gln Asn His Asn lie Phe lie Thr Vai Ser Gly Arg370 375 380
Ala Asn Met Ala Gly Leu Thr His Glu Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln385 390 395 400
Thr lie Asn Asp Ala Vai Arg Asn Vai Asn Arg Glu405 410
<210> 9<211> 1182<212> DNA
<213> Bacillus subtilis<400> 9
atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc 60
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ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca 180
tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa 240
aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa 300
gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg 360
cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt 420
gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc 480
aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa 540
gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat 600
gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg 660
gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt 720
ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat 780
gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt 840
gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt 900
cttgtttcca tgggacttga cgtagttaaa ccgtccggtg cgttttatat cttcccttct 960
attaaatcat ..ttggaatgac ttcatttgat tttagtatgg ctcttttgga agacgctggc 1020
gtggcactcg tgccgggcag ctcgttctca acatatggtg aaggatatgt aaggctgtct 1080
tttgcatgct caatggacac gctgagagaa ggcctagacc gtttagaatt atttgtatta 1140
aaaaaacgtg aagcaatgca gacgataaac aacggcgttt aa 1182<210> 10<211> 393<212> PRT
<213> Bacillus subtilis<400> 10
Met Glu His Leu Leu Asn Pro Lys Ala Arg Glu lie Glu lie Ser Gly15 10 15lie Arg Lys Phe Ser Asn Leu Vai Ala Gln His Glu Asp Vai lie Ser20 25 30
Leu Thr lie Gly Gln Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Vai Lys Ala35 40 45
Ala Ala Lys Lys Ala lie Asp Glu Asn Vai Thr Ser Tyr Thr Pro Asn50 55 60
Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gln Ala Vai Gln Leu Tyr Met Lys Lys65 70 75 80
Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu lie lie lie Thr Thr85 90 95
Gly Ala Ser Gln Ala lie Asp Ala Ala Phe Arg Thr lie Leu Ser Pro100 105 110
Gly Asp Glu Vai lie Met Pro Gly Pro lie Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro115 120 125
lie lie Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Vai lie Vai Asp Thr Thr Ser130 135 140
His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu lie Glu Asp Ala Leu Thr Pro145 150 155 160
Asn Thr Lys Cys Vai Vai Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Vai165 170 175
Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser lie Ala Ala Leu Leu Lys Gly180 185 190
Arg Asn Vai Phe Vai Leu Ser Asp Glu lie Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr195 200 205
Asp Arg Pro His Tyr Ser lie Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gln Thr lie210 215 220
Vai lie Asn Gly Leu Ser Lys Ser His Ser Met Thr Gly Trp Arg lie225 230 235 240
Gly Phe Leu Phe Ala Pro Lys Asp lie Ala Lys His lie Leu Lys Vai245 250 255His Gln Tyr Asn Vai Ser Cys Ala Ser Ser lie Ser Gln Lys Ala Ala260 265 270
Leu Glu Ala Vai Thr Asn Gly Phe Asp Asp Ala Leu lie Met Arg Glu275 280 285
Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Vai Tyr Asp Arg Leu Vai Ser Met290 295 300
Gly Leu Asp Vai Vai Lys Pro Ser Gly Ala Phe Tyr lie Phe Pro Ser305 310 315 320
lie Lys Ser Phe Gly Met Thr Ser Phe Asp Phe Ser Met Ala Leu Leu325 330 335
Glu Asp Ala Gly Vai Ala Leu Vai Pro Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr340 345 350
Gly Glu Gly Tyr Vai Arg Leu Ser Phe Ala Cys Ser Met Asp Thr Leu355 360 365
Arg Glu Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Phe Vai Leu Lys Lys Arg Glu370 375 380
Ala Met Gln Thr lie Asn Asn Gly Vai385 390<210> 11<211> 1176<212> DNA
<213> Lactobacillus amylovorus<400> 11
atgccagaat .tagctaatga tttaggatta agcaaaaaga tcactgatgt aaaagcttca 60
ggaattagaa tctttgataa caaagtttca gctattcctg gcattatcaa attgactttg 120
ggtgaaccag atatgaatac tcctgagcat gttaagcaag cggctattaa gaatattgca 180
gataatgatt cacactatgc tccacaaaag ggaaagcttg aattaagaaa agctatcagt 240
aaatatttga aaaagattac tggaattgaa tatgatccag aaacagaaat cgtagtaaca 300
gttggtgcaa ctgaagcaat taacgctacc ttgtttgcta ttactaatcc gggtgacaag 360
gttgcaattc ctacgccagt cttttctcta tattggcccg tggctacact tgctgatgcc 420
gattatgttt tgatgaatac tgcagaagat ggttttaagt taacacctaa gaagttagaa 480
gaaactatca aagaaaatcc aacaattaaa gcagtaattt tgaattatcc aactaaccca 540
actggtgttg aatatagcga agatgaaatt aaagctttgg ctaaggtaat taaagataat 600
catctgtacg taattaccga tgaaatttac agtactttga cttacggtgt aaaacacttt 660
tcaattgcca gcttaattcc agaaagagca atttatatct ctggtttatc taaatcacat 720
gcgatgactg gttatcgttt aggctatgtt gccggacctg caaaaattat ggcagaaatt 780ggtaaagttc atggccttat ggtgacgact acgacggatt catcacaagc tgccgcaatt 840gaagcacttg aacacggact tgatgaccct gagaaatata gggaagttta tgaaaagcgt 900cgtgactatg ttttaaagga attagccgag atagagatgc aagcagttaa gccagaaggt 960gcattttata tctttgctaa aattccagct aagtatggca aagacgatat gaaatttgcc 1020ttggatttag cttttaaaga aaaagtgggt atcactccag gtagtgcatt tggtcctggt 1080ggtgaaggtc atattagatt atcttatgca tcaagtgatg aaaacttgca tgaggcaatg 1140aagcgaatga agaaagtttt acaagaggac gaataa 1176<210> 12<211> 391<212> PRT
<213> Lactobacillus amylovorus<400> 12
Met Pro Glu Leu Ala Asn Asp Leu Gly Leu Ser Lys Lys lie Thr Asp1 5 10 15
Vai Lys Ala Ser Gly lie Arg lie Phe Asp Asn Lys Vai Ser Ala lie20 .25 30
Pro Gly lie lie Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro35 40 45
Glu His Vai Lys Gln Ala Ala lie Lys Asn lie Ala Asp Asn Asp Ser50 55 60
His Tyr Ala Pro Gln Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala lie Ser65 70 75 80
Lys Tyr Leu Lys Lys lie Thr Gly lie Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu85 90 N 95
lie Vai Vai Thr Vai Gly Ala Thr Glu Ala lie Asn Ala Thr Leu Phe100 105 110
Ala lie Thr Asn Pro Gly Asp Lys Vai Ala lie Pro Thr Pro Vai Phe115 120 125
Ser Leu Tyr Trp Pro Vai Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Vai Leu130 135 140
Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu145 150 155 160
Glu Thr lie Lys Glu Asn Pro Thr lie Lys Ala Vai lie Leu Asn Tyr165 170 175Pro Thr Asn Pro Thr Gly Vai Glu Tyr Ser Glu Asp Glu lie Lys Ala180 185 190
Leu Ala Lys Vai lie Lys Asp Asn His Leu Tyr Vai lie Thr Asp Glu195 200 205
lie Tyr Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Vai Lys His Phe Ser lie Ala Ser210 215 220
Leu lie Pro Glu Arg Ala lie Tyr lie Ser Gly Leu Ser Lys Ser His225 230 235 240
Ala Met Thr Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Vai Ala Gly Pro Ala Lys lie245 250 255
Met Ala Glu lie Gly Lys Vai His Gly Leu Met Vai Thr Thr Thr Thr260 265 270
Asp Ser Ser Gln Ala Ala Ala lie Glu Ala Leu Glu His Gly Leu Asp275 280 285
Asp Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Vai Tyr Glu Lys Arg Arg Asp Tyr Vai290 295 300
Leu Lys Glu Leu Ala Glu lie Glu Met Gln Ala Vai Lys Pro Glu Gly305 310 . 315 320
Ala Phe Tyr lie Phe Ala Lys lie Pro Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Asp325 ' 330 335
Met Lys Phe Ala Leu Asp Leu Ala Phe Lys Glu Lys Vai Gly lie Thr, 340 345 350
Pro Gly Ser Ala Phe Gly Pro Gly Gly Glu Gly His lie Arg Leu Ser355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Asp Glu Asn Leu His Glu Ala Met Lys Arg Met Lys370 375 380
Lys Vai Leu Gln Glu Asp Glu385 390<210> 13<211> 1413<212> DNA<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 13
atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc 60
atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg 120
cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc 180
tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg caccttcgtg 240
gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg 300
gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc 360
gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga 420
gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc 480
gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag 540
atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag 600
gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc 660
gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat 720
ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgàc cgtcaccatg 780
ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc 840
gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc 900
cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc 960
ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg 1020
cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc 1080
cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg 1140
gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg 1200
gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa 1260
gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg 1320
gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg 1380
gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga 1413
<210> 14<211> 470<212> PRT
<213> Rhodobacter sphaeroides<400> 14
Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu lie Asp Pro Gly His Gly Gly Pro1 5 10 15
Leu Phe Leu Ala20
Arg Leu Arg Pro35
lie Ala Glu Ala
Gly Ala Arg Leu40
lie Thr Leu Asp25
Pro Gly Thr Arg
lie Thr Arg Gly30
Ala Leu Ala Arg45
Ala Leu Gly Vai His Arg Asn Thr Vai Asp Ala Ala Tyr Gln Glu Leu50 55 60Leu Thr Gln Gly Trp Leu Gln Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Vai65 70 75 80
Ala Gln Asp Leu Pro Gln Gly Met Leu Vai His Arg Pro Ala Pro Ala85 90 95
Pro Vai Glu Pro Vai Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly100 105 110
Ala Pro Asp Pro Glu Leu Vai Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe115 120 125
Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly130 135 140
Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu145 150 155 160
Ala Ser Asp Arg Gly Vai Vai Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu lie Ala165 170 175
Arg Gly Ser Gln Met Ala Leu Phe Leu Vai Ala Arg Ala Ala Leu Ala180 185 190
Pro Gly Glu Ala lie Ala Vai Glu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ala Trp195 200 205
Glu Ala Phe Arg Ala Ala Gly Ala Glu Vai Arg Gly Vai Pro Vai Asp210 215 220
Gly Gly Gly Leu Arg lie Asp Ala Leu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Asp225 230 235 240
Pro Arg lie Arg Ala Vai Tyr Vai Thr Pro His His Gln Tyr Pro Thr245 250 255
Thr Vai Thr Met Gly Ala Ala Arg Arg Leu Gln Leu Leu Glu Leu Ala260 265 270
Glu Arg His Arg Leu Ala Leu lie Glu Asp Asp Tyr Asp His Glu Tyr275 280 285
Arg Phe Glu Gly Arg Pro Vai Leu Pro Leu Ala Ala Arg Ala Pro Glu290 295 300Gly Leu Pro Leu lie Tyr Vai Gly Ser Leu Ser Lys Leu Leu Ser Pro305 310 315 320
Gly lie Arg Leu Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Thr Arg325 330 335
Met Ala Ala Ala Arg Ala Ala lie Asp Arg Gln Gly Asp Ala Pro Leu340 345 350
Glu Ala Ala Leu Ala Glu Leu lie Arg Asp Gly Asp Leu Gly Arg His355 360 365
Ala Arg Lys Ala Arg Arg Vai Tyr Arg Ala Arg Arg Asp Leu Leu Ala370 375 380
Glu Arg Leu Thr Ala Gln Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Asp Leu Pro385 390 395 400
Ala Gly Gly Leu Ala Leu Trp Leu Arg Cys Ala Gly Vai Ser Ala Glu405 410 415
Thr Trp Ala Glu Ala Ala Gly Gln Ala Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly420 425 430
Thr Arg Phe Ala Leu Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ala Phe Arg Leu Gly435 440 445
Tyr Ala Ala Leu Asp Glu Gly Gln lie Ala Arg Ala Vai Glu lie Leu450 455 460
Ala Arg Ser Phe Pro Gly465 470
<210> 15<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 15
ggtattgagg gtcgcatgaa ggttttagtc aatgg<210> 16<211> 37<212> DNA<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 16
agaggagagt tagagcctta tgaaatgcta gcagcct<210> 17<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 17
ggtattgagg gtcgcatgtt cgacgccctc gcccg<210> 18<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 18
agaggagagt tagagcctca gagactggtg aacttgc<210> 19<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 19
ggtattgagg gtcgcatgga acatttgctg aatcc<210> 20<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 20
agaggagagt tagagcctta aacgccgttg tttatcg 37<210> 21<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 21
ggtattgagg gtcgcatgcg cgagcctctt gccct 3 5
<210> 22<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 22
agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg 37<210> 23<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 23
ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat 35<210> 24<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220><223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 24
agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc 37<210> 25<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 25
ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga 35<210> 26<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 26
agaggagagt tagagcctta ttcgtcctct tgtaaaa 37<210> 27<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 27
ggtattgagg gtcgcatgcg ctctacgacg gctcc 35<210> 28<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 28
agaggagagt tagagcctca gccgcgcagc accttgg 37<210> 29<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 29
ggtattgagg gtcgcatgtt tgagaacatt accgc 3 5
<210> 30<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 30
agaggagagt tagagcctta cagcactgcc acaatcg 37<210> 31<211> 1194<212> DNA
<213> Escherichia coli<400> 31
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt 60aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac 120ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct 180catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg 240ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa 300acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg 360gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc gcgtagcaat attcgccggg 420gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt 480aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca 540tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa 600attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc 660ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg 720gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct 780gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt 840cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat 900gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg 960gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat 1020tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac 1080cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg 1140ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa 1194<210> 32<211> 397<212> PRT
<213> Escherichia coli<400> 32
Vai Phe Gln Lys Vai Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro lie Leu Thr Leu15 10 15
Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Vai Asn Leu Ser20 25 30
lie Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly lie lie Pro Gln Leu Gln Ala35 40 45
Vai Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser50 55 60
Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala lie Ala65 70 75 80
Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Vai Leu Lys Gln Gln Arg Vai85 90 95
Ala Thr lie Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Vai Gly Ala100 105 110
Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Vai Trp Vai Ser Asp115 120 125
Pro Thr Trp Glu Asn Arg Vai Ala lie Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu130 135 140
Vai Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Vai Arg Phe145 150 155 160
Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser lie Vai165 170 175Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn180 185 190
Asp Gln Trp Asp Ala Vai lie Glu lie Leu Lys Ala Arg Glu Leu lie195 200 205
Pro Phe Leu Asp lie Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu210 215 220
Asp Ala Tyr Ala lie Arg Ala lie Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu225 230 235 240
Vai Ser Asn Ser Phe Ser Lys lie Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Vai245 250 255
Gly Gly Leu Ser Vai Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Vai260 265 270
Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Vai Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro275 280 285
Asn Phe Gly Ala Gln Vai Vai Ala Ala Vai Leu Asn Asp Glu Ala Leu290 295 300
Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Vai Glu Glu Met Arg Thr Arg lie Leu305 310 315 320
Ala Met Arg Gln Glu Leu Vai Lys Vai Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu325 330 335
Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr340 345 350
Gly Leu Ser Ala Ala Gln Vai Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Vai355 360 365
Tyr Leu lie Ala Ser Gly Arg Met Cys Vai Ala Gly Leu Asn Thr Ala370 375 380
Asn Vai Gln Arg Vai Ala Lys Ala Phe Ala Ala Vai Met385 390 395
<210> 33<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 33
ggtattgagg gtcgcgtgtt tcaaaaagtt gacgc<210> 34<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 34
agaggagagt tagagcctta catcaccgca gcaaacg<210> 35<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial
<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 35
ggtattgagg gtcgcatgga gtccaaagtc gttga<210> 36<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 36
agaggagagt tagagcctta cacttggaaa acagcct<210> 37<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 37
ggtattgagg gtcgcatgaa aaactggaaa acaag 35<210> 38<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 38
agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta 37<210> 39<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 39
ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa 35<210> 40<211> 36<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 40
agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag 36<210> 41<211> 1416<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 41atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa 60cgtaccaccc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg 120ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg 180cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac 240tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac 300cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa 360aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag 420ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt 540gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg 840tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat 1020ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca 1080ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 132 0catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta 1380ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416<210> 42<211> 1371<212> DNA
<213> Citrobacter freundii<400> 42
atgaattatc cggçagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120aaagatattt .atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag 180tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt 300ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt 480aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg 540gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg 600cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa 660aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc 720gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa 900gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag 960
caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020
ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag 1080
ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag 1140
cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200
gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg 1260
gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320
tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a 1371
<210> 43<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 43
ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35<210> 44<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 44
agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg 37<210> 45<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 45
ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc 35<210> 46<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 46
agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg 37<210> 47<211> 31<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 47
ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t 31<210> 48<211> 30<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 48
tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt 30<210> 49<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 49
tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt 32<210> 50<211> 30<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 50
ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca 30<210> 51<211> 29<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 51
aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg 29<210> 52<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 52
tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at 32<210> 53<211> 29<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 53
gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat 29<210> 54<211> 29<212> DNA
<213> Seqüência artifial
<220><223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 54
gtagacgcgg actaactctt tggcagaag 29<210> 55<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 55
ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt 35<210> 56<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 56
agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc 37<210> 57<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 57
ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca 35<210> 58<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial
<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 58
agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca
37
<210> 59<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 59
ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg 3 5
<210> 60<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<210> 61<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 61
ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35<210> 62<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial
<400>
60
agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca
37
<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 62
agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37<210> 63<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 63
ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35<210> 64<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 64
agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga 37<210> 65<211> 684<212> DNA
<213> Comamonas testosteroni
<400> 65
atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac 60
ggcctggccg .ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc 120
aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg 180
ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagát tcagcccggc 240
gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg 300
gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac 360
gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc 420
acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc 480
acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt 540
gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc 600
aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag 660
gccggcctga aatatattga ctaa 684
<210> 66<212> PRT
<213> Comamonas testosteroni<400> 66
Met Tyr Glu Leu Gly Vai Vai Tyr Arg Asn lie Gln Arg Ala Asp Arg15 10 15
Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Vai His Glu20 25 30
Ala Met Gly Arg Vai Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro lie Tyr35 40 45
Ala Gly Lys Gln Vai Ser Gly Thr Ala Vai Thr Vai Leu Leu Gln Pro50 55 60
Gly Asp Asn Trp Met Met His Vai Ala Ala Glu Gln lie Gln Pro Gly65 70 75 80
Asp lie Vai Vai Ala Ala Vai Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe85 90 95
Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu100 105 110
lie lie Asp Ala Gly Vai Arg Asp Vai Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp115 120 125
Phe Pro Vai Trp Ser Lys Ala lie Ser Ser Lys Gly Thr lie Lys Ala130 135 140
Thr Leu Gly Ser Vai Asn lie Pro lie Vai Cys Ala Gly Met Leu Vai145 150 155 160
Thr Pro Gly Asp Vai lie Vai Ala Asp Asp Asp Gly Vai Vai Cys Vai165 170 175
Pro Ala Ala Arg Ala Vai Glu Vai Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu180 185 190
Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly lie Leu Gly195 200 205
Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys210 215 220Tyr lie Asp225
<210> 67<211> 42<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 67
actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct 42<210> 68<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 68
cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc 33<210> 69<211> 31<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 69
cgcggatcca taatggttga gaacattacc g<210> 70<211> 30<212> DNA
<213> Seqüência artifial
31
<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 70
acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg<210> 71<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 71
ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt<210> 72<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 72
gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc<210> 73<211> 15<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 73
ggtattgagg gtcgc<210> 74<211> 17<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 74
agaggagagt tagagcc<210> 75<211> 1191<212> DNA
<213> Escherichia coli<400> 75
atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtctctatta cgatgagacg 120ggcaaaatcc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180accaccaaac tttacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300ccggggggct ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840gctaactact cttccccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191<210> 76<211> 396<212> PRT
<213> Escherichia coli<400> 76
Met Phe Glu Asn lie Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro lie Leu Gly Leu1 5 10 15
Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys lie Asn Leu Gly20 25 30
lie Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Thr Gly Lys lie Pro Vai Leu Thr Ser35 40 45
Vai Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Leu50 55 60
Tyr Leu Gly lie Asp Gly lie Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu65 70 75 80
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu lie Asn Asp Lys Arg Ala Arg85 90 95
Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Vai Ala Ala Asp100 105 110
Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Vai Lys Arg Vai Trp Vai Ser Asn Pro115 120 125
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Vai Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Vai130 135 140
Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp145 150 155 160
Ala Leu lie Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Vai Vai Leu165 170 175
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly lie Asp Pro Thr Leu Glu180 185 190
Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Vai Glu Lys Gly Trp Leu Pro195 200 205
Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp210 215 220
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu lie Vai225 230 235 240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Vai Gly245 250 255
Ala Cys Thr Leu Vai Ala Ala Asp Ser Glu Thr Vai Asp Arg Ala Phe260 265 270
Ser Gln Met Lys Ala Ala lie Arg Ala Asn Tyr Ser Ser Pro Pro Ala275 280 285
His Gly Ala Ser Vai Vai Ala Thr lie Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg290 295 300
Ala lie Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg lie Gln Arg305 310 315 320
Met Arg Gln Leu Phe Vai Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg325 330 335
Asp Phe Ser Phe lie lie Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly340 345 350
Leu Thr Lys Glu Gln Vai Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Vai Tyr355 360 365
Ala Vai Ala Ser Gly Arg Vai Asn Vai Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn370 375 380
Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala lie Vai Ala Vai Leu385 390 395
<210> 77<211> 30<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 77
gcggaacata tgtttgagaa cattaccgcc 30<210> 78<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 78
ataaccggat ccttacagca ctgccacaat cg 32<210> 79<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência artifial
<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético<400> 79
gcggcgcata tggtgtttca aaaagttgac gc 32<210> 80<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 80
ccaataggat ccttacatca ccgcagcaaa cg 32<210> 81<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 81
ggccggcata tgcgtgatat cgattccgta at 32<210> 82<211> 30<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 82
ggaattctcg agttaggcaa cagcagcgcg 30<210> 83<211> 627<212> DNA
<213> Zyinomonas mobilis
<400> 83
atgcgtgata tcgattccgt aatgcgtttg gcaccggtta tgccggtcct cgtcattgaa 60gatattgctg atgcaaaacc tatcgcagaa gctttggttg ctggtggtct gaacgttctt 120gaagtaacgc ttcgcacccc ttgtgctctt gaagccatca agatcatgaa agaagttccg 180
ggtgccgttg ttggtgccgg tacggttctg aacgcaaaaa tgctcgacca agctcaggaa 240
gctggttgcg aatttttcgt tagcccgggt ctgaccgctg acctcggcaa gcatgctgtt 300
gcccagaaag cagctttgct tccaggtgtt gctaatgctg ctgatgtgat gcttggtctt 360
gaccttggtc ttgatcgctt caaattcttc ccggctgaaa atatcggtgg tttacctgcc 420
ctgaagtcca tggcttctgt tttccgtcag gttcgtttct gcccgaccgg cggtatcacc 480
ccgacgtcag ctcctaaata tcttgaaaac ccgtccattc tttgcgtcgg tggtagctgg 540
gttgttccgg ctggcaaacc agatgtcgca aaaatcacgg cactcgctaa agaagcttct 600
gctttcaagc gcgctgctgt tgcctaa 627<210> 84<211> 208<212> PRT
<213> Zymomonas mobilis<400> 84
Met Arg Asp lie Asp Ser Vai Met Arg Leu Ala Pro Vai Met Pro Vai15 10 15
Leu Vai lie Glu Asp lie Ala Asp Ala Lys Pro lie Ala Glu Ala Leu20 25 30
Vai Ala Gly Gly Leu Asn Vai Leu Glu Vai Thr Leu Arg Thr Pro Cys35 40 45
Ala Leu Glu Ala lie Lys lie Met Lys Glu Vai Pro Gly Ala Vai Vai50 55 60
Gly Ala Gly Thr Vai Leu Asn Ala Lys Met Leu Asp Gln Ala Gln Glu65 70 75 80
Ala Gly Cys Glu Phe Phe Vai Ser Pro Gly Leu Thr Ala Asp Leu Gly85 90 95
Lys His Ala Vai Ala Gln Lys Ala Ala Leu Leu Pro Gly Vai Ala Asn100 105 110
Ala Ala Asp Vai Met Leu Gly Leu Asp Leu Gly Leu Asp Arg Phe Lys115 120 125
Phe Phe Pro Ala Glu Asn lie Gly Gly Leu Pro Ala Leu Lys Ser Met130 135 140
Ala Ser Vai Phe Arg Gln Vai Arg Phe Cys Pro Thr Gly Gly lie Thr145 150 155 160Pro Thr Ser Ala Pro Lys Tyr Leu Glu Asn Pro Ser lie Leu Cys Vai165 170 175
Gly Gly Ser Trp Vai Vai Pro Ala Gly Lys Pro Asp Vai Ala Lys lie180 185 190
Thr Ala Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ala Phe Lys Arg Ala Ala Vai Ala195 200 205
<210> 85<211> 52<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 85
tgaccctcta gataagaagg agatatacat atggctgaca ctcgccctga ac 52<210> 86<211> 39<212> DNA
<213> Seqüência artifiai<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintético
<400> 86
ttctcaagct tttattccgc gttttcgtga atatgtttg 39<210> 87<211> 672<212> DNA
<213> Rhizobium leguminosarum<400> 87
atgggcatcg tcgtacagaa cataccacgg gcggaagctg atgtgatcga caggctcgcc 60aaatcaggcg tcgcgacggt ccacgaagcc caggggcgca aaggcatgct cgccagccat 120atgagaccaa tctattcagg tgcgcagatc gccggctccg ccattacgat ctccgcaccg 180cccggtgata actggatgat ccatgtggcg atcgagcaga tccaggccgg cgacatcctg 240gtgctttcgc cgacctcgcc ctgtgacaac ggttatttcg gcgacctgct tgccacctcg 300gcgcgggcgc gaggttgccg cggccttgtc atcgacgccg gtgtccgcga tatcagggat 360ctgacccaga tgcagttccc cgtgtggtcc aaggccgtgt ccgcgcaggg gaccgtcaag 420gaaacgctcg gttcggtcaa cgttccgatc gtctgcgctg gcgccttcat cgaagccggc 480gacatcatcg tcgccgacga cgacggggtg tgcgtggtga agctcaacgc ggccgaggag 540gttctgactg ctgccgagaa ccgtgtggcg aacgaggagg ccaagcggca acgcctcgcc 600gccggcgaac tcgggctcga tatctatgac atgcggtcga agctccggga aaaggggctt 660aaatatgtat ga 672<210> 88<211> 224<212> PRT
<213> Rhizobium leguminosarum<400> 88
Met Gly lie Vai Vai Gln Asn lie Pro Arg Ala Glu Ala Asp Vai lie1.5 10 15
Asp Arg Leu Ala Lys Ser Gly Vai Ala Thr Vai His Glu Ala Gln Gly20 25 30
Arg Lys Gly Met Leu Ala Ser His Met Arg Pro lie Tyr Ser Gly Ala35 40 45
Gln lie Ala Gly Ser Ala lie Thr lie Ser Ala Pro Pro Gly Asp Asn50 55 60
Trp Met lie His Vai Ala lie Glu Gln lie Gln Ala Gly Asp lie Leu65 70 75 80
Vai Leu Ser Pro Thr Ser Pro Cys Asp Asn Gly Tyr Phe Gly Asp Leu85 90 95
Leu Ala Thr Ser Ala Arg Ala Arg Gly Cys Arg Gly Leu Vai lie Asp100 105 . 110
Ala Gly Vai Arg Asp lie Arg Asp Leu Thr Gln Met Gln Phe Pro Vai115 120 125
Trp Ser Lys Ala Vai Ser Ala Gln Gly Thr Vai Lys Glu Thr Leu Gly130 135 140
Ser Vai Asn Vai Pro lie Vai Cys Ala Gly Ala Phe lie Glu Ala Gly145 150 155 160
Asp lie lie Vai Ala Asp Asp Asp Gly Vai Cys Vai Vai Lys Leu Asn165 170 175
Ala Ala Glu Glu Vai Leu Thr Ala Ala Glu Asn Arg Vai Ala Asn Glu180 185 190
Glu Ala Lys Arg Gln Arg Leu Ala Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp lie195 200 205
Tyr Asp Met Arg Ser Lys Leu Arg Glu Lys Gly Leu Lys Tyr Vai Trp210 215 220
<210> 89<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Iniciador sintéticooligonucleotide
<400> 89
aggtcgtgta ctgtcagtca 20<210> 90<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Oligonucleotide sintético<400> 90
acgtggtgaa ctgccagtga 20<210> 91<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência artifial<220>
<223> Descrição da Seqüência artificial: Marcador 6xHis tag sintético
<400> 91
His His His His His His1 5

Claims (35)

1. Método para produzir monatina ou um sal seu, compreen-dendo o uso de uma aminotransferase HEXAspC (No. de acesso NCBI:uma reação envolvendo triptofano, uma reação envolvendo ácido 2-hidróxi--2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico e uma combinação destas.
2. Método para produzir monatina ou um sal seu, compreen-dendo o uso de uma aminotransferase de cadeia ramificada (BCAT) (EC-2.6.1.42) ou uma desidrogenase de cadeia ramificada (EC 1.4.1.9) para faci-litar a reação do ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a amino-transferase de cadeia ramificada (BCAT) (EC 2.6.1.42) é AT-102 ou AT-104.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a desidro-genase de cadeia ramificada (EC 1.4.1.9) é AADH-110.
5. Método para produzir ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico compreendendo o uso de uma KHG aldolase de Z. mobilis parafacilitar a reação do indol-3-piruvato, em que a KHG aldolase de Z. mobilis éa KHG aldolase de Z. mobilis (No. de Acesso: AAV89621.1 Gl:56543467) ouum polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelomenos cerca de 90% idêntica à KHG aldolase de Z. mobilis (No. de Acesso:AAV89621.1 Gl:56543467) e tem atividade de KHG aldolase de Z. mobilis.
6. Método para produzir monatina ou um sal seu, compreen-dendo o uso de uma KHG aldolase (EC 4.1.3.16) para facilitar uma reaçãodo indol-3-piruvato, em que mais de 60% da monatina produzida na reação éum estereoisômero R,R de monatina.
7. Método para produzir ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico compreendendo a reação de uma mistura reacional, a misturacompreendendo:(a) triptofano;(b) um primeiro polipeptídeo escolhido de HEXAspC aminotrans-ferase (No. de Acesso NCBI: 1 AHF_A Gl:1127190), YfdZ (No. de AcessoNCBI: AAC75438.1) e uma combinação destes, e(c) um segundo polipeptídeo escolhido de KHG aldolase (EC-4.1.3.16), ProA aldolase (EC 4.1.3.17) e uma combinação destes.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o triptofa-no compreende D-triptofano.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a KHG al-dolase é KHG aldolase de Z. mobilis (No. de Acesso: AAV8621.1 Gl:-56543467) ou um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá-cidos que seja pelo menos cerca de 90% idêntica a uma KHG aldolase de Z.mobilis (No. de Acesso: AAV89621.1 Gl:56543467) e tendo atividade deKHG aldolase de Z. mobilis.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que a ProA al-dolase é escolhida de uma ProA aldolase de C. testosteroni, uma ProA aldo-lase de S. meliloti e uma combinação destas.
11. Método para produzir monatina, compreendendo a reação deuma mistura reacional, a mistura compreendendo:(a) ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico; e(b) um polipeptídeo escolhido de YfdZ (No. de Acesso NCBI:AAC75438.1), HEXAspC aminotransferase (No. de Acesso NCBI: 1AHF_AGl: 1127190), uma aminotransferase de cadeia ramificada (BCAT) (EC-2.6.1.42), uma desidrogenase de cadeia ramificada (EC 1.4.1.9) e uma com-binação destas.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a misturareacional compreende ainda:(c) indol-3-piruvato; e(d) um segundo polipeptídeo que é capaz de converter indol-3-piruvato e uma fonte de carbono C3 em ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, a mistura com-preendendo um extrato de células não-purificado que inclui YfdZ (No. de A-cesso NCBI. AAC75438.1), HEXAspC aminotransferase (No. de AcessoNCBI: 1 AHF_A Gl:1127190) ou uma combinação destes.
14. Método para produzir monatina ou um sal seu, compreen-dendo a reação de uma mistura reacional, a mistura compreendendo:(a) ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico; e(b) um polipeptídeo escolhido de AT-101, AT-102, AT-103, AT-104, AADH-102, AADH-110, AADH-112, AADH-113 e uma combinação destes.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que o poli-peptídeo escolhido é AT-103.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que mais de 65% da monatina produzida no método é um estereoisômero R,R da monatina.
17. Método para produzir monatina ou um sal seu a partir de trip-tofano ou indol-3-piruvato, compreendendo a produção enzimaticamente deuma composição de monatina, em que pelo menos cerca de 80% da mona-tina ou de seu sal presente na composição de monatina é um estereoisôme-ro R,R de monatina.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o tripto-fano compreende D-triptofano.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que pelo me-nos cerca de 84% da monatina ou de seu sal presente na composição demonatina é um estereoisômero R,R da monatina.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o métodocompreende ainda o fornecimento de uma ProA aldolase (EC 4.1.3.17) parafacilitar a conversão de indol-3-piruvato em 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárieo.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o métodocompreende ainda o fornecimento de AT-103 (D-transaminase) para facilitara conversão de ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)4-cetoglutárico em monatina.
22. Método para produzir monatina ou um sal seu, compreen-dendo a reação de uma mistura reacional, a mistura compreendendo:(a) triptofano, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico,ou uma cominação destes; e(b) um polipeptídeo AspC de E. coli (No. de Acesso NCBI. A-AC74014.1) com pelo menos uma substituição na posição do aminoácidoescolhida a partir das posições 39, 41, 47, 69, 109, 297 e uma combinaçãodestas, em que a numeração das posições dos aminoácidos é baseada numsistema de numeração de aspartato aminotransferase citosólica de porco.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o poli-peptídeo AspC de E. coli tem atividade de aspartato aminotransferase.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o poli-peptídeo AspC compreende uma substituição de Vai 39 para Leu.
25. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o poli-peptídeo AspC compreende uma substituição Lys 41 para Tyr.
26. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o poli-peptídeo AspC compreende uma substituição Thr 47 para lie.
27. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o poli-peptídeo AspC compreende uma substituição Asn 69 para Leu.
28. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o poli-peptídeo AspC compreende uma substituição Thr 109 para Ser.
29. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o poli-peptídeo AspC compreende uma substituição Asn 297 para Ser.
30. Método para produzir ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico, compreendendo a reação de uma mistura reacional, a misturacompreendendo:(a) indol-3-piruvato; e(b) uma aldolase, escolhida a partir de Bradyrhizobium japoni-cum str. USDA 110 (No. de Acesso NCBI: Gl:27378953); Sphingomonas(Pseudomonas) paucimobilis (No. de Acesso NCBI: Gl: 19918963); Yersiniapestis KIM (No. de Acesso NCBI: Gl:21956715); Ralstonia metalliduransCH34 (No. de Acesso NCBI: Gl:48767386); Yersinia pseudotuberculosis IP-32953 (No. de Acesso NCBI: Gl:51594436); Rhizobium leguminosarum bio-var viciae rhiz23g02-p1k_1009_341 (SEQ ID NO: 88); Novosphingobium a-romaticivorans DSM 12444 (Sphingomonas aromaticivorans F199) (No. deAcesso NCBI: Gl:48849026); Pseudomonas putida KT2440 (No. de AcessoNCBI: Gl:24984081); Magnetospirillum magnetotacticum MS-1 (No. de A-cesso NCBI: Gl:46200890); Rhodopseudomonas palustris CGA009 (No. deAcesso NCBI: Gl:39937756); Xanthomonas campestris ATCC-33913 (No. deAcesso NCBI: Gl:21115297); Xanthomonas axonopodis citri 306 (No. de A-cesso NCBI: Gl:21110581); Streptomyces avermitilis MA-4680 (No. de Aces-so NCBI: Gl:29828159); e uma combinação destas.
31. Método para produzir ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetila)-4-cetoglutárico, compreendendo a reação de uma mistura reacional que inclui:(a) indol-3-piruvato; e(b) uma aldolase compreendendo uma seqüência de aminoáci-dos que é pelo menos cerca de 49% idêntica à ProA de C. testosteroni (SEQID NO: 66) ou uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de56% idêntica à ProA de Sinorhizobium meliloti (No. de Acesso NCBI:CAC46344), em que a aldolase tem atividade de 4-hidróxi-4-metila-2-oxoglutarato liase.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que a se-qüência de aminoácidos é pelo menos cerca de 60% idêntica à ProA de C.testosteroni (SEQ ID NO: 66).
33. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que a se-qüência de aminoácidos é pelo menos cerca de 70% idêntica à ProA de C.testosteroni (SEQ ID NO: 66).
34. Método para produzir monatina ou um sal seu, compreen-dendo a reação de uma mistura reacional que inclui triptofano e uma desa-minase (EC 3.5.1.-) que é derivado de um microrganismo escolhido de: Pro-teus spp., Providencia spp., Morganella spp., ou combinações destes.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o Pro-teus spp. inclui Proteus myxofaciens, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, eProteus morganii.
BRPI0609878-9A 2005-04-26 2006-04-26 polipeptìdeos e vias biossintéticas para a produção de monatina e seus precursores BRPI0609878A2 (pt)

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