ES2285543T3 - Procedimiento para la purificacion de la proteina de union a il-18. - Google Patents
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Abstract
Uso de cromatografía de carga-inducción hidrófoba para la producción de la proteína de unión a IL-18 (IL-18BP).
Description
Procedimiento para la purificación de la
proteína de unión al IL-18.
La presente invención se refiere al campo de
purificación de proteínas. Más específicamente, se refiere a la
purificación de la proteína de unión a IL-18
(IL-18BP) vía cromatografía de
carga-inducción hidrófoba. Preferiblemente, la
invención comprende además etapas de purificación seleccionadas
entre cromatografía de afinidad de iones de metal inmovilizados,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y cromatografía de fase inversa.
Las proteínas se han convertido en fármacos
importantes desde el punto de vista comercial y también se las
denomina "compuestos biológicos". Uno de los desafíos más
grandes es el desarrollo de procedimientos rentables y eficaces
para la purificación de proteínas a escala comercial. Si bien
existen hoy en día muchos métodos para la preparación de proteínas
a gran escala, los productos brutos, como los fluidos corporales,
contienen no solamente el producto deseado sino también las
impurezas que son difíciles de separar del producto deseado. A su
vez, las fuentes biológicas de proteínas usualmente contienen
mezclas complejas de materiales.
Las fuentes biológicas tales como sobrenadantes
de cultivo celular de células que expresan un producto proteínico
en un modo recombinante pueden contener menos impurezas, en
particular si las células se cultivan en medio libre de suero. No
obstante, las autoridades sanitarias exigen altos estándares de
pureza para las proteínas destinadas para administración a seres
humanos. Además, muchos métodos de purificación pueden contener
etapas que requieran la aplicación de bajo o alto pH, altas
concentraciones salinas u otras condiciones extremas que pueden
poner en riesgo la actividad biológica de una proteína determinada.
Por lo tanto, para cualquier proteína, es un desafío establecer un
procedimiento de purificación que permita pureza suficiente a la vez
que retenga la actividad biológica de la proteína.
Los sistemas cromatográficos de intercambio
iónico se han utilizado ampliamente para separación de proteínas
principalmente en base a diferencias en la carga. En la
cromatografía de intercambio iónico, los parches cargados en la
superficie del soluto son atraídos por cargas opuestas a una matriz
de cromatografía, siempre que la fuerza iónica del tampón
circundante sea baja. La elución por lo general se logra aumentado
la fuerza iónica (es decir, la conductividad) del tampón para
competir con el soluto para los sitios cargados de la matriz de
intercambio iónico. Cambiar el pH y en consecuencia alterar la carga
del soluto es otra forma de lograr la elución del soluto. El cambio
en conductividad o pH puede ser gradual (elución en gradiente) o en
incrementos (elución por incrementos).
Los intercambiadores aniónicos se pueden
clasificar como débiles o fuertes. El grupo de carga en un
intercambiador aniónico débil es una base débil que se desprotona
y, por lo tanto, pierde su carga en un alto valor de pH.
DEAE-celulosa es un ejemplo de un intercambiador
aniónico débil, donde el grupo amino puede estar cargado
positivamente debajo de \sim9 y pierde gradualmente su carga en
valores de pH superiores. Dietilaminoetilo (DEAE) o
dietil-(2-hidroxi-propil)aminoetilo
(QAE) tienen cloro como contra ión, por ejemplo.
Un intercambiador aniónico fuerte, por el
contrario, contiene una base fuerte, que permanece positivamente
cargada en todo el intervalo de pH normalmente utilizado para la
cromatografía de intercambio iónico (pH 1-14).
Q-sefarosa (Q equivale a amonio cuaternario) es un
ejemplo de un intercambiador aniónico fuerte.
Los intercambiadores catiónicos pueden también
clasificarse como débiles o fuertes. Un intercambiador catiónico
fuerte contiene un ácido fuerte (como un grupo sulfopropilo) que
permanece cargado de pH 1 -14; mientras que un intercambiador
catiónico débil contiene un ácido débil (como un grupo
carboximetilo), que pierde gradualmente su carga a medida que el pH
disminuye por debajo de 4 ó 5. Carboximetilo (CM) y sulfopropilo
(SP) tienen sodio como contraión, por ejemplo.
Los sistemas cromatográficos que tienen una fase
estacionaria hidrófoba también se han empleado ampliamente en la
purificación de proteínas. Incluidas en esta categoría se encuentran
la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y la cromatografía
líquida de fase inversa (RPLC). La base
físico-química para la separación por HIC y RPLC es
el efecto hidrófobo, las proteínas se separan en una fase
estacionaria hidrófoba basada en diferencias en hidrofobicidad.
En la HIC, en general, las moléculas de muestra
en un tampón altamente salino se cargan en la columna de HIC. La
sal en el tampón interactúa con las moléculas de agua para reducir
la solvatación de las moléculas en disolución, exponiendo así las
regiones hidrófobas en las moléculas de muestra que en consecuencia
son adsorbidas por la columna de HIC. Cuanto más hidrófoba sea la
molécula, menos sal se necesitará para promover la unión.
Usualmente, se utiliza un gradiente de sal decreciente para eluir
las muestras de la columna. A medida que disminuye la fuerza
iónica, la exposición de las regiones hidrófilas de las moléculas
aumenta y las moléculas se eluyen de la columna con el fin de
aumentar la hidrofobicidad. La elución de la muestra también se
puede lograr por la adición de modificadores orgánicos o
detergentes suaves al tampón de elución.
La HIC se estudia, p. ej., en Protein
Purification, 2ª Ed., Springer-Verlag, New York, pág
176-179 (1988).
En la HIC, existen diferentes soportes
cromatográficos que portan diversos ligandos. Los ligandos difieren
con respecto a su hidrofobicidad. Los ligandos hidrófobos comúnmente
utilizados son residuos fenilo, butilo u octilo. La cromatografía
de carga-inducción hidrófoba es un subconjunto de
HIC que usa resinas que portan ligandos tales como derivados de
4-mercaptoetilpiridina. Un ejemplo para una resina
de cromatografía de carga-inducción hidrófoba es
MEP-HyperCel® (Boschetti et al., Genetic
Engineering Vol. 20, No. 13, julio, 2000, Boschetti and
Jungbauer,
2000).
2000).
La cromatografía de fase inversa es un método de
purificación de proteínas íntimamente relacionado a la HIC, ya que
ambos se basan en interacciones entre grupos no polares accesibles a
disolvente en la superficie de las biomoléculas y los ligandos
hidrófobos de la matriz. No obstante, los ligandos usados en la
cromatografía de fase inversa son más altamente sustituidos con
ligandos hidrófobos que con ligandos HIC. Si bien el grado de
sustitución de adsorbentes HIC puede estar en el intervalo de
10-50 \mumoles/ml de matriz de ligandos de arilo
C_{2}-C_{8}, usualmente se utilizan varios
cientos de \mumoles/ml de matriz de ligandos alquilo
C_{4}-C_{8} para los adsorbentes de
cromatografía de fase
inversa.
inversa.
La cromatografía de interacción hidrófoba y la
cromatografía de fase inversa también son distintas en el sentido
que la cromatografía de interacción hidrófoba se realiza en
condiciones disolventes acuosas y se usan cambios en la fuerza
iónica para eluir la columna. La proteína típicamente se une en el
estado nativo vía grupos hidrófobos ubicados en la superficie de la
proteína, y el estado nativo se retiene durante las condiciones de
elución. En contraste, la cromatografía de fase inversa utiliza un
disolvente hidrófobo (típicamente acetonitrilo) y la unión de un
ligando es una función de la fase de división entre la naturaleza
hidrófoba del disolvente y el grupo funcional de la columna. Las
proteínas típicamente se desnaturalizan hasta algún grado en dichos
disolventes y se unen debido a la naturaleza hidrófoba de toda la
secuencia de polipéptidos. Dado que la mayoría de los grupos
hidrófobos están ubicados en el núcleo de las proteínas globulares,
la unión se relaciona al grado de desnaturalización de la proteína
y la accesibilidad de estos grupos a los grupos funcionales de la
columna.
La columna Source 30RPC es una matriz de fase
inversa polimérica. Se basa en microesferas de
poliestireno/divinilbenceno de 30 micrómetros de diámetro, rígidas,
de un solo tamaño. Sus características se pueden resumir de la
siguiente manera: intervalo de pH excesivamente amplio (1 - 12),
alta selectividad, alta resistencia química, gran capacidad y alta
resolución en altos caudales.
Otro tipo de cromatografía ampliamente utilizado
para la purificación de proteínas se denomina cromatografía de
afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC). En 1975, Porath
introdujo la cromatografía de afinidad de iones metálicos
inmovilizados (IMAC) para fraccionar proteínas [J. Porath, J.
Carlsson, I. Olsson y G. Belfrage, Nature (Londres) 258,
598-599 (1975)]. En el trabajo de Porath, la IMAC
consiste en derivatizar una resina con ácido iminodiacético (IDA) y
iones metálicos quelantes a la resina derivatizada de IDA. Las
proteínas se separan en base a su afinidad con los iones de metal,
que han sido inmovilizados por quelación. Las proteínas se unen a
los iones metálicos a través de sitios de coordinación desocupados y
se inmovilizan en la columna. Desde luego, se usaron otros ligandos
distintos de IDA para quelar los iones metálicos a las resinas. Los
estudios con proteínas séricas han demostrado que la IMAC es una
técnica de separación extremadamente específica y selectiva [J.
Porath y B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630
(1983)]. El adsorbente se prepara acoplando un ligando formador de
quelato de metal, como ácido iminodiacético, a Sefarosa o superosa y
tratándolo con una disolución de uno o más iones metálicos
divalentes tales como Zn^{2+}, Cu^{2+} Cd^{2+}, Hg^{2+},
Co^{2+} Ni^{2+} o Fe^{2+}. La reacción de unión depende del pH
y la elución se lleva a cabo reduciendo el pH y aumentando la
fuerza iónica del tampón, o incluyendo EDTA en el tampón.
El mecanismo real que da lugar a la unión de las
proteínas con los iones de metal libres no se comprende del todo y
depende de una serie de factores, especialmente de la conformación
de la proteína particular. No obstante, cuando los iones de metal
se inmovilizan, entran en juego por lo menos tres factores
limitantes, a saber, la cantidad reducida de sitios de coordinación
disponibles en el metal, la accesibilidad restringida del metal a
los sitios de unión en la proteína y, dependiendo de las
características de la resina, acceso limitado de las proteínas al
ión metálico inmovilizado. Por lo tanto, es extremadamente difícil
determinar a priori qué proteínas exhibirán y cuáles no
exhibirán una afinidad hacia los iones metálicos inmovilizados.
La proteína de unión a interleucina 18
(IL-18BP) es una proteína soluble natural
inicialmente purificada por afinidad, en una columna
IL-18, de orina (Novick et al. 1999). La
IL-18BP suprime la inducción de
IL-18 de IFN-\gamma y la
activación de IL-18 de NF-kB in
vitro. Además, la IL-18BP inhibe la inducción de
IFN-7 en ratones inyectados con LPS.
El gen de IL-18BP se localizó en
el cromosoma humano 11, y no se pudo hallar ningún exón que
codifique un dominio de transmembranas en la secuencia genómica 8.3
kb que comprende el gen de IL-18BP. Hasta el
momento, se han identificado cuatro isoformas de
IL-18BP generadas por empalme de ARNm alternativo en
seres humanos. Se designaron IL-18BP a, b, c y d,
compartiendo todas el mismo extremo N y difiriendo en el extremo C
(Novick et al 1999). Estas isoformas varían en su capacidad
de unirse a la IL-18 (Kim et al. 2000). De la
cuatro isoformas de IL-18BP humanas
(hIL-18BP), se sabe que las isoformas a y c tienen
una capacidad de neutralización para la IL-18. La
isoforma más abundante de IL-18BP, la isoforma a,
exhibe una gran afinidad hacia la IL-18 con una
rápida constante de asociación y una lenta constante de disociación,
y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim
et al. 2000). La IL-18BP se expresa
constitutivamente en el bazo, y pertenece a la superfamilia de
inmunoglobulina. Los residuos implicados en la interacción de
IL-18 con IL-18BP se han descrito a
través del uso de modelos de computación (Kim et al. 2000) y
en base a la interacción entre la proteína IL-1B
similar con la IL-1R tipo I
(Vigers et al. 1997).
(Vigers et al. 1997).
La IL-18BP está
constitutivamente presente en muchas células (Puren et al.
1999) y circula en humanos sanos (Urushihara et al. 2000),
representando un fenómeno único en la biología de citocinas. Debido
a la gran afinidad de la IL-18BP hacia la
IL-18 (Kd = 0,4 nM) como también la alta
concentración de IL-18BP hallada en la circulación
(20 veces exceso molar en comparación con la IL-18),
se ha especulado que la mayoría, sino todas las moléculas de
IL-18 en la circulación se unen a la
IL-18BP. Por lo tanto, la IL-18BP
circulante que compite con los receptores de la superficie celular
para IL-18 pueden actuar como antiinflamatorios
naturales y moléculas inmunosupresoras.
Se ha sugerido la IL-18BP como
proteína terapéutica en una diversidad de enfermedades y trastornos,
como la psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoidea,
artritis psoriásica, lesión hepática, septicemia, aterosclerosis,
cardiopatías isquémicas, alergias, etc., véanse p. ej., WO9909063,
WO0107480, WO0162285, WO0185201, WO02060479, WO02096456,
WO03080104, WO02092008, WO02101049, WO03013577. Dado que se sugiere
la IL-18BP como proteína terapéutica para
administración, p. ej., a seres humanos, existe la necesidad de
cantidades adecuadas de IL-18BP de pureza
suficientemente alta.
No obstante, hasta el momento, no existe ningún
procedimiento de purificación que proporcione
IL-18BP purificada.
La presente invención se basa en el desarrollo
de un procedimiento de purificación para la proteína de unión a
IL-18 (IL-18BP).
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención
se refiere al uso de cromatografía de
carga-inducción hidrófoba para purificación de
IL-18BP.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un procedimiento para la purificación de la proteína de unión a
IL-18 (IL-18BP) de un fluido que
comprende una etapa de cromatografía de
carga-inducción hidrófoba.
Más específicamente, el procedimiento de
purificación de la invención comprende además una etapa seleccionada
a partir de cromatografía de afinidad de iones metálicos,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y cromatografía de fase de inversa.
La Fig. 1 muestra una vista esquemática de un
procedimiento de purificación preferido de la invención, que
resulta en IL-18BP purificada
("IL-18BP BULK"). La Fig. 2 muestra las curvas
de dosis y respuesta del material de referencia
IL-18BP en el bioensayo de Kg-1
in vitro en diez experimentos independientes
La presente invención se basa en el desarrollo
de un procedimiento de purificación para IL-18BP que
produce IL-18BP purificada.
En un primer aspecto, la invención se refiere al
uso de cromatografía de carga-inducción hidrófoba
para purificación de IL-18BP. En una realización
preferida, esta etapa de cromatografía de
carga-inducción hidrófoba se lleva a cabo en
combinación con una o más etapas seleccionadas a partir de
cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y cromatografía de fase inversa.
Preferiblemente, la etapa de
carga-inducción hidrófoba se lleva a cabo en una
resina de
4-mercapto-etil-piridina
(MEP).
En otra forma de realización preferida, la etapa
de carga-inducción hidrófoba se lleva a cabo en
combinación con una o más etapas seleccionadas a partir de
cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y cromatografía de fase inversa. Las etapas de
cromatografía individuales se pueden llevar a cabo en cualquier
orden adecuado.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un procedimiento para la purificación de la proteína de unión a
IL-18 (IL-18BP) a partir de un
fluido que comprende una etapa de cromatografía de
carga-inducción hidrófoba.
El término "resina", como se usa en la
presente memoria, se refiere a cualquier material de matriz o
vehículo utilizado en una columna cromatográfica, como p. ej.,
agarosa, sefarosa, superosa, dextrano, sefadex, polipropileno o
similar, que se puede derivatizar con ligandos o grupos funcionales,
tales como DEAE, CM, MEP, fenilo, por ejemplo, como se explica en
detalle en los "Antecedentes de la invención". Los materiales
de matriz pueden estar presentes en diferentes formas
entrecruzadas, dependiendo del uso específico. El volumen de la
resina, como también la longitud y el diámetro de la columna que se
ha de usar, depende de diversos parámetros tales como el volumen de
fluido a tratar, la concentración de proteína en el fluido que se ha
de someter al procedimiento de la invención, etc., y esto lo pueden
determinar los expertos en la técnica.
La cromatografía de
carga-inducción hidrófoba preferiblemente se lleva a
cabo en una resina que tiene
4-mercaptoetil-piridina (MEP) como
ligando inmovilizado. MEP-Hypercel® es una resina
que es particularmente adecuada en el marco de la presente
invención.
Preferiblemente, el procedimiento también
contiene por lo menos una etapa seleccionada a partir de
cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y cromatografía de fase inversa. Las etapas de
cromatografía individuales se pueden llevar a cabo en cualquier
orden. Cada etapa individual también se puede llevar a cabo más de
una vez, si es necesario.
La cromatografía de afinidad de iones metálicos
inmovilizados preferiblemente se lleva a cabo en una resina
quelante, como sefarosa quelante.
La etapa de cromatografía de intercambio iónico
puede contener un intercambiador aniónico o un intercambiador
catiónico. Se prefiere usar un material de cromatografía de
intercambio catiónico, particularmente un material de intercambio
catiónico débil, y se prefiere altamente usar una resina de
carboximetilo (CM), como CM sefarosa FF, para llevar a cabo esta
etapa del procedimiento de purificación. La etapa de cromatografía
de interacción hidrófoba (HIC) se puede llevar a cabo en cualquier
resina HIC conocida, como una resina que tenga residuos alquilo o
arilo como ligando inmovilizado. Butil-, octil- o
fenil-sefarosa (agarosa) son otros ejemplos de
dichas resinas de HIC. Se prefiere usar una resina de fenilo, como
fenil sefarosa FF, para esta etapa del procedimiento de
purifica-
ción.
ción.
El procedimiento de purificación puede además
comprender una etapa de cromatografía de fase inversa. Un material
preferido para esta etapa es una fuente de fase inversa 30 RPC®.
En una realización altamente preferida, el
procedimiento de purificación de IL-18BP de un
fluido comprende las etapas de:
(a) someter el fluido a cromatografía de
afinidad de iones metálicos inmovilizados;
(b) someter el eluato de la cromatografía de
afinidad de iones metálicos a una cromatografía de
carga-interacción hidrófoba;
(c) someter el eluato de la cromatografía de
carga-interacción hidrófoba a cromatografía de
intercambio catiónico;
(d) someter el flujo de la cromatografía de
intercambio catiónico a cromatografía de interacción hidrófoba;
(e) someter el eluato de la cromatografía de
interacción hidrófoba a cromatografía de fase inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Si bien se prefiere el orden de las etapas
anteriormente mencionadas (a) a (e), las etapas del procedimiento
de la invención se pueden llevar a cabo en cualquier orden que
conduzca a un producto proteínico purificado. Cualquier etapa de
purificación de la invención se puede llevar a cabo sola (en
aislamiento) con el fin de lograr algún grado de pureza o
eliminación de impurezas derivadas de la célula hospedante o el
medio. Se ha de observar que en este procedimiento de purificación
preferido, la IL-18BP no se une a la resina de
intercambio catiónico y, por ende, el flujo de esta columna se usa
para procesamiento adicional. Las otras resinas utilizadas en el
marco del procedimiento de purificación de la invención se unen a la
IL-18BP, mientras que las impurezas no se unen.
Después de las etapas de unión y lavado, la IL-18BP
se eluye bajo ciertas condiciones. En estas etapas, el eluato
también se usa, respectivamen-
te.
te.
La etapa (a) preferiblemente se lleva a cabo en
una columna de sefarosa quelante, como una columna Fast Flow de
sefarosa quelante, que tiene iones Zn^{2+} quelados.
Preferiblemente, la unión de IL-18BP se lleva a
cabo a pH 8,5 \pm 0,1, preferiblemente en fosfato sódico 50 mM y
NaCl 0,5 M que tiene este pH. Una etapa de lavado se puede llevar
cabo con cloruro de amonio 15 mM en tampón de equilibrio. La elución
preferiblemente se lleva a cabo a pH 9,0 \pm0,5, p. ej., a pH 8,7
o a pH 9, p. ej., en acetato de amonio 0,075 M o en acetato de
amonio 0,06 M que tenga este pH.
La etapa (b) preferiblemente se lleva a cabo en
una columna MEP (derivado de
4-mercaptoetilpiridina), como MEP HyperCel®
(LifeSciences). La unión de IL-18BP preferiblemente
se lleva a cabo a pH 6,1 + 0,1, p. ej., en PBS 1X + 1 NaCl que
tiene este pH. La elución se lleva a cabo preferiblemente a pH 8,4
\pm0,1, p. ej., con tampón de fosfato 20 mM más 35%
propilenglicol, teniendo la mezcla pH 8,4 + 0,1.
La etapa (c) preferiblemente se lleva a cabo en
una columna de carboximetil-sefarosa (CM). Ésta es
una etapa en la que se recoge el flujo para purificación adicional.
Esta etapa se basa en el hecho de que bajo circunstancias
específicas relacionadas p. ej., con condiciones de pH y sal, la
IL-18BP no se une a la resina, mientras las
impurezas, (p. ej., proteínas de células hospedantes, proteínas
derivadas de suero) sí lo hacen. Preferiblemente, la etapa (c) se
lleva a cabo a pH 6,0+0,2, por ejemplo en presencia de MES 1 mM
(ácido N-morfolinoetanosulfónico).
La etapa (d) preferiblemente se lleva a cabo en
una columna de fenil-sefarosa, como una columna Fast
Flow de fenil-sefarosa. Preferiblemente, la unión
de IL-18BP se lleva a cabo a aproximadamente pH 9,1
\pm 0,2, p. ej., en borato sódico 50 mM y sulfato de amonio 0,9 M
o sulfato de amonio 0,10 M que tiene este pH. La elución de la
columna de fenil-sefarosa preferiblemente se lleva a
cabo a pH 9,1 \pm 0,2 en presencia de una concentración de sal
elevada, como en borato sódico 50 mM 9,1 \pm 0,2, sulfato de
amonio 0,15 M que tenga este pH.
La etapa (e) preferiblemente se lleva a cabo en
una columna Source 30 RPC. La unión de IL-18BP al
material de la columna preferiblemente se lleva a cabo a pH 9,1 +
0,2, p. ej., en tampón de borato sódico 50 mM. La elución
preferiblemente se lleva a cabo usando un gradiente,
IL-18BP eluyendo alrededor de 28-32%
de ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) en acetonitrilo.
Se ha de entender que las condiciones
anteriormente descritas en relación con las etapas (a) a (e) de la
purificación también se pueden aplicar cuando se llevan a cabo las
etapas sencillas de la invención, o (sub-) combinaciones de las
etapas.
En otra realización preferida del presente
procedimiento de purificación, se realizan una o más etapas de
ultrafiltración. La ultrafiltración es útil para eliminar
componentes de poco peso molecular en los eluatos resultantes de
etapas cromatográficas previas. Esta ultrafiltración permite
eliminar disolvente orgánico, TFA y sales de la etapa previa, para
equilibrar la IL-18BP en la mayor parte del tampón y
concentrar la molécula hasta la concentración deseada. Dicha
ultrafiltración se puede realizar, p. ej., en medios de
ultrafiltración que excluyen componentes que tengan pesos
moleculares inferiores a 5 kDa.
Preferiblemente, la ultrafiltración se lleva a
cabo entre las etapas (b) y (c), y/o después de la etapa (e). Más
prefe-
riblemente, se llevan a cabo dos etapas de ultrafiltración, una entre las etapas (b) y (c) y una después de la etapa (e).
riblemente, se llevan a cabo dos etapas de ultrafiltración, una entre las etapas (b) y (c) y una después de la etapa (e).
Si la proteína purificada de acuerdo con el
procedimiento de la invención está destinada a administración a
seres humanos, es ventajoso incluir también una o más etapas de
eliminación de virus en el procedimiento. Preferiblemente, se lleva
a cabo una etapa de eliminación por filtración entre las etapas (d)
y (e). También se prefiere que la etapa de filtración para
eliminación de virus se lleve a cabo después de la etapa (e). Más
preferiblemente, el procedimiento comprende por lo menos dos etapas
de eliminación de virus, una de las cuales se lleva a cabo entre
las etapas (d) y (e), y la otra después de la etapa (e).
Si el volumen inicial de fluido a partir del
cual se purifica la IL-18BP es grande, puede ser
ventajoso reducir el volumen de material capturando la proteína y
resuspendiendo en un volumen más pequeño de tampón antes de
realmente comenzar el procedimiento de purificación.
Por lo tanto, el procedimiento de la invención
preferiblemente también comprende una etapa de captura inicial, es
decir, una etapa que se lleva a cabo antes de cualquiera de las
etapas de purificación anteriormente mencionadas y preferiblemente
antes de la etapa (a) del procedimiento mencionado.
En una realización preferida, la etapa de
captura se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio
iónico. Preferiblemente, la resina de intercambio iónico usada para
la etapa de captura es una matriz de un intercambiador aniónico
fuerte, como p. ej., Q Sefarosa Fast Flow. Se prefiere altamente
usar resina derivatizada de trimetilaminoetilo, como TMAE
Fractogel® (o TMAE HiCap®) como material de intercambio iónico.
Ventajosamente, la etapa de captura puede eliminar >60% de los
contaminantes totales presentes en el material bruto.
Con el fin de facilitar la conservación o el
transporte, por ejemplo, el material puede congelarse y
descongelarse antes y/o después de cualquier etapa de purificación
de la invención.
De acuerdo con la presente invención, la
IL-18BP que se ha de purificar puede ser nativa, es
decir IL-18BP natural. Por lo tanto, se puede
purificar a partir de cualquier material o fuente natural, como p.
ej., fluidos corporales tales como orina.
La IL-18BP también puede derivar
de cualquier fuente animal o humana. Preferiblemente, la
IL-18BP que se ha de purificar es humana, y más
preferiblemente es IL-18BP recombinante. La
IL-18BP recombinante se puede producir en sistemas
de expresión procarióticos, como en sistemas bacterianos como
Escherichia coli. También se puede producir en sistemas de
expresión eucarióticos, como células de mamíferos, insectos o
levadura. De acuerdo con la presente invención, se prefiere
expresar la IL-18BP en células mamíferas, tales como
líneas celulares animales, o en líneas celulares humanas. Las
células ováricas de hámster chino (CHO) son un ejemplo de una línea
celular que es particularmente adecuada para expresión de
IL-18BP.
Si la IL-18BP que se ha de
purificar es expresada por células mamíferas que la segregan, el
material de partida del procedimiento de purificación de la
invención es sobrenadante de cultivo celular, también llamado
recolección o IL-18BP bruta. Si las células se
cultivan en un medio que contiene suero animal, el sobrenadante de
cultivo celular también contiene proteínas del suero como
impurezas.
Preferiblemente, las células que expresan
IL-18BP se cultivan bajo condiciones libres de
suero. En este caso, el material de partida del procedimiento de
purificación de la invención es sobrenadante de cultivo celular
libre de suero que principalmente contiene proteínas de células
hospedantes como impurezas. Si se añaden factores de crecimiento al
medio de cultivo celular, como insulina, por ejemplo, estas
proteínas preferiblemente se eliminarán también durante el
procedimiento de purificación.
Ya que la IL-18BP es una
proteína soluble segregada, se libera en el sobrenadante de cultivo
celular, ya sea mediante su péptido de señal natural, o mediante un
péptido de señal heterólogo, es decir, un péptido de señal derivado
de otra proteína segregada que puede ser más eficaz en el sistema de
expresión particular utilizado. El fluido a partir del cual se
purifica la IL-18BP es por lo tanto preferiblemente
sobrenadante de cultivo celular, como p. ej., sobrenadante de
células CHO. El sobrenadante de cultivo celular puede comprender
suero de origen animal, si las células se cultivan en medio que
contiene suero. Se prefiere purificar la proteína del sobrenadante
de las células que se cultivaron en medio libre de suero, es decir,
en medio de cultivo que no contiene suero derivado de ternero fetal
u otro origen animal.
La expresión "proteína de unión a
IL-18" se utiliza en la presente memoria como
sinónimo de "IL-18BP". Este término se
relaciona con las proteínas de unión a IL-18 tales
como las definidas en el documento WO 99/09063 o en Novick et
al., 1999. El término IL-18BP incluye variantes
de empalme y/o isoformas de proteínas que se unen a la
IL-18, como las definidas en Kim et al.,
2000, en particular las isoformas humanas a y c de
IL-18BP. El término "IL-18PB",
como se emplea en la presente memoria, incluye además muteínas,
derivados funcionales, fracciones activas, proteínas condensadas,
proteínas circularmente permutadas y tablillas de
IL-18BP como se define en el documento WO
99/09063.
La IL-18BP sujeta al
procedimiento de purificación de acuerdo con la presente invención
puede estar glucosilada o no glucosilada, puede derivar de fuentes
naturales, como orina, o preferiblemente puede producirse de forma
recombinante. La expresión recombinante se puede llevar a cabo en
sistemas de expresión procarióticos como E. coli, o en
sistemas de expresión eucarióticos, y preferiblemente de
mamíferos.
Como se emplea en la presente memoria, el
término "muteínas" se refiere a análogos de una
IL-18BP, o análogos de una IL-18BP
vírica, donde uno o más de los residuos de aminoácidos de una
IL-18BP natural o una IL-18BP
vírica se reemplazan con diferentes residuos de aminoácidos, o se
suprimen, o uno o más residuos de aminoácidos se añaden a la
secuencia natural de una IL-18BP, o una
IL-18BP vírica, sin cambiar considerablemente la
actividad de los productos resultantes según lo comparado con la
IL-18BP de tipo salvaje o con la
IL-18BP vírica. Estas muteínas se preparan por
síntesis conocidas y/o por técnicas de mutagénesis dirigidas al
sitio, o por cualquier otra técnica conocida adecuada para
esto.
Las muteínas de acuerdo con lo anterior incluyen
proteínas codificadas por un ácido nucleico, como ADN o ARN, que se
hibridan a ADN o ARN, que codifica una IL-18BP o
codifica una IL-18BP vírica (ambas descritas en el
documento WO99/09063) bajo condiciones rigurosas. La expresión
"condiciones rigurosas" se refiere a condiciones de
hibridación y lavado subsiguiente, que los expertos en la técnica
convencionalmente denominan "rigurosas". Véase Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, supra,
Interscience, N.Y., \NAK\NAK6.3 y 6.4 (1987, 1992). Sin
limitación, los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen
condiciones de lavado 12-20ºC debajo de la Tm
calculada del híbrido bajo estudio en, p. ej., 2 x SSC y 0,5% SDS
durante 5 minutos, 2 x SSC y 0,1% SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC
y 0,5% SDS a 37ºC durante 30-60 minutos y luego, 0,1
x SSC y 0,5% SDS a 68ºC durante 30-60 minutos.
Aquellos con experiencia ordinaria en la técnica entienden que las
condiciones de rigurosidad también dependen de la longitud de las
secuencias de ADN, sondas oligonucleotídicas (como
10-40 bases) o sondas oligonucleotídicas mixtas. Si
se
usan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC. Véase, Ausubel, supra.
usan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC. Véase, Ausubel, supra.
La identidad refleja una relación entre dos o
más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de
polinucleótidos, determinadas comparando las secuencias. En
general, identidad se refiere a una correspondencia de nucleótido
exacto a nucleótido o aminoácido a aminoácido de las dos secuencias
de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente, a lo largo de
las secuencias que se están comparando.
Para secuencias en las que no hay una
correspondencia exacta, se puede determinar un "% de
identidad". En general, las dos secuencias que se han de
comparar se alinean para producir una correlación máxima entre las
secuencias. Esto puede incluir insertar "espacios" bien en una
o ambas secuencias, para mejorar el grado de alineación. Se puede
determinar un % de identidad a lo largo de cada una de las
secuencias que se estén comparando (que se denomina alineación
global), que es particularmente adecuado para secuencias de la misma
longitud o de longitud similar, o en longitudes más cortas y
definidas (que se denomina alineación local), que es más adecuado
para secuencias de longitud desigual.
Los métodos para comparar la identidad y
homología de dos o más secuencias se conocen en la técnica. Por
consiguiente, por ejemplo, los programas disponibles en el
Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux J et
al., 1984), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, se pueden
usar para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y
el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias de
polipéptidos. BESTFIT utiliza el algoritmo de "homología
local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la mejor región
sencilla de similitud entre dos secuencias. Otros programas para
determinar la identidad y/o similitud entre secuencias también se
conocen en la técnica, por ejemplo la familia BLAST de programas
(Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997,
accesibles a través de la página de inicio del NCBI en
www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, 1990).
Cualquiera de dichas muteínas preferiblemente
tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de
aquella de una IL-18BP, o suficientemente
duplicativa de una IL-18BP vírica, como para tener
actividad sustancialmente similar a la IL-18BP. Una
actividad de la IL-18BP es su capacidad de unirse a
IL-18. Siempre que la muteína tenga actividad de
unión sustancial a IL-18, se puede utilizar en la
purificación de IL-18, tal como mediante
cromatografía de afinidad, y, por lo tanto, se puede considerar que
tiene actividad sustancialmente similar a la
IL-18BP. Por ende, se puede determinar si alguna
muteína determinada tiene sustancialmente la misma actividad que la
IL-18BP mediante experimentación de rutina que
comprende someter dicha muteína, p. ej., a un ensayo de competición
sándwich sencillo para determinar si se une o no a una
IL-18 adecuadamente marcada, como un
radioinmunoensayo o ensayo ELISA.
En una realización preferida, cualquiera de
dichas muteínas que se han de purificar tiene por lo menos 40% de
identidad u homología con la secuencia de una
IL-18BP o un homólogo de IL-18BP
víricamente codificado, como se define en el documento WO 99/09063.
Más preferiblemente, tiene por lo menos 50%, por lo menos 60%, por
lo menos 70%, por lo menos 80% o, más preferiblemente, por lo menos
90% de identidad u homología.
Las muteínas de polipéptidos de
IL-18BP o muteínas de IL-18BP
víricas, que se pueden purificar de acuerdo con la presente
invención, o su codificación de ácido nucleico, incluyen un conjunto
finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos
de sustitución o polinucleótidos que los expertos en la técnica
pueden obtener rutinariamente, sin experimentación indebida, en base
a las descripciones y lineamientos de la presente memoria.
Los cambios preferidos para muteínas de acuerdo
con la presente invención son lo que se conoce como sustituciones
"conservadoras". Las sustituciones de aminoácidos conservadoras
de proteínas o polipéptidos de IL-18BP o
IL-18BP víricas pueden incluir aminoácidos
sinónimos dentro de un grupo que tiene propiedades
físico-químicas lo suficientemente similares como
para que la sustitución entre miembros del grupo conserve la función
biológica de la molécula (Grantham, 1974). Es claro que las
inserciones y deleciones de aminoácidos pueden también realizarse en
las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función,
particularmente si las inserciones o deleciones implican únicamente
unos pocos aminoácidos , p. ej., menos de treinta, y preferiblemente
menos de diez, y no eliminan o desplazan aminoácidos que son
críticos para una conformación funcional, p. ej., residuos de
cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por dichas deleciones
y/o inserciones están dentro del alcance de la presente
invención.
Preferiblemente, los grupos de aminoácidos
sinónimos son aquellos que se definen en la Tabla 1. Más
preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos
que se definen en la Tabla 2; y más preferiblemente los grupos de
aminoácidos sinónimos son aquellos que se definen en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de producción de sustituciones de
aminoácidos en proteínas que se pueden emplear para obtener
muteínas de polipéptidos o proteínas de IL-18BP, o
muteínas de IL-18BP víricas, para uso en la presente
invención incluyen cualquier etapa de método conocido, como las
presentadas en las patentes estadounidenses 4.959.314, 4.588.585 y
4.737.462 para Mark et al; 5.116.943 para Koths et
al., 4.965.195 para Namen et al; 4.879.111 para Chong
et al; y 5.017.691 para Lee et al; y proteínas
sustituidas con lisina presentadas en la patente estadounidense No.
4.904.584 (Shaw et al).
La expresión "proteína condensada" se
refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BP,
o una IL-18BP vírica, o su muteína o fragmento,
condensado con otra proteína que, p. ej., tiene un tiempo de
residencia extendido en los fluidos corporales. Una
IL-18BP o una IL-18BP vírica puede,
por lo tanto, condensarse a otra proteína, polipéptido o similar,
p. ej., una inmunoglobulina o su fragmento.
"Derivados funcionales", como se emplea en
la presente memoria, abarca derivados de IL-18BP o
una IL-18BP vírica y sus muteínas y proteínas
condensadas, que se pueden preparar a partir de grupos funcionales
que ocurren como cadenas laterales en los residuos o los grupos N-
o C-terminales, por medios conocidos en la técnica,
y se incluyen en la invención siempre y cuando sigan siendo
farmacéuticamente aceptables, es decir, no destruyan la actividad
de la proteína que es sustancialmente similar a la actividad de la
IL-18BP, o las IL-18BP víricas, y
no confieran propiedades tóxicas a las composiciones que los
contienen.
Estos derivados pueden, por ejemplo, incluir
cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios
antigénicos y extender la residencia de una IL-18BP
o una IL-18BP vírica en los fluidos corporales.
Otros derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo,
amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con
aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo
de grupos amino libres de los residuos de aminoácido formados con
restos acilo (p. ej., grupos alcanoílo o aroílo carbocíclicos) o
derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres
(por ejemplo aquel de residuos serilo o treonilo) formados con
restos acilo.
Como "fracciones activas" de una
IL-18BP, o una IL-18BP vírica,
muteínas y proteínas condensadas, la presente invención cubre
cualquier fragmento o precursores de la cadena de polipéptidos de la
molécula proteínica sola o junto con moléculas asociadas o residuos
unidos a ella, p. ej., residuos de azúcar o fosfato, o agregados de
la molécula proteínica o los residuos de azúcar propiamente dichos,
siempre que dicha fracción tenga actividad sustancialmente similar
a la IL-18BP.
El término "sales" en la presente memoria
se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adición
de ácido de grupos amino de molécula inhibidora de
IL-18, o sus análogos. Las sales de un grupo
carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la técnica e
incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio,
amonio, hierro o zinc, y similares, y sales con bases orgánicas como
aquellas formadas, por ejemplo, con aminas, como trietanolamina,
arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de
adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales
como por ejemplo ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con
ácidos orgánicos, por ejemplo ácido acético o ácido oxálico. Desde
ya, cualquiera de dichas sales debe retener la actividad biológica
del inhibidor de IL-18, como inducción de
IFN-gamma en células sanguíneas.
Las secuencias de IL-18BP y sus
isoformas/variantes de empalme se pueden tomar del documento
WO99/09063 o de Novick et al., 1999, como también de Kim
et al., 2000.
Los derivados funcionales de
IL-18BP se pueden conjugar a polímeros con el fin de
mejorar las propiedades de la proteína, como estabilidad, semivida,
biodisponibilidad, tolerancia en el cuerpo humano o inmunogenicidad.
Para lograr esta meta, la IL18-BP se puede unir, p.
ej., a Polietilenglicol (PEG). La PEGilación se pueden llevar a
cabo por métodos conocidos, descritos en el documento WO 92/13095,
por ejemplo. En consecuencia, en una realización preferida, el
derivado funcional comprende por lo menos un resto unido a uno o más
grupos funcionales, que ocurren como una o más cadenas laterales en
los residuos de aminoácido. Se prefiere altamente una realización
en la que el resto sea polietilenglicol (PEG).
En otra realización preferida de la invención,
la IL-18BP comprende una fusión de inmunoglobulina,
es decir, el inhibidor de IL-18 es una proteína
condensada que comprende toda o parte de una proteína de unión a
IL-18, que se condensa a toda o a una porción de
una inmunoglobulina. Los métodos para elaborar las proteínas de
fusión a inmunoglobulina se conocen en la técnica, como los
descritos en el documento WO 01/03737, por ejemplo. La persona
experimentada en la técnica entenderá que la proteína de fusión
resultante retiene la actividad biológica de la
IL-18BP, en particular la unión a
IL-18. La fusión puede ser directa o vía un péptido
enlazador más corto que puede ser tan corto como de 1 a 3 residuos
de aminoácidos de longitud o más largo, por ejemplo, 13 residuos de
aminoácidos de largo. Dicho enlazador puede ser un tripéptido de la
secuencia E-F-M
(Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una
secuencia enlazadora de aminoácidos que comprende
Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met
introducida entre la secuencia de IL-18BP y la
secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante
tiene propiedades mejoradas, como tiempo de residencia extendido en
los fluidos corporales (semivida), mayor actividad específica,
mayor nivel de expresión, o se facilita la purificación de la
proteína de fusión.
En una realización preferida, la
IL-18BP se condensa a la región constante de una
molécula de Ig. Preferiblemente, se condensa a regiones de cadena
pesada, como los dominios CH2 y CH3 de la IgG1 humana, por ejemplo.
La generación de proteínas de fusión específicas que comprenden
IL-18BP y una porción de una inmunoglobulina se
describen en el ejemplo 11 del documento WO 99/09063, por ejemplo.
Otras isoformas de moléculas Ig son también adecuadas para la
generación de proteínas de fusión de acuerdo con la presente
invención, como isoformas IgG_{2} o IgG_{4}, u otras clases de
Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser
monoméricas o multiméricas, hetero u homomultiméricas.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a
una proteína purificada mediante el procedimiento de purificación
de acuerdo con la invención. A continuación, dicha proteína también
se denomina "IL-18BP purificada". Dicha
IL-18BP purificada es preferiblemente
IL-18BP altamente purificada. La
IL-18BP altamente purificada se determina, p. ej.,
por la presencia de una banda simple en un gel PAGE teñido de plata
después de la carga de la proteína en la cantidad de 2 meg por
banda. La IL-18BP purificada puede también definirse
como moviéndose como un pico sencillo en la HPLC.
La preparación de IL-18BP
obtenida del procedimiento de purificación de la invención puede
contener menos de 20% de impurezas, preferiblemente menos de 10%,
5%, 3%, 2% o 1% de impurezas, o se puede purificar hasta
homogeneidad, es decir, quedar libre de cualquier contaminante
proteináceo.
Habiendo descrito ahora la presente invención
por completo, los expertos en la técnica apreciarán que la misma se
puede llevar a cabo dentro de un amplio intervalo de parámetros,
concentraciones y condiciones equivalentes, sin desviarse del
espíritu y alcance de la invención y sin experimentación
indebida.
Si bien la invención ha sido descrita en
relación con realizaciones específicas de la misma, se ha de
entender que es capaz de otras modificaciones. Esta solicitud tiene
como fin cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la
invención siguiendo, en general, los principios de la invención e
incluyendo dichas desviaciones de la presente descripción que estén
dentro de la práctica conocida o habitual en la técnica a la que
pertenece y según se pueda aplicar a las características esenciales
expuestas anteriormente de la siguiente manera en el alcance de las
reivindicaciones anejas.
La referencia a etapas de métodos conocidos,
etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales no es en modo alguno una admisión de que ningún
aspecto, descripción o realización de la presente invención es
descrito o sugerido en la técnica relevante.
La descripción anterior de las realizaciones
específicas revelará en forma completa la naturaleza general de la
invención que otros podrán, aplicando el conocimiento dentro de la
pericia de la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias
citadas en la presente memoria), modificar y/o adaptar fácilmente
para diversas aplicaciones tales como realizaciones específicas,
sin experimentación indebida y sin desviarse del concepto general
de la presente invención. Por lo tanto, dichas adaptaciones y
modificaciones están destinadas a estar dentro del significado e
intervalo de equivalentes de las realizaciones descritas, en base a
las descripciones y lineamientos presentados en la presente
memoria. Se ha de entender que las frases o la terminología de la
presente memoria tienen fines de descripción y no de limitación, de
modo tal que la terminología y las frases de la presente memoria
serán interpretadas por el experto en la técnica en función de las
descripciones y lineamientos presentados en esta memoria, en
combinación con el conocimiento de la persona con experiencia en la
técnica.
La IL-18BP presente en 300 l de
sobrenadante de cultivo celular libre de suero de células CHO que
expresan IL-18BP se capturó en resina Q Sefarosa
FF. El material capturado se ajustó hasta pH 8,5 \pm 0,1, y
conductividad hasta 50 \pm 5 mS/cm añadiendo algunas gotas de
ácido orto-fosfórico al 35% (H_{3}PO_{4}) y NaCl
sólido en una cantidad correspondiente a aproximadamente 0,35M.
El procedimiento de purificación, comenzando por
el material capturado de acuerdo con (1), se describe en detalle a
continuación. Se presenta un diagrama del procedimiento de
purificación en la Fig. 1.
En general, los valores de pH y conductividad se
refieren a valores a una temperatura de +25ºC.
Las columnas se vigilaron continuamente con
monitores de UV, midiendo la absorbancia a 280 nm.
2.1. Etapa
a
- \bullet
- Columna cromatográfica: XK1,6 x 20cm (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Monitor de UV (longitud de vía óptica 2,5 mm) equipado con un registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente);
- \bullet
- Bomba peristáltica (Minipuls Gilson o equivalente);
- \bullet
- Espectrofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente);
- \bullet
- Medidor de pH (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Conductímetro (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Balanza (Mettler Toledo o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Resina de Sefarosa quelante Fast Flow (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Miniesferas de hidróxido sódico - (Merck);
- \bullet
- Sulfato de cobre (Merck);
- \bullet
- Ácido acético glaciar (Merck);
- \bullet
- Ácido etilendiamintetracético - EDTA- (Fluka);
- \bullet
- Cloruro de sodio - NaCl - Merck;
- \bullet
- Agua purificada (Modulab o equivalente);
- \bullet
- Fosfato de di-hidrógeno sódico dihidratado - Merck;
- \bullet
- Acetato de amonio - Merck;
- \bullet
- Disolución de amoníaco al 25% - Merck;
- \bullet
- Ácido orto-fosfórico al 85% - Merck;
- \bullet
- Disolución de hidróxido sódico al 50% - Baker.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Disolución de carga metálica: Sulfato de cobre 0,2 M
- \bullet
- Agua acidificada
- \bullet
- Tampón de equilibrio: Fosfato sódico 50 mM pH 8,5 \pm 0,1, NaCl 0,5 M.
- \bullet
- Tampón de elución: Acetato de amonio 0,075 M pH 9,0 \pm 0,1
- \bullet
- Disolución de regeneración: fosfato sódico 20 mM pH 5,8 \pm 0,3, NaCl 0,5 M, EDTA 50 mM
- \bullet
- Disolución desinfectante: NaOH 0,5 M
La columna se rellenó con resina de sefarosa
quelante Fast Flow siguiendo las instrucciones del fabricante. Para
desinfección, la columna se lavó con por lo menos 3 BV de NaOH 0,5
M, incubados durante 1 hora a temperatura ambiente y luego la
columna se enjuagó con 3 BV de agua purificada.
Se descongelaron 220-300 mg de
r-hIL-18BP congelada obtenidos de la
etapa de captura anteriormente descrita en (1) y se ajustó hasta pH
8,5 \pm 0,1, conductividad 50 \pm 5 mS/cm añadiendo algunas
gotas de ácido orto-fosfórico al 35%
(H_{3}PO_{4}) y NaCl sólido en la cantidad correspondiente a
aproximadamente 0,35M.
La columna cromatográfica se lavó primero con
5-6 BV (volúmenes de lecho) de agua acidificada
hasta que el pH fue <4,5. Luego, la columna se lavó con 3 BV de
sulfato de cobre 0,2 M y 4 BV de agua acidificada hasta que la
absorbancia alcanzó la línea de base.
Luego, la columna se equilibró lavando 6 o más
BV de tampón de equilibrio, fosfato sódico 50 mM pH 8,5 \pm 0,1,
NaCl 0,5 M, conductividad 50+5 mS/cm a través de la columna. Se
controlaron el pH y la conductividad y se siguió lavando si los
parámetros del efluente de la columna estaban fuera de los valores
diana, es decir, pH 8,5 \pm 0,1, conductividad 50+5 mS/cm.
El material de partida, es decir,
r-hIL-18BP post captura, preparado
como anteriormente, se cargó luego a la columna. Después de
completar la carga de la muestra, la columna se lavó con
5-10 BV de tampón de equilibrio. Estas fracciones
se desecharon, ya que contenían únicamente impurezas del cultivo
celular.
La elución comenzó con acetato de amonio 0,075
M, pH 9,0 \pm 0,1, conductividad 7,6+0,5 mS/cm. La
r-hIL-18BP comenzó a eluirse como
un pico principal después de aproximadamente 0,5 BV del inicio.
Se recogieron 3-5 BV del pico
principal, con el pico principal comenzando cuando la OD en línea
aumentó gradualmente. Esta fracción contenía
r-hIL-18BP semipurificada.
Después de completar la elución, la columna se
lavó con 3-5 BV de tampón de regeneración que
contenía EDTA. Las fracciones muestreadas contenían cobre
desplazado de la resina, como también impurezas del cultivo
celular.
Para desinfección, la columna se lavó con por lo
menos 3 BV de NaOH 0,5 M, incubados durante 1 hora, y luego la
columna se enjuagó con 3 BV de agua purificada. La columna se lavó
luego con por lo menos 3 BV de disolución de conservación, NaOH 10
mM, y se conservó a temperatura ambiente hasta el ciclo
siguiente.
2.2. Etapa
(b)
Esta etapa se llevó a cabo en una resina MEP,
una resina de cromatografía de carga-inducción
hidrófoba que es una mezcla entre la cromatografía de interacción
hidrófoba (HIC) y la cromatografía de intercambio iónico (IEC).
- \bullet
- Columna cromatográfica: XK1,6 x 20cm (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Monitor de UV (vía de longitud óptica 2,5 mm) equipado con un registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente);
- \bullet
- Bomba peristáltica (Minipuls Gilson o equivalente);
- \bullet
- Espectrofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente);
- \bullet
- Medidor de pH (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Conductímetro (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Balanza (Mettler Toledo o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Post lMAC r-hlL-18BP;
- \bullet
- Resina MEP HyperCel® (BioSepra -Cypergen Biosystems);
- \bullet
- Miniesferas de hidróxido sódico - (Merck);
- \bullet
- Cloruro de potasio -(Merck);
- \bullet
- Ácido etilendiamintetracético - EDTA- (Fluka);
- \bullet
- Cloruro de sodio - NaCI - Merck;
- \bullet
- Agua purificada (Modulab o equivalente);
- \bullet
- Fosfato de di-hidrógeno sódico epta-hidratado - Merck;
- \bullet
- Fosfato de di-hidrógeno sódico monobásico dihidratado - Merck;
- \bullet
- Fosfato de potasio - Merck;
- \bullet
- 1-2 propandiol (Propilenglicol) - Merck;
- \bullet
- Ácido orto-fosfórico al 85% - Merck;
- \bullet
- Disolución de hidróxido sódico al 50% - Baker.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Tampón de equilibrio: Disolución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X pH 6,1 \pm 0,1, NaCl 1, conductividad 95 \pm 5 mS/cm
- \bullet
- Tampón de lavado: PBS 1X pH 6,1 \pm 0,1, conductividad 16 \pm 2 mS/cm
- \bullet
- Tampón de elución: Tampón de fosfato 20 mM pH 8,4 \pm 0,1, 35% propilenglicol, conductividad 1,1 \pm 0,3 mS/cm
- \bullet
- Disolución de regeneración 1: agua purificada
- \bullet
- Disolución de regeneración 2: EDTA 100 mM
- \bullet
- Disolución desinfectante: NaOH 1M
La columna se rellenó con resina MEP HyperCel®
siguiendo las instrucciones del fabricante.
La IL-18BP post IMAC, resultante
de la etapa (a), se enriqueció con NaCl 1M bajo agitación hasta una
conductividad de 95 \pm 5 mS/cm.
Para la desinfección de la columna, la columna
se lavó con por lo menos 1 BV de NaOH 0,5 M, luego se enjuagó con
3-5 BV de agua purificada.
\newpage
Para equilibrio de la columna, la columna se
lavó con 6 o más BV de tampón de equilibrio, PBS 1X pH 6,1 + 0,1,
NaCl 1, conductividad 95 \pm 5 mS/cm. Se controlaron el pH y la
conductividad y se siguió lavando si los parámetros del efluente de
la columna estaban fuera de los valores diana, es decir, pH 6,1
\pm 0,1, NaCl 1, conductividad 95 \pm 5 mS/cm. Luego, el
material se cargó con el material resultante de la etapa (a).
Después de cargar, la columna se lavó con 6 BV
de tampón de equilibrio PBS 1X pH 6,1 +0,1, NaCl 1, conductividad
95 + 5 mS/cm. Esta fracción se desechó, ya que contenía solamente
impurezas del cultivo celular. En caso de sobrecarga de la columna,
esta fracción puede contener algo de
r-hIL-18BP.
Luego, la columna se lavó con 10 BV de tampón de
lavado PBS 1X pH 6,1 \pm 0,1, conductividad 16 + 2 mS/cm. Esta
fracción también se desechó, conteniendo únicamente impurezas del
cultivo celular. La fracción puede contener algo de
r-hIL-18BP en caso de sobrecarga de
la columna.
Luego, la elución comenzó con la elución de
tampón de fosfato 20 mM pH 8,4 \pm 0,1, 35% propilenglicol,
conductividad 0,8 \pm 0,1 mS/cm. La
r-hIL-18BP comenzó a eluirse como un
pico principal después de aproximadamente 0,5 BV del comienzo. Se
recogieron 8-10 BV del pico principal, comenzando
por el incremento gradual en absorbancia, aproximadamente después
de los primeros 0,5 BV (desechado), de acuerdo con el perfil
cromatográfico. Este eluato contenía
r-hIL-18BP semipurificada.
Para regeneración, la columna se lavó con por lo
menos 6 BV de disolución de regeneración 1, seguidos de 10 BV de
disolución de regeneración 2. La columna se dejó en disolución de
regeneración durante la noche para mejorar más el efecto de
regeneración. La columna se enjuagó luego con por lo menos 6 BV de
agua purificada. Estas impurezas de las fracciones que contenían
cultivo celular se desecharon.
Para desinfección, la columna se lavó con por lo
menos 6 BV de NaOH 1M, el flujo se detuvo por 1 hora, y la columna
se enjuagó luego con por lo menos 6 BV de agua purificada.
Para conservación, la columna se lavó con por lo
menos 3 BV de disolución de conservación, NaOH 0,1 M, y se conservó
a temperatura ambiente hasta el ciclo siguiente.
2.3. Etapa
intermedia
- \bullet
- Dispositivo de ultrafiltración Vivaflow 200, valor de corte 5000D (RC, PES o HydroSart) - Sartorius o equivalente;
- \bullet
- Bomba peristáltica tipo Masterflex o equivalente;
- \bullet
- Espectrofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente);
- \bullet
- Medidor de pH (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Conductímetro (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Balanza (Mettler Toledo o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Intermedio de r-hIL-18BP post MEP;
- \bullet
- Miniesferas de hidróxido sódico - Merck;
- \bullet
- Agua purificada (Modulab o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Agua purificada por sistemas Modulab o Milli Q
- \bullet
- Disolución desinfectante: NaOH 0,5 M
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa de ultrafiltración se llevó a cabo a
temperatura ambiente (+20\pm5ºC).
Para desinfección del ultrafiltro, se filtraron
alrededor de 500 mL de NaOH 0,5 M durante por lo menos 30 minutos,
y luego el ultrafiltro se enjuagó con agua purificada hasta que el
pH estuvo debajo de 7,5.
La fracción post MEP se diluyó 1:2 con agua
purificada y se filtró en el ultrafiltro. La disolución se concentró
hasta alrededor de 1-2/10 del volumen de partida y
el residuo de diálisis se dializó contra agua purificada hasta que
la conductividad del residuo de diálisis fue <100uS/cm. La
conductividad del residuo de diálisis se ajustó después de la
dilución con agua hasta un volumen de alrededor de
150-200 mL.
El residuo de diálisis se recogió y el
ultrafiltro se lavó con agua purificada. Las fracciones de lavado se
recogieron y combinaron con el residuo de diálisis (volumen final
200-250 mL).
El ultrafiltro se desinfectó filtrando 500 mL de
NaOH 0,5 M, por no menos de 30 minutos y con el lavado posterior
del ultrafiltro con agua purificada hasta que la infiltración de pH
fue inferior a 7,5. El ultrafiltro se conservó en NaOH 0,05 M a
+4ºC \pm 3ºC hasta el ciclo siguiente.
2.4. Etapa
(c)
- \bullet
- Columna cromatográfica: AC10/20 cm (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Monitor de UV (longitud de vía óptica 2,5 mm) equipado con registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente);
- \bullet
- Bomba peristáltica (Minipulse Gilson o equivalente);
- \bullet
- Espectrofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente);
- \bullet
- Medidor de pH (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Conductímetro (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Balanza (Mettler Toledo o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Intermedio de r-hIL-18BP ultrafiltrada post MEP;
- \bullet
- Resina CM Sefarosa FF (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Miniesferas de hidróxido sódico - Merck;
- \bullet
- MES (ácido 2-[N-Morfolino)etanosulfónico) (Sigma o equivalente);
- \bullet
- Agua purificada (Modulab o equivalente);
- \bullet
- Cloruro de sodio - Merck.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Tampón de pre-equilibrio: MES 20 mM, pH 5,0+0,5 conductividad 150 \pm 50 \musi/cm
- \bullet
- Equilibrio: MES 1 mM, pH 6,0 \pm 0,2, conductividad 45 \pm 15 \musi/cm
- \bullet
- Disolución de regeneración: NaCl 1,5M
- \bullet
- Disolución de desinfección: NaOH 0,5 M
- \bullet
- Disolución de conservación: NaOH 0,01 M
La columna se rellenó con resina CM de Sefarosa
Fast Flow siguiendo las instrucciones del fabricante.
La r-hIL-18BP
ultrafiltrada post MEP (véase etapa (b)) se llevó hasta pH 6,0 \pm
0,2 con algunas gotas de MES 20 mM, pH 5+0,5 y conductividad 100
\pm 15 \muS/cm justo antes de cargarse a la columna.
Para desinfección de la columna, la columna se
lavó con 1 BV de NaOH 0,5 M y se enjuagó con 15-20
BV de agua purificada.
Luego, la columna se
pre-equilibró lavando a través de la columna
15-20 BV de MES 20 mM, pH 5 \pm 0,5, conductividad
150+50 \muS/cm. Se controlaron el pH y la conductividad y se
siguió lavando si los parámetros del efluente de la columna estaban
fuera de los valores diana, es decir, pH 5,0+0,5, conductividad 150
\pm 50 \muS/cm.
Luego, la columna se equilibró lavando a través
de la columna 5 o más BV de tampón de equilibrio, MES 1 mM, pH
6,0+0,2, conductividad 45+15 \muS/cm. Se controlaron el pH y la
conductividad y se siguió lavando si los parámetros del efluente de
la columna estaban fuera de los valores diana, pH 6,0+0,2,
conductividad 45+15 \muS/cm.
Después de equilibrar, la
r-hIL-18BP, preparada como
anteriormente, se cargó. El flujo se recogió ni bien la absorbancia
comenzó a enjuagarse, ya que esta fracción contiene la
r-hIL-18BP semipurificada.
Cuando se completó la carga de la muestra, la
columna se lavó con 3-4 BV de tampón de equilibrio,
MES 1 mM, pH 6 \pm 0,2, conductividad 45 + 15 \muS/cm, y el
flujo se recogió continuamente hasta que la absorbancia alcanzó la
línea de base.
Después de la recolección, la disolución se
llevó inmediatamente hasta pH 9,1 + 0,1 añadiendo tetraborato de
sodio sólido 50 mM. Las fracciones recogidas contienen
r-hIL-18BP semipurificada.
Para regeneración de la columna, la columna se
lavó con por lo menos 4 BV de tampón de regeneración de NaCl 1,5 M.
Se tomaron las muestras y se desechó la fracción. Esta fracción
contiene impurezas del cultivo celular y más isoformas básicas de
r-h IL-18BP.
Para desinfección, la columna se lavó con por lo
menos 3 BV de NaOH 0,5 M, se detuvo el flujo por 1 hora y luego la
columna se enjuagó con 3 BV de agua purificada.
Para conservación, la columna se lavó con por lo
menos 3 BV de disolución de conservación, y luego se conservó hasta
el ciclo siguiente.
2.5. Etapa
(d)
- \bullet
- Columna cromatográfica: XK16/20 (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Monitor de UV (longitud de vía óptica 2,5 mm) equipado con registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente);
- \bullet
- Bomba peristáltica (Minipulse 2 Gillson o equivalente);
- \bullet
- Espectrofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente);
- \bullet
- Medidor de pH (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Conductímetro (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Balanza (Mettler Toledo o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Intermedio de r-hIL-18BP post CM;
- \bullet
- Resina de Fenil Sefarosa FF HS (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Tetraborato di-sódico decahidratado - Merck;
- \bullet
- Sulfato de amonio (Merck);
- \bullet
- Agua purificada por Modulab o equivalente;
- \bullet
- Miniesferas de hidróxido sódico - Merck;
- \bullet
- Disolución de NaOH al 50% - J.T. Baker.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Tampón de equilibrio: borato de sodio 50 mM 9,1 \pm 0,2, Sulfato de amonio 0,9M, conductividad 122 \pm 6 mS
- \bullet
- Tampón de elución: borato de sodio 50 mM 9,1 \pm 0,2, sulfato de amonio 0,15M, conductividad 30 \pm 2 mS/cm
- \bullet
- Tampón de regeneración: agua purificada
- \bullet
- Disolución desinfectante: NaOH 0,5 M
- \bullet
- La columna se rellenó con resina Fenil Sefarosa FF HS siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para la preparación del material de partida, se
añadió sulfato de amonio sólido hasta una concentración de 0,9M a
IL-18BP post CM (resultado de la etapa (c)). Después
de completar la disolución de sal, el material se llevó a pH hasta
9,1 \pm 0,2, añadiendo NaOH al 50% en disolución.
Para desinfección de la columna, la columna se
lavó con por lo menos 1 BV de NaOH 0,5 M y se enjuagó la columna
con 6 BV de agua purificada.
La columna se equilibró lavando a través de la
columna 5-7 o más BV de tampón de equilibrio: borato
de sodio 50 mM pH 9,1 \pm 0,2, sulfato de amonio 0,9 M,
conductividad 122 \pm 6 mS. Se controlaron el pH y la
conductividad, y se siguió lavando si los parámetros del efluente
de la columna estaban fuera de los valores diana, es decir, pH 9,1
+ 0,2, conductividad 122 \pm 6 mS.
El material de partida, es decir,
r-hIL-18BP post CM, se cargó luego a
la columna. Cuando se había completado la carga de la muestra, la
columna se lavó con 7-9 BV de tampón de equilibrio.
Esta fracción contiene impurezas de cultivo celular residual.
La elución comenzó con tampón de elución de
borato de sodio 50 mM, pH 9,1 \pm 0,2, sulfato de amonio 0,15M,
conductividad 30 \pm 2 mS/cm. La
r-hIL-18BP comenzó a eluirse como un
pico principal después de aproximadamente 0,5-0,8
BV desde el inicio. Se recogieron 6-8 BV del pico
principal, comenzando por el incremento en absorbancia. Esta
fracción de elución contenía
r-hIL-18BP semipurificada.
Después de completar la elución, la columna se
regeneró enjuagando la columna con por lo menos 3 BV de agua
purificada. Esta fracción se desechó, ya que contenía impurezas de
cultivo celular y agregaba formas de IL-18BP.
Para desinfección, la columna se lavó con por lo
menos 3 BV de NaOH 0,5 M, el flujo se detuvo durante 1 hora y luego
la columna se enjuagó con 6 BV de agua purificada.
Para conservación, la columna se lavó con por lo
menos 3 BV de disolución de conservación, NaOH 10 mM, y la columna
se conservó a temperatura ambiente hasta el ciclo siguiente.
2.6. Etapa 5
(e)
- \bullet
- Columna cromatográfica: AC10//20 (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Monitor de UV (longitud de vía óptica 2,5 mm) equipado con registrador de dos canales (Amersham Biosciences o equivalente);
- \bullet
- Bomba peristáltica (Minipulse 2 Gilson o equivalente);
- \bullet
- Espectrofotómetro de UV (Shimadzu o equivalente);
- \bullet
- Sistema FPLC o equivalente para efectuar el gradiente lineal (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Medidor de pH (Metrohm o equivalente);
- \bullet
- Conductímetro (Metrohm o equivalente).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- IL-18BP post HIC
- \bullet
- Resina Source 30 RPC (Amersham Biosciences);
- \bullet
- Cloruro de sodio - Merck;
- \bullet
- Tetraborato di-sódico decahidratado- Merck;
- \bullet
- Disolución de NaOH al 50% - Baker;
- \bullet
- Agua purificada (Modulab o equivalente);
- \bullet
- Acetonitrilo -Merck;
- \bullet
- Ácido trifluoroacético -J.T.Baker;
- \bullet
- Indicador universal de pH 0-14 -Merck.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Disolución A: 0,1% TFA en agua.
- \bullet
- Disolución B: 0,1% TFA en ACN
- \bullet
- Tampón de equilibrio: borato de sodio 50 mM, pH 9,1 \pm 0,2, conductividad 5 \pm 2 mS/cm
- \bullet
- Disolución desinfectante: NaOH 0,5 M
La columna se rellenó con resina Source 30 RPC
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para la desinfección de la columna, la columna
se lavó en contraflujo con por lo menos 3 BV de NaOH 0,5 M y luego
se enjuagó con 4-5 BV de agua purificada.
Luego, la columna se equilibró por lavado a
través de de la columna (flujo ascendente) 5-6 o más
BV con tampón de equilibrio de borato sódico 50 mM, pH 9,1 \pm
0,2, conductividad 5 \pm 2 mS/cm. Se controlaron el pH y la
conductividad y se siguió lavando si los parámetros del efluente de
la columna estaban fuera de los valores diana, es decir, pH 9,1
\pm 0,2 y conductividad 5 \pm 2 mS/cm.
La r-hIL-18BP
post HIC (resultado de la etapa (d)) a pH 9,1 \pm 0,2
conductividad 30 \pm 2 mS/cm fue el material de partida de esta
etapa. Se cargó a una columna y cuando la carga de la muestra se
había completado, la columna se lavó con 2-3 BV de
tampón de equilibrio. Esta fracción se desechó.
Después, la columna se lavó con disolución A
hasta que el pH del efluente de la columna estuvo debajo de 4. Esta
fracción se combinó con la primera parte del gradiente de elución
(antes 28% de ACN). Esta fracción contiene algunos residuos de las
impurezas del cultivo celular y, por lo tanto, se desecha.
La elución se llevó a cabo en un modo gradiente
usando la combinación de la disolución de elución A y la disolución
de elución B como se detalla a continuación:
La r-hIL-18BP
comenzó a eluir a alrededor de 28-32% de disolución
B (véase arriba en negrita) y se terminó de eluir dentro de 60
minutos (35% B). El eluato se llevó inmediatamente hasta pH 8,0
\pm 0,5 por dilución 1:2 con borato de sodio 50 M, pH 9,1 \pm
0,2 y conductividad 5 \pm 2 mS/cm.
Esta fracción contiene
r-hIL-18BP purificada.
La regeneración de la columna se llevó a cabo al
final del gradiente de elución. La fracción de regeneración se
recogió de acuerdo con el perfil de absorbancia. Esta fracción
contiene residuos de impurezas del cultivo celular y agrega formas
de IL-18BP.
Para desinfección, la columna se enjuagó con
2-3 BV de agua, se lavó con por lo menos
3-4 BV de NaOH y luego el flujo se detuvo por 1
hora. Después de eso, la columna se enjuagó con 3-4
BV de agua purificada.
La columna se lavó con por lo menos 3 BV de
disolución de conservación y se conservó hasta el ciclo
siguiente.
La cantidad de proteínas de células hospedantes
se midió por ELISA usando un antisuero policlonal que se elevó en
el conejo contra contaminantes derivados de células CHO presentes en
el medio de cultivo celular libre de suero. La cantidad de
proteínas de células hospedantes se expresa como ppm (partes por
millón) de proteínas contaminantes en relación con la
IL-18BP purificada. La cantidad de
IL-18BP se midió por determinación de la densidad
óptica (OD) a 280 nm (coeficiente de extinción molar e= 1,26) en la
preparación purificada de IL-18BP, es decir,
después de la etapa de purificación final por cromatografía de fase
inversa.
Este análisis se llevó a cabo en el marco de
tres experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 1 se llevó a cabo como se indicó
anteriormente con las siguientes modificaciones:
La etapa de captura se llevó a cabo en un
Fractogel® TMAE HiCap®, adquirido de Merck.
En la etapa (a), la etapa de purificación IMAC
en una columna de Sefarosa quelante Fast Flow, se añadió una etapa
de lavado adicional que usa cloruro de amonio 15 mM en el tampón de
equilibrio.
Además de esto, en la etapa (a) la elución se
llevó a cabo usando acetato de amonio 0,06 M a pH 8,7.
En la etapa (d), la elución comenzó con el
tampón de elución de borato de sodio 50 mM, pH 9,1 \pm 0,2,
sulfato de amonio 0,10 M.
La caracterización biológica de un Material de
Referencia de r-hIL-18BP se basó en
la evaluación de su capacidad para unir específicamente
r-hIL-18, neutralizar su actividad
biológica en la línea celular de leucemia mielógena aguda humana
KG-1. Esta línea celular es capaz de producir
IFN-\gamma en respuesta a la IL-18
humana más TNF-\alpha humano en un modo
dependiente de la dosis, suprimiendo la
r-hIL-18BP, la producción de
IFN-\gamma.
En síntesis, se añadieron células
KG-1 a 1x10^{5} células/pocillo a una placa de 96
pocillos que ya contenía concentraciones de
r-hIL-18BP en presencia de una
concentración fija de r-hIL18 (40 ng/ml en el
pocillo) más una concentración fija de
r-hTNF-\alpha (10 ng/ml en el
pocillo). La concentración de cada una de estas dos sustancias
combinadas entre sí pudo producir una inducción
sub-máxima de la producción de
IFN-\gamma en células KG-1.
Después de 24 h a 37ºC, 5% CO_{2}, la placa se colocó a -20ºC con
el fin de someter las células tratadas a un ciclo de
congelación/descongelación antes de realizar el inmunoensayo para
determinar la cantidad de IFN-\gamma presente en
el sobrenadante celular. Se recogieron los sobrenadantes celulares
y se midió el IFN-\gamma humano mediante un
inmunoensayo específico (kit ELISA
h-IFN-\gamma, Duo Set R&D
Systems). La cantidad de IFN-y producida por las
células tratadas se calculó interpolando los valores y (O.D.) en la
curva estándar de IFN-\gamma, provista con el kit,
ajustada por una dosis y respuesta sigmoidal (4PL) Log/Log
transformada, obteniendo de este modo los valores x (concentraciones
de IFN-\gamma) (GraphPad Prism). La dilución del
material de referencia de disolución de
r-hIL-18BP
(ST1P01/r-hlL-18 BP) capaz de
inhibir por 50% (CE_{50}) la cantidad de producción de
IFN-y inducida por una concentración fija de
r-hIL-18 + una concentración fija
de r-hTNF-\alpha se definió como
Unidad 1 (U).
Se realizaron diez ensayos independientes y cada
una de las diez curvas de dosis y respuesta se trazó describiendo
en el eje y el % de producción de IFN-\gamma y en
el eje x las diluciones de
ST1P01/r-hIL-18BP. La curva de
dosis y respuesta de la r-hIL-18BP
generada en cada experimento se normalizó primero suponiendo igual a
0% y a 100% el valor más bajo y el valor más alto de
INF-\gamma, respectivamente.
El valor de IFN-y más alto fue
producido por concentraciones combinadas de
r-hIL-18 más
r-hTNF-\alpha en ausencia de
r-hIL-18BP, mientras que el valor
más bajo fue producido por una concentración mayor de
r-hIL-18BP ensayada. Se aplicó
luego una dosis y respuesta sigmoidal con algoritmo de pendiente
variable (4PL) para interpolar los valores normalizados y se
determinó el CE_{50} para cada experimento.
El valor cuantitativo del Material de Referencia
se calculó en cada ensayo de la siguiente manera:
Valor
cuantitativo (U/ml)= Valor recíproco de la dilución a 50% de la
pre-dilución de respuesta
x
El valor cuantitativo
ST1P01/r-hIL-18BP final se calculó
promediando los diez 10 valores cuantitativos individuales
obtenidos en cada experimento.
La Fig. 2 muestra las curvas de dosis y
respuesta de ST1P01/r-hIL-18BP por
el bioensayo de KG-1 in vitro obtenido en
diez experimentos independientes.
Las curvas se normalizaron suponiendo que el
valor más bajo de era INF-7 igual a 0% y el valor
más alto de INF-7 igual a 100%, respectivamente. El
valor más alto de IFN-\gamma fue producido por
concentraciones combinadas de
r-IL-18 más
r-hTNF-\alpha en ausencia de
r-hIL-18BP, mientras que el valor
más bajo fue producido por la concentración de
r-hIL-18BP más alta ensayada. Se
aplicó luego una dosis y respuesta sigmoidal con algoritmo de
pendiente variable (4PL) para interpolar los valores normalizados y
se determinó el CE_{50} para cada experimento mediante GraphPad
Prism.
Los valores cuantitativos individuales para
ST1P01/r-hIL-18BP obtenidos en cada
experimento independiente junto con la desviación estándar, el
coeficiente de variación (%) y el 95% de límites de confianza se
indican a continuación.
La potencia media estimada del Material de
Referencia ST1P01/r-hIL-18BP resultó
ser igual a 895869 U/ml con un CV% de 17,6.
El ensayo se lleva a cabo en placas de 96
pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones de la muestra descrita en la
placa son un ejemplo.
\bullet Se añaden 50 \mul de medio de
cultivo (500 ml IMDM enriquecido con 20% FBS inactivado por calor 30
min a 56º, 5 ml 2-mercaptoetanol 3 mM, 5 ml
l-glutamina 2 mM y 5 ml Pen/Estrep; 10.000
U/ml/10.000 \mug/ml) a los pocillos 2 a 12 de las filas
B-C.
\bullet Se añaden 150 \mul de Material de
Referencia r-hIL-18BP a 1500 ng/ml
(300 ng/ml en el pocillo) al primer pocillo de las filas
B-C.
\bullet usando una pipeta de múltiples canales
se realizan diluciones en serie 1:15, transfiriendo 100 \mul del
pocillo de la columna 1 al pocillo de la columna 9 (filas
B-C), desechando el exceso de 100 \mul del
pocillo de la columna 9.
\bullet Se añaden 50 \mul de muestra de
r-hIL-18BP preparada con una de 2
concentraciones dentro de la parte lineal de la curva de dosis y
respuesta (p. ej., S1^{1} a 600 ng/ml correspondientes a 120 ng/ml
en el pocillo) a los pocillos de las columnas 1-2
de la fila D (2 reproducciones).
Observación: las posiciones de la muestra
descrita en la placa se proveen a modo de ejemplo.
\bullet Se repite el punto 4 para la
concentración de la segunda muestra (S1^{2}).
\bullet Se añaden 50 \mul de
r-hIL-18 a 200 ng/ml (40 ng/ml en el
pocillo) a todos los pocillos de las filas B-C
excepto aquellos en la columna 12 y a los pocillos que contienen la
muestra (p. ej., columnas 1-2 filas
D-E).
\bullet Se añaden 50 \mul de
r-r-hTNF-\alpha a
50 ng/ml (10 ng/ml en el pocillo) a todos los pocillos de las filas
B-C excepto aquellos en la columna 11 y a los
pocillos que contenían la muestra (p. ej., columnas
1-2 filas D-E).
\bullet Se añaden 50 \mul de medio de
cultivo a los pocillos de las columnas 11 y 12 de las filas
B-C
\bullet Se añaden 150 \mul de medio de
cultivo a todos los pocillos de la fila A (Pocillos de células de
control).
\bullet Se añaden 100 \mul de una suspensión
celular de KG-1 a 1x10^{6} células/ml a todos los
pocillos de la placa de 96 pocillos.
Nota: El volumen final en el pocillo es 250
\mul; la dilución final de
r-hIL-18BP 1:5. La suspensión
celular se prepara a partir de un matraz T75 que contiene no menos
de 20-24x10^{6} células (15 ml de medio de
cultivo).
\bullet Se incuba la placa durante 24 h a
37ºC, 5% CO_{2}
\bullet Se elimina la placa de la incubadora y
se coloca a -20ºC hasta realizar el inmunoensayo para determinar la
cantidad de IFN-\gamma presente en el sobrenadante
celular.
\bullet Se recoge el sobrenadante celular y se
mide el IFN-\gamma humano mediante un inmunoensayo
específico (ELISA h-IFN-\gamma,
kit Duo Set R&D Systems).
Nota: de acuerdo con la concentración de
r-hIL-18BP añadida, se realiza, si
es necesario, más de 1 dilución de la muestra del sobrenadante
celular para asegurar que la O.D sea cuantificable en la curva
estándar de IFN-\gamma.
El ELISA se realizó de acuerdo con el protocolo
general provisto con el kit con modificaciones leves:
\bullet Se aumentó el número de etapas de
lavado: de 3 a 4 y de 4 a 5 para al menos una.
\bullet Se preparó tampón de bloqueo añadiendo
1% BSA en PBS (sin añadir sacarosa ni NaN_{3}).
\bullet El diluyente reactivo se preparó
añadiendo 0,1% BSA y 0,05% Tween-20 en PBS en lugar
de disolución salina tamponada con Tris.
La cantidad de IFN-\gamma
producida por las células tratadas se calculó en la curva estándar
de IFN-y (provista con el kit) Log/Log transformada
e interpolada mediante una curva de dosis y respuesta sigmoidal con
algoritmo de pendiente variable (software
Grap-Pad).
La actividad específica de la
IL-18BP se calcula de acuerdo con la siguiente
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes tablas indican los resultados
obtenidos para diversos parámetros a lo largo del procedimiento de
purificación según lo descrito en este ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\global\parskip0.880000\baselineskip
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24. WO03013577
25. WO 92/13095
26. WO 01/03737
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28. US 4.588.585
29. US 4.737.462
30. US 5.116.943
31. US 4.965.195
32. US 4.879.111
33. US 5.017.691
34. US 4.904.584
\global\parskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Uso de cromatografía de
carga-inducción hidrófoba para la producción de la
proteína de unión a IL-18
(IL-18BP).
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que la cromatografía de carga-inducción hidrófoba se
lleva a cabo en una resina de
4-mercapto-etil-piridina
(MEP).
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
en el que la cromatografía de carga-inducción
hidrófoba se usa en combinación con una etapa seleccionada entre
cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y cromatografía de fase inversa.
4. Un procedimiento para la producción de
IL-18BP purificada, que comprende someter un fluido
a una etapa de cromatografía de carga-inducción
hidrófoba.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación, en el que la cromatografía de
carga-inducción hidrófoba se lleva a cabo en una
resina de
4-mercapto-etil-piridina.
6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 4 ó 5, que además comprende una etapa
seleccionada entre cromatografía de afinidad de iones metálicos
inmovilizados, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía
de interacción hidrófoba y cromatografía de fase inversa.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la cromatografía de afinidad de iones
metálicos se lleva a cabo en una resina quelante.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la cromatografía de intercambio iónico
es una cromatografía de intercambio catiónico.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la cromatografía de intercambio
catiónico se lleva a cabo en una resina de carboximetilo (CM).
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la cromatografía de interacción
hidrófoba se lleva a cabo en una resina de fenilo.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la etapa de cromatografía de fase
inversa se lleva a cabo en una matriz de fase inversa
polimérica.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la matriz de fase inversa polimérica es
la fase inversa source 30 RPC.
13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 12, que comprende las etapas de:
(a) someter el fluido a cromatografía de
afinidad de iones metálicos;
(b) someter el eluato de la cromatografía de
afinidad de iones metálicos a cromatografía de
carga-inducción hidrófoba;
(c) someter el eluato a la cromatografía de
carga-inducción hidrófoba a cromatografía de
intercambio catiónico;
(d) someter el flujo de la cromatografía de
intercambio catiónico a cromatografía de interacción hidrófoba;
(e) someter el eluato de la cromatografía de
interacción hidrófoba a cromatografía de fase inversa.
14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, que además comprende una o más
etapas de ultrafiltración.
15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, que además comprende una o más
etapas de filtración para eliminación de virus.
16. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, que además comprende una etapa
de captura inicial.
17. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que la etapa de captura se lleva a cabo por
cromatografía de intercambio aniónico fuerte.
18. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que la etapa de captura se lleva a cabo en
una resina de amonio cuaternario (Q).
19. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que la etapa de captura se lleva a cabo en
una resina de TMAE.
20. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 o el procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 19, en el que la IL-18BP
es IL-18BP humana recombinante.
21. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 o el procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 19, en el que el fluido es sobrenadante
de cultivo celular libre de suero.
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