ES2285840T3 - Medio de cultivo para el cultivo de celulas animales y metodo para producir proteinas que utilizan dicho metodo. - Google Patents
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Abstract
Un medio de cultivo adecuado para el cultivo de una célula animal, caracterizado por contener un producto de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne de pescado.
Description
Medio de cultivo para el cultivo de células
animales y método para producir proteínas que utilizan dicho
método.
Esta invención se refiere a un medio de cultivo
para el cultivo de una célula animal y a un método para producir
una proteína utilizando dicho método. Más específicamente, la
invención se refiere a un medio de cultivo para el cultivo de una
célula animal, conteniendo el medio de cultivo un extracto de carne
de pescado, o un producto de la degradación enzimática de carne de
pescado, pero no contiene componente derivado de mamífero tal como
proteína o su producto de descomposición; y a un método para
producir una proteína utilizando el medio de cultivo.
En el cultivo de una célula animal para obtener
una proteína natural producida por la célula animal, o en el
cultivo de una célula animal incorporando un gen que codifica para
una proteína deseada para producir esa deseada proteína, etc., se
añaden al medio de cultivo nutrientes esenciales tales como bases,
azúcares, aminoácidos y vitaminas. Además, se añade habitualmente
un extracto derivado de mamífero, concretamente, suero tal como
suero bovino fetal, en una cantidad en el intervalo de 5 a 20% para
proliferación de la célula animal. Sin embargo, tal suero derivado
de mamífero tiene una serie de desventajas. Supone un 75 a un 96%
del coste del medio de cultivo, y a causa de las diferencias que
existen entre lotes en cuanto a calidad, no se alcanza una
proliferación estable. Además, el suero derivado de mamífero no
puede esterilizarse en un autoclave o similar, por lo que puede
contaminarse con virus y micoplasmas. Aunque la mayoría de estos
virus o micoplasmas no son patógenos, pueden llegar a ser factores
desconocidos adicionales desde el punto de vista de una producción
estable. Además, el suero contiene más de 500 tipos de proteínas, lo
que complica el aislamiento y purificación de la proteína deseada,
el producto de la célula, desde el medio de cultivo. Para resolver
estos problemas con una producción estable, se llevan a cabo métodos
que utilizan una proteína purificada derivada del suero tal como
fetuina, insulina o transferrina, en lugar del suero. También se han
intentado métodos que utilizan componentes de medio de cultivo
extraído de animales, desde el punto de vista de los costes de
producción.
En años recientes, se ha expresado la
preocupación sobre la relación de componentes derivados de mamíferos
con la enfermedad de las vacas locas, encefalopatía espongiforme
bovina (BSE), encefalopatía espongiforme transmisible (TSE), y
enfermedad de Creutzfeld- Jakob (CJD). Por eso, por el aspecto de
la seguridad, existe la demanda del desarrollo de un medio de
cultivo para el cultivo de una célula animal, medio de cultivo que
esté libre de estos componentes derivados de mamífero.
En el cultivo de una célula animal, el no añadir
los anteriormente mencionados componentes derivados de mamífero al
medio de cultivo da lugar a una marcada caída en la tasa de
supervivencia de las células, y una disminución en el número de
células viables en el caldo de cultivo, en un estadio temprano del
cultivo. Estos episodios hacen imposible el cultivo a largo plazo o
a gran escala. La presente invención tiene como objetivo
proporcionar un medio de cultivo de una célula animal, medio de
cultivo que no contiene componentes derivados de mamífero y que
está libre de los anteriores problemas, y un método para producir
una proteína empleando el medio de cultivo.
Para conseguir el anterior objetivo, los autores
de la presente invención han eliminado los componentes derivados de
mamífero de los medios de cultivo convencionales para cultivar las
células animales. Han añadido varias substancias a los medios de
cultivo resultantes y han llevado a cabo un estudio exhaustivo
utilizando célula CHO transformada con un gen que codifica una
proteína anticuerpo. El propósito del estudio era la obtención de
una substancia que estimulara la proliferación de la célula CHO,
produciendo así una elevada concentración de la proteína
anticuerpo. El estudio ha conducido al hallazgo de que podía
conseguirse el propósito por adición de un extracto de carne de
pescado o un producto de degradación enzimática de la carne de
pescado, y basándose en este hallazgo se ha completado la presente
invención.
Según esto, la invención se refiere a un medio
de cultivo para cultivo de una célula animal, medio de cultivo que
contiene un extracto de carne de pescado o un producto de
degradación enzimática de carne de pescado, y un método para
producir una proteína con el empleo del medio de cultivo.
La Figura 1 es una gráfica que muestra la
densidad de células viables de células CHO cultivadas en medios de
cultivo que contienen 1% Brix y 2% Brix de un producto de
degradación enzimática de carne de pescado, y 10 g/l de hidrolizado
de buey, respectivamente.
La Figura 2 es una gráfica que muestra las tasas
de supervivencia (%) de células CHO cultivadas en medios de
cultivo que contienen 1% Brix y 2% Brix de un producto de
degradación enzimática de carne de pescado, y 10 g/l de un
hidrolizado de buey, respectivamente.
\newpage
La Figura 3 es una gráfica que muestra las
concentraciones (mg/l) de una proteína anticuerpo producida en
medios de cultivo por células CHO que habían sido cultivadas en
medios de cultivo que contiene 1% Brix y 2% Brix de un producto de
degradación enzimática de carne de pescado, y 10 g/l de un
hidrolizado de buey, respectivamente.
La Figura 4 muestra los resultados de cultivo de
células utilizando un dispositivo de cultivo de células tipo matraz
de sacudidor del Ejemplo 5. Los ejes verticales de los paneles de la
Figura 4 representan la densidad de célula viables, la tasa de
supervivencia de células, y la cantidad de proteína anticuerpo
producida, respectivamente. Los ejes horizontales representan, cada
uno, el número de días de cultivo tras comenzar el cultivo
utilizando el medio de cultivo B.
La presente invención se describirá a
continuación con detalle. Todos los documentos aquí citados lo son
como referencia.
El medio de cultivo de la invención es un medio
de cultivo de una célula animal, medio de cultivo que contiene un
extracto de carne de pescado o un producto de degradación enzimática
de la carne de pescado. Según la invención, se puede cultivar
satisfactoriamente una célula animal sin adición de componentes
derivados de mamífero en un medio de cultivo que ha sido utilizado
generalmente como medio de cultivo para el cultivo de una célula
animal.
Entre los ejemplos de la carne del pescado
utilizado en la invención están la de los pescados de carne roja,
tales como bonito, caballa fragata, atún, caballa, jurel, sardina,
caballa equina, y salmón, y los pescados de carne blanca, tales
como bacalao, perca de los mares de Japón, platija de ojo derecho,
platija de ojo izquierdo y ciprínido marino. Los ejemplos que se
prefieren son bonito, caballa fragata, bacalao, caballa, salmón, y
sardina.
El extracto de carne de pescado utilizado en la
invención se puede obtener cortando la carne del pescado en trozos
adecuados, o desmenuzando la carne del pescado hasta formar una
pasta y extrayendo los componentes solubles de los trozos o la
pasta con agua caliente, por ejemplo, agua caliente entre 90 y 95ºC,
durante varias decenas de minutos a varias decenas de horas.
Ejemplos concretos son los stocks hechos de bonito hervido para
producción de bonito desecado, y el drenado de la cocción durante la
producción del alimento enlatado.
El producto de degradación de enzima de la carne
de pescado se puede obtener, por ejemplo, por adición de una
cantidad adecuada de agua a la carne del pescado cocida como tal, o
la carne de pescado desmenuzada hasta una pasta, o el extracto de
la carne del pescado anterior, seguido, si es necesario, por
calentamiento para desnaturalización de la proteína, tratando
entonces el material con una proteasa, y centrifugando o filtrando
el material tratado según se desee, para separar aceites e
insolubles. El extracto de carne de pescado resultante o el
producto de degradación enzimática de la carne de pescado se ajusta
deseablemente a pH 7 a 7,4 para su uso.
La proteasa utilizada en la invención es, por
ejemplo, una proteinasa y/o una peptidasa. En la invención, el
término proteinasa se refiere a una enzima que hidroliza una
proteína como substrato, mientras que el término peptidasa se
refiere a una hidrolasa del enlace péptido para un péptido como
substrato. Es decir, la actividad de la proteasa frente al
substrato proteína se puede designar como actividad de proteínasa,
mientras que la actividad de proteasa frente al substrato péptido
se puede designar como actividad de peptidasa. Cuando se cataliza
la escisión de una cadena de enlaces peptídicos, en su posición
intermedia, por la actividad de proteasa frente al substrato
proteína, se utiliza el término proteinasa. Por tanto, endopeptidasa
se utiliza aquí como una de las proteinasas.
Entre los ejemplos de enzimas que se utilizan
están las enzimas de origen vegetal, tales como papaína,
quimopapaína, bromomelaína, y ficina, y enzimas de microrganismos,
tales como mohos, bacterias y levaduras. Estas incluyen
endopeptidasa, exopeptidasa, aminopeptidasa, carboxipeptidasa y
dipeptidasa. Estas enzimas se pueden utilizar solas o en
combinación. Cuando se combinan, se pueden añadir al mismo tiempo o
progresivamente.
El producto de degradación enzimática de la
carne de pescado en la presente invención es, preferiblemente, un
producto de degradación enzimática de la carne de pescado obtenido
por tratamiento con la proteinasa, seguido del tratamiento con la
peptidasa.
Las condiciones para el tratamiento con la
encima difieren según el tipo de la enzima utilizada. Normalmente,
el tratamiento de enzima se lleva a cabo durante 30 minutos a 72
horas, preferiblemente 3 a 24 horas, a pH 2 a 12, preferiblemente
pH 4 a 8, a 30, a 90ºC, preferiblemente 40 a 65ºC. La enzima se
utiliza en una proporción de aproximadamente 0,01 a 10%,
preferiblemente 0,5 a 5%, más preferiblemente 1 a 3%, basado en la
proteína como substrato.
La enzima en el producto de degradación
enzimática resultante de la carne de pescado se inactiva por
calentamiento o similar y llevando a cabo centrifugación o
filtración, según se desee, para separar aceites insolubles, con lo
que se puede preparar el producto de degradación enzimática.
Como otros componentes del medio de cultivo de
la invención, se pueden utilizar varios componentes en medios de
cultivo de células animales según se desee. Estos incluyen
aminoácidos, vitaminas, factores de lípidos, fuentes de energía,
reguladores osmóticos, fuentes de hierro y reguladores de pH. Además
de estos componentes, se pueden añadir elementos de metal traza,
agentes tensioactivos, cofactores de crecimiento, y nucleosidos.
Entre los ejemplos están aminoácidos, tales
como L-alanina, L-arginina,
L-asparagina, ácido L-aspártico,
L-cisteína, L-cistina,
L-glutamina, ácido L-glutámico,
glicina, L-histidina, L-isoleucina,
L-leucina, L-lisina,
L-metionina, L-ornitina.
L-fenilalanina, L-prolina,
L-serina, L-treonina,
L-triptofano, L-tirosina, y
L.valina, preferiblemente, L-alanina,
L-arginina, L-asparagina, ácido
L-aspártico, L-cistina,
L-glutamina, ácido L-glutámico,
glicina, L-histidina, L-isoleucina,
L-leucina, L-lisina,
L-metionina, L-fenilalanina,
L-prolina, L-serina,
L-treonina, L-triptofano,
L-tirosina y L-valina; vitaminas,
tales como i-inositol, biotina, ácido fólico, ácido
lipoico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido
p-aminobenzoco, pantotenato de calcio, hidrocloruro
de piridoxal, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, hidrocloruro
de tiamina, vitamina B_{12}, y ácido ascórbico, preferiblemente
biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, pantotenato de
calcio, hidrocloruro de piridoxal, riboflavina, hidrocloruro de
tiamina, vitamina B_{12}, y ácido ascórbico; factores de lípidos,
tales como cloruro de colina, tartrato de colina, ácido linoleico,
ácido oleico y colesterol, preferiblemente, cloruro de colina;
fuentes de energía, tales como glucosa, galactosa, manosa y
fructosa, preferiblemente, glucosa; reguladores osmóticos, tales
como cloruro de sodio, cloruro de potasio, y nitrato de potasio,
preferiblemente, cloruro de sodio; fuentes de hierro, tales como
EDTA de hierro, citrato férrico, cloruro ferroso, cloruro férrico,
sulfato ferroso, sulfato férrico y nitrato férrico, preferiblemente,
cloruro férrico, EDTA de hierro y citrato férrico y reguladores del
pH, tales como bicarbonato de sodio, cloruro de calcio, fosfato
monobásico de sodio, HEPES, y MOPS, preferiblemente bicarbonato de
sodio. Se pueden citar como ejemplos los medios de cultivo que
contienen cualquiera de estos componentes.
Junto con los anteriores componentes, se pueden
añadir elementos metálicos traza, tales como sulfato de cobre,
sulfato de manganeso, sulfato de zinc, sulfato de magnesio, cloruro
de níquel, cloruro de estaño, cloruro de magnesio, y subsilicato
de sodio, preferiblemente sulfato de cobre, sulfato de zinc, y
sulfato de magnesio; agentes tensioactivos, tales como Tween 80, y
Pluronic F68; cofactores de crecimiento, tales como insulina
recombinante, IGF recombinante, EGF recombinante, FGF recombinante
PDGF recombinante, TGF-\alpha recombinante,
hidrocloruro de etanolamina, selenito de sodio, ácido retinoico, y
dihidrocloruro de putrescina, preferiblemente, selenito de sodio,
hidrocloruro de etanolamina, IGF recombinante, y dihidrocloruro de
putrescina; y nucleosidos, tales como desoxiadenosina,
desoxicitidina, desoxiguanosina, adenosina, citidina, guanosina y
uridina. En modos de realización preferidos de la presente
invención, puede estar contenidos antibióticos, tales como
estreptomicina, penicilina G potasio y gentamicina, e indicadores de
pH, tales como Rojo fenol.
Para preparar, en concreto, el medio de cultivo
de la invención, se puede añadir el extracto de la carne del
pescado, o el producto de la degradación enzimática de la carne de
pescado, en lugar de los componentes derivados del mamífero, a un
medio de cultivo disponible comercialmente, para el cultivo de la
célula animal, por ejemplo medio BME, medio MEM, medio DMEM, medio
F10, o medio F12.
En la invención, se añade el extracto de carne
del pescado, o producto de la degradación enzimática de la carne de
pescado al medio de cultivo a una concentración de aproximadamente
5% Brix o menos, preferiblemente 0,5 a 3% Brix, preferiblemente en
particular 1 a 2% Brix, en el medio de cultivo. Esta concentración
es una concentración determinada por los sólidos solubles, como un
índice, medida con un refractómetro para el contenido de azúcar.
Las cantidades de los otros componentes en el
medio de cultivo son 0,05 a 1.500 mg/l para aminoácidos, 0,001 a 10
mg/l para vitaminas, 0 a 200 mg/l para factores de lípidos, 1 a 20
g/l para fuentes de energía, 0,1 a 10.000 mg/l para reguladores
osmóticos, 0,1 a 500 mg/l para fuentes de hierro, 1 a 10.000 mg/l
para agentes tampón de pH, 0,00001 a 200 mg/l para elementos de
metal traza, 0 a 5.000 mg/l para agentes tensioactivos, 0,05 a
10.000 \mug/l para cofactores de crecimiento, y 0,001 a 50 mg/l
para nucleosidos. Sus cantidades se pueden determinar, según se
requiera, dependiendo del tipo de célula animal que se cultiva y el
tipo de proteína deseada.
El pH del medio de cultivo difiere según la
célula que se cultiva, pero generalmente es un pH de 6,8 a 7,6, pH
7,2 a 7,4 en muchos casos.
El medio de cultivo de la invención se puede
utilizar sin restricción para cultivar preferiblemente varios tipos
de células animales. Por ejemplo, se puede cultivar una célula COS o
célula CHO que tiene un gen para el deseado anticuerpo o substancia
fisiológicamente activa incorporado por un procedimiento de
ingeniería genética o una célula fundida que produce anticuerpo
tipificada por un hibridoma, tal como una ratón.- humano.
ratón-ratón o ratón-rata. El medio
de cultivo es preferido en particular para cultivar una célula CHO.
No hace falta decir que el medio de cultivo para cultivar una
célula animal según la invención se puede utilizar cuando se
cultiva una célula animal para obtener una proteína natural
producida por la célula animal. El medio de cultivo se puede
utilizar para cultivar una célula de BHK y una célula HeLa así como
las células antes mencionadas.
Las condiciones de cultivo difieren según el
tipo de célula utilizada, y se pueden determinar las condiciones
preferidas según se desee. La célula CHO, por ejemplo, se cultiva
normalmente durante 1 a 14 días en una atmósfera con una
concentración de CO_{2} en la fase gaseosa de 0 a 40%,
preferiblemente 2 a 10%, a 30 a 39ºC, preferiblemente
aproximadamente 37ºC.
El cultivo se puede llevar a cabo utilizando
varios dispositivos de cultivo para cultivo de células animales,
por ejemplo un dispositivo de cultivo de depósito tipo fermentador,
un dispositivo de cultivo de tipo elevador neumático, un
dispositivo de cultivo del tipo matraz de cultivo, un dispositivo de
cultivo tipo matraz giratorio, un dispositivo de cultivo tipo
microtransportador, un dispositivo de cultivo de lecho fluidizado,
un dispositivo de cultivo de tipo fibra hueca, un dispositivo de
cultivo del tipo botella rodillo, y un dispositivo de cultivo del
tipo lecho empaquetado.
Por realización de un cultivo en el medio de
cultivo para cultivar una célula animal según la invención, se
puede obtener una proteína producida por la célula animal en el
medio de cultivo. Para producir la proteína desde la célula animal,
puede ser suficiente el simple cultivo, o se puede requerir un
procedimiento especial. El procedimiento, condiciones, etc. se
pueden determinar, según se requiera, dependiendo de la célula
animal que se cultiva. En el caso de una célula CHO transformada
por un vector que contiene un gen que codifica un anticuerpo
quimérico ratón-humano por una operación de
ingeniería genética, por ejemplo, el cultivo se realiza en las
condiciones antes mencionadas, con lo que puede obtenerse la
proteína deseada en el medio de cultivo en aproximadamente 1 a 14
días, preferiblemente en aproximadamente 7 a 10 días. El medio de
cultivo se somete a aislamiento y purificación por los métodos
acostumbrados (véase, por ejemplo, "Introducción a Ingeniería de
Anticuerpos", editorial Chijin Sho Kan, páginas
102-104; Principios y Métodos de Cromatografía de
Afinidad; Amersham Pharmacia Bitech, páginas
56-60), con lo que se puede obtener la proteína
deseada.
Los métodos anteriores de producción pueden
producir proteínas de gen recombinantes, tales como anticuerpos
recombinantes tales como anticuerpo de receptor IL-6
anti-humano (incluyendo anticuerpos quiméricos,
anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos), factor estimulante
de colonia de granulocitos (G-CSF), factor
estimulante de colonia de macrófagos granulocitos
(GM-CSF), eritropoyetina, interferon, interleucinas
(por ejemplo, IL-1 y IL-6),
t-PA, urocinasa, albúmina de suero, y factor VIII de
coagulación de la sangre.
El medio de cultivo para cultivar una célula
animal según la presente invención contiene un extracto de carne de
un pescado o un producto de degradación enzimática de la carne de
pescado, haciendo así posible cultivar establemente una célula
animal, sin emplear una proteína cara que varía mucho en calidad,
tal como el suero bovino fetal. Además, por cultivo de la célula
animal en el medio de cultivo para cultivar una célula animal según
la presente invención, es decir, el medio de cultivo que tiene el
extracto de la carne de pescado o el producto de degradación
enzimática de la carne de pescado, se puede eliminar el riesgo de
contaminación por prion anormal o por virus, que es el problema que
ha aparecido en los últimos años, y se pueden producir productos
biotecnológicos seguros y disponer de ellos.
A continuación se dan ejemplos para describir
con más detalle la presente invención, pero la invención no queda
limitada por estos ejemplos. Se pueden realizar cambios y
modificaciones por personas especialistas en esta área, los cuales
también se incluyen en el marco de la invención.
Se utilizó sardina comercial como carne de
pescado. A 500 g de la carne de pescado desmenuzada, se añadieron
2.500 g de agua y la carne del pescado se dejó en extracción durante
90 minutos a una temperatura de 95ºC.
El extracto se centrifugó y filtró para separar
insolubles y aceites. El residuo se concentró para obtener 64 g de
un extracto de la carne del pescado (sardinas).
Se utilizó bonito disponible comercialmente como
carne del pescado. A 1.000 g del bonito desmenuzado, se añadieron
1.500 g de agua. La mezcla se incubó durante 1 hora junto con 4 g de
papaina derivada de vegetal a un pH 6,0 y 50ºC para degradación
enzimática. Se llevó a cabo entonces más degradación enzimática con
4 g de exopeptidasa derivada de mohos durante 20 minutos bajo las
condiciones anteriores, después de lo cual se calentó el sistema a
95ºC para inactivar las enzimas. Se centrifugó entonces el sistema y
se filtró para separar los insolubles y aceites. Se concentró el
residuo para obtener 500 g de un producto de degradación enzimática
de carne de pescado (bonito) según la invención.
Se separaron timidina e hipoxantina de un medio
DMEM/F12 comercialmente disponible (Productos GIBCO BRL y Guía de
Referencia, páginas 357-358). Al medio resultante se
añadieron los siguientes componentes (la mezcla se citará después
como Medio de Cultivo A) y la mezcla se utilizó como medio de base
para el cultivo de una célula animal.
Se separaron la timidina y la hipoxantina de un
medio comercial DMEM/F12, y se añadieron los siguientes
componentes:
- 30 mg/l de ácido ascórbico
- 10 mg/l de desoxiadenosina (1H_{2}O)
- 10 mg/l de desoxicitina
- 10 mg/l de desoxiguanosina
- 5 mg/l de adenosina
- 5 mg/l de citidina
- 5 mg/l de guanosina
- 4 mg/l de uridina
- 4 mg/l de etanolamina (HCl)
- 1000 mg/l de Pluronic F-68
- 18,9 mg/l de cloruro férrico (6H_{2}O).
Al anterior medio de cultivo A, se añadió el
producto de degradación enzimática preparado en el Ejemplo 2 a una
concentración final de 1% Brix o 2% Brix, y la mezcla se
esterilizó por filtración.
Se llevó a cabo un ensayo utilizando cepa de
células CHO que producían anticuerpo humanizado (anticuerpo de
receptor IL-6 anti-humano) que se
preparó según el método descrito en el Ejemplo de referencia 2 de la
Publicación de Patente sin examinar No. 99902/1996 por utilización
de promotor I\alpha de factor de elongación humano descrito en el
Ejemplo 10 de la Publicación de Solicitud de Patente Internacional
Nº WO92/19759.
Las anteriores células (1,5 x 10^{5}
células/ml) se añadieron a Medio de cultivo A que contenía el
producto de degradación enzimática de la carne del pescado, que se
había preparado en el Ejemplo 2 de la presente invención, a una
concentración final de 1% Brix o 2% Brix. El sistema se cultivó
durante 10 días en las condiciones de incubadora de 37ºC, 5% de
CO_{2}, por medio de un dispositivo de cultivo de células tipo
matraz de sacudidor.
Se midieron entonces la densidad de células
viables, la tasa de células supervivientes, y la cantidad de
producción de una proteína de anticuerpo obtenida desde el medio de
cultivo. La cantidad de producción se midió utilizando
cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa.
Se preparó, como control, un medio de cultivo
que contenía 10 g/litro de un hidrolizado de buey (Primatone^{TM}:
Quest, Estados Unidos) en lugar del producto de degradación de
enzima del Ejemplo 2, y las células CHO se cultivaron de la misma
manera.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 1. Comparando con el control, las células CHO cultivadas en
el medio de cultivo que contenía 1% Brix del producto de
degradación enzimática de bonito mostraba un crecimiento celular
comparable al del control. Las células CHO cultivadas en el medio de
cultivo que contenía 2% Brix del producto de degradación enzimática
de bonito producían una cantidad mayor de proteína de anticuerpo
que el control.
Se añadieron productos de degradación enzimática
de las carnes de pescado de bonito, sardina, salmón, caballa
fragata, bacalao y caballa a un medio de cultivo de origen
no-mamífero, y se estudió la cantidad de producción
de proteína anticuerpo.
Se preparó un producto de degradación de la
carne de los pescados anteriores por el método descrito en el
Ejemplo 2. Es decir, se desmenuzó la carne del pescado y se sometió
a degradación enzimática con papaína, una endopeptidasa derivada de
vegetales. Se sometió entonces el material a más degradación con
exopeptidasa derivada de moho, después de lo cual se calentó el
sistema para inactivar las enzimas. Se centrifugó entones el
sistema y se filtró para separar insolubles y aceites. Se concentró
el residuo para preparar un producto de degradación enzimática de la
carne de pescado.
Se añadieron células CHO dhfr (-) transformadas
con un gen que codifica el anticuerpo PM-1
humanizado (anticuerpo de receptor IL-6
anti-humano) descrito en el Ejemplo 4, y se añadió
gen marcador selectivo dhfr al medio de cultivo B que contenía el
producto de degradación enzimática de bonito, sardina, salmón,
caballa fragata, bacalao o caballa a una concentración final de 10
g/litro (1% Brix) o 15 g/litro (1,5% Brix). Se cultivó el sistema
durante 10 días bajo condiciones de incubadora, 37ºC, 5% de
CO_{2}, en un dispositivo de cultivo de células tipo matraz de
sacudidor. Se determinaron entonces la densidad de células viables,
la tasa de supervivencia de células, y la cantidad de producción de
una proteína anticuerpo. A continuación se muestran los componentes
del medio de cultivo B.
Se separaron timidina e hipoxantina de un medio
DMEM/F12 comercial, y se añadieron los siguientes componentes:
- 12,5 mg/l de ácido ascórbico
- 2,5 mg/l de desoxiadenosina (1H_{2}O)
- 2,5 mg/l de desoxicitina
- 2,5 mg/l de desoxiguanosina
- 2,5 mg/l de adenosina
- 2,5 mg/l de citidina
- 2,5 mg/l de guanosina
- 5,0 mg/l de uridina
- 0,2 mg/l de putrescina (HCl)
- 0.975 mg/l de etanolamina (HCl)
- 500 mg/l de Pluronic F-68
- 10 mg/l de citrato férrico.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 4. Había diferencias en la cantidad de la proteína de
anticuerpo producido por el hidrolizado de carne de pescado. Es
decir, cuando se añadió el producto de degradación de la carne de
pescado a una concentración final de 1% Brix (10 g/l), las
cantidades producidas, en orden decreciente eran las siguientes:
bonito > caballa fragata > bacalao > salmón > caballa
> sardina. Cuando se añadió el producto de degradación
enzimática de la carne de pescado a una concentración final de 1,5%
Brix (15 g/l), las cantidades producidas, en orden decreciente,
eran las siguientes: bonito > caballa fragata > bacalao >
caballa > salmón > sardina.
Los anteriores ensayos demuestran que el
producto de degradación enzimática de la carne de pescado muestra
diferentes efectos sobre la cantidad de producción de proteína
anticuerpo según el tipo de carne de pescado utilizada, pero es
eficaz para el crecimiento de células CHO dhfr (-) transformadas con
un gen que codifica proteína anticuerpo y un gen marcador selectivo
de dhfr, y es eficaz también para la producción de una proteína
anticuerpo.
Claims (14)
1. Un medio de cultivo adecuado para el cultivo
de una célula animal, caracterizado por contener un producto
de degradación enzimática de carne de pescado o un extracto de carne
de pescado.
2. El medio de cultivo según la reivindicación
1, que es un medio de cultivo para producir una proteína deseada por
cultivo de una célula animal, conteniendo el medio de cultivo el
extracto de carne de pescado.
3. El medio de cultivo según la reivindicación
1, que es un medio de cultivo para producir una proteína deseada
por cultivo de célula animal, conteniendo el medio de cultivo el
producto de degradación enzimática de la carne del pescado.
4. El medio de cultivo según la reivindicación
3, donde el producto de degradación enzimática de la carne del
pescado ha sido obtenido por tratamiento de la carne del pescado o
extracto de la carne del pescado con una proteasa.
5. El medio de cultivo según la reivindicación
4, donde la proteasa es una proteinasa y/o una peptidasa.
6. El medio de cultivo según la reivindicación
4, donde el producto de degradación enzimática de la carne de
pescado ha sido obtenido por tratamiento de la carne de pescado o
extracto de la carne de pescado con una proteinasa y luego con una
peptidasa.
7. El medio de cultivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que es un medio libre de componentes
derivados de un mamífero.
8. El medio de cultivo sobre cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que contiene aminoácidos, vitaminas,
factores de lípido, fuentes de energía, reguladores osmóticos,
fuentes de hierro y reguladores del pH.
9. El medio de cultivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde la célula animal es una célula animal
a la que se ha transducido un gen que codifica la proteína
deseada.
10. El medio de cultivo según la reivindicación
9, donde la proteína deseada es un anticuerpo o substancia
fisiológicamente activa.
11. El medio de cultivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde la célula animal es una célula
CHO.
12. El medio de cultivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde la carne del pescado deriva de uno o
más miembros seleccionados del grupo formado por bonito, caballa
fragata, bacalao, caballa, salmón y sardina.
13. Un método para producir una proteína deseada
que comprende el cultivo de una célula animal, donde el citado
cultivo se lleva a cabo con el medio de cultivo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12.
14. El método según la reivindicación 13, que
comprende además la obtención de la citada proteína desde el medio
de cultivo.
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