ES2286033T3 - Celulas procariotas que producen trehalosa como vacunas. - Google Patents
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Abstract
Método para aumentar la inmunogenicidad de una composición de vacuna que comprende células procariotas como el componente activo del determinante inmunogénico caracterizado porque el método comprende las etapas de: a. tratar las células procariotas en condiciones para inducir un aumento de la concentración de trehalosa dentro de las células procariotas mediante síntesis de trehalosa dentro de la célula; b. usar las células procariotas tratadas como el determinante inmunogénico en la producción de una composición de vacuna.
Description
Células procariotas que producen trehalosa como
vacunas.
Esta invención se refiere al campo de las
vacunas. Más específicamente, se refiere a métodos de producción de
vacunas de células procariotas que contienen trehalosa y a las
composiciones obtenidas de ese modo.
Las células procariotas, particularmente las
bacterias, se usan ampliamente y cada vez más en aplicaciones
médicas, agrícolas e industriales. Las aplicaciones agrícolas, o
medioambientales, incluyen biopesticidas y biorremediación. Las
aplicaciones médicas incluyen el uso de bacterias en vacunas así
como para la producción de productos farmacéuticos para otros
tratamientos.
Para que las células procariotas se usen
eficazmente, tanto en cuanto a resultados como costes deseados, las
células deben poder almacenarse durante periodos significativos de
tiempo mientras que conservan su viabilidad. El término viabilidad
se usa en el presente documento para indicar que las células
manifiestan las características de un organismo vivo en
funcionamiento, tales como metabolismo y división celular.
Los métodos para conservar células procariotas
vivas padecen varios inconvenientes graves, tales como requerir
mucha energía y almacenamiento en frío. Por tanto, se usa a menudo
la liofilización para la conservación y almacenamiento de células
procariotas. Sin embargo, tiene la característica no deseada de
reducir significativamente la viabilidad de las células, así como
requerir mucho tiempo y energía y por tanto ser caro.
El documento PCT WO98/24882 describe un
procedimiento de estabilización de células procariotas mediante la
inducción de la síntesis de trehalosa y el secado de las células
resultantes en una matriz vítrea de hidratos de carbono. Este
procedimiento proporciona células estabilizadas que pueden
almacenarse a temperaturas ambiente sin pérdida de viabilidad. La
trehalosa,
(\alpha-D-glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido),
es un disacárido no reductor, que se produce de manera natural que
se encontró inicialmente que estaba asociado con la prevención del
daño por desecación en determinadas plantas y animales que pueden
secarse sin dañarse y pueden revivir cuando se rehidratan. Se ha
demostrado que la trehalosa es útil en la prevención de la
desnaturalización de proteínas, virus y productos alimenticios
durante la desecación, véanse las patentes estadounidenses números
4.891.319; 5.149.653, 5.026.566; Colaco et al. (1992) Bio/
Tech. 10:1007-1011.
La síntesis de trehalosa en células procariotas
se induce mediante varios métodos incluyendo choque osmótico que
induce la producción endógena de trehalosa, Welsh et al.
(1991) J. Gen. Microbiol. 137:745-750.
La publicación PCT número WO 95/03395 describe
un procedimiento para mejorar la viabilidad de células bacterianas
secas mediante la inducción de la síntesis de trehalosa por
limitación de nutrientes, choque térmico u osmoadaptación. La
publicación PCT número WO 98/24882 describe un método para la
conservación de células procariotas mediante el secado de las
células en una matriz de hidratos de carbono tras la inducción de
la síntesis de trehalosa. Esta última invención proporciona
composiciones de células secas que pueden almacenarse a
temperaturas ambiente y permiten así varias aplicaciones
industriales.
De manera sorprendente, se ha encontrado ahora
que las células procariotas secas, estabilizadas producidas
mediante los métodos anteriores, son más inmunogénicas que las
células vivas frescas y por tanto tienen un valor particular como
el componente activo del determinante inmunogénico en
composiciones de vacuna. Además, también se ha encontrado que este
aumento de inmunogenicidad de las células procariotas estabilizadas
no depende del procedimiento de secado considerado esencial en los
procedimientos de estabilización anteriores, sino que resulta de la
inducción de la síntesis de trehalosa. Aunque más pronunciada con
células secas, se observa también este aumento de inmunogenicidad
en células inducidas para producir trehalosa pero que no se han
sometido a un procedimiento de secado.
Por tanto, la presente invención proporciona un
método para aumentar la inmunogenicidad de una composición de
vacuna que comprende células procariotas como el componente activo
del determinante inmunogénico, que comprende las etapas de:
- a.
- tratar células procariotas in vitro en condiciones tales que induzcan un aumento de la concentración de trehalosa dentro de las células procariotas mediante la síntesis de trehalosa dentro de la célula;
- b.
- usar las células inducidas que contienen trehalosa como el determinante inmunogénico en la producción de una composición de vacuna.
Preferiblemente, el tratamiento de las células
procariotas se lleva a cabo para lograr una concentración de
trehalosa dentro de las células de al menos 10 mM.
Preferiblemente, las células inducidas que
contienen la trehalosa se secan antes de su uso en la producción de
la composición de vacuna, notablemente en presencia de un hidrato
de carbono no reductor tal como trehalosa para proporcionar un
determinante inmunogénico estable en almacenamiento pero viable
para su almacenamiento antes de su uso en una composición de
vacuna.
La invención también proporciona un método para
inmunizar un animal que comprende administrar una cantidad
farmacéuticamente eficaz de una composición de vacuna de la
invención a un animal suficiente para provocar una respuesta inmune
en el animal.
Preferiblemente, la composición de vacuna
contiene un adyuvante para el determinante antigénico, se pone en
un medio vehículo acuoso y se administra por inyección.
Las células procariotas para su uso en la
presente invención son las que pueden sintetizar trehalosa. Esta
capacidad puede ser nativa o puede conferirse mediante técnicas
recombinantes. La capacidad de una célula procariota de sintetizar
trehalosa puede determinarse midiendo la concentración de trehalosa
tal como se describe más adelante.
El término procariota se usa en el presente
documento para indicar células que muestran características de
procariotas, que son normalmente organismos unicelulares, carecen
de orgánulos (tales como mitocondrias, cloroplastos y aparato de
Golgi), carecen de citoesqueleto y carecen de un núcleo
diferenciado. Loa ejemplos de células procariotas para su presente
uso incluyen bacterias, tales como eubacterias, cianobacterias y
proclorofitos; arqueobacterias; y otros microorganismos tales como
rickettsias, micoplasmas, espiroplasmas y clamidias. Las células
procariotas preferidas para su presente uso son bacterias.
En general, cualquier célula procariota o mezcla
de células, particularmente bacterias, que contienen genes de la
trehalosa sintasa, deben ser capaces de sintetizar trehalosa. Las
bacterias tienen dos genes implicados en la síntesis de trehalosa
(es decir, T-fosfato sintasa y T-P
fosfatasa), mientras que las levaduras tiene al menos tres genes y
pueden usarse combinaciones de estos genes para permitir la
síntesis de trehalosa. Los ejemplos de bacterias que contienen el
gen de la trehalosa sintasa incluyen, pero no se limitan a,
enterobacterias, tales como Salmonella y Escherichia
(por ejemplo, S. typhimurium y E. coli); bacterias
halófilas y halotolerantes, tales como Ectothriorhodospira
(por ejemplo, E. halochloris); micrococos, tales como
Micrococcus (por ejemplo, M. luteus); especies de
Rhizobium tales como R. japonicum y R.
leguminosarum bv phaseoli; cianobacterias; especies de
Mycobacteria tales como M. tuberculosis, M.
bovis, y M. smegmatis.
Las células procariotas pueden inducirse para
sintetizar trehalosa cultivando las células in vitro en
condiciones estresantes, por ejemplo, choque osmótico, limitación
de calor u oxígeno (choque), falta de carbono/nitrógeno, o
cualquier combinación de lo anterior. Las condiciones adecuadas
incluyen el choque térmico y otras condiciones descritas, por
ejemplo, en las publicaciones PCT números WO95/03395 y
WO98/24882.
Alternativamente, el uso de inhibidores, tales
como validomicina, de enzima(s) tal(es) como
trehalasa implicada en la degradación de la trehalosa puede dar
como resultado un aumento de la concentración de trehalosa dentro
de las células. Alternativamente, puede modificarse la estructura
genética del organismo procariota para eliminar o inhibir la parte
de la estructura genética que inhibe o restringe la síntesis de
trehalosa dentro de la célula, de modo que las células sintetizan
constitutivamente trehalosa a medida que se cultivan sin la
necesidad de aplicar estímulos externos. Tal modificación genética
puede lograrse usando cualquier técnica adecuada. Por conveniencia,
la invención se describirá en lo sucesivo en el presente documento
en términos del uso de estímulos externos para inducir la
producción de trehalosa dentro de la célula, en lugar del uso de
una célula procariota a la que se ha modificado su estructura
genética.
El término choque osmótico se usa en el presente
documento para indicar que la concentración de soluto en el medio
de crecimiento en el cual se cultivan las células está por encima
del nivel al cual una célula existe y/o crece en su ambiente
nativo. El soluto puede ser una mezcla de sales y la concentración
es normalmente de desde 0,2 hasta 0,5 moles por encima del nivel al
que la célula se cultiva normalmente.
Se cree que la inducción de la síntesis de
trehalosa en condiciones estresantes también puede inducir la
síntesis o acumulación de otras moléculas que pueden ser
beneficiosas para la conservación, tales como betaína y chaperoninas
o que potencian la acción de la vacuna de las células
inducidas.
Para las bacterias, particularmente
Escherichia, se induce preferiblemente la síntesis de
trehalosa haciendo crecer la(s) célula(s) en
condiciones de alta osmolaridad, es decir, concentraciones de sal
suficientes para estimular la producción de trehalosa. Para inducir
la síntesis de trehalosa mediante choque osmótico, la concentración
total de sal(es) en el medio debe ser al menos
aproximadamente 0,2 M, preferiblemente al menos aproximadamente 0,4
M, más preferiblemente al menos aproximadamente 0,5 M. La
concentración total de sal(es) no debe exceder de 0,6 M, dado
que por encima de este nivel la síntesis de trehalosa desciende en
E. coli. Las concentraciones de sal corresponden a
osmolaridades de al menos aproximadamente 350 mOsmoles a
aproximadamente 1,5 Osmoles, preferiblemente de al menos
aproximadamente 400 mOsmoles a 1 Osmol, lo más preferiblemente de
al menos aproximadamente 250 mOsmoles a 500 mOsmoles. Generalmente,
se requiere una osmolaridad mínima de aproximadamente 200 mOsmoles
ya que ésta proporcionará normalmente una concentración superior de
soluto que aquélla bajo la cual se cultivan las células
normalmente.
Puede proporcionarse el soluto necesario
mediante el uso de una única sal, por ejemplo, NaCl KCl 200 mM y/o
CaCl_{2}. También puede usarse (NH_{4})_{2}SO_{4},
sin embargo, sólo se produce aproximadamente la mitad do la
cantidad de trehalosa comparado con la producida en presencia de
KCl, NaCl y/o CaCl_{2}. También puede usarse una mezcla de sales.
Además, cuando se usa para aumentar la osmolaridad del medio, un
soluto no penetrante tal como sorbitol y/o glucosa puede contribuir
a la estimulación de la síntesis de trehalosa.
La concentración de sal (es decir, osmolaridad)
requerida para estimular y/o inducir la síntesis de trehalosa
dependerá del género, especie y/o cepa de la célula procariota
usada. Preferiblemente, la(s) célula(s) se hacen
crecer en un medio mínimo que contiene solutos y los medios mínimos
disponibles comercialmente pueden complementarse con las sales
deseadas y/u otros solutos. El uso de un medio mínimo no es
esencial y también pueden usarse medios definidos. El tiempo
requerido para iniciar y lograr el nivel deseado de concentración
de trehalosa dentro de las células variará dependiendo del nivel de
osmolaridad así como del género, especie y/o cepa de la célula
procariota usada. La síntesis de trehalosa comenzará generalmente
en el plazo de una hora desde la colocación de las células es las
condiciones diseñadas para estimular la producción de trehalosa.
Generalmente, en E. coli la síntesis de trehalosa alcanza un
máximo a aproximadamente 15-20 horas.
También puede estimularse la síntesis de
trehalosa usando métodos recombinantes que se conocen bien en la
técnica. Por ejemplo, pueden transfectarse células procariotas con
un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica
para el gen de la trehalosa sintasa apropiado. A su vez, el gen
está unido operativamente a un promotor adecuado, que puede ser
constitutivo o inducible. Se describen técnicas recombinantes
adecuadas en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
segunda edición (Sambrook et al., 1989).
Puede medirse la concentración de trehalosa
sintetizada dentro de las células procariotas usando cualquier
técnica de ensayo adecuada, por ejemplo mediante cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), acoplada con detección
electroquímica y ensayo de glucosa (ensayo de Trinder usando
trehalasa) para la determinación enzimática cuantitativa de
trehalosa.
Puede usarse cromatografía en capa fina como un
método cualitativo para la separación de diferentes hidratos de
carbono.
La detección del índice de refracción
proporciona otro medio para detectar azúcares cualitativamente.
En la medición de trehalosa mediante HPLC, se
rompen las células y se solubiliza preferentemente la trehalosa en
etanol al 70%, seguido por la eliminación de los triglicéridos
mediante extracción con cloroformo. Se determina la concentración
de trehalosa multiplicando la concentración de trehalosa
(determinada mediante una curva patrón) por la fracción del volumen
final de sobrenadante dividido por el volumen del sedimento. Se
proporciona una descripción más detallada de este ensayo en el
ejemplo 1.
Preferiblemente, se lleva a cabo la síntesis
para proporcionar una concentración de trehalosa dentro de las
células de al menos aproximadamente 10 mM, por ejemplo de al menos
aproximadamente 30 mM, preferiblemente de al menos aproximadamente
50 mM, notablemente de al menos aproximadamente 100 mM.
Por tanto, en un aspecto preferido la invención
incluye cultivar las células procariotas en condiciones que
estimulan la producción intracelular de trehalosa, en las que la
concentración intracelular de trehalosa alcanza al menos
aproximadamente 10 mM, preferiblemente al menos aproximadamente 30
mM, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 mM,
notablemente al menos aproximadamente 100 mM. Se prefiere
particularmente que la concentración sea al menos aproximadamente
150 mM.
El tiempo requerido para estimular la síntesis
de trehalosa depende, entre otros, de la naturaleza de las células
procariotas (incluyendo género, especie y/o cepa) y las condiciones
en las que se produce la inducción de trehalosa (es decir, si es
mediante choque osmótico, privación de oxígeno, etc.). Para la
inducción de trehalosa mediante choque osmótico, el tiempo
requerido para alcanzar la concentración máxima de trehalosa
depende a su vez del grado de osmolaridad así como de las sales
particulares usadas. Las condiciones óptimas para la síntesis de
trehalosa pueden determinarse fácilmente mediante pruebas de ensayo
y error simples.
Las células procariotas cultivadas que contienen
la trehalosa intracelular pueden congelarse entonces para
almacenarse antes de su uso como una vacuna. Alternativamente,
puede efectuarse el almacenamiento de la vacuna cultivando las
células procariotas en condiciones que aumentan la concentración de
trehalosa hasta un nivel eficaz para aumentar la estabilidad del
almacenamiento, mezclando las células con una disolución de secado
que contiene un agente estabilizante, y secando las células en
condiciones tales que se produce un cristal que tiene menos de
aproximadamente el 5% de humedad residual. Si se requiere una
vacuna inactivada en lugar de una vacuna viva, las células pueden
inactivarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo
fijación química y radiación antes de procesar para el
almacenamiento. Aunque pueden usarse las células procariotas como
el único componente activo del determinante antigénico en la
vacuna, puede añadirse un adyuvante en una cantidad suficiente para
potenciar la respuesta inmunitaria frente a la vacuna procariota.
Puede añadirse el adyuvante a las células procariotas antes del
secado, por ejemplo, puede secarse simultáneamente la subunidad B
de la toxina del cólera con V. cholera. Alternativamente,
puede obtenerse y secarse el adyuvante por separado, y
reconstituirse junto con las células procariotas.
\newpage
Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se
limitan a, hidróxido de aluminio, alumbre, QS-21
(patente estadounidense número 5.057.540), DHEA (patentes
estadounidenses números 5.407.684 y 5.077.284) y sus derivados
(incluyendo sales) y precursores (por ejemplo,
DHEA-S), beta-2 microglobulina
(WO91/16924), dipéptidos de muramilo, tripéptidos de muramilo
(patente estadounidense número 5.171.568),
monofosforil-lípido A (patente estadounidense
número 4.436.728; WO 92/16231) y sus derivados (por ejemplo,
Detox^{TM}), y BCG (patente estadounidense número 4.726.947).
Otros adyuvantes adecuados incluyen sales de aluminio, mezclas de
escualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados
de saponina, preparaciones de la pared de Mycobacterium,
derivados de ácido micólico, tensioactivos de copolímeros en bloque
no iónicos, Quil A, subunidad B de la toxina del cólera,
polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimuladores (ISCOM)
tales como los descritos por Takahashi et al. (1990) Nature
344:873-875. La elección de un adyuvante dependerá
en parte de la estabilidad de la vacuna en presencia del adyuvante,
la vía de administración, y la aceptabilidad reguladora del
adyuvante, particularmente cuando está destinado a uso en seres
humanos. Por ejemplo, el alumbre está aprobado por la United States
Food and Drug Administration (FDA) (Dirección de fármacos y
alimentos de los Estados Unidos) para su uso como un adyuvante en
seres humanos.
La invención también proporciona un método para
tratar un animal con una vacuna de la invención administrando una
cantidad farmacéuticamente aceptable de la vacuna de la invención,
opcionalmente en combinación con un adyuvante, suficiente para
provocar una respuesta inmunitaria en el animal. El animal es
normalmente un ser humano. Sin embargo, la invención también puede
aplicarse al tratamiento de otros mamíferos tales como caballos,
ganado, cabras, ovejas o cerdos, y al tratamiento de pájaros,
particularmente aves de corral tales como pollos o pavos.
Las composiciones de vacuna de la presente
invención pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado,
tal como por vía oral, mediante inhalación, por vía transdérmica o
mediante inyección y en cualquier medio vehículo adecuado. Sin
embargo, se prefiere administrar la vacuna como una composición
acuosa mediante inyección usando cualquier técnica con aguja o sin
aguja adecuada.
Las vacunas de la invención pueden contener
cualquier concentración adecuada de las células procariotas
inducidas. Los inventores prefieren que las células se administren
a dosis en el intervalo de 10-600 \mug,
preferiblemente 10-100 \mug, lo más
preferiblemente 25 \mug, por kg de peso corporal del animal que se
está tratando. Se apreciará que la vacuna de la invención puede
aplicarse como un tratamiento inicial seguido por uno o más
tratamientos posteriores a la misma o diferente tasa de
dosificación en un intervalo de desde 1 hasta 26 semanas entre cada
tratamiento para proporcionar una inmunización prolongada frente al
patógeno.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar pero no para limitar la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó E. coli (cepa NCIMB 9484) en
medio Evans (pH 7,0) que contenía cloruro de amonio 5 mM. Tras la
incubación durante toda la noche a 37°C en el medio Evans inicial,
se usó un cultivo de 4 ml de E. coli hecho crecer en medio
Evans bajo limitación de nitrógeno para inocular un cultivo de 200
ml de medio Evans modificado para inducir choque osmótico
aumentando la concentración de sal (KC1) hasta 0,5 M.
Se midió la concentración de trehalosa mediante
análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y se
observaron aumentos significativos en las concentraciones de
trehalosa a las 15-17 horas tras el inicio del
choque osmótico, alcanzándose valores máximos a menos de 20
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo crecer Salmonella typhimurium
(1344) durante toda la noche a 37°C en medio M9 (mínimo) con y sin
NaCl 0,5 M. Se recogieron las células mediante centrifugación y se
analizaron para determinar la concentración de trehalosa mediante
análisis por HPLC tal como se describió en el ejemplo 1. El
crecimiento en medio con alta salinidad mostró una inducción de 4 a
5 veces de la síntesis de trehalosa comparada con el medio de baja
salinidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer E. coli y
Salmonella typhimurium durante toda la noche a 37°C en medio
M9 (mínimo) con y sin NaCl 0,5 M y se indujo la síntesis de
trehalosa tal como se describió en los ejemplos 1 y 2. Se
recogieron las bacterias inducidas mediante centrifugación a 10.000
rpm durante 10 minutos y se resuspendieron los sedimentos celulares
en disolución de secado que contenía trehalosa al 45%, cmc al 0,1%
(carboximetilcelulosa de sodio, Blanose 7HF, Aqualon) hasta una
densidad celular típica de 0,5-1,2 x l0^{9}
UFC/ml. Se dispensaron alícuotas de 300 \mul y 500 \mul en
viales farmacéuticos de 3 ml y se secaron a vacío sin congelación,
durante toda la noche a temperatura ambiente y una presión de vacío
de 30 mTorr. Alternativamente, pueden liofilizarse las alícuotas
usando el siguiente protocolo: elevación a 2,5°C/min hasta una
temperatura propia inicial de -40°C; se realizó el secado principal
a una presión de vacío de 30 mT a -40°C y se mantuvo durante 40
horas; para el secado secundario, elevación a 0,05°C/min desde -40
hasta 30°C y se mantiene durante 12 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujeron células de E. coli y
Salmonella typhimurium para sintetizar trehalosa como en los
ejemplos 1 y 2 y se usaron para inmunizar ratones y conejos. La
valoración de las bacterias mostró que se requería un título de 100
a 1000 veces inferior de las bacterias inducidas para la síntesis
de trehalosa para producir una respuesta de anticuerpos
equivalente en los animales comparado con el uso de bacterias no
inducidas. Las preparaciones secas eran generalmente
2-50 veces más eficaces basándose en el número de
células para provocar una inmunidad protectora en los animales
inmunizados que las preparaciones no secadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer E. coli y
Salmonella typhimurium (cepas como en los ejemplos 1 y 2)
durante toda la noche a 37°C en medio LB. Se usaron alícuotas de 4
ml de los cultivos estacionarios para inocular 200 ml de medio LB
en un matraz cónico de 2 litros y se hicieron crecer los cultivos
durante 3 horas a 30°C. Se elevaron los cultivos en fase
logarítmica hasta 40°C y se hicieron crecer durante unas 3 horas
adicionales antes de que se recogiesen las bacterias mediante
centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos. Se usó un protocolo
similar para el crecimiento e inducción de Mycobacterium
Bovis y Vaccae (NCTC 11659) que se hicieron crecer
durante 2 días en medio de Sauton antes de la dilución para obtener
cultivos en fase logarítmica para inducción por calor. Se
resuspendieron los sedimentos celulares en disolución de lisis que
contenía Tween al 0,5% y se midió la concentración de trehalosa
mediante análisis por cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC). Normalmente, se observaron aumentos de 3-5
veces en las concentraciones de trehalosa comparado con células
hechas crecer a 30°C solas.
Las células bacterianas inducidas para
sintetizar trehalosa tal como se describió anteriormente se
inactivaron mediante ciclos de
congelación-descongelación repetidos y se usaron
para inmunizar conejos. Se sometieron a ensayo los títulos de
anticuerpo en los animales inmunizados mediante diluciones seriadas
de 10 veces usando un ensayo de inmunotransferencia puntual
(dot-blot) sobre los lisados celulares totales
preparados tal como se describió para el análisis de trehalosa
anterior. Los animales vacunados con bacterias inducidas mostraron
un título de anticuerpo de 10 a 100 veces superior que los
inmunizados con bacterias no inducidas.
Claims (9)
1. Método para aumentar la inmunogenicidad de
una composición de vacuna que comprende células procariotas como
el componente activo del determinante inmunogénico
caracterizado porque el método comprende las etapas de:
- a.
- tratar las células procariotas en condiciones para inducir un aumento de la concentración de trehalosa dentro de las células procariotas mediante síntesis de trehalosa dentro de la célula;
- b.
- usar las células procariotas tratadas como el determinante inmunogénico en la producción de una composición de vacuna.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el tratamiento de las células
procariotas se lleva a cabo para lograr una concentración de
trehalosa dentro de las células procariotas de al menos 10 mM.
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado porque la condición que
provoca la síntesis de trehalosa dentro de la célula es calor,
choque osmótico, supresión de la degradación de trehalosa, o
síntesis de trehalosa constitutiva modificada genéticamente dentro
de las células.
4. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células procariotas inducidas que contienen trehalosa se secan
antes de su uso en la producción de la composición de vacuna.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células procariotas son bacterias.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células procariotas se tratan cultivándolas en un medio que
contiene uno o más solutos y que tiene una osmolaridad de al menos
350 mOsmoles.
7. Método según la reivindicación 6
caracterizado porque el soluto se selecciona de una sal de
sodio, potasio, calcio y/o amonio.
8. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el tratamiento de las células
procariotas se lleva a cabo para lograr una concentración de
trehalosa dentro de las células procariotas de al menos 100 mM.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células procariotas que contienen la trehalosa inducida se
inactivan antes de usarse en la composición de vacuna.
Applications Claiming Priority (2)
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