ES2286060T3 - Variantes de la secuencia de nucleotidos de tcf-1. - Google Patents

Abstract

Un método para la caracterización de un individuo como poseedor de un factor que contribuye a un riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th1 o un riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th2, y dicho método comprende: (a) la determinación del genotipo de dicho individuo respecto al nucleótido presente en la posición 883 del gen TCF-1, y dicha secuencia génica se proporciona como Id. de Sec. Nº:1; (b) la clasificación de dicho paciente en base al resultado obtenido en el paso (a), en el que la presencia del alelo A indica un factor que contribuye al riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th1, y la presencia del alelo C indica un factor que contribuye al riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th2.

Description

Variantes de la secuencia de nucleótidos de TCF-1.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención está relacionada con las áreas de la inmunología y la biología molecular. Más específicamente, está relacionada con los métodos y reactivos para la detección de la variabilidad de la secuencia de nucleótidos en el locus de TCF-1, que puede estar asociado con el riesgo de desarrollar una enfermedad inflamatoria mediada por Th1 o Th2.

Descripción de la materia relacionada

Los linfocitos T CD4+ se han dividido en dos subgrupos funcionalmente distintos en base al patrón de citoquinas que secretan. Un subgrupo, denominado T ayudante tipo 1 (Th1), secretan interleuquina 2 (IL-2), IL-12, factor de necrosis tumoral (TNF), linfotoxina (LT) e interferón gamma (IFN-\gamma) tras su activación, y son principalmente responsables de la inmunidad mediada por células como la hipersensibilidad de tipo retardado. Un segundo subgrupo, denominado T ayudante tipo 2 (Th2), secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 e IL-13 tras su activación, y son principalmente responsables de los mecanismos de defensa extracelular. La estimulación de los linfocitos de tipo Th2 resulta en la secreción de linfoquinas que inducen en las células B la producción de anticuerpos y estimulan un aumento de células eosinofílicas y la producción de IgE, que resulta en un aumento de mastocitos, la liberación de histaminas y en una reacción inflamatoria. El papel de las células Th1 y Th2 se revisa en Peltz, 1991, Immunological Reviews 123: 23-35.

La respuesta inmunológica frente a un antígeno está mediada a través de la diferenciación selectiva de las células precursoras CD4+ T ayudantes (Th0) hacia células efectoras Th1 o Th2, con sus diferentes patrones de producción de linfoquinas. La secreción de los subgrupos de linfoquinas proporciona además una función reguladora en la diferenciación de Th0 hacia células efectoras Th1 o Th2. Por ejemplo, una linfoquina producida por las células Th2, IL-4, promueve la diferenciación hacia células Th2 e inhibe la diferenciación hacia células Th1. Por el contrario, las linfoquinas producidas por las células Th1, IL-12 e IFN-\gamma, promueven la diferenciación hacia células Th1, inhiben la diferenciación hacia células Th2 y suprimen la sintesissíntesis de IgE a través de un efecto directo sobre las células B. Los efectos reguladores recíprocos de las linfoquinas específicas de subgrupo están involucrados en la polarización de la respuesta Th1 o Th2.

Las células T humanas, tras su activación en respuesta a antígenos involucrados en la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias crónicas o alérgicas, muestran un patrón selectivo de producción de linfoquinas característico de las células de tipo Th1 o Th2. Se ha demostrado que ciertas enfermedades autoinmunes, como la diabetes tipo 1 o la esclerosis múltiple (EM), están asociadas con una respuesta predominante Th1. El patrón de expresión de linfoquinas de tipo Th1 se detecta en las células T específicas de alérgeno aisladas de pacientes con artritis de Lyme crónica y en pacientes con lepra tuberculoide. Por el contrario, en las células T específicas de alérgeno aisladas de pacientes atópicos se observa una respuesta de tipo Th2 de expresión de linfoquinas. La mayoría de las particularidades características de la atopia y el asma, en especial la síntesis de IgE, resultan de los efectos combinados de las citoquinas secretadas por las células Th2.

Es probable que un desequilibrio selectivo o activación inadecuada de los subgrupos de células T Th1 o Th2 sea central en la patogénesis de ciertas enfermedades inflamatorias crónicas o alérgicas. El motivo por el cual la respuesta inmune de ciertos individuos frente a un patógeno o alérgeno es una respuesta protectora, mientras que la respuesta inmune en otros da lugar a una enfermedad, permanece por esclarecer. Sin embargo, la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad inflamatoria o alérgica en respuesta a la exposición a un patógeno o alérgeno puede determinarse por el tipo de células T CD4+ que dominan la respuesta. Una enfermedad mediada por la inmunidad puede desarrollarse si la respuesta celular queda fijada de forma patológica en un modo Th1 o Th2. La capacidad de eliminar o resolver una infección viral también puede reflejar una respuesta Th1, en lugar de Th2.

Diferencias determinadas a nivel genético en la diferenciación de las células T pueden determinar la naturaleza de la respuesta de las células T frente a un antígeno, y por lo tanto si existirán consecuencias patogénicas o no patogénicas. Aunque el control de la diferenciación de las células T aun está por esclarecer, se han identificado muchos componentes del sistema en cascada de genes que controlan la diferenciación de las células T. El factor de transcripción específico de las células T TCF-1 (ahora denominado oficialmente TCF-7) es uno de los componentes del sistema de genes que controlan la diferenciación de las células T. El gen TCF-1 se ha clonado y se han descrito su secuencia y estructura (véase van der Wetering et al., 1992, J. Biol. Chem. 367(12):8530-8536; van der Wetering et al., 1996, Molecular and Cellular Biology 16(3):745-7852.

Las secuencias de ácido nucleico enviadas por Adams (Nº de acceso de GenBank AA311787) y Marra (nº de acceso de GenBank AI131784) son homólogas en la región de la posición 883 del gen TCF-1 (Id. de Sec. Nº:1) descrito aquí.

Resumen de la invención

La presente invención está relacionada con un polimorfismo de la secuencia de nucleótidos recientemente descubierto en el exón 2 del gen TCF-1 y la asociación de las variantes de la secuencia con enfermedades inflamatorias mediadas por Th1 y Th2. La identificación de la(s) variante(s) alélica(s) de la secuencia presente proporciona información referente al sistema inmune, que puede ayudar en la caracterización de los individuos según su riesgo de padecer una enfermedad en la que uno de los factores de predisposición sea el sistema inmune, como una enfermedad inflamatoria.

Se han identificado dos variantes alélicas de la secuencia, que se diferencian en el nucleótido presente en la posición nucleotídica 883 del gen TCF-1. Un aspecto de la invención está relacionado con la genotipificación de la variante de secuencia presente en la posición nucleotídica 883.

Las diferencias alélicas de TCF-1 parecen estar asociadas con la probabilidad de una enfermedad inflamatoria mediada por Th1 o Th2. Como TCF-1 es un componente del sistema de genes que controlan la diferenciación de células T, y las diferencias determinadas a nivel genético en la diferenciación de células T pueden determinar la naturaleza de la respuesta de las células T frente a un antígeno, y por lo tanto si existirán consecuencias patogénicas o no patogénicas, es esperable que las diferencias alélicas en el gen TCF-1 puedan afectar la diferenciación de células T. La asociación de las diferencias alélicas en TCF-1 con la probabilidad de una enfermedad inflamatoria mediada por Th1 o Th2 sugiere que las diferencias alélicas en TCF-1 pueden ser un factor en la determinación de la tendencia de una respuesta de tipo Th1 o Th2. Parece que uno de los alelos puede asociarse con una tendencia aumentada hacia una respuesta de tipo Th1 frente a un antígeno, mientras el otro alelo puede asociarse con una tendencia aumentada hacia una respuesta de tipo Th2. Por lo tanto, los métodos de genotipificación de la presente invención proporcionan información referente a un factor que puede ser relevante para la clasificación de un individuo en función de su tendencia relativa a responder frente a un antígeno con una respuesta Th1 o una respuesta Th2. Como se ha hecho notar con anterioridad, la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad inflamatoria o alérgica en respuesta a la exposición a un patógeno o alérgeno puede determinarse por la naturaleza de la respuesta de las células T. Proporcionando información sobre la tendencia de un individuo a responder frente a un antígeno con una respuesta Th1 o una respuesta Th2, la presente invención proporciona información referente del sistema inmune de un individuo que puede ser relevante para clasificar el riesgo relativo de un individual de padecer una enfermedad mediada por Th1 o Th2. Por lo tanto, los métodos de genotipificación de la presente invención proporcionan información referente a un factor que puede ser relevante para la clasificación de un individuo con un riesgo elevado de padecer una enfermedad mediada por Th1 o Th2.

En realizaciones concretas, los métodos de genotipificación de la presente invención pueden proporcionar información útil para la valoración del riesgo de un individuo de padecer una enfermedad particular mediada por Th1, como la esclerosis múltiple y la diabetes tipo 1, o enfermedades mediadas por Th2, como el asma y la atopia. Los individuos con al menos un alelo "A" poseen un factor que contribuye al riesgo de padecer una enfermedad mediada por Th1. Los individuos con al menos un alelo "C" poseen un factor que contribuye al riesgo de padecer una enfermedad mediada por Th2.

Como TCF-1 es un componente del complejo sistema de genes que controla la diferenciación de células T, y un gran número de otros genes están involucrados en la respuesta inmune, el genotipo de TCF-1 en la respuesta inmune es uno de una serie de componentes que determinan la naturaleza de la respuesta de las células T y la probabilidad de una enfermedad mediada por Th1 o Th2. En consecuencia, se espera que el efecto del locus de TCF-1 sea pequeño. Otros factores, como el genotipo del HLA de un individuo, pueden ejercer efectos dominantes que, en algunos casos, pueden enmascarar el efecto del genotipo de TCF-1. Por ejemplo, se conoce que genotipos concretos de HLA tienen un importante efecto sobre la probabilidad de padecer diabetes tipo 1 (véase Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59:1134-1148). El genotipo de TCF-1 probablemente será más informativo como indicador de predisposición a padecer diabetes tipo 1 entre los individuos que poseen genotipos de HLA que no confieran un riesgo aumentado o reducido. Se espera que estos efectos dominantes podrán observarse en otras enfermedades mediadas por el sistema inmune, y se espera que una estratificación similar de los individuos sea útil en estos casos. Además, a causa de que las frecuencias alélicas en otros loci relevantes en las enfermedades relacionadas con el sistema inmune difieren entre poblaciones y, por lo tanto, las poblaciones muestran diferentes riesgos de padecer enfermedades relacionadas con el sistema inmune, se espera que el efecto del genotipo de TCF-1 pueda no ser aparente en todas las poblaciones. Aunque la contribución del genotipo de TCF-1 pueda ser relativamente poco importante por sí misma, la genotipificación del locus de TCF-1 proporcionará información que será, sin embargo, útil para la caracterización de la predisposición de un individuo de padecer enfermedades mediadas por Th1 o Th2. La información del genotipo de TCF-1 puede ser particularmente útil si se combina con información del genotipo de otros loci.

La presente invención proporciona los métodos, reactivos y equipos preferidos para la genotipificación de las variantes de secuencia presentes en la posición nucleotídica 883. El genotipo puede determinarse utilizando cualquier método capaz de identificar el nucleótido presente en un punto de polimorfismo de un único nucleótido. El método concreto utilizado no es un aspecto crítico de la invención. Una serie de métodos adecuados se describen a continuación.

En una realización preferida de la invención, la genotipificación se realiza utilizando sondas oligonucleotídicas específicas de una u otra secuencia variante. Preferiblemente, se amplifica una región del gen TCF-1 que comprende la región de hibridación de la sonda previamente a, o de forma concurrente, con la hibridación de la sonda. Un oligonucleótido específico para una de las secuencias variante es exactamente o sustancialmente complementario de cada cadena del gen TCF-1, en una región del gen que comprende el lugar polimórfico, y es exactamente complementario del lugar polimórfico de una de las secuencias variantes. Los ensayos basados en sondas son bien conocidos en la materia.

Alternativamente, la genotipificación se realiza utilizando una reacción de amplificación o extensión específica de alelo, en la que se utiliza un cebador específico de alelo que permite la extensión del cebador sólo en caso de que la secuencia variante diana esté presente. Normalmente, un cebador específico de alelo hibrida con el gen TCF-1 de forma que el nucleótido terminal en 3' se alinea con la posición polimórfica. Las reacciones de amplificación específicas de alelo y de extensión específica de alelo son bien conocidos en la materia.

Otro aspecto de la invención está relacionado con los oligonucleótidos como se definen en la reivindicación 6 útiles como cebadores de amplificación, sondas de detección o secuencias control positivo que se añaden a las reacciones para proporcionar una secuencia diana conocida. Para su utilización como secuencia control positivo, preferiblemente el oligonucleótido está contenido en un vector de DNA como un plásmido. Para su utilización en una amplificación o detección específica de secuencia, el oligonucleótido preferiblemente es de alrededor de 10 a alrededor de 35 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de alrededor de 15 a alrededor de 35 nucleótidos de longitud.

Los equipos tienen variedad de formas, pero en todos los casos contienen uno o más reactivos para realizar los métodos de genotipificación de la invención, como un oligonucleótido que es específico de una de las secuencias variantes. Los equipos también pueden incluir uno o más reactivos de amplificación, por ejemplo cebadores, polimerasa, tampones y nucleósidos trifosfato.

Descripción detallada de la invención

Para mejorar la comprensión general de la invención, a continuación se definen varios términos.

El término "gen TCF-1" se refiere a la secuencia de ácido nucleico genómico que codifica la proteína factor de transcripción específica de células T, específicamente, la secuencia génica disponible en GenBank con el número de depósito X63901 y se muestra en la Figura 1, y las variantes alélicas de las mismas. La secuencia de nucleótidos del gen, como se utiliza aquí, incluye tanto las regiones codificantes, denominadas exones, como las regiones intermedias, no codificantes, denominadas intrones.

El término "alelo" se refiere a una secuencia de nucleótidos variante del gen.

Como se utiliza aquí, un "alelo C" se refiere a variantes de secuencia que contienen una citosina en la posición polimórfica que es la posición nucleotídica 883 de la cadena del gen TCF-1 que se muestra en la Figura 1. Como se utiliza aquí, un "alelo A" se refiere a variantes de secuencia que contienen una adenosina en la posición nucleotídica 883 de la cadena del gen TCF-1 que se muestra en la Figura 1. Queda claro que en una forma de doble cadena, la cadena complementaria de cada alelo contendrá la base complementaria en la posición polimórfica.

El término "genotipo" se refiere a una descripción de los alelos de un gen contenido en un individuo o una muestra. Como se utiliza aquí, no se distingue entre el genotipo de un individuo y el genotipo de una muestra original del individuo. Aunque, normalmente, un genotipo se determina a partir de muestras de células diploides, puede determinarse un genotipo a partir de una muestra de células haploides, como las células espermáticas.

Los términos "polimórfico" y "polimorfismo", como se utiliza aquí, se refieren a la condición en la que dos o más variantes de una secuencia genómica específica se pueden encontrarse en una población. La región polimórfico o lugar polimórfico se refiere a una región del ácido nucleico en la que aparece la diferencia de nucleótido que distingue las variantes.

Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas y fragmentos de oligómero a detectar, y pueden ser generales para los polidesoxiribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), para los poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glicósido de bases de purina o pirimidina, o bases de purina o pirimidina modificadas. No se pretende hacer una distinción en longitud entre los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido", y estos términos se utilizan de forma intercambiable. Estos términos se refieren sólo a la estructura primaria de la molécula. Así, estos términos incluyen el DNA de cadena doble y sencilla, así como el RNA de cadena doble y sencilla y los híbridos DNA/RNA.

Los oligonucleótidos pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, lo que incluye, por ejemplo, el clonaje y la restricción de las secuencias adecuadas y la síntesis química directa mediante un método como el método fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; el método fosfodiéster de Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; y el método en soporte sólido de la Patente de U.S.A. Nº. 4.458.066. En Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187 se proporciona una revisión de los métodos de síntesis. Los oligonucleótidos normalmente se sintetizan utilizando reactivos e instrumentos disponible comercialmente de, por ejemplo, PE Biosystems (Foster City, CA) y Pharmacia (Piscataway, NJ). Los métodos para incorporar un oligonucleótido en un vector de DNA, como para su utilización como secuencia diana control positivo, son bien conocidos en la materia y se describen en las referencias citadas aquí.

El término "hibridación" se refiere a la formación de una estructura de dúplex entre dos ácidos nucleicos de cadena sencilla debido al emparejamiento de bases complementarias. La hibridación puede ocurrir entre cadenas de ácido nucleico exactamente complementarias o entre cadenas de ácido nucleico que contienen pequeñas regiones de desemparejamiento. Como se utiliza aquí, el término "sustancialmente complementario" se refiere a las secuencias que son complementarias excepto por las pequeñas regiones de desemparejamiento, en las que el número total de nucleótidos desemparejados no es superior a 3 para secuencias de entre alrededor de 15 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud. Las condiciones bajo las que sólo las cadenas de ácido nucleico exactamente complementarias hibridarán se denominan condiciones de hibridación "astringentes" o "específicas de secuencia". Los dúplex estables de ácidos nucleicos sustancialmente complementarios pueden conseguirse bajo condiciones de hibridación menos astringentes. Los expertos en la materia de la tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad de los dúplex empíricamente considerando un número de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud y la concentración de pares de bases de los oligonucleótidos, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases desemparejados. Existen programas informáticos comercialmente disponibles para el cálculo de la estabilidad de los dúplex de National Biosciences, Inc. (Plymouth, MN); manual de referencia OLIGO versión 5.

Las condiciones de hibridación astringentes, específicas de secuencia, bajo las que un oligonucleótido hibrida sólo con la secuencia diana exactamente complementaria, son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones astringentes se seleccionan de forma que son alrededor de 5ºC inferiores a la temperatura de fusión (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de los pares de bases se han disociado. La relajación de la astringencia de las condiciones de hibridación permitirá que se toleren los desemparejamientos de secuencia; el grado de desemparejamientos tolerados puede controlarse mediante el ajuste adecuado de las condiciones de hibridación.

El término "sonda" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridar de forma selectiva con un ácido nucleico diana bajo condiciones adecuadas. La sonda contendrá una "región de hibridación" exactamente o sustancialmente complementaria a la secuencia diana, y será exactamente complementaria a la secuencia diana en el lugar polimórfico. Un ensayo de hibridación realizado utilizando la sonda bajo condiciones de hibridación suficientemente astringentes permite la detección selectiva de una secuencia diana específica. Para su utilización en un ensayo de hibridación para la discriminación de diferencias de un único nucleótido en la secuencia, la región de hibridación de la sonda es preferiblemente de entre alrededor de 10 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de entre alrededor de 15 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud. La utilización de bases modificadas o bases análogas que afectan la estabilidad de la hibridación, que son bien conocidas en la materia, pueden permitir la utilización de sondas más cortas o más largas con una estabilidad comparable. Un experto reconocerá que, en general, el complementario exacto de una sonda dada es igualmente útil como sonda. Un oligonucleótido sonda puede consistir por completo en la región de hibridación o puede contener características adicionales que permitan la detección o inmovilización de la sonda, pero que no alteran de forma significativa las características de hibridación de la región de hibridación. Por ejemplo, la región de hibridación de la sonda puede estar unida a una "cola" de poli-T, que se utiliza para inmovilizar la sonda a un soporte sólido para su utilización en el ensayo de dot-blot reverso.

El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis de DNA bajo condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y un agente para la polimerización (es decir, polimerasa de DNA o transcriptasa reversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Un cebador es preferiblemente un oligodesoxiribonucleótido de cadena sencilla. El cebador contendrá una "región de hibridación" exactamente o sustancialmente complementaria a la secuencia diana, preferiblemente de alrededor de 15 a alrededor de 35 nucleótidos de longitud. Un cebador oligonucleótido puede consistir completamente en la región de hibridación o puede contener características adicionales que permiten la detección, inmovilización o manipulación del producto amplificado, pero que no alteran las propiedades básicas del cebador, las de actuar como punto de iniciación de la síntesis de DNA. Por ejemplo, para facilitar el clonaje del producto amplificado, puede unirse una secuencia corta de ácido nucleico que contenga una diana de corte de un enzima de restricción al extremo 5' del cebador.

Un cebador "específico de alelo", como se utiliza aquí, es un cebador que hibrida con la secuencia diana de forma que el extremo 3' del cebador se alinea con el lugar polimórfico que define los alelos (es decir, la posición 883 para los alelos TCF-1 A y C) y es exactamente complementario a uno de los alelos en la posición polimórfica. El cebador es "específico" del alelo del que es exactamente complementario en el extremo 3'. En general, la extensión del cebador, que ocurre en el extremo 3' del cebador, está inhibida por un desemparejamiento en el extremo 3' de un cebador. Un cebador específico de alelo, cuando hibrida con el alelo exactamente complementario, puede extenderse. Sin embargo, el mismo cebador, cuando hibrida con el otro alelo, no puede extenderse a causa del desemparejamiento en el extremo 3' del cebador en el dúplex de hibridación. Por lo tanto, la utilización de un cebador específico de alelo permite la discriminación de los alelos en base a la formación de producto de amplificación.

El término "región diana" se refiere a una región de un ácido nucleico que quiere analizarse y normalmente incluye una región polimórfica.

Las técnicas convencionales de biología molecular y química de ácidos nucleicos, que son conocidas por un experto en la materia, están explicadas en su totalidad en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Ed., 1984); Nucleic acid hibridization (B. D. Hames y S. J. Higgins, Eds., 1984); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), y la serie Current Protocols in Human Genetics (Dracopoli et al., Eds., 1984 con actualizaciones trimestales, John Wiley & Sons, Inc.).

Secuencia de nucleótidos del gen TCF-1

La secuencia de nucleótidos de un alelo C completo del gen TCF-1 está disponible en GenBank con el número de entrada X63901 y se proporciona como Id. de Sec. Nº:1, que se muestra en orientación de 5' a 3' en la Tabla 1, a continuación. El polimorfismo de un único nucleótido recién descubierto aparece en la posición 883, que se muestra resaltada. La variante de secuencia que define el alelo A consiste en una sustitución en esta posición de una "A" en lugar de la "C" presente en Id. de Sec. Nº:1. Una sustitución de C a A en esta posición corresponde a un cambio en el aminoácido codificado de prolina a treonina.

Aunque sólo se muestra una cadena del ácido nucleico en la Tabla 1, un experto en la materia reconocerá que el Id. de Sec. Nº:1 identifica una región de ácido nucleico genómico de doble cadena, y que las secuencias de ambas cadenas están completamente especificadas por la información de secuencia proporcionada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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Métodos de genotipificación

En los métodos de la presente invención, se identifican los alelos presentes en una muestra mediante la identificación del nucleótido presente en el lugar polimórfico, la posición nucleotídica 883 del Id. de Sec. Nº:1. Cualquier tipo de tejido que contenga el ácido nucleico de TCF-1 puede utilizarse para la determinación del genotipo TCF-1 de un individuo. Se conocen variedad de métodos en la materia para la identificación del nucleótido presente en un polimorfismo de un único nucleótido. El método particular utilizado para identificar el genotipo no es un aspecto crítico de la invención. Aunque otras consideraciones como su rendimiento, coste y comodidad hacen unos métodos concretos más adecuados que otros, queda claro que cualquier método que pueda identificar el nucleótido presente proporcionará la información necesaria para identificar el genotipo. Los métodos de genotipificación preferibles involucran la secuenciación de DNA, la amplificación específica de alelo o la detección del ácido nucleico amplificado basada en sondas.

Los alelos de TCF-1 pueden identificarse mediante métodos de secuenciación de DNA, como el método de finalización de la cadena (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467), que es bien conocido en la materia. En una realización, se amplifica una subsecuencia del gen que incluye el lugar polimórfico y se clona en un plásmido adecuado y luego se secuencia, o bien se secuencia directamente. La secuenciación basada en PCR se describe en la patente estadounidense Nº 5.075.216; Brow, en PCR Protocols, 1990, (Innis et al. Eds., Academic Press, San Diego), capítulo 24; y Gyllensten, en PCR Technology, 1989 (Erlich, Ed., Stockton Press, New York), capítulo 5. Normalmente, la secuenciación se realiza utilizando uno de los secuenciadores de DNA automáticos que está disponibles a nivel comercial de, por ejemplo, PE Biosystems (Foster City, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), Genomyx Corp. (Foster City, CA), LI-COR Biotech (Lincoln, NE), GeneSys technologies (Sauk City, WI), y Visable Genetics, Inc. (Toronto, Canada).

Los alelos de TCF-1 pueden identificarse utilizando métodos de genotipificación basados en la amplificación. Se han descrito variedad de métodos de amplificación de ácidos nucleicos que pueden utilizarse en los ensayos capaces de detectar cambios de una única base en un ácido nucleico diana. Un método preferible es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que actualmente se conoce bien en la materia y se describe en las patentes estadounidenses Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188. Ejemplos de los numerosos artículos publicados que describen los métodos y aplicaciones de la PCR se encuentran en PCR Applications, 1999, (Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego), PCR Strategies, 1995, (Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego); PCR Protocols, 1990, (Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego); y PCR Technology, 1989, (Erlich, Ed., Stockton Press, New York). Distribuidores comerciales, como PE Biosystems (Foster City, CA) comercializan reactivos para la PCR y publican protocolos de PCR.

Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (Wu y Wallace 1988, Genomics 4:560-569); el ensayo de desplazamiento de la cadena (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, Walker et al. 1992, Nucleic acid Res. 20:1691-1696, y la patente estadounidense Nº 5.455.166); y varios sistemas de amplificación basados en la transcripción, lo que incluye los métodos descritos en las patentes estadounidenses Nº 5.437.990, 5.409.818 y 5.399.491; el sistema de amplificación de la transcripción (TAS) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177); y la replicación de secuencia automantenida (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 y WO 92/08800). Alternativamente, pueden utilizarse métodos que amplifican la sonda hasta niveles detectables, como la amplificación con asQ®-replicase (Kramer y Lizardi, 1989, Nature 339:401-402, y Lomeli et al., 1989, Clin. Chem. 35:1826-1831). En Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, se proporciona una revisión de los métodos de amplificación conocidos.

La genotipificación también puede realizarse mediante la detección del mRNA de TCF-1. La amplificación del RNA puede realizarse mediante una transcripción reversa inicial del RNA diana utilizando, por ejemplo, una transcriptasa reversa viral, y entonces amplificando el cDNA resultante, o utilizando una combinación de reacción en cadena de la polimerasa y transcripción reversa a elevada temperatura (RT-PCR), como se describe en la patente estadounidense Nº 5.310.652, 5.322.770, 5.561.058, 5.641.864 y 5.693.517 (véase también Myers y Sigua, 1995, en PCR Strategies, supra, capítulo 5).

Los alelos de TCF-1 pueden identificarse utilizando métodos de amplificación o extensión del cebador específica de alelo, que se basan en el efecto inhibitorio de un desemparejamiento terminal del cebador sobre la capacidad de extender el cebador de la polimerasa de DNA. Para detectar una secuencia alélica utilizando un método de amplificación o extensión del cebador específica de alelo, se escoge un cebador complementario al gen TCF-1 de forma que el nucleótido terminal en 3' hibrida en la posición polimórfica. En presencia del alelo a identificar, el cebador se une a la secuencia diana en el extremo 3' y el cebador puede extenderse. En presencia sólo del otro alelo, el cebador presente un desemparejamiento en 3' en relación con la secuencia diana y la extensión del cebador se evita o se reduce significativamente. Los métodos de amplificación o extensión del cebador específica de alelo se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nº 5.137.806, 5.595.890, 5.639.611 y 4.851.331. En los ejemplos se describe un método de genotipificación basado en la amplificación específica de alelo preferible.

Alternativamente, la amplificación específica de secuencia puede realizarse utilizando un cebador que hibrida con una región que incluye el lugar polimórfico y es exactamente complementaria de un alelo, seleccionando condiciones en las que sólo se forma un dúplex de hibridación estable entre el cebador y el alelo perfectamente emparejado. Tales métodos son menos preferibles para la distinción de polimorfismos de un único nucleótido debido a la dificultad de eliminar la hibridación parcial del cebador con el alelo desemparejado, lo que resulta en la generación de un producto amplificación no deseado. Por el contrario, los métodos basados en la presencia de un 3' desemparejamiento terminal discriminan entre los alelos incluso si el cebador hibrida con ambos alelos.

Utilizando la genotipificación basada en la amplificación específica de alelo, la identificación de los alelos sólo requiere la detección de la presencia o ausencia de las secuencias diana amplificadas. Los métodos para la detección de secuencias diana amplificadas son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la electroforesis en gel (véase Sambrook et al., 1989, supra.) y los ensayos de hibridación de sondas descritos anteriormente se han utilizado ampliamente para la detección de la presencia de ácidos nucleicos.

Un método alternativo sin sondas, aquí denominado método de PCR cinética, en el que la generación de ácido nucleico amplificado se detecta mediante la monitorización del aumento en la cantidad total de DNA de doble cadena en la mezcla de reacción, se describe en Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10:413-417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 1026-1030; Higuchi y Watson, en PCR Applications, supra, capítulo 16; la patente estadounidense Nº 5.994.056 y las patentes europeas Nº 487.218 y 512.334. La detección del DNA diana de doble cadena se basa en el aumento de fluorescencia que muestran el bromuro de etidio (EtBr) y otros colorantes de unión al DNA cuando se unen a DNA de doble cadena. El aumento de DNA de doble cadena que resulta de la síntesis de secuencias diana resulta en un aumento de la cantidad de colorante unido a DNA de doble cadena y un aumento detectable concomitante en la fluorescencia. Para la genotipificación utilizando los métodos de PCR cinética, las reacciones de amplificación se realizan utilizando un par de cebadores específicos de uno de los alelos, de forma que cada amplificación puede indicar la presencia de un alelo en particular. Realizando dos amplificaciones, una utilizando cebadores específicos del alelo A y otra utilizando cebadores específicos del alelo C, puede determinarse el genotipo de la muestra.

En los ejemplos se describe un método preferible basado en la amplificación específica de alelo en el que se utilizan múltiples cebadores específicos de alelo en una única reacción. Los cebadores se seleccionan de forma que los productos de amplificación producidos a partir de los alelos sean distinguibles por su tamaño. Por lo tanto, ambos alelos en una única muestra pueden identificarse utilizando una única amplificación mediante un análisis en gel del producto de amplificación.

Los alelos pueden identificarse utilizando métodos basados en sondas, que se basan en la diferencia de la estabilidad de los dúplex de hibridación formados entre la sonda y los alelos TCF-1, que difieren en el grado de complementariedad. En condiciones suficientemente astringentes de hibridación, se forman dúplex estables solamente entre la sonda y la secuencia del alelo diana. La presencia de dúplex estables de hibridación puede detectarse mediante cualquiera de los diferentes métodos bien conocidos. En general, es preferible amplificar el ácido nucleico previamente a la hibridación para facilitar la detección. Sin embargo, no es necesario si puede obtenerse suficiente ácido nucleico sin amplificación.

En una realización, el nucleótido presente en el lugar polimórfico se identifica mediante la hibridación bajo unas condiciones de hibridación específicas de secuencia con una sonda de oligonucleótido exactamente complementaria a uno de los alelos TCF-1 en una región que comprende el lugar polimórfico. La secuencia de hibridación de la sonda y las condiciones de hibridación específicas de secuencia se seleccionan de forma que un único desemparejamiento en el lugar polimórfico desestabilice el dúplex de hibridación lo suficiente como para no se forme de forma efectiva. Así, bajo unas condiciones de hibridación específicas de secuencia, se formarán dúplex estables sólo entre la sonda y la secuencia alélica exactamente complementaria. Por lo tanto, los oligonucleótidos entre alrededor de 10 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre alrededor de 15 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud, que son exactamente complementarios a una secuencia alélica en una región que comprende el lugar polimórfico están dentro del alcance de la invención.

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En una realización alternativa, el nucleótido presente en el lugar polimórfico se identifica mediante la hibridación bajo condiciones de hibridación suficientemente astringentes con un oligonucleótido sustancialmente complementario a uno de los alelos TCF-1 en una región que comprende el lugar polimórfico, y exactamente complementario al alelo en el lugar polimórfico. Como los desemparejamientos que aparecen en puntos no polimórficos son desemparejamientos con ambas secuencias alélicas, la diferencia en el número de desemparejamientos en un dúplex formado con la secuencia del alelo diana y en un dúplex formado con la secuencia del alelo no diana correspondiente es el mismo que cuando se utiliza un oligonucleótido exactamente complementario a la secuencia del alelo diana. En esta realización, las condiciones de hibridación se relajan lo suficiente para permitir la formación de dúplex estables con la secuencia diana, mientras se mantiene una astringencia suficiente para evitar la formación de dúplex estables con la secuencia no diana. Bajo tales condiciones de hibridación suficientemente astringentes, se formarán dúplex estables sólo entre la sonda y el alelo diana. Así, los oligonucleótidos de entre alrededor de 10 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud, preferiblemente de entre alrededor de 15 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud, que son sustancialmente complementarios a la secuencia del alelo en una región que comprende el lugar polimórfico, y son exactamente complementarios a la secuencia del alelo en el lugar polimórfico, están dentro del alcance de la invención.

La utilización de oligonucleótidos sustancialmente complementarios, en lugar de exactamente complementarios, puede ser deseable en formatos de ensayo en los que la optimización de las condiciones de hibridación es limitada. Por ejemplo, en un formato de ensayo típico con sondas inmovilizadas multi-diana, las sondas para cada diana están inmovilizadas en un único soporte sólido. Las hibridaciones se realizan simultáneamente al poner en contacto el soporte sólido con una solución que contiene el DNA diana. Como todas las hibridaciones se realizan bajo las mismas condiciones, las condiciones de hibridación no pueden optimizarse de forma separada para cada sonda. La incorporación de desemparejamientos en una sonda puede utilizarse para ajustar la estabilidad del dúplex cuando el formato de ensayo impide el ajuste de las condiciones de hibridación. El efecto de un desemparejamiento particular introducido en la estabilidad del dúplex es bien conocido, y la estabilidad del dúplex puede tanto estimarse como determinarse empíricamente de forma rutinaria, como se ha descrito anteriormente.

Una sonda adecuada para su utilización en los métodos basados en sondas de la presente invención, que contiene una región de hibridación sustancialmente complementaria o exactamente complementaria a la región diana del Id. de Sec. Nº:1 o la complementaria del Id. de Sec. Nº:1, en la que la región diana incluye el lugar polimórfico, y es exactamente complementaria a una de las dos secuencias alélicas en el lugar polimórfico, puede seleccionarse utilizando las guías que se proporcionan aquí y que son bien conocidas en la materia. De la misma forma, las condiciones de hibridación adecuadas, que dependen del tamaño y de la secuencia de la sonda, pueden seleccionarse empíricamente utilizando las guías que se proporcionan aquí y que son bien conocidas en la materia. La utilización de sondas de oligonucleótido para detectar diferencias de un único par de bases en una secuencia se describe en, por ejemplo, Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282 y las patentes estadounidenses Nº 5.468.613 y 5.604.099.

El cambio proporcional en la estabilidad entre un dúplex de hibridación perfectamente emparejado y uno con un desemparejamiento de una única base depende de la longitud de los oligonucleótidos hibridados. Los dúplex formados con secuencias de sondas más cortas se desestabilizan proporcionalmente más en presencia de un desemparejamiento. En la práctica, los oligonucleótidos de entre alrededor de 15 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud son preferibles para la detección específica de secuencia. Además, a causa de que los extremos de un oligonucleótido hibridado sufren una disociación continua al azar y una re-hibridación debida a la energía térmica, un desemparejamiento en cualquiera de los extremos desestabiliza el dúplex de hibridación en menor medida que un desemparejamiento que aparece de forma interna. Preferiblemente, para la discriminación de un cambio de un único par de bases en la secuencia diana, la secuencia de la sonda se selecciona para que hibride con la secuencia diana de forma que el lugar polimórfico quede en la región interna de la sonda.

El criterio anterior de selección de una secuencia de sonda que hibrida con el Id. de Sec. Nº:1 es aplicable a la región de hibridación de la sonda, es decir, la parte de la sonda que está involucrada en la hibridación con la secuencia diana. Una sonda puede estar unida a una secuencia de ácido nucleico adicional, como una cola de poli-T utilizada para inmovilizar la sonda, sin alterar significativamente las características de hibridación de la sonda. Un experto en la materia reconocerá que para su utilización en los presentes métodos, una sonda unida a una secuencia de ácido nucleico adicional que no es complementaria a la secuencia diana y, por lo tanto, no está involucrada en la hibridación, es esencialmente equivalente a la sonda no unida.

En las realizaciones preferibles de los métodos basados en sondas para la determinación del genotipo TCF-1, se amplifica una secuencia de ácido nucleico del gen TCF-1 que comprende el lugar polimórfico y se hibrida con las sondas bajo condiciones de hibridación suficientemente astringentes. Los alelos TCF-1 presentes se infieren a partir del patrón de unión de la sondas con la secuencia diana amplificada. En esta realización, la amplificación se realiza para proporcionar el suficiente ácido nucleico para su análisis mediante sondas de hibridación. Así, los cebadores se diseñan de forma que una región del gen TCF-1 que incluye el lugar polimórfico se amplifica independientemente del alelo presente en la muestra. La amplificación independiente de alelo se consigue utilizando cebadores que hibridan con regiones conservadas del gen TCF-1. La secuencia del gen TCF-1 está altamente conservada y los cebadores independientes de alelo adecuados pueden seleccionarse de forma rutinaria a partir del Id. de Sec. Nº:1. Un experto en la materia reconocerá que, normalmente, la optimización experimental de un sistema de amplificación es útil.

Los formatos de ensayo adecuados para la detección de híbridos formados entre las sondas y las secuencias de ácido nucleico diana en una muestra son conocidas en la materia e incluyen los formatos de ensayo con la diana inmovilizada (dot-blot) y con la sonda inmovilizada (dot-blot inverso o line-blot). Los formatos de ensayo de dot-blot y dot-blot inverso se describen en las patentes estadounidenses Nº 5.310.893, 5.451.512, 5.468.613 y 5.604.099.

En un formato de dot-blot, el DNA diana amplificado se inmoviliza sobre un soporte sólido, como una membrana de nylon. El complejo membrana-diana se incuba con una sonda marcada bajo las condiciones de hibridación adecuadas, la sonda no hibridada se elimina mediante lavado bajo condiciones astringentes adecuadas, y se monitoriza la presencia de sonda unida en la membrana. Un ensayo de detección dot-blot preferible se describe en los ejemplos.

En el formato de dot-blot inverso (o line-blot), las sondas se inmovilizan sobre un soporte sólido, como una membrana de nylon o una placa microtitulada. El DNA diana se marca, normalmente durante la amplificación mediante la incorporación de cebadores marcados. Uno o ambos cebadores pueden estar marcados. El complejo membrana-sonda se incuba con el DNA diana amplificado marcado bajo condiciones de hibridación adecuadas, el DNA diana no hibridado se elimina mediante lavado bajo condiciones astringentes adecuadas, y se monitoriza la presencia de DNA diana unido en la membrana. Un ensayo de detección line-blot inverso preferible se describe en los ejemplos.

La genotipificación basada en sondas puede realizarse utilizando un "ensayo TaqMan" o "ensayo 5'-nucleasa", como se describe en las patentes estadounidenses Nº 5.210.015, 5.487.972 y 5.804.375; y Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280. En el ensayo TaqMan, se añaden sondas de detección marcadas que hibridan en el interior de la región amplificada en la mezcla de reacción de amplificación. Las sondas se modifican de forma que se evita que las sondas actúen como cebadores para la síntesis de DNA. La amplificación se realiza utilizando una polimerasa de DNA que posee actividad exonucleasa de 5' a 3', por ejemplo, la polimerasa de DNA Tth. Durante cada paso de síntesis de la amplificación, cualquier sonda que hibride con el ácido nucleico diana hacia 5' desde el cebador que va a extenderse se degrada por la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la polimerasa de DNA. Así, la síntesis de una nueva cadena diana también resulta en la degradación de una sonda, y la acumulación de producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de secuencias diana.

Cualquier método adecuado para la detección de producto de degradación puede utilizarse en el ensayo TaqMan. En un método preferible, las sondas de detección se marcan con dos colorantes fluorescentes, uno de los cuales es capaz de bloquear la fluorescencia del otro colorante. Los colorantes se unen a la sonda, preferiblemente uno unido al extremo 5' y el otro unido a un lugar interno, de forma que el bloqueo ocurre cuando la sonda está en estado no hibridado y de forma que la escisión de la sonda por la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la polimerasa de DNA ocurre entre los dos colorantes. La amplificación resulta en la escisión de la sonda entre los colorantes con una eliminación concomitante del bloqueo y un aumento de la fluorescencia observable del colorante inicialmente bloqueado. La acumulación de producto de degradación se monitoriza mediante la medida del aumento de la fluorescencia de la reacción. Las patentes estadounidenses Nº 5.491.063 y 5.571.673, describen métodos alternativos para la detección de la degradación de la sonda que ocurre de forma concomitante con la amplificación.

El ensayo TaqMan puede utilizarse con cebadores de amplificación específicos de alelo de forma que la sonda se utiliza sólo para detectar la presencia de producto amplificado. Un ensayo tal se realiza como se describe para los métodos basados en la PCR cinética descritos anteriormente. Alternativamente, el ensayo TaqMan puede utilizarse con una sonda específica de diana.

Los formatos de ensayo descritos anteriormente normalmente utilizan oligonucleótidos marcados para facilitar la detección de los dúplex híbridos. Los oligonucleótidos pueden marcarse mediante la incorporación de un marcaje detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Los marcajes útiles incluyen el ^{32}P, colorantes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (como se utiliza comúnmente en los ELISA), biotina, o haptenos y proteínas para los que hay antisueros o anticuerpos monoclonales disponibles. Los oligonucleótidos marcados de la invención pueden sintetizarse y marcarse utilizando las técnicas descritas anteriormente para la síntesis de oligonucleótidos. Por ejemplo, un ensayo dot-blot puede realizarse utilizando sondas marcadas con biotina, como se describe en Levenson y Chang, 1989, en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego), págs. 99-112. Tras la hibridación del DNA diana inmovilizado con las sondas biotiniladas bajo condiciones específicas de secuencia, las sondas que se mantienen unidas se detectan mediante la unión inicial de la biotina a avidina-peroxidasa de rábano picante (A-HRP) o estreptavidina- peroxidasa de rábano picante (SA-HRP), que entonces se detecta mediante la realización de una reacción en la que la HRP cataliza un cambio de color de un cromógeno.

Se han descrito otros métodos que pueden utilizarse para la genotipificación. Por ejemplo, los alelos TCF-1 pueden identificarse mediante cambios en la movilidad analizada por electroforesis en gel. Normalmente, se amplifica una pequeña región del alelo TCF-1 que incluye el lugar polimórfico y el producto de amplificación se analiza mediante electroforesis en gel. Alternativamente, los fragmentos del alelo se generan mediante digestión con enzimas de restricción y los fragmentos que incluyen el lugar polimórfico se analizan mediante electroforesis en gel. Los métodos basados en gel para la identificación de cambios de un único nucleótido en el DNA se describen en Sheffield et al., en PCR Protocols, 1990, (Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego), capítulo 26.

La diferencia en la movilidad puede potenciarse mediante la incorporación selectiva de análogos de nucleótido en la secuencia de ácido nucleico en la posición polimórfica. La patente estadounidense Nº 4.879.214 describe un método basado en la extensión del cebador en el que se incluye un análogo de nucleótido de forma que el producto de extensión formado utilizando uno de los alelos como molde incorpora el análogo. El análogo se selecciona de forma que éste cambia la movilidad del producto extendido, lo que facilita la distinción de los productos de extensión formados a partir de diferentes alelos.

La incorporación selectiva de análogos de nucleótido en la posición polimórfica también puede utilizarse para dar lugar a un producto de extensión a partir de un alelo resistente a la degradación por nucleasas. La patente estadounidense Nº 4.656.127 describe un método en el que se hibrida una sonda de DNA marcada con el ácido nucleico diana de forma que el extremo 3' de la sonda se posiciona adyacente a la posición a analizar. Un análogo de nucleótido, como el tionucleótido, se incluye en la reacción de extensión de forma que el análogo se incorpora utilizando sólo uno de los alelos como molde y no si el otro alelo está presente como molde. La sonda extendida es resistente a la escisión con exonucleasa III si el análogo de nucleótido se ha incorporado. Por lo tanto, la presencia de sonda marcada no digerida tras el tratamiento con exonucleasa III indica la presencia del alelo específico.

Cualquiera que sea el método de determinación, en el que oligonucleótidos de la invención hibridan selectivamente con secuencias alélicas de TCF-1 en una muestra, la característica principal del método de tipificación involucra la identificación de los alelos TCF-1 presentes en la muestra mediante la detección de las variantes de secuencia presentes.

Los equipos, unidades que contienen los componentes útiles para la práctica del presente método, pueden contener sondas de oligonucleótido específicas de los alelos TCF-1. En algunos casos, las sondas de detección pueden estar fijadas a una membrana de soporte adecuada. El equipo también puede contener cebadores de amplificación para la amplificación de una región del locus TCF-1 que incluye el lugar polimórfico, y tales cebadores son útiles en la realización preferible de la invención. Alternativamente, los equipos útiles pueden contener un grupo de cebadores que comprenden un cebador específico de alelo par la amplificación específica de alelos TCF-1. Otros componentes opcionales de los equipos incluyen reactivos adicionales utilizados en los métodos de genotipificación como se describen aquí. Por ejemplo, un equipo puede contener de forma adicional un agente para catalizar la síntesis de los productos de extensión del cebador, nucleósidos trifosfato substrato, los medios para el marcaje y/o la detección del ácido nucleico (por ejemplo, una enzima conjugada con avidina y el sustrato de la enzima, y el cromógeno si el marcaje es biotina), tampones apropiados para las reacciones de amplificación o hibridación, y las instrucciones para la realización del presente método.

Los ejemplos de la presente invención presentados a continuación se proporcionan sólo con un propósito ilustrativo y no para limitar el alcance de la invención. A partir de la lectura del texto precedente y de los siguientes ejemplos serán evidentes para los expertos en la materia numerosas realizaciones de la invención dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen los ejemplos.

Ejemplo 1 Protocolo de Genotipificación Identificación de los Alelos TCF-1 basada en la Amplificación Específica de Secuencia

El genotipo de una muestra humana puede determinarse mediante amplificaciones específicas de secuencia utilizando cebadores que distinguen los alelos en base al nucleótido presente en la posición 883. En el siguiente protocolo, el genotipo se determina mediante el análisis del patrón de productos de amplificación generados utilizando cebadores que amplifican fragmentos de diferente longitud dependiendo de los alelos presentes.

Cebadores de Amplificación

Las amplificaciones se llevan a cabo utilizando cuatro cebadores, dos de los cuales son cebadores directos y los otros dos son cebadores reversos. Las secuencias de los cebadores preferibles se muestran a continuación en una orientación de 5' a 3'.

3

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El cebador directo LS045B (Id. de Sec. Nº:3) y el cebador reverso GZ348B (Id. de Sec. Nº:6) hibridan con una región que incluye el polimorfismo de un único nucleótido. La utilización de estos dos cebadores resulta en la amplificación de un producto de 311 pares de bases (pb) independientemente del nucleótido presente en la posición polimórfica.

El cebador GZ374B (Id. de Sec. Nº:5) es un cebador reverso que hibrida con la secuencia TCF-1 de tal forma que el nucleótido 3' terminal hibrida en el lugar polimórfico de la posición 883. El cebador GZ374B (Id. de Sec. Nº:5) es exactamente complementario al alelo C, y de este modo, presenta un desemparejamiento en 3' terminal en relación al alelo A. Bajo condiciones adecuadas, como se describe a continuación, se genera un producto de amplificación solo si un alelo C está presente en la muestra. La amplificación utilizando cebadores LS045B (Id. de Sec. Nº:3) y GZ374B (Id. de Sec. Nº:5) resulta en una amplificación de un producto de 268 pb si un alelo C está presente en la
muestra.

El cebador GZ351B (Id. de Sec. Nº:4) es un cebador directo que hibrida con la secuencia TCF-1 de tal forma que el nucleótido en el extremo 3' hibrida en el lugar polimórfico de la posición 883. El cebador GZ351B (Id. de Sec. Nº:4) es exactamente complementario al alelo A y, de este modo, presenta un desemparejamiento en el extremo 3' en relación con el alelo C. Bajo condiciones adecuadas, como se describe a continuación, se genera un producto de amplificación sólo si un alelo A está presente en la muestra. La amplificación utilizando los cebadores GZ351B (Id. de Sec. Nº:4) y GZ348B (Id. de Sec. Nº:6) resulta en la amplificación de un producto de 73 pb sólo si un alelo A está presente en la muestra.

El cebador GZ346B (Id. de Sec. Nº:2) es un cebador directo alternativo que puede utilizarse en lugar del cebador LS045B (Id. de Sec. Nº:3) en los emparejamientos anteriores.

Al utilizar los cebadores anteriores, los Id. de Sec. Nº:3-6, los productos generados por las amplificaciones de los posibles genotipos son distinguibles. Los posibles resultados de la amplificación se muestran en la siguiente tabla.

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4

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Amplificación

La amplificación por PCR se lleva a cabo en un volumen de reacción total de 25-100 \mul que contienen los siguientes reactivos:

0,2-1 ng/\mul de DNA genómico humano purificado

0,2 \muM de cada uno de los cuatro cebadores

800 \muM de dNTP total (200 \muM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

KCl 60 mM

Tris-HCl 12 mM, pH 8,3

MgCl_{2} 2,4 mM

0,05-0,1 unidades/\mul de polimerasa de DNA AmpliTaq Gold^{TM} *

*desarrollada y fabricada por Hoffmann-La Roche y disponible comercialmente de PE Biosystems (Foster City, CA).

La amplificación se lleva a cabo en un termociclador GeneAmp® PCR System 9600 (PE Biosystems, Foster City, CA), utilizando el perfil de ciclado de temperaturas específico que se muestra a continuación.

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Incubación pre-reacción:

94ºC durante 12 minutos

37 ciclos: desnaturalización:

95ºC durante 45 segundos

hibridación:

61ºC durante 30 segundos

extensión:

72ºC durante 30 segundos

Extensión final:

72ºC durante 7 minutos

Mantenimiento:

10ºC-15ºC

Detección Electroforética en Gel

El DNA amplificado se separa por tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa para determinar el tamaño de los productos amplificados. Se utiliza un gel de NuSieve al 3%/agarosa 1% en tampón de separación 0,5 X TBE (Tris-borato 0,045 M y EDTA disódico 0,001 M). Se añade bromuro de etidio (0,5 mg/ml) tanto al gel como al tampón de separación (alternativamente, se puede teñir después de la electroforesis). La electroforesis se lleva a cabo a 100 voltios durante aproximadamente 1 hora. Las bandas de DNA teñidas con bromuro de etidio se visualizan utilizando radiación UV.

Ejemplo 2 Protocolo de Genotipificación Identificación Basada en Sondas de los Alelos TCF-1

Este ejemplo describe un método de genotipificación alternativo. Se amplifica una región del gen TCF-1 que abarca el lugar polimórfico y se identifica el nucleótido presente mediante la hibridación con sondas. La detección de la sonda se lleva a cabo utilizando un formato de diana inmovilizada (dot-blot), o utilizando un formato de sonda inmovilizada (dot-blot inverso o line-blot).

Cebadores de Amplificación

La amplificación de una región del gen TCF-1 que corresponde a los nucleótidos de 847 a 939 del Id. de Sec. Nº:1, que abarca el lugar polimórfico en la posición 883, se lleva a cabo utilizando el cebador directo, RR328B (Id. de Sec. Nº:7), mostrado a continuación, junto con el cebador reverso GZ348B (Id. de Sec. Nº:6). La secuencia del cebador directo se muestra en orientación 5' -> 3'.

RR328B (Id. de Sec. Nº:7) TACTCCGCCTTCAATCTGCTCA

Para su utilización en el formato de detección de sonda inmovilizada, descrito anteriormente, el cebador que se incorpora en la cadena complementaria a la sonda se marca con biotina unida en el fosfato 5', lo que facilita la detección. Los reactivos para la síntesis de oligonucleótidos con un marcaje de biotina unida al fosfato 5' están disponibles comercialmente de Clonetech (Palo Alto, CA) y Glenn Research (Sterling, VA). Un reactivo preferible es Biotin-ON de Clonetech.

Amplificación

La amplificación por PCR se lleva a cabo en un volumen de reacción total de 25-100 \mul que contienen los siguientes reactivos:

0,2 ng/\mul de DNA genómico humano purificado

0,2 \muM de cada cebador

800 \muM de dNTP total (200 \muM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

KCl 50 mM

Tris-HCl 10 mM, pH 8,3

MgCl_{2} 1 mM,

0,05 unidades/\mul de polimerasa de DNA AmpliTaq Gold^{TM}*

*desarrollada y fabricada por Hoffmann-La Roche y disponible comercialmente por PE Biosystems (Foster City, CA).

La amplificación se lleva a cabo en un termociclador GeneAmp® PCR System 9600 (PE Biosystems, Foster City, CA), utilizando el perfil de ciclado de temperaturas específico que se muestra a continuación.

Incubación pre-reacción:

94ºC durante 12,5 minutos

37 ciclos: desnaturalización:

95ºC durante 45 segundos

hibridación:

60ºC durante 30 segundos

extensión:

72ºC durante 45 segundos

Extensión final:

72ºC durante 7 minutos

Mantenimiento:

10ºC-15ºC

Sondas de Detección

Las sondas preferibles utilizadas para la identificación de las variantes de secuencia alélica presentes en el ácido nucleico de TCF-1 amplificado se describen a continuación. Las sondas se muestran en orientación de 5' a 3'.

Sonda del alelo C:

KW196 (Id. de Sec. Nº:8) ATTACCCACCCCCCTCGGGA

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Sonda del alelo A:

KW118 (Id. de Sec. Nº:9) CCGAGGTGGGTGGGTAAT

Ensayo de Hibridación de Sondas, Formato de Diana Inmovilizada

En el formato de diana inmovilizada, se desnaturaliza una porción del ácido nucleico amplificado, se aplica a un filtro de nylon, y se inmoviliza como se describe a continuación. El filtro se sumerge en una solución que contiene la sonda marcada para permitir la hibridación. Se elimina la sonda no unida mediante lavados bajo condiciones de hibridación específicas de secuencia, y se detectan las sondas que permanecen unidas al ácido nucleico inmovilizado. Los detalles del ensayo se describen a continuación.

Para su utilización en el formato de detección de dianas inmovilizadas, descrito a continuación, las sondas se marcan con peroxidasa de rábano picante (HRP) para facilitar la detección. La síntesis de oligonucleótidos marcados con HRP se describe en Levenson y Chang, Capítulo 13 en PCR Protocols, 1990, (Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego), incorporado aquí en las referencias.

Para desnaturalizar los productos de amplificación, se añaden 10 \mul de producto de amplificación a 90 \mul de solución de desnaturalización que consiste en 4,5 \mul de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 7,2 \mul de NaOH 5 N y 78,3 \mul de H_{2}O. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para completar la desnaturalización.

Los filtros de nylon, (filtros de nylon BioDyne^{TM} B, Pall Corp., Glen Cove, NY) se preparan sumergiéndolos en H_{2}O durante 5 a 10 minutos y con un posterior enjuague con 200 \mul de H_{2}O. Los 100 \mul de mezcla de muestra desnaturalizada se aplican en la membrana de nylon bajo vacío utilizando un dosificador para dot-blot (Bio-Dot^{TM} de Bio Rad, Richmond, CA). Cada pocillo se lava entonces con 200 \mul de NaOH 0,4 N, después se lava brevemente con 2X SSC, y se seca al aire hasta eliminar todo rastro de líquido. El DNA inmovilizado se fija al filtro de nylon mediante radiación ultravioleta a un flujo de 500 mJ/cm^{2} utilizando una cámara de radiación UV Stratalinker^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) (en la posición de "autocrosslink").

La hibridación se lleva a cabo en un tampón de hibridación (5X SSPE, SDS 0,5%, en el que 20X SSPE es NaCl 3,6 M, NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O 0,2 M, EDTA 20 mM, ajustado a pH 7,4 con NaOH) que contiene sonda marcada con HRP 2 mM. Los filtros se dejaron hibridar durante 25-30 minutos a 55ºC. Tras la hibridación, se lavan los filtros en un tampón de lavado (2,5X SSPE, SDS 0,1%) a temperatura ambiente para eliminar el exceso de sonda. Se lleva a cabo un lavado astringente en un tampón de lavado durante 12 minutos a 55ºC en un baño de agua en agitación. Las condiciones de hibridación específicas de secuencia del lavado astringente aseguran que sólo las sondas exactamente complementarias a la secuencia diana permanecen unidas.

Las sondas marcadas con HRP que permanecen unidas al producto de amplificación inmovilizado se visualizan como sigue. Se prepara una solución de revelado de color mezclando 100 ml de tampón citrato (Citrato Sódico 0,1 M, pH 5,0), 5 ml de solución 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (TMB en polvo 2 mg/ml de Fluka, Milwaukee, WI, disuelto en EtOH al 100%), y 100 \mul de peróxido de hidrógeno al 3%. Los filtros primero se lavaron con citrato sódico 100 mM (pH 5,0) durante 5 minutos, después se incubaron en la solución de revelado de color con agitación suave durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El TMB, inicialmente incoloro, se convierte mediante la HRP unida a la sonda en presencia de peróxido de hidrógeno en un precipitado de color. Los filtros revelados se lavan en agua durante varios minutos y se fotografían de forma inmediata.

Ensayo de Hibridación de Sondas, Formato de Sonda Inmovilizada

En el formato de sonda inmovilizada, las sondas se han inmovilizado en un soporte sólido antes de ser utilizadas en la hibridación. El complejo soporte-sonda se sumerge en una solución que contiene el ácido nucleico amplificado desnaturalizado para permitir que se de la hibridación. Los ácidos nucleicos no unidos se eliminan mediante lavados bajo condiciones de hibridación de secuencia específicas, y se detecta el ácido nucleico que permanece unido a las sondas inmovilizadas. La detección se lleva a cabo utilizando la misma reacción cromogénica utilizada en el ensayo de dot-blot descrito antes. Los detalles del ensayo se describen a continuación.

Para su utilización en el formato de detección de sonda inmovilizada, descrito a continuación, se une una porción al fosfato 5' de la sonda para facilitar la inmovilización en el soporte sólido. Preferiblemente, se une albúmina de suero bovino (BSA) al fosfato 5', esencialmente como se ha descrito en Tung et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:464-465. Alternativamente, se añade una cola de poli-T al extremo 5' como se ha descrito en la patente estadounidense Nº 5.451.512.

Las sondas se aplican de forma lineal en las láminas de membrana de nylon utilizando un controlador Linear Striper and Multispense 2000^{TM} (IVEK, N. Springfield, VT). La titulación de las sondas, KW196 2 mM (Id. de Sec. Nº:8) y KW118 1,75 mM (Id. de Sec. Nº:9), se escogen para alcanzar un equilibrio de la señal entre las variantes alélicas. Cada lámina se corta en tiras de entre 0,35 y 0,5 cm de ancho. Para desnaturalizar los productos de amplificación, se añaden 20 \mul del producto de amplificación (basado en una reacción de 50 \mul) a 20 \mul de solución de desnaturalización (NaOH al 1,6%) y se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos para completar la desnaturalización.

El producto de amplificación desnaturalizado (40 \mul) se añade al pocillo de una bandeja de genotificación que contiene 3 ml de tampón de hibridación (4X SSPE, SDS al 0,5%) y la tira de membrana. Se dejan hibridar durante 15 minutos a 55ºC en un baño de agua rotatorio. Tras la hibridación, la solución de hibridación se aspira, la tira se lava con 3 ml de tampón de lavado caliente (2X SSPE, SDS al 0,5%) mediante un movimiento suave atrás y adelante de las tiras, y el tampón de lavado se aspira. Tras el lavado, las tiras se incuban en 3 ml de una solución de enzima conjugada (3,3 ml de tampón de hibridación y 12 \muL de peroxidasa de rábano picante-estrepavidina (SA-HRP)) en el baño de agua rotatorio durante 5 minutos a 55ºC. Después se lavan las tiras con tampón de lavado como anteriormente, y se incuban en tampón de lavado a 55º durante 12 minutos (lavado astringente), y finalmente se lavan con tampón de lavado de nuevo.

El ácido nucleico diana, ahora marcado con HRP, que permanece unido al producto de amplificación inmovilizado se visualiza como sigue. Las tiras se lavan primero con citrato sódico 0,1 M (pH 5,0) durante 5 minutos, después se incuban en la solución de revelado de color (descrita anteriormente) con agitación suave durante 8 a 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El TMB, inicialmente incoloro, se convierte mediante la HRP unida a la diana, en presencia de peróxido de hidrógeno, en un precipitado de color. Las tiras reveladas se lavan con agua durante varios minutos y se fotografían de forma inmediata.

Ejemplo 3 Presencia del alelo A

Se analizó la presencia del alelo A en muestras de individuos de 4 poblaciones diferentes. Las poblaciones muestreadas consistieron en 47 afro-americanos, 47 caucasianos estadounidenses, 47 hispanos estadounidenses y 47 japoneses.

La genotipificación se llevó a cabo utilizando los métodos de amplificación específicos de alelo esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior. El protocolo descrito en el Ejemplo 1 representa una versión mejorada del ensayo utilizado en la actualidad. Las mejoras realizadas están relacionadas con la eficiencia de la amplificación y la detección, pero no alteran los resultados cualitativos del ensayo.

Los resultados identificaron 19 de 188 muestras que contenían el alelo A: 2 afro-americanos, 11 caucasianos estadounidenses, 6 hispanos estadounidenses y 0 japoneses.

Ejemplo 4 Frecuencia del alelo A en muestras filipinas

Las muestras de 200 individuos de Filipinas se genotipificaron utilizando los métodos basados en sondas descritos en el Ejemplo 2 (formato de sonda inmovilizada). Todos los individuos de esta población resultaron ser homozigotos para el alelo C.

La ausencia del alelo A en esta población puede explicar que la aparición de diabetes tipo 1 sea inferior en las Filipinas que en la población caucasiana.

Ejemplo 5 Asociación con la Diabetes tipo 1

La genotipificación de TCF-1 se llevó a cabo en individuos de 282 familias caucasianas elegidas debido a que contenían dos descendientes afectados de diabetes tipo 1. Se determinaron los genotipos de TCF-1 de todos los individuos. La genotipificación de TCF-1 se llevó a cabo utilizando los métodos de amplificación específicos de alelo descritos en el Ejemplo 1. Además de los 564 descendientes (2 hermanos en cada una de las 282 familias) de las parejas de hermanos afectados en la que se basó la determinación, existen otros 26 niños afectados. Existen 270 descendientes no afectados en estas familias.

Las muestras basadas en familias se proporcionaron como DNA genómico purificado de la Human Biological Data Interchange (HBDI), que es una reserva de líneas celulares de familias afectadas de diabetes tipo 1. Todas las familias del HBDI utilizadas en este estudio son familias nucleares con padres no afectados y al menos dos hermanos afectados. Estas muestras se describen en profundidad en Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59:1134-1148.

Se sabe que el genotipo HLA puede tener un efecto significativo, que puede aumentar o disminuir, dependiendo del genotipo, el riesgo de diabetes tipo 1. En particular, los individuos con el genotipo HLA DR DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302 (referido como DR3/DR4 a continuación) parece tener el mayor riesgo de padecer diabetes tipo 1 (véase Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59:1134-1148). Estos individuos de alto riesgo poseen una probabilidad de alrededor de 1 entre 15 de verse afectados de diabetes tipo 1. Debido al importante efecto de este genotipo en la probabilidad de diabetes tipo 1, la presencia del genotipo DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302 puede enmascarar la contribución de las variantes alélicas TCF-1.

Los individuos de estas familias también se genotipificaron en los loci HLA DRB1 y DQB1. De las parejas de hermanos, ambos hermanos poseían el genotipo DR3/DR4 en 90 familias. Ningún hermano afectado mostró el genotipo DR3/4 en las 144 familias. Exactamente una de las parejas afectadas muestran el genotipo DR3/4 en las 48 familias restantes.

Métodos Estadísticos

Se llevaron a cabo una serie de pruebas estadísticas de asociación, como se describe en las siguientes secciones. Los miembros de la misma familia no son observaciones independientes, especialmente si la hipótesis alternativa del efecto genético es cierta. Por lo tanto, se utilizaron los métodos de re-muestreo a lo largo del análisis para evaluar la significación. Se realizó un re-muestreo estándar no paramétrico de las familias, que son las unidades primarias de muestreo, utilizando rutinas en el programa informático SPlus (MathSoft, Cambrige, MA). Para cada estadístico, se realizaron 1000 muestras de re-muestreo. Los intervalos de confianza se basaron en el método del percentil más simple. Los valores de p se determinaron encontrando el intervalo de confianza más amplio que excluye el valor del parámetro en la hipótesis nula. Si 1 - \alpha es el nivel de confianza de este intervalo, el correspondiente valor de p de dos colas es \alpha. Por ejemplo, un intervalo de confianza del 90% corresponde a un valor de p de 0,10.

Padres

Los genotipos, frecuencias alélicas y frecuencias genotípicas de los padres de cada una de las 282 familias se muestran en las tablas a continuación:

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Frecuencias de Genotipo en las Parejas de Padres

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Las frecuencias alélicas se calcularon en base al número de alelos A y C en los 1128 alelos parentales (2 padres en cada una de las 282 familias, 2 alelos en cada padre).

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Frecuencias Alélicas en los Padres

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Las frecuencias genotípicas en los padres se comparó con las frecuencias genotípicas esperadas, asumiendo el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE). Los datos se ajustan claramente a las frecuencias esperadas.

Frecuencias genotípicas en los Padres

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Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE)

El HWE se comprobó también mediante la tabla de alelos transmitidos y no transmitidos, que se muestra a continuación, y comprobando la independencia en las filas y las columnas. Se incluyeron todos los padres en este análisis, incluyendo los padres homozigotos que no son informativos en un análisis TDT (descrito a continuación). Sólo se utilizaron los niños afectados.

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Datos para la prueba del HWE en el locus TCF-1

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P_{AT} y P_{AU} son la probabilidad de que el alelo A esté transmitido y no transmitido, respectivamente. Se definen términos análogos para el alelo C. La proporción de probabilidades (P_{AT}P_{CU})/(P_{AU}P_{CT}) mide la dependencia de los alelos transmitidos y no transmitidos.

Como se puede observar, los contajes son muy cercanos a los valores nulos esperados. Esto apoya el HWE en el locus TCF-1. Un valor de p, que asume la independencia de los niños de la misma familia, es 0,88. En este caso, el análisis de re-muestreo para valorar de forma correcta la dependencia de los niños no se realizó. El re-muestreo podría, en este caso, reducir el nivel de significación aún más.

Asociación entre TCF-1 y DRB1

Se llevó a cabo una prueba de asociación en la población general entre el locus DRB1 y el TCF-1. La asociación indicaría la presencia de una estratificación de la población en relación a este loci, que podría afectar al resto del análisis. Además, la asociación no puede mantenerse más de una única generación en un loci no ligado si la población se empareja de forma aleatoria. En ese caso, una asociación entre los dos loci se podría mantener sólo si existiera una presión selectiva continua a favor o en contra de una combinación de DRB1-TCF-1 en particular.

Se comprobó la asociación como sigue. Se observó el haplotipo no transmitido a cada individuo afectado. Estos haplotipos no transmitidos se pueden tomar como una muestra aleatoria de la población (bajo el HWE). A y C indican los dos alelos TCF-1. 3, 4 y X indican el grupo serológico en DRB1, en el que X es cualquier grupo serológico diferente de los dos primeros. AX es la probabilidad del haplotipo A y X. N_{AX} es el número de tales haplotipos. Se definen cantidades similares de los otros haplotipos. La probabilidad de A dado X puede estimarse mediante (N_{AX}/N_{CX}). La proporción de probabilidades, (A3/C3)/(AX/CX), puede estimarse mediante (N_{A3}N_{CX})/(N_{C3}N_{AX}). Una estimación similar se aplica a 4 vs. X y 4 vs. 3. Si no hubiera asociación entre los dos loci, las tres proporciones de probabilidades serían igual a uno.

Los datos se presentan en la tabla, a continuación. En la tabla, la proporción de probabilidades de A dado 3, versus A dado X se abrevia 3 vs. X; se utilizan abreviaturas análogas para las otras proporciones. La significación de las proporciones de probabilidades se estima utilizando un análisis de re-muestreo. El análisis no muestra asociación entre TCF-1 y DRB1. Esto indica que cualquier asociación entre los dos loci en la prueba de desequilibrio en la transmisión (TDT) es debida a una interacción entre los dos loci en su efecto sobre el riesgo.

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Proporción de probabilidades: Prueba de Asociación de TCF-1 con DRB1

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Esta aproximación no es válida para los hermanos no afectados de individuos escogidos por su estado de afectados. Los hermanos no afectados probablemente no tenían el mismo haplotipo que su hermano afectado. Asimismo, es más probable que los haplotipos no transmitidos a los no afectados contengan haplotipos de alto riesgo que la población general. La inversa no es válida para los niños afectados ya que los hermanos no afectados no se consideran en el esquema de determinación. Para los hermanos afectados, puede haber cierta tendencia a la aparición de falsas distancias a la no asociación, debido a que la determinación de cada niño también depende del estado de su hermano. Este efecto podría conducir a un falso positivo que no aparece aquí.

Efectos de género

La distribucón del genotipo TCF-1 en las madres, padres y descendencia se muestra en la siguiente tabla.

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En ausencia de un efecto relacionado con el género, se podría esperar que las madres y los padres tuvieran la misma distribución. La prueba estadística de chi-cuadrado para la misma distribución en las madres y en los padres es de 5,08 con un valor de p de 0,08. Como la primera columna tenía pocos datos, la prueba chi-cuadrado también se realizó sólo sobre la segunda y tercera columnas. Esto presentó un estadístico de 2,71 con un valor de p de 0,10. Esto sugiere que hay más alelos A presentes en las madres que en los padres o que el riesgo de A es mayor si este alelo se recibe de la madre. El esquema de determinación aumentaría entonces el número de madres portadoras de A en la muestra.

Bajo el HWE, este efecto también puede analizarse observando los alelos no transmitidos a niños afectados. La proporción de probabilidades para el tipo de alelos no transmitidos en relación a su origen materno o paterno es (Am\cdotCp)/(Cm\cdotAp), en la que Am es el número de alelos A no transmitidos de origen materno, Ap es el número de alelos A no transmitidos de origen paterno, y el resto de notación para el alelo C se define de forma análoga. Esta proporción de probabilidades mide la frecuencia relativa a toda la población de A en mujeres.

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Proporciones de probabilidades (OR): Test de Asociación del Alelo A con el Origen Materno

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El hecho de que las proporción de probabilidades sea mayor de uno, indica que las mujeres son portadoras del alelo A más frecuentemente que los hombres. Este efecto aparece más fuertemente en las madres de niños no DR3/DR4, que, de media, es presumiblemente menos probable que sean portadoras de un alelo DRB1 3 o 4. Existe un ligero sesgo en esta prueba debido a la existencia de al menos dos niños afectados en cada familia. Como se muestra más tarde, el riesgo parece atribuirse al origen paterno, lo que debería hacer más probable que los hombres en la muestra fueran portadores del alelo A, al contrario de lo que muestra el resultado.

Las proporciones de probabilidades del origen materno frente al paterno de los alelos A transmitidos, también se calcularon a partir de las transmisiones de alelo de padres heterozigotos, como se muestra en las tablas a continuación. Las transmisiones a la descendencia afectada y no afectada se calcularon de forma separada.

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Proporciones de probabilidades (OR): Prueba de Asociación del Alelo A con Origen Materno

Transmisión de los padres heterozigotos a la descendencia afectada

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Proporciones de probabilidades (OR): Prueba de Asociación del Alelo A con el Origen Materno

Transmisión de los padres heterozigotos a la descendencia no afectada

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Las proporciones de probabilidades calculadas a partir de las transmisiones de padres heterozigotos a la descendencia afectada es menor de uno, lo que indica que los hombres heterozigotos transmiten A más frecuentemente que las mujeres heterozigotas. Como esto se basa tan sólo en padres heterozigotos, este efecto no puede ser debido a diferencias en las distribuciones de genotipo de hombres y mujeres. Parece que existe una pequeña diferencia en este efecto entre los DR3/DR4 y los no DR3/DR4, pero no hay una evidencia suficiente para estar seguro. No existe una diferencia visible en la transmisión entre los no afectados, pero hay pocos datos.

Transmisión del Alelo TCF-1

Un método para detectar los efectos alélicos es mediante el análisis de las tasas de transmisión de alelos. Si los alelos no están asociados con la enfermedad, entonces se esperaría que los alelos A y C se transmitieran, por ejemplo, de uno de los padres heterozigotos a un descendiente afectado con una proporción de 50:50. Las desviaciones en las tasas de transmisión indican una asociación de un alelo con la enfermedad.

Se han propuesto una serie de pruebas estadísticas para analizar las desviaciones en las tasas de transmisión de alelos. Por ejemplo, la prueba del desequilibrio en la transmisión (TDT) se describe en Spielman et al., 1993, Am. J. Hum. Genet. 52:506-516; Ewens y Spielman, 1995, Am. J. Hum. Genet. 57:455-464; y Ewens y Spielman, 1999, Suplemento 20 en Current Protocols in Human Genetics (Dracopoli et al., Eds., 1984 con actualizaciones trimestrales, John Wiley & Sons, Inc.). En particular, Speilman et al., 1993, discute las propiedades estadísticas del TDT aplicado a familias que contienen dos descendientes afectados.

En el presente caso, se llevó a cabo un análisis basado en las transmisiones de alelo A frente a alelo C. Esta proporción A/C, proporciona una medida de riesgo relativo, aunque algo distorsionado por la determinación de pares afectados con padres no afectados. Se utilizó un análisis de re-muestreo para evaluar la significación. La utilización de la proporción de transmisiones es equivalente a un análisis basado en la proporción de transmisiones de A debido a que hay una correspondencia uno-a-uno entre A/C y A/(A+C).

En el primer caso, los riesgos relativos se calcularon para los subgrupos definidos por el estado de la enfermedad de la descendencia, el genotipo HLA de la descendencia y el origen materno/paterno del alelo transmitido. Las abreviaturas utilizadas en la tabla, a continuación, son: af= descendencia afectada; naf = descendencia no afectada; 34 = genotipo de la descendencia DR3/DR4; n34 = genotipo de la descendencia no-DR3/DR4; m = origen materno; y p = origen paterno.

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Riesgos relativos (RR) calculados a partir de TDT

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Los únicos resultados claramente significativos son los de los padres de afectados DR3/DR4 y no DR3/DR4. El resultado de las madres de no afectados no DR3/DR4 es ligeramente sugestivo.

Los riesgos relativos también se calcularon en base a los subgrupos definidos mediante combinaciones de las categorías anteriores, como se muestra en la tabla a continuación.

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Riesgos relativos (RR) calculados a partir de TDT (datos agrupados)

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El aumento de la transmisión del alelo A de los padres a la descendencia afectada es altamente significativo. También existe una significación marginal de otros grupos que incluyen alguno de los padres de afectados. Para los padres de afectados, se estima que el riesgo relativo es de 1,64. Esto representa el riesgo de ser uno en un par de hermanos afectados. También, debe notarse que el número incluye los hijos afectados extra.

La transmisión entre los afectados, entre los no DR3/DR4 y de los padres, está en el intervalo de algo a muy significativa. La transmisión de los padres presenta el resultado más significativo. Parece que la transmisión aumentada puede aislarse tan sólo a los padres de afectados. El ligero aumento de A transmitido a los no afectados puede ser debido al azar.

Reparto de riesgo

El siguiente análisis se llevó a cabo para repartir los efectos del ligamiento y los efectos de la asociación para determinar si el locus TCF-1 está relacionado de forma causal con la diabetes tipo 1 o si está en un desequilibrio de ligamiento con algún otro locus relacionado de forma causal. El análisis está basado en los 51 padres heterozigotos y las correspondientes parejas de hermanos afectados. La descendencia extra afectada no se incluye.

AA, AC y CC representan las frecuencias con las que los padres heterozigotos transmiten un alelo A a ambos hermanos, un alelo A a un hermano y un alelo C al otro hermano, o un alelo C a ambos hermanos, respectivamente. Si no hay un efecto genético, las frecuencias de transmisión esperadas son 0,25 AA, 0,5 AC, y 0,25 CC. Las frecuencias de transmisión observadas fueron de 19,25 AA, 25 AC y 6,75 CC. Los números observados no son números enteros debido a que, cuando el genotipo parental no permite una determinación segura del alelo parental que se ha transmitido, se asigna una frecuencia de transmisión decimal basada en la probabilidad del suceso. Por ejemplo, una familia en la que ambos hermanos recibieron un alelo A del padre o, con la misma probabilidad, un hermano recibió un alelo A del padre y uno de la madre, contribuiría 0,5 a la frecuencia calculada con la que los padres heterozigotos transmiten un alelo A a ambos hermanos, AA.

Considérense las siguientes proporciones para medir el efecto genético:

AA/CC, \ AC/CC, \ AC/AA, \ \frac{AA \cdot CC}{AC \cdot AC} \ y \ \frac{AA + CC}{AC}

AA/CC es una medida del riesgo relativo del alelo A, causado por el locus TCF-1 o un locus en desequilibrio de ligamiento con TCF-1. AC/CC es una medida del riesgo relativo de hermanos con alelos A que no comparten alelos con su hermano afectado en comparación con los hermanos con alelos C que sí los comparten. (AA.CC)/AC^{2} es una medida del riesgo relativo debido al ligamiento una vez se conoce el alelo TCF-1. Estas dos últimas proporciones proporcionan una visión de si el TCF-1 es el locus causal. (AA+CC)/AC es una medida del riesgo relativo de hermanos que poseen alelos idénticos por descendencia (IBD) en comparación con los no IBD.

p es el riesgo asociado con el alelo A y r el riesgo asociado con el alelo C. Estos riesgos pueden ser debidos al alelo en sí o al desequilibrio de ligamiento con un alelo causal en un locus ligado. s es el riesgo añadido a la pareja de hermanos debido a sus alelos compartidos en TCF-1 dado que el genotipo TCF-1 ya se conoce. t es el riesgo añadido a las parejas que no comparten alelos. Dados los alelos transmitidos, el riesgo de las parejas AA es p^{2}s, de las parejas AC es prt, y de las parejas CC es r^{2}s.

Se utilizaron varias proporciones, mostradas en la tabla a continuación, que miden el efecto genético para comprobar los valores relativos de los diferentes riesgos. Los valores esperados de las proporciones, también indicados en la tabla a continuación, pueden calcularse en términos de los valores anteriores para los riesgos de las parejas AA, parejas AC y parejas CC. Los límites de los resultados de este estadístico puede predecirse bajo varias hipótesis, que se muestran en la tabla siguiente. Cuando sean predecibles, los límites para estos estadísticos se muestran en la tabla siguiente.

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Predicción de resultados

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Cuando existen dos loci causales (hipótesis D y E), la dirección de la alternativa depende del riesgo relativo de los dos loci, el grado de ligamiento, y del grado y dirección del desequilibrio de ligamiento entre los loci.

A continuación están los resultados calculados de los datos de TCF-1.

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Reparto del Riesgo de las Parejas de Hermanos Afectados de Padres Heterozigotos

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AA/CC es mayor de lo esperado bajo la hipótesis nula, que muestra una asociación específica de riesgo con el alelo A, ya sea a través del locus TCF-1 o un locus en desequilibrio de ligamiento con TCF-1. AC/CC es mayor de lo esperado bajo la hipótesis nula, que muestra que los hermanos con alelos A que no comparten alelos con su hermano afectado están en un mayor riesgo que los hermanos con alelos C que sí comparten alelos. Esto sugiere que TCF-1 es de hecho un locus causal. AC/AA es menor de lo esperado bajo la hipótesis nula, de forma consistente con los resultados previos que muestran que una identidad por descendencia (IBD) de A está en un riesgo mayor que un C no IBD. (AA\cdotCC)/AC2 está ligeramente por debajo de su valor esperado bajo la hipótesis nula, lo que muestra que no hay un riesgo añadido debido al ligamiento una vez se conoce el alelo TCF-1. Estos resultados son consistentes con que no haya otro locus causativo ligado, además o en lugar de TCF-1. (AA+CC)/AC mide el riesgo del estado IBD vs. el estado no IBD. Éste es ligeramente mayor a lo esperado bajo la hipótesis nula, pero es consistente con la hipótesis nula.

Los valores de (AA+CC)/AC y AA/CC pueden resolverse para tener estimaciones del riesgo relativo de A frente a C, que es p/r. S es el valor del estadístico de (AA+CC)/AC. Entonces, la estimación de p/r es (s\pm\surds^{2}-1)r. T es el valor observado de AA/CC. Entonces, otra estimación de p/r es \surdT.

La estimación del riesgo relativo del alelo A frente al alelo C basado en S es de 1,33; la estimación basada en T es de 1,69. Ambas estimaciones sugieren un cierto aumento del riesgo asociado con el alelo A. El límite superior de los intervalos de confianza de 80, 90, y 95% para p/r derivado de S son 2,45, 2,80 y 3,70. Los límites inferiores no pueden evaluarse, pero los intervalos incluyen 1. Los intervalos de confianza para p/r basados en T pueden encontrarse calculando la raíz cuadrada de los intervalos dados en la tabla para AA/CC. Los límites superiores son bastante consistentes con los intervalos basados en S, pero el límite inferior no incluye el valor nulo de 1. Los intervalos de confianza incluyen la posibilidad, pero no la probabilidad, de que el riesgo relativo pueda ser tan grande como 3.

Conclusiones

Basado en el análisis anterior, se detallan las siguientes conclusiones.

1. Distribución de TCF-1 en la población general.

(a)

No existen evidencias de desequilibrio de Hardy-Weinberg en el locus TCF-1.

(b)

No existen evidencias de asociación entre TCF-1 y los grupos serológicos DRB1 03, 04 y X.

(c)

Las mujeres parecen ser portadoras del alelo A con más frecuencia que los hombres.

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2. El riesgo de diabetes tipo 1 está asociado con TCF-1.

(a)

En general, los padres heterozigotos transmiten el alelo A a sus hijos afectados más frecuentemente que el alelo C, lo que indica una asociación del alelo A con esta enfermedad.

(b)

El aumento de la transmisión del alelo A a los hermanos no afectados de hijos afectados no es estadísticamente significativo y es más probable que sea debido al azar.

(c)

Los hombres heterozigotos transmiten el alelo A a sus hijos afectados más frecuentemente que el alelo C, probablemente sin tener en cuenta el estado DRB1 3/4 del hijo, lo que indica la asociación del alelo A de origen parental con la enfermedad.

(d)

Las mujeres heterozigotos transmiten ambos alelos en la misma proporción a sus hijos afectados.

(e)

Basado en evidencias limitadas, los padres heterozigotos y las madres de hijos afectados transmiten ambos alelos en la misma proporción a su descendencia no afectada.

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3. Riesgo de TCF-1 vs. riesgo de otro loci vecinos.

(a)

Los padres heterozigotos transmiten el alelo A a ambos miembros de la pareja de hermanos afectados más frecuentemente que el alelo C, confirmando el aumento del riesgo asociado con el alelo A.

(b)

Los padres heterozigotos de una pareja de hermanos afectados transmiten ambos alelos, es decir, un A y un C, más del doble la frecuencia de lo que suelen transmitir dos copias del alelo C, lo que es más frecuente de lo que sucedería por azar. Esto sugiere que existe más riesgo de recibir el alelo A que el mismo alelo que tu hermano afectado, apoyando que TCF-1 es el locus inductor del riesgo.

(c)

Los padres heterozigotos de una pareja de hermanos afectados transmiten ambos alelos menos del doble la frecuencia de lo que transmiten dos copias del alelo A, que es menos frecuente que lo que sucedería por azar y es consistente con los resultados de 3.a y 3.b.

(d)

No existe un riesgo añadido debido a la identidad por descendencia con un hermano afectado más allá de lo que contribuye el alelo A, lo que es consistente con que no hay otro loci relacionado con el riesgo ligado a TCF.

(e)

El riesgo relativo debido a la recepción del alelo A en lugar de un alelo C del propio padre, se estimó utilizando dos mediciones diferentes de 1,33 y 1,69, respectivamente. Precisamente, el riesgo medido es el riesgo de estar afectado de diabetes tipo 1 y simultáneamente tener un hermano con diabetes tipo 1. Los intervalos de confianza sugieren que los datos son compatibles con valores de riesgo relativo en el intervalo de 1,2 a cerca de 3.

En general, los datos son más consistentes con un aumento moderado del riesgo de padecer diabetes tipo 1 en hijos que reciben un alelo A de TCF-1 de sus padres. Este aumento del riesgo probablemente no depende del estado de DRB1 3/4. No parece que exista un riesgo añadido cuando el alelo A se recibe de la propia madre. Los datos indican que no hay otros loci relacionados con el riesgo ligados a TCF-1. Las mujeres en la población general parecen tener una mayor frecuencia del alelo A de TCF-1 que los hombres.

Todas las muestras se re-tipificaron posteriormente utilizando los métodos de line-blot inverso descritos en el Ejemplo 2. Con la excepción de una muestra, ambos protocolos proporcionaron genotipos consistentes. El único resultado discrepante se cree que apareció como resultado de una mezcla de muestras, en lugar de error de tipificación. Durante este posterior análisis, se descubrió que un pequeño número de los genotipos determinados originalmente, aunque correctos, se registraron de forma incorrecta en una base de datos de un ordenador. El análisis estadístico descrito antes se llevó a cabo utilizando los datos tal y como se introdujeron. Está claro que los errores en la entrada de datos son tan mínimos que las conclusiones estadísticas siguen siendo válidas.

Ejemplo 6 Asociación con la Diabetes de tipo 1 en Familias Americanas Mexicanas (Resultados Preliminares)

Se analizaron sesenta y tres familias Americanas Mexicanas con descendencia afectada de diabetes de tipo 1 esencialmente como se ha descrito en el ejemplo anterior. Toda la genotipificación de TCF-1 se llevó a cabo utilizando los métodos de genotipificación basados en la amplificación específica de alelo descritos en el Ejemplo 1. Como el tamaño de muestras es significativamente menor, estos resultados deben considerarse preliminares.

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Genotipos parentales

25

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Frecuencias del alelo TCF-1 en los padres

26

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Las tasas de transmisión se determinaron a partir de los genotipos de 21 descendientes afectados de padres AC,CC. Los genotipos esperados y observados se muestran a continuación, junto con las tasas de transmisión calculadas. La frecuencia del genotipo AC proporciona la tasa de transmisión del alelo A, y la frecuencia del genotipo CC proporciona la tasa de transmisión del alelo C.

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27

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Los resultados anteriores, aunque no son estadísticamente significativos, pueden sugerir una tendencia que es opuesta a la tendencia observada en el gran estudio presentado en el ejemplo anterior. Es posible que este refleje una diferencia entre las poblaciones estudiadas. No obstante, dado el pequeño número de hermanos afectados genotipificados (21 en total), es más probable que el resultado sea un artefacto estadístico.

Los resultados en el ejemplo anterior indican que el efecto del genotipo TCF-1 es pequeño, y que puede necesitar poblaciones de estudio mayores para determinar sin ambigüedades el efecto. Además, el efecto puede estar enmascarado por los efectos más significativos del genotipo HLA. El presente estudio no fue lo suficientemente extenso como para permitir la estratificación mediante el genotipo HLA, como se hizo en el ejemplo anterior. La verificación de la tendencia sugerida es de esperar que necesite una población en estudio significativamente mayor.

Ejemplo 7 Asociación con la Esclerosis Múltiple

La genotipificación de TCF-1 se llevó a cabo en individuos de dos grupos de familias escogidos ya que contenían un único descendiente afectado con esclerosis múltiple (EM). El primer grupo consistía en 180 familias, la mayoría caucásicas, pero que contenía familias de otras etnias. El segundo grupo consistía en 74 familias españolas. La genotipificación de TCF-1 de los hijos afectados y de ambos padres no afectados se llevó a cabo utilizando los métodos de genotipificación basados en sondas descritos en el Ejemplo 2. La distribución de los genotipos parentales y las frecuencias del alelo A, f(A), se muestran en la tabla, a continuación.

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28

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Transmisión de los Alelos de TCF-1: Grupo 1

Las tasas de transmisión de alelos se analizaron considerando tan sólo las familias informativas, es decir, las familias en las que existe al menos un padre heterozigoto. En el Grupo 1, 53 de las familias tienen un padre heterozigoto y uno homozigoto. En estas familias, se contó el número de alelos A transmitidos, de los 53 alelos informativos transmitidos del padre heterozigoto; y los 53 alelos transmitidos de los padres homozigotos fueron no informativos y no se consideraron. En 11 familias, ambos padres son heterozigotos. En estas familias, se contó el número de alelos A de los 22 alelos transmitidos de ambos padres a los 11 descendientes. En ambos casos, bajo la hipótesis nula de no efecto genético, los alelos A y C se transmitirían con la misma probabilidad, proporcionando una proporción esperada de 50:50. Las desviaciones en las tasas de transmisión indican la asociación de un alelo con la enfermedad. La significación de las desviaciones se analizó utilizando una prueba de chi-cuadrado. Además, a causa de que bajo la hipótesis nula, las transmisiones de alelos están distribuidas de forma binomial, con una probabilidad de transmitir un alelo A de 0,5, puede determinarse la probabilidad exacta. Se calculó la probabilidad de una desviación en las tasas de transmisión al menos tan grande como la observada,

Probabilidad \ \{ | X-\mu | \geq | f(A)-\mu | \},

en la que f(A) es la frecuencia observada de las transmisiones de A y m es el valor esperado de f(A), lo que corresponde a una prueba estándar de dos colas de la hipótesis nula.

Los datos de transmisión de alelos de las 64 familias informativas de las 180 familias del Grupo 1 se muestran en la siguiente tabla.

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Transmisiones de Alelos, Grupo 1

29

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De un total de 75 eventos de transmisión de alelos, el alelo A se transmitió 47 veces y el alelo C se transmitió 28 veces. Los valores esperados de las transmisiones de alelos bajo la hipótesis nula serán de 37,5 para cada alelo. Una prueba de chi-cuadrado de la significación proporcionó un valor P de 0,028. La probabilidad de observar una desviación en las tasas de transmisión al menos tan grande como la observada, obtenida directamente de una distribución binomial, proporcionó un valor P de dos colas de 0,037. Los resultados indican que el aumento de la transmisión de los alelos A a la descendencia afectada es estadísticamente significativa.

Asociación con el genotipo HLA

Se sabe que el haplotipo HLA DRB1*1501-DQB1*0602 ("DR15") está asociado con un aumento de la susceptibilidad a padecer EM (véase, por ejemplo, Oksenberg et al., 1993, JAMA 270:2362-2369). Para determinar si los alelos en estos dos loci, TCF-1 y HLA, interactúan para determinar la susceptibilidad de padecer EM, se determinaron los genotipos HLA y se estratificaron los datos en base al genotipo HLA de la descendencia. De los 64 descendientes en las familias informativas, 33 fueron DR15 y 31 no fueron DR15.

Los datos de transmisión de alelos de las 33 familias informativas en las que la descendencia posee el genotipo DR15, seleccionados de las familias del Grupo 1, se muestran en la siguiente tabla.

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Transmisiones de Alelos a la Descendencia DR15

30

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De los 40 alelos transmitidos a la descendencia DR15, 25 fueron alelos A y 15 fueron alelos C. Bajo la hipótesis nula de no efecto genético, las transmisiones esperadas serían de 20 de cada.

Los datos de transmisión de alelos de las 31 familias informativas en que la descendencia no posee el genotipo DR15, seleccionados de las familias del Grupo 1, se muestran en la siguiente tabla.

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Transmisiones de Alelos a la Descendencia no DR15

32

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De los 35 alelos transmitidos a la descendencia no DR15, 22 fueron alelos A y 13 fueron alelos C. Bajo la hipótesis nula de no efecto genético, las transmisiones esperadas serían de 17,5 de cada.

En general, las variables aleatorias W y Z son independientes si la probabilidad de W condicionada al valor de Z es igual a la probabilidad de W (no condicional). Utilizando las frecuencias observadas como estimaciones de las probabilidades, es aparente que el efecto del alelo A y el genotipo DR15 es independiente. En particular, la frecuencia condicional de transmisión del alelo A, dado que la descendencia es DR15 (25/40 = 0,625), es virtualmente idéntica a la frecuencia no condicional de transmisión del alelo A (47/75 = 0,627). De forma similar, la frecuencia condicional de transmisión, dado que la descendencia no es DR15 (22/35 = 0,629), es virtualmente idéntica a la frecuencia no condicional de transmisión. Estos resultados indican que los efectos de los genotipos TCF-1 y DR15 son independientes. Esta conclusión está apoyada por una prueba de chi-cuadrado de significación de la independencia de los genotipos TCF-1 y DR15, lo que proporciona un valor P de 0,97 (ver las tablas 2x2, a continuación).

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Prueba de Independencia de TCF-1 y DR15

33

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34

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Transmisión de Alelos de TCF-1: Grupos 1 y 2

El Grupo 2 consiste en 74 familias informativas con EM simplex de origen español. Estas familias se tipificaron sólo para TCF-1. Los datos de transmisión de alelos se muestran en la tabla, a continuación.

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Transmisiones de Alelos, Grupo 2

35

Debido a los números tan bajos, los datos se combinaron con los datos del Grupo 1 y las tasas de transmisión de alelo se analizaron como se ha descrito antes. Se observaron un total de 103 transmisiones de alelo combinadas, 28 de las familias del Grupo 2 y 75 de las familias del Grupo 1. Bajo la hipótesis nula, el número esperado de alelos A y C transmitidos sería de 51,5 cada uno. Por el contrario, 63 alelos A fueron transmitidos y 40 alelos C fueron transmitidos. Una prueba de chi-cuadrado de la significación proporcionó un valor de P de 0,023. La probabilidad de observar una desviación en las tasas de transmisión al menos tan grande como la observada, se calculó a partir de una distribución binomial, lo que proporcionó un valor P de dos colas de 0,030. Los resultados son consistentes con los datos obtenidos a partir del Grupo 1 e indican una asociación estadísticamente significativa del alelo A con la EM.

Ejemplo 8 Asociación con Asma y Atopia

Este ejemplo describe los resultados de un estudio de la asociación entre el genotipo TCF-1 y el asma y la atopia.

El asma es una enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias del pulmón, que se reconoce normalmente mediante un diagnóstico médico. Con el asma se asocia una hiper-responsividad bronquial no específica. La responsividad bronquial se mide normalmente mediante la respuesta del flujo respiratorio a dosis de un bronco-constrictor, como la metacolina.

La atopia (a menudo referida indistintamente como alergia), provocada por la reacción inmune a los alérgenos, se tipifica por la intensidad de la respuesta de IgE frente a un alérgeno. La atopia normalmente se reconoce clínicamente mediante pruebas de punciones cutáneas, que indican la presencia de IgE específicas de alérgeno, mediante la presencia de IgE específicas de alérgeno en el suero, mediante el aumento de la IgE en suero total, o mediante la presencia de eosinófilos en sangre.

Aunque el asma a menudo se asocia con la atopia, es improbable que el asma sea una única enfermedad. La mayoría de niños asmáticos también son atópicos. Por el contrario, la aparición de asma en adultos es una enfermedad peor definida, que a menudo no está asociada con atopia. Además, los individuos atópicos difieren en los alérgenos a los que reaccionan, y el asma y la hiper-responsividad bronquial están asociadas con la alergia a antígenos del ácaro del polvo, pero no con los del polen de la hierba.

Se sabe que el asma y la atopia tienen una base genética y es probable que estén influenciadas por una serie de genes con efectos moderados. Las enfermedades como el asma es probable que se deban a variantes alélicas en los genes que alteran la función génica de forma sutil, en lugar de eliminar la función. No obstante, la base genética permanece aún por descubrir.

Sujetos

Se estudiaron dos paneles de familias. El panel A consistió en 447 individuos británicos de 66 genealogías nucleares y 5 extendidas elegidas por los miembros de la familia con asma o rinitis. El panel B consistió en 401 individuos australianos de 88 familias nucleares cada una con 2 o más hermanos atópicos identificados a partir de una muestra de población aleatoria. Estos paneles se describen en Moffat et al., 1994, Lancet 343:1597-1600. La población y las características se midieron como se describe también en Daniels et al., 1996, Nature 383(19):247-250.

Datos Clínicos

Las variables analizadas se muestran en la siguiente tabla.

36

Las variables anteriores están todas correlacionadas positivamente. En ambos grupos, la atopia, lige, dige, iger, psti y rasti están fuertemente correlacionadas de forma positiva (lige, dige e iger están relacionadas por definición). Las correlaciones de estas variables con el asma y los silbidos son menos fuertes. Como se ha dicho antes, el asma es una enfermedad pobremente definida que puede presentar múltiples etiologías, lo que incluye enfermedades no asociadas con la atopia. Esto puede estar relacionado con la mayor correlación con las variables que miden los niveles de IgE y que están más directamente relacionadas con la atopia.

Genotipificación

El genotipo de cada individuo se determinó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1, anteriormente, con la excepción de que se realizaron ligeras modificaciones en las condiciones de reacción para optimizar el ensayo para su uso con un termociclador diferente. Las diferencias entre el ensayo descrito en el Ejemplo 1 y las condiciones utilizadas realmente pueden afectar potencialmente la amplificación y la eficiencia de detección, pero probablemente no alterará el resultado cualitativo del ensayo.

Análisis

Los datos se analizaron para detectar la presencia de efectos genéticos, en lugar del alcance del efecto. La ausencia de un efecto genético indicará que ninguno de los locus de TCF-1 ni ningún locus ligado, afectan de forma directa a ninguna de las variables fenotípicas o cualquier otra característica que conduce a la elección de la familia.

Se utilizaron métodos de TDT (prueba de desequilibrio en la transmisión) análogos a los métodos descritos anteriormente para el análisis de la asociación de alelos TCF-1 con la diabetes tipo 1. Para la TDT se utilizaron todas las transmisiones de alelo informativas de un padre heterozigoto a un hijo, en las que se proporcionaron genotipos válidos de los tres miembros del trío padres-hijo. Se asumió que, condicionado a la estructura de la genealogía y de la heterozigosidad parental, los resultados de estas transmisiones informativas fueron más o menos independientes bajo las hipótesis nulas de no efecto genético. En general, las muestras parecieron lo suficientemente grandes para utilizar resultados estadísticos para muestras grandes.

Para las variables discretas; asma, silbidos y atopia; los valores p se obtuvieron a partir de una prueba exacta de proporciones. Para las variables continuas, que incluyen las diferentes mediciones de la respuesta de IgE, se utilizaron pruebas t y pruebas de sumatorio del rango de Wilcoxon para comparar los valores de las variables continuas en hijos que han recibido un alelo A frente a los valores en hijos que han recibido un alelo C. Sólo se incluyeron los hijos con un padre heterozigoto.

Resultados 1. Datos británicos

Los datos británicos contenían 47 tríos informativos de padres-hijo en 17 genealogías. De estos, 3 tenían dos padres heterozigotos, 28 tenían sólo un padre heterozigoto y 16 tenían una madre heterozigota. Las distribuciones de genotipo se muestran a continuación.

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Distribución de Genotipo (Británico)

38

Estas familias no presentan diferencias obvias en la distribución de genotipo entre hombres y mujeres.

Variables Discretas

Las transmisiones de alelo de padres heterozigotos a hijos distribuidos en categorías por el estado de su enfermedad se muestran en la siguiente tabla. Se muestran tanto el número (Núm.) como la proporción (%). Los alelos transmitidos de los padres y las madres se describen por separado. Para la categoría "todos", los hijos se clasificaron como receptores de un alelo A si cualquier padre heterozigoto transmitió un alelo A. Esto posee la ventaja de realizar cada cuenta independiente ya que así dos contajes no representan el mismo hijo. (Los hijos con dos padres heterozigotos no se cuentan dos veces.) Como consecuencia, el número de alelos transmitidos por los padres y madres no se añade al número en la categoría "todos".

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Transmisiones de Padres Heterozigotos (Británicos)

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39

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Todos los valores p son exactos. No se observó una asociación significativa en la transmisión del alelo A con el asma o estado atópico de los hijos, fuera la transmisión del padre, madre o cualquiera de los dos.

Variables Continuas

Los valores p de la prueba t y de la prueba del sumatorio de rango de Wilcoxon para las variables continuas se muestran a continuación. Los valores p de la prueba del sumatorio de rango de Wilcoxon se muestran entre paréntesis. Ambas pruebas midieron la asociación de los niveles de IgE con la transmisión de un alelo A versus un alelo C. En todos los casos, los valores mayores de las variables estaban asociados con la transmisión del alelo C.

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Variables Continuas (Británicos)

41

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Los datos sugieren una asociación de varias variables con el alelo transmitido por el padre, en comparación con el transmitido por la madre. Los valores p para los padres es menor (más significativo) que los valores p para las madres para todas las variables con la excepción de rasti. De forma interesante, los valores p para la categoría "todos", aunque por un corto margen, son menores que los valores p separados de padres y de madres. Si hubiera una diferencia para los padres pero no para las madres, se podría esperar que los valores p de "todos" fueran superiores a los valores p de los "padres", ya que la inclusión de las madres diluyera el efecto. Pero este no es el caso. En general, los datos sugieren que puede haber una fuerte asociación con el alelo transmitido por el padre en comparación con el transmitido por la madre.

2. Datos australianos

La población australiana del estudio contenía 76 tríos informativos en 88 genealogías. De estas, 9 tenían dos padres heterozigotos, 27 tenían un padre heterozigoto y 40 tenían solo una madre heterozigota. La distribución del genotipo se muestra a continuación.

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Distribución de Genotipo (Australiano)

42

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Variables Discretas

Las variables categóricas de las enfermedades consideradas en la población australiana fueron asma, silbidos y atopia. Las transmisiones de alelo a partir de padres heterozigotos se resumen en la siguiente tabla. Se muestran tanto el número (Núm) como la proporción (%). La categoría "todos" es como se ha definido para los datos británicos anteriores.

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Transmisiones de Padres Heterozigotos (Australianos)

43

Variables Continuas

Los valores p de la prueba t y de la prueba de la suma de rango de Wilcoxon para las variables continuas se muestran más abajo. Los valores p de la prueba de la suma de rango de Wilcoxon se muestran entre paréntesis. Ambas pruebas midieron la asociación de los niveles de IgE con la transmisión de un alelo A versus un alelo C. En todos los casos, los valores más grandes de las variables estaban asociados con la transmisión del alelo C.

\newpage

Variables Continuas (Australianos)

44

Los datos sugieren una asociación de varias variables con el alelo transmitido. Los valores p son significativos marginales para ambos padres y madres y para psti y rasti. Para lige, dige e iger, los valores p son marginales para los padres.

3. Datos agrupados Variables Discretas

La asociación del alelo transmitido con atopia se analizó en profundidad utilizando los datos combinados. Los resultados se muestran a continuación.

Transmisiones de Padres Heterozigotos (combinados)

45

Como se ha dicho antes, los datos para las variables discretas en las poblaciones individuales, incluyendo atopia, son consistentes con la ausencia de un efecto genético, mientras que los datos para las variables continuas sugieren un efecto genético. Las variables continuas están relacionadas con la respuesta de IgE y se utilizaron en categorizar un individuo como atópico. La falta de un efecto genético observado, aún en los datos combinados, puede resultar del bajo número de hijos no atópicos de padres heterozigotos en la población del estudio, en lugar de una ausencia real de efecto genético. Los métodos utilizados para analiza las variables continuas están menos afectados por el bajo número de individuos en esta categoría y, así, tendrán probablemente un mayor poder para identificar un efecto genético.

Variables Continuas

Los valores p de la prueba t y de la prueba de la suma de rango de Wilcoxon para las variables continuas se muestran más abajo. Los valores p de la prueba de la suma de rango de Wilcoxon se muestran entre paréntesis. Ambas pruebas midieron la asociación de los niveles de IgE con la transmisión de un alelo A versus un alelo C. En todos los casos, los valores más grandes de las variables estaban asociados con la transmisión del alelo C.

Variables Continuas (combinadas)

47

Los datos combinados indican que existen asociaciones significativas del alelo TCF-1 con los valores de las variables. Los datos sugieren un efecto significativo en ambos géneros para psti y rasti. También existe un efecto significativo para el alelo transmitido de los padres, pero no para el alelo transmitido por las madres, para lige, dige e iger.

Conclusiones

Los datos británicos parecen consistentes con una ausencia de efectos genéticos que contribuyan a la presencia o ausencia de asma y atopia. Los datos sugieren un efecto genético en las medidas específicas de la respuesta IgE, como se ha medido por las variables continuas. Los datos sugieren que existe una asociación entre el alelo transmitido del padre heterozigoto de cualquier sexo sobre psti y rasti, y entre el alelo transmitido de un padre heterozigoto sobre lige, dige e iger.

El patrón para los datos australianos es similar al de los datos británicos. Los datos parecen ser consistentes con una ausencia de efectos genéticos que contribuyan a la presencia o ausencia de asma, silbidos y atopia. Los datos sugieren un efecto genético en las medidas específicas de la respuesta IgE. Los datos sugieren que existe una asociación entre el alelo transmitido del padre heterozigoto de cualquier sexo sobre psti y rasti, y entre el alelo transmitido de un padre heterozigoto sobre lige, dige e iger.

Las tendencias observadas en las poblaciones individuales están indicadas de forma más clara por los datos combinados. Como en el caso de los datos de las poblaciones separadas, los datos combinados también parecen ser consistentes con una ausencia de efectos genéticos que contribuyan a la presencia o ausencia de atopia. No obstante, los datos combinados indican más claramente que existen asociaciones significativas del alelo TCF-1 transmitido con las medidas específicas de la respuesta IgE. Los datos combinados indican una asociación significativa entre el alelo transmitido del padre heterozigoto de cualquier sexo sobre psti y rasti, y entre el alelo transmitido de un padre heterozigoto sobre lige, dige e iger. La asociación está entre el alelo C y un aumento de la respuesta IgE.

Como se ha dicho antes, el asma es una enfermedad pobremente definida que puede presentar múltiples etiologías, que incluye enfermedades no asociadas con la atopia. Como TCF-1 es parte de la ruta que afecta a la producción de IgE, se puede hipotetizar que cualquier efecto del alelo TCF-1 se manifestará sólo en las enfermedades inflamatorias mediadas por Th2, como el asma atópico, y que el efecto del alelo no jugará un papel en otras formas de asma. Los datos presentes aquí, que indican una asociación del alelo TCF-1 con la respuesta IgE aunque no sea aparente un efecto sobre el asma, como se define aquí de forma imprecisa, son consistentes con esta hipótesis.

La asociación significativa del alelo TCF-1 con la respuesta IgE indica que la genotipificación del locus TCF-1 puede proporcionar información útil en la caracterización de la probabilidad del asma atópico y otras enfermedades inflamatorias mediadas por Th2. En particular, los datos indican que es más probable que los individuos que han recibido un alelo C paterno generen una respuesta elevada de IgE y pueden indicar que el individuo tiene un riesgo aumentado de sufrir una enfermedad mediada por Th2.

Debido a la compleja y todavía gran desconocida base genética del asma y de las enfermedades inflamatorias en general, se espera identificar otros loci que afecten la probabilidad de una enfermedad mediada por Th2. Se espera que el genotipo TCF-1 sea más informativo en combinación con la información del genotipo de uno o más loci que puedan estar asociados con una enfermedad mediada por Th2.

<110> Roche Diagnostics GmbH F.Hoffmann-La Roche AG

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<120> Variación en la secuencia de nucleótidos de TCF-1

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<130> 5469/00/EP

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<150> US 219812

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<151> 2000-07-12

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<160> 9

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<170> Patent In Ver. 2,1

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<210> 1

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<211> 2855

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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48

49

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<210> 2

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccaggtcctt cccctaa

\hfill

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

tccaggtcct tcccctaaaa

\hfill

20

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<210> 4

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

catgcattac ccaccca

\hfill

17

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<210> 5

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<211> 14

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctgctcccg aggg

\hfill

14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcggggtcca cttacca

\hfill

17

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<210> 7

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

tactccgcct tcaatctgct ca

\hfill

22

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<210> 8

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Sonda

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

attacccacc cccctcggga

\hfill

20

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<210> 9

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Sonda

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaggtggg tgggtaat

\hfill

18

Claims (10)

1. Un método para la caracterización de un individuo como poseedor de un factor que contribuye a un riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th1 o un riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th2, y dicho método comprende: (a) la determinación del genotipo de dicho individuo respecto al nucleótido presente en la posición 883 del gen TCF-1, y dicha secuencia génica se proporciona como Id. de Sec. Nº:1; (b) la clasificación de dicho paciente en base al resultado obtenido en el paso (a), en el que la presencia del alelo A indica un factor que contribuye al riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th1, y la presencia del alelo C indica un factor que contribuye al riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th2.

2. El método de la reivindicación 1 para la caracterización de un individuo como poseedor de un factor que contribuye a un riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th1, y dicho método comprende: (a) la determinación del genotipo de dicho individuo respecto al nucleótido presente en la posición 883 del gen TCF-1, y dicha secuencia génica se proporciona como Id. de Sec. Nº:1; (b) la clasificación de dicho paciente en base al resultado obtenido en el paso (a), en el que la presencia del alelo A indica un factor que contribuye al riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th1.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha enfermedad mediada por Th1 es la diabetes tipo 1 o la esclerosis múltiple.

4. El método de la reivindicación 1 para la caracterización de un individuo como poseedor de un factor que contribuye a un riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th2, y dicho método comprende: (a) la determinación del genotipo de dicho individuo respecto al nucleótido presente en la posición 883 del gen TCF-1, y dicha secuencia génica se proporciona como Id. de Sec. Nº:1; (b) la clasificación de dicho paciente en base al resultado obtenido en el paso (a), en el que la presencia del alelo C indica un factor que contribuye al riesgo aumentado de padecer una enfermedad mediada por Th2.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha enfermedad mediada por Th2 es el asma alérgico o la atopia.

6. Un oligonucleótido aislado, siendo dicho oligonucleótido exactamente o sustancialmente complementario a una de las cadenas del Id. de Sec. Nº:1 en una región que incluye el lugar polimórfico en la posición nucleotídica 883, y siendo dicho oligonucleótido exactamente complementario al Id. de Sec. Nº:1 en dicha posición nucleotídica 883 y dicha región es de entre alrededor de 10 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud.

7. Un oligonucleótido aislado de la reivindicación 6 seleccionado de entre el grupo que consiste en (GZ351B) Id. de Sec. Nº:4, (GZ374B) Id. de Sec. Nº:5, (KW196) Id. de Sec. Nº:8, (KW118) Id. de Sec. Nº:9, y las complementarias exactas de los mismos.

8. La utilización de una sonda de oligonucleótido exactamente complementaria a un alelo que es el alelo A o el alelo C en una región que incluye la posición 883 del gen TCF-1 o un grupo de cebadores que comprenden un cebador específico de alelo, que es específico de un alelo que es el alelo A o el alelo C en la posición 883 del gen TCF-1 para la determinación del genotipo de una muestra respecto al nucleótido presente en el gen TCF-1 en la posición 883.

9. La utilización de la reivindicación 8, en la que dicha sonda de oligonucleótido se selecciona de entre el grupo de (KW 196) Id. de Sec. Nº:8 o (KW 118) Id. de Sec. Nº:9.

10. La utilización de la reivindicación 8, en la que dicho cebador específico de alelo es (GZ351B) Id. de Sec. Nº:4 o (GZ374B) Id. de Sec. Nº:5.