ES2279916T3 - Deteccion de susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes, especialmente a la diabetes tipo 1. - Google Patents
Deteccion de susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes, especialmente a la diabetes tipo 1. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2279916T3 ES2279916T3 ES03022242T ES03022242T ES2279916T3 ES 2279916 T3 ES2279916 T3 ES 2279916T3 ES 03022242 T ES03022242 T ES 03022242T ES 03022242 T ES03022242 T ES 03022242T ES 2279916 T3 ES2279916 T3 ES 2279916T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- il4r
- diabetes
- dddseqskip
- hskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un método para la determinación del riesgo de los individuos de padecer diabetes tipo 1, que comprende la detección de la presencia de al menos uno de los polimorfismos asociados a la diabetes tipo 1, A(-1512)C, C(-1112)T, C4045T y G4166A en el locus de IL13, como se lista en la Tabla 2, en una muestra de ácido nucleico del individuo, y en el que la presencia de dicho polimorfismo indica el riesgo de un individuo de padecer diabetes tipo 1.
Description
Detección de susceptibilidad a las enfermedades
autoinmunes, especialmente a la diabetes tipo 1.
La presente invención está relacionada con las
áreas de la inmunología y la biología molecular. En particular,
está relacionada con los métodos y reactivos para la detección del
riesgo de un individuo de padecer enfermedades autoinmunes. Más
específicamente, está relacionada con los métodos y reactivos para
la detección del aumento o reducción del riesgo de un individuo a
padecer diabetes tipo 1.
La respuesta inmunológica a un antígeno está
mediada a través de la diferenciación selectiva de células T
ayudantes precursoras CD4+ (Th0) a células T ayudantes efectoras
tipo 1 (Th1) o tipo 2 (Th2), con patrones funcionalmente diferentes
de secreción de citoquinas (también descritas como linfoquinas). Las
células Th1 secretan interleuquina 2 (IL-2),
IL-12, factor de necrosis tumoral (TNF), linfotoxina
(LT) e interferón gamma (IFN-\gamma) tras su
activación, y son principalmente responsables de la inmunidad
mediada por células, como la hipersensibilidad de tipo retardado.
Las células Th2 secretan IL-4, IL-5,
IL-6, IL-9 e IL-13
tras su activación, y son principalmente responsables de los
mecanismos de defensa extracelular. El papel de las células Th1 y
Th2 se revisa en Peltz, 1991, Immunological Reviews, 123:
23-35.
IL-4 e IL-13
tienen un papel central en las reacciones inflamatorias dependientes
de IgE.
La IL-4 induce la producción de
anticuerpos IgE por las células B y, además, proporciona una función
de regulación de la diferenciación de Th0 a células efectoras Th1 o
Th2 tanto mediante la promoción de la diferenciación a células Th2
como con la inhibición de la diferenciación a células Th1. La
IL-13 también induce la producción de anticuerpos
IgE por las células B.
Se ha asociado un SNP en la región del promotor
de la IL-4 con la diabetes tipo 1 (Ohkubo et
al., Diabetologia, vol. 44, supl. 1, pág. 80a, 2001).
IL-4 e IL-13
operan a través del receptor de IL-4 ("IL4R"),
que se encuentra tanto en células B como T, y del IL13R, que se
encuentra en células B, respectivamente. El receptor de
IL-4 humano (IL4R) es un heterodímero que comprende
la cadena \alpha de IL4R y la cadena \gamma del receptor de
IL-2. La cadena \alpha del receptor
IL-4 también funciona como cadena \alpha del
receptor de IL-13. IL-4 se une tanto
al IL4R como al IL13R a través de la cadena \alpha del IL4R y
puede activar tanto las células B como las T, mientras que la
IL-13 se une sólo al IL13R a través de la cadena
\alpha1 del IL13R y activa sólo las células T. Algunos SNP del
IL4R se han asociado con la diabetes tipo 1 (Bugawan et al.,
American Journal of Human Genetics, Vol. 69, nº 4, suplemento, pág.
403, 2001).
La presente invención proporciona los métodos
para la detección de un aumento o reducción del riesgo de un
individuo de sufrir una enfermedad autoinmune como la diabetes tipo
1, también conocida como diabetes mellitus
insulino-dependiente ("DMID"). La presente
invención también proporciona los equipos, reactivos y chips útiles
para la detección del riesgo de un individuo de padecer enfermedades
autoinmunes como la diabetes tipo 1.
La presente invención proporciona un método para
la detección del aumento o reducción del riesgo de un individuo de
sufrir una enfermedad autoinmune, como la diabetes tipo 1, mediante
la detección de la presencia de un polimorfismo asociado a la
diabetes tipo 1 en el locus de IL-13 en una muestra
de ácido nucleico de un individuo, en el que la presencia de dicho
polimorfismo indica el aumento del riesgo de un individuo de sufrir
diabetes tipo 1.
En una realización, se detectan un polimorfismo
del IL4R y un polimorfismo de IL-13. En otra
realización, se detectan un polimorfismo de IL-4 y
un polimorfismo de IL-13. En otra realización, se
detectan un polimorfismo del IL4R, un polimorfismo de
IL-4 y un polimorfismo de IL-13. El
polimorfismo de IL-13 se selecciona de entre los
polimorfismos de IL-13 que se listan en la Tabla 21.
El individuo puede pertenecer a cualquier raza o población. En una
realización, el individuo es un asiático, preferiblemente un
filipino, o un caucásico.
La muestra de ácido nucleico puede obtenerse a
partir de cualquier parte del cuerpo del individuo, lo que incluye,
pero no se limita al pelo, piel, uñas, tejidos o fluidos corporales
como la saliva, sangre, etc. La muestra de ácido nucleico puede,
pero no necesita, amplificarse mediante ningún método de
amplificación, lo que incluye, pero no se limita a la reacción en
cadena de la polimerasa ("PCR"). En una realización, el
polimorfismo puede ser un polimorfismo de un único nucleótido
("SNP") en el locus de IL-13.
En otra realización, haplotipos específicos en
los locus de IL4R, IL-4 e IL-13 así
como combinaciones específicas e interacciones entre SNP en esos
locus pueden ser indicativos de un aumento o reducción del riesgo de
padecer una enfermedad autoinmune como la diabetes tipo 1.
El polimorfismo puede detectarse mediante
cualquier método conocido en la materia para la detección de la
presencia de un polimorfismo específico en una muestra de ácido
nucleico. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a poner en
contacto la muestra de ácido nucleico con una o más moléculas de
ácido nucleico que hibridan bajo condiciones de hibridación
astringentes con al menos un polimorfismo del IL4R,
IL-4 o IL-13 asociado a la diabetes
tipo 1, y la detección de la hibridación, la detección mediante la
amplificación de la muestra de ácido nucleico mediante, por
ejemplo, PCR, y mediante secuenciación directa de la muestra de
ácido nucleico.
Otro aspecto de la invención está relacionado
con un equipo útil para la detección la presencia de un polimorfismo
que predispone o protege en el locus del IL4R, IL-4
o IL-13, en una muestra de ácido nucleico de un
individuo cuyo riesgo de padecer diabetes tipo 1 se está valorando.
El equipo puede comprender uno o más oligonucleótidos capaces de
detectar un polimorfismo que predispone o que protege en el locus
del IL4R, IL-4 o IL-13 así como las
instrucciones para la utilización del equipo para la detección de
susceptibilidad de padecer una enfermedad autoinmune como la
diabetes tipo 1. En realizaciones preferibles, el oligonucleótido o
oligonucleótidos comprenden individualmente una secuencia que
hibrida bajo condiciones de hibridación astringentes con al menos un
polimorfismo del IL4R, IL-4 o IL-13
asociado a la diabetes tipo 1. En algunas realizaciones, el
oligonucleótido u oligonucleótidos comprenden individualmente una
secuencia que es totalmente complementaria a una secuencia de ácido
nucleico que comprende un polimorfismo del IL4R,
IL-4 o IL-13 asociado a la diabetes
tipo 1.
El equipo de la presente invención
comprende:
(a) uno o más oligonucleótidos específicos de
secuencia que individualmente comprenden una secuencia que hibrida
bajo condiciones astringentes con el alelo variante del
polimorfismo de IL-13 asociado con la diabetes tipo
1, A(-1512)C o C(-1112)T, como se lista en la Tabla 2;
y
(b) las instrucciones para la utilización del
equipo en la determinación del riesgo de un individuo de padecer
diabetes tipo 1.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido
puede utilizarse para detectar la presencia de un polimorfismo del
IL4R, IL-4 o IL-13 asociado a la
diabetes tipo 1 mediante la hibridación al polimorfismo bajo
condiciones de hibridación astringentes. En algunas realizaciones,
el oligonucleótido puede utilizarse como un cebador de extensión en
una reacción de amplificación como la PCR o en una reacción de
secuenciación, en la que el polimorfismo del IL4R,
IL-4 o IL-13 asociado a la diabetes
tipo 1 se detecta mediante amplificación o mediante
secuencia-
ción.
ción.
En ciertas realizaciones, el equipo puede
comprender también cebadores de amplificación o secuenciación que
pueden ser, aunque no es necesario, específicos de secuencia. El
equipo también puede comprender reactivos para el marcaje de uno o
más de los oligonucleótidos, o comprende oligonucleótidos marcados.
Opcionalmente, el equipo puede comprender reactivos para detectar
el marcaje.
En algunas realizaciones, el equipo puede
comprender uno o más oligonucleótidos que pueden utilizarse para
detectar la presencia de dos o más polimorfismos del IL4R,
IL-4 o IL-13 que predisponen o que
protegen, o combinaciones de polimorfismos que predisponen, de
polimorfismos que protegen o de ambos.
En otro aspecto, la invención proporciona un
chip útil para la detección de la presencia de un polimorfismo de
IL4R, IL-4 o IL-13 que predispone o
que protege en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo
riesgo de padecer diabetes tipo 1 se está valorando. El chip puede
comprender uno o más oligonucleótidos capaces de detectar un
polimorfismo de IL4R, IL-4 o IL-13
que predispone o que protege. Los oligonucleótidos pueden estar
inmovilizados sobre un sustrato, por ejemplo, una membrana o
vidrio.
En realizaciones preferibles, el oligonucleótido
u oligonucleótidos individualmente comprenden una secuencia que
puede hibridar bajo condiciones de hibridación astringentes con una
secuencia de ácido nucleico que comprende un polimorfismo de IL4R,
IL-4 o IL-13 asociado a la diabetes
tipo 1. En algunas realizaciones, el oligonucleótido u
oligonucleótidos individualmente comprenden una secuencia que es
totalmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico que
comprende un polimorfismo de IL4R, IL-4 o
IL-13 asociado a la diabetes tipo 1. El
oligonucleótido u oligonucleótidos pueden estar marcados, aunque no
es necesario. En algunas realizaciones, el chip puede ser un
microchip.
En algunas realizaciones, el chip puede
comprender uno o más oligonucleótidos utilizados para detectar la
presencia de dos o más polimorfismos de IL4R, IL-4 o
IL-13 que predisponen o que protegen, o
combinaciones de polimorfismos que predisponen, de polimorfismos
que protegen o de ambos.
En ciertas realizaciones, el riesgo de un
individuo de padecer enfermedades concretas mediadas por las Th1 se
diagnostica a partir del genotipo de IL4R, IL-4 o
IL-13 del individuo. En una realización preferida,
la enfermedad mediada por las Th1 es la diabetes tipo 1. Un
individuo que presenta al menos un polimorfismo estadísticamente
asociado con la diabetes tipo 1 posee un factor que contribuye al
aumento o la reducción del riesgo de padecer diabetes tipo 1
comparado con un individuo sin el polimorfismo. La asociación
estadística de los polimorfismos de IL4R, IL-4 o
IL-13 (variantes de secuencia) se muestra en los
ejemplos.
El genotipo puede determinarse utilizando
cualquier método capaz de identificar variaciones de nucleótidos
que consisten en lugares polimórficos de un único nucleótido. El
método particular utilizado no es un aspecto crítico de la
invención. A continuación se describen una serie de métodos
adecuados.
En una realización de la invención, la
genotipificación se realiza utilizando sondas de oligonucleótidos
específicas de las secuencias variantes de IL4R,
IL-4 o IL-13. Preferiblemente, una
región de los genes del IL4R, IL-4 o
IL-13 que incluye uno o varios puntos polimórficos
de interés se amplifica previamente, o de forma concurrente, con la
hibridación de sondas dirigidas a estos puntos. Los ensayos basados
en sondas para la detección de variantes de secuencia son bien
conocidos en la materia.
Alternativamente, la genotipificación se realiza
utilizando reacciones de amplificación específicas de alelo o de
extensión, en las que se utilizan cebadores específicos de alelo que
permiten la extensión del cebador sólo si el alelo diana está
presente. Normalmente, un cebador específico de alelo hibrida con
los genes del IL4R, IL-4 o IL-13 de
forma que el nucleótido terminal en 3' se alinea con una posición
polimórfica. Las reacciones de amplificación específicas de alelo y
las reacciones de extensión específicas de alelo son bien conocidas
en la materia.
La Fig. 1 proporciona un esquema de un método de
haplotipificación molecular;
La Fig. 2 proporciona una ilustración de la
epistasis entre los SNP del IL4R y los SNP de IL-4 e
IL-13.
La Tabla 1 proporciona la secuencia de
nucleótidos de la región codificante del IL4R (ID. de SEC. Nº:
2);
La Tabla 2 proporciona los SNP de IL4R,
IL-4 e IL-13 útiles en los métodos
de la invención;
La Tabla 3 proporciona las sondas utilizadas
para identificar los polimorfismos del IL4R (ID. de SEC. Nº:
3-19);
La Tabla 4 proporciona las frecuencias estimadas
informáticamente del haplotipo, comparando filipinos control y
diabéticos (ID. de SEC. Nº: 20-24);
La Tabla 5 proporciona los genotipos de
individuos afectados y no afectados;
La Tabla 6 proporciona los polimorfismos de un
único nucleótido detectados;
La Tabla 7 proporciona los cebadores y longitud
de los amplicones (ID. de SEC. Nº: 25-36);
La Tabla 8 proporciona las sondas de hibridación
y los títulos (ID. de SEC. Nº: 37-53);
La Tabla 9 proporciona la frecuencia alélica del
alelo salvaje en los fundadores del HBDI;
La Tabla 10 proporciona los valores D' y D para
los pares de SNP de IL4R;
La Tabla 11A proporciona los resultados del
análisis PTD de locus único;
La Tabla 11B proporciona los resultados del
análisis PTD de locus único;
La Tabla 12 proporciona los cebadores para la
PCR específica de alelo (ID. de SEC. Nº:
54-62);
La Tabla 13 proporciona las distribuciones de
IPD de los haplotipos de IL4R;
La Tabla 14A proporciona las transmisiones de
haplotipo;
La Tabla 14B proporciona las transmisiones de
haplotipo;
La Tabla 14C proporciona las transmisiones de
haplotipo;
La Tabla 15A proporciona las transmisiones de
haplotipo SNP por SNP;
La Tabla 15B proporciona las transmisiones de
haplotipo SNP por SNP;
La Tabla 16A proporciona un análisis PTD;
La Tabla 16B proporciona un análisis PTD;
La Tabla 16C proporciona un análisis PTD;
La Tabla 17A proporciona un análisis PTD;
La Tabla 17B proporciona un análisis PTD;
La Tabla 18 proporciona las frecuencias alélicas
en filipinos control y diabéticos;
La Tabla 19 proporciona las frecuencias
estimadas de los haplotipos;
La Tabla 20 proporciona las frecuencias
observadas de los haplotipos;
La Tabla 21 proporciona las frecuencias alélicas
en diabéticos y controles;
La Tabla 22 proporciona los valores de
desequilibrio de ligamiento por pares de los SNP de IL4R;
La Tabla 23 proporciona los valores de
desequilibrio de ligamiento por pares de los SNP de
IL-4 e IL-13;
La Tabla 24 proporciona las frecuencias de los
genotipos en pacientes y controles;
La Tabla 25A proporciona los haplotipos de 7 SNP
de IL4R en filipinos diabéticos y controles;
La Tabla 25B proporciona las frecuencias
estimadas de los haplotipos de 10 SNP de IL4R en diabéticos y
controles;
La Tabla 26 proporciona las frecuencias
estimadas de los haplotipos de 5 SNP de IL-4 e
IL-13 en diabéticos y controles;
La Tabla 27 proporciona la correlación entre las
frecuencias de los genotipos en los SNP de IL4R y cinco SNP de
IL-4 e IL-13;
La Tabla 28 proporciona la interacción
epistática entre los SNP de IL4R y cinco SNP de IL-4
e IL-13;
La Tabla 29 proporciona las sondas utilizadas
para identificar los polimorfismos de IL-4 e
IL-13 (ID. de SEC. Nº: 63-68);
La Tabla 30 proporciona los cebadores y la
longitud de los amplicones para un promotor de IL-4
y SNP de IL-13 (ID. de SEC. Nº:
69-74);
La Tabla 31 proporciona los cebadores y la
longitud de los amplicones para los SNP del promotor de IL4R (ID.
de SEC. Nº: 75-80);
La Tabla 32 proporciona los cebadores y la
longitud de los amplicones para los SNP del promotor de
IL-13 (ID. de SEC. Nº: 81-86)
La presente invención proporciona los métodos,
reactivos y equipos para la detección de un aumento o reducción del
riego de un individuo de padecer la enfermedad autoinmune diabetes
tipo 1.
El término "gen del IL4R" o
"locus del IL4R" se refiere a la secuencia de ácido
nucleico genómico que codifica la subunidad alfa de la proteína del
receptor de la interleuquina 4. La secuencia de nucleótidos de un
gen, como se utiliza aquí, incluye las regiones codificantes,
denominadas exones, las regiones no codificantes intercaladas,
denominadas intrones, y las regiones anteriores y posteriores. Las
regiones anteriores y posteriores pueden incluir regiones del gen
que se transcriben que no forman parte de un intrón o exón, o
regiones del gen que comprenden, por ejemplo, los sitios de unión
de factores que modulan la transcripción del gen. La secuencia
génica de un mRNA humano de IL4R se proporciona en GenBank con el
número de acceso X52425.1 (ID. de SEC. Nº: 1). La región
codificante se proporciona con el ID. de SEC. Nº: 2. La secuencia
de genómico del gen del IL4R está incluida en GenBank con el número
de acceso AC004525.1 (ID. de SEC. Nº: 88).
El término "gen de la
IL-4" o "locus de la
IL-4" se refiere a la secuencia de ácido
nucleico genómico que codifica la proteína interleuquina 4. La
secuencia de nucleótidos de un gen, como se utiliza aquí, incluye
las regiones codificantes, denominadas exones, las regiones no
codificantes intercaladas, denominadas intrones, y las regiones
anteriores y posteriores. Las regiones anteriores y posteriores
pueden incluir regiones del gen que se transcriben que no forman
parte de un intrón o exón, o regiones del gen que comprenden, por
ejemplo, los sitios de unión de factores que modulan la
transcripción del gen. La secuencia de genómico del gen de la
IL-4 se proporciona en GenBank con el número de
acceso M23442.1 (ID. de SEC. Nº: 89).
\newpage
El término "gen de la
IL-13" o "locus de la
IL-13" se refiere a la secuencia de ácido
nucleico genómico que codifica la proteína interleuquina 13. La
secuencia de nucleótidos de un gen, como se utiliza aquí, incluye
las regiones codificantes, denominadas exones, las regiones no
codificantes intercaladas, denominadas intrones, y las regiones
anteriores y posteriores. Las regiones anteriores y posteriores
pueden incluir regiones del gen que se transcriben que no forman
parte de un intrón o exón, o regiones del gen que comprenden, por
ejemplo, los sitios de unión de factores que modulan la
transcripción del gen. La secuencia de genómico del gen de la
IL-13 se proporciona en GenBank con el número de
acceso U10307.1 (ID. de SEC. Nº: 90).
El término "alelo", como se utiliza
aquí, se refiere a una variante de la secuencia del gen. Los alelos
se identifican respecto a una o más posiciones polimórficas, sin
especificar el resto de la secuencia génica. Por ejemplo, un alelo
del IL4R puede definirse mediante el nucleótido presente en un único
SNP, o mediante los nucleótidos presentes en una serie de SNP. En
ciertas realizaciones de la invención, un IL4R se define mediante
los genotipos de 6, 7, 8 o 10 SNP de IL4R. Ejemplos de tales SNP de
IL4R se proporcionan en la Tabla 2, a continua-
ción.
ción.
Convenientemente, el alelo presente con una
mayor frecuencia en la población se denominará el alelo salvaje;
el(los) alelo(s) menos frecuentes se denominará(n)
alelo(s) mutante(s). Esta denominación de un alelo
como mutante únicamente pretende distinguir el alelo del alelo
salvaje y no pretende indicar un cambio o pérdida de fun-
ción.
ción.
El término "polimorfismo que
predispone" se refiere a un polimorfismo que se asocia
positivamente con una enfermedad autoinmune como la diabetes tipo
1. La presencia de un polimorfismo que predispone en un individuo
podría ser indicativa de que el individuo tiene un riesgo aumentado
de padecer la enfermedad en relación con un individuo sin el
polimorfismo.
El término "polimorfismo que
protege" se refiere a un polimorfismo que se asocia
negativamente con una enfermedad autoinmune como la diabetes tipo
1. La presencia de un polimorfismo que protege en un individuo
podría ser indicativa de que el individuo tiene un riesgo reducido
de padecer la enfermedad en relación con un individuo sin el
polimorfismo.
Los términos "polimórfico" y
"polimorfismo", como se utilizan aquí, se refieren a la
condición en la que dos o más variantes de una secuencia de
genómico específica, o la secuencia de aminoácidos codificada,
pueden encontrarse en una población. Los términos se refieren a la
secuencia de ácido nucleico o a la secuencia de aminoácidos
codificada; su utilización estará clarificada por el contexto. La
región polimórfica o lugar polimórfico se refiere a una región del
ácido nucleico en el que aparece la diferencia de nucleótido que
distingue las variantes, o, para secuencias de aminoácido, una
región de la secuencia de aminoácido en la que aparece la
diferencia de aminoácido que distingue las variantes de proteína.
Como se utiliza aquí, un "polimorfismo de un único
nucleótido", o SNP, se refiere a un lugar polimórfico que
consiste en una posición de un único nucleótido.
El "cociente de probabilidad"
("CP") se refiere a la proporción entre la probabilidad de
padecer la enfermedad de los individuos con el marcador (alelo o
polimorfismo) y la probabilidad de padecer la enfermedad de los
individuos sin el marcador (alelo o polimorfismo).
El "desequilibrio de ligamiento"
("DL") se refiere a los alelos en diferentes locus que no están
asociados al azar, es decir, no están asociados en proporción a sus
frecuencias. Si los alelos tienen un desequilibrio de ligamiento
positivo, entonces los alelos aparecen juntos más frecuentemente de
lo esperable si se asume su independencia estadística. Por el
contrario, si los alelos tienen un desequilibrio de ligamiento
negativo, entonces los alelos aparecen juntos menos frecuentemente
de lo esperable si se asume su independencia estadística.
El término "genotipo" se refiere a
una descripción de los alelos de un gen o genes contenidos en un
individuo o una muestra. Como se utiliza aquí, no se distingue
entre el genotipo de un individuo y el genotipo de una muestra a
partir de este individuo. Aunque, normalmente, un genotipo se
determina a partir de muestras de células diploides, un genotipo
puede determinarse a partir de una muestra de células haploides,
como una célula espermáti-
ca.
ca.
El término "haplotipo" se refiere a
una descripción de las variantes de un gen o genes contenidos en un
único cromosoma, es decir, el genotipo de un único cromosoma. Un
haplotipo es un conjunto de alelos heredados maternos, o un
conjunto de alelos heredados paternos, en cualquier locus.
El término "región diana" se refiere
a una región de un ácido nucleico que va a analizarse y que
normalmente incluye al menos una región polimórfica.
Los aminoácidos individuales en una secuencia
están representados aquí como AN o NA, en las que A es el aminoácido
en la secuencia y N es la posición en la secuencia. En el caso de
que la posición N sea polimórfica, es conveniente designar la
variante más frecuente como A_{1}N y la variante menos frecuente
como NA_{2}. De forma alternativa, el lugar polimórfico, N, se
representa como A_{1}NA_{2}, en la que A_{1} es el aminoácido
en la variante más común y A_{2} es el aminoácido en la variante
menos común. Se utilizan los códigos de una letra o tres letras
para designar los aminoácidos (véase Lehninger, BioChemistry 2ª ed.,
1975, Worth Publishers, Inc. New York, NY: págs.
73-75). Por ejemplo, I50V representa un polimorfismo
de un único aminoácido en la posición de aminoácido 50, en la que
la isoleucina está presente en la variante de la proteína más
frecuente en la población y la valina está presente en la variante
menos frecuente. Las posiciones de aminoácido están numeradas en
base a la secuencia de la proteína IL4R madura, como se describe a
continuación.
"Astringente" como se utiliza aquí
se refiere a condiciones de hibridación y lavados a 50ºC o superior.
También pueden seleccionarse otras condiciones de hibridación
astringentes. Generalmente, las condiciones astringentes se
seleccionan para que sean alrededor de 5ºC inferiores al punto de
fusión térmica (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica
y pH definidos. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH
definidos) a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una
sonda perfectamente complementaria. Normalmente, las condiciones
astringentes serán aquellas en las que la concentración de sal es
de al menos de alrededor de 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es
de al menos alrededor de 50ºC. Como otros factores pueden afectar
significativamente la astringencia de la hibridación, lo que
incluye entre otros, la composición de bases, longitud de las
cadenas de ácido nucleico, la presencia de solventes orgánicos o la
extensión de bases no complementarias, la combinación de parámetros
es más importante que la medida absoluta de cualquiera de ellos.
Las representaciones de los nucleótido y los
cambios de un único nucleótido en secuencias de DNA son análogas.
Por ejemplo, A398G representa un polimorfismo de un único nucleótido
en la posición de nucleótido 398, en la que la adenina está
presente en el alelo más frecuente (salvaje) en la población y la
guanina está presente en el alelo menos frecuente (mutante). Las
posiciones de nucleótido están numeradas en base a la secuencia de
la región codificante del IL4R proporcionada como ID. de SEC Nº: 2,
que se muestra a continuación. Quede claro que en una forma de
doble cadena, la cadena complementaria de cada alelo contendrá la
base complementaria en la posición polimór-
fica.
fica.
Las técnicas convencionales de biología
molecular y química de ácidos nucleicos, que están al alcance del
experto en la materia, se exponen de forma completa en la
literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis
(M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic acid Hybridization (B. D. Hames y
S. J. Higgins, eds., 1984); la serie, Methods in Enzymology
(Academic Press, Inc.); y la serie con actualizaciones trimestrales,
Current Protocols in Human Genetics (Dracopoli et al., eds.,
1984, John Wiley & Sons, Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Como IL4R, IL-4 o
IL-13 son una pequeña parte del complejo sistema de
genes involucradas en una respuesta inmune, es esperable que el
efecto de los locus del IL4R, IL-4 o
IL-13 sea pequeño. Otros factores, como un genotipo
del HLA del individuo, puede ejercer un efecto dominante que, en
algunos casos, puede enmascarar el efecto de los genotipos del
IL4R, IL-4 o IL-13. Por ejemplo, se
conocen genotipos de HLA concretos que tienen un efecto importante
sobre la probabilidad de padecer diabetes tipo 1 (véase Noble et
al., 1996, Am. J. Hum. Genet, 59:1134-1148).
Los genotipos del IL4R, IL-4 o IL-13
serán probablemente más informativos como indicadores de
predisposición a padecer diabetes tipo 1 entre los individuos que
presenten genotipos de HLA que no confieran un aumento o reducción
del riesgo. Además, como las frecuencias alélicas en otros locus
relevantes para las enfermedades relacionadas con el sistema inmune
son diferentes entre poblaciones y, por lo tanto, las poblaciones
muestran diferentes riesgos de padecer enfermedades relacionadas con
el sistema inmune, es esperable que el efecto de los genotipos de
IL4R, IL-4 o IL-13 pueda ser de
diferente magnitud en algunas poblaciones. Aunque la contribución
de los genotipos del IL4R, IL-4 o
IL-13 pueden ser relativamente menor en sí misma,
la genotipificación de los locus de IL4R, IL-4 o
IL-13 aportará información que es, no obstante,
útil para la caracterización de la predisposición de un individuo a
padecer diabetes tipo 1. La información del genotipo del IL4R,
IL-4 o IL-13 puede ser
particularmente útil si se combina con la información del genotipo
de otros locus.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona los métodos
para la determinación del riesgo de un individuo de padecer
cualquier enfermedad o trastorno autoinmune o cualquier enfermedad
mediada por las Th-1. Tales enfermedades o
trastornos incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple,
miastenia grave, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, cirrosis
biliar primaria, diabetes mellitus tipo 1 (diabetes mellitus
dependiente de insulina o DMDI), enfermedad de Grave, anemia
hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, trombocitopenia
autoinmune, vasculitis como la granulomatosis de Wegener,
enfermedad de Behcet, artritis reumatoide, lupus sistémico
eritematoso (lupus), escleroderma, esclerosis sistémica, síndrome
de Gullian-Barre, tiroiditis de Hashimoto,
espondiloartropatias como la espondilitis anquilosante, psoriasis,
dermatitis herpetiforme, enfermedades de intentino inflamatorio,
pénfigo vulgar y vitíligo. En ciertas realizaciones de la invención,
los métodos se utilizan para determinar el riesgo de un individuo
de padecer diabetes tipo 1. Preferiblemente, el individuo es un
humano.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con esto, una realización de la
invención es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una porción de los genes del IL4R, IL4 o IL13, sus complementarios o
variantes de los mismos. Preferiblemente dicha variante comprende
al menos uno de los polimorfismos identificados aquí. Aún más
preferiblemente, dicha variante comprende al menos uno de los
polimorfismos que aquí se han identificado que están asociados con
la diabetes tipo 1. Por lo tanto, en una realización, la molécula de
ácido nucleico comprende al menos uno de los polimorfismos del
IL4R, IL4, y/o IL13 que se proporcionan en la Tabla 2. En otra
realización, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en
cebadores y sondas específicos de los polimorfismos identificados
en los genes del IL4R, IL4 o IL13, lo que incluye pero no se limita
al ID. de SEC. Nº: 3-19, 25-36,
37-53, 54-62,
69-74, 75-80 y
81-86.
81-86.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden
ser RNA, mRNA, DNA, cDNA, y pueden ser de doble cadena o de cadena
sencilla.
Estas pueden codificar la cadena sentido, las
regiones no codificantes, o la cadena antisentido. La molécula de
ácido nucleico puede incluir toda o una porción de la secuencia
codificante del gen y además puede comprender regiones no
codificantes adicionales como los intrones y las secuencias 3' y 5'
no codificantes (lo que incluye, por ejemplo, las secuencias
reguladoras). De forma adicional, la molécula de ácido nucleico
puede fusionarse a una secuencia marcador, por ejemplo, una
secuencia que codifica un polipéptido que ayuda en el aislamiento o
purificación del polipéptido.
Una molécula de ácido nucleico "aislada",
como se utiliza aquí, es una que se ha separado de las secuencias
nucleotídicas que normalmente flanquean la molécula de ácido
nucleico y/o se ha purificado completamente o parcialmente de otro
material biológico (por ejemplo, proteínas) normalmente asociado al
ácido nucleico.
La molécula de ácido nucleico puede fusionarse a
otras secuencias codificantes o reguladoras y aún considerarse
aislada.
Por lo tanto, el DNA recombinante contenido en
un vector se incluye en la definición de "aislada" como se
utiliza aquí. Además, las moléculas de ácido nucleico aisladas
incluyen las moléculas de DNA recombinante en células huésped
heterólogas, así como las moléculas de DNA parcialmente o
sustancialmente purificadas en solución. Las moléculas de ácido
nucleico "aisladas" también incluyen los tránscritos de RNA
in vivo e in vitro de las moléculas de DNA de la
presente invención. Una molécula de ácido nucleico aislada o una
secuencia de nucleótidos puede incluir una molécula de ácido
nucleico o secuencia de nucleótidos que se ha sintetizado mediante
métodos químicos o recombinantes. Además, los polinucleótidos
aislados incluyen las moléculas de DNA recombinante en organismos
heterólogos, así como moléculas de DNA parcialmente o
sustancialmente purificadas en solución. Los tránscritos de RNA
in vivo e in vitro de las moléculas de DNA de la
presente invención también están englobados por las secuencias de
nucleótidos "aisladas". Tales polinucleótidos son útiles en la
elaboración del polipéptido codificado, como sondas para el
aislamiento de secuencias homólogas (por ejemplo, de otras especies
de mamíferos), para el mapeo de genes (por ejemplo, mediante una
hibridación in situ con cromosomas), o para la detección de
la expresión del gen en tejido (por ejemplo, tejido humano), como
con un análisis de Northern
blot.
blot.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden comprender uno o más residuos de nucleótido modificados. La
modificación puede estar en la porción de la base, azúcar y/o
fosfato e incluye, por ejemplo, la halogenación, hidroxilación,
alquilación o un enlazante y/o marcaje unidos. Las modificaciones
además pueden comprender, por ejemplo, el marcaje, metilación,
modificaciones internucleótido como los enlaces sin carga (por
ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos,
carbamatos), enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos,
fosforoditioatos), porciones salientes (por ejemplo, polipéptidos),
intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno), quelantes,
alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos
alfa-anoméricos). También están incluidas las
moléculas sintéticas que mimetizan a moléculas de ácido nucleico en
su capacidad de unirse a una secuencia designada a través de
puentes de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales
moléculas incluyen, por ejemplo, aquellas en las que enlaces
peptídicos sustituyen los enlaces fosfato en el armazón de la
molécula.
En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido
nucleico de la invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas
de mRNA, cDNA y/o DNA genómico del IL4R, IL4 y/o IL13. La secuencia
de nucleótidos de la región codificante del mRNA de IL4R está
disponible en GenBank bajo el número de acceso X52425.1, los
nucleótidos 176-2653 se proporcionan como ID. de
SEC. Nº: 2, que se muestra con una orientación de 5' a 3' en la
Tabla 1, a continuación. El mRNA de IL4R se proporciona como ID. de
SEC. Nº: 1. Aunque sólo se muestra una cadena del ácido nucleico
en la Tabla 1, los expertos en la materia reconocerán que los ID. de
SEC. Nº: 1 e ID. de SEC. Nº: 2 identifican regiones de ácido
nucleico genómico de doble cadena, y que las secuencias de ambas
cadenas están totalmente especificadas mediante la información de
secuencia que se proporciona. La secuencia de genómico del gen del
IL4R está incluida en GenBank con el número de acceso AC004525.1
(ID. de SEC. Nº: 88). La secuencia de nucleótidos de la región
codificante del mRNA de IL4 está disponible en GenBank con el número
de acceso M23442.1 (ID. de SEC. Nº: 89) y la secuencia de
nucleótidos de la región codificante del mRNA de IL13 está
disponible en GenBank con el número de acceso U10307.1 (ID. de SEC.
Nº: 90).
Por "oligonucleótido" se entiende un
polímero de nucleótidos de cadena sencilla compuesto por más de 2
subunidades de nucleótido covalentemente unidos. En una realización
dichos oligonucleótidos tienen entre alrededor de 10 y 1000
unidades de nucleótido, en otra realización, dichos oligonucleótidos
tienen entre alrededor de 12 y 100 unidades de nucleótido. Los
grupos azúcar de las subunidades de nucleótido pueden ser ribosa,
desoxiribosa o derivados modificados de los mismos como la
o-metilribosa. Las subunidades de nucleótido de un
oligonucleótido pueden estar unidas mediante enlaces fosfodiéster,
enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato o mediante otros
enlaces, lo que incluye pero no se limita a, enlaces infrecuentes o
que no aparecen en la naturaleza, que no evitan la hibridación del
oligonucleótido. Además, un oligonucleótido puede contener porciones
de nucleótido o no nucleótido poco comunes. Un oligonucleótido como
se define aquí es un ácido nucleico, preferiblemente DNA, pero
puede ser RNA o contener una combinación de ribo- y
desoxiribonucleótidos covalentemente unidos. Las sondas de
oligonucleótido y los oligonucleótidos para la amplificación de una
secuencia definida pueden obtenerse mediante técnicas conocidas
para los expertos en la materia, como mediante síntesis química o
bioquímica, y mediante expresión in vitro o in vivo a
partir de moléculas de ácido nucleico recombinantes, por ejemplo,
vectores bacterianos o retrovirales. Como se utiliza aquí, un
oligonucleótido no consiste en el DNA cromosómico salvaje o los
productos de transcripción in vivo del
mismo.
mismo.
Las secuencias de cebadores y sondas pueden
comprender análogos de DNA, RNA (oligonucleótidos - véanse
anteriormente) o ácido nucleico como los análogos de ácido nucleico
sin carga, lo que incluye pero no se limita a los ácidos nucleicos
peptídicos (PNA) que se describen en la solicitud de patente
internacional WO 92/20702 o los análogos morfolino que se describen
en las patentes U.S. Nº 5.185.444, 5.034.506 y 5.142.047. Tales
secuencias pueden sintetizarse de forma rutinaria utilizando una
serie de técnicas actualmente disponibles.
Por ejemplo, una secuencia de DNA puede
sintetizarse utilizando la química convencional de nucleótidos con
fosforamidita y la maquinaria disponible de Applied Biosystems, Inc,
(Foster City, Calif.); DuPont, (Wilmington, Del.); o Milligen,
(Bedford, Mass.). De forma similar, y cuando se desee, las
secuencias pueden marcarse utilizando metodologías bien conocidas
en la materia como se describe en las solicitudes de patente U.S. Nº
5.464.746, 5.424.414 y 4.948.882.
Los cebadores y sondas pueden utilizarse de
varias formas y pueden definirse por su utilización específica. Por
ejemplo, una "sonda de captura" está inmovilizada o puede
inmovilizarse sobre un soporte sólido mediante cualquier método
apropiado, lo que incluye, pero no se limita a: mediante unión
covalente, adsorción, interacción hidrofóbica y/o electrostática, o
mediante síntesis directa sobre un soporte sólido (véase
concretamente la solicitud de patente WO 92 10092). Una "sonda de
detección" puede marcarse mediante un marcador elegido, por
ejemplo, isótopos radiactivos, enzimas, en particular enzimas
capaces de actuar sobre un sustrato cromogénico, fluorigénico o
luminescente (en particular una peroxidasa o una fosfatasa
alcalina), compuestos químicos cromóforos, compuestos cromogénicos,
fluorigénicos o luminescentes, análogos de bases nucleotídicas y
ligandos como la biotina. Un "cebador" es una sonda que
comprende, por ejemplo, entre 10 y 100 unidades de nucleótido y con
una especificidad de hibridación bajo condiciones determinadas para
la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo en una
técnica de amplificación como la PCR (reacción en cadena de la
polimerasa), en un proceso de secuenciación, en un método de
transcripción reversa y similares. Una utilización de una sonda es
como sonda de un ensayo de hibridación; las sondas también pueden
utilizarse como oligómeros de amplificación terapéutica in
vivo o in vitro, o como agentes antisentido para bloquear
o inhibir la transcripción génica o la traducción en células
enfermas, infectadas o
patogénicas.
patogénicas.
Todos los oligonucleótidos, cebadores y sondas
de la presente invención, que sean sondas de un ensayo de
hibridación, oligonucleótidos para amplificación u oligonucleótidos
ayudantes, pueden modificarse con grupos químicos para potenciar su
funcionamiento o para facilitar la caracterización de los productos
de amplificación. Por ejemplo, los oligonucleótidos de armazón
modificado, como los que contienen grupos fosforotioato o
metilfosfonato y que resultan en oligonucleótidos resistentes a la
actividad nucleolítica de ciertas polimerasas o a enzimas nucleasa,
pueden permitir la utilización de tales enzimas en una amplificación
u otra reacción. Otro ejemplo de modificación involucra la
utilización de enlazantes no nucleotídicos (por ejemplo, Arnold
et al., "Non-Nucleotide Linking Reagents
for Nucleotide Probes", PE 0 313 219) que se incorporan entre
nucleótidos en la cadena de ácido nucleico y que no interfieren con
la hibridación o la elongación del cebador. Los oligonucleótidos
para la amplificación también pueden contener mezclas de los
nucleótidos deseados modificados y naturales.
El extremo 3' para amplificación puede
bloquearse para evitar la iniciación de la síntesis de DNA como se
describe en McDonough et al., de título "Nucleic Acid
Secuence Amplification", WO 94/03472, que es de propiedad común
con la presente invención. Una mezcla de diferentes oligonucleótidos
para amplificación bloqueados en 3', o de oligonucleótidos
bloqueados en 3' y no bloqueados, puede aumentar la eficiencia de la
amplificación de ácido nucleico, como se ha descrito.
El extremo 5' de los oligonucleótidos puede
modificarse para que sean resistentes a la actividad exonucleasa en
5' presente en algunas polimerasas de ácidos nucleicos. Tales
modificaciones pueden realizarse mediante la adición de un grupo no
nucleotídico al nucleótido terminal en 5' del cebador utilizando
técnicas como las descritas en Arnold et al., supra,
de título "Non-Nucleotide Linking Reagents for
Nucleotide Probes".
Una vez sintetizadas, las sondas de
oligonucleótido seleccionadas pueden marcarse mediante cualquiera de
los muchos métodos bien conocidos (por ejemplo, J. Sambrook,
supra). Los marcajes útiles incluyen los radioisótopos así
como los grupos de marcaje no radiactivo. Los marcajes isotópicos
incluyen ^{3}H, ^{35}S, ^{32}P, ^{125}I, ^{57}Co y
^{14}C. Los marcajes isotópicos pueden introducirse en el
oligonucleótido mediante técnicas conocidas en la materia como la
traslación de la muesca, marcaje terminal, síntesis de la segunda
cadena, utilización de transcripción reversa y mediante métodos
químicos. Cuando se utilizan sondas radiomarcadas la hibridación
puede detectarse mediante autoradiografía, contador de centelleo o
contador gamma. El método de detección seleccionado dependerá del
radioisótopo particular utilizado en el marcaje.
También pueden utilizarse materiales no
isotópicos para el marcaje y pueden introducirse internamente en la
secuencia de ácido nucleico o al final de la secuencia de ácido
nucleico. Los nucleótidos modificados pueden incorporarse de forma
enzimática o química. Las modificaciones químicas de la sonda pueden
realizarse durante o tras la síntesis de la sonda, por ejemplo, a
través de la utilización de grupos enlazantes no nucleotídicos como
los descritos en Arnold et al., supra
"Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide
Probes". Los marcajes no isotópicos incluyen las moléculas
fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes, enzimas, cofactores,
substratos de enzimas, haptenos u otros ligandos.
En una realización, las sondas están marcadas
con un éster de acridinio. El marcaje con éster de acridinio puede
realizarse como se describe en Arnold et al., patente U.S. Nº
5.185.439, de título "Acridinium Ester Labeling and Purification
of Nucleotide Probes," emitida el 9 de Feb. de 1993.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, se describe un método para la
detección de un aumento o reducción del riesgo de un individuo de
padecer una enfermedad autoinmune como la diabetes tipo 1 mediante
la detección de la presencia de uno o más SNP del IL4R, IL4 o IL13
en una muestra de ácido nucleico del individuo, en el que la
presencia de dicho(s) SNP(s) indica un aumento o
reducción del riesgo de un individuo de padecer diabetes tipo 1. Los
SNP pueden cualquier SNP en los locus del IL4R, IL4 o IL13, lo que
incluye los SNP en los exones, intrones o regiones anteriores o
posteriores. Ejemplos de tales SNP incluyen, pero no se limitan a
los que se proporcionan en la Tabla 2, a continuación, y se
discuten en detalle en los Ejemplos. En una realización, los SNP
presentes en los locus del IL4R, IL4 o IL13 se identifican mediante
genotipificación de los SNP del IL4R, IL4 o IL13.
En ciertas realizaciones, el genotipo de un SNP
del IL4R, IL4 o IL13 puede utilizarse para determinar el riesgo de
un individuo de padecer una enfermedad autoinmune. En otras
realizaciones, pueden utilizarse los genotipos de una serie de SNP
del IL4R, IL4 o IL13. Por ejemplo, en ciertas realizaciones pueden
utilizarse los genotipos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30 o 31 de los SNP de la Tabla 2 para determinar el riesgo de un
individuo de padecer una enfermedad autoinmune. En otras
realizaciones, pueden utilizarse ciertas combinaciones de SNP en el
mismo locus o en locus diferentes, como se describe en los
Ejemplos, a continuación.
En los métodos descritos, los alelos presentes
en una muestra se identifican mediante la identificación del
nucleótido presente en uno o más de los puntos polimórficos.
Cualquier tipo de tejido que contenga el ácido nucleico del IL4R,
IL4 o IL 13 puede utilizarse para la determinación de los genotipos
de IL4R, IL4 o IL13 de un individuo. Se conocen en la materia una
serie de métodos para la identificación de los nucleótidos presentes
en los lugares polimórficos. El método particular utilizado para
identificar el genotipo no es un aspecto crítico de la invención.
Aunque por consideraciones de realización, coste y conveniencia
algunos métodos particulares serán más deseables que otros, queda
claro que cualquier método que pueda identificar el nucleótido
presente proporcionará la información necesaria para identificar el
genotipo. Los métodos de genotipificación preferibles involucran la
secuenciación de DNA, la amplificación específica de alelo o la
detección basada en sondas de ácido nucleico amplificado.
Los alelos de IL4R, IL4 o IL13 pueden
identificarse mediante métodos de secuenciación de DNA, como el
método de terminación de la cadena (Sanger et al., 1977,
Proc. Natl. Acad Sci., 74:5463-5467), que es bien
conocido en la materia. En una realización, se amplifica una
subsecuencia del gen que incluye el lugar polimórfico y se clona en
un plásmido adecuado y luego se secuencia, o bien se secuencia
directamente. La secuenciación basada en la PCR se describe en la
patente U.S. Nº 5.075.216, Brow, en PCR Protocols, 1990, (Innis
et al., Eds. Academic Press, San Diego), capítulo 24; y
Gyllensten, en PCR Technology, 1989 (Erlich, Ed. Stockton Press,
New York), capítulo 5; ambos se incorporan aquí como referencia.
Normalmente, la secuenciación se realiza utilizando uno de los
secuenciadores de DNA automáticos que están comercialmente
disponibles de, por ejemplo, PE Biosystems (Foster City, CA),
Pharmacia (Piscataway, NJ), Genomyx Corp. (Foster City, CA),
LI-COR Biotech (Lincloln, NE), GeneSys technologies
(Sauk City, WI) y Visible Genetics, Inc. (Toronto, Canada).
Los alelos de IL4R, IL4 o IL13 también pueden
identificarse utilizando métodos de genotipificación basados en la
amplificación. Varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos
conocidos en la materia pueden utilizarse para detectar cambios de
nucleótido en un ácido nucleico diana. Un método preferible es la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ahora es bien
conocida en la materia, y se describe en las patentes U.S. Nº
4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188. Ejemplos de los numerosos
artículos publicados describiendo los métodos y aplicaciones de la
PCR se encuentran en PCR Applications, 1999, (Innis et al.,
Eds., Academic Press, San Diego), PCR Strategies, 1995, (Innis
et al., Eds., Academic Press, San Diego); PCR Protocols,
1990, (Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego); y PCR
Technology, 1989, (Erlich, Ed., Stockton Press, New York);
Proveedores comerciales como PE Biosystems (Foster City, CA)
comercializan reactivos de PCR y publican protocolos de PCR.
Otros métodos de amplificación adecuados
incluyen la reacción en cadena de la ligasa (Wu y Wallace, 1988,
Genomics 4:560-569); el ensayo de desplazamiento de
la cadena (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:392-396, Walker et al. 1992, Nucleic Acids
Res. 20:1691-1696, y la patente U.S. Nº 5.455.166);
y varios sistemas de amplificación basados en la transcripción, lo
que incluye los métodos descritos en las patentes U.S. Nº
5.437.990, 5.409.818 y 5.399.491, el sistema de amplificación de la
transcripción (TAS) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad
Sci. USA, 86:1173-1177); y la replicación de la
secuencia autosostenida (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878 y WO 92/08800).
Alternativamente, pueden utilizarse los métodos que amplifican la
sonda hasta niveles detectables, como la amplificación con la
replicasa Qb (Kramer et al., 1989, Nature,
339:401-402 y Lomeli et al., 1989, Clin.
Chem., 35:1826-1831). Una revisión de los métodos
de amplificación conocidos se proporcionan en Abramson et
al., 1993, Current Opinion in Biotechnology,
4:41-47, se incorpora aquí como referencia.
La genotipificación también puede realizarse
mediante la detección y análisis del mRNA de IL4R, IL4 o IL13 bajo
condiciones en las que tanto el cromosoma materno como el paterno se
transcriban. La amplificación de RNA puede realizarse mediante una
transcripción reversa inicial del RNA diana utilizando, por ejemplo,
una transcriptasa reversa viral, y luego amplificando el cDNA
resultante, o utilizando una transcripción reversa y una reacción
en cadena de la polimerasa combinadas a elevada temperatura
(RT-PCR), como se describe en las patentes U.S. Nº
5.310.652, 5.322.770, 5.561.058, 5.641.864 y 5.693.517 (véase
también Myers y Sigua, 1995, en PCR Strategies, supra,
capítulo 5).
Los alelos de IL4R, IL4 o IL13 también pueden
identificarse utilizando métodos de amplificación específica de
alelo o de extensión del cebador, que se basan en el efecto
inhibitorio de una falta de complementariedad terminal del cebador
sobre la capacidad de una polimerasa de DNA de extender el cebador.
Para detectar la secuencia de un alelo utilizando una amplificación
específica de alelo o método basado en la extensión, se escoge un
cebador complementario a los genes del IL4R, IL4 o IL13 de forma que
el nucleótido del extremo 3' hibrida en la posición polimórfica. En
presencia del alelo a identificar, el cebador es complementario de
la secuencia diana en el extremo 3' y el cebador se extiende. En
presencia sólo del otro alelo, el cebador tiene ausencia de
complementariedad en 3' en relación a la secuencia diana y la
extensión del cebador se elimina o se reduce significativamente.
Los métodos basados en la amplificación específica de alelo o en la
extensión se describen en, por ejemplo, la patente U.S. Nº
5.137.806, 5.595.890, 5.639.611 y la patente U.S. Nº 4.851.331.
Utilizando la genotipificación basada en la
amplificación específica de alelo, la identificación de los alelo
sólo requiere la detección de la presencia o ausencia de las
secuencias diana amplificadas. Los métodos para la detección de las
secuencias diana amplificadas son bien conocidos en la materia. Por
ejemplo, la electroforesis en gel (véase Sambrook et al.,
1989, supra.) y los ensayos de hibridación de sondas
descritos anteriormente se han utilizado ampliamente para detectar
la presencia de ácidos nucleicos.
Los métodos de genotipificación basados en la
amplificación específica de alelo pueden facilitar la identificación
de haplotipos, como se describe en los ejemplos. Esencialmente, la
amplificación específica de alelo se utiliza para amplificar una
región que incluye múltiples lugares polimórficos de sólo uno de los
dos alelos en una muestra heterozigota. Las variantes del SNP
presentes en la secuencia amplificada se identifican entonces,
mediante la hibridación de sondas o secuenciación.
Un método alternativo sin sondas, denominado
aquí como método de PCR cinética, en la que la generación de ácido
nucleico amplificado se detecta mediante la monitorización del
aumento de la cantidad total de DNA de doble cadena en la mezcla de
reacción, se describe en Higuchi et al., 1992,
BiolTechnology, 10:413-417; Higuchi et al.,
1993, BiolTechnology, 11: 1026-1030; Higuchi y
Watson, en PCR Applications, supra, capítulo 16; la patente
U.S. Nº 5.994.056 y 6.171.785, y las publicaciones de patente
europea Nº 487.218 y 512.334. La detección del DNA diana de doble
cadena se basa en el aumento de la fluorescencia que los colorantes
de unión a DNA, como el bromuro de etidio, muestran cuando se unen
a DNA de doble cadena. El aumento de DNA de doble cadena que
resulta de la síntesis de secuencias diana resulta en un aumento en
la cantidad de colorante unido a DNA de doble cadena y a un aumento
detectable concomitante de la fluorescencia. Para la
genotipificación utilizando los métodos de PCR cinética, las
reacciones de amplificación se realizan utilizando un par de
cebadores específicos de uno de los alelos, de forma que cada
amplificación puede indicar la presencia de un alelo particular.
Realizando dos amplificaciones, una utilizando cebadores específicos
del alelo salvaje y una utilizando cebadores específicos del alelo
mutante, puede determinarse el genotipo de la muestra respecto a
este SNP. De forma similar, realizando cuatro amplificaciones, cada
una de ellas con unos de los posibles pares utilizando cebadores
específicos de alelo tanto en los cebadores anteriores como en los
posteriores, puede determinarse el genotipo de la muestra respecto
a dos SNP. Esto proporciona información del haplotipo de un par de
SNP.
Los alelos también pueden identificarse
utilizando métodos basados en sondas, que se basan en la diferencia
en la estabilidad de los dúplex de hibridación formados entre una
sonda y su correspondiente secuencia diana que comprende un alelo
de IL4R, IL4 o IL13. Bajo condiciones de hibridación lo
suficientemente astringentes, se forman dúplex estables sólo entre
una sonda y la secuencia de su alelo diana y no con las secuencias
de otros alelos. La presencia de dúplex de hibridación estable
puede detectarse mediante cualquiera de una serie de métodos bien
conocidos. En general, es preferible amplificar un ácido nucleico
que incluye un lugar polimórfico de interés previamente a la
hibridación para facilitar su detección. Sin embargo, esto no es
necesario si puede obtenerse suficiente ácido nucleico sin una
amplificación.
Una sonda adecuada para su utilización en los
métodos basados en sondas de la presente invención, que contiene
una región de hibridación sustancialmente complementaria o
exactamente complementaria a la región diana de los ID. de SEC. Nº:
2, 88, 89 o 90, o la complementaria de los ID. de SEC. Nº: 2, 88, 89
o 90, en las que la región diana incluye el lugar polimórfico, y es
exactamente complementaria de una de los dos secuencias alélicas en
el lugar polimórfico, puede seleccionarse utilizando las reglas que
aquí se proporcionan y que son bien conocidas en la materia. De
forma similar, las condiciones de hibridación adecuadas, que
dependen del tamaño exacto y de la secuencia de la sonda, pueden
seleccionarse de forma empírica utilizando las reglas que aquí se
proporcionan y que son bien conocidas en la materia. La utilización
de sondas de oligonucleótido para detectar variaciones de
nucleótidos, lo que incluye diferencias de un único par de bases en
la secuencia, se describe en, por ejemplo, Conner et al.,
1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:278-282, y la
patente U.S. Nº 5.468.613 y 5.604.099.
En realizaciones preferibles de los métodos
basados en sondas para la determinación de los genotipos de IL4R,
IL4 o IL13, se amplifican múltiples secuencias de ácido nucleico de
los genes de IL4R, IL4 o IL13 que incluyen el lugar polimórfico, y
se hibridan a un conjunto de sondas bajo condiciones de hibridación
lo suficientemente astringentes. Los alelos presentes se infieren
del patrón de unión de las sondas a las secuencias diana
amplificadas. En esta realización, se realiza la amplificación para
proporcionar suficiente ácido nucleico para el análisis mediante la
hibridación de sondas. Por lo tanto, los cebadores se diseñan de
forma que las regiones de los genes de IL4R, IL4 o IL13 que
incluyen los lugares polimórficos se amplifican independientemente
del alelo presente en la muestra. La amplificación independiente
del alelo se consigue utilizando cebadores que hibridan con
regiones conservadas de los genes de IL4R, IL4 o IL13. Los genes de
IL4R, IL4 o IL13 contienen muchas regiones invariables o
monomórficas y pueden seleccionarse rutinariamente cebadores
adecuados independientes de alelo de los ID. de SEC. Nº: 1, 88, 89
o 90. Un experto reconocerá que, normalmente, la optimización
experimental de un sistema de amplificación es
útil.
útil.
Los formatos de ensayo adecuados para la
detección de los híbridos formados entre las sondas y las secuencias
de ácido nucleico diana en una muestra son conocidos en la materia
e incluyen el formato de diana inmovilizada
(dot-blot) y el formato de ensayo de sonda
inmovilizada (dot-blot inverso o
line-blot). Los formatos de ensayo de dot blot y
dot blot inverso se describen en las patentes U.S. Nº 5.310.893,
5.451.512, 5.468.613 y 5.604.099.
En un formato de dot-blot, el
DNA diana amplificado se inmoviliza sobre un soporte sólido, como
una membrana de nylon. El complejo membrana-diana
se incuba con sondas marcadas bajo condiciones de hibridación
adecuadas, la sonda no hibridada se elimina mediante lavado bajo
condiciones de astringencia adecuada, y se monitoriza la presencia
de sonda unida a la membrana. Un ensayo de dot-blot
preferible se describe en los ejemplos.
En el formato de dot-blot
inverso (o line-blot), las sondas se inmovilizan
sobre un soporte sólido, como una membrana de nylon o una placa
microtitulada. El DNA diana está marcado, normalmente durante la
amplificación mediante la incorporación de cebadores marcados.
Pueden estar marcados uno o ambos cebadores. El complejo
membrana-sonda se incuba con el DNA diana
amplificado marcado bajo condiciones de hibridación adecuadas, el
DNA diana no hibridado se elimina mediante lavado bajo condiciones
de astringencia adecuada, y se monitoriza la presencia de DNA diana
unido a la membrana. Un ensayo preferible de detección de
line-blot inverso se describe en los ejemplos.
La genotipificación basada en sondas puede
realizarse utilizando un ensayo "TaqMan" o "nucleasa 5'"
como se describe en las patentes U.S. Nº 5.210.015, 5.487.972 y
5.804.375; y en Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad Sci.
USA, 88:7276-7280. En el ensayo TaqMan, se añaden
sondas de detección marcadas que hibridan con la región amplificada
en la mezcla de reacción de amplificación. Las sondas están
modificadas para evitar que las sondas actúen como cebadores para
la síntesis de DNA. La amplificación se realiza utilizando una
polimerasa de DNA que posee actividad exonucleasa de 5' a 3', por
ejemplo, la polimerasa de DNA Tth. Durante cada paso de síntesis de
la amplificación, cualquier sonda que hibrida con el ácido nucleico
diana a continuación del cebador que se va a extender se degrada
por la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la polimerasa de DNA. Por
lo tanto, la síntesis de una nueva cadena diana también resulta en
la degradación de una sonda, y la acumulación del producto de
degradación proporciona una medida de la síntesis de secuencias
diana.
Cualquier método adecuado para la detección del
producto de degradación puede utilizarse en el ensayo TaqMan. En un
método preferible, las sondas de detección están marcadas con dos
colorantes fluorescentes, y uno de ellos es capaz de bloquear la
fluorescencia del otro colorante. Los colorantes están unidos a la
sonda, preferiblemente uno está unido al extremo 5' y el otro está
unido a un punto interno, de forma que el bloqueo ocurre cuando la
sonda está en forma no hibridada y de forma que la escisión de la
sonda por la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la polimerasa de
DNA ocurre entre los dos colorantes. La amplificación resulta en la
escisión de la sonda entre los colorantes con una eliminación
concomitante del bloqueo y un aumento de la fluorescencia
observable del colorante inicialmente bloqueado. La acumulación de
producto de degradación se monitoriza mediante la medida del
aumento en la reacción de fluorescencia. Las patentes U.S. Nº
5.491.063 y 5.571.673 describen métodos alternativos para la
detección de la degradación de sonda que aparece de forma
concomitante con la amplificación.
El ensayo TaqMan puede utilizarse con cebadores
de amplificación específicos de alelo de forma que la sonda se
utiliza sólo para detectar la presencia de producto amplificado. Tal
ensayo se realiza como se describe para la PCR cinética descrita
anteriormente. Alternativamente, el ensayo TaqMan puede utilizarse
con una sonda específica de la diana.
Ejemplos de otras técnicas que pueden utilizarse
para la genotipificación basada en sondas incluyen, pero no se
limitan a, Amplifluor™, intercalado-unión de
colorantes, transferencia de energía de resonancia de la
fluorescencia (FRET), método de amplificación de la señal de
hibridación (HSAM), Sondas HYB™, tecnología invasor/cleavasa
(Invader/CFLP™), balizas moleculares™, Origen™, amplificación de la
ramificación basada en el DNA (RAM™), amplificación de círculo
rodante (RCA™), Scorpions™, amplificación de desplazamiento de la
cadena (SDA).
Los formatos de ensayo descritos anteriormente
normalmente utilizan oligonucleótidos marcados para facilitar la
detección de los dúplex híbridos. Los oligonucleótidos pueden estar
marcados mediante la incorporación de una señal detectable mediante
métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos,
radiológicos, radioquímicos o químicos. Los marcajes útiles
incluyen el ^{32}P, colorantes fluorescentes, reactivos
electrodensos, enzimas (como se utiliza normalmente en los ELISA),
biotina o haptenos y proteínas para los que están disponibles
antisueros o anticuerpos monoclonales. Los oligonucleótidos marcados
de la invención pueden sintetizarse y marcarse utilizando las
técnicas descritas anteriormente para la síntesis de
oligonucleótidos. Por ejemplo, un ensayo de
dot-blot puede realizarse utilizando sondas marcadas
con biotina, como se describe en Levenson et al., 1989, en
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et
al., Eds., Academic Press. San Diego), págs
99-112. Tras la hibridación del DNA diana
inmovilizado con las sondas biotiniladas bajo condiciones
específicas de secuencia, las sondas que permanecen unidas se
detectan mediante una primera unión a la biotina de
avidina-peroxidasa de rábano picante
(A-HRP) o estreptavidina-peroxidasa
de rábano picante (SA-HRP), que entonces se detecta
realizando una reacción en la que la HRP cataliza un cambio de color
de un cromógeno.
Sea cual sea el método para la determinación de
cuales oligonucleótidos de la invención hibridan selectivamente con
las secuencias alélicas de IL4R, IL4 o IL13 en una muestra, la
característica principal del método de tipificación involucra la
identificación de los alelos de IL4R, IL4 o IL13 presentes en la
muestra mediante la detección de las secuencias variantes
presentes.
La presente invención también está relacionada
con los métodos para la determinación del riesgo de un individuo de
padecer diabetes tipo 1, lo que comprende, la detección de 2 o más,
especialmente 6, 7, 8 o los 10 polimorfismos de IL4R que se listan
en la Tabla 21 en una muestra de ácido nucleico de un individuo, en
el que la presencia de dicho(s)
polimorfismo(s) indica el riesgo de un individuo de padecer diabetes tipo 1.
polimorfismo(s) indica el riesgo de un individuo de padecer diabetes tipo 1.
La presente invención también está relacionada
con un equipo, una unidad contenedora que comprende los componentes
útiles para poner en práctica el presente método. Un equipo útil
puede contener sondas de oligonucleótido específicas de los alelos
de IL4R, IL4 o IL13 así como las instrucciones para su utilización
para determinar el riesgo de padecer una enfermedad autoinmune como
la diabetes tipo 1. En algunos casos, las sondas de detección
pueden estar fijadas a una membrana de soporte apropiada. El equipo
también puede contener cebadores de amplificación para amplificar
las regiones de los locus de IL4R, IL4 o IL13 que incluyen los
lugares polimórficos, y tales cebadores son útiles en la
realización preferible de la invención. Alternativamente, los
equipos útiles pueden contener un conjunto de cebadores que
comprende un cebador específico de alelo para la amplificación
específica de los alelos de IL4R, IL4 o IL13. Otros componentes
opcionales de los equipos incluyen reactivos adicionales utilizados
en los métodos de genotipificación como se describen aquí. Por
ejemplo, un equipo puede contener de forma adicional un agente para
catalizar la síntesis de productos de extensión del cebador,
nucleósidos trifosfato sustrato, reactivos para el marcaje y/o
detección del ácido nucleico (por ejemplo, un conjugado
avidina-enzima, sustrato del enzima y cromógeno si
el marcaje es biotina) y los tampones apropiados para las
reacciones de amplificación o hibridación.
La presente invención también está relacionada
con un chip, un soporte con oligonucleótidos inmovilizados útiles
para la práctica del presente método. Un chip útil puede contener
sondas de oligonucleótido específicas de los alelos de IL4R, IL4,
IL13 o ciertas combinaciones de alelos de IL4R, IL4 y/o IL13. Los
oligonucleótidos pueden estar inmovilizados sobre un sustrato, por
ejemplo, una membrana o vidrio. Los oligonucleótidos pueden, pero
no es necesario, estar marcados. En algunas realizaciones, el chip
puede ser un microchip. En algunas realizaciones, el chip puede
comprender uno o más oligonucleótidos utilizados para detectar la
presencia de dos o más alelos de IL4R, IL4, IL13 o ciertas
combinaciones de alelos de IL4R, IL4 y/o IL13.
Los ejemplos de la presente invención que se
presentan a continuación se proporcionan sólo con propósitos
ilustrativos y no para limitar el alcance de la invención. Varias
realizaciones de la invención dentro del alcance de las
reivindicaciones que siguen los Ejemplos serán obvias para los
expertos en la materia a partir de la lectura del texto anterior y
de los siguientes ejemplos.
Este ejemplo describe un método para la
genotipificación de SNP en los locus de IL4R, IL4 e IL13 que están
asociados con la diabetes tipo 1. Se utilizaron dos métodos de
genotipificación diferentes, el ensayo de line blot y el
termociclado cinético, en función de la región y del gen
genotipificado.
Ocho ejemplos de SNP en el gen de IL4R humano
(listado en la Tabla 6), un ejemplo de SNP en el gen de IL4 humano
(Tabla 2) y dos ejemplos de SNP en el gen de IL4R humano (Tabla 2)
se genotipificaron utilizando este método. Cada SNP se describe
mediante su posición en la secuencia de referencia de acceso en
GenBank. Por ejemplo, el SNP 1 de la Tabla 6 se encuentra en la
posición 398 de X52425.1 (ID. de SEC. Nº: 1), en el que está
presente un nucleótido "A". El alelo variante en esta posición
tiene un nucleótido "G". Los SNP se denominarán mediante el nº
de SNP en el texto subsiguiente.
Las regiones de los genes de IL4R, IL4 e IL13
que incluyen los SNP se amplificaron y se identificaron los
nucleótidos presentes mediante la hibridación de sondas. La
detección de sondas se realizó utilizando un formato de sondas
inmovilizadas (line blot).
Los pares de cebadores utilizados para
amplificar las regiones que incluyen los ocho SNP de IL4R se listan
en la Tabla 7 (ID. de SEC. Nº: 25-36) y los que se
utilizan para amplificar las regiones que incluyen los SNP de IL4 y
los dos SNP de IL13 se listan en la Tabla 30 (ID. de SEC. Nº:
69-74). Los SNP de IL4R número 3, 4 y 5 (Tabla 6)
se coamplificaron en el mismo fragmento de 228 pares de bases. Los
cebadores se modificaron en el fosfato 5' mediante la conjugación
con biotina. Los reactivos para la síntesis de oligonucleótidos con
un marcaje de biotina unido en el fosfato 5' están comercialmente
disponibles de Clontech (Palo Alto, CA) y Glenn Research (Sterling,
VA). Un reactivo preferible es Biotin-ON de
Clontech.
La amplificación de seis regiones del gen de
IL4R, que incluyen ocho lugares polimórficos, la región del gen de
IL4, que incluye un lugar polimórfico, y las dos regiones del gen de
IL13, que incluye dos lugares polimórficos, se realizó utilizando
los pares de cebadores que se muestran a continuación. Todos los
cebadores se muestran con orientación de 5' a 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 114 pares de bases que incluye la posición de nucleótido 398 del
gen de IL4R.
- RR192B (ID. de SEC. Nº: 25) CAGCCCCTGTGTCTGCAGA
- RR193B (ID. de SEC. Nº: 31) GTCCAGTGTATAGTTATCCGCACTGA
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 163 pares de bases que incluye la posición de nucleótido
676.
- DBM0177B (ID. de SEC. Nº: 26) CTGACCTGGAGCAACCCGTA
- DBM0178B (ID. de SEC. Nº: 32) ACTGGGCCTCTGCTGGTCA
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 228 pares de bases que incluye las posiciones de nucleótido
1374, 1417 y 1466 del gen de IL4R.
- DBM0023B (ID. de SEC. Nº: 27) ATTGTGTGAGGAGGAGGAGGAGGTA
- DBM0022B (ID. de SEC. Nº: 33) GTTGGGCATGTGAGCACTCGTA
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 129 pares de bases que incluye la posición de nucleótido 1682
del gen de IL4R.
- DBM0097B (ID. de SEC. Nº: 28) CTCGTCATCGCAGGCAA
- DBM0098B (ID. de SEC. Nº: 34) AGGGCATCTCGGGTTCTA
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 198 pares de bases que incluye la posición de nucleótido 1902
del gen de IL4R.
- RR200B (ID DE SEC. Nº: 29) GCCGAAATGTCCTCCAGCA
- RR178B (ID DE SEC. Nº: 35) CCACATTTCTCTGGGGACACA
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 177 pares de bases que incluye la posición de nucleótido 2531
del gen de IL4R.
- DBM0112B (ID DE SEC. Nº: 30) CCGGCCTCCCTGGCA
- DBM0071B (ID DE SEC. Nº: 36) GCAGACTCAGCAACAAGAGG
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 107 pares de bases que incluye la posición de nucleótido 582 de
la región promotora del gen de IL4R.
- RR169B (ID. de SEC. Nº: 69) ACTAGGCCTCACCTGATACGA
- RR170B (ID. de SEC. Nº: 72) CATAGAGGCAGAATAACAGGCAGA
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 118 pares de bases que incluye la posición de nucleótido 4045
del intrón 3 del gen de IL13.
- DBM0165B (ID DE SEC. Nº: 70) CTCGGACATGCAAGCTGGAA
- DBM0166B (ID DE SEC. Nº: 73) ACTGAATGAGACAGTCCCTGGA
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores amplifican una región
de 187 pares de bases que incluye el codón 4166 del exón 4 del gen
de IL13.
- DBM0167B (ID. de SEC. Nº: 71) AATCGAGGTGGCCCAGTTTGTA
- DBM0168B (ID. de SEC. Nº: 74) CCTAACCCTCCTTCCCGCCTA
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación por PCR se realizó en un
volumen total de reacción de 25-100 \mul que
contienen los siguientes reactivos:
- 0,2 ng/\mul de DNA genómico humano purificado
- 0,2 mM de cada cebador
- 800 mM dNTP total (200 mM de dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- 70 mM KCl
- 12 mM Tris-HCl, pH 8,3
- 3 mM MgCl_{2},
- 0,25 unidades/\mul polimerasa de DNA AmpliTaq Gold™*
- \text{*} desarrollada y elaborada por Hoffmann-La Roche y comercialmente disponible de Applera (Foster City, CA).
La amplificación se realizó en un termociclador
GeneAmp™ PCR System 9600 (Applera, Foster City, CA), utilizando el
perfil de ciclado de temperaturas específico que se muestra a
continuación.
- Incubación pre-reacción: 94ºC durante 12,5 minutos
- 33 ciclos: desnaturalización: 95ºC durante 45 segundos
\hskip2.5cmhibridación: 61ºC durante 30 segundos
\hskip2.5cmextensión: 72ºC durante 45 segundos
- Extensión final: 72ºC durante 7 minutos
- Mantenimiento: 10ºC - 15ºC
Las sondas preferibles utilizadas para
identificar los nucleótidos presentes en los 8 SNP presentes en los
ácidos nucleicos amplificados de IL4R se describen en la Tabla 3. Se
muestran dos sondas para la detección de T1466; se utilizó una
mezcla de las dos sondas.
Las sondas preferibles utilizadas para
identificar los nucleótidos presentes en el SNP presente en los
ácidos nucleicos amplificados de IL4 y los dos SNP presentes en los
ácidos nucleicos amplificados de IL13 se describen en la Tabla 29.
Todas las sondas se muestran con orientación de 5' a 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
En el formato de sondas inmovilizadas, las
sondas se inmovilizaron en un soporte sólido previamente a su
utilización en la hibridación. El complejo de
sonda-soporte se sumergió en una solución que
contenía ácido nucleico amplificado desnaturalizado (marcado con
biotina) para permitir que ocurra la hibridación. El ácido nucleico
no unido se eliminó mediante lavado bajo condiciones de hibridación
astringentes, y el ácido nucleico que permanece unido a las sondas
inmovilizadas se detectó utilizando una reacción cromogénica. Los
detalles del ensayo se describen a continuación.
Para su utilización en el formato de detección
de sondas inmovilizadas, descrito a continuación, se unió una
porción al fosfato 5' de la sonda para facilitar su inmovilización
sobre un soporte sólido. Véase Cheng et al., 1999, Genome
Res 9:936-949, incorporada aquí como referencia.
Preferiblemente, se une albúmina sérica bovina (BSA) al fosfato 5'
esencialmente como se describe en Tung et al., 1991,
Bioconjugate Chem., 2:464-465. Alternativamente, se
añade una cola de poli-T al extremo 5' como se
describe en la patente U.S. Nº 5.451.512.
Las sondas se aplicaron en un formato lineal en
láminas de membrana de nylon (por ejemplo, filtros de nylon
BioDyne™ B, Pall Corp., Glen Cove, NY) utilizando un dispensador
Linear Striper y controlador Multispense2000™ (IVEK, N.
Springfield, VT). La detección del alelo salvaje del SNP nº 5 (Tabla
6) se realizó utilizando una mezcla de dos sondas como se lista;
esta mezcla permite la detección del SNP nº 5 de forma independiente
de otros SNP cercanos. Los títulos de sonda se eligieron de forma
que alcanzan el equilibrio de señal entre las variantes alélicas;
los títulos utilizados se proporcionan en la Tabla de sondas
anterior. Cada lámina se cortó en tiras de entre 0,35 y 0,5 cm de
ancho. Para desnaturalizar los productos de amplificación, se
añadieron 20 \mul de producto de amplificación (basado en una
reacción de 50 \mul) a 20 \mul de solución de desnaturalización
(NaOH al 1,6%) y se incubó a temperatura ambiente para completar la
desnaturalización.
El producto de amplificación desnaturalizado (40
\mul) se añadió al pocillo de una bandeja de tipificación que
contiene 3 ml de tampón de hibridación (4X SSPE, SDS al 0,5%) y la
tira de membrana.
Se permitió que las hibridaciones sucedieran
durante 15 minutos a 55ºC en un baño de agua rotatorio. Tras la
hibridación, la solución de hibridación se aspiró, la tira se lavó
en 3 ml de tampón de lavado templado (2X SSPE, SDS al 0,5%)
agitando suavemente las tiras, y se aspiró tampón de lavado. Tras el
lavado, las tiras se incubaron en 3 ml de solución de conjugado
enzimático (3,3 ml de tampón de hibridación y 12 \mul de
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante
(SA-HRP)) en baño de agua rotatorio durante 5
minutos a 55ºC. Entonces las tiras se lavaron con tampón de lavado,
como anteriormente, se incubaron en tampón de lavado a 55º durante
12 minutos (lavado astringente), y finalmente se lavaron con tampón
de lavado de nuevo.
El ácido nucleico diana, ahora marcado con HRP,
que permanece unido al producto de amplificación inmovilizado se
visualizó como sigue. Se preparó una solución de revelado mediante
la mezcla de 100 ml de tampón citrato (citrato sódico 0,1 M, pH
5,0), 5 ml de solución de
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (2 mg/ml de TMB
en polvo de Fluka, Milwaukee, WI, disuelto en EtOH al 100%), y 100
\mul de peróxido de hidrógeno al 3%. Las tiras se lavaron
inicialmente en citrato sódico 0,1 M (pH 5,0) durante 5 minutos,
luego se incubaron en la solución de revelado con agitación suave
durante entre 8 y 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. El
TMB, que inicialmente no tiene color, se convierte mediante la HRP
unida a la diana, en presencia de peróxido de hidrógeno en un
precipitado coloreado. Las tiras reveladas se lavaron en agua
durante varios minutos y se fotografiaron inmediata-
mente.
mente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos SNP del promotor de IL4R y los dos del
promotor de IL13 se genotipificaron utilizando una PCR específica
de alelo en un termociclador PE9700 (ABI) midiendo la fluorescencia
del SyBr Green (Molecular Probes) (Higuchi, Fockler, Dollinger,
Watson. Biotechnology 11:1026-30 (1993)). Para cada
DNA, se realizaron dos amplificaciones en paralelo. Una contenía
cebadores específicos; la otra contenía el cebador común y otro
cebador específico de alelo. Los cebadores utilizados para
genotipificar los dos SNP del promotor de IL4R se proporcionan en
la Tabla 31 y los cebadores utilizados para genotipificar los dos
SNP del promotor de IL13 se proporcionan en la Tabla 32. La
amplificación del DNA con un cebador específico de alelo particular
indica la presencia del alelo correspondiente. Un aumento de la
fluorescencia del SyBr Green indica la acumulación de producto de
amplificación. Un experto en la materia podrá correlacionar el
cambio de la fluorescencia con la presencia o ausencia de producto
de amplificación, y por lo tanto, la presencia o ausencia del alelo
correspondiente.
La amplificación de PCR se realizó en un volumen
total de reacción de 100 \mul que contienen los siguientes
reactivos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación se realizó en un termociclador
GeneAmp™ PCR System 9600 (Applera, Foster City, CA), utilizando el
perfil de ciclado de temperatura específico que se muestra a
continuación.
- \quad
- 2 minutos a 50ºC
- Incubación pre-reacción:
- 12 minutos a 94ºC
- 50 ciclos: desnaturalización:
- 20 segundos a 95ºC
- hibridación:
- 20 segundos a 58ºC
- Extensión final:
- 5 minutos a 72ºC
Este ejemplo demuestra la asociación de los SNP
de IL4R con la diabetes tipo 1 en familias del HBDI.
La genotipificación de IL4R se realizó en
individuos de 282 familias caucásicas escogidas porque tenían dos
descendientes afectados de diabetes tipo 1. Los genotipos de IL4R de
todos los individuos se determinaron. La genotipificación de IL4R
se realizó utilizando un método de genotipificación esencialmente
como el que se describe en el Ejemplo 1. Además de los 564
descendientes (2 hermanos en cada una de las 282 familias) de los
pares de hermanos afectados en los que se basa la elección, había
otros 26 hijos afectados. Había 270 descendientes no afectados
entre estas familias.
Las muestras basadas en las familias se
proporcionaron como DNA genómico purificado del Intercambio de Datos
Biológicos Humanos (HBDI), que es un depósito de líneas celulares
de familias afectadas por la diabetes tipo 1. Todas las familias
del HBDI utilizadas en este estudio son familias nucleares con
progenitores no afectados (genéticamente no relacionados) y al
menos dos hermanos afectados. Estas muestras se describen además en
Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet.
59:1134-1148.
Es conocido que el genotipo del HLA puede tener
un efecto significativo, tanto de aumento como de reducción
dependiendo del genotipo, en el riesgo de padecer diabetes tipo 1.
En particular, los individuos con el genotipo de HLA DR
DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302
(denominado DR3/DR4 a continuación) parecen tener el mayor riesgo de
padecer diabetes tipo 1 (véase Noble et al., 1996, Am. J.
Hum. Genet., 59:1134-1148). Estos individuos de
riesgo elevado tienen alrededor de 1 posibilidad entre 15 de estar
afectados con diabetes tipo 1. A causa del fuerte efecto de este
genotipo en la probabilidad de la diabetes tipo 1, la presencia del
genotipo DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302
podría enmascarar la contribución de las variantes alélicas de
IL4R.
Los individuos de estas familias también se
genotipificaron en los locus de HLA DRB1 y DQB1. De los pares de
hermanos afectados, ambos hermanos tenían el genotipo DR3/DR4 en 90
familias. Ninguno de los hermanos afectados tenía el genotipo DR
3/4 en 144 familias. Exactamente uno de los hermanos afectados
tenían el genotipo DR 3/4 en las 48 familias restantes.
Como los ocho SNP de IL4R están tanto
físicamente como genéticamente íntimamente ligados el uno al otro,
la presencia de un alelo particular en un SNP particular se
correlaciona con la presencia de otro alelo particular en un SNP
cercano. Esta asociación no aleatoria de dos o más alelos de SNP se
conoce como desequilibrio de ligamiento (DL).
El desequilibrio de ligamiento entre los ocho
SNP de IL4R se evaluó utilizando los genotipos de los 282 pares de
progenitores. Estos 564 individuos no están relacionados entre ellos
excepto por matrimonio. Un resumen de la frecuencia calculada del
alelo salvaje para cada SNP en este grupo de 564 individuos (los
"fundadores del HBDI") se muestra en la Tabla 9.
El cálculo del DL puede realizarse de varias
formas. se utilizaron dos métodos complementarios para evaluar el
DL entre todos los pares de locus de SNP de IL4R. En el primer
método, se calcularon los valores de dos medidas distintas pero
relacionadas del DL, llamadas D' y D (Devlin y Risch 1995, Genomics,
29(2):311-22), utilizando el algoritmo de
estimación de la máxima probabilidad de Hill (Hill, 1974, Heredity,
33(2): 229-39). Los valores de D' y D para
todos los pares de SNP de IL4R se muestran en la Tabla 10, en la
parte triangular inferior izquierda. Tanto D' como D pueden tener
valores que oscilan entre -1 y +1. Los valores cercanos a +1 o -1
sugieren un fuerte desequilibrio de ligamiento; los valores cercanos
a cero indican la ausencia de DL.
Una segunda medida del DL utiliza el método de
la prueba de permutación implementado en el programa Arlequin
(Excoffier et al., 1995, Mol Biol Evol,
12:921-7, Universidad de Génova, CH) (Slatkin et
al., 1996, Heredity, 76:377-83). Este método
maximiza el estadístico cociente de probabilidad (S = -2log
(L_{H*}/L_{H})) mediante la permutación de alelos y el
recálculo de S en un gran número de iteraciones hasta que S se
maximiza. Estas iteraciones permiten la determinación de la
distribución nula de S, y por lo tanto la S máxima obtenida puede
convertirse en un valor exacto de P (nivel de significación). Estos
valores de P se listan en la porción triangular superior derecha de
la Tabla 10.
La Tabla 10 de DL a pares muestra que existe una
evidencia significativa de DL entre los SNP 1 y 2, y entre (todas
las combinaciones de) los SNP 3, 4, 5, 6, 7 y 8. Se conoce que los
SNP del 3 al 8 se sitúan dentro de 1200 pares de bases de un único
exón (exón 9) del gen de IL4R, y el DL entre estos SNP es evidente
también por la pequeña distancia genética.
La prueba de la transmisión del desequilibrio
(PTD) de Spielman (Spielman y Ewens, 1996, Am J Hum Genet, 59
(5):983-9; Spielman y Ewens, 1998, Am J Hum Genet,
62(2):450-8) se realizó en los datos de
genotipo de IL4R de los 282 pares de hermanos afectados (es decir,
estructura familiar que consiste en los dos progenitores y los dos
hijos afectados). La PTD se utilizó para valorar la asociación de
los alelos del individuo de los ocho SNP de IL4R con la diabetes
tipo 1. La PTD evalúa si un alelo se transmite de progenitores
heterozigotos a sus hijos afectados con una frecuencia que es
significativamente diferente de la esperada por azar. En la
hipótesis nula de no asociación de un alelo con la enfermedad, un
progenitor heterozigoto transmitirá o no transmitirá un alelo con
la misma frecuencia a un hijo afectado. La significación de la
desviación de la hipótesis nula puede evaluarse utilizando la
prueba estadística de chi-cuadrado de McNemar
(=(T-NT)^2/(T+NT), en la que T es el número
observado de transmisiones y NT es el número observado de no
transmisiones). La significación (valor P) de la prueba estadística
de chi-cuadrado de McNemar es igual al estadístico
chi-cuadrado de Pearson con un grado de libertad
(Glantz et al., Primer of biostatistics., New York, McGraw
Hill Health Professions Division, 1997).
Los resultados de la PTD de los locus
individuales de los SNP se muestran en las tablas 11A y 11B. Se
utilizó el programa PTD/S-PTD (versión 1.1) de
Spielman para realizar el contaje de los alelos transmitidos y no
transmitidos (Spielman, McGinnis et al., 1993, Am J Hum
Genet, 52(3):506-16; Spielman y Ewens, 1998,
supra). La Tabla lista las transmisiones observadas del
alelo salvaje en cada locus de SNP. Como estos polimorfismos son
bialélicos, los contajes de transmisión del alelo variante son
iguales a los de no transmisión del alelo salvaje.
Los contajes de las transmisiones y no
transmisiones de los alelos a los casos índice, que sólo se
muestran en la Tabla 11A, no alcanzan una significación
estadística, a \alpha = 0,05. Sin embargo, es válida para el
contaje de los eventos de transmisión a todos los hijos
afectados. Sin embargo, cuando la PTD se utiliza de este modo (o
con este propósito, con más de una hijo por familia), entonces una
prueba estadística significativa es evidencia sólo de ligamiento,
no de asociación y ligamiento. La Tabla 11B muestra el análisis de
PTD cuando se incluyen 26 hijos afectados adicionales. Los
resultados que se presentan en la Tabla 11B a continuación muestran
que existe una desviación significativa de las frecuencias de
transmisión esperadas para los alelos de los SNP 3, 4, 5 y 6. El
análisis de los valores de "% de transmisión" para estos SNP
indica que el alelo salvaje se transmite a los hijos afectados con
frecuencias superiores que la previsión del 50%.
La evidencia de un marcado DL entre los ocho SNP
de IL4R sugiere que la transmisión del conjunto ordenado de alelos
de cada progenitor a cada hijo afectado en la cohorte del HBDI puede
detectarse. Este conjunto ordenado de alelos corresponde
físicamente a uno de los dos cromosomas parentales, y se denomina
haplotipo. Infiriendo los haplotipos parentales y su transmisión o
no transmisión a los hijos afectados, se espera obtener más
información estadística que con sólo los alelos.
Los haplotipos se infirieron utilizando una
combinación de dos métodos. Como paso inicial, se utilizó el
programa Gene Hunter (Falling Rain Genomics, Palo Alto, CA)
(Kruglyak, et al., 1996, Am J Hum Genet,
58(6):1347-63) ya que calcula muy
rápidamente los haplotipos a partir de los datos de genotipo de los
pedigríes. Cada pedigrí familiar del HBDI se analizó entonces de
forma individual utilizando el programa Cyrillic (Cherwell
Scientific Publishing, Palo Alto, CA), para resolver cualquier
adjudicación de haplotipo ambigua o no fundamentada. Los haplotipos
no ambiguos y no recombinantes pudieron asignarse con certeza en
todas excepto en 6 de las 282 familias. Los datos de los haplotipos
de estas 276 familias se utilizaron en el subsiguiente análisis de
datos.
El gen de IL4R tiene la propiedad de que muchos
de sus SNP se sitúan en el exón más a 3' (exón 9), cuya región
codificante es de aproximadamente 1,5 Kb de longitud. Se desarrolló
un método para la haplotipificación directa de hasta cinco de estos
alelos del exón 9 (es decir, los SNP nº 3-7) sin
necesidad de los genotipos parentales. Muchos de estos SNP resultan
en cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína IL4R, por
lo que diferentes haplotipos codifican diferentes proteínas con
posiblemente diferentes funciones.
Los haplotipos, en un individuo del que no se
posee información genotípica parental, pueden inferirse de forma no
ambigua sólo cuando un máximo de uno de los lugares de estos SNP es
heterozigoto. En otros casos, la ambigüedad puede resolverse de
forma experimental.
Se utilizaron dos cebadores específicos de alelo
con un cebador en común para realizar las reacciones de PCR
(utilizando la polimerasa Stoffel Gold™) para amplificar
separadamente el DNA de cada cromosoma, como se muestra en la
Figura 1 a continuación. Los alelos de cada amplicón se detectaron
entonces mediante el mismo procedimiento de hibridación de tiras, y
los alelos ligados se obtuvieron directamente. La elección de
cebadores específicos de alelo (flechas coloreadas o sombreadas) y
comunes (flechas negras) depende de cuales locus de SNP son
heterozigotos. Los cebadores se modificaron en el fosfato 5'
mediante la conjugación de biotina, y se muestran en la Tabla 12
(ID. de SEC. Nº: 54-62).
En cada ensayo de haplotipificación, se
prepararon dos reacciones de PCR para cada DNA a analizar. Una
reacción contenía el cebador común y el cebador específico del
alelo salvaje, la otra contenía el cebador común y el cebador
específico del alelo variante. Cada reacción de PCR se realizó en un
volumen total de reacción de 50-100 \mul que
contenían los siguientes reactivos:
- 0,2 ng/\mul de DNA genómico humano purificado
- 0,2 mM de cada cebador
- 800 mM dNTP total (200 mM de dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- 10 mM KCl
- 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
- 2,5 mM MgCl_{2},
- 0,12 unidades/ml polimerasa de DNA Stoffel Gold™*
- \text{*} desarrollada y elaborada por Roche Molecular Systems.
La amplificación se realizó en un termociclador
GeneAmp™ PCR System 9600 (PE Biosystems, Foster City, CA),
utilizando el perfil de ciclado de temperaturas específico que se
muestra a continuación.
- Incubación pre-reacción:
- 94ºC durante 12,5 minutos
- 33 ciclos: desnaturalización:
- 95ºC durante 45 segundos
- hibridación:
- 64ºC durante 30 segundos
- extensión:
- 72ºC durante 45 segundos
- Extensión final:
- 72ºC durante 7 minutos
- Mantenimiento:
- 10ºC - 15ºC
Tras la amplificación, cada producto de reacción
de PCR se desnaturalizó y se utilizó separadamente para la
hibridación con las sondas unidas a membrana como se ha descrito
anteriormente.
La evidencia del ligamiento de IL4R a la
diabetes tipo 1 (opuesto a asociación) puede valorarse mediante el
método de coincidencia de haplotipos. Este método evalúa la
distribución en todas las familias del número de cromosomas que son
idénticos por descendencia (IPD) entre los dos hermanos afectados en
cada familia. Por ejemplo, en una familia, el padre transmite el
mismo de sus dos haplotipos de IL4R a ambos hijos, y la madre
transmite el mismo de sus dos haplotipos de IL4R a ambos hijos,
entonces se dice que los hijos comparten dos cromosomas IPD (o, son
IPD = 2). Si ambos progenitores transmiten haplotipos de IL4R
diferentes a sus dos hijos, se dice que los hijos son IPD = 0.
Bajo la hipótesis nula de no ligamiento de IL4R
a la diabetes tipo 1, la proporción de familias IBD = 0 es del 25%,
de IBD = 1 es del 50% y de IBD = 2 es del 25%, como se espera por
una distribución al azar (véase Tabla 13). La evidencia de una
diferencia estadísticamente significativa de esta expectativa puede
valorarse utilizando el estadístico de
chi-cuadrado.
Los valores de identidad por descendencia (IPD)
de los haplotipos parentales de IL4R en los hermanos afectados
pudieron determinarse de forma no ambigua en 256 familias. En el
resto de familias, uno o ambos progenitores eran homozigotos y/o el
origen paterno de los cromosomas de los hijos no pudo determinarse.
La distribución de la IPD se muestra en la Tabla 13.
Es conocido que el genotipo del HLA puede tener
un efecto significativo, tanto un aumento como una reducción en
función del genotipo, sobre el riesgo de padecer diabetes tipo 1. En
particular, los individuos con el genotipo de
HLA-DR
DR3-DQB1*0201/DR4-DBQ1*0302
(denominados DR3/4 a continuación) parecen tener el mayor riesgo de
padecer diabetes tipo 1 (véase Noble, Valdes et al., 1996),
incorporado aquí como referencia). Estos individuos con riesgo
elevado tienen alrededor de 1 posibilidad entre 15 de estar
afectados de diabetes tipo 1. A causa del potente efecto de este
genotipo en la probabilidad de padecer diabetes tipo 1, la presencia
del genotipo DR3/4 podría enmascarar la contribución de los alelos
o haplotipos de IL4R.
La distribución de la IPD en las familias se
estratificó en dos grupos basados en el genotipo DR3/4 de los
hijos. El primer grupo contiene a las familias en las que uno o
ambos de los hermanos son DR3/4 ("uno/ambos hermanos DR3/4", n
= 119). El segundo grupo contiene a las familias en las que ningún
hijo es DR3/4 ("ningún hermano DR3/4", n = 137). La
distribución de IPD en estos subgrupos se muestra en la Tabla 13. No
existía una diferencia estadísticamente significativa de la
distribución esperada de la coincidencia de IPD en el subgrupo de
familias de "uno/ambos hermanos DR3/4". Existe una diferencia
estadísticamente significativa de la distribución esperada de la
coincidencia de IPD en el subgrupo de familias de "ningún hermano
DR3/4" (Tabla 13). Esto indica que existe una evidencia de
ligamiento del locus de IL4R con la DMID en las familias de
"ningún hermano DR3/4".
La asociación de los haplotipos de IL4R con la
diabetes tipo 1 se evaluó utilizando el método de CDFA (Control
dentro de la familia afectada) (Thomson G., 1995, Am J Hum Genet
57:487-98). Brevemente, se comparan dos grupos de
haplotipos, y las frecuencias de los haplotipos en los grupos, entre
ellos como en un sistema de muestreo de caso/control. Estos dos
grupos son los haplotipos caso (transmitidos) y los control
(CDFA).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los haplotipos caso, es decir los transmitidos a
los hijos afectados, se registraron y contaron como sigue. Para
cada par de hermanos, se contaron los cuatro cromosomas
transmitidos, independientemente del estado de los progenitores
(homozigotos o heterozigotos). Sin embargo, los haplotipos en los
dos hermanos de un par no son independientes el uno del otro. La
forma de realizar una enumeración estadísticamente conservadora y
válida es dividiendo todos los contajes entre dos.
Los haplotipos control (CDFA) son aquellos que
nunca se transmiten al par de hijos afectados (Thomson, 1995). Los
haplotipos CDFA permiten una estimación no sesgada de las
frecuencias de los haplotipos control. Los CDFA sólo pueden
determinarse a partir de progenitores heterozigotos, y además, sólo
cuando el progenitor transmite un haplotipo a ambos hijos; el otro
haplotipo que no se transmite se cuenta en la población CDFA. La
población CDFA sirve como un conjunto bien emparejado de haplotipos
control para el estudio.
La Tabla 14A muestra la comparación de las
frecuencias transmitidas y CDFA para todos los haplotipos del HBDI
que se observaron al menos cinco veces en el conjunto de muestras
completo. Cada fila representa los datos del haplotipo de un
individuo. Sin embargo, aunque se observaron 16 haplotipos distintos
en el conjunto de datos de HBDI, algunos aparecían muy raramente.
Los siete haplotipos más infrecuentes se agruparon juntos en la
fila "otros". Cada haplotipo se lista mediante el conjunto
ordenado de alelos (es decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8)
presentes en cada uno de los ocho SNP de IL4R como se describe en la
Tabla 6. Un "1" indica la presencia del alelo de referencia,
un "2" la presencia del alelo variante para cada SNP. El alelo
de "referencia" para cada SNP es el que está presente en
GenBank nº de acceso X52425.1 como se describe en la Tabla 6.
Las Tablas 14B y 14C muestran la comparación de
las frecuencias de transmitidos y CDFA para todos los haplotipos
del HBDI observados en los subgrupos de familias de "uno/ambos
hermanos DR3/4" y de "ningún hermano DR3/4",
respectivamente. Estas tablas muestran que la estratificación de las
familias basada en el genotipo DR3/4 de los hijos permite la
identificación de haplotipos que están asociados con la DMID. En
particular, en el subgrupo de "ningún hermano DR3/4" un
haplotipo (identificado como "2 1 2 2 2 2 2 1") está
significativamente poco representado en el conjunto de cromosomas
transmitidos(P < 0,005).
A partir de la información de las frecuencias de
los haplotipos transmitidos y CDFA en las Tablas 14B y 14C, pueden
derivarse mediante contaje las frecuencias de los alelos
transmitidos y CDFA. El análisis de CDFA locus por locus se muestra
en las Tablas 15A y 15B.
Los datos presentes en las Tablas 15A y 15B
muestran que existe una evidencia estadísticamente significativa,
en el subgrupo de familias de "ningún hermano DR3/4", de que
los alelos de los SNP número 3, 4, 5, 6 y 7 están asociados con la
DMID. La evidencia de la asociación es especialmente fuerte en el
SNP nº 6. En el subgrupo "uno/ambos hermanos DR3/4", existe la
misma tendencia de asociación alélica, aunque la tendencia no
alcanza la significación estadística.
El análisis de PTD puede utilizarse para la
determinación de la transmisión (o no transmisión) del haplotipo de
8 locus a partir de los progenitores de los hijos afectados, una vez
se han inferido o asignado los haplotipos mediante métodos
moleculares. Las tablas 16A, B, y C resumen los resultados de la PTD
de las familias del HBDI. Cada haplotipo se lista mediante el
conjunto ordenado de alelos (es decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8)
presentes en cada uno de los ocho SNP de IL4R como se describe en
la Tabla 6. Un "1" indica la presencia del alelo de
referencia, un "2" la presencia del alelo variante para cada
SNP. El alelo de "referencia" para cada SNP es el que está
presente en GenBank nº de acceso X52425.1 como se describe en la
Tabla 6. La Tabla 16A muestra el contaje de los sucesos de
transmisión informativa sólo a un hijo (el caso índice) por familia,
la Tabla 16B muestra el contaje de las transmisiones informativas a
los dos hijos primarios afectados por familia, y la Tabla 16C
muestra el contaje de las transmisiones informativas a todos
los hijos afectados. Los resultados de la PTD del haplotipo de 8
locus alcanzan la significación estadística cuando se incluyen
todos los hijos afectados (2 o más por familia).
Los análisis de PTD pueden realizarse en las
familias tras la estratificación de los hijos mediante el genotipo
DR3/4. El resumen de los contajes de las transmisiones informativas
a los dos hijos primarios afectados por familia, en los subgrupos
de familias de "uno/ambos hermanos DR3/4" y de "ningún
hermano DR3/4", se muestra en las Tablas 17A y 17B
respectivamente. Cada haplotipo se lista mediante el conjunto
ordenado de alelos (es decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8)
presentes en cada uno de los ocho SNP de IL4R como se describe en la
Tabla 6. Un "1" indica la presencia del alelo de referencia,
un "2" la presencia del alelo variante para cada SNP. El alelo
de "referencia" para cada SNP es el que está presente en
GenBank nº de acceso X52425.1 como se describe en la Tabla 6.
Como se ha presentado anteriormente, existe una
evidencia significativa de ligamiento de la DMID al IL4R en el
subgrupo de "ningún hermano DR3/4".
Los datos de la Tabla 17B indican que existe una
evidencia significativa de asociación de los haplotipos de IL4R a
la DMID, en presencia de este ligamiento. En particular, en el
subgrupo de "ningún hermano DR3/4" un haplotipo (denominado
"2 1 2 2 2 2 2 1") está significativamente poco transmitido a
los hijos afectados.
Este ejemplo demuestra la asociación de los SNP
de IL4R con la diabetes tipo 1 en una población filipina.
Como se utiliza en esta sección,
"pacientes" se refiere a individuos con la enfermedad, es decir
individuos con diabetes tipo 1 y "controles" se refiere a
individuos normales, aquellos sin la enfermedad.
Se seleccionaron 90 pacientes (n = 90) para este
estudio de entre la población filipina. Los pacientes incluidos en
el estudio estaban afectados por la diabetes tipo 1 como se define
mediante la reciente clasificación ADA (comité de expertos en el
diagnóstico y clasificación de la diabetes mellitus, 1997). Los
pacientes nacieron en Filipinas y todos ellos tienen progenitores
filipinos. En estos pacientes se han caracterizado los niveles de
péptido C inferiores a 0,3 mmol/l y los autoanticuerpos contra
autoantígenos de las células de los islotes (Medici et al.,
1999, Diabetes Care, 9: 1458-62). También se
recogieron muestras de 94 sujetos normales filipinos sin historia
familiar de diabetes. Este fue el grupo control. Todos los pacientes
y controles eran de la región del sur de Filipinas, Luzon. El
estudio fue aprobado por el comité ético local y se recogió un
consentimiento informado de los pacientes. Además, se utilizaron
muestras independientes de un estudio previo del locus de HLA clase
II en filipinos (Bugawan et al., 1994, Genetics,
54:331-340) con origen en la misma región, tras una
prueba estadística de heterogeneidad, para complementar las muestras
control. Estas comprenden un total de 194 cromosomas obtenidos de
muestras familiares e individuales.
Los individuos se genotipificaron como se ha
descrito anteriormente. Los genotipos de los individuos afectados y
no afectados se muestran en la Tabla 4 (ID. de SEC. Nº:
20-24). Tanto los números reales como las
frecuencias se proporcionan para cada genotipo. Los datos (Tabla 5)
confirman la presencia de una asociación de las variantes de los
SNP de IL4R con la diabetes tipo 1.
Las frecuencias de los alelos y haplotipos entre
grupos se compararon utilizando la prueba z. Las composiciones de
haplotipos y las frecuencias se estimaron a partir de los datos de
genotipos utilizando el algoritmo EM del programa Arlequin (L.
Excoffier, Universidad de Genova, CH) (Excoffier et al.,
1995, Mol Biol Evol, 12:921-7; Slatkin et
al., 1996, Heredity, 76:377-83).
Las frecuencias del alelo salvaje para cada uno
de los ocho SNP de IL4R en los grupos filipinos control y
diabéticos se muestran en la Tabla 18. La Tabla 18 proporciona la
evidencia de que las frecuencias alélicas de los SNP nº 3 y 4 son
significativamente diferentes entre los dos grupos, y sugiere una
asociación con la DMID.
También es posible inferir y construir los
haplotipos multi-locus de IL4R en los sujetos
filipinos, ya sea informáticamente mediante una estimación de
máxima verosimilitud (EMV), o bien utilizando los métodos de
haplotipificación molecular descritos previamente.
La Tabla 19 lista los cinco haplotipos más
frecuentes estimados informáticamente y sus frecuencias en los
diabéticos y controles filipinos, y presenta la significación de las
diferencias en las frecuencias. Cada haplotipo se lista mediante el
conjunto ordenado de alelos (es decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8)
presentes en cada uno de los ocho SNP de IL4R como se describe en
la Tabla 6. Un "1" indica la presencia del alelo de
referencia, un "2" la presencia del alelo variante para cada
SNP. El alelo de "referencia" para cada SNP es el que está
presente en GenBank nº de acceso X52425.1 como se describe en la
Tabla 6.
La Tabla 20 lista los haplotipos observados como
se deriva e infiere mediante haplotipificación molecular; se
compilan los haplotipos de siete locus no ambiguos (no se muestran
los alelos del SNP nº 1, como se indica con la "x"). Cada
haplotipo se lista mediante el conjunto ordenado de alelos (es
decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8)
presentes en cada uno de los ocho SNP de IL4R como se describe en
la Tabla 6. Un "1" indica la presencia del alelo de
referencia, un "2" la presencia del alelo variante para cada
SNP. El alelo de "referencia" para cada SNP es el que está
presente en GenBank nº de acceso X52425.1 como se describe en la
Tabla 6. Las Tablas 18 y 19 proporcionan evidencia de una
diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de uno o
más haplotipos entre las poblaciones filipinas control y diabética,
y apoya la presencia de una asociación de IL4R con la DMID. En
particular, un haplotipo (que se indica "x 1 2 2 2 2 2 1") está
significativamente poco representado en el grupo de diabéticos
filipinos.
Este ejemplo demuestra la asociación de los SNP
de IL4R, IL4 e IL13 con la diabetes tipo 1 en la misma población
filipina descrita anteriormente en el Ejemplo 3.
Como se utiliza en esta sección,
"pacientes" se refiere a individuos con la enfermedad, es decir
individuos con diabetes tipo 1 y "controles" se refiere a
individuos normales, aquellos sin la enfermedad.
Los individuos se genotipificaron como se ha
descrito anteriormente.
Las distribuciones de alelos de los SNP
individuales en el locus de IL4R (n = 10), el locus de IL4 (n = 1)
y el locus de IL13 (n = 4) entre los pacientes y los controles se
muestran en la Tabla 21. Los patrones de desequilibrio de
ligamiento se estimaron utilizando aproximaciones de máxima
verosimilitud a partir de los datos de los genotipos individuales
de individuos no relacionados (Slatkin y Excoffier, 1996 Heredity
76:377-383). Los patrones de desequilibrio de
ligamiento (DL) a pares para estos SNP inferidos entre la población
control se muestran en la Tablas 22 y 23. Entre los SNP de IL4R
individuales, tres (E375A, L389L, y C406R) mostraron asociación
nominalmente significativa con la diabetes tipo 1 mientras que el
alelo variante de dos SNP adicionales (I50V, p = 0,062 y S478G, p
= 0,064) se encontraba reducido entre los pacientes (Tabla 21).
Los dos SNP del promotor no se encontraron
significativamente asociados con la diabetes tipo 1, aunque el
alelo variante del SNP-3223 se encontraba
ligeramente aumentado en pacientes (CP = 1,45, p = 0,10). Con la
excepción de este SNP del promotor y del SNP 150 V, con es que está
en fuerte DL, el alelo variante en cada SNP se encontró con una
baja representación entre los pacientes. Algunos de los residuos de
aminoácido polimórficos en esta cadena parecen ser biológicamente
importantes y afectan a la señalización del receptor de
IL-4 (Kruse et al., 1999, Immunology,
96:365-71).
De los 10 SNP de IL4R tipificados, el SNP L389L
mostró la mayor asociación con la diabetes tipo 1 en esta
población, con frecuencias significativamente menores entre los
pacientes que entre los controles (CP = 0,34; p = 0,001). Sin
querer suscribir una teoría, se cree que a causa de que es un
polimorfismo silente (sinónimo), es improbable que este SNP sea
responsable del efecto protector observado de padecer la diabetes
tipo 1. Este SNP se encuentra en un potente DL (Tabla 22) con los
SNP no sinónimos flanqueantes (E375A, C406R, S478P y Q551R) y todos
estos SNP muestran una tendencia a la protección (asociación
negativa). El SNP L389L también se encuentra en un potente DL
negativo con el SNP del promotor -3223 (Tabla 22).
En la comparación de genotipos en los SNP
individuales de IL4R (Tabla 24), el efecto protector es dominante
ya que el heterozigoto del 389 de IL4R muestra un CP = 0,29. Entre
los SNP individuales del cromosoma 5q31, sólo los alelos variantes
en los dos SNP del promotor de IL13 se encontraban aumentados entre
los pacientes (CP = 1,58 y p = 0,05 para -1512, y CP = 1,49 y p =
0,12 para -1112) (Tabla 21). Si se comparan las frecuencias de
genotipo, sin embargo, R110Q de IL13 mostró una asociación
nominalmente significativa en esta población (p = 0,03; Tabla 24).
Estos datos sugieren que el homozigoto variante, pero no el
heterozigoto, puede tener un riesgo aumentado de padecer diabetes
tipo 1. En la Tabla 24, cada haplotipo se lista mediante el conjunto
ordenado de alelos (es decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8)
presentes en cada uno de los ocho SNP de IL4R como se describe en
la Tabla 6. Las letras se refieren al alelo real (nucleótido)
presente, como se describe en la Tabla 6.
Los haplotipos de IL4R se estimaron en base al
método de maximizado de expectativa (ME) (Excoffier et al.,
1995, Mol. Biol. Evol., 12:921-927.) y se
determinaron directamente mediante métodos moleculares de
haplotipificación, descritos en el Ejemplo 4. El método molecular
de haplotipificación permitió la asignación no ambigua de fase para
7 SNP de IL4R (C676T, A1374C, G1417T, T1466C, T1682C, A1902G y
T2531C). Utilizando la haplotipificación molecular de estos 7 SNP,
se determinaron 7 haplotipos diferentes de IL4R en esta población y
sus frecuencias entre los pacientes y los controles se compararon
(Tabla 25A).
En Tabla 25A cada haplotipo se lista mediante el
conjunto ordenado de alelos (es decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8)
presentes en cada uno de los ocho SNP de IL4R como se describe en
la Tabla 6. Las letras se refieren al alelo real (nucleótido)
presente, como se describe en la Tabla 6.
Un haplotipo específico (CCTCCGT)) se encontró
significativamente poco representado entre los pacientes (CP = 0,4,
p = 0,013). Este mismo haplotipo también se encontró que era
protector (asociación negativa significativa), mediante los métodos
de PTD, en las familias del HBDI, como se describe en el Ejemplo 2.
Este efecto protector por lo tanto se ha observado en dos
poblaciones diferentes y en dos diseños de estudio diferentes, es
decir caso/ control (filipinos) y PTD, además de que con estos SNP
es biológicamente plausible (es decir, consecuencias funcionales).
Esto apunta claramente que las variantes de la molécula del IL4R
tienen influencia en la susceptibilidad a la diabetes tipo 1. En
particular, este haplotipo específico de IL4R parece conferir un
efecto protector dominante.
En las familias del HBDI, la estratificación
basada en el genotipo del HLA de mayor riesgo
(HLA-DRB1*0301-DQB1*0201/HLA-DRB1*04-DQB1*0302)
fue necesaria para demostrar el efecto protector del de haplotipo
IL4R. Se encontró una asociación negativa significativa sólo entre
aquellas familias en las que ningún hermano afectado era DR3/4,
presumiblemente porque el efecto del polimorfismo de IL4R era
relativamente modesto comparado con el riesgo conferido por este
genotipo de HLA de alto riesgo, que confiere un riesgo de padecer
la enfermedad mayor que el de los homozigotos DR3/3 o DR4/4. Entre
los filipinos, se observó un efecto protector significativo de un
haplotipo específico de IL4R sin estratificación (Tabla 25). Sin
querer suscribir una teoría, esto podría reflejar la ausencia entre
los filipinos de un aumento del riesgo asociado con DR3/4 en
relación con los genotipos DR3/3 o DR4/4. La ausencia del "efecto
DR3/4", bien establecida por varios estudios de la diabetes tipo
en caucásicos, puede atribuirse entre los filipinos a los
diferentes patrones de desequilibrio de ligamiento de los alelos
DQB1 con los alelos DRB1*04 entre asiáticos y caucásicos.
La aproximación de haplotipificación molecular
utilizada en este ejemplo no asignó la fase de los dos SNP del
promotor y del SNP 150V en el locus de IL4R. En consecuencia, se
utilizó la aproximación de ME para estimar las frecuencias de los
haplotipos de 10 SNP para estos 3 SNP individuales y los haplotipos
de 7 SNP previamente determinados mediante métodos moleculares
(Tabla 25B). En la Tabla 25B, cada haplotipo se lista mediante el
conjunto ordenado de alelos (es decir, de los SNP
1-2-3-4-5-6-7-8-9-10)
presentes en cada uno de los diez SNP de IL4R descritos en la Tabla
21 (SNP en orden: C(-3223)T - C(-1914)T - I50V - N142N
E375A - L389L - C406R - S478P - Q551R - S761P). Las letras se
refieren al alelo real (nucleótido) presente, como se describe en
la Tabla 21.
De los 17 haplotipos de 10 SNP con una
frecuencia estimada >1%, en algún grupo, sólo un haplotipo de 10
SNP que contiene el haplotipo de 7 SNP protector (H5A o CCACCTCCGT)
apareció con una fuerte asociación negativa (CP = 0,0; IC 95%
[0-0,5]; p = 0,001) con la enfermedad. De forma
interesante, el otro haplotipo que contenía el mismo haplotipo de 7
SNP (H5B o CTA-CCTCCGT) no se encontró
significativamente asociado con la enfermedad (CP = 0,66, p =
0,33). Esto sugiere que una combinación específica de SNP del
promotor de IL4R con una variante de la secuencia codificante
particular contribuye al riesgo de padecer diabetes tipo 1.
Los SNP de IL4 y de IL13 están en un fuerte DL
(Tabla 23). Las frecuencias estimadas de estos haplotipos de 5 SNP
se compararon entre pacientes y controles (Tabla 26). En la Tabla
26, cada haplotipo se lista mediante el conjunto ordenado de alelos
presentes en el SNP de IL4 y los cuatro SNP de IL13 descritos en la
Tabla 21. El orden es C(-524)T de IL4 - A(-1512)C de
IL13 - C(-1112)T de IL13 - intrón 3 de IL13 - R110Q de IL13.
Las letras se refieren al alelo real (nucleótido) presente, como se
describe en la Tabla 21.
Las distribuciones generales fueron diferentes
(p = 0,005) y un haplotipo, TCTTA, se encontró fuertemente asociado
con la diabetes tipo 1 (CP = 3,47, p = 0,004). Otros dos haplotipos
mostraron una asociación nominalmente significativa (p = 0,02 y
0,03). Una observación sorprendente fue que el haplotipo de IL13
CTTA pareció estar asociado con la enfermedad sólo en combinación
con el alelo T en el SNP-524 del promotor de IL4 ya
que el haplotipo CCTTA no mostró asociación a la enfermedad.
Estos datos podrían reflejar DL entre el
haplotipo de 5 SNP asociado con algún gen cercano causal o sugiere
que una combinación particular de una variante del promotor de IL4 y
variantes del promotor y codificantes de IL13 son responsables de
un riesgo elevado de padecer diabetes tipo 1 (interacción
gen-gen).
Este ejemplo demuestra epistasis, la interacción
entre SNP del locus IL4R en el cromosoma 16 y aquellos en los locus
de IL4 e IL13 en el cromosoma 5.
Como tanto IL4 como IL13 son ligandos de un
receptor compuesto, en parte, de la cadena alfa IL4R, existe una
posibilidad de que existan interacciones gen-gen
entre polimorfismos en el locus de IL4R en el cromosoma 16p11 y los
cinco SNP en los locus de IL4 e IL13 en el cromosoma 5q31. En una
aproximación se examinó la independencia estadística de los
genotipos en los 10 SNP de IL4R y los genotipos de cada uno de los
SNP de IL4 e IL13 (Tabla 27). Se evaluaron las interacciones gen
por gen en los SNP en diferentes genes valorando si las frecuencias
de los genotipos en los locus no ligados eran independientes (es
decir, los SNP de IL13 e IL4 en el cromosoma 5 y los SNP de IL4R en
el cromosoma 16) entre los pacientes. Estos análisis se realizaron
en cada par de SNP no ligados mediante una prueba de
chi-cuadrado en tablas de contingencia con
marginales definidos por los contajes de genotipo en pacientes o en
controles. Los valores de chi-cuadrado y los
correspondientes grados de libertad para cada comparación de los
SNP de IL4R se sumaron y se computaron los valores p de la suma de
chi-cuadrados.
No se encontró una desviación de la
independencia de estos SNP entre controles pero se observó una
desviación significativa de los SNP-524 del
promotor de IL4 (p = 0,001) y SNP del intrón 3 de IL13 (p = 0,019)
entre pacientes.
Para valorar si el efecto sobre la
susceptibilidad a la diabetes tipo 1 debido a los SNP de IL4R era
modificada por los SNP de IL4 o IL13, se realizó un modelo de
epistasis utilizando un modelo de regresión logística (véase a
continuación). Para cada uno de los cinco SNP de IL4 e IL13, se
testó si el efecto de los genotipos de los SNP de IL4R combinados
sobre la susceptibilidad a la diabetes tipo 1 era diferente en
función de los SNP de IL4 e IL13. Los resultados (Tabla 28) indican
que sí existe una interacción epistática entre los genotipos de
IL4R y los genotipos de IL4 e IL13. Para efectuar las comparaciones
múltiples, se realizó un análisis de permutación de esta prueba. En
22/200 permutaciones uno o más de las pruebas de 5 SNP mostró una p
< 0,035, en 13/200 uno o más de las pruebas de los SNP mostraron
una p < 0,035 y otro mostró una p < 0,075. En 9/200 uno o más
de las pruebas de 5 SNP mostró una p < 0,035, otro mostró una p
< 0,075 y otro mostró una p < 0,135. Por lo tanto, el patrón
observado en la Tabla 28 tiene una probabilidad de p < 0,045. La
conclusión que se deriva es que la interacción epistática observada
entre los de SNP IL4 e IL13 y los genotipos de IL4R es
estadísticamente significativa lo que indica que, en este conjunto
de datos, los genotipos en la región de IL4, IL13 afectan la
susceptibilidad genética a la diabetes tipo 1 conferida por
IL4R.
Para ilustrar esta interacción, también se
calcularon los cocientes de probabilidades para los SNP individuales
de IL4R como una función del genotipo de los SNP de IL4 e IL 13.
Las diferencias entre los cocientes de probabilidades fueron
superiores para el SNP de IL4R-3223 y los cuatro SNP
de IL13. En la Figura 2 se muestran los cocientes de probabilidades
con los intervalos de confianza del 95% y los valores p de los
análisis de las tablas de contingencia estratificadas. La Figura 2
muestra los cocientes de probabilidades, los contajes de pacientes
y controles de los genotipos específicos de IL4R, IL4 e IL13. La
Figura 2A muestra la interacción de Ala375Glu de IL4R con -524 de
IL4 (promotor). La Figura 2B muestra la interacción de Gln551Arg de
IL4R con A-1512C de IL13. La Figura 2C muestra la
interacción entre C-3223T de IL4R y
A-1512C de IL13, y la Figura 2D muestra la
interacción entre C-3223T de IL4R y
C-1112T de IL13. El valor p de la asociación de cada
combinación de genotipos se muestra sobre cada barra de cociente de
probabilidades.
La observación más sorprendente fue que el
genotipo CT en el SNP-3223 de IL4R tenía un CP de
8,55 (IC 95% = 1,05, 69,8) si se encontraba presente con el
genotipo TT del -1112 de IL13, y un CP = 0,53 (IC 95% = 0,29, 0,98)
si se encontraba presente con el genotipo CC. Sin suscribir teoría
alguna, la observación de una interacción entre polimorfismos en
los genes IL13 e IL4 y polimorfismos en el gen que codifica el
receptor para los productos de estos dos genes representa una
hipótesis interesante y biológicamente plausible que, dadas las
comparaciones múltiples, requiere de un posterior estudio. Un
estudio recientemente publicado sobre pacientes de asma informaba
de una interacción gen-gen entre IL4R e IL13 en la
determinación de los niveles de IgE en suero (Howard et al.,
2002, Am J Hum Genet, 70:230-6).
Como se ha descrito anteriormente, los datos de
asociación de IL4R obtenidos en este estudio de caso control en
filipinos indica que el haplotipo de 7 SNP, compuesto primariamente
por alelos variantes en estos SNP, confiere una protección
dominante frente a la diabetes tipo 1 (Tabla 25A), que es
consistente con nuestras observaciones recientes, basadas en la PTD
y análisis de CDFA en un conjunto de múltiples familias caucásicas
(del registro HBDI). La repetición de esta observación en dos
poblaciones diferentes y en dos diseños de estudio diferentes
aumenta el valor de esta inferencia. El análisis de haplotipos de 10
SNP de IL4R entre los filipinos sugiere que una variante del
promotor específica en combinación con variantes de secuencia
codificante específicas puede ser responsable de la protección
observada (Tabla 25B). Varios estudios recientes han mostrado que el
alelo de referencia o salvaje en varios de estos SNP de IL4R está
asociado con el asma atópico y con un aumento de los niveles de IgE
(Howard et al., 2002, Am J Hum Genet,
70:230-6, Sandford et al., 2000, J Allergy
Clin Immunol, 106:135-40). Por los tanto, parece que
los mismos alelos en los SNP de IL4R confieren un aumento del
riesgo de una enfermedad básicamente Th1 (diabetes tipo 1) y una Th2
(asma atópico). Sin suscribir teoría alguna, estas asociaciones no
apoyan un efecto sobre el equilibrio Th1/Th2 mediado por el
polimorfismos en el gen de IL4R, sino que sugieren que este
polimorfismo puede influenciar algún aspecto de la regulación inmune
y la homeóstasis en las vías Th1 y Th2, y posiblemente, la
activación de las células B. Posiblemente, los patrones observados
de asociación de la enfermedad reflejan el efecto de los
polimorfismos de IL4R en el equilibrio entre la activación de las
células Th1 y Th2 y la de las células T reguladoras. En conclusión,
la importancia del riesgo de padecer diabetes tipo 1 puede
determinarse mediante combinaciones específicas de variantes en el
locus de IL4R y en los genes que codifican sus dos ligandos, IL4 e
IL13.
Para cada SNP de IL4R, al genotipo homozigoto
con el mayor cociente de probabilidades se le otorga el valor de 2,
al heterozigoto se le otorga el valor de 1 y al otro homozigoto 0.
Se realizó una regresión logística en nueve polimorfismos de IL4R
(S761P no mostró la variante) de este modo y se derivó una nueva
variable numérica "il4r" mediante:
il4r =
\alpha_{1}G_{-3223} + \alpha_{2}G_{-1914} + \alpha_{3}G_{50} +
\alpha_{4}G_{142} + \alpha_{5}G_{375} + \alpha_{6}G_{389} +
\alpha_{7}G_{406} + \alpha_{8}G_{478} +
\alpha_{9}G_{551}
en la que G_{i} indica el
genotipo (0, 1 o 2) en la posición i y \alpha_{j} indica el
coeficiente ajustado mediante regresión
logística.
Los coeficientes ajustados mediante regresión
fueron \alpha_{1} = 0,368; \alpha_{2} = 0,053;
\alpha_{3} = 0,37; \alpha_{4} = 0,061; \alpha_{5} =
0,66;
\alpha_{6} = 1,08; \alpha_{7} = 0,57; \alpha_{8} = 0,54 y \alpha_{9} = 0,22. entonces se comprobó la epistasis de forma independiente para cada uno de los cinco SNP del cromosoma 5 ajustando el siguiente modelo de regresión logística:
\alpha_{6} = 1,08; \alpha_{7} = 0,57; \alpha_{8} = 0,54 y \alpha_{9} = 0,22. entonces se comprobó la epistasis de forma independiente para cada uno de los cinco SNP del cromosoma 5 ajustando el siguiente modelo de regresión logística:
P(T1DM)
= exp(X)/(1 +
exp(X)),
en el
que
X = C +
\beta_{1}il4r + \beta_{2}G_{cr5i} +
\beta_{3}(il4r.G_{cr5i})
y G_{cr5i} es el genotipo de uno
de los SNP del cromosoma 5 (valores 0, 1 o
2).
\newpage
Como se comparan cinco SNP diferentes, es
importante corregir las múltiples pruebas. Sin embargo, una
corrección de Bonferroni o Dunn-Sidak no era
apropiada ya que los SNP de IL4 e IL13 no son independientes (véase
Tabla 23). Por lo tanto el análisis de permutación se realizó
manteniendo constantes las frecuencias del genotipo de paciente y
control, y permutando los genotipos de IL4 e IL13 y los genotipos de
IL4R de los grupos de pacientes y los grupos de control de forma
separada.
De esta forma, sólo se analizó la interacción
epistática entre las dos regiones genéticas y no las asociaciones
genéticas individuales de IL4 o IL13 e IL4R. se realizaron 200
permutaciones en la prueba de epistasis en los cinco SNP del
cromosoma 5 cada vez. Los análisis se realizaron utilizando
S-Plus versión 6.0 Profesional (Insightful
Corporation).
Se han descrito varias realizaciones de la
invención. Las descripciones y Ejemplos pretenden ser ilustrativos
de la invención y no limitantes.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DETECCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A
ENFERMEDADES AUTOINMUNES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> caso 21907
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 10/267.844
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-10-08
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 10/264.965
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-10-04
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3597
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacacgtgt atccctgaga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcagggac acacgtgtg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggagtgaaa acgacccggc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgccgggtc attttcgctc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagggaaggg agggcattgt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggaagggc gggcattgt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctccgagc aggtccagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctggacct tctcggagag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtggaag aaggcatgac tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtgggag aagacatgac tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtcacgt cttctcctac ctt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggctcagag agttgctgaa gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcagcaacc ccctgagcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggctatc aggagtttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggctatc gggagtttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcttctctg agatgcccga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgggcatc ccagagaaga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencias utilizada para la determinación de las
frecuencias de los haplotipos estimados informáticamente comparadas
entre filipinos control y diabéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacatttat
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencias utilizada para la determinación de las
frecuencias de los haplotipos estimados informáticamente comparadas
entre filipinos control y diabéticos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagttgt
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencias utilizada para la determinación de las
frecuencias de los haplotipos estimados informáticamente comparadas
entre filipinos control y diabéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctccgt
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencias utilizada para la determinación de las
frecuencias de los haplotipos estimados informáticamente comparadas
entre filipinos control y diabéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagttat
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencias utilizada para la determinación de las
frecuencias de los haplotipos estimados informáticamente comparadas
entre filipinos control y diabéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgccgt
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcccctgt gtctgcaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgacctgga gcaacccgta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgtgtgag gaggaggagg aggta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtcatcg caggcaa
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgaaatgt cctccagca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggcctccc tggca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccagtgta tagttatccg cactga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgggcctc tgctggtca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgggcatg tgagcactcg ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggcatctc gggttcta
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacatttct ctggggacac a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagactcag caacaagagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacacgtgt atccctgaga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggagtgaaa acgacccggc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagggaaggg agggcattgt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctccgagc aggtccagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtggaag aaggcatgac tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtgggag aagacatgac tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggctcagag agttgctgaa gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggctatc aggagtttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcttctctg agatgcccga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcagggac acacgtgtg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgccgggtc attttcgctc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggaagggc gggcattgt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctggacct tctcggagag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtcacgt cttctcctac ctt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcagcaacc ccctgagcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggctatc gggagtttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgggcatc ccagagaaga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacatttct ctggggacac a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgtgtgag gaggaggagg aggta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgtgtgag gaggaggagg aggta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccaggagg gaaggga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccgcatgt acaaactcct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgactggc tcaggga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccaggagg gaagggc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccgcatgt acaaactccc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR específico de alelo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgactggc tcagggg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4 e IL13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacattgtcc cccagtgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4 e IL13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcactgggg aacaatgttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4 e IL13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctactcac gtgctgacct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4 e IL13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcagcaca tgagtagaac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4 e IL13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagttgaac cgtccctcg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda utilizada para la identificación de polimorfismos
de IL4 e IL13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagggacagt tcaactgaaa c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactaggcctc acctgatacg a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcggacatg caagctggaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatcgaggtg gcccagtttg ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatagaggca gaataacagg caga
\hfill24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgaatgag acagtccctg ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctaaccctc cttcccgcct a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacttat ctttactgtc acttct
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagacagc caccaaccc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacttatct ttactgtcac ttcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 0
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgctccca ggactgac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagacttt atctgtgact gctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgctccca ggactgat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaacaggc ccgtaga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtgccgct acttggcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaacaggcc cgtagc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctggaggac ttctaggaaa ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcagccatg tcgccttt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador del amplicón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctggaggac ttctaggaaa at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9900
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4740
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
Claims (19)
1. Un método para la determinación del riesgo
de los individuos de padecer diabetes tipo 1, que comprende la
detección de la presencia de al menos uno de los polimorfismos
asociados a la diabetes tipo 1, A(-1512)C, C(-1112)T,
C4045T y G4166A en el locus de IL13, como se lista en la Tabla 2, en
una muestra de ácido nucleico del individuo, y en el que la
presencia de dicho polimorfismo indica el riesgo de un individuo de
padecer diabetes tipo 1.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la muestra de ácido nucleico comprende DNA.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
la muestra de ácido nucleico comprende RNA.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
la muestra de ácido nucleico se amplifica.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
la muestra de ácido nucleico se amplifica mediante una reacción en
cadena de la polimerasa.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
el polimorfismo se detecta mediante amplificación.
7. El método de la reivindicación 6, en el que
el polimorfismo se detecta mediante una reacción en cadena de la
polimerasa.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
el polimorfismo se detecta mediante secuenciación.
9. El método de la reivindicación 1, en el que
el polimorfismo se detecta al poner en contacto la muestra de ácido
nucleico, bajo condiciones que permiten la unión del oligonucleótido
a la muestra de ácido nucleico, con al menos un oligonucleótido
específico de secuencia que hibrida bajo condiciones astringentes
con un polimorfismo asociado a la diabetes tipo 1, y detectar la
hibridación.
10. El método de la reivindicación 1, que
además comprende la detección del polimorfismo de IL4 (-524) listado
en la Tabla 21.
11. El método de las reivindicaciones 1 o 10,
que además comprende la detección de un polimorfismo de IL4R
listado en la Tabla 2.
12. El método de la reivindicación 11, en el
que el polimorfismo de IL4R es IL4R 5'(-3223).
13. El método de la reivindicación 1, que
comprende la detección del polimorfismo de IL13 5'(-1112).
14. Un equipo para la determinación del riesgo
de un individuo de padecer diabetes tipo 1 que comprende,
(a) uno o más oligonucleótidos específicos de
secuencia y que individualmente comprenden una secuencia que
hibrida bajo condiciones astringentes con el alelo variante del
polimorfismo de IL13 asociado a la diabetes tipo 1,
A(-1512)C o C(-1112)T como se lista en la Tabla 2,
y
(b) las instrucciones de uso del equipo para la
determinación del riesgo de los individuos de padecer diabetes tipo
1.
15. El equipo de la reivindicación 14, en el
que los oligonucleótidos son totalmente complementarios a una
secuencia de ácido nucleico que comprende el polimorfismo de IL13
asociado a la diabetes tipo 1, A(-1512)C o C(-1112)T
como se lista en la Tabla 2.
16. El equipo de la reivindicación 14, que
contiene cebadores adicionales de secuenciación.
17. El equipo de la reivindicación 14, en el
que uno o más oligonucleótidos específicos de secuencia están
marcados.
18. El equipo de la reivindicación 17 que
incluye un reactivo para la detección del marcaje.
19. La utilización de la detección de uno o más
de los polimorfismos de IL13, A(-1512)C, C(-1112)T,
C4045T y G4166A, como se listan en la Tabla 21, en una muestra de
ácido nucleico de un individuo para la determinación del riesgo del
individuo de padecer diabetes tipo 1.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26496502A | 2002-10-04 | 2002-10-04 | |
| US264965 | 2002-10-04 | ||
| US267844 | 2002-10-08 | ||
| US10/267,844 US7205106B1 (en) | 2001-07-20 | 2002-10-08 | Association of polymorphisms in IL4-related genes with autoimmune disease |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2279916T3 true ES2279916T3 (es) | 2007-09-01 |
Family
ID=31996810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03022242T Expired - Lifetime ES2279916T3 (es) | 2002-10-04 | 2003-10-01 | Deteccion de susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes, especialmente a la diabetes tipo 1. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1405921B1 (es) |
| JP (1) | JP2004267200A (es) |
| AT (1) | ATE351924T1 (es) |
| CA (1) | CA2441701C (es) |
| DE (1) | DE60311207T2 (es) |
| ES (1) | ES2279916T3 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2006051886A1 (ja) * | 2004-11-12 | 2008-05-29 | 国立大学法人大阪大学 | 組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する方法 |
| CA2724475C (en) * | 2008-05-16 | 2019-05-07 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Genetic alterations on chromosomes 21q, 6q and 15q and methods of use thereof for the diagnosis and treatment of type i diabetes |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023410A2 (en) * | 1999-09-28 | 2001-04-05 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Drug target isogenes: polymorphisms in the interleukin 13 gene |
| WO2001023404A1 (en) * | 1999-09-30 | 2001-04-05 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Drug target isogenes: polymorphisms in the interleukin-4 gene |
-
2003
- 2003-09-29 CA CA2441701A patent/CA2441701C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-01 DE DE60311207T patent/DE60311207T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-01 ES ES03022242T patent/ES2279916T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-01 EP EP03022242A patent/EP1405921B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-01 AT AT03022242T patent/ATE351924T1/de active
- 2003-10-02 JP JP2003344915A patent/JP2004267200A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE351924T1 (de) | 2007-02-15 |
| JP2004267200A (ja) | 2004-09-30 |
| DE60311207D1 (de) | 2007-03-08 |
| CA2441701C (en) | 2010-07-13 |
| EP1405921B1 (en) | 2007-01-17 |
| EP1405921A1 (en) | 2004-04-07 |
| CA2441701A1 (en) | 2004-04-04 |
| DE60311207T2 (de) | 2007-12-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090305900A1 (en) | Genemap of the human genes associated with longevity | |
| Good et al. | Identification of SQSTM1 mutations in familial Paget's disease in Australian pedigrees | |
| Savage et al. | Genetic variation in telomeric repeat binding factors 1 and 2 in aplastic anemia | |
| JP2008523844A5 (ja) | ワルファリンの投与範囲を予想する方法 | |
| Kawasaki et al. | Independent contribution of HLA-DRB1 and TNFα promoter polymorphisms to the susceptibility to Crohn’s disease | |
| Kato et al. | Single nucleotide polymorphisms in the coding regions of human CXC-chemokine receptors CXCR1, CXCR2 and CXCR3 | |
| US7205106B1 (en) | Association of polymorphisms in IL4-related genes with autoimmune disease | |
| EP1412531B1 (en) | Il-4 receptor sequence variation associated with type 1 diabetes | |
| ES2279916T3 (es) | Deteccion de susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes, especialmente a la diabetes tipo 1. | |
| Parkinson et al. | Parathyroid hormone gene analysis in autosomal hypoparathyroidism using an intragenic tetranucleotide (AAAT) n polymorphism | |
| WO2014067005A1 (en) | Novel marker for mental disorders | |
| ES2286060T3 (es) | Variantes de la secuencia de nucleotidos de tcf-1. | |
| US20070154935A1 (en) | Human obesity susceptibility gene and uses thereof | |
| JP2007516719A (ja) | 一塩基多型を含む二型糖尿病に関与するポリヌクレオチド、それを含むマイクロアレイ及び診断キット、並びにそれを利用したポリヌクレオチドの分析方法 | |
| KR20110110758A (ko) | 단일염기 다형을 포함하는 대장암과 관련된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단 키트 및 그를 이용한 대장암의 진단방법 | |
| Hang et al. | TAP1 gene AccI polymorphism is associated with atopic bronchial asthma | |
| Jensen et al. | Polymorphisms in the neurogenin 3 gene (NEUROG) and their relation to altered insulin secretion and diabetes in the Danish Caucasian population | |
| EP1618210B1 (en) | Associations of polymorphisms in the frzb gene with osteoporosis | |
| AU2005254806B2 (en) | Human obesity susceptibility gene encoding a potassium voltage-gated channel and uses thereof | |
| ES2351146T3 (es) | Asociación de los polimorfismos en el gen frzb con la osteoporosis. | |
| AU2005254805B2 (en) | Human obesity susceptibility gene encoding a taste receptor and uses thereof | |
| WO2008026233A2 (en) | Single nucleotide polymorphisms on the irak-m gene, related methods, uses and kit for the diagnosis of allergic asthma. | |
| Hu et al. | Schizophrenia susceptibility genes on chromosome 13q32 |