ES2286133T3 - Acidos nucleicos de polipeptidos de estreptococos del grupo b y composiciones terapeuticas y vacunas de los mismos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido EmaA estreptocócico aislado que comprende la SEC. ID. nº: 2 y análogos sustancialmente homólogos, variantes alélicas y fragmentos inmunógenos de las mismas, en el que el análogo sustancialmente homólogo comparte por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 2.

Description

Ácidos nucleicos de polipéptidos de estreptococos del grupo B y composiciones terapéuticas y vacunas de los mismos.

Ayuda gubernamental

La investigación que condujo a la presente invención fue apoyada, por lo menos en parte, por una beca del NAID, beca nº A140918. Por lo tanto, el Gobierno puede ostentar determinados derechos sobre la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la proteína adhesina con matriz extracelular (Ema), EmaA, a los anticuerpos para la misma y a las vacunas, composiciones y productos terapéuticos.

La invención se refiere también a la identificación y prevención de infecciones por estreptococos y a los ácidos nucleicos aislados que codifican EmaA.

Antecedentes de la invención

Los estreptococos son cocos gram positivos negativos a la catalasa. Pueden clasificarse por el tipo de hemólisis presentada en agar-agar con sangre, por la detección serológica de antígenos de carbohidrato, o por determinadas reacciones bioquímicas. Los estreptococos clínicamente importantes incluyen los Grupos A, B, D y S de neumonías y el grupo de viridanos de estreptococos. Streptococcus pyogenes (Grupo A) de tipo A de Lancefield es un patógeno humano importante, causa de la faringitis estreptocócica, impétigo y de infecciones más graves tales como bacteriemia y fascitis necrotizante. Las secuelas inmunológicas de las infecciones estreptocócicas del Grupo A constituyen asimismo importantes problemas de salud -la carditis reumática es la causa más común de enfermedad cardíaca adquirida en el mundo y la glomerulonefritis posestreptocócica es una causa de hipertensión y de disfunción renal. Los estreptococos agalactiae son la causa más común de infecciones bacterianas graves en recién nacidos e importantes patógenos en mujeres embarazadas y adultas no embarazadas con problemas médicos subyacentes tales como la diabetes y la enfermedad cardiovascular. Los estreptococos del Grupo D incluyen los enterococos (Streptococcus faecalis y faecium) y los estreptococo del grupo D "no enterocócicos". El Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) no está clasificado por grupo en el sistema Lancefield. Los nemococos son patógenos humanos extremadamente importantes, la causa más común de neumonía bacteriana, infecciones del oído medio y meningitis tras el periodo neonatal. El grupo viridans de estreptococos incluye S. milleri, S. mitis, S. sanguis y otros. Causan bacteremia, endocarditis e infecciones dentales. Los enterococos son causas importantes de infecciones del tracto urinario, bacteremia e infecciones de heridas (de forma predominante como infecciones nosocomiales en pacientes hospitalizados), y endocarditis. Durante la última década, los enterococos han desarrollado una resistencia a numerosos antibióticos convencionales y existen algunas cepas resistentes a todos los antibióticos conocidos.

Los estreptococos del Grupo B (GBS) son la causa más común de enfermedades bacterianas graves en recién nacidos, y constituyen importantes patógenos en mujeres embarazadas y en adultos con enfermedades subyacentes (Baker CJ. (2000) "Group B streptococcal infections" en Streptococcal infections. Clinical aspects, microbiology, and molecular pathogenesis. (D. L. Stevens y E. L. Kaplan), New York: Oxford University Press, 222-237). Las manifestaciones comunes de estas infecciones incluyen bacteremia, neumonía, meningitis, endocarditis, e infecciones osteoarticulares (Baker CJ. (2000) "Group B streptococcal infections" en Streptococcal infections. Clinical aspects, microbiology, and molecular pathogenesis. (D. L. Stevens y E. L. Kaplan), New York: Oxford University Press, 222-237; Blumberg H.M. et al. (1996) J Infect Dis 173:365-373). La incidencia de la enfermedad por GBS invasiva es de aproximadamente 2,6 por 1.000 nacimientos y de 7,7 por 100.000 en la población mundial, con índices de mortalidad comprendidos entre 6 y 30% (Baker CJ. (2000) "Group B streptococcal infections" en Streptococcal infections.

Clinical aspects, microbiology, and molecular pathogenesis. (D. L. Stevens y E. L. Kaplan), New York: Oxford University Press, 222-237; Blumberg H.M. et al. (1996) J Infect Dis 173:365-373). Aunque muchas enfermedades neonatales se pueden prevenir mediante la administración de antibióticos profilácticos a mujeres parturientas, los programas de profilaxis con antibióticos pueden resultar ineficaces, resultan insatisfactorios o fallan si surge una resistencia al antibiótico. No se ha establecido ninguna estrategia de profilaxis efectiva para infecciones en adultos.

Durante el parto, los GBS pueden pasar de la madre al recién nacido. Según una estimación, hasta el 30% de mujeres embarazadas portan GBS por lo menos temporalmente en la vagina o en el recto sin síntomas. Los bebés de estas mujeres se colonizan con GBS durante el parto (Baker, C.J. y Edwards, M.S. (1995) "Group B Streptococcal Infections" en Infectious Disease of the Fetus and Newborn Infant (J.S. Remington y J.O Klein), 980-1054). La aspiración de fluido amniótico o secreciones vaginales infectados permiten que los GBS accedan a los pulmones. La adhesión a y la invasión del epitelio y endotelio respiratorio parecen ser factores críticos en la infección neonatal de aparición temprana (Baker, C.J. y Edwards, M.S. (1995) "Group B Streptococcal Infections" en Infectious Disease of the Fetus and Newborn Infant (J. S. Remington y J.O Klein); 980-1054; Rubens, C.E. et al. (1991) J Inf Dis 164:320-330). No se han clarificado las etapas subsiguientes en la infección, tales como la invasión del flujo sanguíneo y el establecimiento de infecciones locales metastásicas. Tampoco se entiende bien la patogénesis de infecciones neonatales que aparecen tras la primera semana de vida. La colonización gastrointestinal puede resultar más importante que un foco respiratorio en una enfermedad neonatal de aparición tardía (Baker, C.J. y Edwards, M.S. (1995) "Group B Streptococcal Infections" en Infectious Disease of the Fetus and Newborn Infant (J.S. Remington y J.O. Klein), 980-1054). Unas pruebas importantes indican que la invasión de las células endoteliales microvasculares del cerebro por GBS resulta la etapa inicial en la patogénesis de la meningitis. Los GBS pueden invadir las células endoteliales microvasculares del cerebro humano y los GBS de tipo III, que son responsables de la mayoría de meningitis, realiza esto 2 a 6 veces más eficientemente que otros serotipos (Nizet, V. et al (1997) Infect Immun 65:5074-5081).

Debido a que los GBS están ampliamente distribuidos ente la población y resulta un importante patógeno en los recién nacidos, se realizan comúnmente pruebas a las mujeres embarazadas para determinar si presentan GBS en las semanas 35 a 37 del embarazo. Gran parte de la enfermedad neonatal por GBS puede prevenirse mediante la administración de antibióticos profilácticos durante el parto a mujeres que resultan positivas en el análisis o muestran factores de riesgo conocidos. Sin embargo, los programas de antibióticos no previenen la totalidad de la enfermedad por GBS. Los programas resultan deficientes por una serie de razones. En primer lugar, los programas pueden resultar ineficaces. En segundo lugar, resulta difícil asegurar que los proveedores de servicios sanitarios y los pacientes siguen las pruebas y el tratamiento. Y finalmente, si aparecen nuevos serotipos o resistencia al antibiótico, los programas de antibióticos pueden fracasar totalmente. Las pruebas disponibles actualmente para GBS resultan ineficaces. Estas pruebas pueden proporcionar falsos negativos. Además, las pruebas no son específicas para las cepas virulentas de GBS. Por lo tanto, puede proporcionarse el tratamiento con antibióticos de manera innecesaria y añadirse al problema de la resistencia al antibiótico. Aunque podría resultar ventajosa una vacuna, no existe aún ninguna disponible comercialmente.

Tradicionalmente, los GBS se dividen en 9 serotipos según la reactividad inmunológica de la cápsula polisacárida (Baker CJ. (2000) "Group B streptococcal infections" en Streptococcal infections. Clinical aspects, microbiology, and molecular pathogenesis. (D.L. Stevens and E.L. Kaplan), New York: Oxford University Press, 222-223; Blumberg H.M. et al. (1996) J Infect Dis 173:365-373; Kogan, G. et al. (1996) J Biol Chem 271:8786-8790).Los GBS de serotipo III resultan particularmente importantes en los neonatos humanos, causando del 60 al 70% de la totalidad de las infecciones y casi la totalidad de las meningitis (Baker CJ. (2000) "Group B streptococcal infections" en Streptococcal infections. Clinical aspects, microbiology, and molecular pathogenesis. (D.L. Stevens y E.L. Kaplan), New York: Oxford University Press, 222-237). Los GBS de tipo III pueden subdividirse en tres grupos de cepas relacionadas sobre la base del análisis de los patrones de digestión de restricción (RDP) producidos por la digestión del ADN cromosómico con Hind III y Sse8387. (1. Y. Nagano et al. (1991) J Med Micro 35:297-303; S. Takahashi et al. (1998) J Inf Dis 177:1116-1119).

Por encima del 90% de las enfermedades neonatales por GBS de tipo III invasivas en Tokio, Japón y en Salt Lake City, Utah, están causadas por bacterias de uno de los tres tipos de RDP, calificadas del tipo III-3 de RDP, mientras que el tipo III-2 de RDP es considerablemente más probable de resultar aislado de la vagina que de la sangre o CSF. Estos resultados sugieren que este grupo relacionado genéticamente de los GBS de tipo III-3 es más virulento que las cepas III-2 y podría ser responsable de la mayoría de enfermedades de tipo III invasivas de manera global.

Las vacunas preliminares para los GBS utilizaron polisacárido purificado no conjugado. Los poli- y oligosacáridos de GBS son muy poco inmunógenos y no producen ni memoria ni respuestas de refuerzo significativas. Baker et al inmunizaron a 40 mujeres embarazadas con polisacárido capsular de serotipo III (Baker, C.J. et al. (1998) New Engl J of Med 319:1180-1185). En general, únicamente el 57% de las mujeres con niveles bajos de anticuerpo específico respondieron a la vacuna. La escasa inmunogenicidad del antígeno polisacárido purificado se demostró además en un estudio en el que treinta voluntarios adultos fueron inmunizados con una vacuna tetravalente compuesta de polisacárido purificado de los serotipos Ia, II y III (Kotloff, K.L. et al. (1996) Vaccine 14:446:450). Aunque segura, esta vacuna fue únicamente moderadamente inmunógena, respondiendo únicamente el 13% de los sujetos al tipo Ib, el 17% al tipo II, el 33% al tipo Ia, y el 70% al polisacárido de tipo III. La escasa inmunogenicidad de los antígenos de polisacárido provocó esfuerzos para desarrollar las vacunas conjugadas de polisacárido, por lo que estos poli- u oligosacáridos están conjugados a los portadores de proteína. El noventa por ciento de las mujeres adultas sanas inmunizadas con una vacuna conjugada de polisacárido de tipo III y de toxoide tetánico respondió con una aumento cuadruplicado en la concentración de anticuerpo, en comparación con el 50% inmunizado con únicamente polisacárido (Kasper, D.L. et al (1996) J of Clin Invest 98:2308-2314). Un tipo de vacuna conjugada de polisacárido de tipo Ia/ib y de toxoide tetánico fue igualmente más inmunógeno en adultos sanos que el polisacárido solo (Baker, C.J. et al (1999) J Infect Dis 179:142-150).

La desventaja que presentan las vacunas de conjugado de proteína y polisacárido consiste en que el procedimiento de purificación y conjugación de los polisacáridos resulta dificultosa, ocupa mucho tiempo y resulta cara. Un antígeno de proteína que podría resultar más económico y de fácil producción podría comportar una mejora.

En caso de preparar una vacuna conjugada de polisacárido y proteína, una proteína portadora específica para GBS puede resultar preferida para uno de los portadores comúnmente utilizados tales como los toxoides tetánicos o diftéricos debido a los problemas potenciales asociados a algunas de estas proteínas portadoras, particularmente la inmunogenicidad variable y los problemas asociados a la vacunación repetida con la misma proteína portadora. La selección de las proteínas portadoras adecuadas resulta importante para el desarrollo de las formulaciones de vacuna de polisacárido y proteína. Por ejemplo, el poli- u oligosacárido de tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a diferentes portadores de proteínas presenta una inmunogenicidad variable y provoca un anticuerpo con avidez variable (Decker, M.D. et al (1992) J Pediatrics 120:184-189; Schlesinger, Y. (1992) JAMA 267:1489-1494). La inmunización repetida con la misma proteína portadora puede asimismo suprimir las respuestas inmunes por competencia para las células B específicas (supresión epitópica) u otros mecanismos. Esto resulta de particular interés para el desarrollo de vacunas de GBS ya que la totalidad de las vacunas de conjugado de poli/oligosacárido y proteína desarrolladas recientemente contra las bacterias H. influenzae, S. Pneumoniae, y N. Meningitis utilizan un número limitado de proteínas portadoras (toxoide tetánico, CRM197, toxoide diftérico), aumentando el número de exposiciones a estos portadores que es probable que reciba un individuo. Además, utilizar el tétano como una proteína portadora no ofrece ninguna ventaja específica más que la inmunogenicidad mejorada de la vacuna. Una vacuna de segunda generación que contiene una proteína portadora específica para GBS podría potenciar la inmunogenicidad y presentar una ventaja ya que la respuesta inmune específica para GBS podría ser generada contra la proteína portadora y el poli/oligosacárido.

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Por lo tanto, en vista de las deficiencias mencionadas anteriormente relacionadas con las vacunas y procedimientos de la técnica anterior, resultaría evidente que existe todavía una necesidad en la técnica de una vacuna de GBS inmunógena y eficaz. La disponibilidad y la utilización de un polipéptido de GBS en una vacuna conjugada resulta deseable. Un polipéptido de GBS que está presente o expresado en la totalidad de los serotipos de GBS podría presentar la ventaja añadida que consiste en proporcionar inmunidad amplia, general a lo largo de muchos serotipos de GBS. Podría resultar particularmente relevante y útil para proporcionar una vacuna o inmunógeno estreptocócicos que se expresa ampliamente en varias especies estreptocócicas, por lo que la inmunidad amplia o general contra los grupos múltiples y únicos de estreptococos (por ejemplo, el Grupo A, el Grupo B y S. Pneumoniae), particularmente contra distintas bacterias estreptocócicas virulentas y clínicamente relacionadas, pudo generarse de este modo. Manganelli y Van de Rijn, Infection and Immunity (1999) 50-56, se refiere a la adhesina emb estreptocócica que se une a la matriz extracelular.

Sumario de la invención

Según la presente invención, se proporciona el polipéptido EmaA estreptocócico que es particularmente útil en la identificación y prevención de infecciones por estreptococos.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido EmaA estreptocócico aislado que comprende la SEC. ID. nº: 2 y análogos sustancialmente homólogos, variantes alélicas y fragmentos inmunógenos de las mismas, en el que el análogo sustancialmente homólogo presenta por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 2.

Preferentemente, el polipéptido está marcado con un marcador detectable.

En el caso en el que se utiliza un marcador radioactivo, tal como los isótopos ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re, pueden utilizarse conocidos procedimientos de recuento disponibles actualmente. En el caso en el que el marcador sea una enzima, la detección puede realizarse por cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas utilizadas actualmente, conocidas en la técnica.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna o una composición inmunógena que comprende el polipéptido y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, la vacuna o la composición inmunógena comprende además por lo menos un antígeno seleccionado de entre:

a.

polipéptido Spb1 o un fragmento inmunógeno del mismo;

b.

polipéptido Spb2 o un fragmento inmunógeno del mismo;

c.

polipéptido antígeno alfa con proteína C o un fragmento inmunógeno del mismo;

d.

polipéptido Rib o un fragmento inmunógeno del mismo;

e.

polipéptido Lmb o un fragmento inmunógeno del mismo;

f.

polipéptido C5a-asa o un fragmento inmunógeno del mismo;

g.

polisacáridos u oligosacáridos estreptocócicos del Grupo B.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido y un portador farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, la composición farmacéutica comprende además un ingrediente activo seleccionado de entre:

a.

los polipéptidos Spb1 y Spb2;

b.

el antígeno alfa con proteína C;

c.

el polipéptido Rib;

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d.

el polipéptido Lmb;

e.

el polipéptido C5a-asa;

f.

un polisacárido u oligosacárido estreptocócico del Grupo B; y

g.

una vacuna antiestreptocócica.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un anticuerpo purificado contra el polipéptido.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo monoclonal contra el polipéptido.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una estirpe celular inmortal que produce el anticuerpo monoclonal.

Preferentemente, el anticuerpo está marcado con un marcador detectable.

Preferentemente, el marcador se selecciona de entre una enzima, un producto químico que emite fluorescencia y un elemento radioactivo.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos contra el polipéptido, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, la composición farmacéutica comprende además por lo menos un anticuerpo contra una proteína seleccionada de entre Spb1, Spb2, Rib, Lmb, C5a-asa y antígeno alfa con proteína C.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido.

Preferentemente, el ácido nucleico se selecciona de entre:

a.

la secuencia SEC. ID. nº: 1 de ADN.

b.

una secuencia de ADN que se hibrida con la secuencia SEC. ID. nº: 1 de ADN en condiciones de hibridación a severidad moderada;

c.

una secuencia de ADN capaz de codificar por lo menos una de las secuencias de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN de (a) o (b);

d.

una variante degenerada de la misma;

e.

un alelo de la misma; y

f.

un fragmento de la misma que se hibrida con la secuencia SEC. ID. nº: 1 de ADN en condiciones de hibridación normales.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico y un activador.

Preferentemente, el activador comprende un activador bacteriano, de levadura, de insecto o de mamífero.

Convenientemente el vector es un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial de levadura (YAC), un bacteriófago o un ADN vírico eucariótico.

En una forma de realización adicional de la presente invención, se proporciona un sistema de vector huésped para la producción de un polipéptido que comprende el vector en una célula huésped adecuada.

Preferentemente, la célula huésped adecuada comprende una célula procariótica o eucariótica.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende el ácido nucleico.

Preferentemente, la molécula de ADN está operativamente ligada a una secuencia de control de la expresión.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un huésped unicelular transformado con la molécula de ADN recombinante.

\newpage

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna de ácido nucleico que comprende la molécula de ADN recombinante.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para detectar la presencia del polipéptido, en el que el polipéptido se mide de la manera siguiente:

a.

poniendo en contacto una muestra en la que se supone la presencia o actividad del polipéptido, con un anticuerpo contra dicho polipéptido en condiciones que permitan que se produzca la unión del polipéptido al anticuerpo; y

b.

detectando si se ha producido la unión entre el polipéptido procedente de la muestra y el anticuerpo;

en la que la detección de la unión indica la presencia o actividad del polipéptido en la muestra.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una bacteria que tiene un gen que codifica el polipéptido, procedimiento que comprende:

a.

poner en contacto una muestra, en la que se supone la presencia o actividad del polipéptido, con un oligonucleótido que se hibrida con el gen del polipéptido, en condiciones que permiten que se produzca la hibridación específica del oligonucleótido con el gen; y

b.

detectar si se ha producido la hibridación entre el oligonucleótido y el gen;

en el que la detección de la hibridación indica la presencia o actividad de la bacteria en la muestra.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona la utilización de la vacuna o de la composición inmunógena para la preparación de un medicamento destinado a la prevención de una infección con una bacteria que expresa el polipéptido.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona la utilización de la composición farmacéutica para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una infección con una bacteria que expresa el polipéptido.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona la utilización de la composición farmacéutica para la preparación de un medicamento destinado a la provocación de una respuesta inmunitaria en un sujeto que ha sido expuesto a una bacteria estreptocócica o infectado con ella.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona la utilización de la composición farmacéutica para la preparación de un medicamento destinado a la prevención de una infección por una bacteria estreptocócica.

Spb1 y Spb2 se describen en el documento WO 00/78787. El antígeno alfa con proteína C se describe en Michel et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (21), 10060-4. Rib se describe en Wästfelt et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 (31), 18892-18897. Lmb se describe en Spellerberg et al. (1999) Infect. Immun. 67 (2), 871-8. C5a-asa se describe en Chmouryguina et al. (1996) Infect. Immun. 65 (7), 2387-90.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa las sondas específicas de tipo III-3 del modelo de digesta de restricción (RDP). Hibridación por transferencia de manchas de la sonda DY1-1 con ADN genómico aislado de GBS de tipo III. 10 \mug de ADN genómico de cada una de las 62 cepas de GBS de tipo III se transfirió a una membrana de nilón. La sonda DY1-1 radiomarcada se hibridó con ADN de todas las cepas III-3 (filas A-D) incluyendo la cepa de tipo III-3 original (pocillo E-1). La sonda no pudo hibridarse con el ADN de las cepas III-2 (F1-F10, G1-7) incluyendo la cepa original utilizada en la hibridación por substracción (pocillo E 10) y las cepas III-1 (pocillos H1-3; véase la Figura 3). El mismo modelo de hibridación se observó utilizando la sonda DY1-11.

La Figura 2 representa el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos prevista de emaA.

La Figura 3 representa el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos prevista de emaB.

La Figura 4 representa el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos prevista de emaC.

La Figura 5 representa el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos prevista de emaD.

Las Figuras 6 A-D representa el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos prevista de emaE.

La presente invención se refiere al objeto de las reivindicaciones.

Polipéptidos

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Ema bacteriano. Se proporcionan polipéptidos Ema bacterianos de estreptococos, enterococos y corinebacterias. La presente invención se refiere específicamente a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido EmaA de estreptococos. Otros polipéptidos Ema incluyen EmaB, EmaC, EmaD y EmaE, sin embargo, la presente invención se refiere únicamente a EmaA.

Los polipéptidos de la presente invención son adecuados para su utilización en animales que se inmunizan generalmente contra la infección por estreptococos. Los polipéptidos de la presente invención son adecuados para su utilización en animales que se inmunizan generalmente contra la infección por estreptococos del Grupo B, del Grupo A y por S. pneumoniae. Los polipéptidos de la presente invención son adecuados para su utilización en animales que se inmunizan contra estreptococos del Grupo B. Estos polipéptidos o fragmentos de péptido de los mismos, cuando se formulan con un adyuvante apropiado, se utilizan en vacunas para la protección contra estreptococos, particularmente estreptococos del Grupo B, y contra otras bacterias con proteínas con reacción cruzada.

Las proteínas de GBS con homólogos de estreptococos fuera del Grupo B han sido identificadas anteriormente (Lachenauer CS y Madoff LC (1997) Adv. Exp. Med. Biol. 418:615-8; Brady L. J. et al. (1991) Infect Immun. 59(12):4425-35; Stahlhammer-Carlemalm M. et al. (2000) J. Infect. Dis. 182(1):142-129). Stahlhammer-Carlemalm et al. han demostrado protección cruzada entre estreptococos del Grupo A y Grupo B debida a proteínas superficiales con reacción cruzada (Stahlhammer-Carlemalm M. et al. (2000) J. Infect. Dis. 182(1):142-129). La proteína R28 del estreptococo del grupo A (GAS) y la proteína Rib del estreptococo del grupo B (GBS) son moléculas de la superficie que producen inmunidad protectora contra la infección experimental. Estas proteínas son miembros de la misma familia y reaccionan en cruz inmunológicamente. A pesar de la extensa identidad del resto de aminoácidos, la reactividad cruzada entre R28 y Rib se descubrió que era limitada, como se demuestra por análisis con proteínas muy purificadas y antisueros específicos. No obstante, la inmunización de ratones con R28 purificada proporcionó protección contra la infección letal con cepas de GBS que expresan a Rib, e inmunización con protección proporcionada por Rib contra GAS que expresa a R28. Por lo tanto, R28 y Rib produjeron inmunidad protectora cruzada.

La presente invención se refiere a un polipéptido EmaA estreptocócico aislado que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC. ID. nº: 2, y análogos sustancialmente homólogos, variantes alélicas y fragmentos inmunógenos de la misma.

La identidad o posición de uno o más restos de aminoácidos puede cambiarse o modificarse para que incluya variantes tales como, por ejemplo, deleciones que contienen no todos los restos especificados para la proteína, sustituciones en la que uno o más restos especificados se sustituyen por otros restos y adiciones en las que uno o más restos de aminoácidos se añaden a una parte terminal o media del polipéptido. Estas moléculas incluyen: la incorporación de codones "preferidos" para la expresión por huéspedes no mamíferos seleccionados; el aporte de puntos para la escisión por enzimas endonucleasa de restricción; y el aporte de secuencias de ADN iniciales, terminales o intermedias adicionales que facilitan la construcción de vectores expresados fácilmente.

La presente invención contempla la utilización de los polipéptidos de estreptococos de la presente invención para pruebas y procedimientos de diagnóstico destinados a determinar y/o controlar la infección por estreptococos. De este modo, la presente invención proporciona un polipéptido EmaA de GBS aislado, marcado con un marcador detectable.

En el caso en el que se utiliza un marcador radioactivo, tal como los isótopos ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re, pueden utilizarse conocidos procedimientos de recuento disponibles actualmente. En el caso en el que el marcador sea una enzima, la detección puede realizarse por cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas utilizadas actualmente, conocidas en la técnica.

Tal como se define en la presente memoria, "adherencia" significa la unión no covalente de una bacteria a una célula o secreción humanas que es suficientemente estable para resistir el lavado.

La expresión "adhesina de la matriz extracelular", "Ema", "ema" puede utilizarse en la presente memoria indistintamente, y tal como se utiliza en toda la presente solicitud y en las reivindicaciones se refiere al material proteico incluyendo las proteínas simples o múltiples.

Se contemplan asimismo las proteínas y polipéptidos que presentan actividad sustancialmente equivalente o alterada. Puede deliberarse sobre estas modificaciones, por ejemplo, como las modificaciones obtenidas por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como las obtenidas por mutaciones en huéspedes que son productores de uno o más polipéptidos Ema. Asimismo, la expresión "adhesina de la matriz extracelular (Ema)" pretende incluir dentro de su alcance las proteínas específicamente mencionadas en la presente memoria así como todos los análogos sustancialmente homólogos y las variaciones alélicas.

En otra forma de realización, la presente invención contempla fragmentos de péptido del polipéptido que proceden de los productos de la digestión proteolítica del polipéptido.

El derivado del polipéptido puede tener uno o más grupos químicos unidos a él. El grupo químico puede ser un polímero soluble en agua, un polietilenglicol, un mono-, di-, tri- o tetrapegilado o monopegilado con terminal N.

El acoplamiento de polietilenglicol (PEG) a compuestos es particularmente útil porque el PEG tiene una toxicidad muy baja en mamíferos (Carpenter et al., 1971). Por ejemplo, un aducto de PEG de adenosina desaminasa fue aprobado en los Estados Unidos para su utilización en seres humanos para el tratamiento del síndrome de la inmunodeficiencia combinada grave. Una segunda ventaja proporcionada por la conjugación de PEG es la de reducir eficazmente la inmunogenicidad y la antigenicidad de los compuestos heterólogos. Por ejemplo, un aducto de PEG de una proteína humana puede ser útil para el tratamiento de la enfermedad en otra especie de mamífero sin riesgo de desencadenar una respuesta inmunitaria grave. El compuesto de la presente invención puede administrarse en un dispositivo de microencapsulación a fin de reducir o prevenir una respuesta inmunitaria del huésped contra el compuesto o contra las células que pueden producir el compuesto. El compuesto de la presente invención puede administrarse también microencapsulado en una membrana, tal como en un liposoma.

Se han descrito numerosas formas activadas de PEG adecuadas para la reacción directa con proteínas. Los reactivos de PEG útiles para la reacción con grupos amino de proteínas incluyen los ésteres activos de ácido carboxílico o derivados de carbonato, particularmente aquellos en los que los grupos salientes son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o 1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato. Los derivados de PEG que contienen grupos maleimido o haloacetilo son reactivos útiles para la modificación de grupos sulfhidrilo libres de proteínas. Asimismo, los reactivos PEG que contienen grupos aminohidrazina o hidrazida son útiles para la reacción con aldehídos generados por oxidación con peryodato de los grupos carbohidrato en las proteínas.

Los restos de aminoácido del polipéptido descrito en la presente memoria se prefieren al estar en la forma isomérica "L". Los restos en forma isomérica "D" pueden sustituirse por cualquier resto de L-aminoácido, siempre que la propiedad funcional deseada de actividad de lectina sea conservada por el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el terminal amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el terminal carboxi de un polipéptido. Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria están de acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos habitual, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969).

Debe observarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos están representadas en la presente memoria por las fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del terminal amino al terminal carboxi. Además, debe observarse que un guión al comienzo o final de una secuencia del resto aminoácido indica un enlace peptídico en una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos.

El polipéptido sintético, preparado utilizando las técnicas bien conocidas de fase sólida, fase líquida o las técnicas de condensación de péptidos, o cualquier combinación de las mismas, puede incluir aminoácidos naturales y no naturales. Los aminoácidos utilizados para la síntesis de péptidos pueden ser la resina de aminoácido Boc habitual (N^{\alpha}-t-butiloxicarbonil protegida con N^{\alpha}-amino) con los protocolos de desprotección, neutralización, acoplamiento y lavado habituales del procedimiento original en fase sólida de Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154), o con los aminoácidos 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) protegidos con N^{\alpha}-amino con base lábil descritos por primera vez por Carpino y Han (1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409). De este modo, el polipéptido descrito en la presente memoria puede comprender D-aminoácidos, una combinación de D- y L-aminoácidos y varios aminoácidos "diseñadores" (p. ej., \beta-metil aminoácidos, C\alpha-metil aminoácidos y N\alpha-metil aminoácidos, etc.) para transportar propiedades especiales. Los aminoácidos sintéticos incluyen ornitina por lisina, fluorofenilalanina por fenilalanina y norleucina por leucina o isoleucina. Además, por asignación de aminoácidos específicos en las etapas de acoplamiento específico, pueden generarse hélices \alpha, espiras \beta, hojas \beta, espiras \gamma y péptidos cíclicos.

Los péptidos pueden comprender un aminoácido especial en el terminal C que incorpora una cadena lateral con CO_{2}H o CONH_{2} para simular una glicina libre o un grupo glicina-amida. Otra manera de considerar este resto especial sería como análogo de aminoácido D o L con una cadena lateral que está constituida por un enlazador o enlace a la perla. El resto C-terminal seudolibre puede ser de configuración óptica D o L; puede utilizarse una mezcla racémica de isómeros D y L.

Puede incluirse piroglutamato como resto N-terminal del péptido. Aunque el piroglutamato no es adecuado para la secuencia por degradación de Edman, al limitar la sustitución a solamente el 50% de los péptidos en una perla dada con piroglutamato N-terminal, permanecerá suficiente péptido sin piroglutamato en la perla para el secuenciado. Cualquier experto debería reconocer fácilmente que esta técnica se podría utilizar para el secuenciado de cualquier péptido que incorpore un resto resistente a la degradación de Edman en el terminal N. Otros procedimientos para caracterizar péptidos aislados que demuestran actividad deseada se describen con detalle a continuación. La actividad específica de un péptido que comprende un grupo N-terminal bloqueado, p. ej., piroglutamato, cuando el grupo N-terminal específico está presente en el 50% de los péptidos, se demostraría fácilmente comparando la actividad de un péptido completamente bloqueado (100%) con un péptido no bloqueado (0%).

Asimismo se describe la preparación de péptidos que presentan propiedades estructurales mejor definidas, y la utilización de peptidomiméticos, y enlaces peptidomiméticos, tales como los enlaces éster, para preparar péptidos con nuevas propiedades.

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Puede generarse un péptido que incorpore un enlace péptido reducido, es decir, R_{1}-CH_{2}-NH-R_{2}, en la que R_{1} y R_{2} son restos o secuencias de aminoácido. Un enlace péptido reducido puede introducirse como subunidad dipeptídica. Dicha molécula sería resistente a la hidrólisis del enlace péptido, p. ej., la actividad de proteasa. Dichos péptidos proporcionarían ligandos con función y actividad únicas, tales como vidas medias prolongadas in vivo debido a la resistencia a la descomposición metabólica o a la actividad de la proteasa. Además, es bien sabido que en determinados sistemas los péptidos dependientes presentan aumento de actividad funcional (Hruby, 1982, Life Sciences 31:189-199; Hruby et al., 1990, Biochem J. 268:249-262); asimismo se describe un procedimiento para producir un péptido dependiente que incorpora secuencias aleatorias en todas las demás posiciones.

Un péptido forzado, cíclico o rígido puede prepararse por síntesis, con la condición de que en por lo menos dos posiciones en la secuencia del péptido se inserte un aminoácido o un análogo de aminoácido que proporcione un grupo funcional químico capaz de reticularse para forzar, ciclar o hacer rígido el péptido después del tratamiento para formar la reticulación. La ciclación se favorecerá cuando se incorpore un aminoácido que produzca espiras. Ejemplos de aminoácidos capaces de reticular un péptido son la cisteína para formar disulfuro, el ácido aspártico para formar una lactona o una lactasa, y un quelante tal como el ácido \gamma-carbonil-glutámico (Gla) (Bachem) para quelar un metal de transición y formar una reticulación. El ácido \gamma-carboxil glutámico protegido puede prepararse modificando la síntesis descrita por Zee-Cheng y Olson (1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 94:1128-1132). Un péptido en el que la secuencia peptídica comprende por lo menos dos aminoácidos capaces de reticularse puede ser tratado, p. ej., por oxidación de restos de cisteína para formar un disulfuro o por adición de un ión metálico para formar un quelato, a fin de reticular el péptido y formar un péptido forzado, cíclico o rígido.

Asimismo se describen estrategias para preparar sistemáticamente reticulaciones. Por ejemplo, si se incorporan cuatro restos de cisteína en la secuencia peptídica, pueden utilizarse diferentes grupos protectores (Hiskey, 1981, en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Gross y Meienhofer, eds., Academic Press: Nueva York, págs. 137-167; Ponsanti et al., 1990, Tetrahedron 46:8255-8266). El primer par de cisteínas puede desprotegerse y oxidarse, a continuación el segundo conjunto puede desprotegerse y oxidarse. De esta manera puede formarse una serie definida de reticulaciones de disulfuro. Alternativamente, pueden incorporarse un par de cisteínas y un par de análogos de aminoácido de intercalación de modo que las reticulaciones son de diferente naturaleza química.

Pueden incorporarse los siguientes aminoácidos no clásicos en el péptido a fin de introducir motivos de configuración específicos: 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Kazmierski et al., 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-metil-fenilalanina, (2S,3R)-metil-fenilalanina, (2R,3S)-metil-fenilalanina y (2R,3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski y Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.); ácido 2-aminotetrahidronaftaleno-2-carboxílico (Landis, 1989, Tesis doctoral, University of Arizona); hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Miyake et al., 1989, J. Takeda Res. Labs. 43:53-76); \beta-carbolina (D y L) (Kazmierski, 1988, Tesis doctoral, University of Arizona); HIC (ácido histidina isoquinolina carboxílico) (Zechel et al., 1991, Int. J. Pep. Protein Res. 43); y HIC (histidina urea cíclica) (Dharanipragada).

Los análogos y peptidomiméticos de aminoácidos siguientes pueden incorporarse en un péptido para producir o favorecer estructuras secundarias específicas: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico), análogo de dipéptido que produce una espira \beta (Kemp et al., 1985, J. Org. Chem. 50:5834-5838); análogos que producen la hoja \beta (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); análogos que producen la espira \beta (Kemp et al., 1988, 29:5057-5060); análogos que producen la hélice \alpha (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:4935-4938); análogos que producen la espira \gamma (Kemp et al., 1989, J. Org. Chem. 54:109:115); y análogos proporcionados por las referencias siguientes: Nagai y Sato, 1985, Tetrahedron Lett. 26:647-650; DiMaio et al., 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans. pág. 1687; también un análogo de la espira Gly-Ala (Kahn et al., 1989, Tetrahedron Lett. 30:2317); isóstero con enlace amida (Jones et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856); tetrazol (Zabrocki et al., 1988, J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880); DTC (Samanen et al., 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35:501:509); y análogos dados a conocer en Olson et al., 1990, J. Am. Chem. Sci. 112:323-333 y Garvey et al., 1990, J. Org. Chem. 56:436. Los miméticos dependientes de la configuración de espiras beta y protuberancias beta y los péptidos que los contienen, se describen en la patente US nº 5.440.013, publicada el 8 de agosto de 1995 por Kahn.

Se describe además la modificación o derivación del polipéptido o péptido. Las modificaciones de los péptidos son bien conocidas por cualquier experto, e incluyen la fosforilación, carboximetilación y acilación. Las modificaciones pueden efectuarse por medios químicos o enzimáticos. En otro aspecto, pueden prepararse derivados peptídicos glucosilados o acilados grasos. La preparación de péptidos glucosilados o acilados grasos es bien conocida en la técnica. También pueden prepararse derivados peptídicos grasos de acilo. A título de ejemplo no limitativo, puede acilarse un grupo amino libre (N-terminal o lisil), p. ej., miristoilarse.

Un aminoácido que comprende una cadena lateral alifática de estructura -(CH_{2})_{n}CH_{3} puede incorporarse en el péptido. Este y otros conjugados de péptido-ácido graso adecuados para su utilización se dan a conocer en la patente británica GB-8809162.4, solicitud de patente internacional PCT/AU89/00166, y referencia 5, anteriormente.

Grupos químicos para derivación. Los grupos químicos adecuados para la derivación pueden seleccionarse de entre los polímeros solubles en agua. El polímero seleccionado debería ser soluble en agua de modo que el componente al que se une no precipite en un medio acuoso, tal como un medio fisiológico. Preferentemente, para la utilización terapéutica de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Un experto en la materia podrá seleccionar el polímero deseado basándose en dichas consideraciones tales como si el conjugado polímero/componente se utilizará terapéuticamente, y si es así, la dosis deseada, tiempo de circulación, resistencia a la proteólisis y otras consideraciones. Para el presente componente o componentes, estas pueden determinarse utilizando los análisis proporcionados en la presente memoria.

El polímero soluble en agua puede seleccionarse de entre el grupo constituido, por ejemplo, por polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico. El polietilenglicol propionaldehído puede presentar ventajas en la preparación debido a su estabilidad en agua.

El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está comprendido entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilidad de manipulación y preparación. Pueden utilizarse otros tamaños, dependiendo de las propiedades terapéuticas deseadas (p. ej., la duración de la liberación lenta deseada, los efectos, si existe actividad biológica, la facilidad en la manipulación, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína o análogo terapéuticos).

El número de moléculas de polímero acopladas de esta manera pueden variar, y un experto en la materia podrá determinar el efecto sobre la función. Se puede monoderivar, o se puede proporcionar una o alguna combinación di-, tri-, o tetra- de derivación, con el mismo o diferentes grupos químicos (p. ej., polímeros, tales como de diferentes pesos de polietilenglicoles). La proporción de moléculas de polímero a moléculas de componente o componentes variará, dependiendo de sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima (desde el punto de vista de la eficacia de la reacción en la que no existe componente o componentes sin reaccionar en exceso y polímero) se determinará por los factores tales como el grado deseado de modificación (p. ej., mono, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado, de si el polímero está ramificado o sin ramificar y de las condiciones de reacción.

Las moléculas de polietilenglicol (u otros grupos químicos) deberían estar unidos al componente o componentes en consideración de los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existen numerosos procedimientos de acoplamiento disponibles para los expertos en la materia, p. ej., el documento EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., 1992, Exp. Hematol. 20:1028-1035 (que describe la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede estar unido por enlace covalente por restos de aminoácido mediante un grupo reactivo, tal como, un grupo amino o carboxilo libre. Grupos reactivos son aquellos a los que puede unirse una molécula de polietilenglicol activada. Los restos de aminoácido que tienen un grupo amino libre incluyen los restos de lisina y los restos de aminoácido terminales, aquellos que tienen un grupo carboxilo libre incluyen los restos de ácido aspártico, restos de ácido glutámico y el resto de aminoácido C-terminal. Asimismo pueden utilizarse grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para acoplar la(s) molécula(s) de polietilenglicol. Con fines terapéuticos se prefiere el acoplamiento a un grupo amino, tal como el acoplamiento al terminal N o al grupo lisina.

Ácidos nucleicos

Según la presente invención pueden emplearse técnicas de biología molecular, microbiología y de ADN recombinante convencionales dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas están explicadas completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volúmenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Pueden realizarse mutaciones en un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención de modo que se cambie un codón determinado por un codón que codifica un aminoácido diferente. Dicha mutación se realiza generalmente haciendo los menores cambios posibles de nucleótido. Una mutación de sustitución de esta clase puede hacerse para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de manera no conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos con un determinado tamaño o características por un aminoácido que pertenece a otro grupo) o de manera conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o características determinados por un aminoácido que pertenece al mismo grupo). Dicho cambio conservador generalmente conduce a menos cambios en la estructura y función de la proteína resultante. Un cambio no conservador es más probable que altere la estructura, actividad o función de la proteína resultante. La presente invención debería considerarse que incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente las características de actividad o unión de la proteína resultante. Los sustitutos para un aminoácido en la secuencia pueden seleccionarse de entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen la alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromático son la fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen la arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Dichas alteraciones no es de esperar que afecten al peso molecular aparente determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida o al punto isoeléctrico.

Particularmente los ejemplos de sustituciones son:

- Lys por Arg y viceversa de modo que pueda mantenerse una carga positiva;

- Glu por Asp y viceversa de modo que pueda mantenerse una carga negativa;

- Ser por Thr de modo que pueda mantenerse un -OH libre; y

- Gln por Asn de modo que pueda mantenerse un NH_{2} libre.

Las secuencias de ADN sintético permiten la construcción conveniente de genes que expresarán análogos o "muteínas". Un procedimiento general para la incorporación específica para el sitio de aminoácidos no naturales en las proteínas se describe en Noren, et al. Science, 244:182-188 (abril de 1989). Este procedimiento puede utilizarse para crear análogos con aminoácidos no naturales.

La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Ema de estreptococos.

La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Ema de estreptococos del Grupo B EmaA, que incluye variantes, alelos y fragmentos del mismo.

El ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ARN. Además, el ácido nucleico aislado puede estar ligado operativamente a un activador de transcripción del ARN.

La presente invención se refiere también a ácidos nucleicos aislados, tales como moléculas de ADN recombinantes o genes clonados, o a variantes degeneradas de los mismos, alelos o fragmentos de los mismos, que codifican el polipéptido aislado o que inhiben competitivamente la actividad del polipéptido.

La secuencia del ADN de la molécula de ADN recombinante o del gen clonado puede estar operativamente ligada a una secuencia de control de expresión que puede ser introducida en un huésped apropiado. La invención por consiguiente se extiende a huéspedes unicelulares transformados con el gen clonado o la molécula de ADN recombinante que comprenden una secuencia de ADN que codifica una proteína Ema, EmaA.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN con el fin de efectuar la replicación del segmento acoplado.

Un "ADN" o "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma monocatenaria, o en una hélice bicatenaria. Esta expresión se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no limita ninguna forma terciaria concreta. Por lo tanto, esta expresión incluye el ADN bicatenario, entre otros, en moléculas de ADN lineal (p. ej., fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al tratar la estructura de determinadas moléculas de ADN bicatenario, pueden describirse las secuencias en la presente memoria según el convenio normal de dar solamente la secuencia en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga con el ARNm).

"Origen de replicación" se refiere a las secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.

Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que está transcrita y se traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación están determinados por un codón de iniciación en el terminal 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el terminal 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (p. ej., mamífero) e incluso secuencias de ADN de síntesis. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción estará situada normalmente 3' de la secuencia de codificación en el caso del ARNm eucariótico.

Las secuencias de control de la transcripción y de la traducción son secuencias reguladoras de ADN tales como activadores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula huésped.

Una "secuencia activadora" es una zona reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3'). Con el fin de definir la presente invención, la secuencia activadora está unida en su terminal 3' por el punto de iniciación de la transcripción y se prolonga corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia activadora se hallará un punto de iniciación de la transcripción (convenientemente definido por cartografía con nucleasa S1), así como dominios de unión de la proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa. Los activadores eucarióticos con frecuencia, pero no siempre, contendrán las secuencias "TATA" y las secuencias "CAT". Los activadores procarióticos contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias de consenso 10 y 35.

Una "secuencia de control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Otra secuencia de codificación esta "bajo el control" de las secuencias de control de la transcripción y de la traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia de codificación en el ARNm, que se traduce a continuación en la proteína codificada por la secuencia de codificación.

Una "secuencia señal" puede incluirse antes de la secuencia de codificación. Esta secuencia codifica un péptido señal, N-terminal en el polipéptido, que comunica a la célula huésped para dirigir el polipéptido a la superficie de la célula o segregar el polipéptido en el medio, y este péptido señal es sujetado por la célula huésped antes que la proteína abandone la célula. Las secuencias señal pueden encontrarse asociadas con una variedad de proteínas naturales a procariotas y eucariotas.

El término "oligonucleótido", tal como se utiliza en la presente memoria para referirse a una sonda se define como una molécula compuesta por dos o más ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función y utilización última del oligonucleótido.

El término "cebador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un oligonucleótido, ya se produzca de forma natural como en una digesta de restricción purificada o se produce por síntesis, que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se produce la síntesis de un producto de extensión del cebador, que es complementario con una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser monocatenario o bicatenario y debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, procedencia del cebador y utilización del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador del oligonucleótido contiene típicamente de 15 a 25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Los cebadores en la presente memoria se seleccionan para que sean "sustancialmente" complementarios con diferentes cadenas de una secuencia de ADN diana determinada. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridarse con sus cadenas respectivas. Por consiguiente, la secuencia de cebador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia de cebador complementario con la cadena. Alternativamente, pueden intercalarse bases no complementarias o secuencias más largas en el cebador, con la condición de que la secuencia de cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena para hibridarse con ella y de este modo formar la plantilla para la síntesis del producto de la ampliación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN bicatenario en una secuencia nucleotídica específica o cerca de la misma.

Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido en la célula. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido por enlace covalente) en el ADN cromosómico construyendo el genoma de la célula. En los procariotas, levaduras y células de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada estable es aquella en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que es heredado por las células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariótica para crear estirpes celulares o clones compuestos de una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células procedentes de una sola célula o antecesor común por mitosis. Una "estirpe celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" cuando por lo menos aproximadamente el 75% (preferentemente por lo menos aproximadamente el 80%, y aún más preferentemente por lo menos aproximadamente el 90 o el 95%) de los nucleótidos son iguales en toda la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias que utilizan un programa informático típico disponible en los bancos de datos de secuencia, o en el experimento de hibridación de Southern en condiciones, por ejemplo, severas definidas para este sistema concreto. Definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia en la materia. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Una secuencia de ADN está "operativamente ligada" a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esta secuencia de ADN. La expresión "operativamente ligada" incluye las que tienen una señal de partida apropiada (p. ej., ATG) frente a la secuencia de ADN que se ha de expresar y que mantienen el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal de partida apropiada, dicha señal de partida puede insertarse enfrente del gen.

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La expresión "condiciones normales de hibridación" se refiere a las condiciones salinas y de temperatura sustancialmente equivalentes a 5 \times SSC y 65ºC tanto para la hibridación como para el lavado. Sin embargo, un experto en la materia apreciará que dichas "condiciones normales de hibridación" dependen de condiciones específicas incluyendo la concentración de sodio y magnesio en el tampón, la longitud y concentración de la secuencia nucleotídica, del porcentaje de incompatibilidad, del porcentaje de formamida y similares. Es también importante en la determinación de las "condiciones normales de hibridación" si las dos secuencias que se hibridan son ARN-ARN, ADN-ADN o ARN-ADN. Tales condiciones normales de hibridación son determinadas fácilmente por un experto en la materia según las fórmulas bien conocidas, en las que la hibridación está comprendida típicamente de 10 a 20ºC por debajo de la T_{m} prevista o determinada con lavados de mayor severidad, si se desea.

"Degeneran en" significa que un codón de tres letras diferentes se utiliza para especificar un aminoácido concreto. Es bien sabido en la técnica que pueden utilizarse los codones siguientes indistintamente para codificar cada aminoácido específico:

100

Se entiende que los codones especificados anteriormente son para las secuencias del ARN. Los codones correspondientes para el ADN tienen la U sustituida por T.

Pueden realizarse mutaciones en la SEC. ID. nº: 1, de modo que un codón específico se cambie por un codón que codifica un aminoácido diferente. Dicha mutación se realiza generalmente haciendo los menores cambios posibles de nucleótido. Una mutación de sustitución de esta clase puede realizarse para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de manera no conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica específicos para un aminoácido que pertenece a otro grupo) o de manera no conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica específicos para un aminoácido que pertenece al mismo grupo). Dicho cambio conservador conduce generalmente a menos cambio en la estructura y función de la proteína resultante. Un cambio no conservador es más probable que altere la estructura, actividad o función de la proteína resultante. La presente invención debe considerarse que incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente la actividad o características de unión de la proteína resultante.

Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" cuando por lo menos aproximadamente el 70% de los restos de aminoácidos (preferentemente por lo menos aproximadamente el 80%, y aún más preferentemente por lo menos aproximadamente el 90 ó 95%) son idénticos o representan sustituciones conservadoras.

Una zona "heteróloga" del montaje de ADN es un segmento identificable de ADN en una molécula de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. De este modo, cuando la zona heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen normalmente estará flanqueado por el ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo original. Otro ejemplo de una secuencia de codificación heteróloga es un montaje en el que la propia secuencia de codificación no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADNc en el que la secuencia de codificación genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen natural). Las variaciones alélicas o los episodios de mutaciones naturales no dan lugar a una zona heteróloga de ADN como se define en la presente memoria.

Una secuencia de ADN está "operativamente ligada" a una secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esta secuencia de ADN. La expresión "operativamente ligada" incluye la que tiene una señal de iniciación apropiada (p. ej., ATG) enfrente de la secuencia de ADN que debe expresarse y que mantiene el marco de lectura correcto que permite la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de la expresión y la producción del producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal de iniciación apropiada, dicha señal de iniciación puede insertarse enfrente del gen.

Además la presente invención también proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. El activador puede ser, o es idéntico a un activador bacteriano, de levadura, de insecto o de mamífero. Además, el vector puede ser un plásmido, cósmido, cromosoma artificial de levadura (YAC), ADN vírico de bacteriófago o eucariótico. Pueden emplearse otros numerosos ejes centrales de vector conocidos en la materia como útiles para expresar proteínas. Dichos vectores incluyen, adenovirus, virus 40 de simio (SV40), citomegalovirus (CMV), virus del tumor de mama de ratón (MMTV), virus de leucemia murina de Moloney, sistemas de administración de ADN, es decir liposomas, y sistemas de administración de plásmido de expresión. Dichos vectores pueden adquirirse en el comercio o montarse a partir de las secuencias descritas por procedimientos bien conocidos en la técnica.

La presente invención también proporciona un sistema vector huésped para la producción de un polipéptido que comprende el vector de una célula huésped adecuada. Una amplia variedad de células huésped unicelulares son también útiles para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien conocidos tales como las cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras, y células de animal, tales como las células CHO, R1.1, B-W y L-M, células de riñón de mono verde africano (p. ej., COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40 y BMT10), células de insecto (p. ej., Sf9) y células humanas y células vegetales en cultivo tisular.

Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden estar constituidos por segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, p. ej., plásmidos de E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tal como RP4; los ADN de fago, p. ej., los numerosos derivados del fago \lambda, M13 y ADN del fago monocatenario filamentoso; plásmidos de levaduras tal como el plásmido 2 \mu o derivados del mismo; vectores útiles en células eucarióticas tales como los vectores útiles en células de insecto o de mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y los ADN del fago, tales como los plásmidos que han sido modificados para emplear el ADN del fago u otras secuencias de control de expresión, y similares.

Cualquiera de entre una amplia variedad de secuencias de control de expresión (secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN operativamente unida a éste) pueden utilizarse en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los activadores precoz o tardío de SV40, CMV, vacunas, poliomas o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, el operador principal y las zonas activadoras del fago \lambda, las zonas de control de la proteína de la cubierta fd, el activador de 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los activadores de la fosfatasa ácida (p. ej., Pho5), los activadores de los factores de apareamiento \alpha de la levadura, y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de los genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos.

Se entiende que no todos los vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Ni todos los huéspedes funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia podrá seleccionar los vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes apropiados sin excesiva experimentación para llevar a cabo la expresión deseada sin apartarse del alcance de la presente invención. Por ejemplo, al seleccionar un vector, debe considerarse el huésped porque el vector debe funcionar en éste. El número de copias del vector, la capacidad para controlar el número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibióticos, también se considerarán.

Al seleccionar una secuencia de control de expresión, se considerará normalmente una variedad de factores. Éstos incluyen, por ejemplo, la resistencia relativa del sistema, su controlabilidad y su compatibilidad con la secuencia de ADN específica o el gen que debe expresarse, particularmente con respecto a las estructuras secundarias potenciales. Los huéspedes unicelulares adecuados se seleccionarán por consideración de p. ej., su compatibilidad con el vector seleccionado, sus características de secreción, su capacidad para plegar correctamente proteínas y sus requisitos de fermentación, así como la toxicidad para el huésped del producto codificado por las secuencias de ADN que deben expresarse y la facilidad de purificación de los productos de expresión.

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Se describe también un procedimiento de producción de un polipéptido que comprende cultivar el sistema de vector huésped descrito anteriormente en condiciones adecuadas que permitan la producción del polipéptido y la recuperación del polipéptido producido de este modo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "pg" significa picogramo, "ng" significa nanogramo, "ug" o "\mug" significan microgramo, "mg" significa miligramo, "ul" o "\mul" significa microlitro, "ml" significa mililitro y "l" significa litro.

Se describe además la preparación de oligonucleótidos complementarios y ribozimas que pueden utilizarse para interferir con la expresión de una o más proteínas Ema a nivel de traducción. Este procedimiento utiliza ácido nucleico complementario y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm específico, ya sea enmascarando este ARNm con un ácido nucleico complementario o escindiéndolo con una ribozima.

Los ácidos nucleicos complementarios son moléculas de ADN o ARN que son complementarias con por lo menos una parte de una molécula de ARNm específica. (Véase Weintraub, 1990; Marcus-Sekura, 1988). En la célula, se hibridan al ARNm, formando una molécula de doble cadena. La célula no traduce un ARNm en esta forma de doble cadena. Por consiguiente, los ácidos nucleicos complementarios interfieren con la expresión de ARNm en la proteína. Los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y moléculas que se hibridan con el codón de iniciación AUG serán particularmente eficaces, ya que son fáciles de sintetizar y probablemente plantean menos problemas que las moléculas mayores cuando las introducen en las células productoras de Ema. Se han utilizado procedimientos complementarios para inhibir la expresión de muchos genes in vitro (Marcus-Sekura, 1988; Hambor et al., 1988).

Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la capacidad de escindir específicamente otras moléculas de ARN de una sola cadena de manera algo análoga a las endonucleasas de restricción del ADN. Las ribozimas se descubrieron a partir de la observación de que determinados ARNm tienen la capacidad de escindir sus propios intrones. Modificando la secuencia de nucleótidos de estos ARN, los investigadores han sido capaces de modificar moléculas que reconocen secuencias nucleotídicas específicas en una molécula de ARN y escindirla (Cech, 1988). Debido a que son específicos para la secuencia, solamente se inactivan los ARNm con secuencias específicas.

Los investigadores han identificado dos tipos de ribozimas, el tipo Tetrahymena y el tipo "cabeza de martillo". (Hasselhoff y Gerlach, 1988). Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias de cuatro bases, mientras que las de tipo "cabeza de martillo" reconocen secuencias de once a dieciocho bases. Cuanto mayor sea la secuencia de reconocimiento más probablemente ocurrirá exclusivamente en las especies de ARNm diana. Por consiguiente, las ribozimas de tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas de tipo Tetrahymena para inactivar una especie de ARNm específico, y las secuencias de reconocimiento de dieciocho bases son preferibles a las secuencias de reconocimiento más cortas.

Anticuerpos

La presente invención proporciona además un anticuerpo capaz de reconocer o unir específicamente al polipéptido Ema aislado de la presente invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. Además, el anticuerpo puede estar marcado con un marcador detectable que es un marcador radioactivo, calorimétrico, fluorescente o luminiscente. El anticuerpo marcado puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En una forma de realización, el anticuerpo marcado es un anticuerpo marcado purificado. Los procedimientos de marcado de anticuerpos son bien conocidos en la técnica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo purificado contra un polipéptido Ema bacteriano, particularmente un polipéptido EmaA estreptocócico.

Los anticuerpos contra los polipéptidos aislados de la presente invención incluyen anticuerpos surgidos de manera natural y preparados de manera recombinante. Éstos pueden incluir tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales preparados por técnicas genéticas conocidas, así como anticuerpos biespecíficos (híbridos) y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que les aconsejan para su utilización en diagnóstico. Dichos anticuerpos pueden utilizarse en inmunoanálisis para diagnosticar infección con una cepa específica o especies de bacterias. Los anticuerpos pueden también utilizarse para la inmunización pasiva para tratar una infección por bacterias de estreptococos del Grupo B. Estos anticuerpos pueden también ser adecuados para modular la adherencia y/o invasión bacterianas incluyendo la actuación como agentes competitivos.

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal contra un polipéptido EmaA de estreptococos del Grupo B.

Se proporciona además un anticuerpo contra un polipéptido Ema, EmaA, marcado con un marcador detectable. El marcador puede seleccionarse de entre el grupo constituido por un enzima, un producto químico que emite fluorescencia y un elemento radioactivo.

El término "anticuerpo" incluye, a título de ejemplo, tanto los anticuerpos naturales como los no naturales. Específicamente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de los mismos. Además, el término "anticuerpo" incluye los anticuerpos híbridos y los anticuerpos sintéticos completos, y fragmentos de los mismos. Tales anticuerpos incluyen los policlonales, monoclonales, híbridos, de una sola cadena, los fragmentos Fab y un banco de expresión de Fab.

Un "anticuerpo" es cualquier inmunoglobulina, incluyendo los anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen a un epítopo específico. El término comprende anticuerpos policlonales, monoclonales e híbridos, los últimos mencionados descritos con mayor detalle en las patentes US nº 4.816.397 y nº 4.816.567.

Una "zona de combinación de anticuerpo" es la parte estructural de una molécula de anticuerpo compuesta por una cadena pesada y ligera variable y zonas hipervariables que se unen específicamente al antígeno.

La frase "molécula de anticuerpo" en sus varias formas gramaticales utilizadas en la presente memoria contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como una parte inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina.

Las moléculas de anticuerpo a título de ejemplo son moléculas de inmunoglobulina intactas, las moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y las fracciones de una molécula de inmunoglobulina que contiene el parátopo, incluyendo las fracciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')_{2} y F(v), cuyas fracciones se prefieren para su utilización en los procedimientos terapéuticos descritos en la presente memoria.

Las fracciones Fab y F(ab')_{2} de moléculas de anticuerpo se preparan mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, en moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas por procedimientos que son bien conocidos. Véase, por ejemplo, la patente US nº 4.342.566 de Theofilopoulos et al. Las fracciones Fab' de la molécula de anticuerpo son también bien conocidas y se producen a partir de fracciones F(ab')_{2} seguido de reducción de los enlaces disulfuros que unen las dos fracciones de cadena pesada como con mercaptoetanol, y seguido de alquilación del mercaptano de la proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. En la presente memoria se prefiere un anticuerpo que contenga moléculas de anticuerpo intactas.

La frase "anticuerpo monoclonal" en sus varias formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solamente una especie de zona de combinación del anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antígeno específico. Un anticuerpo monoclonal por lo tanto presenta típicamente una sola afinidad de unión para cualquier anticuerpo con el que inmunorreaccione. Un anticuerpo monoclonal puede contener por lo tanto una molécula de anticuerpo que tenga varias zonas de combinación del anticuerpo, cada una inmunoespecífica para un antígeno diferente; p. ej., un anticuerpo monoclonal (híbrido) biespecífico.

Varios procedimientos conocidos en la técnica pueden utilizarse para la producción de anticuerpos policlonales contra el polipéptido o derivados o análogos del mismo (véase, p. ej., Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988). Para la producción del anticuerpo, pueden inmunizarse varios animales huéspedes por inyección con el polipéptido Ema de estreptococos del Grupo B, un fragmento de inmunógeno del mismo, o un derivado (p. ej., fragmento o proteína de fusión) del mismo, incluyendo pero sin limitarse a conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. El polipéptido puede estar conjugado con un portador inmunógeno, p. ej., albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH). Pueden utilizarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, o fragmento, análogo o derivado del mismo, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por estirpes celulares continuas en el cultivo (véase, p. ej., Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988). Éstas incluyen pero no se limitan a la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Theraphy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Los anticuerpos monoclonales pueden producirse en animales exentos de gérmenes que utilizan tecnología reciente (PCT/US90/02545). Los anticuerpos humanos pueden utilizarse y pueden obtenerse utilizando hibridomas humanos (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) o transformando linfocitos B humanos con virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, págs. 77-96). De hecho, pueden utilizarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos híbridos" (Morrison et al., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) cortando y empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para un polipéptido junto con los genes de una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada. Dichos anticuerpos híbridos humanos o humanizados se prefieren para su utilización en la terapia de infecciones o enfermedades humanas, ya que los anticuerpos humanos o humanizados tienen menos probabilidades que los anticuerpos xenogénicos para provocar una respuesta inmunitaria, en particular una respuesta alérgica, ellos mismos. Se utilizan las técnicas descritas para la construcción de bancos de expresión de Fab (Huse et al., 1989 Science 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada para el polipéptido, o sus derivados, o análogos.

Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula de anticuerpo pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen pero no se limitan a: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse produciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

En la producción de anticuerpos, la identificación del anticuerpo deseado puede realizarse por técnicas conocidas en la materia, p. ej.,radioinmunoanálisis, ELISA (ensayo inmunosorbente con enzima ligada), inmunoanálisis en "sándwich", análisis inmunorradiométrico, reacciones de precipitina con difusión en gel, análisis de inmunodifusión, inmunoanálisis in situ (utilizando oro coloidal, enzima o marcadores de radioisótopo, por ejemplo), transferencias Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (p. ej., ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemoaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.

La unión del anticuerpo se detecta por detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otro procedimiento, el anticuerpo primario se detecta por detección de la unión de un anticuerpo secundario o reactivo con el anticuerpo primario. En un procedimiento adicional, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoanálisis.

Los anticuerpos pueden marcarse para la detección in vitro, p. ej., con marcadores tales como enzimas, fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, colorantes, oro coloidal, partículas de látex y agentes quimioluminiscentes. Alternativamente, los anticuerpos pueden marcarse para la detección in vivo, p. ej., con radioisótopos (preferentemente tecnecio o yodo); reactivos de desplazamiento de resonancia magnética (tales como gadolinio y manganeso); o reactivos opacos al radio.

Los marcadores empleados más frecuentemente para estos estudios son los elementos radioactivos, enzimas, productos químicos que emiten fluorescencia cuando se exponen a la luz ultravioleta y otros. Se conocen numerosos materiales fluorescentes y pueden utilizarse como marcadores. Éstos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, rojo de Texas, azul AMCA y amarillo Lucifer. Un material de detección específico es un anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína mediante un isotiocianato. El polipéptido puede también marcarse con un elemento radioactivo o con una enzima. El marcador radioactivo puede ser detectado por cualquiera de los procedimientos de recuento disponibles actualmente. El isótopo preferido puede seleccionarse de entre ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re.

Los marcadores enzimáticos son asimismo útiles, y pueden detectarse por cualquiera de las técnicas calorimétrica, espectrofotométrica, fluoroespectrofotométrica, amperométrica o gasométrica actualmente utilizadas. La enzima se conjuga con la partícula seleccionada por reacción con moléculas enlazadoras tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares. Muchas enzimas que pueden utilizarse en estos procedimientos son conocidas y pueden utilizarse. Las preferidas son peroxidasa, \beta-glucuronidasa, \beta-D-glucuronidasa, \beta-D-glucosidasa, \beta-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes US nº 3.654.090; nº 3.850.752 y nº 4.016.043 son mencionadas a título de ejemplo para su exposición del material y procedimientos de marcado alternativos.

Aplicaciones para diagnóstico

La presente invención se refiere asimismo a las aplicaciones para diagnóstico, incluyendo los procedimientos para la identificación de infecciones por estreptococos.

Como se describió con detalle anteriormente, puede(n) producirse el/los anticuerpo(s) contra los polipéptidos Ema o fragmentos de los mismos y aislarse por procedimientos normalizados incluyendo las técnicas de hibridoma bien conocidas. Por conveniencia, el/los anticuerpo(s) contra los polipéptidos Ema se denominará(n) en la presente memoria Ab_{1} y anticuerpo(s) surgidos en otras especies como Ab_{2}.

La presencia de estreptococos en células puede determinarse por los procedimientos inmunológicos habituales aplicables a dichas determinaciones. Se conocen numerosos procedimientos útiles. Los procedimientos que son especialmente útiles utilizan los polipéptidos Ema marcados con un marcador detectable, anticuerpo contra los polipéptidos Ema marcados con un marcador detectable o anticuerpo secundario marcado con un marcador detectable.

Los procedimientos y su aplicación son en su totalidad conocidos por los expertos en la materia. El procedimiento "competitivo", se describe en las patentes US nº 3.654.090 y nº 3.850.752. El procedimiento en "sándwich", se describe en las patentes US nº RE 31.006 y nº 4.016.043. Incluso se conocen otros procedimientos tales como los procedimientos de "doble anticuerpo" o "DASP".

En cada caso, los polipéptidos Ema forman complejos con uno o más anticuerpo(s) o acompañantes de unión y un elemento del complejo está marcado con un marcador detectable. El hecho de que se haya formado un complejo y, si se desea, la cantidad del mismo, puede determinarse por procedimientos conocidos aplicables a la detección de marcadores.

Los kits de ensayo comerciales adecuados para su utilización por un médico especialista pueden prepararse para determinar la presencia o ausencia de estreptococos, particularmente del polipéptido EmaA que expresa estreptococos.

En la misma medida que el locus ema, como se describe en la presente memoria, se encuentra en el ADN genómico de muchos, si no en todos, los serotipos de los estreptococos del Grupo B, es un marcador general útil para estreptococos del Grupo B. En la medida que los homólogos de Ema existen en otra especie de estreptococos, incluyendoel grupo A y S. pneumoniae, es un marcador general útil para estreptococos. Por consiguiente, pueden producirse los kits de ensayo comerciales para determinar la presencia o ausencia de estreptococos, y por esta razón determinar si un individuo está infectado con estreptococos.

Asimismo se describe un sistema analítico para la identificación de potenciales compuestos eficaces para modular la actividad de una proteína Ema bacteriana de la presente invención. En un caso, el compuesto de ensayo, o un extracto que contiene el compuesto, podría administrarse a una muestra celular que exprese la proteína Ema específica para determinar el efecto del compuesto sobre la actividad de la proteína por comparación con una referencia. En un caso adicional, el compuesto de ensayo, o un extracto que contiene el compuesto, podría administrarse a una muestra celular que exprese la proteína Ema para determinar el efecto del compuesto sobre la actividad de la proteína, y por esta razón sobre la adherencia de dicha muestra celular a las células huésped, en comparación con una referencia.

Puede prepararse un sistema analítico para identificar potenciales fármacos eficaces para modular la actividad del polipéptido Ema. El polipéptido Ema puede introducirse en un sistema de ensayo, y el fármaco en estudio puede introducirse también en el cultivo celular resultante, y el cultivo ser examinado después para observar cualquier cambio en la actividad del polipéptido Ema de las células, debida a la adición del fármaco en estudio solo, o debida al efecto de cantidades añadidas del polipéptido Ema conocido.

Aplicaciones terapéuticas

Las posibilidades terapéuticas que surgen por la existencia de los polipéptidos Ema de estreptococos del Grupo B EmaA, EmaB, EmaC, EmaD y EmaE proceden del hecho de que los polipéptidos Ema se encuentran generalmente en varios serotipos de estreptococos del Grupo B. Además, las amplias posibilidades terapéuticas que surgen por la existencia de polipéptidos homólogos de Ema en varias especies de estreptococos distintas, incluyendo S. pneumoniae y S. pyogenes. Además los polipéptidos homólogos Ema han sido identificados en E. faecalis y C. diptheriae. De particular relevancia a su idoneidad en la terapia de vacunas e inmunológica es que los polipéptidos EmaA, EmaB y EmaC poseen secuencias N-terminales coherentes con un péptido señal, lo que indica la secreción de la célula bacteriana y por lo menos la localización extracelular parcial. Además, los polipéptidos EmaA, EmaB, EmaC, EmaD y EmaE demuestran homología con distintas proteínas bacterianas involucradas o implicadas en la adherencia e invasión bacterianas. Por lo tanto, se prevé que los polipéptidos Ema están implicados en la adherencia a estreptococos o requeridos por la misma y/o en la invasión de células, crítica para la supervivencia bacteriana y la virulencia en el huésped humano.

Moduladores de la proteína adhesina de la matriz extracelular

Por lo tanto, en los casos en los que se desee reducir o inhibir los efectos resultantes de la proteína Ema adhesina de la matriz extracelular de la presente invención, podría introducirse un inhibidor apropiado de EmaA para bloquear su actividad.

En la presente memoria se describen tamices para un modulador de un polipéptido Ema, en particular que modula la adherencia o invasión facilitadas por EmaA.

En dicho ejemplo, un vector de expresión que contiene el polipéptido Ema de la presente invención, o un derivado o análogo del mismo, se coloca en una célula en presencia de por lo menos un agente que se supone que presenta actividad del modulador del polipéptido Ema. La célula es preferentemente una célula bacteriana, aun más preferentemente una célula de estreptococo o una célula huésped bacteriana. La cantidad de actividad de adherencia o de unión se determina y se identifica cualquiera de dichos agentes como modulador cuando la cantidad de actividad de adherencia o de unión en presencia de dicho agente es diferente que en su ausencia. Los vectores pueden introducirse por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. En un ejemplo citado, el polipéptido Ema de GBS se expresa en estreptococos y la etapa de determinación de la cantidad de actividad de adherencia o de unión se lleva a cabo determinando la cantidad de unión a células huésped bacterianas in vitro.

Cuando la cantidad de actividad de adherencia o de unión en presencia del modulador es mayor que en su ausencia, el modulador se identifica como agonista o activador del polipéptido Ema, mientras que cuando la cantidad de actividad de unión por adherencia en presencia del modulador es menor que en su ausencia, el modulador se identifica como agonista o inhibidor del polipéptido Ema. Como reconocería cualquier experto en la materia, determinaciones tales como éstas y las siguientes podrían requerir alguna forma de análisis estadístico, que está comprendida dentro de la experiencia en la materia.

Los efectores naturales descubiertos en las células que expresan el polipéptido Ema pueden fraccionarse y analizarse utilizando análisis de efector estándar como se ejemplifica por ejemplo en la presente memoria. De este modo un agente que se identifica puede ser un modulador de adherencia o de unión natural. Alternativamente, los bancos de productos naturales pueden cribarse utilizando los ensayos descritos en la presente memoria para el cribado de dichos agentes.

Otro método utiliza bacteriófago recombinante para producir grandes bancos. Utilizando el "procedimiento del fago" [Scout y Smith, 1990, Science 249:386-390 (1990); Cwirla, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)], pueden construirse bancos muy grandes (10^{6} a 10^{8} entidades químicas). Incluso otro procedimiento utiliza principalmente procedimientos químicos, de los cuales el procedimiento de Geysen [Geysen et al., Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysen et al. J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)] y el procedimiento de Fodor et al. [Science 251:767-773 (1991)] son ejemplos. Furka et al. [14th Internacional Congress of Biochemistry, volumen 5, resumen FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)], Houghton [patente US nº 4.631.211, publicada en diciembre 1986] y Rutter et al. [patente US nº 5.010.175, publicada el 23 de abril de 1991] describen procedimientos para producir una mezcla de péptidos que pueden analizarse.

En otro ejemplo, bancos sintéticos [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4 (1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lam et al., publicación de patente internacional nº WO 92/00252; Kocis et al., publicación de patente internacional nº WO 9428028, y similares pueden utilizarse para cribar dicho agente.

Se describen también antagonistas o agentes de bloqueo que incluyen fragmentos de péptidos, miméticos, una molécula de ácido nucleico, un ribozima, un polipéptido, una molécula pequeña, una molécula de carbohidrato, un monosacárido, un oligosacárido o un anticuerpo. Asimismo, se describen los agentes que bloquean o inhiben de manera competitiva la bacteria estreptocócica. Se describe un agente que comprende un compuesto inorgánico, una molécula de ácido nucleico, un oligonucleótido, un compuesto orgánico, un péptido, un compuesto peptidomimético o una proteína que inhibe el polipéptido.

Vacunas

En otro aspecto, la presente invención comprende las vacunas basadas en las proteínas Ema descritas en la presente memoria.

La inmunidad activa contra estreptococos puede provocarse por inmunización (vacunación) con una cantidad inmunógena del polipéptido, o derivado del péptido o fragmento del mismo, y un adyuvante, en el que el polipéptido, o el derivado antigénico o fragmento del mismo, es el componente antigénico de la vacuna. El polipéptido, o derivado antigénico o fragmento del mismo, puede ser un componente antigénico, en presencia de otros componentes antigénicos en una vacuna. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención puede combinarse con otros polipéptidos o poli/oligosacáridos estreptocócicos, o fragmentos inmunógenos de los mismos, incluyendo por ejemplo el polisacárido capsular de GBS, Spb1, Spb2, antígeno alfa de la proteína C, Rib, Lmb y C5a-asa en una vacuna multicomponente. Dicha vacuna multicomponente puede utilizarse para potenciar la respuesta inmunitaria, aun en los casos en los que el polipéptido de la presente invención provoca una respuesta sobre sí mismo. El polipéptido de la presente invención puede también combinarse con las vacunas existentes, vacunas bacterianas completas o a base de cápsula, solas o en combinación con otros polipéptidos de GBS, particularmente Spb1 y/o Spb2 y/o antígeno alfa de la proteína C y/o Rib para potenciar dichas vacunas existentes.

El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmunitaria contra un antígeno. Un adyuvante puede servir como medicamento de liberación retardada en el tejido que libera lentamente el antígeno y también como activador del sistema linfoide que potencia de manera no específica la respuesta inmunitaria (Hood et al., Immunology, segunda ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, pág. 384). Con frecuencia, una prueba de provocación primaria con un antígeno solo, en ausencia de un adyuvante, no podrá provocar una respuesta inmunitaria humoral o celular. Los adyuvantes incluyen, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, aceite o emulsiones de hidrocarburos, hemocianina de la lapa californiana, dinitrofenol y adyuvante humano potencialmente útil tal como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Se utiliza un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Se describe asimismo una vacuna que comprende un mutante no adherente ni virulento, incluyendo los mutantes ema descritos en la presente memoria.

Medaglini et al. (Madaglini et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92;6868-6872) y Oggioni y Pozzi (Oggioni, M. R. y Pozzi, G. (1996) Gene 169:85-90) han descrito anteriormente la utilización de Streptococcus gordonii, una bacteria comensal de la cavidad oral humana, como vehículos de administración de vacuna activa y para la expresión génica heteróloga. Dicho mutante ema puede utilizarse por consiguiente como vehículo para la expresión de las proteínas inmunógenas con el fin de provocar una respuesta inmunitaria a tales otras proteínas en el contexto de las vacunas. Puede provocarse inmunidad activa contra estreptococos del Grupo B, por inmunización (vacunación) con una cantidad inmunógena del vehículo ema que expresa una proteína inmunógena. También se describe la utilización de dicho mutante ema en la expresión de una proteína terapéutica en el huésped en el contexto de otras formas de terapia.

El polipéptido de la presente invención, o fragmentos del mismo, pueden prepararse en una mezcla con un adyuvante para preparar una vacuna. El polipéptido o derivado del péptido o fragmento del mismo, utilizado como componente antigénico de la vacuna puede ser un antígeno común a todos o muchos serotipos de bacterias GBS, o común a especies de bacterias íntimamente relacionadas, por ejemplo Streptococcus.

Los vectores que contienen la vacuna a base de ácido nucleico de la invención pueden introducirse en el huésped deseado por procedimientos conocidos en la materia, p. ej., transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), utilización de una pistola génica, o un transportador del vector del ADN (véase, p. ej., Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Harmut et al., solicitud de patente canadiense nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

Los modos de administración de la vacuna o composiciones de la presente invención pueden comprender la utilización de cualquier procedimiento adecuado y/o procedimientos para administrar la vacuna o composición al animal huésped por lo que son eficaces desde un punto de vista inmunoestimulante. Los modos de administración pueden incluir, sin limitación, procedimientos de administración parenteral tales como por vía paracanceral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, intracraneal e intratumoral. Ya que el resultado deseado de la vacunación consiste en interpretar una respuesta inmunitaria contra el antígeno, y de este modo contra el organismo patógeno, es deseable la administración directa, o por direccionamiento o selección de un vector vírico, indirectamente, a los tejidos linfoides, p. ej., ganglios linfáticos o bazo. Ya que las células inmunes se están replicando continuamente, son dianas ideales para las vacunas de ácido nucleico a base de vector retrovírico, ya que los retrovirus requieren células replicadoras. Estas vacunas y composiciones pueden utilizarse para inmunizar mamíferos, por ejemplo, por las vías intramuscular o parenteral, o mediante la administración a las superficies de la mucosa utilizando micropartículas, cápsulas, liposomas y moléculas de direccionamiento, tales como toxinas y anticuerpos. Las vacunas y composiciones inmunógenas pueden administrarse a las superficies de la mucosa, por ejemplo, por las vías nasal u oral (intragástricas). Alternativamente, pueden ser deseables otros modos de administración incluyendo los supositorios. Para los supositorios, pueden incluirse aglutinantes y portadores, por ejemplo, polialquilenglicoles y triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir incipientes empleados normalmente tales como calidades farmacéuticas de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio.

Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación lenta o polvos y contienen entre 1 y 95% de las composiciones inmunógenas. Las composiciones inmunógenas se administran de manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal para que sea terapéuticamente eficaz, protectora e inmunógena. La cantidad que debe administrarse depende del sujeto que debe inmunizarse, incluyendo, por ejemplo la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, y si se desea, para producir una respuesta inmunitaria mediada por células, humoral o por anticuerpo. Las cantidades exactas de antígeno y de composición inmunógena que deben administrarse dependen del criterio del médico de familia. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados son fácilmente determinables por expertos en la materia y pueden ser del orden de microgramos a miligramos. Los regímenes adecuados para la administración inicial y dosis de refuerzo son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida de administración ulterior. La dosificación de la vacuna puede también depender de la vía de administración y variará según el tamaño del hués-
ped.

Puede proporcionarse inmunidad pasiva a un sujeto animal susceptible de padecer una infección por estreptococos mediante administración de antisuero, anticuerpos policlonales o un anticuerpo monoclonal neutralizante contra el polipéptido Ema de la invención al paciente. Se describe una combinación de anticuerpos dirigida contra uno o más polipéptidos Ema EmaA, en combinación con uno o más anticuerpos contra Spb1, Spb2, Rib y antígeno alfa de la proteína C. Aunque la inmunidad pasiva no proporciona protección a largo plazo, puede ser una herramienta valiosa para el tratamiento de una infección bacteriana en un sujeto que no ha sido vacunado. La inmunidad pasiva es particularmente importante para el tratamiento de cepas de bacterias resistentes a antibióticos, ya que ninguna otra terapia puede estar disponible. Los anticuerpos administrados para la terapia inmunitaria pasiva pueden ser anticuerpos autólogos. Por ejemplo, si el paciente es un ser humano, los anticuerpos son de origen humano o han sido "humanizados", para minimizar la posibilidad de una respuesta inmunitaria contra los anticuerpos. Pueden utilizarse vacunas activas o pasivas para proteger a un paciente animal de la infección por estreptococos, particularmente estreptococos del Grupo B.

Se han generado y probado anteriormente vacunas contra GBS. Las vacunas preliminares utilizaron polisacárido no conjugado purificado. Los polisacáridos y oligosacáridos de GBS son poco inmunógenos y no pueden producir memoria ni respuestas de refuerzo significativas. Baker et al. inmunizaron 40 mujeres embarazadas con polisacárido capsular de serotipo III purificado (Baker, C. J. et al. (1998) New Engl. J. of Med. 319:1180-1185). En conjunto, solamente el 57% de las mujeres con bajas concentraciones de anticuerpo específico respondieron a la vacuna. La escasa inmunogenicidad del antígeno polisacárido purificado se demostró más en un estudio en el que treinta voluntarios adultos se inmunizaron con una vacuna tetravalente compuesta por polisacárido purificado de los serotipos Ia, Ib, II y III (Kotloff, K. L. et al. (1996) Vaccine 14:446-450). Aunque segura, esta vacuna fue solo modestamente inmunógena, respondiendo solamente el 13% de los pacientes al tipo Ib, el 17% al tipo II, respondiendo el 33% al tipo Ia y respondiendo el 70% al polisacárido de tipo III. La escasa inmunogenicidad de los antígenos de polisacárido incitó esfuerzos para desarrollar vacunas conjugadas de polisacárido, con lo cual estos polisacáridos u oligosacáridos se conjugan con portadores de proteína. El noventa por ciento de mujeres adultas sanas inmunizadas con una vacuna conjugada de polisacárido de tipo III-toxoide contra el tétanos respondió con un aumento cuádruple en la concentración de anticuerpo, en comparación con el 50% de las inmunizadas solo con polisacárido (Kasper, D. L. et al. (1996) J. of Clin. Invest. 98:2308-2314). Una vacuna conjugada de polisacárido de tipo Ia/Ib y toxoide contra el tétanos fue igualmente más inmunógena en adultos sanos que solo el polisacárido (Baker, C. J. et al. (1999) J. Infect. Dis. 179:142-150).

El procedimiento general para la conjugacion del polisacárido se describe en Wessels et al. (Wessels, M. R. et al. (1990) J. Clin. Investigation 86:1428-1433). Antes del acoplamiento con el toxoide contra el tétanos, se introducen grupos aldehído en el polisacárido por oxidación controlada con peryodato, dando como resultado la conversión de una parte de los restos de ácido siálico del polisacárido a restos del análogo en el carbono 8 del ácido siálico, ácido 5-acetamido-3,5-didesoxi-D-galactosiloctulosónico. El toxoide contra el tétanos se conjuga con el polisacárido por aminación reductora utilizando grupos de aldehído libres presentes en los restos de ácido siálico parcialmente oxidados. La preparación y conjugación de oligosacáridos se describe en Paoletti et al. (Paoletti, L. C. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:18278-18283). El polisacárido capsular purificado se despolimeriza mediante digestión enzimática utilizando endo-beta-galactosidasa producida por Citrobacter freundii. Después de la digestión, los oligosacáridos se fraccionan por cromatografía de filtración en gel. El toxoide contra el tétanos se acopló por enlaces covalentes mediante una molécula espaciadora sintética al extremo reductor del oligosacárido por aminación reductora.

Los procedimientos y las vacunas que comprenden vacunas de conjugado de GBS, que comprenden polisacárido capsular y proteína se proporcionan y se describen en las patentes US nº 5.993.825, nº 5.843.461, nº 5.795.580, nº 5.302.386 y nº 4.356.263.

Estas vacunas de conjugado incluyen las vacunas de conjugado polisacárido-toxoide contra el tétanos.

Un polipéptido propuesto para ser utilizado en una vacuna con GBS en el antígeno alfa de la proteína C de GBS repetitiva, que contiene hasta nueve unidades repetidas una tras de otra de 82 aminoácidos (Michel, J. K. et al. (1992) PNAS USA 89: 10060-10064). El polipéptido, los procedimientos y las vacunas del mismo, incluyendo las vacunas del conjugado de polisacárido generadas con el mismo, se proporcionan y se describen en las patentes US nº 5.968.521, nº 5.908.629, nº 5.858.362, nº 5.847.081, nº 5.843.461, nº 5.843.444, nº 5.820.860 y 5.648.241.

Los anticuerpos generados contra el antígeno alfa con proteína C con un gran número de repeticiones protegen contra la infección, pero los GBS son capaces de cambiar la estructura de la proteína eliminando una o más de las zonas de repetición y la detección del escape por estos anticuerpos (Madoff, L. C. et al. (1996) PNAS USA 93:4131-4136). Este efecto pudo evitarse teóricamente por inmunización con una proteína con un número inferior de unidades de repetición, pero la inmunogenicidad del antígeno alfa con la proteína C está inversamente relacionada con el número de repeticiones, el 65% de los ratones respondieron a la inmunización con la proteína de 9 repeticiones, pero solamente el 11% a una proteína con 1 repetición (Gravekamp, C. et al. (1997) Infect Immunity 65:5216-5221). Esto es un inconveniente con cualquier proteína con una estructura repetitiva, es común para bacterias que son capaces de alterar o reclasificar estos genes para alterar las proteínas expuestas en su superficie.

Las dosis típicas para una vacuna compuesta de un antígeno de proteína están comprendidas en el intervalo entre 2,5 y 50 \mug de proteína total por dosis. Las dosis típicas para una vacuna conjugada polisacárido-proteína son de 7,5 a 25 \mug de polisacárido y de 1,25 a 250 \mug de proteína portadora. Estos tipos de vacunas se administran casi siempre por vía intramuscular. Los programas de dosificación de una vacuna pueden ser determinados fácilmente por un especialista experto, particularmente por comparación de vacunas similares, incluyendo otras vacunas con GBS. Si se utiliza como vacuna universal, una vacuna con GBS se integraría en el programa de inmunización de rutina. Las vacunas más similares requieren una serie principal de inmunizaciones (normalmente 2 ó 3 dosis a intervalos de 2 meses empezando al mes o 2 meses de edad) y un único refuerzo a los 12 a 18 meses de edad. Un número más pequeño de dosis o una sola dosis puede ser adecuada en niños mayores (más de un año de edad). Para la inmunización de mujeres embarazadas, un programa de inmunización a título de ejemplo sería una sola dosis administrada en el segundo o al principio del tercer trimestre. Para la inmunización de mujeres adultas no embarazadas, se utilizaría probablemente una sola dosis. El requisito para las dosis de refuerzo ulteriores en adultos es difícil de predecir, ésta se basaría en la inmunogenicidad de la vacuna y del seguimiento continuo de la eficacia de la vacuna.

Composiciones inmunógenas

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunógena que comprende uno o más polipéptidos Ema bacterianos.

Composiciones farmacéuticas

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido Ema de estreptococos, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Dicha composición farmacéutica para prevenir la fijación de estreptococos a la superficie de la mucosa puede incluir anticuerpos EmaA contra el polipéptido Ema, o cualquier combinación de anticuerpos contra uno o más de dichos polipéptidos Ema. Además, alguna de dichas composiciones puede incluir además anticuerpo contra los polipéptidos de GBS Spb1, Spb2, antígeno alfa con proteína C o Rib. La adherencia de bloqueo que utiliza dicho anticuerpo bloquea la etapa inicial en la infección reduciendo de este modo la colonización. Ésta a su vez disminuye de una persona a otra la transmisión y evita el desarrollo de la enfermedad sintomática.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "composición farmacéutica" significa las cantidades terapéuticamente eficaces de productos de polipéptidos o anticuerpos de la invención junto con diluyentes, conservantes, disolventes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores adecuados útiles en la terapia contra la infección bacteriana o para provocar una respuesta inmunitaria. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una enfermedad y un régimen de administración dados. Dichas composiciones son líquidas o liofilizadas o si no formulaciones secas e incluyen diluyentes de varios contenidos de tampón (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a las superficies, detergentes (p. ej., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes disolventes (p. ej., glicerol, polietilenglicerol), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (p. ej., Timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias de relleno o modificadores de tonicidad (p. ej., lactosa, manitol), enlace covalente de polímeros tal como polietilenglicol a la proteína, acomplejado con iones metálicos, o incorporación del material en o sobre preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo de los polipéptidos de la presente invención. La selección de composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas del polipéptido. Las composiciones de liberación controlada o mantenida incluyen la formulación en productos de liberación lenta lipófilos (p. ej., ácidos grasos, ceras, aceites). También se describen composiciones en partículas recubiertas con polímeros (p. ej., poloxámeros o poloxaminas) y los polipéptidos de la presente invención acoplados a anticuerpos dirigidos contra receptores específicos para tejidos, ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos para tejidos. Otros ejemplos de las composiciones incorporan formas en partículas, recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o potenciadores de permeación para varias vías de administración, incluyendo las vías parenteral, pulmonar, nasal y oral.

Además, tal como se utiliza en la presente memoria "portador farmacéuticamente aceptable" es bien conocido por los expertos en la materia e incluyen, tampón fosfato 0,01 a 0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,8%. Además, dichos portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tal como el oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo la solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen la solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluido y de nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Pueden estar también presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes comparadores, gases inertes y similares.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción alérgica o desfavorable similar, tales como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano.

La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" utilizada en la presente memoria significa una cantidad suficiente para prevenir, y preferentemente reducir en por lo menos aproximadamente el 30 por ciento, más preferentemente por lo menos el 50 por ciento, aún más preferentemente el 90 por ciento, una infección clínicamente significativa por bacteria estreptocócica. Alternativamente, en el caso de una vacuna o composición inmunógena, una cantidad terapéuticamente eficaz utilizada en la presente memoria significa una cantidad suficiente y adecuada para provocar una respuesta inmunitaria y una respuesta al anticuerpo en un individuo, y particularmente para proporcionar una respuesta suficiente para prevenir, y preferentemente reducir en por lo menos aproximadamente el 30 por ciento, más preferentemente por lo menos el 50 por ciento, aún más preferentemente el 90 por ciento, una infección clínicamente significativa por bacteria estreptocócica.

Las composiciones de liberación controlada o mantenida incluyen la formulación en productos de liberación lenta lipófilos (p. ej., ácidos grasos, ceras, aceites). También se describen composiciones en partículas recubiertas con polímeros (p. ej., poloxámeros o poloxaminas) y los compuestos acoplados a anticuerpos dirigidos contra receptores específicos para tejidos, ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos para tejidos. Otros ejemplos de las composiciones incorporan formas en partículas, recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o potenciadores de permeación para varias vías de administración, incluyendo las vías parenteral, pulmonar, nasal y oral.

Cuando se administran, los compuestos se eliminan con frecuencia rápidamente de las superficies de las mucosas o de la circulación y pueden por consiguiente producir actividad farmacológica de vida relativamente corta. En consecuencia, pueden requerirse administraciones frecuentes de dosis relativamente grandes de compuestos bioactivos para mantener la eficacia terapéutica. Los compuestos modificados por el enlace covalente de los polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina se conocen porque presentan vidas medias sustancialmente más largas en la sangre tras la inyección intravenosa que lo hacen los compuestos no modificados correspondientes (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; y Katre et al., 1987). Dichas modificaciones pueden también aumentar la solubilidad de los compuestos en solución acuosa, eliminar la agregación, aumentar la estabilidad física y química del compuesto y reducir en gran medida la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. Como resultado, puede conseguirse la actividad biológica deseada in vivo mediante la administración de dichos aductos polímero-compuesto con menos frecuencia o en dosis menores que con el compuesto no modificado.

Dosis. La cantidad suficiente puede incluir pero no se limita a la comprendida aproximadamente entre 1 \mug/kg y aproximadamente 1.000 mg/kg. La cantidad puede ser de 10 mg/kg. La forma farmacéuticamente aceptable de la composición incluye un portador farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos anteriores proporcionan composiciones terapéuticas que comprenden composiciones farmacéuticas que comprenden vectores, vacunas, polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos, anti-anticuerpos y agentes, para competir con la bacteria de estreptococos del Grupo B por las actividades patógenas, tal como la adherencia a las células huésped.

La preparación de las composiciones terapéuticas que contienen un componente activo está bien comprendida en la materia. Típicamente, dichas composiciones se preparan en forma de aerosol del polipéptido administrado a la nasofaringe o como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación puede estar también emulsionada. El ingrediente terapéutico activo se mezcla con frecuencia con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponación del pH que aumentan la eficacia del ingrediente activo.

Un componente activo puede formularse en la composición terapéutica en formas salinas neutralizadas farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido o de la molécula de anticuerpo) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres pueden también proceder de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Una composición que comprende "A" (en la que "A" es una sola proteína, molécula de ADN, vector, etc.) está sustancialmente exenta de "B" (en la que "B" comprende una o más proteínas contaminantes, moléculas de ADN, vectores, etc.) cuando por lo menos aproximadamente el 75% en peso de las proteínas, ADN, vectores (dependiendo de la categoría de especies a la que pertenecen A y B) en la composición es "A". Preferentemente, "A" comprende por lo menos aproximadamente el 90% en peso de la especie A+B en la composición, aún más preferentemente por lo menos aproximadamente el 99% en peso.

La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" utilizada en la presente memoria significa una cantidad suficiente para reducir por lo menos aproximadamente el 15 por ciento, preferentemente por lo menos el 50 por ciento, más preferentemente por lo menos el 90 por ciento y aún más preferentemente prevenir, una insuficiencia clínicamente significativa de la actividad, función y respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para producir una mejora en una enfermedad clínicamente significativa en el huésped. Una insuficiencia en la respuesta del huésped se pone de manifiesto continuando o propagando la infección bacteriana. Una mejora en una enfermedad clínicamente significativa en el huésped incluye una disminución de la carga bacteriana, eliminación de bacterias de las células huésped colonizadas, reducción de la fiebre o de la inflamación asociadas con la infección, o una reducción de cualquier síntoma asociado a la infección bacteriana.

El componente o los componentes de una composición terapéutica puede introducirse por vía parenteral, a través de las mucosas, p. ej., por vía oral, nasal, pulmonar, o por vía rectal o transdérmica. Preferentemente, la administración es parenteral, p. ej., por inyección intravenosa, e incluyendo también, pero sin limitarse a, administración intraarteriolar, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. La administración oral o pulmonar puede resultar preferida para activar la inmunidad de la mucosa; dado que los estreptococos del Grupo B generalmente colonizan las mucosas nasofaríngea y pulmonar, particularmente la de los recién nacidos, la inmunidad de la mucosa puede ser un tratamiento preventivo particularmente eficaz. La expresión "dosis unitaria" cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a las unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para seres humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el diluyente requerido; es decir, el portador o vehículo.

El compuesto activo puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Theraphy of Infectious Disease and Cancer, López-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); López-Berestein, ibid, págs. 317-327; generalmente íbidem).

La composición terapéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el polipéptido puede administrarse utilizando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. Puede utilizarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otro ejemplo, pueden utilizarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Incluso en otro ejemplo, un sistema de liberación controlada puede colocarse en la proximidad de la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo de este modo solamente una fracción de la dosis general (véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Un dispositivo de liberación controlada puede introducirse en un paciente en la proximidad del punto de activación inmunitaria apropiada o de un tumor. Otros sistemas de liberación controlada se exponen en el estudio de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Un paciente en el que la administración de un componente activo como se indicó anteriormente es un régimen terapéutico eficaz para una infección bacteriana es preferentemente un ser humano, pero puede ser cualquier animal. De este modo, como puede apreciar por cualquier experto en la materia, los procedimientos y composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente adecuados para la administración a cualquier animal, particularmente un mamífero, e incluyendo, animales domésticos, tales como animales felinos o caninos, animales de granja, tales como de las especies bovina, equina, caprina, ovina y porcina, animales salvajes (ya sea en la naturaleza o en un zoológico), animales de investigación, tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, etc., es decir, para uso médico veterinario.

En los procedimientos y composiciones terapéuticos se proporciona una dosis terapéuticamente eficaz del componente activo. Una dosis terapéuticamente eficaz puede ser determinada por cualquier investigador médico experto basándose en las características del paciente (edad, peso, sexo, enfermedad, complicaciones, otras enfermedades, etc.), como es bien conocido en la materia. Además, a medida que se llevan a cabo más estudios rutinarios, aparecerá más información específica con respecto a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de varias enfermedades en varios pacientes, y cualquier investigador experto, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, es capaz de determinar la dosificación apropiada. Generalmente, para la inyección o infusión intravenosa, la dosis puede ser inferior que para la administración intraperitoneal, intramuscular u otra vía de administración. El programa de dosificación puede variar, dependiendo de la vida media en circulación y de la formulación utilizada. Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de la dosificación en la cantidad terapéuticamente eficaz. Las cantidades exactas de ingrediente activo requeridas para ser administradas dependen del criterio del médico de cabecera y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, las dosis adecuadas pueden estar comprendidas entre aproximadamente 0,1 y 20, preferentemente entre 0,5 y aproximadamente 10, y más preferentemente uno a varios, miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo al día y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas mediante una inyección u otra administración posteriores. Alternativamente, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones de diez nanomolar a diez micromolar en la sangre.

Administración con otros compuestos. Para el tratamiento de una infección bacteriana, se puede administrar el presente componente activo junto con una o más composiciones farmacéuticas utilizadas para tratar la infección bacteriana, incluyendo

(1) antibióticos; (2) inhibidores de adhesina bacteriana solubles en carbohidratos; (3) otros inhibidores de adhesina bacteriana de molécula pequeña; (4) inhibidores del metabolismo, transporte o transformación bacterianos; (5) estimulantes de la lisis bacteriana, o (6) anticuerpos antibacterianos o vacunas dirigidas a otros antígenos bacterianos. Otros componentes activos potenciales incluyen agentes antiinflamatorios, tales como esteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos. La administración puede ser simultánea (por ejemplo, administración de una mezcla del presente componente activo y un antibiótico) o pueden ser en serie.

Así pues, las composiciones terapéuticas pueden incluir además una cantidad eficaz del componente activo y uno o más de los ingredientes activos siguientes: un antibiótico, un esteroide, etc.

Por lo tanto, en un caso específico en el que se desea reducir o inhibir la infección resultante de una unión mediada por la bacteria de la bacteria a una célula huésped, o de un anticuerpo a ésta, o de un ligando de la misma o de un anticuerpo a este ligando, el polipéptido se introduce para bloquear la interacción de la bacteria con la célula huésped.

Asimismo en la presente memoria se describe la administración pulmonar de un inhibidor del polipéptido de la presente invención que actúa como agente inhibidor de adhesina (o derivados del mismo). El agente inhibidor de adhesina (o el derivado) se administra a los pulmones de un mamífero, en los que puede interferir con bacterias, es decir, estreptococos, y preferentemente estreptococos del Grupo B que se unen a células huésped. Otros artículos de la preparación de proteínas para la administración pulmonar se encuentran en la técnica [Adjei et al. (1990) Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al. (1990) Internacional Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (acetato de leuprolida); Braquet et al. (1989), Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(supl. 5):143-146 (endotelina-1); Hubbard et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, págs. 206-212 (\alpha1-antitripsina); Smith et al. (1989) J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (\alpha-1-proteinasa); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzo, (1990) (hormona de crecimiento humano recombinante); Debs et al. (1988) J. Immunol. 140:3482-3488 (interferón-\gamma y factor alfa de la necrosis tumoral); Platz et al., patente US nº 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos)]. Un procedimiento y una composición para la administración pulmonar de fármacos se describe en la patente US nº 5.451.569, publicada el 19 de septiembre de 1995 concedida a Wong et al.

Todos los dispositivos citados requieren la utilización de formulaciones adecuadas para la administración del agente (o derivado) inhibidor de adhesina. Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede conllevar la utilización de un material propulsor adecuado, además de los diluyentes, adyuvante y/o portadores habituales útiles en la terapia. Asimismo, la utilización de liposomas, microcápsulas o microesferas, la inclusión de complejos, o de otros tipos de portadores se contempla. El agente inhibidor de adhesina químicamente modificado puede prepararse también en diferentes formulaciones dependiendo del tipo de modificación química o del tipo de dispositivo empleado.

Las formulaciones adecuadas para su utilización con un nebulizador, ya sea de chorro a presión o ultrasónico, comprenderán típicamente el agente (o derivado) inhibidor de adhesina disuelto en agua a una concentración de entre aproximadamente 0,1 y 25 mg del agente inhibidor de adhesina biológicamente activo por ml de solución. La formulación puede incluir también un tampón y un azúcar sencillo (p. ej., para la estabilización del agente inhibidor de adhesina y regulación de la presión osmótica). La formulación del nebulizador puede contener también un tensioactivo, para reducir o prevenir la agregación producida por la superficie del agente inhibidor de adhesina producida por atomización de la solución en la formación del aerosol.

Las formulaciones para su utilización con un dispositivo inhalador dosificador comprenderán generalmente un polvo finamente dividido que contiene el agente (o derivado) inhibidor de adhesina en suspensión en un propulsor con ayuda de un tensioactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como un clorofluorocarbonado, un hidroclorofluorocarbonado, un hidrofluorocarbonado o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen el trioleato de sorbitán y la lecitina de soja. El ácido oleico puede también ser útil como tensioactivo.

Las formulaciones líquidas de aerosol contienen agente inhibidor de adhesina y un agente dispersante en un diluyente fisiológicamente aceptable. Las formulaciones de aerosol en polvo seco están constituidas por una forma sólida finamente dividida de agente inhibidor de adhesina y agente dispersante. Ya sea con el líquido o con la formulación de aerosol en polvo seco, la formulación debe ser aerosolizada. Es decir, puede ser descompuesta en partículas líquidas o sólidas a fin de asegurar que la dosis aerosolizada alcanza realmente las membranas de la mucosa de las fosas nasales o del pulmón. La expresión "partícula de aerosol" se utiliza en la presente memoria para describir la partícula líquida o sólida adecuada para la administración nasal o pulmonar, es decir, que alcance las membranas mucosas. Otras consideraciones, tal como la construcción del dispositivo de administración, los componentes adicionales en la formulación y las características de la partícula son importantes. Estos aspectos de la administración pulmonar de un fármaco son bien conocidos en la materia, y la manipulación de las formulaciones, los procedimientos de aerosolización y la construcción de un dispositivo de administración requieren como máximo la experimentación de rutina por cualquier experto en la materia. En un ejemplo específico, el diámetro dinámico másico medio será de 5 micrómetros o menos con el fin de asegurar que las partículas de fármaco alcanzan los alvéolos pulmonares [Wearley, L. L. (1991) Crit. Rev. In Ther. Drug Carrier Systems 8:333].

Los sistemas de administración del aerosol, tales como el inhalador dosificador presurizado y el inhalador de polvo seco se dan a conocer en Newman, S. P., Aerosols and the Lung, Clarke, S. W. y Davia, D. editores, págs. 197-22 y pueden utilizarse a propósito de la presente invención.

Como se expuso con detalle anteriormente, una formulación de aerosol puede influir otros ingredientes terapéutica o farmacológicamente activos además del agente inhibidor de adhesina, tales como, pero sin limitarse un antibiótico, un esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.

Formulaciones líquidas de aerosol. Asimismo se describen formulaciones y formas farmacéuticas de aerosol para su utilización en el tratamiento de pacientes que padecen enfermedades bacterianas, p. ej., por estreptococos, particularmente por infección por estreptococos. En general dichas formas farmacéuticas contienen agente inhibidor de adhesina en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a agua esterilizada, solución salina, solución salina tamponada, solución de dextrosa y similares. Un diluyente que puede utilizarse es la solución salina tamponada con fosfato, o una solución salina tamponada comprendida generalmente en el intervalo de pH entre 7,0 y 8,0, o agua.

La formulación líquida de aerosol puede incluir, como ingredientes opcionales, portadores, agentes de solubilización o emulsión, tensioactivos y excipientes farmacéuticamente aceptables. La formulación puede incluir un portador. El portador es una macromolécula que es soluble en el sistema circulatorio y que es fisiológicamente aceptable en el que aceptación fisiológica significa que los expertos en la materia aceptarían la inyección de dicho portador en un paciente como parte de un régimen terapéutico. El portador preferentemente es relativamente estable en el sistema circulatorio con una vida media en el plasma aceptable para su eliminación. Dichas macromoléculas pueden incluir lecitina de soja, ácido oleico y trioleato de sorbitán, siendo preferido el trioleato de sorbitán.

Las formulaciones pueden incluir también otros agentes útiles para el mantenimiento del pH, la estabilización de la solución o para la regulación de la presión osmótica. Ejemplos de los agentes pueden incluir sales, tales como cloruro sódico o cloruro de potasio y carbohidratos, tales como glucosa, galactosa o manosa y similares.

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También se describen formulaciones líquidas de aerosol que comprenden el agente inhibidor de adhesina y otro fármaco terapéuticamente eficaz, tal como un antibiótico, un esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.

Formulaciones de aerosol en polvo seco. La presente formulación de aerosol puede prepararse como una formulación en polvo seco que comprende una forma en polvo finamente dividido del agente inhibidor de adhesina y un dispersante.

Las formulaciones para administrar desde un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene agente (o derivado) inhibidor de adhesina y pueden incluir también un agente de relleno, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, p. ej., 50 a 90% en peso de la formulación. El agente (o derivado) inhibidor de adhesina debería prepararse de la manera más ventajosa en forma de partículas con un tamaño medio de partícula inferior a 10 mm (o micras), lo más preferentemente entre 0,5 y 5 mm, para la administración más eficaz al pulmón distal. En otro ejemplo, la formulación en polvo seco puede comprender un polvo seco finamente dividido que contiene agente inhibidor de adhesina, un agente dispersante y un agente de relleno. Los agentes de relleno útiles en unión con la presente formulación incluyen agentes tales como lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol, en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo.

Se describen además formulaciones en polvo seco que comprende en agente inhibidor de adhesina y otro fármaco terapéuticamente eficaz, tal como un antibiótico, un esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.

Se describen también formas farmacéuticas orales sólidas, que están descritas generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) en el capítulo 89. Las formas farmacéuticas sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, tabletas o pastillas, sellos o bolitas. Asimismo, puede utilizarse la encapsulación liposómica o proteinoide para formular las composiciones (como, por ejemplo, microesferas proteinoides descritas en la patente US nº 4.925.673). Puede utilizarse la encapsulación liposómica y los liposomas pueden modificarse con varios polímeros (p. ej., patente US nº 5.013.556). Una descripción de las posibles formas farmacéuticas sólidas para utilización terapéutica se dan en Marshall, K. en: Modern Pharmaceutics editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes capítulo 10, 1979.

En general, la formulación incluirá el componente o componentes (o formas químicamente modificadas del mismo) e ingredientes inertes que permiten la protección contra el medio estomacal, y la liberación del material biológicamente activo en el intestino.

También se describen formas farmacéuticas orales del componente o componentes modificados anteriormente. El componente o componentes pueden modificarse químicamente de modo que la administración oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificación química consiste en la fijación de por lo menos un grupo a la propia molécula del componente, en la que dicho grupo permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la absorción en el torrente sanguíneo procedente del estómago o del intestino. Asimismo se desea el aumento de la estabilidad general del componente o componentes y el aumento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Ejemplos de dichos grupos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski y Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Abducts" en: Enzymes as Drugs, Hocenberg y Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nueva York, NY, págs. 367-383; Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189. Otros polímeros que podrían utilizarse son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Los preferidos para su utilización farmacéutica, como se indicó anteriormente, son los grupos de polietilenglicol.

Para el componente (o derivado) la posición de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (duodeno, yeyuno o íleon) o el intestino grueso. Un experto en la materia tiene formulaciones disponibles que no se disolverán en el estómago, aunque liberarán el material en el duodeno o en cualquier parte en el intestino. Preferentemente, la liberación impedirá los efectos perjudiciales del medio estomacal, ya sea por protección de la proteína (o derivado) o por liberación del material biológicamente activo más allá del medio estomacal, tal como en los intestinos.

Para asegurar la resistencia gástrica completa es esencial un recubrimiento impermeable hasta por lo menos pH 5,0. Ejemplos de los ingredientes inertes más frecuentes que se utilizan como recubrimientos entéricos son el acetato trimelitato de celulosa (CAT), el ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, acetato ftalato de polivinilo (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, acetato ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y goma laca. Estos recubrimientos pueden utilizarse como películas mezcladas.

Puede utilizarse también un recubrimiento o mezcla de recubrimientos en comprimidos, que no está destinado para la protección del estómago. Éste puede incluir recubrimientos de azúcar o recubrimientos que facilitan la ingestión del comprimido. Las cápsulas pueden estar constituidas por una cubierta dura (tal como gelatina) para la administración de producto terapéutico seco, es decir en polvo; para las formas líquidas, puede utilizarse una cubierta blanda de gelatina. El material de la cubierta de los sellos podría ser almidón espeso u otro papel comestible. Para las píldoras, pastillas, comprimidos moldeados o triturados de comprimidos, pueden utilizarse técnicas de amasado en húmedo.

El péptido terapéutico puede estar incluido en la formulación en forma de multipartículas finas en forma de gránulos o bolitas de tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración de cápsulas podría también ser en forma de polvo, torundas ligeramente comprimidas o incluso como comprimidos. El producto terapéutico podría prepararse por compresión. Pueden incluirse todos los colorantes y agentes saborizantes. Por ejemplo, la proteína (o derivado) puede formularse (tal como mediante liposomas o encapsulación en microesferas) y además contenido dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene colorantes y agentes saborizantes.

Se puede diluir o aumentar el volumen del producto terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextrano modificado y almidón. Determinadas sales inorgánicas pueden también utilizarse como cargas incluyendo el trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro sódico. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Pueden incluirse disgregadores en la formulación del producto terapéutico en forma farmacéutica sólida. Los materiales utilizados como disgregadores incluyen pero no se limitan a almidón, incluyendo el disgregador comercial a base de almidón, Explotab. Pueden utilizarse almidón glucolato sódico, Amberlite, carboximetilcelulosa sódica, ultramilopectina, alginato sódico, gelatina, cáscara de naranja, carboximetilcelulosa ácida, esponja natural y bentonita. Otra forma de disgregadores son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Pueden utilizarse gomas en polvo como disgregadores y como aglutinantes y éstas pueden incluir gomas en polvo tal como agar-agar, Karaya o tragacanto. Son también útiles como disgregadores el ácido algínico y su sal sódica. Pueden utilizarse aglutinantes para mantener el agente terapéutico unido para formar un comprimido duro e incluir materiales de productos naturales tales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Pueden utilizarse tanto la polivinilpirrolidona (PVP) como la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el agente terapéutico.

Puede incluirse un agente contra la fricción en la formulación del agente terapéutico para prevenir la adherencia durante el proceso de formulación. Pueden utilizarse lubricantes como una capa entre el agente terapéutico y la pared del molde, y éstos pueden incluir pero no se limitan a; ácido esteárico incluyendo sus sales de magnesio y de calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Pueden utilizarse también lubricantes solubles tales como laurilsulfato sódico, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de varios pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Pueden añadirse fluidificantes que pueden mejorar las propiedades del fluido del fármaco durante la formulación y para ayudar a la redistribución durante la compresión. Los fluidificantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirógena y silicoaluminato hidratado.

Para ayudar a la disolución del agente terapéutico en el medio acuoso puede añadirse un tensioactivo como agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como laurilsulfato sódico, sulfosuccinato de dioctil sodio y sulfonato de dioctil sodio. Pueden utilizarse detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetomio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían incluirse en la formulación como tensioactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de sacarosa y ácido graso, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos podían estar presentes en la formulación de la proteína o derivado bien solos o como mezcla en diferentes proporciones.

Los aditivos que aumentan potencialmente la absorción del polipéptido (o derivado) son por ejemplo los ácidos grasos, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

Administración pulmonar. En la presente memoria se describe también la administración pulmonar del presente polipéptido (o de los derivados del mismo). El polipéptido (o derivado) se administra a los pulmones de un mamífero mientras que se inhala y se recubre la superficie de la mucosa de los alvéolos. Otros artículos al respecto incluyen Adjei et al. (1990) Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al. (1990) Internacional Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (acetato de leuprolida); Braquet et al. (1989), Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (supl. 5):143-146 (endotelina-1); Hubbard et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, págs. 206-212 (\alpha1-antitripsina); Smith et al. (1989) J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (\alpha-1-proteinasa); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzo, (1990) (hormona de crecimiento humano recombinante); Debs et al. (1988) J. Immunol. 140:3482-3488 (interferón-g y factor alfa de la necrosis tumoral); Platz et al., patente US nº 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos)]. Un procedimiento y una composición para la administración pulmonar de fármacos para efecto generalizado se describe en la patente US nº 5.451.569, publicada el 19 de septiembre de 1995 concedida a Wong et al.

Para su utilización se contempla una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo pero sin limitarse a nebulizadores, inhaladores dosificadores de dosis e inhaladores de polvo, todos los cuales son conocidos por los expertos en la materia.

Las formulaciones adecuadas para su utilización con un nebulizador, ya sea de chorro a presión o ultrasónico, comprenderán típicamente el polipéptido (o derivado) disuelto en agua a una concentración entre aproximadamente 0,1 y 25 mg de la proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede incluir también un tampón y un azúcar sencillo (p. ej., para la estabilización de la proteína y regulación de la presión osmótica). La formulación del nebulizador puede contener también un tensioactivo, para reducir o prevenir la agregación producida por la superficie de la proteína producida por atomización de la solución en la formación del aerosol.

Las formulaciones para su utilización con un dispositivo inhalador dosificador comprenderán generalmente un polvo finamente dividido que contiene el polipéptido (o derivado) en suspensión en un propulsor con ayuda de un tensioactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen el trioleato de sorbitán y la lecitina de soja. El ácido oleico puede también ser útil como tensioactivo.

Las formulaciones para administrar desde un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene polipéptido (o derivado) y pueden incluir también un agente de relleno, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, p. ej., 50 a 90% en peso de la formulación. La proteína (o derivado) debería prepararse de la manera más ventajosa en forma de partículas con un tamaño medio de partícula inferior a 10 mm (o micras), lo más preferentemente entre 0,5 y 5 mm, para la administración más eficaz al pulmón distal.

Administración nasal. Se describe también la administración nasal o nasofaríngea del polipéptido (o derivado). La administración nasal permite el paso del polipéptido directamente sobre la mucosa del aparato respiratorio superior después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin necesidad de deposición del producto en los pulmones. Las formulaciones para administración nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano.

Las composiciones terapéuticas que contienen polipéptido, análogo o fragmento activo se administran de forma convencional por vía intravenosa, tal como por ejemplo, por inyección de una dosis unitaria. La expresión "dosis unitaria" cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para seres humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el diluyente requerido; es decir, el portador o vehículo.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de la dosificación y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que debe administrarse depende del paciente que debe tratarse, de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para utilizar el ingrediente activo y del grado de inhibición o neutralización de la capacidad de fijación deseada. Las cantidades exactas de ingrediente activo requeridas que deben administrarse dependen del criterio del médico de cabecera y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, las dosis adecuadas pueden estar comprendidas entre aproximadamente 0,1 y 20, preferentemente entre 0,5 y aproximadamente 10, y más preferentemente uno a varios, miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo al día y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas mediante una inyección u otra administración posteriores. Alternativamente, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones de diez nanomolar a diez micromolar en la sangre.

La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a los siguientes Ejemplos no limitativos, que se proporcionan a título de ejemplo de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente las formas de realización preferidas de la invención y no deberían considerarse en modo alguno, sin embargo, como limitativos del amplio alcance de la invención.

Ejemplo 1 Identificación de los genes de estreptococo del grupo B

Comparando la composición genética y fenotípica de los grupos relacionados genéticamente de una especie bacteriana se facilita la identificación de factores de virulencia presentes en la mayoría de los grupos patógenos. El GBS de tipo III puede subdividirse en tres grupos de cepas relacionadas basadas en el análisis de los modelos del digesto de restricción (RDP) producidos por la digestión del ADN cromosómico con Hind III y Sse 8387 (5, 6). Más del 90% de la enfermedad por GBS de tipo III invasiva en recién nacidos en Japón y en Salt Lake City es producida por bacterias de uno de los tres tipos de RDP, denominados RDP de tipo III-3, mientras que RDP de tipo III-2 es significativamente más probable que se aíslen de la vagina que de la sangre o de CSF (6). Estos resultados sugieren que este grupo de GBS de tipo III-3 genéticamente relacionado son más virulentos que las cepas III-2 y podían ser responsables de la mayoría de la enfermedad de tipo III invasiva en conjunto. Los autores proponen que los factores bacterianos que contribuyen al aumento de la virulencia de las cepas III-3 pueden identificarse caracterizando las diferencias entre la composición genética de las cepas III-3 y III-2. Dichas diferencias genéticas se encontrarán en los cromosomas bacterianos ya que estas cepas no contienen plásmidos (6).

Para identificar los genes presentes en las cepas de GBS de tipo III-3 virulentas y no en las cepas de tipo III-2 no virulentas los autores utilizaron una modificación de la técnica descrita por Lisitsyn et al. (7). El ADN genómico de alto peso molecular procedente de una cepa de GBS de tipo III-3 de RDP invasivo (cepa 874391) y una cepa de tipo III-2 de RDP colonizador ("no virulenta") (cepa 865043) se preparó por lisis celular con mutanolisina y digestión con proteinasa K (5). Para la sustracción genética, se digirió el ADN genómico de ambas cepas con Taq I. El ADN digerido con Taq I procedente de la cepa virulenta se mezcló con dos oligonucleótidos complementarios (TaqA (5'-CTAGGTGGATCCTTCGGCAAT-3' (SEC. ID. nº: 11)) y TaqB (5'-CGATTGCCGA-3' (SEC. ID. nº: 12)), se calentó a 50ºC durante 5 minutos, a continuación se dejó enfriar lentamente a 16ºC en tampón de T4 ligasa. Se ligaron los oligonucleótidos al ADN de la cepa virulenta por incubación con 20 unidades de T4 ligasa a 16ºC durante 12 horas. Tras la ligadura, 500 ng de ADN de la cepa virulenta, con enlazadores ligados, y 40 \mug de ADN de la cepa no virulenta, sin enlazadores, se mezclaron, se desnaturalizaron por calentamiento y se hibridaron a 68ºC durante 20 horas.

El diez por ciento de la mezcla de hibridación resultante se incubó con Taq ADN polimerasa y los dNTP para completar los extremos del ADN de la cepa virulenta hibridada. El ADN hibridado se amplió mediante Taq ADN polimerasa durante 10 ciclos utilizando el TaqA oligonucleótido como cebador de ampliación transcrito y complementario. Después de la ampliación, los productos monocatenarios que permanecen tras la ampliación se digirieron con nucleasa de la alubia mung. El veinte por ciento del producto resultante se volvió a ampliar a continuación durante 20 ciclos. Este procedimiento de sustracción seguido de ampliación por PCR produce un aumento de la ampliación de los segmentos de ADN de las cepas III-3 que no se hibridan con los segmentos de ADN procedentes de las cepas III-2.

Se realizaron un total de cuatro ciclos de sustracción y ampliación, utilizando sucesivamente pequeñas cantidades de productos de PCR específicos para III-3 y alternando dos series de adaptadores (TaqA/B (SEC. ID. nº: 11 y nº: 12, respectivamente) y TaqE/F (TaqE (5'-AGGCAACTGTGCTAACCGAGGGAAT-3' (SEC. ID. nº: 13)); y TaqF (5'-CGATTCCCTCG-3') (SEC. ID. nº: 14)). Los productos de la ampliación final se ligaron en vectores PBS KS+. Se seleccionaron al azar trece clones para análisis. Se utilizaron estas sondas en experimentos de transferencia de huellas y manchas para determinar si la sustracción tuvo éxito y para identificar las sondas que se hibridan con todas las cepas III-3. Cada una de las 6 sondas únicas se hibridó con la cepa virulenta III-3 paterna, mientras que ninguna de las sondas se hibridó con las cepas III-2 no virulentas. Dos de las etiquetas de la secuencia ampliada (clones DY1-1 y DY1-11) se hibridaron con el ADN genómico de las 62 cepas de tipo III, pero no se hibridaron con el ADN preparado a partir de las cepas III-2 y III-1 (Figura 1). Para obtener información de la secuencia adicional, los autores construyeron un banco genómico GBS III-3. Las múltiples placas que se hibridan con cada una de las sondas específicas para III-3 GBS se han purificado para la caracterización adicional.

Resultados Locus spb

Se identificaron tres clones genómicos solapantes que se hibridan con la sonda DY1-1. Se subclonó y se secuenció un fragmento Sal I-Bgl II de 6,4 kb presente en cada clon. Este ADN genómico está presente en todas las cepas de tipo III-3 de RDP pero no en las cepas de serotipo III-2, III-1 o de otros serotipos de GBS.

Más del 90% de este fragmento de ADN genómico se ha secuenciado y se ha descubierto que contiene 5 marcos de lectura abiertos (ORF). Dos ORF parecen ser candidatos para genes virulentos. spb 1 es un ORF de 1509 bp. La proteína prevista (502 aminoácidos y Mr 53.446) tiene las características de una proteína unida a la membrana celular. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos previstas de sbp I se proporcionan en las SEC. ID. nº: 15 y nº: 16, respectivamente. El terminal N de la proteína prevista es un tramo básico, hidrófilo de 6 aminoácidos seguido de un núcleo rico en prolina, hidrófobo de 23 aminoácidos, consistente en un péptido señal. La proteína madura hidrófila termina en un dominio LPXTG (SEC. ID. nº: 17) típico que precede inmediatamente a un núcleo hidrófobo de 20 aminoácidos y un terminal hidrófilo básico corto. La secuencia de nucleótidos no es homóloga a las secuencias de otros genes bacterianos conocidos. La secuencia de aminoácidos traducida, sin embargo, comparte homología de segmentos con un número de proteínas caracterizadas, incluyendo la proteína tipo 2 de la franja de Actinomyces naeslundii (27% de identidad en 350 aminoácidos) y la proteína de tipo I de la franja de Actinomyces viscosus (25% de homología en 420 aminoácidos) (16), la proteína superficial T6 de S. pyogenes (23% de identidad en 359 aminoácidos) (20), y la hsf (27% de identidad en 260 aminoácidos) y las adhesinas de HMW1 (25% de identidad en 285 aminoácidos) de Haemophilus influenzae (21, 22). La función de la proteína T6 de S. pyogenes es desconocida. Cada uno de los demás homólogos desempeña una función en la adherencia y/o invasión bacteriana.

Se creó una cepa de GBS mutante con deleción isógona spb 1^{-} por recombinación homóloga (utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 a continuación) y se determinó la capacidad del mutante spb 1^{-} para adherirse a las células epiteliales respiratorias A549 e invadirlas. En comparación con la cepa natural, el número de bacterias spb 1^{-} adherentes a las monocapas de A549 se redujo el 60,0% (p<0,01) y el número de bacterias intracelulares invasoras se redujo el 53,6% (p<0,01). Estos datos sugieren que spb1 puede contribuir a la patogénesis de la neumonía por GBS y a la entrada de bacterias en el torrente sanguíneo.

El segundo ORF, spb2, termina 37 bp corriente arriba del spb1 y está en la misma orientación de la transcripción. Este ORF de 1692 bp tiene una secuencia de aminoácidos deducida de 579 restos y Mr 64.492. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos previstas de sbp2 se proporcionan en las SEC. ID. nº: 18 y nº: 19, respectivamente. spb2 comparte el 50,5% de identidad de ácido nucleico y el 20,7% de la identidad de aminoácidos con spb1. La conservación es mayor en las zonas del terminal carboxi, incluyendo un motivo LPSTGG (SEC. ID. nº: 20) compartido. En contraste con spb1, spb2 no presenta una secuencia con señal obvia. Su secreción puede estar mediada por las secuencias de reconocimiento del terminal carboxi o por péptidos accesorios (23). La secuencia de aminoácidos deducida de Spb2 es también homóloga con las proteínas T6 de S. pyogenes y de Actinomyces naeslundii, y con internalina A de Listeria monocytogenes (22% de identidad en 308 aminoácidos); de nuevo, las proteínas son importantes en la adherencia y la invasión (24).

Locus ema

Se identificaron dos clones genómicos que se hibridan con la sonda DY1-11. Se subclonó y secuenció un fragmento Hind III de 7 kb presente en cada clon. A diferencia de las secuencias spb específicas para el serotipo III, este ADN genómico, que es adyacente a una zona del ADN específico para el serotipo III-3, se descubrió que estaba presente en todas los GBS probados hasta la fecha, incluyendo las cepas de serotipo Ia, Ib, II y V. Esta zona del cromosoma de GBS, de la cual los autores han diseñado el locus de adhesina de la matriz extracelular (ema), contiene 5 ORF significativos.

emaA

El primer ORF, emaA, tiene una longitud de 738 bp, con un producto proteico previsto de 246 aminoácidos y Mr 26,2. La secuencia de ácido nucleico (SEC. ID. nº: 1) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 2) de emaA se presentan en la Figura 2. La proteína EmaA es una proteína no repetitiva. El terminal N de 27 aminoácidos de la proteína prevista es coherente con un péptido señal. La proteína madura tiene un dominio imperfecto que se une a la pared celular (XPXTGG (SEC. ID. nº: 21)) seguido de un dominio que se extiende a través de la transmembrana que abarca los restos 219 a 235 y una cola hidrófila terminal. La secuencia nucleotídica emaA no es homóloga a las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La secuencia de aminoácidos traducida, sin embargo, comparte homología de segmentos con numerosas proteínas caracterizadas, incluyendo la adhesina del colágeno, Bbp, de Staphylococcus aureus (identidad del 37% en 103 aa) (15), una subunidad estructural de la franja de tipo 2 de Actinomyces naeslandii (39% de homología en 112 aa) (16), y la proteína FimP de Actinomyces viscosus (28% de homología en 228 aa) (17). La función de la proteína T6 de S. pyogenes es desconocida. Las franjas de tipo 1 y tipo 2 de Actinomyces median la adherencia bacteriana a las glucoproteínas salivares y a varias células huésped, contribuyendo a la patogénesis de la caries dental.

emaB

El segundo ORF, emaB, empieza 94 bp 3' de emaA y está en la misma orientación de la transcripción. La secuencia de ácido nucleico (SEC. ID. nº: 3) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 4) de emaB se presentan en la Figura 3. Tiene una longitud de 924 bp; con un producto de la proteína previsto de 308 aminoácidos y Mr de 33,9. La proteína EmaB es una proteína no repetitiva. El terminal N de 27 aminoácidos de la proteína prevista es consecuencia de un péptido señal. La proteína madura tiene un dominio imperfecto que se une a la pared celular (XPXTG) seguido de un dominio que se extiende a través de la transmembrana que comprende los restos 279 a 294. La secuencia nucleotídica emaB no es homóloga a las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La secuencia de aminoácidos traducida, sin embargo, comparte homología de segmentos con numerosas proteínas caracterizadas, incluyendo la subunidad estructural de las franjas de tipo 2 de Actinomices naeslandii (28% de homología en 222 aminoácidos), la proteína T6 de S. pyogenes (26% de homología en 266 aminoácidos) (20) y una supuesta adhesina de la superficie celular de S. epidermidis (24% de identidad en 197 aminoácidos). La primera de estas proteínas media en la adherencia de S. aureus al colágeno y se supone que contribuye a la patogénesis de la osteomielitis y la artritis infecciosa.

emaC

El tercer ORF, emaC, empieza 2 bp 3' de EmaB y está en la misma orientación de la transcripción. Tiene una longitud de 918 bp; con un producto de la proteína previsto de 305 aminoácidos y Mr de 34,5. La secuencia del ácido nucleico (SEC. ID. nº: 5) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 6) de emaC se representan en la Figura 4. La proteína EmaC es una proteína no repetitiva. El terminal N de 30 aminoácidos de la proteína prevista es consecuencia de un péptido señal. La proteína madura tiene un dominio que se extiende a través de la transmembrana que comprende los restos 265 a 281 y una cola hidrófila terminal. La secuencia nucleotídica de emaC no es homóloga a las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La secuencia de aminoácidos traducida, sin embargo, comparte homología de segmentos con numerosas proteínas caracterizadas, incluyendo las proteínas asociadas al montaje de la subunidad estructural de la franja de tipo 2 de Actinomyces naeslandii (38% de homología en 234 aminoácidos) (16). Estas proteínas se necesitan para el montaje de las franjas de tipo 2.

emaD

El cuarto ORF, emaD, tiene una longitud de 852 bp, solapa a emaC mediante 47 bp, y está en la misma orientación de la transcripción. El producto proteico previsto es de 284 aminoácidos y Mr 33,1. La secuencia de ácido nucleico (SEC. ID. nº: 7) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 8) de emaD se presentan en la Figura 5. La secuencia señal N-terminal no identificable está presente y los potenciales segmentos transmembranarios están presentes en las posiciones 19 a 35 y 252 a 280. La proteína madura no es repetitiva y carece de un dominio de unión a la pared celular. La secuencia nucleotídica de emaD no es homóloga con las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La secuencia de aminoácidos traducida, comparte homología del segmento con las mismas proteínas asociadas a las franjas de Actinomyces como lo hace EmaC.

emaE

El quinto ORF, emaC, empieza 42 bp 3' de EmaB y está en la misma orientación de la transcripción. Tiene una longitud de 2.712 bp; con un producto de la proteína previsto de 904 aminoácidos y Mr de 100,9. La Figura 6 representa la secuencia del ácido nucleico (SEC. ID. nº: 9) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 10) de emaE. La proteína EmaE prevista es una proteína no repetitiva. Un péptido señal obvio del terminal N no es evidente pero una supuesta zona transmembranaria está situada en los restos 24 a 40. La proteína madura tiene un dominio de unión a la pared celular imperfecto (XPXTGG (SEC. ID. nº: 21)) seguido de un dominio que comprende transmembrana que comprende los restos 880 a 896. La secuencia de nucleótidos emaE no es homóloga con las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La secuencia de aminoácidos traducida, sin embargo, comparte homología de segmentos con numerosas proteínas caracterizadas, incluyendo las proteínas de unión a la fibronectina F1 y F2 de S. pyogenes (31% de homología en 207 aminoácidos) (18, 19). Estas proteínas median la unión por alta afinidad a la fibronectina, y son importantes en la adherencia de S. pyogenes a las células respiratorias.

La similitud de los productos proteicos del locus ema a adhesinas e invasinas fisiológicamente importantes de otras especies bacterianas sugiere que las proteínas Ema desempeñan una función facilitando la adherencia de GBS a los componentes de la matriz extracelular y a las superficies celulares y la invasión posterior de células epiteliales y endoteliales, las etapas iniciales en la patogénesis de la infección.

Varias líneas de prueba sugieren que los miembros del locus ema y del spb pueden tener funciones similares, pero es probable que representen distintas clases de proteínas. Los genes del locus ema y spb son cada uno y todos similares a las adhesiones e invasiones fisiológicamente importantes de las especies bacterianas, sin embargo, tanto Spb1 como Spb2 tienen dominios prototípicos de unión a la pared celular gram positivos, mientras que los miembros del locus ema tienen un motivo infrecuente, lo que sugiere un mecanismo distinto del anclaje en la superficie celular. En segundo lugar el locus spb está restringido a las cepas de serotipo III-3 virulento de GBS, mientras que el locus ema parece estar omnipresente en todos los serotipos de GBS. En tercer lugar spb1 y spb2 son más homólogos entre sí que los miembros del locus ema y los genes ema son más estrechamente homólogos entre sí que con spb1 y spb2.

Ejemplo 2 Caracterización biológica de nuevos genes de GBS Cepas bacterias mutantes isógenas

Para identificar la actividad biológica de estos nuevos genes de GBS, se crean cepas bacterianas mutantes isógenas que son idénticas desde todos los puntos de vista excepto por la presencia o ausencia de un gen específico. Los mutantes con deleción se crean por sustitución alélica. El gen relevante, con 100 a 300 bp de secuencias de flanqueo, se subclona y modifica mediante la deleción de un fragmento intragénico de la secuencia de codificación y, en algunos casos, la inserción de un gen con resistencia a la kanamicina. El gen mutante se clona en el vector pHY304 suicida (proporcionado gentilmente por el Dr. Craig Rubens), un plásmido huésped de amplio espectro que contiene un gen ori sensible a la temperatura, con resistencia a la eritromicina (erm^{TS}), y un punto de clonación múltiple pBS. El vector pHY304 es un derivado del vector pWV01 (Framson, P. E. et al. (1997) Applied Environ Microbiology 63:3539-3547). Los plásmidos que contienen genes mutantes se electroporan en la cepa 874391 y se seleccionan mutantes con entrecruzamiento único por resistencia antibiótica a 37ºC. Las colonias resistentes al antibiótico resultantes se someten a un cambio de temperatura a 30ºC. La integración del plásmido es inestable a esta temperatura permisiva debido a que existen dos ori funcionales en el cromosoma. El plásmido escindido se elimina por cultivo en un medio no selectivo para muchas generaciones, a continuación se criba la presencia del alelo mutante en las colonias por sensibilidad a la eritromicina. Los mutantes con doble entrecruzamiento son estables y no requieren mantenimiento en la selección del fármaco. El genotipo mutante se confirma por transferencia Southern o demostrando por PCR la deleción apropiada. Se criba la presencia de la expresión génica en los mutantes resultantes por análisis de transferencia Northern y Western. El fenotipo de los mutantes modificados genómico se compara a continuación con el de la cepa 874391 natural examinando la velocidad de crecimiento y la morfología de la colonia, y la expresión de \beta-hemolisina y el factor CAMP. Se evalúa la expresión de la proteína superficial por transferencia Western, utilizando sueros policlonales de conejos inmunizados con GBS de tipo III completo, destruido térmicamente.

Modelos in vitro A. Adherencia

La adherencia de GBS a las células huésped es un requisito previo para la enfermedad invasiva. Tres tipos de células diferentes presentan el potencial para ser importantes en este proceso: i) la adherencia a las células epiteliales respiratorias es probable que facilite el infecciones neonatales de comienzo más precoz, ii) la adherencia a las células epiteliales gastrointestinales se ha supuesto que es importante en la patogénesis de las infecciones neonatales de comienzo tardío, y iii) la adherencia a las células endoteliales es necesaria tanto para la endocarditis como para otras infecciones endovasculares, y es probable que sea el episodio inicial en la meningitis por GBS. La capacidad de las cepas naturales y mutantes para adherirse a las células epiteliales y endoteliales se compara en los ensayos de adherencia.

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Se utilizan cuatro estirpes celulares diferentes para investigar la función de los nuevos genes de GBS en la adherencia. Los GBS se adhieren a las células de carcinoma epitelial alveolar humano A549 y las invaden y las proteínas superficiales parecen desempeñar una función importante en este proceso (8). La unión de GBS a las células A549 se utiliza como modelo para la colonización respiratoria in vitro. GBS también se adhiere a C2BBeL, una estirpe celular epitelial intestinal humana, que se utiliza como modelo para la colonización gastrointestinal, y a las células HeLa epiteliales cervicales, un modelo para la colonización genital y la infección maternal. Para la adherencia endotelial, se estudian dos líneas celulares: células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVE) recién aisladas; y una estirpe celular endotelial microvascular del cerebro (BMEC) humana inmortalizada. Los ensayos de adherencia se realizan como describe Tamura et al. (9). Las líneas celulares se cultivan hasta confluencia en placas de cultivo tisular de 96 pocillos en los medios recomendados. Se lavan las monocapas con PBS y se fijan con gluteraldehído al 0,5%. Después del bloqueo con BSA al 5% en PBS, se inoculan las células con varios inóculos de GBS, se centrifugan durante 10 minutos a 2.000 rpm y se incuban durante 1 hora a 4ºC. Las bacterias no adherentes se eliminan lavando tres veces con leche en polvo descremada al 5% en PBS y las bacterias unidas se eluyen a continuación y se siembran en placas cuantitativamente.

B. Invasión

Las GBS se adhieren al epitelio respiratorio, al endotelio y a BMEC y los invaden (8, 10, 11). Se determina la capacidad de las cepas de GBS naturales y mutantes isógenas para invadir tanto las células epiteliales como las endoteliales como se describió anteriormente (8, 10, 11). Los ensayos que distinguen la capacidad de GBS para invadir las células eucarióticas frente a adherirse a las células capitalizan la inestabilidad de la penicilina y la gentamicina para introducirse en las células huésped, lo que permite la cuantificación de las bacterias intracelulares una vez destruidas las bacterias extracelulares. Se cultivan GBS hasta la fase de crecimiento deseada en caldo de cultivo TH, se lavan dos veces con PBS y se vuelven a poner en suspensión en medio de cultivo tisular que contiene suero de ternero fetal al 10%. Monocapas de cultivo tisular cultivadas hasta confluencia en placas de 24 pocillos se inoculan con inóculos variables de GBS, se centrifugan a 800 \times g y se incuban a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 2 a 6 horas. Se eliminan las bacterias extracelulares lavando cuatro veces con PBS. Las células se incuban a continuación en medio reciente con 5 mg/ml de penicilina y 100 mg/ml de gentamicina durante 2 horas. Los medios se eliminan a continuación, se lavan las monocapas y se lisan las células por tratamiento con Triton X-100 al 0,025%. Los lisados celulares se tratan con ultrasonidos para destruir las cadenas bacterianas y se colocan alícuotas en placas cuantitativamente.

C. Anticuerpo contra proteínas de GBS

Se prueba la capacidad del anticuerpo específico contra las nuevas proteínas de GBS para facilitar la destrucción opsonofagocítica de GBS (12). Se inmunizan conejos con proteínas GBS recombinantes o purificadas producidas por técnicas normalizadas. El antisuero de conejo de diferentes diluciones (comprendidas entre 1/50 y 1/5.000) que ha sido absorbido exhaustivamente con la cepa mutante isógena relevante a 4ºC se incubará con GBS en presencia de complemento humano y leucocitos polimorfonucleares (3 \times 10^{6}). La destrucción opsonofagocítica se expresa como el log del número de CFU que sobreviven después de 1 hora de incubación sustraído del log del número de CFU en el punto de tiempo cero. La destrucción de cepas naturales se compara con la de mutantes isógenos que carecen de nuevas proteínas de GBS.

Modelos in vivo

La rata recién nacida ha sido utilizada por numerosos laboratorios como modelo de infección de GBS porque simula con detalle la infección del ser humano recién nacido (13). La contribución de nuevos genes a la patogénesis de las infecciones por GBS se prueba comparando el tipo natural y el mutante en este sistema. Se inoculan crías de rata por dos vías. En primer lugar, se inoculan las crías por vía intranasal para simular la infección respiratoria y la septicemia típica del comienzo precoz de la infección por GBS. En segundo lugar, la inoculación intraperitoneal o subcutánea reproduce el alto grado de bacteriemia asociada con la septicemia por GBS y que precede a la meningitis por GBS (14).

Se inoculan crías de rata con dosis variables de cepas de GBS y se determina la mortalidad. Se determina el nivel de bacteriemia mediante cultivos de sangre cuantitativos. Se conservan tejidos de pulmón, hígado, bazo y meninges para examen histológico.

Se determina la capacidad del antisuero para las proteínas GBS para proteger las ratas recién nacidas de la infección por GBS (13). Las ratas recién nacidas (<18 horas de vida) reciben una inyección intraperitoneal de 0,5 ml de antisuero de conejo no diluido, seguido de la inoculación intraperitoneal del equivalente de una unidad LD50 de GBS (normalmente unas 5.000 bacterias) en PBS. Se determinan a continuación la mortalidad y la morbilidad.

Función de las nuevas proteínas de GBS en vacunas

Varias proteínas superficiales de GBS, incluyendo C y Rib son inmunógenas y protectoras contra la infección por GBS en modelos de roedor lactante (25, 26). Ninguna de estas proteínas está presente en todas las cepas de GBS (27). Además, cada una de estas proteínas tiene una estructura repetitiva. La variabilidad fenotípica de estas proteínas repetitivas permite escapar a los mutantes que expresan formas variantes para evadir los sistemas inmunitarios del huésped y pueden limitar la eficacia de estas vacunas (28). Es destacable que cada una de las proteínas previstas de los locus spb y ema no tienen una estructura repetitiva y no presentarían este inconveniente.

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Las nuevas proteínas de GBS que describen en la presente los autores pueden ser antígenos útiles para una vacuna contra GBS. Los datos presentados en la presente memoria indican que estas proteínas desempeñan una función en la mediación de la adherencia y la invasión de GBS a las células epiteliales humanas, de este modo el anticuerpo contra estos antígenos puede prevenir estas etapas iniciales en la infección. Es muy deseable desarrollar una vacuna que impida la colonización de mujeres embarazadas y otros individuos en situación de riesgo aumentada de infección invasiva por GBS, ya que esto eliminaría la mayoría de las infecciones. Los datos de los autores sugieren que el anticuerpo contra Spb1 es eficaz para reducir la colonización o infección después de la colonización con cepas muy virulentas de serotipo III, y por consiguiente esta proteína es un antígeno de vacuna específicamente útil. Los miembros del locus ema, a diferencia de spb1 y spb2, están omnipresentes en GBS y por consiguiente desempeñan una función en la prevención de la infección por serotipos múltiples de GBS. Una formulación de vacuna óptima incluye combinaciones de estos antígenos.

Se utilizan dos estrategias para diseñar vacunas contra GBS utilizando estas nuevas proteínas. En primer lugar, se utilizan proteínas recombinantes purificadas o purificadas por afinidad como antígenos de vacuna, individualmente o en combinación (25). En segundo lugar, estas proteínas se utilizan como proteínas portadoras para vacunas a base de polisacárido u oligosacárido capsular. Los polisacáridos y oligosacáridos de GBS generalmente son poco inmunógenos y no pueden provocar respuestas significativas de recuerdo ni de refuerzo (29). La conjugación de estos polisacáridos u oligosacáridos con portadores de proteína aumenta la inmunogenicidad. El polisacárido GBS conjugado con toxoide contra el tétano, por ejemplo, se ha utilizado para inmunizar mujeres embarazadas y produce grandes concentraciones de anticuerpo contra el polisacárido del suero materno que pueden transferirse al feto en el tercer trimestre del embarazo (30). La selección de las proteínas portadoras apropiadas es importante para el desarrollo de las formulaciones de la vacuna con polisacárido y proteína. Por ejemplo, el poli- u oligosacárido de tipo b de Haemophilus influenzae conjugado con diferentes portadores de proteína presenta inmunogenicidad variable y provoca anticuerpos con avidez variable (31, 32). La inmunización repetida con la misma proteína portadora puede también suprimir las respuestas inmunitarias por competencia con linfocitos B específicos (supresión epitópica) u otros mecanismos. Esto resulta particularmente interesante para el desarrollo de las vacunas contra GBS ya que todas las vacunas del conjugado de polisacárido y oligosacárido con conjugado de proteína desarrolladas recientemente contra las bacterias H. influenzae, S. pneumoniae y N. meningitidis utilizan un número limitado de proteínas portadoras (toxoide tetánico, CRM197, toxoide diftérico), que aumentan el número de exposiciones a estos portadores que es probable que reciba un individuo. Una vacuna de "diseñador", compuesta por un polisacárido u oligosacárido de GBS acoplado a una proteína portadora específica para GBS, tal como los nuevos polipéptidos de GBS, proporcionados en esta memoria, particularmente incluyendo Spb1, EmaC y EmaE, pueden ser una estrategia preferible. El gran tamaño de algunos de estos nuevos antígenos de GBS puede presentar también una ventaja para las proteínas con vehículo tradicional ya que el aumento de tamaño está asociado a una mejor inmunogenicidad.

Ejemplo 3 Homólogos de Ema en estreptococos y otras bacterias

Como se expuso anteriormente, las proteínas Ema de GBS comparten homología de segmentos con determinadas proteínas caracterizadas de otras especies bacterianas, incluyendo las proteínas de adherencia y de invasión bacterianas. El homólogo segmentario se observa en el intervalo entre 24 y 39%. Además, las proteínas Ema demuestran alguna homología entre sí. Una comparación de los genes ema demuestra que EmaA y EmaB son 47% homólogas, sin embargo, debido a la diferencia en sus longitudes previstas es necesario insertar huecos en la secuencia de EmaA a fin de alinearlas. Las dos proteínas Ema que son más similares en estructura, EmaC y EmaD comparten el 48,7% de homología de aminoácidos entre sí. EmaA/B, EmaC/D y EmaE son cada una \leq20% de homólogas entre sí.

Se utilizaron secuencias de ema para buscar los genomas microbianos no anotados (Eubacteria). Las proteínas Ema previstas se buscaron frente a las traducciones en los seis marcos (tblast x) de genomas microbianos no anotados acabados e inacabados disponibles en la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se identificó el homólogo del aminoácido segmentario.

EmaA tiene algún homólogo segmentario con S. pneumoniae, E. faecalis, B. anthracis y C. diptheriae. EmaB presenta algún homólogo segmentario con B. anthracis. EmaE presenta homología segmentaria con S. pyogenes y homología menor con B. anthracis.

Se identificó la homología significativa entre EmaC y EmaD de GBS y proteínas en otra especie bacteriana. EmaC presenta homología significativa (55% de identidad sobre 149 aminoácidos) con una zona del cromosoma de S. pneumoniae y el cromosoma de S. pyogenes (47% de identidad sobre 150 aminoácidos). Se observó homología segmentaria menor en E. faecalis, S. equi y C. diptheriae. EmaD presenta homología segmentaria acusada (66% sobre 184 aminoácidos) con una zona del cromosoma de S. pneumoniae, y menor homología segmentaria con C. diphtheriae y S. pyogenes.

Los autores han identificado dos homólogos de Ema en S. pneumoniae. Estos homólogos de S. pneumoniae presentan homología con EmaC y EmaD y, como EmaC y EmaD, también demuestran homología con la proteína asociada a franjas de Actinomyces. El ácido nucleico codificador y la secuencia de aminoácidos prevista del primer homólogo EmaC/D de S. pneumoniae se proporcionan en las SEC. ID. nº: 24 y nº: 23, respectivamente. El ácido nucleico de la zona del genoma que incluye la secuencia que codifica el primer homólogo se proporciona en la SEC. ID. nº: 22. El ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos prevista del segundo homólogo de EmaC/D de S. pneumoniae se proporcionan en la SEC. ID. nº: 27 y nº: 26 respectivamente. El ácido nucleico de la zona genómica de este segundo homólogo se encuentra en la SEC. ID. nº: 25. Se ha identificado un homólogo de EmaC/D en Enterococcus faecalis mediante reconocimiento y análisis. La secuencia de aminoácidos prevista del homólogo de EmaC/D de E. faecalis se proporciona en la SEC. ID. nº: 29. La secuencia de ácido nucleico que codifica este homólogo de Ema de E. faecalis se proporciona en la SEC. ID. nº: 30. La secuencia de ácidos nucleicos de E. faecalis cuya zona genómica codifica el homólogo de EmaC/D se proporciona en la SEC. ID. nº: 28.

Los autores también han identificado un homólogo de EmaD en Corynebacterium diptheriae. La secuencia de aminoácidos prevista del homólogo EmaD de C. diptheriae se proporciona en la SEC. ID. nº: 32. La secuencia de ácidos nucleicos de C. diptheriae que codifica el homólogo se encuentra en la SEC. ID. nº: 33. La secuencia de la zona genómica correspondiente de C. diptheriae se proporciona en la SEC. ID. nº: 31.

Un homólogo de EmaC/D previsto ha sido identificado en S. pyogenes. La secuencia de aminoácidos parcial prevista de este homólogo de Ema se proporciona en la SEC. ID. nº: 37.

Una zona de aminoácidos TLLTCTPYMINS/THRLLVR/KG (SEC. ID. nº: 34) se encuentra en EmaC de GBS, EmaD de GBS, tanto en los homólogos EmaC/D de S. pneumoniae como en el homólogo Ema de E. faecalis. Una secuencia similar TLVTCTPYGINTHRLLVTA (SEC. ID. nº: 35) se encuentra también en el homólogo Ema de C. diptheriae. El homólogo Ema previsto de S. pyogenes también tiene una secuencia similar TLVTCTPYGVNTKR
LLVRG (SEC. ID. nº: 36).

Lo siguiente es una lista de las referencias citadas en este apartado del Ejemplo.

Referencias

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\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Adderson, Elisabeth

\hskip1cm Bohnsack, John

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> ÁCIDOS NUCLEICOS DE POLIPÉPTIDOS DE ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO B Y COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS Y VACUNAS DE LOS MISMOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 2511-1-001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-08-08

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 37

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 737

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 245

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<212> PRT

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<213> Streptococcus agalactiae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 924

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 918

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 852

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2712

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 903

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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17

18

19

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaggtggat ccttcggcaa t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgattgccga

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcaactgt gctaaccgag ggaat

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgattccctc g

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1509

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1509)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 502

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X puede ser un aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 17

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\sa{Leu Pro Xaa Thr Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1683

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1683)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

29

30

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 560

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<212> PRT

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<213> Streptococcus agalactiae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\sa{Leu Pro Ser Thr Gly Gly}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X puede ser un aminoácido.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Pro Xaa Thr Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 2714

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<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

\newpage

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<400> 22

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35

36

37

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<210> 23

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<211> 297

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pneumoniae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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38

39

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<210> 24

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<211> 894

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<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

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<400> 24

40

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<210> 25

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<211> 3010

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<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

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41

42

43

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<210> 26

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<211> 304

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pneumoniae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

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44

45

46

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<210> 27

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<211> 915

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<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

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47

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 2199

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<212> ADN

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<213> Enterococcus faecalis

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<400> 28

48

49

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<210> 29

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<211> 284

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<212> PRT

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<213> Enterococcus faecalis

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<400> 29

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50

51

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<210> 30

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<211> 855

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<212> ADN

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<213> Enterococcus faecalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

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52

53

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

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<211> 2687

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<212> ADN

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<213> Corynebacterium diphtheriae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

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54

55

56

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

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<211> 348

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<212> PRT

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<213> Corynebacterium diphtheriae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

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57

58

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<210> 33

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<211> 1047

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<212> ADN

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<213> Corynebacterium diphtheriae

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<400> 33

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59

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Consenso/Streptococcus pyogenes

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<220>

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<223> X en posición 12 puede ser asimismo S/T.

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<220>

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<223> X en posición 18 puede ser asimismo R/K.

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<400> 34

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\sa{Thr Leu Leu Thr Cys Thr Pro Tyr Met Ile Asn Xaa His Arg Leu Leu}

\sac{Val Xaa Gly}

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<210> 35

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Corynebacterium diphtheriae

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<400> 35

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\sa{Thr Leu Val Thr Cys Thr Pro Tyr Gly Ile Asn Thr His Arg Leu Leu}

\sac{Val Thr Ala}

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<210> 36

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pyogenes

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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\sa{Thr Leu Val Thr Cys Thr Pro Tys Gly Val Asn Thr Lys Arg Leu Leu}

\sac{Val Arg Gly}

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<210> 37

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<211> 150

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pyogenes

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<400> 37

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60

61

Claims (30)

1. Polipéptido EmaA estreptocócico aislado que comprende la SEC. ID. nº: 2 y análogos sustancialmente homólogos, variantes alélicas y fragmentos inmunógenos de las mismas, en el que el análogo sustancialmente homólogo comparte por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 2.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, marcado con un marcador detectable.

3. Vacuna o composición inmunógena que comprende un polipéptido según la reivindicación 1, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

4. Vacuna o composición inmunógena según la reivindicación 3, que comprende además por lo menos un antígeno seleccionado de entre:

a.

polipéptido Spb1 o un fragmento inmunógeno del mismo;

b.

polipéptido Spb2 o un fragmento inmunógeno del mismo;

c.

polipéptido antígeno alfa de la proteína C o un fragmento inmunógeno del mismo;

d.

polipéptido Rib o un fragmento inmunógeno del mismo;

e.

polipéptido Lmb o un fragmento inmunógeno del mismo;

f.

polipéptido C5a-asa o un fragmento inmunógeno del mismo;

g.

polisacáridos u oligosacáridos estreptocócicos del Grupo B.

5. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido según la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, que comprende además un ingrediente activo seleccionado de entre:

a.

los polipéptidos Spb1 y Spb2;

b.

el antígeno alfa de la proteína C;

c.

el polipéptido Rib;

d.

el polipéptido Lmb;

e.

el polipéptido C5a-asa;

f.

un polisacárido u oligosacárido estreptocócico del Grupo B; y

g.

una vacuna antiestreptocócica.

7. Anticuerpo purificado contra un polipéptido según la reivindicación 1.

8. Anticuerpo monoclonal contra un polipéptido según la reivindicación 1.

9. Estirpe celular inmortal que produce un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 8.

10. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 marcado con un marcador detectable.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, en el que el marcador se selecciona de entre una enzima, un producto químico que emite fluorescencia y un elemento radioactivo.

12. Composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos contra un polipéptido según la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, que comprende además un anticuerpo contra una proteína seleccionada de entre Spb1, Spb2, Rib, Lmb, C5a-asa y antígeno alfa con proteína C.

14. Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

15. Ácido nucleico según la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico se selecciona de entre:

a.

la secuencia de ADN de SEC. ID. nº: 1.

b.

una secuencia de ADN que se hibrida con la secuencia de ADN de SEC. ID. nº: 1 en condiciones de hibridación de severidad moderada;

c.

una secuencia de ADN capaz de codificar por lo menos una de las secuencias de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN de (a) o (b);

d.

una variante degenerada de la misma;

e.

un alelo de la misma; y

f.

un fragmento de la misma que se hibrida con la secuencia de ADN de SEC. ID. nº: 1 en condiciones de hibridación normales.

16. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14 y un activador.

17. Vector según la reivindicación 16, en el que el activador comprende un activador bacteriano, de levadura, de insecto o de mamífero.

18. Vector según la reivindicación 16 ó 17, en el que el vector es un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial de levadura (YAC), un bacteriófago o un ADN vírico eucariótico.

19. Sistema de vector huésped para la producción de un polipéptido que comprende el vector según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en una célula huésped adecuada.

20. Sistema de vector huésped según la reivindicación 19, en el que la célula huésped adecuada comprende una célula procariótica o eucariótica.

21. Molécula de ADN recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14.

22. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 21, en la que la molécula de ADN está operativamente ligada a una secuencia de control de expresión.

23. Huésped unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 21 ó 22.

24. Vacuna de ácido nucleico que comprende la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 21 ó
22.

25. Procedimiento para detectar la presencia de un polipéptido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido se mide mediante:

a.

puesta en contacto de una muestra en la que se supone la presencia o actividad del polipéptido, con un anticuerpo contra dicho polipéptido en condiciones que permitan que se produzca la unión del polipéptido con el anticuerpo; y

b.

detección de si se ha producido la unión entre el polipéptido procedente de la muestra y el anticuerpo;

en el que la detección de la unión indica la presencia o actividad del polipéptido en la muestra.

26. Procedimiento para detectar la presencia de una bacteria que presenta un gen que codifica un polipéptido según la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento:

a.

poner en contacto una muestra, en la que se supone la presencia o actividad de la bacteria, con un oligonucleótido que se hibrida con el gen del polipéptido, en condiciones que permiten que se produzca la hibridación específica del oligonucleótido con el gen; y

b.

detectar si se ha producido la hibridación entre el oligonucleótido y el gen;

en el que la detección de la hibridación indica la presencia o actividad de la bacteria en la muestra.

27. Utilización de la vacuna o composición inmunógena de la reivindicación 3 ó 4, en la preparación de un medicamento destinado a la prevención de una infección con una bacteria que expresa un polipéptido según la reivindica-
ción 1.

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28. Utilización de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 12 ó 13, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una infección con una bacteria que expresa un polipéptido según la reivindicación 1.

29. Utilización de la composición farmacéutica según la reivindicación 5 ó 6, en la preparación de un medicamento destinado a la provocación de una respuesta inmunitaria en un objeto que ha sido expuesto o infectado con una bacteria estreptocócica.

30. Utilización de la composición farmacéutica según la reivindicación 12 ó 13, en la preparación de un medicamento destinado a la prevención de una infección por una bacteria estreptocócica.