ES2286542T3 - 1,3-oxatiolanos sustituidos con propiedades antivirales. - Google Patents
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Abstract
Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo constituido por (a) 2R-hidroximetil-4R-(citosin-1''-il)-1, 3-oxatiolano; (b) 2S-hidroximetil-4S-(citosin-1''-il)-1, 3-oxatiolano; (c) cualquier combinación de los isómeros (a) y (b); (d) 2R-hidroximetil-4R-(5''-fluorocitosin-1''-il)-1, 3-oxatiolano; (e) 2S-hidroximetil-4S-(5''-fluorocitosin-1''-il)-1, 3-oxatiolano; (f) cualquier combinación de los isómeros (d) y (e); y (g) las sales y ésteres farmacéuticamente aceptables de los compuestos anteriores, en una cantidad eficaz para tratar infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana resistentes a 2R-hidroximetil-5S-(citosin-1''-il)-1, 3-oxatiolano y 2-hidroximetil-5-(S''-fluorocitosin-1''-il)-1, 3-oxatiolano, en la que dicha formulación farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, otro agente terapéutico, y en la que dicha formulación farmacéutica está en una forma adecuada para su administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para su administración mediante inhalación o insuflación.
Description
1,3-oxatiolanos sustituidos con
propiedades antivirales.
La presente invención se refiere a compuestos de
1,3-oxatiolano sustituidos novedosos que tienen
actividad farmacológica, a composiciones farmacéuticas que los
contienen, y al uso de estos compuestos en el tratamiento antiviral
de mamíferos.
Las infecciones retrovirales son una causa grave
de enfermedad, de la manera más notable, el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) se ha reconocido como el agente
etiológico del SIDA. Se están buscando activamente compuestos que
tienen un efecto inhibidor sobre la multiplicación del VIH o
eficaces de otra manera en el tratamiento de las infecciones
retrovirales.
H. Mitsuya et al.,
"3'-Azido-3'-deoxythymidine
(BW A509U): An antiviral agent that inhibits the infectivity and
cytopathic effect of human T-lymphotropic virus type
III/lymphadenopathy-associated virus in
vitro", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, págs.
7096-7100 (1985), hace referencia a la
3'-azido-3'-desoxitimidina
de fórmula (A), denominada comúnmente AZT. Se dice que este
compuesto es útil para proporcionar alguna protección para los
portadores de SIDA frente al efecto citopatógeno del virus de la
inmunodeficiencia (VIH).
H. Mitsuya y S. Broder, "Inhibition of the
in vitro infectivity and cytopathic effect of human
T-lymphotrophic virus type
III/lymphadenopathy-associated virus
(HTLV-III/LAV) by
2',3'-dideoxynucleosides", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 83, págs.1911-15 (1986), han hecho también
referencia a un grupo de 2',3'-didesoxinucleósidos
mostrados en la fórmula (B) que se dice que tienen una actividad
protectora frente a la citopatogenicidad inducida por VIH.
P. Herdewijn et al.,
"3'-Substituted
2',3'-dideoxynucleoside analogues as potential
anti-HIV (HTLV-III/LAV) agents",
J. Med. Chem., 30, págs. 1270-1278 (1987), describen
la actividad anti-VIH de una serie de análogos de
nucleósidos 3'-sustituidos. Aunque los análogos
3'-fluoro de la 3'-desoxitimidina y
2',3'-didesoxicitidina mostrados en las fórmulas
(C) y (D) se encuentra que tienen una actividad antirretroviral
potente, los sustituyentes unidos al 3'-carbono por
medio de un puente de oxígeno o tio no dieron productos activos.
Los análisis de los estudios de conformación
molecular en P. Van Roey et al., "Correlation between
preferred sugar ring conformation and activity of nucleoside
analogues against human immunodeficiency virus", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 86(10), págs. 3929-3933
(1989), indican que los análogos de nucleósido
anti-VIH activos tiene conformaciones de
3'-carbono en el lado opuesto a la base.
D. Huryn et al., "Synthesis of
iso-ddA, member of a novel class of
anti-HIV agents", Tetrahedron Lett.,
30(46), págs. 6259-6262 (1989), hacen
referencia al análogo de isonucleósido de fórmula (E) como un
inhibidor estable de la duplicación del VIH.
R. Vince y M. Hua, "Synthesis and
anti-HIV activity of carbocyclic
2',3'-didehydro-2',3'-dideoxy
2,6-disubstituted purine nucleosides", J. Med. Chem.,
33(1), págs. 17-21 (1990), describen los
análogos mostrados en las fórmulas (F) y (G) como que tienen
actividad anti-VIH. El análogo (F) insaturado
muestra una mayor selectividad y potencia como inhibidor de la
duplicación del VIH que el análogo (G) saturado.
C. Chu et al., "Synthesis and
structure-activity relationships of
6-substituted 2',3'-dideoxypurine
nucleosides as potential anti-human
immunodeficiency virus agents", J. Med. Chem., 33(6),
págs. 1553-1561 (1990), describen el derivado
N6-metilo mostrado en la fórmula (H) como que tiene
una mayor potencia frente al VIH que la
2',3'-didesoxiadenosina no metilada.
Finalmente, B. Belleau et al., "Design
and activity of a novel class of nucleoside analogues effective
against HIV-1", Abstracts of papers, Quinta
Conferencia Internacional sobre el SIDA, Montreal, T.C.O. 1, pág.
515 (1989), hacen referencia a los dioxolanos y oxatiolanos de
fórmulas (J) y (K) como que tiene una actividad
anti-VIH potente.
Se ha encontrado que el isómero cis de
fórmula (K) es activo frente a VIH y VHB, y se ha encontrado que su
enantiómero no natural ((2R,5S cis) denominado "el
enantiómero (-)" tiene sorprendentemente una toxicidad baja.
Llamado ahora lamivudina o "3TC^{TM}", este nuevo fármaco
antiviral se está convirtiendo en el tratamiento de elección para
la politerapia de pacientes con SIDA y para el tratamiento único de
pacientes con VHB.
Aunque se ha encontrado que la lamivudina
(3TC^{TM}) es un compuesto extremadamente interesante en la
práctica clínica, siempre existe la posibilidad de que el paciente
desarrollo cepas de virus que sean resistentes a ella tras periodos
de tratamiento prolongados. Por tanto, existe todavía la necesidad
de desarrollar agentes antivirales que sean activos frente a las
cepas virales resistentes a nucleósidos, en particular, frente a
cepas virales resistentes a 3TC^{TM}.
Se ha encontrado que las clases de compuestos
conocidos como 1,3-oxatiolanos
2-sustituidos 4-sustituidos tienen
una actividad antiviral potente. En particular, se ha encontrado que
estos compuestos actúan como inhibidores potentes de la duplicación
del VIH-1 en los linfocitos T durante un periodo de
tiempo prolongado con menores efectos secundarios citotóxicos que
los compuestos conocidos en la técnica. Se ha encontrado también que
estos compuestos son activos frente a las cepas de VIH resistentes
a 3TC. Estos compuestos también son útiles para la profilaxis y el
tratamiento de infecciones por virus de la hepatitis B.
Por consiguiente se proporciona en un primer
aspecto de esta invención un enantiómero simple de compuestos de
fórmula (I) en la configuración cis:
en la
que
R_{1} es hidrógeno,
R_{2} es citosina o
5-fluorocitosina, y sales y ésteres
farmacéuticamente aceptables de las mismas.
Tal como se usa en el presente documento, "una
sal, éster o sal de tal éster farmacéuticamente aceptable", de
un compuesto de fórmula (I) o cualquier otro compuesto que, tras su
administración al receptor, puede proporcionar (directa o
indirectamente) un compuesto de fórmula (I) o un metabolito
antiviralmente activo o un residuo del mismo.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos de fórmula (I) incluyen aquellas derivadas de bases y
ácidos orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables. Los
ejemplos de ácidos adecuados incluyen ácidos clorhídrico,
bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico,
fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico,
p-toluensulfónico, tartárico, acético, cítrico,
metansulfónico, fórmico, benzoico, malónico,
naftalen-2-sulfónico y
bencensulfónico. Otros ácidos tales como el oxálico, aunque no son
en sí farmacéuticamente aceptables, pueden ser útiles en la
preparación de sales útiles como productos intermedios en la
obtención de los compuestos de la invención y sus sales de adición
de ácido farmacéuticamente aceptables.
Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen
sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), de metales
alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), de amonio y de N-(alquilo
C_{1-4})_{4}^{+}.
Los expertos en la técnica apreciarán que los
compuestos de fórmula (I) pueden modificarse para proporcionar
sales y ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos, en
grupos funcionales tanto en el resto citosina como en el grupo
hidroximetilo del anillo de oxatiolano. La modificación de todos los
grupos funcionales de este tipo se incluye dentro del alcance de la
invención. Sin embargo, son de interés particular las sales y
ésteres farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ésteres o ésteres
de aminoácidos) obtenidos mediante la modificación del grupo
2-hidroximetilo del anillo de oxatiolano.
Los ésteres preferidos de los compuestos de
fórmula (I) incluyen los compuestos en los que R_{1} está
sustituido por una función carbonilo R-(CO) en la que el resto R no
carbonilo de la agrupación éster se selecciona de hidrógeno,
alquilo de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, t-butilo,
n-butilo), alcoxialquilo (por ejemplo,
metoximetilo), aralquilo (por ejemplo, bencilo), ariloxialquilo (por
ejemplo, fenoximetilo), arilo (por ejemplo, fenilo opcionalmente
sustituido con halógeno, alquilo C_{1-4} o
alcoxilo C_{1-4}); dihidropiridinilo sustituido
(por ejemplo, N-metildihidropiridinilo); ésteres de
sulfonato tales como alquil o aralquilsulfonilo (por ejemplo,
metansulfonilo); ésteres de sulfato; ésteres de aminoácido (por
ejemplo, L-valilo o L-isoleucilo) y
ésteres de mono, di o trifosfato.
También se incluyen dentro del alcance de tales
ésteres los ésteres derivados de ácidos polifuncionales tales como
los ácidos carboxílicos que contienen más de un grupo carboxilo, por
ejemplo, ácidos dicarboxílicos
HO_{2}C(CH_{2})_{n}
CO_{2}H en los que n es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, ácido succínico) o ácidos fosfóricos. Se conocen bien los métodos para preparar tales ésteres. Véase, por ejemplo, E. Hahn et al., "Nucleotide dimers as anti-human immunodeficiency virus agents", Nucleotide Analogues As Antiviral Agents, J.C. Martin, Ed. Symposium Serie nº 401, American Chemical Society, págs. 156-159 (1989) y M. Busso et al., "Nucleotide dimers suppress HIV expression in vitro", AIDS Research and Human Retroviruses, 4(6), págs.449-455 (1988).
CO_{2}H en los que n es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, ácido succínico) o ácidos fosfóricos. Se conocen bien los métodos para preparar tales ésteres. Véase, por ejemplo, E. Hahn et al., "Nucleotide dimers as anti-human immunodeficiency virus agents", Nucleotide Analogues As Antiviral Agents, J.C. Martin, Ed. Symposium Serie nº 401, American Chemical Society, págs. 156-159 (1989) y M. Busso et al., "Nucleotide dimers suppress HIV expression in vitro", AIDS Research and Human Retroviruses, 4(6), págs.449-455 (1988).
Los compuestos específicos de fórmula (I)
incluyen:
Compuesto nº
1:
2R-hidroximetil-4R-(citosin1'-il)-1,3-oxatiolano;
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto nº
2:
2S-hidroximetil-4S-(citosin1'-il)-1,3-oxatiolano;
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto nº
3:
2R-hidroximetil-4R-(5'-fluorocitosin1'-il)-1,3-oxatiolano;
y
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto nº
4
2S-hidroximetil-4S-(5'-fluorocitosin1'-il)-1,3-oxatiolano;
y sales y ésteres farmacéuticamente aceptables
de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
En los procedimientos para preparar los
compuestos de esta invención, se usan las definiciones
siguientes:
R_{2} es citosina o
5-fluorocitosina;
R_{w} es hidrógeno, sililo trisustituido,
alquilo C_{1-6}, aralquilo tal como bencilo o
tritilo, acilo C_{1-16}, preferiblemente un
benzoílo o un benzoílo sustituido en cualquier posición con al menos
un halógeno (bromo, cloro, fluoro o yodo), alquilo
C_{1-6}, alcoxilo C_{1-6},
nitro, o grupo triluorometilo;
R_{x} es alquilo C_{1-6};
y
L es un "grupo saliente", es decir, un
átomo o grupo que puede desplazarse tras la reacción con una base
apropiada, con o sin un ácido de Lewis. Los grupos salientes
adecuados incluyen grupos aciloxilo, grupos alcoxilo, por ejemplo,
grupos alcoxicarbonilo tales como etoxicarbonilo; halógenos tales
como yodo, bromo, cloro, o fluoro; amido; azido; isocianato;
tiolatos saturados o insaturados, sustituidos o no sustituidos,
tales como tiometilo o tiofenilo; compuestos de selenio o selenino
saturados o insaturados, sustituidos o no sustituidos, tales como
seleniuro de fenilo o seleniuro de alquilo; y cetonas alifáticas o
aromáticas, saturadas o insaturadas, sustituidas o no sustituidas,
tales como metil cetona.
Un grupo saliente adecuado también puede ser
-OR, en el que R es un grupo alquilo saturado o insaturado,
sustituido o no sustituido, por ejemplo, grupo alquenilo o alquilo
C_{1-6}; un grupo acilo alifático o aromático,
sustituido o no sustituido, por ejemplo, un grupo acilo alifático
C_{1-6} tal como acetilo y un grupo acilo
aromático tal como benzoílo; un grupo alcoxi- o ariloxicarbonilo
saturado o insaturado, sustituido o no sustituido, tal como
carbonato de metilo y carbonato de fenilo; sulfonilimidazolida
sustituida o no sustituida; grupo aminocarbonilo alifático o
aromático sustituido o no sustituido, tal como carbamato de fenilo;
grupo imidato de alquilo sustituido o no sustituido tal como
tricloroacetamidato; fosfonatos saturados o insaturados, sustituidos
o no sustituidos, tales como fosfonato de dietilo; grupo sulfonilo
alifático o aromático sustituido o no sustituido, tal como tosilato;
o hidrógeno.
Los compuestos de oxatiolano de fórmula (I),
\vskip1.000000\baselineskip
y sales y ésteres,
farmacéuticamente aceptables, pueden prepararse según los
procedimiento tratados en el presente documento o mediante
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la preparación
de compuestos de estructura análoga. El compuesto de esta invención
puede producirse mediante los procedimientos descritos por Mansour
et al., "Anti-Human Immunodeficiency Virus
and Anti-Hepatitis-B Virus
Activities and Toxicities of the Enantiomers of
2'-Deoxy-3'-oxa-4'-thiacytidine
and Their 5-Fluoro Analogues in vitro", J.
Med. Chem., 1995, vol. 38, nº 1, págs. 1-4, que se
incorpora al presente documento por
referencia.
En un procedimiento de este tipo para producir
los oxatiolanos de esta invención, un compuesto de fórmula (V),
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{w} es hidrógeno o un
grupo protector del hidroxilo y L es un átomo o grupo desplazable,
es decir, un grupo saliente, se hace reaccionar con una base
apropiada.
En un segundo procedimiento para producir
oxatiolanos de esta invención, un compuesto de fórmula (VI)
\vskip1.000000\baselineskip
puede convertirse en un compuesto
de fórmula (I) mediante la conversión del grupo NH_{2} anomérico
en la base requerida mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica de la química de los
nucleósidos.
Los 1,3-oxatiolanos de fórmula
(I) también pueden prepararse, por ejemplo, mediante la reacción de
un aldehído de fórmula (VII)
(VII)C_{6}H_{5}COOCH_{2}CHO
con
2-mercaptoetanol en un disolvente orgánico
compatible seguido de transposiciones de Pummerer tal como se
conoce en la técnica (T. Durst, "Dimethylsulfoxide in Organic
Synthesis", Adv. Org. Chem., E.C. Taylor y B. Wynberg, Eds., 6,
págs. 356-365(1969)) para dar los
1,3-oxatiolanos de fórmula (V), que se convierten
en los 1,3-oxatiolanos de fórmula (I) mediante
procedimientos conocidos en la técnica de la química de los
nucleósidos.
Otro procedimiento para preparar los
1,3-oxatiolanos de fórmula (I) se ilustra en el
esquema 1.
Las diversas etapas implicadas en la síntesis de
los 1,3-oxatiolanos de fórmula (I) tal como se
ilustra en el esquema 1 pueden describirse brevemente tal como
sigue:
Esquema
1
Se condensa el benzoiloxiacetaldehído de fórmula
(VII) o cualquier aldehído de fórmula R_{w}OCH_{2}CHO (C.D.
Hurd y E.M. Filiachione, "A new approach to the syntheses of
aldehyde sugars", J. Am. Chem. Soc., 61, págs.
1156-1159 (1939)) con un mercaptoalcohol tal como
2-mercaptoetanol en un disolvente orgánico
compatible, tal como tolueno, que contiene una cantidad catalítica
de un ácido fuerte para dar el producto intermedio mostrado en la
fórmula (VIII).
Se oxida entonces el
1,3-oxatiolano de fórmula (VIII) con un perácido tal
como ácido monoperoxiftálico de magnesio en un disolvente orgánico
compatible tal como cloruro de metileno que contiene una sal tal
como bromuro de tetrabutilamonio para dar el producto intermedio de
sulfóxido mostrado en la fórmula (IX).
Se trata el producto intermedio de sulfóxido
mostrado en la fórmula (IX) con un anhídrido de ácido tal como
anhídrido acético o cualquier otro anhídrido de fórmula
(R_{x}CO)_{2}O en presencia de un tampón tal como
acetato de tetra-n-butilamonio para
dar el 1,3-oxatiolano
2,4-disustituido de fórmula (X) (T. Durst, Adv. Org.
Chem., 6, págs. 356-365 (1969)).
Se hace reaccionar entonces el
1,3-oxatiolano de fórmula (X) con una base de
pirimidina o un análogo de la misma, (por ejemplo, citosina)
sililada previamente con, por ejemplo, hexametildisilazano en un
disolvente compatible usando un ácido de Lewis o triflato de
trimetilsililo para dar el producto intermedio de fórmula (XI) como
isómeros cis y trans. Pueden separarse los isómeros,
preferiblemente mediante cromatografía, para dar (XI) cis
puro y (XI) trans puro.
Se hidroliza la función benzoato del compuesto
de fórmula (XI) (isómero cis o trans), usando una
base tal como amoniaco metanólico para obtener el compuesto mostrado
en la fórmula (XII) como isómero cis o trans,
preferiblemente a presión, para dar el producto mostrado en
Muchas de las reacciones en los procedimientos
descritos anteriormente se han notificado ampliamente en el
contexto de la síntesis de nucleósidos de pirimidina, por ejemplo,
en L.B. Townsend, "Synthesis and reaction of pyrimidine
nucleoside", Chemistry of Nucleoside and Nucleotides vol. 1,
Eds., Plenum Press, Nueva York (1989) en las páginas
1-95, cuyo texto se incorpora al presente documento
por referencia.
En el procedimiento descrito anteriormente, los
compuestos de fórmula (I) se obtienen generalmente como una mezcla
de los isómeros cis y trans.
Los isómeros cis y trans pueden
separarse, por ejemplo, mediante acetilación, por ejemplo, con
anhídrido acético seguido de separación mediante medios físicos,
por ejemplo, cromatografía sobre gel de sílice y desacetilación,
por ejemplo, con amoniaco metanólico o mediante cristalización
fraccional.
Por tanto, la resolución del producto final, o
un producto intermedio o material de partida puede efectuarse
mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica:
véase por ejemplo, Stereochemistry of Carbon Compounds, de E.L.
Eliel (McGraw Hill, 1962) y Tables of Resolving Agents, de S.H.
Wilen.
Cuando el compuesto de fórmula (I) se desea como
un enantiómero simple, puede obtener o mediante la resolución de la
mezcla de los dos enantiómeros cis (mediante HPLC quiral) o
bien mediante la síntesis estereoespecífica a partir de material de
partida isométricamente puro o cualquier producto intermedio
conveniente. Así, puede obtenerse el compuesto de fórmula (I) o
cualquier compuesto intermedio conveniente mediante HPLC quiral
usando una fase estacionaria adecuada, por ejemplo
\beta-ciclodextrina acetilada o triacetato de
celulosa y un disolvente adecuado, por ejemplo un alcohol tal como
etanol o una disolución acuosa tal como acetato de trietilamonio.
Como alternativa, el compuesto de fórmula (I) o cualquier compuesto
intermedio conveniente puede resolverse mediante catabolismo
enantioselectivo mediado por enzima con una enzima adecuada tal como
citidina desaminasa o degradación enzimática selectiva de un
derivado adecuado usando una 5'-nucleotidasa, por
ejemplo véase Storer et al., "The resolution and Absolute
Stereochemistry of the Enantiomers of
cis-1[2(Hydroxomethyl)-1,3-Oxathiolan-5-yl)Cytosine
(BCH-189): Equipotent Anti-HIV
Agents", Nucleosides & Nucleotides, 12(2),
225-236 (1993). Cuando la resolución se efectúa
enzimáticamente, la enzima puede emplearse o en disolución o en
forma inmovilizada. Las enzimas en forma inmovilizada se conocen en
la técnica por ejemplo, mediante absorción sobre una resina tal como
Eupergit.
Se apreciará que las reacción de los
procedimientos descritos anteriormente pueden requerir la
utilización de, o convenientemente pueden aplicarse a, materiales
de partida que tienen grupos funcionales protegidos, y por tanto
puede requerirse una desprotección como una etapa intermedia o final
para dar el compuesto deseado. La protección y desprotección de
grupos funcionales puede efectuarse usando medios convencionales.
Así, por ejemplo, los grupos amino pueden protegerse mediante un
grupo seleccionado de aralquilo (por ejemplo, bencilo), acilo o
arilo (por ejemplo, 2,4-dinitrofenilo); efectuándose
la eliminación posterior del grupo protector cuando se desee
mediante hidrólisis o hidrogenolisis según sea apropiado usando
condiciones estándar. Los grupos hidroxilo pueden protegerse usando
cualquier grupo protector de hidroxilo convencional, por ejemplo,
tal como se describe en "Protective Groups in Organic
Chemistry", Ed. J.F.W. McOmie (Plenum Press, 1973) o
"Protective Groups in Organic Synthesis" de Theodora W. Greene
(John Wiley and Sons, 1981) que se incorpora al presente documento
por referencia. Los ejemplos de grupos protectores de hidroxilo
adecuados incluyen grupos seleccionados de alquilo (por ejemplo,
metilo, t-butilo o metoximetilo), aralquilo (por
ejemplo, bencilo, difenilmetilo o trifenilmetilo), grupos
heterocíclicos tales como tetrahidropiranilo, acilo, (por ejemplo,
acetilo o benzoílo) y grupos sililo tales como trialquilsililo (por
ejemplo, t-butildimetilsililo). Los grupos
protectores de hidroxilo pueden eliminarse mediante técnicas
convencionales. Así, por ejemplo, los grupos alquilo, sililo, acilo
y heterocíclicos pueden eliminarse mediante solvolisis, por ejemplo,
mediante hidrólisis en condiciones ácidas o básicas. Los grupos
aralquilo tales como trifenilmetilo pueden eliminarse de manera
similar mediante solvolisis, por ejemplo, mediante hidrólisis en
condiciones ácidas. Los grupos aralquilo tales como bencilo pueden
separarse, por ejemplo, mediante tratamiento con BF_{3}/eterato y
anhídrido acético seguido de la eliminación de los grupos acetato
así formados en una fase apropiada de la síntesis. Los grupos
sililo también pueden eliminarse convenientemente usando una fuente
de iones fluoruro tales como fluoruro de
tetra-n-butilamonio.
tetra-n-butilamonio.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos de la invención pueden prepararse tal como se describe
en la patente estadounidense nº 4.383.114, cuya descripción se
incorpora al presente documento por referencia. Así, por ejemplo,
cuando se desea preparar una sal de adición de ácido de un compuesto
de fórmula (I), puede convertirse el producto de cualquiera de los
procedimientos anteriores en una sal mediante el tratamiento de la
base libre resultante con un ácido adecuado usando procedimientos
convencionales. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptables pueden prepararse haciendo reaccionar la base libre con
una ácido apropiado opcionalmente en presencia de un disolvente
adecuado tal como un éster (por ejemplo, acetato de etilo) o un
alcohol (por ejemplo, metanol, etanol o isopropanol). Las sales
básicas inorgánicas pueden prepararse haciendo reaccionar la base
libre con una base adecuada tal como un alcóxido (por ejemplo,
metóxido de sodio) opcionalmente en presencia de un disolvente tal
como un alcohol (por ejemplo, metanol). Las sales farmacéuticamente
aceptables también pueden prepararse a partir de otras sales,
incluyendo otras sales farmacéuticamente aceptables, de los
compuestos de fórmula (I) usando procedimientos convencionales.
Un compuesto de fórmula (I) puede convertirse en
un fosfato u otro éster farmacéuticamente aceptable mediante la
reacción con un agente de fosforilación, tal como POCl_{3}, o un
agente de esterificación adecuado, tal como un anhídrido o haluro
de ácido, según sea apropiado. Un éster o sal de un compuesto de
fórmula (I) puede convertirse en el compuesto original, por
ejemplo, mediante hidrólisis.
Los compuestos de la invención tienen actividad
antiviral. En particular estos compuestos son eficaces para inhibir
la duplicación del virus de la hepatitis B y retrovirus, incluyendo
retrovirus humanos tales como virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH), el agente causante del SIDA.
Se proporciona por tanto como otro aspecto de la
invención un compuesto de fórmula (I) o un derivado
farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como agente
terapéutico activo, en particular como agente antiviral, por ejemplo
en el tratamiento de la hepatitis B viral e infecciones
retrovirales tales como infección por VIH.
También se proporciona en otro aspecto o aspecto
alternativo de esta invención, el uso de un compuesto de fórmula
(I) o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección
viral.
Tales infecciones virales pueden ser, en
particular infecciones por VIH y VHB.
En otro aspecto o aspecto alternativo se
proporciona un procedimiento para el tratamiento de una infección
viral, en particular un infección provocada por el virus de la
hepatitis B o un retrovirus tal como VIH, en un mamífero,
incluyendo el hombre, que comprende la administración de una
cantidad eficaz de un compuesto antiviral de fórmula (I) o un
derivado farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos de la invención también son
útiles para el tratamiento de estados relacionados con el SIDA
tales como complejo relacionado con el SIDA (CRS), linfadenopatía
generalizada persistente (LGP), estados neurológicos relacionados
con el SIDA (tales como demencia), estados de anticuerpos
anti-VIH positivos y VIH-positivos,
sarcoma de Kaposi, púrpura trombocitopénica e infecciones
oportunistas.
Los compuestos de la invención son también
útiles para la prevención o evolución de una enfermedad clínica de
individuos que son anticuerpo anti-VIH o antígeno
VIH positivos y para la profilaxis tras la exposición al VIH.
Los compuestos de fórmula (I) o las sales y
ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos, también pueden
usarse para la prevención de la contaminación viral de fluidos
biológicos tales como sangre o semen in vitro.
Se apreciará por los expertos en la técnica que
las referencias en el presente documento al tratamiento se
extienden a la profilaxis así como al tratamiento de las infecciones
o síntomas establecidos.
Se apreciará además que la cantidad de un
compuesto de la invención requerida para su uso en el tratamiento
variará no sólo con el compuesto particular seleccionado sino
también con la vía de administración, la naturaleza del estado que
está tratándose y la edad y el estado del paciente y estará en
última instancia a discreción del médico adjunto o veterinario. En
general, sin embargo, una dosis adecuada estará en el intervalo
desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 750 mg/kg de
peso corporal por día, tal como de 3 mg a aproximadamente 120 mg
por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferiblemente
en el intervalo de 6 mg/kg/día a 90 mg/kg/día, lo más
preferiblemente en el intervalo de 15 mg/kg/día a 60 mg/kg/día.
La dosis deseada puede presentarse
convenientemente en una dosis única o como dosis divididas
administradas a intervalos apropiados, por ejemplo como dos, tres,
cuatro o más subdosis por día.
El compuesto se administra convenientemente en
una forma de dosificación unitaria; por ejemplo que contiene de 10
mg a 1500 mg, convenientemente de 20 mg a 1000 mg, lo más
convenientemente de 50 mg a 700 mg de principio activo por forma de
dosificación unitaria.
De manera ideal el principio activo debe
administrarse para conseguir concentraciones en plasma máximas del
principio activo desde aproximadamente 1 \muM hasta 75 \muM,
preferiblemente de manera aproximada de 2 \muM a 50 \muM, lo
más preferiblemente de manera aproximada de 3 \muM a
aproximadamente 30 \muM. Esto puede conseguirse, por ejemplo,
mediante la inyección intravenosa de una disolución a del 0,1% al 5%
del principio activo, opcionalmente en solución salina, o
administrada como un bolo que contiene de aproximadamente 0,1 mg/kg
a aproximadamente 110 mg/kg del principio activo. Pueden mantenerse
niveles sanguíneos deseables mediante una infusión continua para
proporcionar de aproximadamente 0,01 mg/kg/hora a aproximadamente
5,0 mg/kg/hora o mediante infusiones intermitentes que contienen de
aproximadamente 0,4 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg del principio
activo.
Aunque es posible que, para su uso en el
tratamiento, pueda administrarse un compuesto de la invención como
el producto químico puro, es preferible presentar el principio
activo como una formulación farmacéutica.
Por tanto, la invención proporciona además una
formulación farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I)
o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo junto con uno o
más vehículos farmacéuticamente aceptables del mismo y,
opcionalmente, otros componentes terapéuticos y/o profilácticos.
El/Los vehículo(s) debe(n) ser
"aceptable(s)" en el sentido de ser compatible con los
demás componentes de la formulación y no nocivo para el receptor del
mismo.
Las formulaciones farmacéuticas incluyen
aquellas adecuadas para su administración oral, rectal, nasal,
tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral
(incluyendo intramuscular, subcutánea e intravenosa) o en una forma
adecuada para su administración mediante inhalación o insuflación.
Las formulaciones pueden presentarse, cuando sea apropiado,
convenientemente en unidades de dosificación diferenciadas y pueden
prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos
en la técnica de la farmacia. Todos los procedimientos incluyen la
etapa de asociar el compuesto activo con vehículos líquidos o
vehículos sólidos finamente divididos o ambos y entonces, si es
necesario, conformar el producto para dar la formulación
deseada.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para
su administración oral pueden presentarse convenientemente como
unidades diferenciadas tales como cápsulas, cáchets o comprimidos
conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio
activo; como un polvo o gránulos; como una disolución; como una
suspensión; o como una emulsión. El principio activo también puede
presentarse como un bolo, electuario o pasta. Los comprimidos y
cápsulas para su administración oral pueden contener excipientes
convencionales tales como agentes aglutinantes, cargas,
lubricantes, disgregantes o agentes humectantes. Los comprimidos
pueden recubrirse según procedimientos bien conocidos en la
técnica. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en la forma
de, por ejemplo, elixires, jarabes, emulsiones, disoluciones o
suspensiones acuosas u oleosas, o pueden presentarse como un
producto seco para su constitución con agua u otro vehículo
adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden
contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión,
agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir
aceites comestibles) o conservantes.
Los compuestos según la invención también pueden
formularse para su administración parenteral (por ejemplo, mediante
inyección, por ejemplo inyección en bolo o inyección continua) y
pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas,
jeringuillas rellenadas previamente, infusión de volumen pequeño o
en recipiente de dosis múltiples con un conservante añadido. Las
composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones,
disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden
contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión,
estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio
activo puede estar en forma de polvo, obtenida mediante el
aislamiento aséptico del sólido estéril o mediante liofilización a
partir de la disolución, para su constitución con un vehículo
adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno, antes de su uso.
Para su aplicación tópica a la epidermis, los
compuestos según la invención pueden formularse como pomadas,
cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Las pomadas y
cremas puede formularse, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa
con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las
lociones pueden formularse con una base acuosa u oleosa y en
general contendrán también uno o más agentes emulsionantes, agentes
estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes
espesantes, o agentes colorantes.
Las formulaciones adecuadas para su
administración tópica en la boca incluyen pastillas para chupar que
comprenden el principio activo en una base aromatizada, normalmente
sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el
principio activo en una base inerte tales como gelatina y glicerina
o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el
principio activo en un vehículo líquido adecuado.
Las formulaciones farmacéuticamente adecuadas
para su administración rectal en las que el vehículo es un sólido,
se representan lo más preferiblemente como supositorios de dosis
unitaria. Los vehículos adecuados incluyen manteca de cacao y otros
materiales usados comúnmente en la técnica, y los supositorios
pueden formarse convenientemente mediante el mezclado del compuesto
activo con el/los vehículo(s) reblandecido(s) o
fundido(s) seguido de enfriamiento y conformado en
moldes.
Las formulaciones adecuadas para su
administración vaginal pueden presentarse como óvulos vaginales,
tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que
contienen además del principio activo, tales vehículos que se
conocen en la técnica como apropiados.
Para la administración intranasal los compuestos
de la invención pueden usarse como un pulverizador líquido o polvo
dispersable o en la forma de gotas.
Las gotas pueden formularse con una base acuosa
o no acuosa que comprende también uno o más agentes dispersantes,
agentes solubilizantes o agentes de suspensión. Los pulverizadores
líquidos se administran convenientemente desde envases
presurizados.
Para su administración mediante inhalación, los
compuestos según la invención se administran convenientemente a
partir de un insuflador, nebulizador o un envase presurizado u otro
medio conveniente de administración de un pulverizador de aerosol.
Los envases presurizados pueden contener un propelente adecuado tal
como diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede
determinarse proporcionando una válvula para administrar una
cantidad medida.
Como alternativa, para su administración
mediante inhalación o insuflación, los compuestos según la invención
pueden tomar la forma de una composición en polvo seca, por ejemplo
una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal
como lactosa o almidón. La composición en polvo seca puede
presentarse en forma de dosificación unitaria en, por ejemplo,
cápsulas o cartuchos o, por ejemplo, gelatina o envases tipo blister
desde los que puede administrarse el polvo con ayuda de un
inhalador o insuflador.
Cuando se desee, pueden emplearse las
formulaciones descritas anteriormente adaptadas para dar la
liberación sostenida del principio activo.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención también pueden contener otros principios activos tales
como agentes antimicrobianos, o conservantes.
Los compuestos de la invención también pueden
usarse en politerapia para evitar la producción de cepas virales
resistentes.
En particular, los compuestos de la invención
también pueden usarse en combinación con otros agentes terapéuticos,
por ejemplo, otros agentes antiinfecciosos. En particular los
compuestos de la invención pueden emplearse junto con agentes
antivirales conocidos.
Por tanto, la invención proporciona, en otro
aspecto, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I)
o un derivado fisiológicamente aceptable del mismo junto con otro
agente terapéuticamente activo, en particular, un agente
antiviral.
Los agentes terapéuticos adecuados para su uso
en tales combinaciones incluyen análogos de nucleósido tales como
3TC^{TM},
3'-azido-3'-desoxitimidina
(AZT), 2',3'-didesoxicitidina (ddC),
2',3'-didesoxiadenosina,
2',3'-didesoxiinosina (ddI),
3'-desoxitimidina,
2',3'-didesoxi-2',3'-didehidrotimidina,
y
2',3'-didesoxi-2',3'-didehidrocitidina
y ribavirina; nucleósidos acíclicos tales como aciclovir,
ganciclovir, interferones tales como interferón alfa, beta y gamma;
inhibidores de la glucuronación tales como probenecid; inhibidores
del transporte de nucleósidos tales como dipiridamol;
inmunomoduladores tales como interleucina II (IL2) y factor
estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos
(GM-CSF), eritropoyetina, ampligen, timomodulina,
timopentina, foscarnet, inhibidores de la glucosilación tales como
2-desoxi-D-glucosa,
castanospermina, 1-desoxinojirimicina; e inhibidores
de la unión del VIH a receptores CD4 tales como CD4 soluble,
fragmentos de CD4, moléculas híbridas de CD4 e inhibidores de la
aspartil proteasa de VIH tales como L-735,524.
Otros agentes terapéuticos adecuados para su uso
en tales combinaciones incluyen también inhibidores de la
transcriptasa inversa no nucleosídicos tales como revirapina, TIBO,
HEPT, BHAP, MKC-422, \alpha-APA,
TSAO, calanolidas, y L-697,661.
Preferiblemente, el otro agente terapéutico se
selecciona de: 3TC^{TM}, AZT, ddC y ddI.
Los componentes individuales de tales
combinaciones pueden administrarse secuencial o bien simultáneamente
en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas.
Las combinaciones a las que se hace referencia
anteriormente pueden presentarse convenientemente para su uso en
forma de una formulación farmacéutica y por tanto las formulaciones
farmacéuticas que comprenden una combinación tal como se definió
anteriormente con un vehículo farmacéuticamente aceptable de las
mismas comprenden otro aspecto de la invención.
Cuando el compuesto de fórmula (I) o un derivado
farmacéuticamente aceptable del mismo se usa en combinación con un
segundo agente terapéutico activo frente al mismo virus, la dosis de
cada compuesto puede ser la misma o bien diferir de aquella cuando
el compuesto se usa solo. Las dosis apropiadas se apreciarán
fácilmente por los expertos en la técnica.
Se apreciará adicionalmente que la cantidad de
un compuesto de la invención y la cantidad del otro agente
terapéutico requerido para su uso en el tratamiento variarán no sólo
con el compuesto particular de la invención y el otro agente
terapéutico seleccionado sino también con la vía de administración,
la naturaleza del estado que está tratándose y la edad y el estado
del paciente y estará en última instancia a discreción del médico
adjunto o veterinario. En general, sin embargo, una dosis adecuada
del compuesto de la invención estará en el intervalo desde
aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 750 mg/kg de peso
corporal por día, tal como de 3 mg a aproximadamente 120 mg por
kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferiblemente en
el intervalo de 6 mg/kg/día a 90 mg/kg/día, lo más preferiblemente
en el intervalo de 15 mg/kg/día a 60 mg/kg/día. Una dosis adecuada
del otro agente terapéutico estará en el intervalo desde
aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 750 mg/kg de peso
corporal por día, tal como de 3 mg a aproximadamente 120 mg por
kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferiblemente en
el intervalo de 6 mg/kg/día a 90 mg/kg/día, lo más preferiblemente
en el intervalo de 15 mg/kg/día a 60 mg/kg/día.
La dosis deseada puede presentarse
convenientemente en una dosis única o como dosis divididas
administradas a intervalos apropiados, por ejemplo como dos, tres,
cuatro o más subdosis por día.
La invención se describirá adicionalmente
mediante los ejemplos siguientes que no pretenden limitar la
invención de ninguna manera. Todas las temperaturas están en grados
Celsius.
(VII)C_{6}H_{5}COOCH_{2}CHO
Se preparó este producto intermedio conocido
mediante la adición por porciones de NaIO_{4} (80 g) a una mezcla
de 1-benzoilglicerol (50 g), CH_{2}Cl_{2} (500
ml), y H_{2}O (25 ml) con agitación vigorosa a temperatura
ambiente. Se agitó la disolución resultante durante 2 horas, se
añadió MgSO_{4} (100 g) y se agitó la disolución durante otros 30
minutos. Se filtró la mezcla, se evaporó el filtrado a vacío y se
destiló el residuo a vacío para dar 26 g de producto puro.
p.e. 92-94º/0,25 mm
^{1}H RMN (200 MHz; TMS como referencia
interna):
8 (ppm en CDCl_{3})
- 9,71 (s, 1H; -CHO)
- 8,11 (d, 2H;-aromático)
- 7,60 (m, 1H; aromático)
- 7,46 (m, 2H; aromático)
- 4,88 (s, 2H; -CH_{2}CHO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó una mezcla de benzoiloxiacetaldehído
(ejemplo 1) (6,21 g), 2-mercaptoetanol (3 ml) y
ácido para-toluensulfónico (0,2 g) en tolueno (150
ml) durante 3 horas a reflujo en condiciones de eliminación de agua
usando un aparato Dean Stark. Se enfrió la mezcla hasta temperatura
ambiente, se lavó en primer lugar con disolución de NaHCO_{3}
acuosa (1 x 50 ml), y después con agua (2,5 ml) y se secó sobre
MgSO_{4}. Se filtró la disolución y se evaporó el filtrado a
presión reducida. Se purificó el residuo sobre gel de sílice usando
hexano:acetato de etilo (9:1) como eluyente. Dio 7,63 g (90%) de
producto puro, que se identificó mediante ^{1}H- y
^{13}C-RMN.
R_{f}: 0,39 (hexano:acetato de etilo)
^{1}H-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 8,03 (m, 2H, aromático)
- 7,53 (m, 1H, aromático)
- 7,39 (m, 2H, aromático)
- 5,41 (dd, 1H, C_{2}-H)
- 4,43 (m, 2H, C_{2}-CH_{2}OCC_{6}H_{5})
- 4,21 (m, 1H, C_{5}-H)
- 3,96 (m, 1H, C_{5}-H)
- 2,98 (m, 2H, C_{4}-H)
^{13}C-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 166,82, 133,74, 130,35, 128,97, 83,58, 71,87, 66,62 y 32,74
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió sal de magnesio del ácido
monoperoxiftálico (MMPP, 28 g) por porciones con agitación vigorosa
a una mezcla de
2-benzoiloximetil-1,3-oxatiolano
(ejemplo 2) (20 g), bromuro de tetrabutilamonio (0,4 g) en cloruro
de metileno (200 ml), y agua (200 ml). Se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante 30 minutos y se recogió la fase
orgánica. Se extrajo la fase acuosa con cloruro de metileno (3 x 75
ml) y se lavó la fase orgánica combinada en primer lugar con agua
(2 x 100 ml), después con disolución de salmuera (100 ml), se secó
sobre MgSO_{4}, y se filtró. Se evaporó el filtrado a vacío y se
purificó el residuo mediante cromatografía sobre gel de sílice
usando acetato de etilo como eluyente para dar 18,5 g (86%) de
producto puro como una mezcla de isómeros cis y trans
en una proporción de 1:2 respectivamente.
m.p.: 70-72º
^{1}H-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 8,05 (m, 2H, aromático, isómero cis)
- 7,95 (m, 2H, aromático, isómero trans)
- 7,56 (m, aromático)
- 7,23 (m, aromático)
- 4,77 (m, 4H, C_{2}-H, C_{5}-H, y C_{2}-CH_{2}OOCC_{6}H_{5})
- 4,43 (m, 1H, C_{5}-H, isómero trans)
- 4,09 (m, 1H, C_{5}-H, isómero cis)
- 3,11 (m, 2H, C_{4}-H, isómero trans)
- 2,75 (m, 2H, C_{4}-H, isómero cis)
^{13}C-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
isómero cis:
- 166,64, 134,02, 130,42, 129,88, 129,06, 96,16, 68,83, 59,47 y 54,30
isómero trans:
- 166,36, 134,12, 130,29, 129,68, 129,15, 108,07, 70,09, 61,83 y 53,47
Se calentó una mezcla de
2-benzoiloximetil-3-oxo-1,3-oxatiolano
(ejemplo 3) (10,5 g), acetato de
tetra-n-butilamonio (17 g) en
anhídrido acético (250 ml) a de 110ºC a 120ºC bajo argón durante 14
horas y se enfrió hasta temperatura ambiente. Se eliminó el
anhídrido acético en exceso a presión reducida. Se disolvió el
residuo en cloruro de metileno (500 ml), se lavó en primer lugar
con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 200 ml), después con disolución
de salmuera (200 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se
evaporó a vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía
sobre gel de sílice usando hexano:acetato de etilo (8:1) como
eluyente para dar 7,4 g (rendimiento del 60%) del producto deseado
como una mezcla de isómeros cis y trans. También se
aisló una pequeña cantidad de cada isómero y se caracterizó
mediante ^{1}H- y ^{13}C-RMN.
Isómero cis:
R_{f}: 0,43 (hexano:EtOAc)
^{1}H-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 8,05 (m, 2H, aromático)
- 7,58 (m, 1H, aromático)
- 7,45 (m, 2H, aromático)
- 6,24 (d, 1H, C_{4}-H)
- 5,50 (t, 1H, C_{2}-H)
- 4,61 (d, 1H, C_{2}-CH_{2}OOCC_{6}H_{5})
- 4,53 (d, 2H, C_{5}-H)
- 3,94 (dd, 1H, C_{5}-H)
- 2,05 (s, 3H, CH_{3})
Isómero trans:
R_{f}: 0,43 (hexano:EtOAc 7:3)
^{1}H-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 8,04 (m, 2H, aromático)
- 7,58 (m, 1H, aromático)
- 7,45 (m, 2H, aromático)
- 6,27 (dd, 1H, C_{4}-H)
- 5,73 (dd, 1H, C_{2}-H)
- 4,53 (dd, 1H, C_{2}-CH_{2}OOCC_{6}H_{5})
- 4,34 (dd, 1H, C_{5}-H)
- 4,26 (dd, 1H, C_{2}-CH_{2}OCC_{6}H_{5})
- 4,20 (dd, 1H, C_{5}-H)
- 2,09 (s, 3H, CH_{3})
^{13}C-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 177,66, 166,37, 133,46, 129,93, 128,60, 83,76, 81,22, 74,33, 64,65 y 20,79
\vskip1.000000\baselineskip
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Se calentó una mezcla de citosina (206 mg),
sulfato de amonio (10 mg) y hexametildisilazano (HMDS, 10 ml) a
reflujo bajo argón hasta que dio como resultado una disolución
transparente. Se evaporaron los reactivos en exceso a vacío y se
eliminaron los compuestos volátiles restantes a alto vacío (15
minutos). Se disolvió el residuo sólido en cloruro de metileno seco
(20 ml) y se añadió una disolución de
2-benzoiloximetil-4-acetoxi-1,3-oxatiolano
(ejemplo 4) (350 mg) en cloruro de metileno seco (20 ml) bajo
argón, seguido de una disolución de cloruro de estaño IV
(SnCl_{4}, 124 ml) en cloruro de metileno (20 ml) a 0ºC. Se agitó
la mezcla de reacción bajo argón durante la noche a temperatura
ambiente, después se calentó a reflujo durante 3 horas y se enfrió
hasta temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla con cloruro de
metileno (100 ml) y se vertió con agitación en NaHCO_{3} acuoso
saturado. Se separó la fase orgánica mediante filtración sobre
celite, se lavó en primer lugar con agua (2 x 75 ml), después con
disolución de salmuera (100 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se
filtró. Se purificó el residuo mediante cromatografía sobre gel de
sílice usando acetato de etilo:CH_{3}OH como el eluyente para dar
140 mg (35%) del producto deseado como una mezcla de isómeros
cis y trans en una proporción de 1:1 tal como se
determinó mediante ^{1}H-RMN. Se separaron estos
isómeros como los derivados de N-acetilo en el
ejemplo siguiente.
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Se agitó una disolución de la mezcla cis
y trans de
2-benzoiloximetil-4-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 5) (135 mg), 4-dimetilaminopiridina (DMAP,
15 mg) y anhídrido acético (44 ml) en piridina seca (10 ml) durante
la noche a temperatura ambiente (16 horas) y se vertió en agua fría
(100 ml), seguido de una extracción con cloruro de metileno (3 x 50
ml). Se lavó el extracto con agua, se secó sobre MgSO_{4}, se
filtró y se evaporó a vacío. Se añadió tolueno al residuo, después
se evaporó a vacío. Se añadió tolueno al residuo, después se
evaporó a vacío y se purificó el aceite residual mediante
cromatografía sobre gel de sílice usando acetato de etilo como
eluyente para dar 65 mg de isómero trans puro como el
producto de movilidad rápida y 60 mg de isómero cis puro
como el producto de movilidad baja. Éstos se caracterizaron mediante
^{1}H y ^{13}C-RMN.
\newpage
Isómero cis:
^{1}H-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 9,61 (b, 1H, C_{4}'-NHCOCH_{3})
- 8,29 (d, 1H, C_{6}'-H)
- 8,06 (m, 2H, aromático)
- 7,65 (m, 1H, aromático)
- 7,51 (m, 2H, aromático)
- 7,25 (d, 1H, C_{5}'-H)
- 6,61 (d, 1H, C_{4}-H)
- 5,50 (t, 1H, C_{2}-H)
- 4,80 (m, 2H, C_{2}-CH_{2}OOCC_{6}H_{5})
- 4,48 (d, 1H, C_{5}-H)
- 4,05 (dd, 1H, C_{5}-H)
- 2,25 (s, 3H, CH_{3})
^{13}C-RMN: \delta (ppm en
CDCl_{3})
- 170,93, 166,28, 162,80, 155,76, 146,06, 133,91, 129,90, 128,84, 97,45, 85,88, 78,25, 64,60, 63,53 y 24,71.
Isómero trans:
^{1}H-RMN: \delta (ppm
en\cdotDMSO d_{6})
- 10,88 (s, 1H, C_{4}'-NHCOCH_{3})
- 8,13 (d, 1H, C_{6}'-H)
- 7,96 (m, 2H, aromático)
- 7,68 (m, 1H, aromático)
- 7,52 (m, 2H, aromático)
- 7,20 (d, 1H, C_{5}'-H)
- 6,35 (d, 1H, C_{4}-H)
- 5,96 (dd, 1H, C_{2}-H)
- 4,58 (dd, 1H, C_{2}-CH_{2}OOCC_{6}H_{5})
- 4,44 (d, 1H, C_{5}-H)
- 4,29 (m, 2H, C_{5}-H y CH_{2}OOCC_{6}H_{5})
- 2,07 (s, 3H, CH_{3})
^{13}C-RMN: \delta (ppm en
DMSO d_{6})
- 171,53, 165,84, 162,76, 155,21, 146,59, 134,00, 129,64, 129,23, 96,54, 83,78, 74,24, 64,58, 64,01 y 24,35
Se agitó una disolución de
cis-2-benzoiloximetil-4(N4'-acetil-citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 6) (54 mg) en amoniaco metanólico (50 ml) durante la noche
a temperatura ambiente (16 horas). Se evaporó el disolvente a vacío
y se trató el residuo con éter dando 37 mg (90%) del producto
deseado. Se caracterizó después el producto mediante ^{1}H y
^{13}C-RMN. p.f.: 213-215ºC
UV: (CH_{3}OH) Lamda máx: 270 nm
^{1}H-RMN: \delta (ppm en,
DMSO d_{6})
- 7,85 (d, 1H, C_{6}'-H)
- 7,16 (d, 2H, C_{4}'-NH_{2})
- 6,34 (d, 1H, C_{4}-H)
- 5,76 (d, 1H, C_{5}'-H)
- 5,31 (t, 1H, C_{2}-CH_{2}OH)
- 5,18 (t, 1H, C_{2}-H)
- 4,40 (d, 1H, C_{5}-H)
- 3,92 (dd, 1H, C_{5}-H)
- 3,78 (m, 2H, C_{2}-CH_{2}OH)
^{13}C-RMN: \delta (ppm en
DMSO d_{6})
- 165,95, 155,74, 142,39, 94,98, 88,85, 77,29, 62,91 y 62,48
Se agitó una disolución de
trans-2-benzoiloximetil-4-(N4'-acetil-citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 6) (63 mg) en amoniaco metanólico (50 ml) durante la noche
a temperatura ambiente (16 horas). Se eliminó el disolvente a vacío
y se solidificó el residuo con éter para dar 36 mg (93%) del
producto deseado que se caracterizó mediante ^{1}H y
^{13}C-RMN.
p.f.: 175-177ºC
UV: (CH_{3}OH) Lamda máx: 270 nm
^{1}H-RMN: \delta (ppm en
DMSO d_{6})
- 7,67 (d, 1H, C_{6}'-H)
- 7,19 (d, 2H, C_{4}'-NH_{2})
- 6,30 (d, 1H, C_{4}-H)
- 5,77 (d, 1H, C_{5}'-H)
- 5,56 (t, 1H, C_{2}-CH_{2}OH)
- 5,23 (t, 1H, C_{2}-H)
- 4,18 (m, 2H, C_{5}-H)
- 3,61 (m, 1H, C_{2}-CH_{2}OH)
- 3,36 (m, 1H, C_{2}-CH_{2}OH)
^{13}C-RMN: \delta (ppm en
DMSO d_{6})
- 166,00, 155,65, 142,30, 95,11, 87,52, 74,52, 63,42 y 62,86
Se disolvió
2-benzoiloximetil-1,3-oxatiolano
(ejemplo 2) (0,4 g, 1,78 mmol) en 200 ml de benceno seco
desgasificado bajo una corriente de argón. Se añadió a esta
disolución peróxido de benzoílo (0,863 g, 3,56 mmol) y catalizador
AIBN (15 mg, 0,09 mmol, al 5%) en una porción. Se sometió a reflujo
la mezcla resultante durante 4 horas bajo argón. Después se eliminó
el disolvente a alto vacío, y se disolvió el residuo en
diclorometano (40 ml), se extrajo 2X con una disolución de
bicarbonato de sodio al 10% (15 ml) y se secó sobre MgSO_{4}. La
evaporación de diclorometano a presión reducida y la purificación
del residuo en columna de gel de sílice usando acetato de etilo;
hexano (30%) como eluyente proporcionaron la mezcla pura del
derivado cis- y trans-1,3-oxatiolano
como un aceite incoloro (264 mg, 0,76 mmol, rendimiento del 43%). Se
separó el isómero trans como un sólido blanco p.f.
60-62ºC. Se caracterizó completamente esta mezcla
mediante espectro de ^{1}H, y ^{13}C RMN. Rf= 0,43 (acetato de
etilo:hexanos 1:4).
^{1}H RMN \delta (ppm en CDCl_{3}): 8,07
(m, 2H, aromático), 7,59 (m, 1H, aromático), 7,56 (m, 2H,
aromático), 6,51 (t, 1H, C_{4}-H), 5,79 (m, 1H,
C_{2}-H), 4,63 (m, 2H,
CH_{2}-OCOPh), 4,32 (m, 2H,
C_{5}-H). ^{13}C RMN \delta (ppm en
CDCl_{3}): 166,56, 166,36, 134,12, 133,78, 130,35, 129,04, 84,40,
82,53, 75,04, 65,33, 39,89, 25,43, 23,93.
Se calentó 5-fluorocitosina (700
mg, 5,4 mmol) a reflujo HMDS
(1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano, 30 ml) que
contiene una cantidad catalítica de sulfato de amonio (20 mg)
durante la noche (16 h). Se evaporó la disolución transparente
hasta sequedad a presión reducida y se disolvió el residuo en
cloruro de metileno seco (50 ml). Se añadió a esta disolución a
través de una cánula una mezcla de
2-benzoiloximetil-4-benzoiloxi-1,3-oxatiolano
(ejemplo 8) (1,25 g, 3,63 mmol) en cloruro de metileno seco (50
ml), seguido de la adición de tetracloruro de estaño (4 ml de
disolución 1 M en cloruro de metileno). Se agitó la mezcla de
reacción bajo atmósfera de argón a temperatura ambiente durante 16
h y se calentó a reflujo durante 1 h. Tras el enfriamiento hasta
temperatura ambiente, se vertió la mezcla en disolución de
NaHCO_{3} acuosa saturada (150 ml), se agitó durante 15 min. y se
filtró sobre celite. Se recogió la fase orgánica. Se extrajo
adicionalmente la disolución acuosa con cloruro de metileno (2 x
100 ml). Se lavó la fase orgánica combinada dos veces con agua (2 x
150 ml), una vez con disolución de salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4}, y se filtró. Se eliminó el disolvente a presión
reducida. El residuo contenía dos compuestos en una proporción de
2:3 para los isómeros cis y trans y se purificó sobre
gel de sílice usando acetato de etilo-metanol 95:5
como eluyente para dar 280 mg de isómero cis y 420 mg de
isómero trans para un rendimiento total del 53%.
Isómeros cis:
p.f.: 235-236ºC (desc.).
R_{f}.: 0,36 (EtOAc:MeOH 9:1)
^{1}H-RMN (300 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta en ppm: 7,94 (m, 2H,
aromático), 7,80 (d, 2H, H-6' y 1H de NH_{2} por
debajo, JH-F=6,8Hz), 7,68 (m, 1H, aromático), 7,58
(b, 1H de NH_{2}), 7,47 (m, 2H, aromático), 6,28 (d, 1H,
H-4, J=3,0 Hz), 5,51 (t, 1H,
H-2,J=3,8 Hz), 4,73 (m, 2H, -CH_{2}OBz), 4,61 (d,
1H, H-5, J=11 Hz) y 3,98 (dd, 1H,
H-5, J=4,7 y 11 Hz).
p.f.: 235-236ºC (desc.).
^{1}H-RMN (300 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta en ppm: 7,97 (m, 2H,
aromático), 7,81 (d, 2H, H-6' y 1H de NH_{2} por
debajo, J_{H-F}=7,1 Hz), 7,66 (m, 1H, aromático),
7,55 (m, 3H, 2H de compuesto aromático y 1H de NH_{2}), 6,32 (d,
1H, H-4, J=4,8 Hz), 6,02 (dd, 1H,
H-2, J=3,2 y 8,5 Hz), 4,55 (dd, 1H, -CH_{2}OBz,
J=8,4 y 11,9 Hz), 4,38 (d, 1H, H-5, J=10,2 Hz) y
4,26 (dd, 2H, 1H de H-5 y 1H de -CH_{2}OBz, J=3,6
y 10,5 Hz).
Se disolvió
cis-2-benzoiloximetil-4-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 9) (75 mg, 0,21 mmol) en amoniaco metanólico (25 ml). Se
agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 16 h y se eliminaron
los disolventes a presión reducida. Se trituró el residuo con éter
(2 x 20 ml). Se recristalizó el sólido restante en etanol-éter para
dar el compuesto deseado (43 mg) con un rendimiento del 80%.
P.f.: >210ºC (desc.)
R_{f}: 0,41 (EtOAc:MeOH 4:1)
UV: \lambda_{máx} (H_{2}O): 284 nm
^{1}H-RMN (300 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta en ppm: 8,14 (d, 1H,
H-6', JH-F=7,1 Hz), 7,79 (sa, 1H,
NH_{2}, D_{2}O intercambiable), 7,56 (sa, 1H, NH_{2}, D_{2}O
intercambiable), 6,28 (d, 1H, H-4, J=2,6 Hz), 5,44
(t, 1H, OH, D_{2}O intercambiable), 5,18 (t, 1H,
H-2,J=5,5 Hz), 4,44 (d, 1H, H-5,
J=10,5 Hz), 3,91 (dd, 1H, H-5, J=4,6 y 10,6 Hz), y
3,78 (m, 2H, CH_{2}OH).
Se añadió a una mezcla de
(1'R,2'S,5'R)-mentil-5S-acetoxi-1,3-oxatiolan-2S-carboxilato
(documento WO 92/
20669, incorporado de este modo por referencia) (1,0 g, 3,03 mmol) y trietilsilano (4,84 ml, 30,3 mmol) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,584 ml, 3,03 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h y después se diluyó con diclorometano (150 ml), se lavó con disolución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró.
20669, incorporado de este modo por referencia) (1,0 g, 3,03 mmol) y trietilsilano (4,84 ml, 30,3 mmol) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,584 ml, 3,03 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h y después se diluyó con diclorometano (150 ml), se lavó con disolución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró.
La cromatografía (Hexano-EtOAc,
6:1) del producto bruto dio el producto (0,71 g, 87%) como un aceite
incoloro: ^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta
0,45-2,10 (m, 17H), 2,96-3,20 (m,
2H), 4,20-4,40 (m, 2H), 4,72 (dt, 1H), 5,45 (s, 1H)
; [\alpha]_{D}^{25}-102,9º (c, 1,02,
CHCl_{3}).
Se añadió a una mezcla de
(1'R,2'S,5'R)-mentil-5S-acetoxi-1,3-oxatiolan-2R-carboxilato
(documento WO 92/
20669) (0,50 g, 1,51 mmol) y trietilsilano (2,42 ml, 15,1 mmol) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,29 ml, 1,51 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h y después se diluyó con diclorometano (125 ml), se lavó con disolución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La cromatografía (Hexano-EtOAc, 6:1) del producto bruto dio el producto (0,369 g, 86%) como un aceite incoloro: ^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta 0,40-2,10 (m, 17H), 2,98-3,19 (m, 2H), 4,20-4,40 (m, 2H), 4,72 (dt, 1H), 5,46 (s, 1H).
20669) (0,50 g, 1,51 mmol) y trietilsilano (2,42 ml, 15,1 mmol) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,29 ml, 1,51 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h y después se diluyó con diclorometano (125 ml), se lavó con disolución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La cromatografía (Hexano-EtOAc, 6:1) del producto bruto dio el producto (0,369 g, 86%) como un aceite incoloro: ^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta 0,40-2,10 (m, 17H), 2,98-3,19 (m, 2H), 4,20-4,40 (m, 2H), 4,72 (dt, 1H), 5,46 (s, 1H).
Se añadieron a una disolución de
(1'R,2'S,5'R)-mentil-1,3-oxatiolan-2R-carboxilato
(ejemplo 12) (3,23 g, 11,9 mmol) en etanol anhidro (20 ml) a 0ºC
bajo una atmósfera de argón, borohidruro de sodio (1,12 g, 29,7
mmol) y metanol anhidro (0,916 ml, 47,6 mmol). Se agitó la mezcla
de reacción a 0ºC durante 1 h y se dejó calentar hasta temperatura
ambiente y se agitó durante 12 h. Después se extinguió la reacción
con ácido acético y se eliminó el disolvente a vacío. Se diluyó el
residuo obtenido con diclorometano (225 ml), se lavó con agua,
salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La
cromatografía (Hexano-Et_{2}O, 1:1) del producto
bruto dio el producto (1,30 g, 91%) como un aceite incoloro: ^{1}H
RMN en CDCl_{3} \delta 2,85-2,97 (m, 2H), 3,58
(dd, 1H, J=12,2, 5,4 Hz), 3,66 (dd, 1H, J=12,2, 3,3 Hz),
3,75-3,85 (m, 1H), 4,14-4,25 (m,
1H), 5,16 (dd, 1H, J=5,4, 3,3 Hz).
Se añadieron a una disolución de
(1'R,2'S,5'R)-mentiil-1,3-oxatiolan-2S-carboxilato
(ejemplo 11) (1,16 g, 4,26 mmol) en etanol anhidro (10 ml) a 0ºC
bajo una atmósfera de argón, borohiduro de sodio (0,403 g, 10,7
mmol) y metanol anhidro (0,690 ml, 17,03 mmol). Se agitó la mezcla
de reacción a 0ºC durante 1 h y se dejó calentar hasta temperatura
ambiente y se agitó durante 12 h. Después se extinguió la reacción
con ácido acético y se eliminó el disolvente a vacío. Se diluyó el
residuo obtenido con diclorometano (150 ml), se lavó con agua,
salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La
cromatografía (Hexano-Et_{2}O, 1:1) del producto
bruto dio el producto (0,47 g, 92%) como un aceite incoloro: ^{1}H
RMN en CDCl_{3} : \delta 2,85-2,99 (m, 2H),
3,60 (dd, 1H, J=12,2, 5,5 Hz), 3,65 (dd, 1H, J=12,2, 3,3 Hz),
3,80-3,90 (m, 1H), 4,20-4,30 (m,
1H), 5,15 (dd, 1H, J=5,5, 3,3 Hz); [\alpha]_{D}^{25} -
35,6º (c, 1,25, CHCl_{3}).
Se añadió a una disolución de
2S-hidroximetil-1,3-oxatiolano
(ejemplo 14) (0,63 g, 5,3 mmol), imidazol (0,71 g, 10,4 mmol) en
tetrahidrofurano (15 ml) a 0ºC bajo una atmósfera de argón una
disolución de cloruro de t-butildifenilsililo (2,16
g, 7,9 mmol) en tetrahidrofurano (8 ml). Se dejó calentar la mezcla
de reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12 h,
después se diluyó con diclorometano (125 ml). Se lavó la fase
orgánica con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se
concentró. La cromatografía (Hexano-EtOAc, 6:1) del
producto bruto dio el producto (1,87 g, 99%) como un aceite
incoloro: ^{1}H RMN en CDCl_{3} : \delta 1,08 (s, 9H),
2,93-2,99 (m, 2H), 3,70 (dd, 1H, J=10,9, 4,6 Hz),
3,86 (dd, 1H, J=10,9, 6,4 Hz), 3,94-4,15 (m, 2H),
5,29 (dd, 1H, J=6,4, 4,6 Hz), 7,35-7,50 (m, 6H),
7,68-7,75 (m, 4H),
[\alpha]_{D}^{25}-23,3º (c, 1,0,
CHCl_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió a una disolución de
2R-hidroximetil-1,3-oxatiolano
(ejemplo 13) (1,30 g, 10,8 mmol), imidazol (1,47 g, 21,6 mmol) en
tetrahidrofurano (30 ml) a 0ºC bajo una atmósfera de argón una
disolución de cloruro de t-butildifenilsililo (4,46
g, 16,2 mmol) en tetrahidrofurano (15 ml). Se dejó calentar la
mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12
h, después se diluyó con diclorometano (150 ml). Se lavó la fase
orgánica con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se
concentró. La cromatografía (Hexano-EtOAc, 6:1) del
producto bruto dio el producto (3,64 g, 94%) como un aceite
incoloro: ^{1}H RMN en CDCl_{3} : \delta 1,04 (s, 9H),
2,89-2,99 (m, 2H), 3,65 (dd, 1H, J=10,9, 4,6 Hz),
3,88 (dd, 1H, J=10,9, 6,4 Hz), 3,90-4,14 (m, 2H),
5,27 (dd, 1H, J=6,4, 4,6 Hz), 7,34-7,46 (m, 6H),
7,64-7,74 (m, 4H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido metacloroperbenzoico sólido
(MCPBA) (0,23 g, 80%, 1,06 mmol) a una disolución agitada de
2R-t-butildifenilsiloximetil-1,3-oxatiolano
(ejemplo 16) (0,32 g, 0,89 mmol) en diclorometano (20 ml) a 0ºC. Se
agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 2 h y después se diluyó
con diclorometano (150 ml), se lavó con disolución de
Na_{2}CO_{3} acuosa saturada, agua, salmuera, se secó sobre
sulfato de sodio y se concentró. La cromatografía del producto bruto
dio una mezcla de sulfóxidos. Después se calentó la mezcla del
sulfóxido obtenido, anhídrido acético (10 ml), acetato de
tetrabutilamonio (0,32 g, 1,06 mmol) a 120ºC durante 6 h y se
eliminó el anhídrido acético en exceso a vacío. Se diluyó el
residuo en diclorometano (150 ml), se lavó con agua, salmuera, se
secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La cromatografía del
producto bruto dio una mezcla de acetato (0,164 g, 45%) como un
aceite incoloro: ^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta 1,05 (s, 9H),
2,03 (s, 1,35H), 2,08 (s, 1,65H), 3,60-4,50 (m,
4H), 5,28 (t, 0,45H, J=5,4 Hz), 5,55 (dd, 0,55H, J=6,5, 4,7
Hz),6,14-6,20 (m, 1H), 7,30-7,50 (m,
6H), 7,60-7,78 (m, 4H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió MCPBA sólido (0,85 g, 80%, 3,9 mmol) a
una disolución agitada de
2S-t-butildifenilsiloximetil-1,3-oxatiolano
(ejemplo 15) (1,35 g, 3,9 mmol) en diclorometano (30 ml) a 0ºC. Se
agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 2 h y después se diluyó
con diclorometano (225 ml), se lavó con disolución de
Na_{2}CO_{3} acuosa saturada, agua, salmuera, se secó sobre
sulfato de sodio y se concentró. La cromatografía del producto bruto
dio una mezcla de sulfóxidos. Después se calentó la mezcla del
sulfóxido obtenido, anhídrido acético (15 ml), acetato de
tetrabutilamonio (1,19 g, 3,9 mmol) a 120ºC durante 6 h y se eliminó
el anhídrido acético en exceso a vacío. Se diluyó el residuo con
diclorometano (200 ml), se lavó con agua, salmuera, se secó sobre
sulfato de sodio y se concentró. La cromatografía del producto
bruto dio una mezcla de acetato (0,601 g, el 40%) como un aceite
incoloro: ^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta 1,10 (s, 9H), 2,05 (s,
1,2H), 2,10 (s, 1,8H), 3,60-4,50 (m, 4H), 5,30 (t,
0,4H, J=5,5 Hz), 5,58 (dd, 0,6H, J=6,5, 4,8 Hz),
6,14-6,23 (m, 1H), 7,33-7,50 (m,
6H), 7,65-7,78 (m, 4H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 2,6-lutidina (0,054
ml, 0,49 mmol) y trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,095
ml, 0,49 mmol) a una suspensión de
N-4'-acetilcitosina (0,045 g, 0,29
mmol) en dicloroetano (2 ml) a temperatura ambiente bajo atmósfera
de argón. Se agitó la mezcla durante 15 min y se introdujeron la
mezcla de cis y trans
2R-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-1,3-oxatiolano
(ejemplo 17) (0,100 g, 0,25 mmol) en dicloroetano (2 ml) y
trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,048 ml, 0,25 mmol)
sucesivamente. Se calentó la mezcla de reacción a reflujo durante
media hora y se diluyó con diclorometano, se lavó con disolución de
NaHCO_{3} acuosa saturada, agua, salmuera, se secó sobre sulfato
de sodio y se concentró. La cromatografía del producto bruto dio
una mezcla de isómero trans y cis que se sometió a
separación por TLC preparativa para dar isómero cis (33 mg,
el 26%) [^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta 1,08 (s, 9H), 2,22 (s,
3H), 3,85-4,45 (m, 4H), 5,26 (t, 1H, J=4,3 Hz),
6,54 (d, 1H, J=4,2 Hz), 7,21 (d,1H, J=7,4 Hz),
7,35-7,50 (m, 6H),7,60-7,75 (m,
4H), 8,23 (d, 1H, J=7,4 Hz), 9,02 (sa,1H)] e isómero trans
(49 mg, el 39%) [^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta 1,04 (s, 9H),
2,21 (s, 3H), 3,56-4,26 (m, 4H), 5,64 (dd, 1H,
J=6,8, 4,4 Hz), 6,39 (d, 1H, J=3,6 Hz), 7,31-7,48
(m, 7H), 7,58-7,71 (m, 4H), 8,01 (d, 1H, J=7,4 Hz),
8,86 (sa, 1H)].
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 2,6-lutidina (0,131
ml, 1,13 mmol) y trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,218
ml, 1,13 mmol) a una suspensión de
N-4'-acetilcitosina (0,104 g, 0,68
mmol) en dicloroetano (2 ml) a temperatura ambiente bajo atmósfera
de argón. Se agitó la mezcla durante 15 min y se introdujeron la
mezcla de cis y trans
2S-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-1,3-oxatiolano
(ejemplo 18) (0,235 g 0,56 mmol) en dicloroetano (2 ml) y
trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,109 ml, 1,13 mmol)
sucesivamente. Se calentó la mezcla de reacción a reflujo durante
media hora y se diluyó con diclorometano, se lavó con disolución de
NaHCO_{3} acuosa saturada, agua, salmuera, se secó sobre sulfato
de sodio y se concentró. La cromatografía (EtOAc) del producto
bruto dio una mezcla de isómero trans y cis (0,225 g,
el 78%): ^{1}H RMN en CDCl_{3}: \delta 1,05 (s, 5,4H), 1,08
(s, 3,6H), 2,24 (s, 1,2H), 2,28 (s, 1,8H), 3,67-4,42
(m, 4H), 5,26 (t, 0,4H, J=4,3 Hz), 5,64 (dd, 0,6H, J=6,8, 4,3 Hz),
6,40 (d, 0,6H, J=3,8 Hz), 6,53 (d, 0,4H, J=4, Hz),
7,20-7,75 (m,11H), 8,00 (d, 0,6H, J=7,5 Hz), 8,21
(d, 0,4H, J=7,5 Hz), 9,63 (sa, 1H).
Se añadieron 2,6-lutidina (0,124
ml, 1,07 mmol) y trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,207
ml, 1,07 mmol) a una suspensión de
N-4'-acetil-5'-fluorocitosina
(0,110 g, 0,64 mmol) en dicloroetano (3 ml) a temperatura ambiente
bajo atmósfera de argón. Se agitó la mezcla durante 15 min y se
introdujeron la mezcla de cis y trans
2R-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-1,3-oxatiolano
(ejemplo 17) (0,223 g, 0,54 mmol) en dicloroetano (3 ml) y
trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,103 ml, 0,54 mmol)
sucesivamente. Se calentó la mezcla de reacción a reflujo durante
media hora y se diluyó con diclorometano, se lavó con disolución de
NaHCO_{3} acuosa saturada, agua, salmuera, se secó sobre sulfato
de sodio y se concentró. La cromatografía del producto bruto dio
una mezcla de isómero trans y cis que se sometió a
separación por TLC preparativa para dar isómero cis (97 mg,
el 34%) [^{1}H RMN en CDCl_{3} \delta 1,08 (s, 9H), 2,65 (s,
3H), 3,90-4,50 (m, 4H), 5,27 (t, J=4,2 Hz), 6,53
(d, 1H, J=4,2 Hz), 7,32-7,530 (m, 6H),
7,55-7,76 (m, 4H), 8,21 (d, 1H, J=6,1 Hz)] e
isómero trans (68 mg, el 24%) [^{1}H RMN en CDCl_{3}
\delta 1,07 (s, 9H), 2,63 (s, 3H), 3,56-4,26 (m,
4H), 5,68 (dd, J=6,9, 4,4 Hz), 6,37 (d, 1H, J=2,4 Hz),
7,30-7,53 (m, 6H), 7,57-7,75 (m,
4H), 7,93 (d, 1H, J=6,1 Hz)].
Se añadieron 2,6-lutidina (0,248
ml, 2,13 mmol) y trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,418
ml, 2,13 mmol) a una suspensión de
N-4'-acetil-5'-fluorocitosina
(0,218 g, 1,27 mmol) en dicloroetano (4,5 ml) a temperatura
ambiente bajo atmósfera de argón. Se agitó la mezcla durante 15 min
y se introdujeron la mezcla de cis y trans
2S-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-1,3-oxatiolano
(ejemplo 18) (0,433 g, 1,06 mmol) en dicloroetano (4 ml) y
trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,206 ml, 1,06 mmol)
sucesivamente. Se calentó la mezcla de reacción a reflujo durante
media hora y se diluyó con diclorometano, se lavó con disolución de
NaHCO_{3} acuosa saturada, agua, salmuera, se secó sobre sulfato
de sodio y se concentró. La cromatografía del producto bruto dio
una mezcla de isómero trans y cis que se sometió a
separación por TLC preparativa para dar isómero cis (145 mg,
el 26%) [^{1}H RMN en CDCl_{3} \delta 1,09 (s, 9H), 2,66 (s,
3H), 3,90-4,50 (m, 4H), 5,26 (t, J=4,1 Hz), 6,53
(d, 1H, J=4,1 Hz), 7,36-7,50 (m, 6H),
7,55-7,78 (m, 4H), 8,20 (d,1H, J=6,1 Hz)] e isómero
trans (119 mg, el 21%) [^{1}H RMN en CDCl_{3} \delta
1,07 (s, 9H), 2,64 (s, 3H), 3,58-4,25 (m, 4H), 5,68
(dd, J=6,8, 4,2 Hz), 6,37 (d, 1H, J=2,7 Hz),
7,35-7,51 (m, 6H), 7,60-7,76 (m,
4H), 7,93 (d, 1H, J=6,1 Hz)].
Se añadieron lentamente a una disolución de
2R-t-butildifenilsiloximetil-4R-(N-4'-acetilcitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 19) (72 mg, 0,14 mmol) en THF (3 ml) a temperatura
ambiente bajo una atmósfera de argón una disolución de fluoruro de
tetrabutilamonio (0,212 ml, 1 M en THF, 0,21 mmol) y ácido acético
glacial (0,012 ml, 0,21 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción
durante 1 h, seguido de la adición de gel de sílice (0,5 g). Se
sometió la suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna
de gel de sílice (EtOAc-MeOH, 9:1) para dar el
producto desililado. Se disolvió el producto desililado en
disolución de metanol y K_{2}CO_{3} saturada y se agitó la
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante media hora. Se
neutralizó la mezcla de reacción con disolución de HCl 1N/metanol
seguido de la adición de gel de sílice (0,5 g). Se sometió la
suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna de gel de
sílice (EtOAc-MeOH, 4:1) para proporcionar el
producto (27 mg, el 91%) como un sólido blando que se trituró en
Et_{2}O-MeOH: p.f. 200ºC (desc.);
[\alpha]_{D}^{25}-126,8º (c, 0,5,
MeOH); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta
3,70-3,82 (m, 2H), 3,91 (dd, 1H, J=10,4, 4,6 Hz),
4,38 (d, 1H, J=10,4 Hz), 5,16 (t, 1H, J=4,6 Hz), 5,32 (t, 1H, J=5,8
Hz), 5,75 (d, 1H, J=7,4 Hz), 6,32 (d,1H, J=4,6 Hz), 7,12 (sa, 1H),
7,23 (sa, 1H), 7,84 (d, 1H, J=7,4 Hz); ^{13}C RMN
(DMSO-d_{6}):\delta 62,7, 63,1, 77,4, 89,0,
95,6, 142,4, 155,4, 165,8.
Con el fin de evaluar la pureza enantiomérica
del producto nucleosídico final sintetizado o de resolver la mezcla
racémica de los análogos de nucleósido desprotegidos, se usaron
procedimientos de HPLC quiral. Por ejemplo, se encontró que el
compuesto nº 1 anterior tenía un tiempo de retención de 43,88 min en
las condiciones siguientes:
- Tipo de columna:
- cyclobond^{TM} RSP 4,6x250 nm
- Caudal:
- 0,27 ml/min
- Disolvente:
- TFAA al 0,05%, pH 7,0
- Detección:
- 254 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron lentamente a una disolución de
2S-t-butildifenilsiloximetil-4S-(N-4'-acetilcitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 20) (202 mg, 0,40 mmol) en THF (3,5 ml) a temperatura
ambiente bajo una atmósfera de argón una disolución de fluoruro de
tetrabutilamonio (0,595 ml, 1 M en THF, 0,60 mmol) y ácido acético
glacial (0,034 ml, 0,60 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción
durante 1 h, seguido de la adición de gel de sílice (0,9 g). Se
sometió la suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna
de gel de sílice (EtOAc-MeOH, 9:1) para dar el
producto desililado. Se disolvió el producto desililado en
disolución de metanol y K_{2}CO_{3} saturada y se agitó la
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante media hora. Se
neutralizó la mezcla de reacción con disolución de metanol y HCl 1N
seguido de la adición de gel de sílice (0,9 g). Se sometió la
suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna de gel de
sílice (EtOAc-MeOH, 4:1) para proporcionar el
producto (74 mg, el 81%) como un sólido blanco que se trituró en
Et_{2}O-MeOH: p.f. 220ºC (desc.);
[\alpha]_{D}^{25} +118,6º (c, 0,5, MeOH); ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 3,70-3,82
(m, 2H), 3,92 (dd, 1H, J=10,6, 4,6 Hz), 4,38 (d, 1H, J=10,6 Hz),
5,17 (t, 1H, J=4,5 Hz), 5,32 (t,1H, J=5,8 Hz), 5,75 (d, 1H, J=7,4
Hz), 6,32 (d,1H, J=4,6 Hz), 7,12 (sa, 1H), 7,22 (sa, 1H), 7,85
(d,1H, J=7,4 Hz); ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}):
\delta 63,0, 63,1, 77,4, 88,9, 95,1, 142,4, 155,4, 165,7.
Con el fin de evaluar la pureza enantiomérica
del producto nucleosídico final sintetizado o de resolver la mezcla
racémica de los análogos de nucleósido desprotegidos, se usaron
procedimientos de HPLC quiral. Por ejemplo, se encontró que el
compuesto nº 2 tenía un tiempo de retención de 48,18 min en las
condiciones siguientes:
- Tipo de columna:
- cyclobond^{TM} RSP 4,6x250 nm
- Caudal:
- 0,27 ml/min
- Disolvente:
- TFAA al 0,05%, pH 7,0
- Detección:
- 254 nm
Se añadieron lentamente a una disolución de
2R-t-butildifenilsiloximetil-4R-(N-4'-acetil-5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 21) (152 mg, 0,29 mmol) en THF (3,5 ml) a temperatura
ambiente bajo una atmósfera de argón una disolución de fluoruro de
tetrabutilamonio (0,432 ml, 1 M en THF, 0,43 mmol) y ácido acético
glacial (0,025 ml, 0,43 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción
durante 1 h, seguido de la adición de gel de sílice (0,5 g). Se
sometió la suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna
de gel de sílice (EtOAc-MeOH, 9:1) para dar el
producto desililado. Se disolvió el producto desililado en
disolución de metanol y K_{2}CO_{3} saturada y se agitó la
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante media hora. Se
neutralizó la mezcla de reacción con disolución de metanol y HCl 1N
seguido de la adición de gel de sílice (0,5 g). Se sometió la
suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna de gel de
sílice (EtOAc-MeOH, 4:1) para proporcionar el
producto (58 mg, el 81%) como un sólido blanco que se trituró en
Et_{2}O-MeOH: p.f. 183ºC (desc.);
[\alpha]_{D}^{25} -86,5º (c, 0,57, MeOH); ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 3,70-4,50
(m, 4H), 5,18 (t, 1H, J=3,6 Hz), 5,44 (t, 1H, J=5,8 Hz),
6,25-6,30 (m,1H), 7,56 (sa, 1H), 7,80 (sa, 1H), 8,14
(d, 1H, J=7,2 Hz); ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}):
\delta 62,2, 63,4, 77,5, 88,9, 126,7, 127,1, 134,7, 137,9, 153,8,
157,6, 157,7.
Con el fin de evaluar la pureza enantiomérica
del producto nucleosídico final sintetizado o de resolver la mezcla
racémica de los análogos de nucleósido desprotegidos, se usaron
procedimientos de HPLC quiral. Por ejemplo, se encontró que el
compuesto nº 3 anterior tenía un tiempo de retención de 16,73 min en
las condiciones siguientes:
- Tipo de columna:
- cyclobond^{TM} RSP 4,6x250 nm
- Caudal:
- 0,43 ml/min
- Disolvente:
- TFAA al 0,05%, pH 7,0
- Detección:
- 254 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron lentamente a una disolución de
2S-t-butildifenilsiloximetil-4S-(N-4'-acetil-5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(ejemplo 22) (78 mg, 0,15 mmol) en THF (3 ml) a temperatura
ambiente bajo una atmósfera de argón una disolución de fluoruro de
tetrabutilamonio (0,222 ml, 1 M en THF, 0,22 mmol) y ácido acético
glacial (0,013 ml, 0,22 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción
durante 1 h, seguido de la adición de gel de sílice (0,5 g). Se
sometió la suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna
de gel de sílice (EtOAc-MeOH, 9:1) para dar el
producto desililado. Se disolvió el producto desililado en
disolución de metanol y K_{2}CO_{3} saturada y se agitó la
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante media hora. Se
neutralizó la mezcla de reacción con disolución de metanol y HCl 1
N seguido de la adición de gel de sílice (0,5 g). Se sometió la
suspensión acuosa resultante a cromatografía en columna de gel de
sílice (EtOAc-MeOH, 4:1) para proporcionar el
producto (36 mg, el 98%) como un sólido blanco que se trituró en
Et_{2}O-MeOH: p.f. 180ºC (desc.);
[\alpha]_{D}^{25} +75,7º (c, 0,56, MeOH); ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 3,69-4,50
(m, 4H), 5,18 (t, 1H, J=3,7 Hz), 5,44 (t, 1H, J=5,8 Hz),
6,25-6,29 (m,1H), 7,55 (sa, 1H), 7,8 (sa, 1H), 8,14
(d,1H, J=7,2 Hz); ^{13}C RMN (DMSO-d_{6}):
61,8, 63,1, 77,1, 88,6, 126,3, 126,8, 134,4, 137,6, 153,5, 157,1,
157,3.
Con el fin de evaluar la pureza enantiomérica
del producto nucleosídico final sintetizado o de resolver la mezcla
racémica de los análogos de nucleósido desprotegidos, se usaron
procedimientos de HPLC quiral. Por ejemplo, se encontró que el
compuesto nº 4 anterior tenía un tiempo de retención de 15,07 min en
las condiciones siguientes:
- Tipo de columna:
- cyclobond^{TM} RSP 4,6x250 nm
- Caudal:
- 0,43 ml/min
- Disolvente:
- TFAA al 0,05%, pH 7,0
- Detección:
- 254 nm
Se determinó actividad antiviral
anti-VIH-1 en células
MT-4 y células MT-4 que se habían
hecho resistentes frente a 3TC^{TM}. Se infectó una suspensión de
células (aproximadamente 10^{6} células/ml) en medio de
crecimiento RPMI 1640 con la cepa RF de VIH-1 a una
M.O.I. de 10^{-3} unidades infecciosas/célula. Se preparó una
suspensión de células no infectadas en paralelo para evaluar la
toxicidad inducida por el fármaco. Se incubaron las dos
suspensiones durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se diluyeron
en serie los compuestos de prueba en decrementos de 10 veces desde
100 \mug/ml hasta 0,01 \mug/ml (concentraciones finales en dos
placas de microtitulación de 96 pocillos). Se inocularon 20 \mul
de la suspensión de células infectadas en cada uno de los pocillos
de uno de las placas (antiviral), mientras se añadieron 20 \mul de
la suspensión de células sin infectar a cada pocillo de la segunda
placa (citotoxicidad). Después se incubaron las placas durante 7
días a 37ºC. Tras la incubación, se añadieron 10 \mul de bromuro
de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazolio (MTT) a 20 mg/ml a todos los pocillos y se incubaron las placas durante otros 90 minutos a 37ºC.
difeniltetrazolio (MTT) a 20 mg/ml a todos los pocillos y se incubaron las placas durante otros 90 minutos a 37ºC.
Después se añadieron 150 \mul de Triton
X-100 alcohólico al 10% (v/v) y se resuspendieron
las células. Tras 15 minutos a temperatura ambiente, se analizaron
las placas en un lector Multiskan MC a 405 nm. La conversión de MMT
amarillo en su derivado de formazán es máxima en las células sin
infectar, y está ausente en las células infectadas sin tratar. Se
representaron gráficamente los valores de densidad óptica para los
controles de citotoxicidad y se calcularon las dosis de los
compuestos requeridos para inhibir la conversión de MMT en el 50%
de los controles no infectados sin tratar. De esta manera, pueden
calcularse tanto la dosis citotóxica al 50% (DC al 50%) y la dosis
antiviral al 50% (DI al 50%). La tabla 1 muestra los valores de DC
al 50% y DI al 50% obtenidos para:
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron células C8166 con
VIH-1 (cepa RF) a una M.O.I. de 1x10^{-3} unidades
infecciosas/célula y se adsorbieron a temperatura ambiente durante
60 minutos. Tras la adsorción, se lavaron las células tres veces en
medio de crecimiento. Se añadieron alícuotas de 10^{5} células a
cada pocillo de las placas de 24 pocillos que contenían diluciones
en serie de los compuestos de prueba a concentraciones finales de 50
\mug/ml a 0,05 \mug/ml en medio de crecimiento RPMI® 1640.
También se incluyeron células infectadas sin tratar y células no
infectadas sin tratar como controles. Se incubaron las placas a
37ºC/5% de CO_{2} durante 3-4 días en recipientes
humidificados. Se examinaron las células diariamente para obtener
pruebas de la formación de sincitios inducida por
VIH-1. Se cuantificaron los sincitios mediante
referencia a los controles infectados sin tratar, y se calcularon
las dosis de los compuestos requeridos para reducir el efecto
citopático en un 50% (DI_{50}).
Se realizaron ensayos en células mononucleares
de sangre de cordón sustancialmente tal como se describe en Gu et
al., J. Virol. (1992), 66:7128-7135.
Resumiendo, se pasaron los virus
(HTLV-IIIB) que se habían crecido inicialmente en
células MT-4 células a células mononucleares de
sangre de cordón (CBM, cord blood mononuclear cells) estimuladas
previamente con fitohemaglutinina. Para análisis posteriores, se
pretrataron las muestras de CBM (5 x 10^{5} células por ml) con
diversas concentraciones de los diferentes compuestos durante 4 h y
después se inocularon con HIV-1 crecido en CBL a
una multiplicidad de infección de 1,0 en la concentración del
compuesto usado durante el pretratamiento. Se añadió medio nuevo,
incluyendo la concentración apropiada del compuesto tres veces
semanalmente, y se añadieron CBM estimuladas previamente con
fitohemaglutinina (5 x 10^{5} células por ml) a intervalos de 2
días. Se determinó el cálculo de la CI_{50} basándose en los
niveles de TA en los fluidos de cultivo tal como se describe en Gao
et al., (1992), J. Virol. 66: 12-19.
El procedimiento es similar al procedimiento
usado en el ensayo de CBM, con la excepción de que se usaron virus
construidos y virus mutados construidos.
Los virus construidos HXB2D-65
corresponden a la mutación de resistencia a ddC y los virus
construidos HXB2D-184 corresponden a la mutación de
resistencia a 3TC^{TM} y FTC.
Se infectaron varias líneas celulares con
HTLV-IIIb (TCDI50 = 200) y después se cultivaron con
diversas concentraciones de fármaco. Se determinó la CI_{50}
midiendo los niveles de antígeno p24 en el sobrenadante de los
cultivos en el día 6 de la infección.
Se determinó el crecimiento celular mediante el
recuento celular y la viabilidad mediante exclusión con azul tripán
7 días tras el tratamiento con el fármaco. CCDI50 se expresa como la
concentración de fármaco que inhibe el 50% del crecimiento
celular.
El procedimiento usado durante esta prueba se
describe en detalle en Korba et al., Antiviral Research 15,
217-228 (1992) que se describe brevemente tal como
sigue:
Se hicieron crecer células Hep G2 transfectadas
con ADN genómico del virus de la hepatitis B humano (células
2.2.15) y se mantuvieron en medio de cultivo
RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 5%,
glutamina 2 mM y gentamicina sulfato 50 \mug/ml, y se comprobó de
manera rutinaria la resistencia a G418. Se hicieron crecer los
cultivos de células 2.2.15 hasta confluencia en placas de cultivo
tisular de 24 pocillos y se mantuvieron durante de 2 a 3 días en
ese estado antes del tratamiento con el fármaco.
Se disolvieron los fármacos en agua estéril o
DMSO al 50% estéril en agua a concentraciones 100 veces superiores
a la concentración de prueba más alta. Se diluyeron estas
disoluciones según fue necesario en el medio de cultivo.
Se cambió el medio de cultivo en las células
confluentes 24 horas antes de la exposición a los compuestos de
prueba. Durante el tratamiento de 10 días, se cambió el medio de
cultivo diariamente. 10 días tras el tratamiento, se recogió el
medio de cultivo y se congeló a -70ºC durante el análisis del ADN
del VHB.
Para analizar el ADN de VHB extracelular, se
incubaron muestras de 0,2 ml de medio de cultivo durante 20 minutos
a 25ºC en NaOH 1 M/10X SSC (1X SSC es NaCl 0,15 M/ citrato de sodio
0,015 M, pH 7,2) y después se aplicaron a membranas de
nitrocelulosa empapadas previamente en 20X SSC. Después se aclararon
los filtros en 2X SSC y secaron en estufa a 80ºC durante 1 hora a
vacío.
Se marcó un fragmento de ADN de VHB de EcoRl de
3,2 kb purificado con [32P]dCTP mediante traducción de mellas
y se usó una sonda para detectar el ADN de VHB en la
inmunotransferencia puntual mediante hibridación de ADN. Tras el
lavado, se secó la inmunotransferencia hibridada y se cuantificó el
^{32}P usando un escáner Ambis beta.
Claims (28)
1. Una formulación farmacéutica que comprende un
compuesto seleccionado del grupo constituido por
- (a)
- 2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano;
- (b)
- 2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano;
- (c)
- cualquier combinación de los isómeros (a) y (b);
- (d)
- 2R-hidroximetil-4R-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano;
- (e)
- 2S-hidroximetil-4S-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano;
- (f)
- cualquier combinación de los isómeros (d) y (e); y
- (g)
- las sales y ésteres farmacéuticamente aceptables de los compuestos anteriores,
en una cantidad eficaz para tratar infecciones
por el virus de la inmunodeficiencia humana resistentes a
2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
y
2-hidroximetil-5-(S'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano,
en la que dicha formulación farmacéutica comprende además un
vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, otro agente
terapéutico, y en la que dicha formulación farmacéutica está en una
forma adecuada para su administración oral, rectal, nasal, tópica
(incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo
intramuscular, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada
para su administración mediante inhalación o insuflación.
2. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que el compuesto es
2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en una
cantidad eficaz para tratar infecciones por el virus de la
inmunodeficiencia humana resistentes a
2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
y
2-hidroximetil-5-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano.
3. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que el compuesto es
2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en una
cantidad eficaz para tratar infecciones por virus de la
inmunodeficiencia humana resistentes a
2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
y
2-hidroximetil-5-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano.
4. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que el compuesto es
2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en una
cantidad eficaz para tratar una infección por el virus de la
hepatitis B en mamíferos.
5. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que el compuesto es
2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en una
cantidad eficaz para tratar una infección por virus de la hepatitis
B en mamíferos.
6. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, en la que dicha formulación farmacéutica
está en una forma adecuada para su administración oral o
parenteral.
7. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, en la que dicha formulación farmacéutica
está en una forma adecuada para su administración oral, tal como una
cápsula, cachet, comprimido (incluyendo comprimido recubierto),
polvo, gránulos, disolución, suspensión (incluyendo suspensión
acuosa u oleosa), emulsión, bolo, electuario, pasta, jarabe, elixir
o puede presentarse como un producto seco para su constitución con
agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
8. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, en la que dicha formulación farmacéutica
está en una forma adecuada para su administración parenteral, tales
como un inyectable, por ejemplo inyección en bolo o infusión
continua, ampolla, jeringuillas rellenadas previamente, infusión de
volumen pequeño, en un recipiente de múltiples dosis con un
conservante, suspensión, disolución, emulsión (incluyendo una
emulsión en un vehículo oleoso o acuoso) añadidos, o puede estar en
forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado (por
ejemplo agua estéril, libre de pirógeno) antes de su uso.
9. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, en la que el otro agente terapéutico es un
agente antiviral.
10. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, que contiene 10-1500 mg de
dicho compuesto por dosificación.
11. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, que contiene 20-1000 mg de
dicho compuesto por dosificación.
12. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, que contiene 50-700 mg de
dicho compuesto por dosificación.
13. Una formulación farmacéutica según cualquier
reivindicación anterior, en la que dicho otro agente terapéutico es
un inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleosídico o un
análogo de nucleósido o un inhibidor del transporte de nucleósidos o
un inmunomodulador.
14. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 13, en la que el análogo de nucleósido se selecciona
de
2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(3TC^{TM}),
3'-azido-3'-desoxitimidina
(AZT), 2',3'-didesoxicitidina (ddc) y
2',3'-didesoxiinosina (ddI).
15. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 14, en la que dicho otro agente terapéutico es
2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano.
16. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 14, en la que dicho otro agente terapéutico es
3'-azido-3'-desoxitimidina.
17. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 14, en la que dicho otro agente terapéutico es
2',3'-didesoxicitidina.
18. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 14, en la que dicho otro agente terapéutico es
2',3'-didesoxiinosina.
19. El uso de una formulación farmacéutica según
la reivindicación 1 para la fabricación de una preparación
farmacéutica para el tratamiento de infecciones por virus de la
inmunodeficiencia humana, en el que dichas infecciones virales son
resistentes a
2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
y
2-hidroximetil-5-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
o para el tratamiento de una infección por virus de la hepatitis B
en mamíferos.
20. El uso según la reivindicación 19, en el que
el mamífero es un ser humano.
21. Una formulación farmacéutica para su
administración oral que comprende un compuesto eficaz para el
tratamiento de infecciones por el virus de la inmunodeficiencia
humana en un mamífero seleccionado del grupo constituido por
- (a)
- 2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano;
- (b)
- 2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; y
- (c)
- una sal o éster farmacéuticamente aceptable de (a) o (b),
en una cantidad eficaz para tratar dicha
infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, y un
excipiente farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo
constituido por agentes aglutinantes, cargas, lubricantes,
disgregantes, agentes humectantes, agentes de suspensión, agentes
emulsionantes, vehículos no acuosos, conservantes y combinaciones de
los mismos.
22. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 21, en la que la cantidad del compuesto está entre 10
y 1500 mg.
23. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 22, en la que tras su administración oral a un
mamífero se obtiene una concentración en plasma del compuesto entre
1 \muM y 75 \muM.
24. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 21 que comprende además un agente terapéutico
seleccionado del grupo constituido por
3'-azido-3'-desoxitimidina
(AZT),
2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano
(3TC), 2',3'-didesoxicitidina (ddC), y
2',3'-didesoxiinosina (ddI).
25. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 24, en la que dicho agente terapéutico es AZT.
26. Una formulación farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en la que la formulación
está en forma sólida o forma líquida.
27. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 26, en la que la forma sólida es un comprimido o una
cápsula adecuada para su administración oral.
28. Una formulación farmacéutica según la
reivindicación 26, en la que la forma líquida se selecciona del
grupo constituido por suspensiones acuosas, suspensiones oleosas,
disoluciones, emulsiones, jarabes y elixires adecuados para su
administración oral.
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