ES2286828T3

ES2286828T3 - Metodo de calibracion.

Info

Publication number: ES2286828T3
Application number: ES97906392T
Authority: ES
Inventors: Stig Tormod
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1996-02-27
Filing date: 1997-02-26
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2017-02-26
Also published as: EP0886767A1; SE9600747D0; JP2000505555A; US6226084B1; ATE360801T1; DE69737649T2; EP0886767B1; DE69737649D1; WO1997032187A1; JP4117905B2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA CALIBRAR UN SISTEMA OPTICO, CUYO SISTEMA COMPRENDE UNA LAMPARA DE DESTELLOS COMO FUENTE LUMINOSA (4), UN SISTEMA DE LENTES (6), UN MONOCROMADOR QUE COMPRENDE UNA REJILLA (10), UN MOTOR (20) PARA DESPLAZAR LA REJILLA Y PERMITIR ASI QUE UNA LUZ ESENCIALMENTE MONOCROMATICA EXPLORE UN SISTEMA DE DETECCION. LA FUENTE LUMINOSA PROPORCIONA AL MENOS DOS CRESTAS DE ALTA INTENSIDAD A DISTINTAS LONGITUDES DE ONDA. EL METODO CONSISTE EN EXPLORAR UNA PRIMERA REGION DE LONGITUDES DE ONDA QUE COMPRENDE AL MENOS UNA DE LAS DOS CRESTAS DE ALTA INTENSIDAD ANTEDICHAS QUE HAY POR LO MENOS Y MEDIR LAS INTENSIDADES EN UNA SERIE DE PUNTOS SELECCIONADA DURANTE LA EXPLORACION. SE LOCALIZA UNA PRIMERA CRESTA DE LAS DOS CRESTAS ANTEDICHAS QUE HAY POR LO MENOS. SE EXPLORA UNA REGION DE LONGITUDES DE ONDA ALREDEDOR DE CADA UNA DE DICHAS DOS CRESTAS QUE HAY POR LO MENOS, MIDIENDO LAS INTENSIDADES A INTERVALOS MENORES QUE ANTES. SE LOCALIZAN AL MENOS DOS CRESTAS POR AUTOCORRELACION. LA LOCALIZACION DE DICHAS CRESTAS SE DETERMINA EN TERMINOS DE UNA DISTANCIA DESDE UN PUNTO DE REFERENCIA, CORRESPONDIENDO DICHA DISTANCIA AL DESPLAZAMIENTO DE LA REJILLA.

Description

Método de calibración.

La presente invención se refiere a un método de calibración de longitudes de onda de un sistema óptico, y al autodiagnóstico de semejante sistema que comprende tal calibración.

Antecedentes de la invención

Los sistemas espectrofotométricos de la técnica anterior, frecuentemente hacen uso de una lámpara de deuterio como fuente de luz. La ventaja de una lámpara semejante es que está bien encendida de una forma continua, y tiene un par de picos de longitudes de onda bien definidos. Sin embargo, la intensidad de una lámpara de deuterio es relativamente baja. En un sistema cromatográfico de líquidos, las pequeñas celdas de flujo requieren una alta intensidad de luz con el fin de posibilitar una detección adecuada. También el sistema óptico que comprende, por ejemplo, fibras ópticas requiere mucha más luz que la que se comunica mediante una lámpara de deuterio. La calibración de las longitudes de onda en semejantes sistemas se lleva a cabo mediante la localización de un único pico. Esto, inevitablemente, produce problemas de precisión en los extremos, de las ondas cortas y las ondas largas respectivamente, de la escala de longitudes de onda. También es muy importante que una longitud de onda seleccionada sea reproducible. La reproducibilidad que se puede alcanzar en una calibración deberá ser al menos de \pm2 nm.

El documento US-5.212.537 está dirigido a un método de calibración para monocromadores y espectrofotómetros, que usan una fuente de luz continua, una lámpara de vapor de mercurio con filamento de volframio, que tiene dos picos de intensidad agudos. La localización de los picos se identifica midiendo la anchura de dichos picos a media altura, y en el punto medio de esta anchura se toma como la localización del pico. Esta técnica no sería posible de usar junto con una lámpara de destello, por ejemplo una lámpara de xenón, ya que la intensidad de los picos fluctúa.

El documento US-5.268.737 está dirigido a la calibración de un espectrofotómetro. Como fuente de luz continua se usa una lámpara de deuterio y una lámpara de volframio. Se determina un punto de referencia usando luz de orden cero. Esto no sería posible junto con el uso de fibras ópticas para la transmisión.

Resumen de la invención

El objeto de la invención es proporcionar un método de calibración mejorado para un sistema espectrofotométrico, en el que se pone remedio a los inconvenientes de los sistemas de la técnica anterior.

Este objeto se consigue con el método definido en la reivindicación 1.

La ventaja del método reivindicado es que en virtud del alto brillo de la lámpara de destellos usada en el método, se incrementa la cantidad de luz introducida en el sistema, y la precisión en la calibración se determina sobre toda la región de longitudes de onda de interés.

Las realizaciones preferidas están definidas en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de los dibujos

En las figuras

La Figura 1 es una vista general de un sistema óptico en el que se puede llevar a efecto la invención;

La Figura 2 es un espectro de una lámpara de destellos de xenón; y

La Figura 3 muestra esquemáticamente el mecanismo para hacer rotar la rejilla.

Descripción detallada de una realización preferida de la invención

En la Figura 1 se muestra una vista general de un sistema de detección UV-visible, generalmente designado por 2, en el que el se lleva a efecto el método de calibración.

El sistema comprende una fuente de luz, por ejemplo una lámpara 4 de destellos de xenón, que tiene un espectro de emisión típico, como se muestra en la Figura 2. En una realización preferida, la distancia entre los electrodos en la lámpara es aproximadamente de 1,5 mm. Esto produce un destello con un brillo muy alto. El sistema comprende además lentes 6 que enfocan la luz sobre una rendija 8 de entrada, una rejilla 10 holográfica, cóncava y pivotante, con aberración corregida, que origina la difracción de la luz. La rejilla tiene, preferiblemente, 1200 rayas/mm para las aplicaciones en cuestión, pero se pueden seleccionar por parte de un experto para adecuarse a una aplicación concreta. Se dispone una fibra óptica 12 en el área donde incide la luz difractada procedente de la rejilla, de forma que es posible seleccionar una longitud de onda de una cierta anchura de banda estrecha para los fines de la invención, en principio luz monocromática, y transferir la luz de dicha longitud de onda al sistema de detección. Haciendo rotar la rejilla 10 alrededor de un punto pivotante P, es posible seleccionar cualquier longitud de onda desde aproximadamente
190 nm hasta 700 nm. La rotación de la rejilla 10 se consigue con un motor 20 de pasos (véase la Figura 3) que opera un tornillo micrométrico, esquemáticamente mostrado en 22. Se dispone de un medio 23 con tuerca que se desplaza longitudinalmente sobre el tornillo 22 con un elemento 25 que sobresale y que desplaza una varilla o brazo 24 provisto de una bola 27, y que está bien sujeto a la rejilla 10. El mecanismo está diseñado de forma que un desplazamiento lineal del tornillo micrométrico 22 produce un desplazamiento lineal de la longitud de onda del haz de luz que incide sobre la fibra óptica 12. Es importante que el eje longitudinal del tornillo 22 sea perpendicular a la bisectriz B del ángulo formado entre el punto de ubicación de la rendija 8 de entrada, el punto pivotante P y el punto de ubicación del extremo 13 de la fibra óptica. Esta es una solución técnica estándar bien conocida por los expertos, y no forma parte de la invención, y por eso no se discutirá más en la presente memoria descriptiva.

Debido a que la fuente de luz es una lámpara de destellos, la luz que se transfiere a la fibra necesita estar dividida en un haz R de referencia que incide sobre un detector 14 de referencia, y un haz S de detección, o de muestra, que incide sobre un detector 16 de muestras. La intensidad de la luz procedente del haz R de referencia que incide sobre el detector de referencia se designa I_{0}. La intensidad de la luz que incide sobre el detector de muestras se designa I. El haz de muestras entra en una celda, por ejemplo la celda 18 de flujo, a través de la cual se hacen pasar las muestras desde una columna cromatográfica (no mostrada), que termina en un sistema de recogida (no mostrado) para recoger fracciones del material eluído, e incide sobre dicho detector 16 de muestras que detecta la presencia de muestra en la celda 18 de flujo como un cambio en la intensidad I transmitida, y por tanto un cambio en la absorbancia A. La absorbancia se define según la ecuación bien conocida

A = -log\frac{I}{I_{0}}

La absorbancia A es proporcional a la concentración C, y la longitud de la trayectoria l en la celda según la siguiente ecuación

A = \varepsilon l C

en la que \varepsilon es el coeficiente de absorción molar.

Volviendo ahora a la Figura 2, se muestra el espectro de la lámpara de xenón. Es un espectro continuo en las altas intensidades de corrientes empleadas durante la descarga y, aparte de un pico muy ancho a aproximadamente 200 nm, hay un par de picos característicos, que se emplean a efectos de calibración. Por eso, el pico a 229,6 nm se usa como una longitud de onda de calibración, y el pico a 541,9 nm como la otra. Estos picos están en el espectro de primer orden de la rejilla. A efectos de control, se usa un tercer pico, concretamente el pico del espectro de segundo orden que corresponde a 229,6 nm, es decir 459,2 nm en el primer orden.

Ahora se describirá el procedimiento de calibración.

El primer paso es recorre, de parte a parte, el tramo del tornillo micrométrico entre sus posiciones extremas. Las posiciones extremas son percibidas por un dispositivo sensor que detecta la presencia o ausencia de "señalizaciones" 26 mecánicas provistas en el tornillo micrométrico. Este recorrido inicial se realiza para acondicionar el micrómetro y lubricarlo distribuyendo el aceite. También, de este modo, se detectarán perturbaciones de cualquier clase, y si se producen, se le mostrará al operador un mensaje en ese sentido, es decir no es posible hacer una calibración.

En segundo lugar, se hará un barrido del campo de longitudes de onda entre aproximadamente 100 y 352 nm, y se detecta y almacena en una matriz de datos un valor para cada nm, correspondiente a los tres pasos del motor de pasos. El valor más alto de éstos se identifica, y se le designa como pico máximo. La medida se realiza como sigue: Después de haber ido paso a paso hasta una posición que corresponde a 100 nm (es decir, un número de pasos desde la posición extrema determinada por la señalización anteriormente mencionada. Este número de pasos es, por experiencia, conocido aproximadamente y se programa), el motor de pasos se detiene durante un largo periodo suficiente para que el sistema de detección detecte 5 destellos procedentes de la lámpara de xenón. La lámpara emite destellos continuamente con una frecuencia de 100 Hz, por eso, 5 destellos requerirán que el motor de pasos esté detenido 50 ms antes de continuar. Las intensidades de los dichos cinco destellos se suman y se almacenan como una entrada en la matriz de datos. Por supuesto, el número de destellos detectados no será necesariamente cinco, sino con el fin de obtener un promedio razonable de variaciones, se han seleccionado cinco como un buen compromiso.

Después de la detección de dichos cinco valores de intensidad, el motor de pasos da tres pasos, que corresponden a 1 nm, en unos pocos microsegundos y luego se detiene de nuevo para que el sistema detecte cinco nuevos valores de intensidad, añadiéndolos y almacenándolos en la matriz de datos. Esto se repite a lo largo del intervalo de 100 a 352 nm. Debido a que la óptica del sistema absorbe luz en la región UV, el sistema no se "abrirá" hasta alrededor de los 190 nm y, por eso, los detectores no verán la luz hasta entonces.

Después de que se haya completado el barrido, el primer valor de la intensidad por encima de cero, detectado y almacenado en la matriz de datos (es decir, un valor a aproximadamente 190 nm, más o menos), se compara con el valor más alto detectado. Si dicho primer valor es inferior al 2% del valor más alto (pico máximo) prosigue. Si no lo es, se mostrará una indicación al respecto, señalando alguna clase de fallo, normalmente una óptica defectuosa. Por ejemplo, la luz perdida podría originar un nivel de fondo por encima de cero. El valor del 2% se selecciona arbitrariamente como una medida razonable de que la óptica funciona de forma apropiada. Si el valor es más alto, puede haber elementos extraños tales como reflexiones procedentes de partículas extrañas, etc. El valor del 2% no es crítico y podría, en principio, ser tan elevado como el 20%. El valor en el "punto del 2%" se toma como punto de partida para el siguiente paso del método.

En el siguiente paso, el sistema comprueba los valores de las intensidades en la matriz de datos con el fin de encontrar el pico a 229,6 nm. Sin embargo, el pico ancho a aproximadamente 200 nm, anteriormente mencionado, puede en algunos casos, por ejemplo con corrientes de descarga extremadamente altas, tener una intensidad de pico más alta que el pico a 229,6 nm y, por lo tanto, el sistema está programado para dar paso, en la matriz de datos, a valores que corresponden a un valor localizado a 35 nm (108 pasos) a partir del "punto del 2%" con el fin de pasar dicho pico ancho.

Comparando el conjunto de datos mediante autocorrelación frente a un pico ideal correspondiente a una curva
y = x^{2}, se localiza el pico a 229,6 nm. La autocorrelación es una técnica estándar descrita de forma exhaustiva en la bibliografía, y se hace referencia, por ejemplo a un compendio "Tidsserieanalys" de Lennard Olbjer, Universidad de Lund, para más detalles y métodos alternativos.

Después de eso, se hace de nuevo un barrido de la región entre 225-235 nm, registrando ahora un conjunto de medidas para cada paso del motor de pasos, correspondiendo cada paso a aproximadamente 0,33 nm, con el fin de encontrar el pico a 229,6 nm. De nuevo se hace uso de la autocorrelación, usando los datos de la matriz de datos que parte de 225 nm, para hallar la localización exacta del pico a 229,6 nm. De la misma forma se barre la región de 535-565 nm con el fin de hallar el pico a 541,9 nm usando el mismo método de autocorrelación. Por supuesto, resulta imaginable hacer un barrido de todo el espectro, pero con el fin de ahorrar tiempo en el barrido se restringe a dos regiones del espectro.

Cuando se ha establecido el pico, se comprueba la intensidad a 229,6 nm para ver si excede, o no, de un valor mínimo seleccionado.

Si no es así, un mensaje de error indicará "Baja intensidad de luz". Esto es un indicio de que deberá sustituirse la lámpara. El sistema registra también el tiempo en el que la lámpara ha estado en uso, y al cabo de un cierto número de horas aparecerá un mensaje diciendo que la lámpara deberá ser sustituida.

Se calcula la constante de calibración. Se define como la distancia (contada en pasos del motor de pasos) desde la "señalización" que hay en el tornillo micrométrico hasta el "codo" en el "punto del 2%" en la curva de intensidad. La constante de calibración se toma como un indicio de que el sistema está funcionando apropiadamente si está dentro de ciertos límites predeterminados. También se calcula la dispersión. La dispersión se define como el número de pasos/nm, y se calcula como

dispersión = \frac{\text{número de pasos entre picos de calibración}}{541,9 \ nm - 229,6 \ nm}

La dispersión varía de un grupo a otro grupo de rejillas, y depende de las tolerancias del sistema mecánico. Las dispersiones utilizables son 2,9-3,1 nm.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una comprobación de la calibración, es decir una comprobación de verificación para ver si la calibración es todavía válida. Puede ser necesaria una comprobación semejante si los resultados de un ensayo cromatográfico, por alguna razón, parece exhibir elementos extraños. Normalmente el sistema oscila entre tres longitudes de onda durante un ensayo, y puede ocurrir ocasionalmente que el motor de pasos se salte un paso, debido a una obstrucción en el tornillo micrométrico. Esto conducirá a un desplazamiento del ajuste de la calibración.

La comprobación de la calibración se realiza efectuando de nuevo el procedimiento de calibración, pero esta vez calculando únicamente la desviación de la constante de calibración y la dispersión establecida en la calibración. Si hay una desviación, el sistema le mostrará un mensaje al operador, que entonces puede decidir recalibrar.

En este procedimiento hay una comprobación extra, con el pico del espectro de segundo orden, del pico a 229,6 nm, que se haya a 459,2 nm. Este pico, se bloquea durante el ensayo cromatográfico insertando un filtro de bloqueo de los rayos UV a 360 nm y superiores.

Durante la puesta en marcha se realizan comprobaciones, como por ejemplo la comprobación de la intensidad de la luz. Si la comprobación indica baja intensidad, aparecerá un mensaje de advertencia indicando la necesidad de cambiar la lámpara. El tiempo de operación para los componentes mecánicos también es registrado por el sistema y, por eso, mostrará automáticamente cuando es probable que el sistema mecánico necesite una revisión.

Claims

1. Un método de calibración de un sistema óptico, sistema óptico que comprende una lámpara de destellos como fuente (4) de luz, un sistema de lentes (6), un monocromador para posibilitar hacer un barrido con luz esencialmente monocromática sobre el sistema de detección (14, 16), proporcionando la fuente de luz al menos dos picos de alta intensidad a distintas longitudes de onda, comprendiendo el método los siguientes pasos:

i): hacer un barrido de una primera región de longitudes de onda que comprenda dicho primer pico de alta intensidad y hacer un barrido de una segunda región de longitudes de onda que comprenda dicho segundo pico de alta intensidad; medir las intensidades en un número seleccionado de puntos durante el barrido, en el que se hace una pluralidad de medidas para cada uno de dichos puntos, almacenándose la suma de dicha pluralidad de valores, para cada punto, como un valor de la intensidad para ese punto en una matriz de datos;

ii): localizar aproximadamente dichos, al menos dos, picos;

iii): hacer un barrido de una región de longitudes de onda alrededor de cada uno de dichos, al menos, dos picos, medir las intensidades a intervalos más cortos que en el paso i);

iv): localizar dichos, al menos dos, picos mediante autocorrelación; y

v): determinar el punto de localización de dicho pico como una distancia a un punto de referencia.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho monocromador comprende una rejilla (10) o un prisma, un motor (20) que provoca un desplazamiento de la rejilla, y en el que dicha distancia corresponde al desplazamiento de la rejilla.

3. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que dicha autocorrelación para localizar los respectivos picos se realiza sobre los datos de dicha matriz de datos.

4. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que se toma como punto de partida un punto de la matriz, correspondiente a un primer valor de intensidad detectado, aminorado por un porcentaje preseleccionado de un valor de intensidad detectada más alta, y en el que dicho primer pico se localiza yendo, paso a paso, hasta un punto de datos en dicha matriz correspondiente a un valor de longitud de onda 36 nm más alto que dicho punto correspondiente a dicho primer valor de la intensidad por encima de cero.

5. Un sistema óptico, comprendiendo el sistema una fuente de luz de destellos, un sistema de lentes, una rendija de entrada, un monocromador en forma de rejilla cóncava de reflexión provista de una rejilla, un motor para desplazar la rejilla de forma pivotante para posibilitar el barrido de luz esencialmente monocromática sobre un extremo de una fibra óptica, estando conectada la fibra óptica a un sistema de detección, proporcionando la fuente de luz al menos dos picos de alta intensidad a distintas longitudes de onda, y un sistema electrónico para efectuar un método de calibración según cualquiera de las reivindicaciones previas.

6. Un sistema óptico según la reivindicación 5, caracterizado porque es un espectrofotómetro.