ES2286860T3 - Proceso de produccion de lactoalbumina. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir a-lactoalbúmina biológicamente activa que comprende monómeros y oligómeros de diferente tamaño molecular, método que comprende poner en contacto la a-lactoalbúmina, al menos parte de la cual está en estado tipo glóbulo fundido, con un reactivo de conversión que es ácido oleico, y que resulta en la producción de dicha forma biológicamente activa.
Description
Proceso de producción de lactoalbúmina.
La presente invención se refiere a un proceso
para la preparación de un complejo proteico terapéutico, y al
aparato y los reactivos para utilizar en el proceso.
La \alpha-lactoalbúmina
monomérica es la proteína más abundante del suero de la leche
humana. Esta proteína de 14 KDa se ha caracterizado extensamente y
se ha resuelto la estructura cristalográfica. Existen cuatro
hélices \alpha y una lámina \beta de triple cadena, que se
encuentra en el extremo C-terminal de la proteína.
Un sitio de unión a Ca^{2+} de alta afinidad se coordina mediante
las cadenas laterales de carboxilatos de Asp82, Asp87, Asp88 y el
oxígeno del carbonilo de Lys79 y Asp84, con dos moléculas de
agua.
El monómero nativo es un componente del complejo
de la lactosa sintetasa, y cambia la especificidad de sustrato de
la galactosil transferasa de N-acetilglucosamina a
glucosa, con la posterior síntesis de lactosa.
Previamente se ha descrito una fracción de la
leche humana que contiene un complejo oligomérico, descrito como
\alpha-lactoalbúmina multimérica o MAL (multimeric
\alpha-lactalbumin), que tiene propiedades
biológicas diferentes a la forma monomérica. En particular, se ha
descrito que el complejo oligomérico tiene aplicación terapéutica
tanto en el campo de los antibióticos (WO96/04929) como en la
terapia contra el cáncer (A. H\ring{a}kansson et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 8064-8068). En
particular, la forma oligomérica de la
\alpha-lactoalbúmina induce muerte celular
apoptótica en células cancerosas y en células inmaduras, pero no en
células sanas. Estas observaciones sugerirían que la proteína
adquiere propiedades biológicas nuevas tras el cambio
conformacional.
Se sabe que la
\alpha-lactoalbúmina experimenta un cambio
conformacional cuando se expone a pH bajo. El estado A o estado de
glóbulo fundido tiene una estructura secundaria nativa, pero una
estructura terciaria menos definida que el estado nativo. Estados
similares de \alpha-lactoalbúmina se pueden formar
también a pH neutro, tras la retirada del ión Ca^{2+} que está
fuertemente unido, reducción de los puentes disulfuro o a
temperaturas elevadas.
Se obtuvo la MAL pasando una fracción de caseína
de la leche, particularmente leche humana, a través de una columna
de intercambio iónico, específicamente una columna de
DEAE-Tris-acil M utilizando un
gradiente de NaCl. Se obtuvo una fuente que contenía MAL
terapéuticamente activa. Además, se ha descrito la conversión de la
\alpha-lactoalbúmina monomérica comercialmente
disponible a la forma activa.
Los solicitantes han descubierto que, a pH bajo,
la forma activa de la \alpha-lactoalbúmina
precipitaba con la caseína antes que con la fracción del suero y
eluía a alta concentración de sal durante la cromatografía de
intercambio iónico. La caracterización espectroscópica de la forma
activa sugirió que consistía, al menos en parte, en intermediarios
de plegamiento de la \alpha-lactoalbúmina formando
agregados estables.
Se cree que la conformación y las actividades
biológicas de las proteínas están bajo control termodinámico, y
dirigido por la secuencia de aminoácidos. Recientemente, se ha
puesto de manifiesto que algunas proteínas se pueden quedar
atrapadas en estados de plegamiento con mayor energía libre, y que
tales variantes de plegamiento de una proteína individual pueden
adquirir diferentes funciones biológicas. El cambio conformacional
de la proteína del prión por ejemplo lleva a la formación de una
isoforma causante de la enfermedad, con la misma secuencia de
aminoácidos, y sin modificaciones pos-traduccionales
que permitan distinguir a las dos. La proteína del prión primero
cambia al estado de glóbulo fundido y después prosigue a una forma
rica en lámina \beta no reversible.
Parece que la
\alpha-lactoalbúmina es un caso más de una
proteína que adquiere nuevas funciones tras un cambio
conformacional. Como en el sistema del prión, las dos formas
moleculares de la proteína tienen idéntica secuencia de
aminoácidos, sin modificaciones pos-traduccionales
que se detecten mediante espectrometría de masas. Sin estar unido a
ninguna consideración teórica, se propone que la inestabilidad
relativa de plegamiento de la
\alpha-lactoalbúmina permite a la proteína
experimentar transiciones estructurales y adquirir nuevas funciones
esenciales.
Las variantes de plegamiento de las proteínas
como los priones, amiloide y lisozima están asociadas con
enfermedad, y se piensa que provocan directamente la destrucción de
tejidos. La variante de la \alpha-lactoalbúmina
por el contrario, puede tener efectos beneficiosos. Puede
representar en efecto una función fisiológica para variantes de
plegamiento, que se ha perdido en el caso de los priones y las
fibrillas amiloides.
Los estados de plegamiento modificados de la
\alpha-lactoalbúmina sin embargo modifican
drásticamente sus interacciones con células tumorales. Las células
sanas tienen una longevidad limitada. Cuando son viejas, se activan
programas de muerte celular, y las células mueren por apoptosis. Las
células tumorales con frecuencia inactivan los programas de muerte
celular, se multiplican y sobreviven. Se han tomado muchas
aproximaciones para limitar la supervivencia de las células
tumorales, para hacer revertir las células a un fenotipo
diferenciado o hacerlas someterse a apoptosis. En su estado de
plegamiento modificado, la \alpha-lactoalbúmina
forma MAL que parece tener como objetivo células inmaduras y
células tumorales y activar la muerte celular programada. Hay
claramente aplicaciones para esto en la terapia contra el
cáncer.
\newpage
Con una mayor comprensión de la estructura de la
MAL, los solicitantes han descubierto una forma mejorada de
producir MAL biológicamente activa con rendimientos mayores y a
partir de una mayor variedad de fuentes de
\alpha-lactoalbúmina.
Así, la presente invención proporciona un método
para producir una \alpha-lactoalbúmina
biológicamente activa, que comprende monómeros y oligómeros de
diferente tamaño molecular, método que comprende poner en contacto
la \alpha-lactoalbúmina, al menos parte de la cual
está en el estado tipo glóbulo fundido, con un reactivo de
conversión que es ácido oleico, y que da como resultado la
producción de dicha forma biológicamente activa.
Y un método para producir
\alpha-lactoalbúmina biológicamente activa que
comprende monómeros y oligómeros de diferente tamaño molecular,
método que comprende exponer una fuente de
\alpha-lactoalbúmina a un medio de intercambio
iónico que ha sido pretratado con una fracción de leche que contiene
caseína o ácido oleico, y recuperar la
\alpha-lactoalbúmina de allí en una forma
biológicamente activa.
Además, la invención se refiere a un complejo
biológicamente activo que comprende una forma mutada de la
\alpha-lactoalbúmina nativa en la que los sitios
o dominios de unión a calcio se han modificado de forma que se
interrumpe o previene la unión de calcio a los mismos, y ácido
oleico.
La expresión "biológicamente activa" como
se usa aquí significa que la \alpha-lactoalbúmina
es capaz de inducir apoptosis en células tumorales y/o tiene un
efecto bactericida que no se observa con la
\alpha-lactoalbúmina monomérica.
Los métodos para alcanzar la activación de
acuerdo con la invención incluyen aquellos que se describen
posteriormente. Por ejemplo, la
\alpha-lactoalbúmina en el estado tipo glóbulo
fundido se pone en contacto apropiadamente con el ácido oleico como
reactivo de conversión en condiciones que permiten que el
intercambio iónico tenga lugar. En particular por lo tanto, la
\alpha-lactoalbúmina en estado tipo glóbulo
fundido se aplica a una columna de intercambio iónico,
específicamente una columna de intercambio aniónico, que contiene el
reactivo de conversión. Esto se puede conseguir eluyendo la columna
primero con el agente de conversión. Sin embargo, otros entornos de
reacción pueden producir efectos similares y se pueden utilizar.
Una preparación de
\alpha-lactoalbúmina puede tener material tanto en
el estado nativo como en el estado tipo glóbulo fundido, las
cantidades relativas de los cuales dependerán del método de
purificación utilizado. Se ha descubierto que la MAL que induce
apoptosis se producirá cuando la
\alpha-lactoalbúmina se aplica a una columna de
intercambio iónico en presencia de ácido oleico como reactivo de
conversión.
Sin embargo, es preferible que una parte
sustancial (es decir, más del 50% peso/peso) de la
\alpha-lactoalbúmina aplicada a una columna de
intercambio iónico esté en el llamado estado tipo glóbulo fundido o
que se aplique junto a un reactivo que induzca dicho estado.
El estado A o estado de glóbulo fundido de la
\alpha-lactoalbúmina tiene estructura secundaria
similar a la nativa pero estructura terciaria mucho menos definida
(Kronman et al., 1965 Biochem, 4, 518-525;
Dolgikh et al., Febs Lett., (1981) 136,
311-315 y FEBS Lett., (1984) 165:
88-92; Ohgushi & Wada, 1983, A Febs Lett. 164:
21-25). Los glóbulos fundidos se forman en
condiciones ácidas y estados similares se forman a pH neutro tras
retirada del ión Ca^{2+} estrechamente unido mediante EDTA, por
reducción de los puentes disulfuro, o a altas temperaturas (Pfeil
et al., 1987 Biochim Biophys Acta, 911:
114-116; Kuwajima 1996 Faseb J. 1:
102-109; Shulman et al., 1995 J. Mol. Biol.
253, 651-657).
Alternativamente, la
\alpha-lactoalbúmina se puede producir de forma
recombinante en una forma mutada en la que los sitios o dominios de
unión a calcio se han interrumpido o destruido. Es más probable que
estas proteínas recombinantes formen el estado tipo glóbulo fundido
más fácilmente. Además, este método tiene ventajas ya que la
purificación de moléculas biológicamente activas de la leche humana
es notoriamente difícil, debido a la abundancia de moléculas
altamente bioactivas que contaminan las fracciones. Los métodos
recombinantes de producción evitarán estas dificultades.
Las dianas adecuadas de mutación para destruir
la unión de calcio se pueden identificar de la literatura, pero
incluyen mutación de los residuos de cisteína a otros aminoácidos,
tales como alanina, que no produce puentes disulfuro. Ejemplos de
tales mutaciones se describen en el Ejemplo 11 más adelante.
El ADN que codifica los mutantes requeridos de
la \alpha-lactoalbúmina se puede introducir en
vectores de expresión adecuados que se pueden emplear después para
transformar células huésped, por ejemplo, células procariotas tales
como E. coli o células eucariotas y en particular células de
insecto utilizando métodos convencionales.
Dependiendo del proceso de purificación o de la
fuente de la \alpha-lactoalbúmina utilizada en su
producción, puede ser preferible someter la
\alpha-lactoalbúmina a un paso de pretratamiento
que maximice la cantidad de material en estado tipo glóbulo
fundido. Esto se puede llevar a cabo poniendo en contacto la
\alpha-lactoalbúmina con un agente quelante de
calcio como el EDTA (ácido etilendiaminotetraácetico) para retirar
el exceso de calcio. Esto se puede aplicar como un pretratamiento
en el que la \alpha-lactoalbúmina se pone en
contacto con el agente quelante antes de la elución en la columna
de intercambio iónico, o alternativamente, el EDTA se puede añadir
al tampón de elución.
Alternativamente, la
\alpha-lactoalbúmina se puede someter a un paso de
pretratamiento que implica la exposición a bajo pH, por ejemplo
mediante la adición de material ácido tal como ácido clorhídrico,
para reducir el pH al orden de 2. En todavía otra alternativa más,
la \alpha-lactoalbúmina se calienta a una
temperatura elevada, por ejemplo a la temperatura de
25-120ºC, convenientemente de 25 a 95ºC, por ejemplo
superior a 70ºC. Si un pretratamiento de este tipo es necesario
para obtener niveles óptimos de MAL activa se puede determinar
llevando a cabo carreras de ensayo como se ilustra más adelante.
Así, en una forma de realización preferida, la
invención proporciona una método para producir una forma oligomérica
de \alpha-lactoalbúmina que comprende la
exposición de la fuente de \alpha-lactoalbúmina en
un estado similar al glóbulo fundido a un medio de intercambio
iónico que se ha pretratado con caseína o con un componente activo
de la misma, y la recuperación de la
\alpha-lactoalbúmina oligomérica de allí. La
\alpha-lactoalbúmina oligomérica derivada de allí
es biológicamente activa en que puede tener actividad para inducir
apoptosis en células tumorales y/o tener un efecto bactericida.
La caseína o el componente activo utilizado en
el pretratamiento de la columna puede comprender caseína o una
fracción de la misma que contiene ácido oleico.
El pretratamiento o "entrenamiento" del
medio de intercambio iónico con ácido oleico, por ejemplo según se
encontró en la caseína o en componentes activos de la misma, se ha
descubierto que es particularmente eficaz para aumentar el
rendimiento de MAL, por ejemplo de varias fuentes tales como
\alpha-lactoalbúmina derivadas de leche tanto
humana como bovina comercialmente disponibles.
La caseína de la leche humana contiene ácidos
grasos poliinsaturados de cadena larga además de ácido oleico tales
como ácido linoleico, \gamma-linoleico y
araquidónico así como triglicéridos y lípidos particularmente
fosfolípidos tales como la esfingomielina. Cualquiera de ellos se
puede usar en combinación con el ácido oleico y puede producir
efectos aumentados en la columna.
En el caso de que se use en el paso de
pretratamiento una fracción de leche que contiene caseína o ácido
oleico, esta se debe aislar de leche que proviene de diversos
mamíferos, tales como humanos, bovinos, ovejas o cabras. Es
preferible sin embargo, que la caseína o el componente activo
utilizado en el paso de pretratamiento procedan de leche humana.
El aislamiento de las fracciones de caseína se
puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos según se describe
en WO 96/04929. La caseína se puede usar directamente o se puede
congelar y descongelar más tarde antes de su uso. Se ha descubierto
que la caseína que se ha congelado o que procede de leche humana
congelada es preferida en el paso de pretratamiento. En el caso de
que la caseína se use directamente, es preferible que primero se
someta a una hidrólisis para hidrolizar algunos triglicéridos
presentes y así aumentar la cantidad de ácidos grasos libres y en
particular ácido oleico presente antes de su uso en el paso de
pretratamiento. Esta hidrólisis se puede lograr por ejemplo
mediante exposición de la caseína a sales biliares (J. Bitman et
al., J. Ped. Gast. Nutr. 1983: 521-524).
Preferiblemente el material de intercambio
iónico utilizado se dispone en una columna como es convencional en
la técnica. Los diversos tratamientos se pueden eluir entonces a
través de la columna.
El ácido oleico y la caseína se eluyen
convenientemente a través de una columna que contiene material de
intercambio iónico nuevo no utilizado tal como DEAE Trisacril. Los
tampones de elución adecuados incluyen Tris-HCl con
un pH de 8.5.
La cantidad de caseína o composición de ácido
oleico aplicada a la columna de esta manera puede ser pequeña
dependiendo del volumen de \alpha-lactoalbúmina
que se requiera para convertir en MAL. Por ejemplo, se ha
descubierto que solo se pueden usar 30 mg de caseína o equivalentes
de caseína por ml de material de columna en la conversión de
carreras múltiples de 10 mg de
\alpha-lactoalbúmina bovina. Después de 6 carreras
(60 mg), el rendimiento empieza a disminuir, pero aún se obtuvo
algo de \alpha-lactoalbúmina oligomérica incluso
después de 10 carreras.
En una forma de realización preferida, la
columna se lava después con tampón de intercambio iónico, tal como
el tampón Tris-HCl mencionado antes, sin caseína, y
preferiblemente también otros tampones que se van a usar en el
proceso, tal como un tampón con NaCl para asegurar que nada
inespecífico eluirá de la columna cuando se use en el proceso. El
lavado se puede hacer varias veces.
La columna se puede eluir después con la fuente
de \alpha-lactoalbúmina disuelta en el tampón de
intercambio iónico según se ha descrito anteriormente. La columna
consta de material de intercambio aniónico. Se produce
adecuadamente un gradiente de concentración de sal en la columna
mediante elución con un tampón que contiene sales adecuadas, por
ejemplo aquellas que contienen un anión adecuado tal como el
cloruro. Uno de tales sales es el cloruro de sodio. Las fracciones
que contienen MAL se pueden aislar de la columna. Estas fracciones
se pueden identificar espectroscópicamente por ejemplo como se
ilustra más adelante.
En los experimentos mostrados más adelante, se
ha descubierto que en general, las fracciones más activas de MAL
eluyen primero aunque algunas se pueden posponer hasta un segundo
pico de elución.
Utilizando el proceso de la invención, se puede
obtener MAL de una amplia variedad de fuentes de
\alpha-lactoalbúmina. Por ejemplo se puede aislar
de fracciones de caseína o de fracciones de leche de cualquiera de
los mamíferos mencionados anteriormente o de
\alpha-lactoalbúmina monomérica comercialmente
disponible que deriva de cualquiera de estos mamíferos. Por
ejemplo, la \alpha-lactoalbúmina monomérica bovina
se puede transformar a MAL terapéutica con un rendimiento alto, en
algunos casos sustancialmente por completo de acuerdo con la
invención.
Una columna pretratada se puede usar
reiteradamente para transformar numerosas fracciones de
\alpha-lactoalbúmina a MAL. Una vez que la
columna está agotada o que la tasa de conversión desciende a niveles
inaceptables, se puede repetir el paso de pretratamiento para
reestablecer la actividad de producción de MAL aumentada.
La razón por la que el "entrenamiento" de
la columna de esta manera es tan provechoso en la producción de MAL
no está completamente clara. Es posible que los componentes de la
caseína y en particular el ácido oleico retenido en la columna
catalice la producción de MAL o estabilice la
\alpha-lactoalbúmina en su forma oligomérica.
Las columnas y medios de intercambio iónico que
se han entrenado o condicionado de esta manera forman otro aspecto
más de la invención, como lo hace la
\alpha-lactoalbúmina oligomérica que se obtiene
utilizando este método.
La invención se describirá ahora a modo de
ejemplo con referencia a las figuras esquemáticas que la acompañan
en las que:
la Figura 1 muestra un cromatograma de
intercambio iónico obtenido mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina monomérica humana pretratada
a través de una columna de intercambio iónico limpia;
la Figura 2 muestra un cromatograma de
intercambio iónico obtenido mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina monomérica humana pretratada
y lípidos a través de una columna de intercambio iónico limpia;
la Figura 3 muestra un cromatograma de
intercambio iónico obtenido mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina monomérica humana a través de
una columna de intercambio iónico entrenada según la invención;
la Figura 4 muestra un cromatograma de
intercambio iónico obtenido mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina monomérica bovina a través de
una columna de intercambio iónico entrenada según la invención;
la Figura 5 A) es un cromatograma de intercambio
iónico obtenido mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina humana aislada de leche
humana mediante precipitación con sulfato amónico a través de una
columna entrenada con caseína; B) es un cromatograma de intercambio
iónico obtenido mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina humana aislada de leche
humana mediante precipitación con sulfato amónico y tratada con EDTA
a través de una columna entrenada con caseína; C) es un cromatograma
de intercambio iónico obtenido mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina humana aislada de leche
humana mediante precipitación con sulfato amónico y tratada con EDTA
a través de una columna entrenada con caseína utilizando tampones
que contienen EDTA;
la Figura 6A) es un cromatograma de intercambio
iónico de caseína humana con un recuadro del PAGE de la fracción que
induce apoptosis (VI); 6B es un cromatograma de exclusión molecular
de la fracción que induce apoptosis (VI) con el PAGE de los
correspondientes picos en el recuadro; 6C es el espectro de
fluorescencia con ANS 1.5 \muM de MAL y
\alpha-lactoalbúmina nativa; y 6D muestra el
espectro de dicroísmo circular en la región del UV cercana
registrada a 25ºC de MAL y \alpha-lactoalbúmina
nativa;
la Figura 7 es un cromatograma de intercambio
iónico obtenido mediante elución de la muestra de
\alpha-lactoalbúmina humana aislada de leche
humana mediante precipitación con sulfato amónico y tratada con EDTA
a través de una columna entrenada con lípidos extraídos de una
columna condicionada con caseína; y
la Figura 8 muestra cromatogramas de intercambio
iónico obtenidos mediante elución de una muestra de
\alpha-lactoalbúmina humana aislada de leche
humana mediante precipitación con sulfato amónico y tratado con EDTA
a través de una columna entrenada con ácidos grasos libres
comerciales donde "Nativa" se refiere a la
\alpha-lactoalbúmina no tratada y "Apo" se
refiere a la \alpha-lactoalbúmina tratada con
EDTA.
En los cromatogramas de intercambio iónico que
se muestran en las Figuras, el pico de proteína se indica por una
línea gruesa.
La matriz de intercambio iónico utilizada en los
siguientes ejemplos fue DEAE Trisacril M de BioSepra, Francia. Los
tampones fueron: Tampón A, Tris-HCl 10 mM pH 8.5 y
Tampón B, Tris-HCl 10 mM pH 8.5 con NaCl 1M.
Los experimentos se llevaron a cabo a
temperatura ambiente (22ºC). La muestra se disolvió en 10 ml del
tampón A.
Se inyectaron las muestras disueltas en la
columna a 1 ml/minuto. La columna se eluyó después con tampón A
durante 10 minutos para introducir la muestra en la columna. Después
se generó un gradiente del 15-30% del tampón B. El
gradiente se mantuvo al 30% del tampón B durante 20 minutos tiempo
en el que la proteína no deseada se eluyó de la columna. Se aumentó
entonces la concentración del tampón B al 100% que se mantuvo
durante 10 minutos. Donde estuviera presente, una fracción que
contenía MAL eluyó de la columna durante este período. La
concentración del tampón B se redujo al 0% que se mantuvo durante 20
minutos. Después de esto, la concentración del tampón B se aumentó
otra vez al 100% y se mantuvo durante 20 minutos, durante los cuales
se eluyó una segunda fracción que contenía MAL. La concentración se
redujo después al 0% y la columna se eluyó con tampón A solo durante
otros 50 minutos.
El producto se analizó utilizando electroforesis
en gel (geles de Tris-Glicina PAGE del
4-20%) como se ha descrito previamente en WO
96/04929, el contenido del cual se incorpora aquí por
referencia.
Ejemplo comparativo
A
Este ejemplo se llevó a cabo utilizando una
matriz de intercambio iónico nueva y no utilizada previamente. La
\alpha-lactoalbúmina monomérica (ca. 25 mg) se
añadió a la columna de la forma que se ha explicado anteriormente.
En esta ocasión no se obtuvieron picos multiméricos detectables.
La \alpha-lactoalbúmina
monomérica (20 mg) se sometió a un procedimiento utilizado en la
precipitación de la caseína. Específicamente, la muestra se mezcló
con oxalato potásico al 10% y se incubó durante la noche a 4ºC.
Después se bajó el pH a 4.3 y la muestra se incubó a 32ºC durante 2
horas. Tras incubar durante la noche a 4ºC, la muestra se añadió a
la columna. Aunque se detectaron pequeños picos multiméricos (Figura
1), no se encontró proteína después de la diálisis y liofilización
del producto.
La \alpha-lactoalbúmina
monomérica (20 mg) se mezcló con lípidos extraídos de leche humana
entera, se sometió al procedimiento de precipitación de la caseína
descrito anteriormente, y se añadió a la columna. De nuevo se
detectaron pequeños picos multiméricos pero no se encontró proteína
después de la diálisis y liofilización (Figura 2).
En este ejemplo, se hicieron correr 300 mg de
caseína derivada de leche humana en una matriz de intercambio
iónica nueva no utilizada. La matriz se lavó entonces con dos
carreras de tampón A. Se añadió a la columna
\alpha-lactoalbúmina humana monomérica (8 mg) no
tratada comercialmente disponible (Sigma). Se encontraron dos picos
multiméricos (Figura 3). Se hicieron correr cuatro muestras más a
través de esta columna y todas produjeron dos picos
multiméricos.
Ejemplo comparativo
B
El Ejemplo A anterior se repitió utilizando
diferentes muestras de matriz no usada y con muestras de
\alpha-lactoalbúmina bovina monomérica disponible
comercialmente (Sigma). Ninguna de las muestras produjo picos
multiméricos.
Se repitió el Ejemplo 1 anterior utilizando
\alpha-lactoalbúmina bovina monomérica en lugar de
\alpha-lactoalbúmina humana. Se obtuvieron dos
picos multiméricos claros.
Se obtuvieron suministros de
\alpha-lactoalbúmina de varias fuentes incluyendo
\alpha-lactoalbúmina humana y bovina disponibles
comercialmente (Sigma) y \alpha-lactoalbúmina
aislada de leche humana mediante precipitación con sulfato amónico
de todas las proteínas excepto la
\alpha-lactoalbúmina, y después haciendo correr el
sobrenadante en una columna de fenil-sepharosa.
La muestras se eluyeron de una columna según se
describe en el Ejemplo 1 (Figura 3 y 5A). Un segundo grupo de
muestras se pretrataron con EDTA añadiendo 7 mg de
\alpha-lactoalbúmina a 10 ml de tampón A con EDTA
1 mM. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante alrededor de
3 horas y después se añadió a la columna entrenada y se hizo correr
utilizando los tampones explicados en el Ejemplo 1.
Un tercer grupo de muestras se trataron con un
tampón con EDTA y se hicieron correr utilizando tampones con EDTA
(Figura 5C).
Los dos picos que se cree que contenían MAL se
guardaron separados y se ensayaron individualmente. El ensayo se
llevó a cabo según se describe después en el Ejemplo 4. Los
resultados representativos están clasificados en la
Tabla 1.
Tabla 1.
| * Viabilidad de células tumorales incubadas con MAL según se describe posteriormente. |
| ^{+} Obtenida usando un paso de precipitación con sulfato amónico según se ha discutido anteriormente. |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados indican, que la primera
fracción que eluye conteniendo MAL es la más activa. Es posible que
el segundo pico contenga solo algo de MAL residual que se
"perdió" del primer pico.
Con ciertas muestras, y en particular, aquellas
aisladas de leche humana utilizando un paso de precipitación con
sulfato amónico según se ha explicado anteriormente, se necesita
retirar parte del calcio para asegurar una conversión eficiente de
la \alpha-lactoalbúmina monomérica a MAL.
Se ensayó la eficacia biológica de los productos
obtenidos anteriormente en los Ejemplos 1 y 2 utilizando líneas
celulares tumorales según se describen en H\ring{a}kansson et
al., (1995) supra. Se incubaron las líneas celulares con
muestras de los productos a varias concentraciones en medio de
cultivo celular a 37ºC durante diversos períodos de tiempo. Tras la
incubación, las células se recogieron y se determinó la viabilidad
celular utilizando un colorante vital (azul tripán).
La longitud de los fragmentos de ADN de los
oiligonucleosomas se determinó mediante electroforesis en gel de
agarosa. Las células (2x10^{6}) se lisaron en tampón Tris 5 mM,
EDTA 20 mM, Triton X-100 al 0.5% pH 8.0 a 4ºC
durante 1 hora y se centrifugaron a 13,000 x g durante 15 minutos.
El ADN se precipitó con etanol durante la noche a -20ºC, se trató
con proteinasa K y ARNasa, se cargó en geles de agarosa al 1.8% y se
sometió a electroforesis a voltaje constante fijado a 50V durante
la noche. Los fragmentos de ADN se observaron con bromuro de etidio
utilizando una fuente de luz UV de 305 nm y se fotografiaron
utilizando una película Polaroid positiva-negativa
de tipo 55.
El análisis de los resultados reveló la
existencia de fragmentación del ADN en todos los casos, indicativo
de apoptosis.
La actividad de los productos de los Ejemplos 1
y 2 anteriores fue similar a la obtenida utilizando proteína
aislada de la caseína de la leche humana según se describe en
H\ring{a}kansson et al., (1995) supra.
Se llevó a cabo una serie adicional de
experimentos para caracterizar MAL en mayor medida.
Se descongeló leche humana congelada y se
centrifugó (Sorvall RC-5B centrifuga refrigerada de
alta velocidad, Du Pont Instruments, Wilmington DE, EE.UU.) a 2500
x g durante 15 minutos; se retiró la capa superior de grasa. La
caseína se aisló mediante una incubación durante la noche a +4ºC con
oxalato potásico al 10% seguida de una segunda incubación durante
la noche a +4ºC tras bajar el pH a 4.3 utilizando ácido clorhídrico
1 M y calentando la disolución a 32ºC durante 2 horas. Se recogió
el precipitado de caseína mediante centrifugación a 5000 x g
durante 15 minutos, se lavó con 3-5 ciclos de
centrifugación y resuspensión en agua destilada y se liofilizó. La
caseína se fraccionó más en una columna de intercambio iónico (14 cm
x 1.5 cm) empaquetada con DEAE Trisacril M (BioSepra, Francia)
unido a un sistema de cromatografía Biologic (Biorad Laboratories,
Alfred Nobel Drive, Hercules, CA, EE.UU.) utilizando un gradiente
ascendente de NaCl. La carrera se llevó a cabo en las siguientes
condiciones: tampón A: Tris/HCl 10 mM pH 8.5; tampón B: tampón A que
contiene NaCl 1 M/L. Programa de gradiente: desde el inicio hasta
15 ml, 0% de B; de 15 a 55 ml, 0-15% de B; de 55 a
75 ml, 15% de B; a los 75 ml 100% de B durante 10 min; de 85 a 115
ml, 0% de B; a los 115 ml, 100% de B durante 20 min; de 135 al final
0% de B. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y el tamaño de las
fracciones fue de 0.5 ml. Los picos se detectaron mediante la
absorbancia a 280 nm. El eluido se desaló mediante diálisis
(Spectra/Por, Spectrum Medical Industries, Laguna Hill CA, EE.UU.,
límite de la membrana de 3.5 kD) frente a agua destilada durante al
menos 48 horas y se liofilizó.
La MAL eluyó como un solo pico tras NaCl 1
M.
Se llevó a cabo PAGE analítica utilizando geles
preformados en un sistema Mini Protean II de
Bio-Rad. Cada fracción liofilizada
(5-10 mg/ml) se resuspendió en 10 \mul de tampón
de carga Tris-Hcl 0.5 M, pH 6.8 al 13.1%, glicerol
al 10.5%, SDS al 1.2% y azul de bromofenol al 0.05%, y se cargó en
el gel, que se corrió con tampón Tris-glicina (pH
8.3) con SDS al 0.1% a un voltaje constante de 200V alrededor de 40
min. Las proteínas se tiñeron con una solución de azul de Coomassie
al 0.1%.
La cromatografía de exclusión molecular se
efectuó mediante filtración en gel, llevada a cabo en una columna
de filtración en gel de Sepharosa 12 (S-12) de
Pharmacia en Tris-HCl 10 mM, pH 7.5 con NaCl 0.15 M,
y se detectó mediante absorción a 280 nm. La velocidad de flujo fue
de 0.3 ml/min y el tamaño de la fracción fue de 0.5 ml. Se
recogieron los picos observados y se desalaron mediante diálisis
frente a agua destilada.
El análisis de los aminoácidos de la zona
N-terminal de MAL tras la filtración en gel descrita
anteriormente utilizando la degradación de Edman se llevó a cabo en
un secuenciador automático de pulso líquido (Applied Biosystems
modelo 477A). Los resultados, mostrados en la Tabla 2, confirman la
identidad de MAL con la \alpha-lactoalbúmina
humana.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| Unk, indica desconocido; conforme a resultados publicados, el residuo 6 de la \alpha-lactoalbúmina es cisteína. | |
| Los residuos mostrados debajo de las secuencias de 60 y 100 kD de MAL son otros candidatos posibles. |
Estas técnicas mostraron que el componente
proteico de MAL consistía en monómeros de
\alpha-lactoalbúmina así como oligómeros de
diferente tamaño molecular (Figura 6A y B).
Se registraron los espectros de emisión de
fluorescencia de ANS entre 400 y 700 nm (paso 1 nm) con excitación
a 385 nm. El paso de banda tanto de la excitación como de la emisión
se ajustó a 5 nm. La concentración de las soluciones de proteína
fue de 1.0 mg/ml, que corresponde a 70 \muM del monómero, en un
tampón fosfato potásico 10 mM a pH 7.5.
Se descubrió que el espectro de ANS para MAL
estaba desplazado hacia el azul con respecto al espectro de la
\alpha-lactoalbúmina monomérica nativa, con un
máximo de intensidad a 475 nm y una producción de cuanto aumentada
indicando que ANS se une a MAL (Figura 6C). Se llevaron a cabo
análisis adicionales mediante dicroísmo circular. Los espectros de
dicroísmo circular (DC) se obtuvieron utilizando un
espectropolarímetro JASCO J-720 con un soporte de
células termostatizado tipo JASCO PTC-343 Peltier.
Se utilizaron cubetas de cuarzo con una longitud de paso de 1 cm.
Las proteínas se disolvieron en tampón fosfato potásico 10 mM a pH
7.5 y las concentraciones del extracto de proteínas se determinaron
utilizando análisis de aminoácidos después de hidrólisis ácida.
Se registraron los espectros de UV cercano para
entre 300 y 240 nm. El paso de longitud de onda fue de 1 nm, el
tiempo de respuesta de 4 s y la velocidad de barrido de 10 nm por
minuto. Se registraron seis barridos y se hizo la media para cada
espectro. Se registraron espectros para los valores basales con
tampón puro en cada cubeta y se restaron de los espectros de las
proteínas. Se calculó la elipticidad media de los residuos
\theta_{m}, a partir de la elipticidad registrada \theta,
como,
\theta_{m}
=
\theta/(c.n.l)
donde c es la concentración de
proteína en M, n el número de residuos en la proteína (en este caso
123) y l la longitud de paso en
m.
Mediante DC de UV cercano, MAL mostró un mínimo
a 270 nm que proviene de los residuos de tirosina y un máximo a 294
nm que proviene de los residuos de triptófano, y fue prácticamente
idéntica a la \alpha-lactoalbúmina nativa, pero
con una señal más baja. Esto indica que el movimiento de las
tirosinas y los triptófanos está menos restringido en MAL comparada
con la \alpha-lactoalbúmina nativa (Figura
6D).
Estos análisis espectroscópicos mostraron que
MAL consistía en \alpha-lactoalbúmina parcialmente
desplegada en el estado tipo glóbulo fundido.
Esto indica que debería ser posible producir MAL
a partir de \alpha-lactoalbúmina monomérica en
condiciones que induzcan los cambios de plegamiento adecuados.
Se purificó la
\alpha-lactoalbúmina monomérica a partir de leche
humana mediante precipitación con sulfato amónico. El sulfato
amónico se añadió como una sal, 264 g/l de leche, y la mezcla se
incubó durante la noche a 4ºC. La mezcla se centrifugó después
(Sorvall RC-5B centrifuga refrigerada de alta
velocidad, Du Pont Instruments, Wilmington DE, EE.UU.) a 5000 x g
durante 15 minutos. Se recogió la fracción de suero, se liofilizó y
se disolvió en Tris/HCl 50 mM con EDTA 35 mM, pH 7.5. Se empaquetó
una columna de 400 ml de fenil-sepharosa (Pharmacia
Biotech, Björkgatan, Uppsala, Suecia) en Tris/HCl 50 mM con EDTA 1
mM, pH 7.5, y se cargaron en la columna 500 ml de muestra. La
columna se eluyó primero con Tris/HCl 50 mM con CaCl_{2} 1 mM, pH
7.5.
Para la conversión de la
\alpha-lactoalbúmina monomérica, las muestras se
disolvieron en Tris/HCl 10 mM pH 8.5 (tampón A) antes de cargarlas
en la columna. Se recogió el material eluido con NaCl 1 M, se desaló
y se liofilizó.
La \alpha-lactoalbúmina
monomérica se sometió a una cromatografía de intercambio iónico en
condiciones idénticas a aquellas utilizadas en la purificación de
MAL. Se cargaron diez miligramos de
\alpha-lactoalbúmina en una matriz de columna
nueva que se eluyó después según se ha descrito anteriormente. Esto
no produjo ningún material transformado. Esto confirma el resultado
descrito en el Ejemplo Comparativo A anteriormente.
La \alpha-lactoalbúmina
monomérica en el estado nativo y la
\alpha-lactoalbúmina tratada con EDTA se
sometieron a cromatografía de intercambio iónico en una columna
condicionada con caseína. La \alpha-lactoalbúmina
monomérica nativa se transformó en la forma multimérica y eluyó en
la misma posición que MAL, pero el pico no tenía actividad
inductora de apoptosis. La \alpha-lactoalbúmina
tratada con EDTA se transformó completamente a la forma oligomérica
y eluyó como un solo pico tras NaCl 1 M en la misma posición que
MAL. El material de \alpha-lactoalbúmina
transformado tenía actividad biológica significativa cuando se
ensayó según se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados de la columna condicionada con
caseína indicaron que un factor adicional presente en la caseína
(factor X) se requería para la formación de MAL y eluyó con la
\alpha-lactoalbúmina a NaCl 1 M. El factor X se
consumió según muestra un descenso en el rendimiento de MAL que se
observa después de seis carreras.
El factor X se identificó mediante elución de la
matriz de la columna en condiciones apropiadas para proteínas o
lípidos. La extracción de matriz no utilizada se incluyó como
control. La matriz de la columna condicionada con caseína se eluyó
con NaCl 1 M, EDTA 10 mM, urea 4 M y etanol al 20%. La columna se
unió a un sistema de cromatografía Biologic y las condiciones de
carrera fueron las mismas que para la purificación de caseína
(descrito anteriormente).
La elución con EDTA 10 mM no liberó otra
proteína detectable que la \alpha-lactoalbúmina
monomérica. Urea 4 M, NaCl 1 M, o etanol (al 20%) solo liberaron
\alpha-lactoalbúmina oligomérica residual
detectada con PAGE.
\newpage
La matriz de la columna se extrajo con solventes
orgánicos (cloroformo/metanol) y los lípidos extraídos se
analizaron mediante TLC. La matriz nueva contenía pequeñas
cantidades de fosfolípidos y ácidos grasos libres. La matriz
condicionada con caseína contenía fosfolípidos, diglicéridos,
colesterol, ácidos grasos libres y triglicéridos, es decir, las
mismas clases de lípidos que la leche humana. Tras la elución de la
matriz condicionada con caseína con
\alpha-lactoalbúmina monomérica según se ha
descrito en el Ejemplo 6 anteriormente, el contenido en ácidos
grasos libres descendió, sugiriendo que este componente se
consumía.
Los lípidos se extrajeron según Zeisel et
al., Nutr. 1986, 116, 50-58. Brevemente, se
disolvieron 2 ml de matriz en 25 ml de agua estéril y se mezclaron
con 125 ml de cloroformo/metanol (1:2 vol/vol), las soluciones se
mezclaron a temperatura ambiente durante 15 min, se incubaron en
hielo durante una hora y se centrifugaron a 11 600 x g durante 10
min (Sorvall RC-5B centrifuga refrigerada de alta
velocidad, Du Pont Instruments, Wilmington DE, EE.UU.). Los
sobrenadantes se aspiraron. Los precipitados se resuspendieron en
150 ml de cloroformo/metanol/agua (1:2:0.8 vol/vol/vol) se
mezclaron durante 2 min y se centrifugaron a 11 600 x g durante 10
min. Los sobrenadantes se transfirieron a embudos de decantación y
se añadieron 175 ml de cloroformo/metanol (1:1 vol/vol). Se dejó
que las fases se separaran durante la noche a temperatura ambiente.
Las fases orgánicas se recogieron y se evaporaron a sequedad bajo
nitrógeno.
El contenido de ácidos grasos libres de los
extractos se analizó utilizando cromatografía de capa fina (TLC,
thin layer chromatography). Los lípidos extraídos de 2 ml de matriz
se disolvieron en 10 \mul de cloroformo y se aplicaron en placas
de sílice. Los estándar (monoglicéridos, diglicéridos, colesterol,
ácidos grasos, triglicéridos y ésteres de colesterol) se aplicaron
de forma similar. Los lípidos se separaron utilizando éter de
petróleo/éter dietílico/ácido acético/metanol (80:20:1:2
vol/vol/vol/vol) y los lípidos se observaron pulverizando las
placas con ácido fosfomolíbdico seguido por calentamiento a 120ºC
durante aproximadamente 10 min y se identificaron por comparación
con los estándar conocidos.
Los extractos de la columna se analizaron
utilizando cromatografía de gases (CG). La matriz nueva contenía
cantidades pequeñas de C 16:0, C 18:1, C 12:0 y C 14:0. La matriz
condicionada con caseína contenía cantidades elevadas de C 16:0 y C
18:1, y también algo de C 14:0. Tras la elución con
\alpha-lactoalbúmina de la matriz condicionada
con caseína contenía los mismos tipos de ácidos grasos libres, pero
en mucha menos cantidad.
Los lípidos extraídos de la columna condicionada
con caseína se utilizaron para condicionar una matriz de
intercambio iónico limpia. Los lípidos extraídos de una columna
condicionada con caseína se disolvieron en 500 \mul de etanol al
95% antes de que se añadiera el tampón A. La solución de lípidos se
añadió a la columna y se realizó una carrera del programa para
distribuir los lípidos totalmente por la columna. Allí se añadieron
10 mg de \alpha-lactoalbúmina monomérica en el
estado tipo glóbulo fundido y el programa se corrió otra vez. La
\alpha-lactoalbúmina eluyó como un solo pico en la
posición que MAL, y se descubrió que tenía actividad inductora de
apoptosis (Figura 7).
El análisis por TLC de los lípidos de la matriz
sugirió que los ácidos grasos libres estaban implicados en la
producción de MAL. El análisis por CG mostró que el ácido palmítico
C 16:0 y el ácido oleico C 18:1 estaban unidos a la matriz tras el
condicionamiento con caseína.
Se añadieron ácidos grasos a una columna que
contenía matriz nueva. Se disolvieron dos mg de ácido palmítico (C
16:0), ácido esteárico (C 18:0), ácido oleico (C 18:1), o ácido
linoleico (C 18:2) en 500 \mul de etanol al 95% y después se
añadió tampón A. Cada solución de lípido se añadió a la columna y se
realizó una carrera del programa para distribuir los lípidos
totalmente por la columna. Tras cada condicionamiento, se añadieron
10 mg de \alpha-lactoalbúmina monomérica en estado
tipo glóbulo fundido y el programa se corrió otra vez.
La matriz condicionada con ácido oleico
transformó eficientemente la \alpha-lactoalbúmina
que eluyó como un solo pico en la misma posición que MAL. El ácido
esteárico C 18:0 y el ácido palmítico C 16:0 no tuvieron ningún
efecto (Figura 8).
Esto indica que el ácido oleico es el factor
X.
Para confirmar que los lípidos por si mismos no
eran responsables de la actividad biológica observada, se sometió a
MAL a una extracción con solventes orgánicos. Los lípidos se
analizaron mediante TLC. Se descubrió que MAL contenía del
10-25% de lípidos en peso de las mismas clases
principales de lípidos que la leche humana y la matriz condicionada
con caseína; predominaban los triglicéridos, seguidos por los ácidos
grasos libres, los mono- y di- glicéridos, y los fosfolípidos. El
análisis mediante CG de los ácidos grasos libres mostró que
predominaba C 18:1, seguido de C 16:0 y C 14:0.
La línea celular L1210 (CCL 219) se obtuvo de la
American Type Culture Collection (ATCC), se cultivó en botellas de
25 cm^{2} (Falcon, Becton Dickinson, New Jersey, EE.UU.) a una
densidad de 2 x 10^{6}/pocillo en RPMI suplementado con suero
fetal de ternera al 10%, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales,
piruvato sódico, 50 \mul de gentamicina /ml y para las células
L1210 2-mercaptoetanol \muM, se mantuvo a 37ºC en
una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%, cambiando el medio
cada tres días. Las células se recogieron mediante centrifugación
(200 g durante 10 minutos). El precipitado de células se resuspendió
en RPMI y se sembraron en placas de 24 pocillos (Falcon, Becton
Dickinson, New Jersey, EE.UU.).
Los lípidos extraídos de MAL según se ha
descrito anteriormente y de la matriz de la columna se disolvieron
en medio de cultivo, que carecía de suero fetal de ternera, mediante
sonicación durante 3 minutos en un baño sonicador (Branson 2200,
Branson, Danbury, EE.UU.) y se añadieron a las células. El volumen
final se ajustó con medio hasta 1 ml por pocillo. Las placas se
incubaron a 37ºC en una atmósfera con CO_{2} al 5% durante 6
horas añadiendo 50 \mul de suero fetal de ternera a cada pocillo
después de 30 minutos. Como control se utilizó medio sin
lípidos.
La viabilidad celular se determinó mediante
exclusión de azul tripán. Las células (2x10^{6}) se recogieron
por aspiración, se resuspendieron en PBS (5 ml) y se lavaron
mediante ciclos repetidos de centrifugación y resuspensión en PBS.
El precipitado de células lavado se resuspendió en 1 ml de PBS, se
mezclaron 30 \mul con 30 \mul de una solución de azul tripán al
0.2% y se determinó el número de células teñidas (células muertas)
por cada 100 células mediante microscopía de contraste de
interferencia (Ortolux II).
Se ensayaron los lípidos de MAL para actividad
inductora de apoptosis utilizando células L1210. La concentración
de los lípidos se definió en "equivalentes de MAL" como la
cantidad extraída de una masa determinada de MAL. MAL a 0.7 mg/ml
indujo apoptosis en células L1210 observado por disminución en la
viabilidad celular y la formación de fragmentos de ADN. Sin
embargo, los lípidos de 0.5 a 1 mg de MAL no tuvieron ningún efecto
en la viabilidad celular o la fragmentación de ADN. La viabilidad
celular con lípidos a 2.5 equivalentes de MAL se redujo a un 45% y
se observó fragmentación de ADN, pero a concentraciones mayores las
células murieron por necrosis, y no se observó fragmentación de
ADN. Los lípidos de MAL no eran activos a concentraciones a las que
MAL intacta mataba las células. Los resultados se muestran en la
Tabla 3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los lípidos extraídos de una matriz condicionada
con caseína, a 0.7 mg/ml, mataron las células por necrosis. Los
lípidos de una matriz nueva o de una matriz condicionada con caseína
tras elución con \alpha-lactoalbúmina no tuvieron
efecto en las células incluso a 1 mg/ml. Los lípidos extraídos de
una matriz condicionada con caseína (0.5 mg/ml) se mezclaron con
\alpha-lactoalbúmina (1 mg/ml). Las células aún
murieron por necrosis, indicando que la mezcla de
\alpha-lactoalbúmina con lípidos no produjo la
forma multimérica inductora de apoptosis.
Se aislaron el gen humano ala completo y
sus secuencias contiguas de una genoteca genómica de tejidos de la
placenta humana construido en el bacteriófago \lambda L47 (Hall,
L., Emery, D.C., Davies, M.S., Parker, D., y Craig R.K.
Organization and sequence of the human
alpha-lactalbumin gene., Biochem. J. 242:
735-742, 1987). El gen tiene 2.3 kbp, contiene
cuatro exones y tres intrones, y está flanqueado por secuencias de
alrededor de 5 kbp a ambos lados. El gen se asignó a la región
12q13 por hibridación in situ (Hall, L., Emery, D.C.,
Davies, M.S., Parker, D., y Craig R.K. Organization and sequence of
the human alpha-lactalbumin gene. Biochem. J.
242: 735-742, 1987 y Davies, M.S., West,
L.F., Davies M.B., Povey, S., y Craig R.K. The gene for human
alpha-lactalbumin is assignated to chromosome
12q13., Ann Hum Genet, 1987).
Peng et al. consiguieron expresión de la
\alpha-lactoalbúmina humana en E. coli
(Peng, Z.Y., y Kim, P.S. A protein dissection study of a molten
globule., Biochemistry, 33: 2136-41, 1994).
Se sintetizó un ADN que comprende los cuatro exones de ala
utilizando oligonucleótidos que corresponden a los codones
característicos para E. coli. Se transformaron E. coli
BL21 con un vector basado en la polimerasa de T7, proporcionando el
promotor, los sitios de inicio de la traducción y terminación de la
traducción del bacteriófago T7. Se han construido mutaciones en las
regiones codificantes de ala implicadas en el plegamiento y
en la unión a Ca^{2+}. El plásmido pALA lleva el gen humano
ala entero, pALD- el gen del dominio \alpha de ALA,
pALA-ala con todos los residuos de cisteína cambiados a
alanina. pALA-AZ lleva las secuencias de ala
mutadas reemplazando las cisteínas 61, 73, 77 y 91 con alaninas
(Peng, Z.Y., y Kim, P.S. A protein dissection study of a molten
globule., Biochemistry, 33: 2136-41, 1994).
En pALA-BZ las cisteínas 6, 28, 111 y 120 se
cambiaron a alaninas, y en pALA (28-111) un solo
puente disulfuro entre las cisteínas 28-111
permaneció mientras que el resto de las cisteínas se cambiaron a
alaninas. La inactivación mutacional de los puentes disulfuro en la
lámina \beta y entre los dominios de la molécula destruye el sitio
de unión a Ca^{2+} (pALA-BZ).
Las células de insecto secretan proteínas
humanas si están clonadas en el mismo marco de lectura en un vector
con las secuencias señales apropiadas. Los vectores pMelBac son
vectores de transferencia a baculovirus designados para dirigir la
expresión de proteínas recombinantes a través de la vía secretora al
medio extracelular.
La secuencia ala entera se amplificó
mediante PCR a partir del vector pALA, que codifica el gen completo
de ala humana, y se ligó en el vector de baculovirus pMelBacB
detrás de la señal de melatonina. El pMelBacB que lleva el inserto
de ala se cotransfectó con el ADN
Bac-N-Blue linearizado en células de
insecto para permitir la recombinación homóloga y producir virus
viables. Se formaron placas recombinantes en células High Five, y se
detectó secreción de \alpha-lactoalbúmina.
El material recombinante obtenido de esta forma
se puede someter a oligomerización en el estado nativo y en el
estado tipo glóbulo fundido para producir MAL biológicamente
activa.
Claims (41)
1. Un método para producir
\alpha-lactoalbúmina biológicamente activa que
comprende monómeros y oligómeros de diferente tamaño molecular,
método que comprende poner en contacto la
\alpha-lactoalbúmina, al menos parte de la cual
está en estado tipo glóbulo fundido, con un reactivo de conversión
que es ácido oleico, y que resulta en la producción de dicha forma
biológicamente activa.
2. Un método según la reivindicación 1 en donde
la \alpha-lactoalbúmina, al menos parte de la cual
se encuentra en un estado tipo glóbulo fundido, se pone en contacto
con el reactivo de conversión en condiciones que permiten que el
intercambio iónico tenga lugar.
3. Un método según la reivindicación 2 en donde
la \alpha-lactoalbúmina en el estado tipo glóbulo
fundido se aplica a una columna de intercambio iónico, que contiene
el reactivo de conversión.
4. Un método según la reivindicación 3 en donde
la columna de intercambio iónico es una columna de intercambio
aniónico.
5. Un método según la reivindicación 3 o la
reivindicación 4 en donde la columna de intercambio iónico se ha
eluido con el reactivo de conversión.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en donde una parte sustancial de la
\alpha-lactoalbúmina está en el estado tipo
glóbulo fundido.
7. Un método según la reivindicación 6 en donde
la \alpha-lactoalbúmina se somete a un paso de
pretratamiento para maximizar la cantidad presente de material en
estado tipo glóbulo fundido.
8. Un método según la reivindicación 7 en donde
en el paso de pretratamiento, la
\alpha-lactoalbúmina se pone en contacto con un
agente quelante de calcio.
9. Un método según la reivindicación 8 en donde
el agente quelante de calcio es el ácido etilendiamino
tetraacético.
10. Un método según la reivindicación 7 en donde
el paso de pretratamiento comprende exposición a pH bajo.
11. Un método según la reivindicación 10 en
donde el pH bajo se crea mediante adición de ácido clorhídrico, de
modo que se reduce el pH al orden de 2.
12. Un método según la reivindicación 7 en donde
el paso de pretratamiento comprende calentamiento, la
\alpha-lactoalbúmina se calienta a una temperatura
en exceso de 25-120ºC.
13. Un método según la reivindicación 12 en
donde la temperatura está en exceso de
70ºC-120ºC.
14. Un método según la reivindicación 1 en donde
la \alpha-lactoalbúmina se pone en contacto con el
reactivo de conversión en una columna de intercambio iónico, y en
donde la \alpha-lactoalbúmina se aplica a la
columna junto con el reactivo que provocará su transformación al
estado tipo glóbulo fundido.
15. Un método según la reivindicación 14 en
donde el reactivo que induce el glóbulo fundido es un agente
quelante de calcio que está presente en el tampón de elución.
16. Un método según la reivindicación 15 en
donde el agente quelante de calcio es EDTA.
17. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en donde la
\alpha-lactoalbúmina es una forma mutada de la
proteína nativa en la que los sitios de unión a calcio están
modificados.
18. Un método según la reivindicación 17 en
donde al menos algunos residuos de cisteína de la
\alpha-lactoalbúmina están mutados.
19. Un método para producir
\alpha-lactoalbúmina biológicamente activa que
comprende monómeros y oligómeros de diferente tamaño molecular,
método que comprende exponer una fuente de
\alpha-lactoalbúmina a un medio de intercambio
iónico que ha sido pretratado con una fracción de leche que contiene
caseína o ácido oleico, y recuperar de allí la
\alpha-lactoalbúmina en una forma biológicamente
activa.
20. Un método según la reivindicación 19 en
donde el ácido oleico está en una forma sustancialmente pura.
21. Un método según la reivindicación 19 en
donde el medio de intercambio iónico se ha tratado con una fracción
de leche que contiene caseína derivada de leche humana.
\newpage
22. Un método según la reivindicación 19 o la
reivindicación 21 en donde el medio de intercambio iónico se ha
tratado con una fracción de leche que contiene caseína que se ha
congelado previamente o deriva de leche congelada.
23. Un método según la reivindicación 19 o la
reivindicación 21 en donde la fracción de leche que contiene caseína
utilizada en el pretratamiento del medio de intercambio iónico se ha
sometido a hidrólisis.
24. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 23 en donde una parte sustancial de la
\alpha-lactoalbúmina aplicada al medio de
intercambio iónico está en el estado tipo glóbulo fundido.
25. Un método según la reivindicación 24 en
donde la \alpha-lactoalbúmina se transforma al
estado tipo glóbulo fundido poniéndola en contacto con un agente
quelante de calcio.
26. Un método según la reivindicación 25 en
donde el agente quelante de calcio es el ácido etilendiamino
tetraacético.
27. Un método según la reivindicación 25 o la
reivindicación 26 en donde el agente quelante de calcio se pone en
contacto con la \alpha-lactoalbúmina antes de
entrar en contacto con el medio de intercambio iónico.
28. Un método según la reivindicación 25 o la
reivindicación 26 en donde el agente quelante de calcio se añade a
un tampón de elución que es usado después para efectuar el contacto
entre la \alpha-lactoalbúmina y el medio de
intercambio iónico.
29. Un método según la reivindicación 26 en
donde la \alpha-lactoalbúmina se somete a un paso
de pretratamiento que implica exposición a pH bajo.
30. Un método según la reivindicación 24 en
donde la \alpha-lactoalbúmina se somete a un
pretratamiento en el que se calienta a una temperatura elevada.
31. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 30 en donde el medio de intercambio iónico se
dispone en una columna.
32. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 30 en donde el medio de intercambio iónico
comprende DEAE Trisacril.
33. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 32 que comprende eluir una columna de
intercambio iónico con una fracción de leche que contiene caseína o
los componentes activos de la misma en un tampón de intercambio
iónico, lavar la columna con el tampón de intercambio iónico, y
después eluir la columna con una fuente de
\alpha-lactoalbúmina disuelta en el tampón de
intercambio iónico en presencia de un gradiente de concentración de
sal.
34. Un método según la reivindicación 33 en
donde el tampón de intercambio iónico es
Tris-HCl.
35. Un método según la reivindicación 33 o la
reivindicación 34 en donde el gradiente de concentración de sal se
forma utilizando un tampón de intercambio iónico en que se ha
disuelto cloruro sódico.
36. Un método según la reivindicación 35 en
donde la columna se lava mediante elución con el tampón de
intercambio iónico dos veces.
37. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en donde dicha fuente de
\alpha-lactoalbúmina comprende
\alpha-lactoalbúmina monomérica bovina.
38. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en donde dicha fuente de
\alpha-lactoalbúmina comprende
\alpha-lactoalbúmina monomérica humana.
39. Un complejo biológicamente activo que
comprende una forma mutada de la
\alpha-lactoalbúmina nativa en la que los sitios o
dominios de unión a calcio están modificados de modo que se
interrumpe o previene la unión del calcio a los mismos, y ácido
oleico.
40. Un complejo biológicamente activo según la
reivindicación 39 en donde los dominios de unión a calcio están
interrumpidos.
41. Un complejo biológicamente activo según la
reivindicación 40 en donde los dominios de unión a calcio están
destruidos.
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