ES2287074T3 - Molecula de rna autorreplicante del virus de la hepatitis c. - Google Patents
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Abstract
Una polinucleótido autorreplicante del virus de la hepatitis C (VHC) que contiene una región no traducida (NTR) 5'' en la que la guanina situada en la posición 1 de dicha región está sustituida por adenina.
Description
Molécula de RNA autorreplicante del virus de la
hepatitis C.
La presente invención está relacionada en
términos generales con una molécula de RNA del VHC que posee la
capacidad de autorreplicarse en líneas celulares adecuadas,
concretamente con un constructo autorreplicante de RNA del VHC que
presenta una eficiencia mejorada para establecer su replicación en
cultivos celulares.
El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal
agente etiológico de la hepatitis postransfusional y la
extrahospitalaria que no es ni A ni B a nivel mundial. Se estima
que existen alrededor de 200 millones de personas en el mundo que
están infectadas con el virus. Un elevado porcentaje de portadores
pasa a sufrir infección crónica y gran parte evolucionan hacia una
enfermedad hepática crónica, la denominada hepatitis C crónica. Este
grupo se encuentra a su vez en una situación de riesgo elevado de
contraer enfermedades hepáticas graves como la cirrosis hepática,
el carcinoma hepatocelular o la enfermedad hepática terminal que
conlleva la muerte. El mecanismo mediante el cual el VHC establece
la persistencia vírica y causa una tasa elevada de enfermedad
hepática crónica todavía no se comprende con profundidad. Se
desconoce el modo en que el VHC interacciona con el sistema
inmunitario del huésped y lo elude. Además, todavía falta por
establecer el papel de las respuestas inmunitarias celular y
humoral en la protección frente a las infecciones y enfermedades
causadas por el VHC.
Se han llevado a cabo diversos estudios clínicos
con el objetivo de identificar compuestos farmacéuticos que
permitan tratar de un modo efectivo la infección por VHC en
pacientes que padecen hepatitis C crónica. En la realización de
estos estudios se ha empleado interferón-alfa,
exclusivamente o en combinación con otros agentes antivirales como
la ribavirina. Este tipo de estudios han demostrado que un número
sustancial de los participantes no responde a estos tratamientos, y
de aquellos que responden de forma favorable, se encontró que una
gran parte recayeron después de la finalización del tratamiento.
Hasta la fecha no existen compuestos antivirales que sean
totalmente efectivos para el tratamiento de la infección por el
VHC.
El VHC es un virus de RNA de cadena positiva y
con envoltura, y pertenece a la familia Flaviviridae. El
genoma de cadena única de RNA del VHC tiene una polaridad positiva y
comprende un marco abierto de lectura (ORF) de 9600 nucleótidos de
longitud aproximadamente que codifica una poliproteína lineal de
unos 3010 aminoácidos. En células infectadas, esta poliproteína es
escindida en múltiples sitios por proteasas celulares y víricas
para así producir proteínas estructurales y no estructurales (NS).
Las proteínas estructurales (C, E1, E2 y E2-p7)
comprenden polipéptidos que constituyen la partícula vírica
(Hijikata et al., 1991; Grakoui et al.,
1993(a)). Las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4A,
NS4B, NS5A, NS5B) codifican enzimas o factores auxiliares que
catalizan y regulan la replicación del genoma de RNA del VHC. El
procesado de las proteínas estructurales está catalizado por las
proteasas de la célula huésped (Hijikata et al., 1991). La
generación de las proteínas no estructurales maduras está
catalizada por dos proteasas codificadas por el virus. La primera
es la NS2/3 metaloproteasa dependiente de cinc que autocataliza la
liberación de la proteína NS3 de la poliproteína. La NS3 liberada
contiene un dominio aminoterminal serina proteasa (Grakoui et
al., 1993(b); Hijikata et al., 1993) y cataliza
el resto de escisiones de la poliproteína. La proteína NS4A liberada
desempeña por lo menos dos roles. En primer lugar, forma un
complejo estable con la proteína NS3 y colabora en la localización
en la membrana del complejo NAS3/NS4A (Kim et al., Arch
Virol. 1999, 144:329-343) y, en segundo lugar,
funciona como un cofactor para la actividad NS3 proteasa. Este
complejo asociado a la membrana cataliza a su vez la digestión del
resto de sitios de la poliproteína, efectuando de esta forma la
liberación de NS4B, NS5A y NS5B (Bartenschlager et al.,
1993; Grakoui et al., 1993(a); Hijikata et al.,
1993; Love et al., 1996; revisado en Kwong et al.,
1998). El segmento carboxiterminal de la proteína NS3 también
alberga actividad nucleósido trifosfatasa y RNA helicasa (Kim et
al., 1995). Se desconoce la función de la proteína NS4B. NS5A,
una proteína altamente fosforilada, parece ser la responsable de la
resistencia del interferón a diversos genotipos del VHC (Gale Jr.
et al. 1997 Virology 230,217; Reed et al.,
1997). La NS5B es una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP) que está implicada en la replicación del VHC.
1997). La NS5B es una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP) que está implicada en la replicación del VHC.
El marco abierto de lectura del genoma de RNA
del VHC se encuentra flanqueado en su extremo 5' por una región no
traducida (NTR) de una longitud aproximada de 340 nucleótidos que
funciona como el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, siglas
en inglés), y en su extremo 3' por una NTR de aproximadamente 230
nucleótidos. Para la replicación del genoma de RNA son importantes
las dos NTR, 5' y 3'. Las variaciones de las secuencias genómicas
no está distribuidas de forma uniforme a lo largo del genoma, y la
5'NTR y partes de la 3'NTR son los segmentos que presentan el grado
de conservación más elevado. La región 3'NTR auténtica altamente
conservada es el tema que trata la patente estadounidense US 5 874
565 concedida a Rice et al. Las secuencias parciales y
completas, clonadas y caracterizadas, del genoma del VHC también
han sido analizadas en referencia a dianas adecuadas para un
posible tratamiento antivírico. Existen cuatro actividades de
enzimas víricas que suponen dianas posibles, como son: (1) la NS2/3
proteasa, (2) el complejo NS3/4A proteasa, (3) la NS3 helicasa y (4)
la NS5B RNA polimerasa dependiente de RNA. El complejo NS314A
proteasa y la NS3 helicasa ya han sido cristalizados y se ha
determinado su estructural tridimensional (Kim et al., 1996;
Yem et al., 1998; Love et al., 1996; Kim et
al., 1998; Yao et al., 1997; Cho et al., 1998). La
NS5B RNA polimerasa dependiente de RNA también se ha cristalizado y
ha mostrado una estructura reminiscente de otras polimerasas de
ácido nucleico (Bressanelli et al. 1999, Proc. Natl. Acad.
Sci, USA 96: 13034-13039; Ago et al. 1999,
Structure 7: 1417-1426; Lesburg et al. 1999,
Nat. Struct. Biol. 6: 937-943).
A pesar de que se han definido dianas
importantes para el desarrollo de un tratamiento para la infección
crónica por VHC con estas enzimas, y a pesar de que se está
realizando una búsqueda intensiva de inhibidores adecuados a escala
mundial con la ayuda del diseño racional de fármacos y la evaluación
masiva de compuestos (HTS), el desarrollo del tratamiento presenta
una deficiencia principal que es la falta de sistemas de cultivo
celular o modelos animales simples que permitan una propagación
directa y fiable del virus del VHC. La falta de un sistema
eficiente de cultivos celulares sigue siendo la razón principal
hasta el momento de que la comprensión de la replicación del VHC
siga presentando problemas.
Aunque se han descrito los RNA autorreplicantes
de flavivirus y pestivirus y se han empleado para la replicación en
líneas celulares diferentes con un rendimiento relativamente
elevado, experimentos similares con el VHC no han tenido éxito
hasta la fecha (Khromykh et al., 1997; Behrens et al.,
1998; Moser et al., 1998). A partir de diversas
publicaciones se desprende que es posible infectar líneas celulares
o cultivos celulares primarios con suero de pacientes de título
elevado que contiene VHC (Lanford et al. 1994; Shimizu et
al. 1993; Mizutani et al. 1996; Ikda et al. 1998;
Fourner et al. 1998; Ito et al. 1996). Sin embargo,
estas líneas o cultivos celulares infectados por virus no permiten
la detección directa de RNA del VHC o de antígenos del VHC.
También se sabe a partir de las publicaciones de
Yoo et al. 1995 y de Dash et al. 1997 que es posible
transfectar líneas celulares de hepatoma con RNA sintético del VHC
obtenido mediante transcripción in vitro del genoma clonado
del VHC. En ambas publicaciones los autores partieron de la idea
básica de que el genoma vírico del VHC es un RNA de cadena positiva
que actúa directamente como mRNA una vez transfectadas las células
con él, lo que permite la síntesis de proteínas víricas en el
transcurso del proceso de traducción y, por tanto, se pueden formar
nuevas partículas del VHC cuyo RNA se podría detectar mediante
RT-PCR. No obstante, los resultados publicados de
los experimentos de RT-PCR indican que la
replicación del VHC en las células de hepatoma transfectadas
descritas no es especialmente eficiente y no es suficiente para
medir la calidad de la replicación, y mucho menos medir las
modulaciones que pueden ocurrir en la replicación tras la exposición
a posibles fármacos antivíricos. Asimismo, ahora se conoce que la
región 3'NTR altamente conservada es esencial para la replicación
del virus (Yanagi et al., 1999). Este hecho contradice de
forma contundente los postulados de Yoo et al.
(supra) y Dash et al. (supra), que emplearon
para sus experimentos exclusivamente genomas del VHC con regiones
3'NTR más cortas y no el verdadero extremo 3' del genoma del
VHC.
En WO 98/39031 Rice et al. describieron
secuencias naturales de RNA del genoma de VHC, en concreto que
contienen: a) la secuencia 5'-terminal altamente
conservada "GCCAGCC"; b) la región codificante de la
poliproteína del VHC; y c) secuencias auténticas
3'-NTR.
En WO 99/04008 Purcell et al.
describieron un clon infeccioso de VHC que también contenía
solamente la secuencia 5'-terminal altamente
conservada "GCCAGC".
Recientemente, Lohmann et al. 1999
(Science 285: 110-113) y Bartenschlager et
al. (en CA 2 303 526, publicada el 3 de octubre de 2000, que
corresponde a la patente europea EP 1043399) describieron un sistema
de cultivo celular del VHC en el que el RNA vírico
(I377/NS2-3') se autorreplica en las células
transfectadas con tal eficiencia que la calidad de la replicación
puede medirse con precisión y reproducibilidad. La información
revelada por Lohmann y Bartenschlager constituyó la primera
demostración de replicación del RNA del VHC en cultivos celulares
que estaba apoyada por mediciones directas mediante transferencias
Northern. Este sistema de replicón y las secuencias allí descritas
destacan de nuevo la secuencia 5' conservada "GCCAGC". En
Blight et al. 2000 (Science 290: 1972-1974) y
WO 01/89364, publicada el 29 de Nov. 2001, se realizó una
observación similar que destacaba la conservación de la región
5'NTR.
Además de la conservación de las regiones no
traducidas 3' y 5' en RNA en replicación en cultivos celulares,
existen tres publicaciones diferentes de Lohmann et al. 2001,
Krieger et al. 2001 y Guo et al. 2001 que
recientemente han descrito mutantes adaptativos en la región
codificante de la proteína no estructural del VHC. Se observa que
ciertos cambios específicos de nucleótidos que alteran los
aminoácidos de las proteínas no estructurales del VHC mejoran la
eficiencia del establecimiento de replicones de VHC subgenómicos
estables en cultivos celulares.
El solicitante ha encontrado ahora,
contrariamente a cualquier información previa, que la región
5'-NTR altamente conservada puede mutar por
adaptación para producir una secuencia de RNA del VHC que, junto con
mutaciones en la región no estructural del VHC, proporciona una
mayor eficiencia de transducción o replicación.
El solicitante también ha identificado
mutaciones adaptativas nuevas dentro de la región no estructural del
VHC que mejoran la eficiencia en el establecimiento de sistemas
persistentes de replicación de RNA del VHC en cultivos
celulares.
Una ventaja de la presente invención consiste en
que proporciona una alternativa a estos sistemas ya existentes que
comprende una molécula de RNA del VHC que es capaz de
autorreplicarse. La presente invención demuestra que el nucleótido
de iniciación del genoma de cadena positiva puede ser una A en lugar
de una G, como se conoce habitualmente en este campo.
Otra ventaja de la presente invención consiste
en que proporciona una exclusiva molécula de RNA del VHC que se
transduce o replica con una mayor eficiencia. El solicitante
demuestra la utilidad de esta molécula de RNA específica en una
línea celular y su utilización para la evaluación de un inhibidor
específico de la replicación del VHC.
La presente invención proporciona una región 5'
no traducida del virus de la hepatitis C en la que la guanina
altamente conservada en la posición 1 es sustituida por adenina.
En concreto, la presente invención proporciona
un polinucleótido del virus de la hepatitis C que contiene adenina
en la posición 1 según la numeración del constructo
I377/NS2-3' (Lohmann et al. 1999, núm. de
acceso AJ242651).
Concretamente, la invención proporciona una
polinucleótido autorreplicante del VHC que contiene un extremo 5'
terminal con la secuencia ACCAGC (ID. de SEC. núm. 8) en la que la
primera A es el nucleótido en la posición 1 de la región 5'NTR.
El término "un polinucleótido autorreplicante
del VHC de la invención" engloba cualquiera de estas
modificaciones.
Concretamente, la presente invención versa sobre
un polinucleótido autorreplicante del VHC de la invención que
codifica una poliproteína que contiene una sustitución aminoacídica,
o varias, seleccionada del grupo formado por:
R(1135)K; S(1148)G;
S(1560)G; K(1691)R;
L(1701)F; I(1984)V;
T(1993)A; G(2042)C;
G(2042)R; S(2404)P;
L(2155)P; P(2166)L y
M(2992)T.
Concretamente, la presente invención versa sobre
un polinucleótido autorreplicante del VHC de la invención que
codifica una poliproteína que contiene cualquiera de las
sustituciones aminoacídicas antes descritas, comprendiendo además
la sustitución aminoacídica E(1202)G.
Más en concreto, la invención proporciona un
polinucleótido autorreplicante del VHC de la invención que codifica
una poliproteína que contiene una mutación G2042C o G2042R.
Especialmente en concreto, la invención
proporciona un polinucleótido autorreplicante del VHC que contiene
una sustitución nucleotídica G->A en la posición 1, y dicho
polinucleótido codifica una poliproteína que además contiene una
mutación G2042C o G2042R.
En especial, el polinucleótido de la presente
invención puede estar en forma de RNA o de DNA que puede ser
transcrito a RNA.
La invención también proporciona un vector de
expresión que contiene el polinucleótido de la invención antes
mencionado en forma de DNA unido funcionalmente a un promotor.
La invención también proporciona una célula
huésped transfectada con el polinucleótido autorreplicante o el
vector de la invención antes descritos.
La presente invención proporciona además un
ensayo de replicación de RNA que comprende los siguientes pasos:
- la incubación de la célula huésped antes
descrita en ausencia o en presencia de un inhibidor potencial del
virus de la hepatitis;
- el aislamiento del RNA celular total de las
células; - el análisis del RNA para medir la cantidad de RNA del
VHC replicado;
- la comparación de la cantidad de RNA del VHC
en las células en ausencia o en presencia del inhibidor.
De forma adicional, la invención trata de un
método para analizar la capacidad de un compuesto de inhibir la
replicación del VHC, que incluye los siguientes pasos:
a) el tratamiento de la célula huésped antes
descrita con el compuesto;
b) la evaluación de la replicación reducida en
la célula huésped tratada, indicando dicha reducción en la
replicación que el compuesto posee la capacidad de inhibir la
replicación.
La Figura 1 muestra una vista esquemática del
replicón bicistrónico de RNA. Las desviaciones en la secuencia
entre el replicón I377/NS2-3' de Lohmann et
al., 1999 y el replicón APGK12 están indicadas debajo del
replicón. En lugar de un nucleótido G en la posición +1 del replicón
I377/NS2-3', el APGK12 contiene una G adicional que
da lugar a una GG en el extremo 5' terminal (contando la primera G
como la posición -1). En la región de conexión entre el nuevo gen y
la secuencia del IRES del EMCV (siglas en inglés del virus de la
encefalomiocarditis) existen dos áreas que se desvían del
I377/NS2-3': 14 nucleótidos (CGCGCCCAGATGTT) que no
están presentes en 1377/NS2/3 se insieren en la posición 1184 en
APGK12; 11 nucleótidos (1231 -1241) que están presentes en
I377/NS2-3' se delecionan para generar
APGK-12. En la región codificante NS5B, una T en la
posición 8032 se mutó hacia C para eliminar un sitio de restricción
NcoI.
La Figura 2 muestra transferencias Northern de
líneas celulares Huh-7 transfectadas con RNA. Se
separaron 12 \mug de RNA celular total o de RNA control en geles
de agarosa-formaldehído al 0,5% y se transfirieron
a papel Hybond N+, se fijaron y (figura 2A) se trataron con sondas
radiactivas de RNA de cadena negativa específico para VHC que
detecta la presencia de replicón de RNA de cadena positiva. Carriles
1 y 2: controles positivos que contienen 10^{9} copias de RNA de
APGK12 transcrito in vitro. Carril 3: control negativo de RNA
celular total procedente de células Huh-7 no
transfectadas. Carriles 4 y 5: RNA celular procedente de líneas
celulares B1 y B3 que han integrado en su DNA copias del gen de la
neomicina fosfotransferasa. Carril 6: RNA celular total procedente
de una línea celular Huh-7, denominada S22.3, que
contiene un elevado número de copias de replicón de RNA subgenómico
del VHC destacado con la flecha. Las otras líneas celulares no
presentan replicón de RNA detectable. La figura 2B es idéntica a la
figura 2A a excepción de que la transferencia se marcó con una
sonda de RNA de cadena positiva específica del VHC marcado
radiactivamente para detectar la presencia de RNA de cadena
negativa del VHC. Los carriles 1 y 2 son carriles con controles
positivos que contienen 10^{9} copias de RNA completo de cadena
negativa del VHC. El carril 6, que contiene 12 \mug de RNA celular
total de la línea celular S22.3, incluye replicón de RNA de cadena
negativa detectable del tamaño esperado de 8-9
kilobases. La M representa la migración de marcadores moleculares no
radiactivos sobre el gel de agarosa. El símbolo 28s representa la
migración de RNA ribosómico 28s y responde a la detección de esta
forma de RNA en muestras de RNA celular total.
La figura 3 muestra la inmunofluorescencia
indirecta de una proteína no estructural del VHC de la línea celular
S22.3. Los análisis de inmunofluorescencia indirecta se realizaron
sobre células que se cultivaron, se fijaron, se permeabilizaron y
se expusieron a un anticuerpo policlonal de conejo específico de un
segmento de la proteína NS4A del VHC. Para la detección se empleó
un anticuerpo secundario de cabra anticonejo conjugado con
red-fluor Alexa 594 (Molecular Probes). Los
recuadros superiores muestran los resultados de inmunofluorescencia
(objetivo 40x) y la tinción específica de las células S22.3. Los
inferiores representan el mismo campo de células visto bajo
microscopía de contraste por interferencia diferencial (DIC). La
mayor parte de las células S22.3 (figura 3A) en el campo de visión
dan una tinción positiva para la proteína NS4A del VHC que se
localiza en el citoplasma, mientras que las células B1 (figura 3B)
que no expresan ninguna proteína del VHC solamente presentan una
tinción de fondo.
La figura 4 muestra transferencias Western tras
la separación mediante SDS-PAGE de proteínas totales
extraídas de tres líneas celulares: (i) línea de células
Huh-7 vírgenes, (ii) línea celular B1 de células
Huh-7 resistentes a la neomicina y (iii) la línea
celular S22.3. Los recuadros A, B y C muestran los resultados de
transferencias Western a las que se ha aplicado antisuero
policlonal de conejo específico para la neomicina fosfotransferasa
(NPT), la NS3 del VHC y la NS5B del VHC, respectivamente. La
visualización se consiguió mediante detección autorradiográfica de
un anticuerpo secundario de cabra antirratón reactivo
quimioluminiscente. El recuadro A muestra que la línea celular
S22.3 de replicón de RNA expresa la proteína NPT en cantidades
mayores que las células B1 control, y que la línea de células
Huh-7 vírgenes no produce la proteína NPT. Los
recuadros B y C muestran que solamente la línea celular S22.3
produce, respectivamente, las proteínas NS3 y NS5B del VHC maduras.
La M representa el peso molecular (en kilodaltons) de los marcadores
polipeptídicos previamente teñidos.
Las figuras 5A y 5B identifican las secuencias
de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente, que difieren de
la secuencia APGK12 en los diferentes replicones bicistrónicos del
VHC. El replicón adaptado a S22.3 es un replicón de primera
generación seleccionado tras la transfección de RNA transcrito del
molde de APGK12. R3, R7 y R16 son replicones de segunda generación
que se seleccionaron después de la transfección de RNA aislado de
la línea celular de replicón de primera generación S22.3. Figura 5A:
las mutaciones nucleotídicas que se describieron en cada uno de los
replicones adaptados se indican junto al segmento respectivo del
replicón (IRES, NS3, NS4A, NS5A y NS5B). Figura 5B: los aminoácidos
se numeran según la poliproteína del VHC completa, con el primer
aminoácido del segundo cistrón siendo el que corresponde al
aminoácido 810 en NS2 el constructo I377/NS2-3'.
La Figura 6 muestra la eficiencia en la
formación de colonias de cuatro tipos de replicón de RNA
bicistrónico subgenómico del VHC transcritos in vitro. El
APGK12 sirve de secuencia de referencia; se destacan los
nucleótidos de inicio de los IRES del VHC en cada uno de los
constructos y las diferencias aminoacídicas (a partir de la
secuencia de referencia del APGK12) en la región no estructural del
VHC para los dos R3-rep. Cabe destacar que los RNA
APGK-12 transcritos in vitro con 5'G o 5'A
forman colonias con la misma eficiencia (ca. 80 ufc/\mug
en los recuadros A y B) después de la selección con 0,25 mg/ml de
G418. El RNA aislado de la línea celular de R3 de segunda
generación fue sometido a transcripción inversa para obtener DNA y
se clonó en el esqueleto del vector pAPGK12 para generar el
R3-rep, el cual fue secuenciado y del que se
encontró que codificaba cambios adicionales como la sustitución
L(2155)P en el segmento NS5A de la poliproteína del
VHC (compárese la secuencia de R3-rep con la
secuencia de R3 en las tablas 2 y 3). Se transfectaron diversas
cantidades de RNA R3-rep-5'A
transcrito in vitro en células Huh-7 vírgenes
para determinar una eficiencia en la formación de colonias de 1,2 x
10^{6} ufc/\mug de RNA (recuadro C). Asimismo, también se
transfectaron diversas cantidades de
R3-rep-5'G dando lugar a una
eficiencia en la formación de colonias de 2 x 10^{6} ufc/\mug de
RNA (recuadro D).
La figura 7 muestra un gráfico convencional de
amplificación por RT-PCR (recuadro izquierdo) y la
representación gráfica de los valores Ct frente a la cantidad
conocida de RNA del VHC en una curva estándar (recuadro derecho).
Cada una de las curvas representadas en el recuadro izquierdo
muestran el incremento de señal indicadora de fluorescencia
(delta-Rn) frente al número de ciclos de PCR para
una cantidad predeterminada de replicón de RNA del VHC. El valor Ct
se obtiene determinando el punto en el cual la fluorescencia supera
un valor arbitrario (línea horizontal). El recuadro derecho muestra
la relación lineal entre el número inicial de copias de RNA de los
estándares predeterminados (círculos negros grandes) y el valor Ct.
Los puntos más pequeños corresponden a los valores Ct de las
muestras de RNA (que contienen una cantidad desconocida de replicón
de RNA del VHC) de células S22.3 tratadas con diversas
concentraciones de un inhibidor específico de la replicación del
VHC.
La figura 8 muestra el efecto de concentraciones
cada vez mayores de inhibidor A sobre la cantidad de replicón de
RNA del VHC en células Huh-7. Se cultivaron células
S22.3 en presencia de concentraciones cada vez mayores de inhibidor
A desde 0,5 nM hasta 1024 nM. La curva
dosis-respuesta de inhibidor es el resultado de 11
concentraciones de diluciones en serie a la mitad (1:1). Durante el
transcurso del experimento también se incluyó como control un
pocillo sin ningún inhibidor. Las células se incubaron durante 4
días en un incubador de CO_{2} al 5% a 37ºC.El RNA celular total
se extrajo y se cuantificó por densidad óptica. Se evaluó la
cantidad de replicón de RNA del VHC mediante RT-PCR
en tiempo real y se representó en forma de equivalentes de
genoma/\mug de RNA total en función de la concentración de
inhibidor.
A menos que se definan de un modo diferente, los
términos y la nomenclatura científicos y tecnológicos aquí
empleados tienen el significado que habitualmente le otorgan las
personas expertas en la materia en la que se enmarca esta
invención. En general, los procedimientos para el cultivo celular,
la infección, los métodos de biología molecular y similares son
métodos habituales empleados en las técnicas más actuales. Estas
técnicas estándar pueden hallarse en manuales de referencia como
por ejemplo Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al.
(1994).
Las secuencias de nucleótidos se presentan aquí
en forma de cadena simple, en dirección 5' a 3', de izquierda a
derecha y empleando los símbolos nucleotídicos de letra única igual
que se utiliza normalmente en este ámbito de acuerdo con las
recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la
IUPAC-IUB (1972).
La presente descripción se refiere a un número
de términos empleados habitualmente referentes a la tecnología de
DNA recombinante (rDNA). No obstante, se ofrecen las definiciones de
ejemplos seleccionados de estos términos de rDNA para aportar
claridad y coherencia.
El término "segmento, molécula o secuencia de
DNA" se emplea aquí para referirse a moléculas formadas por los
desoxirribonucleótidos adenina (A), guanina (G),
timina (T) o citosina (C). Estos segmentos, moléculas
o secuencias pueden encontrarse en la naturaleza o ser producidos
sintéticamente. Cuando se leen según el código genético, estas
secuencias pueden codificar un tramo o secuencia lineal de
aminoácidos que se puede denominar polipéptido, proteína, fragmento
de proteína o similar.
Tal como se emplea aquí, el término "gen"
es muy conocido actualmente en la técnica y está relacionado con
una secuencia de ácidos nucleicos que define una única proteína o un
único polipéptido. El polipéptido puede estar codificado por la
totalidad de la secuencia codificante, o únicamente por una porción
de la misma, siempre y cuando mantenga la actividad funcional de la
proteína.
Un "gen estructural" define una secuencia
de DNA que se transcribe a RNA y se traduce en una proteína que
presenta una función estructural específica para constituir las
partículas víricas. El término "proteínas estructurales"
define las proteínas del VHC incorporadas en las partículas víricas,
a saber, core "C", E1, E2 y E2-p7.
El término "proteínas no estructurales"
define las proteínas del VHC que no están dentro de las partículas
víricas, a saber, NS2, NS3, NS4A, NS5A y NS5B.
Una "endonucleasa de restricción o enzima de
restricción" es una enzima que posee la capacidad de reconocer
una secuencia de bases específica (normalmente de una longitud de 4,
5 o 6 pares de bases) de una molécula de DNA y de escindir la
molécula de DNA en todos los lugares en que aparezca dicha
secuencia. Un ejemplo de este tipo de enzima es EcoRI, que reconoce
la secuencia de bases G\downarrowAATTC y escinde una molécula de
DNA en este sitio de reconocimiento. Los "fragmentos de
restricción" son moléculas de DNA producidas por la digestión de
DNA con una endonucleasa de restricción. Cualquier segmento de
genoma o de DNA dado puede ser digerido por una endonucleasa de
restricción en particular, dando lugar a dos moléculas discretas de
fragmentos de restricción por lo menos.
La "electroforesis en gel de agarosa" es un
método analítico de separación de polinucleótidos que se basa en su
tamaño. El método se fundamenta en el hecho de que las moléculas de
ácidos nucleicos migran a través de un gel como si se tratara de un
tamiz, en el que la molécula de menor tamaño presenta la mayor
movilidad y la mayor distancia de desplazamiento a través del gel.
Las características de tamiz del gel provocan el retraso de las
moléculas de mayor tamaño de modo que estas presentan la menor
movilidad de todas. Los polinucleótidos separados pueden
visualizarse mediante la tinción del gel empleando métodos muy
conocidos en el ámbito, la hibridación de ácidos nucleicos o el
marcaje de las moléculas separadas con un marcador detectable. Todos
estos métodos son muy conocidos en el campo; se pueden encontrar
algunos métodos específicos en Ausubel et al.
(supra).
El término "oligonucleótido u oligómero"
indica una molécula que consta de dos o más desoxirribonucleótidos
o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. El tamaño exacto
dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función
última o de la utilización del oligonucleótido. Un oligonucleótido
se puede obtener mediante síntesis, clonación o amplificación.
La "amplificación de secuencias" es un
método que permite generar grandes cantidades de una secuencia
diana. En general, se hibridan uno o varios cebadores de
amplificación con una secuencia de ácidos nucleicos. Mediante el
empleo de las enzimas apropiadas se amplifican las secuencias que se
encuentran junto a los cebadores o entre ellos. Un método de
amplificación empleado aquí es el de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y puede utilizarse junto con la transcriptasa
inversa (RT) para producir copias amplificadas de DNA de secuencias
específicas de RNA.
El término "cebador de amplificación" hace
referencia a un oligonucleótido que es capaz de hibridar con una
región de RNA o DNA adyacente a una secuencia diana y que funciona
como el cebador de iniciación para la síntesis de DNA bajo las
condiciones adecuadas habituales en la técnica. El producto
sintetizado de extensión del cebador es complementario a la
secuencia diana.
El término "dominio" o "región" se
refiere a una secuencia de aminoácidos específica que define una
función o una estructura específica de una proteína. A modo de
ejemplo, en este caso se encuentra el dominio proteasa de NS3
comprendido dentro de la poliproteína no estructural del VHC.
Los términos "plásmido", "vector" o
"constructo de DNA" se conocen comúnmente en este ámbito y
hacen referencia a cualquier elemento genético que incluye, entre
otros, DNA plasmídico, DNA fágico, DNA vírico o similares que
pueden incorporar las secuencias de oligonucleótidos, o secuencias
de la presente invención, y funcionar como vehículos de DNA dentro
de los que se puede clonar el DNA de la presente invención. Existen
numerosos tipos de vectores que son muy conocidos en el ámbito.
La denominación "vector de expresión"
define un vector como el antes descrito pero diseñado para permitir
la expresión de una secuencia inserida después de la transformación
o transfección de un huésped. El gen clonado (secuencia inserida)
normalmente se sitúa bajo el control de secuencias de elementos
controladores como las secuencias promotoras. Estas secuencias
controladoras de la expresión variarán en función de si el vector
está diseñado para expresar in vitro o in vivo el gen
funcionalmente unido en un huésped procariota o eucariota, o en
cualquiera de los dos (vectores lanzadera), y pueden contener
adicionalmente elementos transcripcionales como elementos
potenciadores o sitios de iniciación o terminación de la
transcripción.
Se dice que una célula huésped o célula
indicadora ha sido "transfectada" con un DNA o RNA exógeno o
heterólogo (p. ej. un constructo de DNA) cuando dicho ácido nucleico
ha sido introducido dentro de la célula. El DNA que se emplea para
transfectar la célula puede estar o no integrado (unido de forma
covalente) en el DNA cromosómico formando parte del genoma de la
célula. En procariotas, levaduras y células de mamífero, por
ejemplo, el DNA de transfección/transformación puede mantenerse en
un elemento episómico como un plásmido. Con relación a las células
eucariotas, un ejemplo de una célula transfectada de forma estable
es aquella en la que el DNA de la transfección se ha integrado
dentro de un cromosoma y se transmite a las células descendientes
por replicación cromosómica. Una célula huésped o una célula
indicadora pueden ser transfectadas con RNA. Una célula puede ser
transfectada de forma estable con RNA si el RNA se replica y las
copias del RNA se transfieren a las células hijas durante la
división celular. Esta estabilidad se demuestra con la capacidad que
posee la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones
formados por una población de células hijas que contienen el DNA o
RNA utilizado en la transfección. Todos estos métodos son
ampliamente conocidos en el campo (Sambrook et al., 1989;
Ausubel et al., 1994). Si el RNA codifica un marcador
genético que confiere un fenotipo observable, como una resistencia
a antibióticos, se puede realizar un seguimiento de la transfección
estable de RNA de replicación según la adquisición de dicho fenotipo
por la célula huésped.
Tal como se emplea aquí, el término
"transducción" se refiere a la transferencia de un marcador
genético a células huésped mediante la transfección estable de un
RNA de replicación.
Las secuencias de nucleótidos y los polipéptidos
que son útiles para la práctica de la invención incluyen, entre
otros, mutantes, homólogos, subtipos, cuasiespecies, alelos y
similares. Se comprende que, en general, las secuencias de la
presente invención codifican una poliproteína. Para cualquier
experto en la técnica será evidente que la poliproteína de la
presente invención y cualquier variante, derivado o fragmento de la
misma, sufre un autoprocesado para convertirse en una proteasa
activa.
En el contexto de la presente invención la
denominación "variante", tal como se emplea aquí, denota una
secuencia, sea una molécula de ácidos nucleicos o de aminoácidos,
que mantiene una actividad biológica (funcional, o bien
estructural) que es sustancialmente similar a la de la secuencia
original. Esta variante puede proceder de la misma especie o bien
de una diferente y puede ser una variante natural o estar producida
de forma sintética. Estas variantes incluyen secuencias de
aminoácidos que presentan sustituciones, deleciones o adiciones de
uno o varios aminoácidos con la condición de que se conserve la
actividad biológica de la proteína. Esto mismo se puede aplicar a
las variantes de las secuencias de ácidos nucleicos que pueden
presentar sustituciones, deleciones o adiciones de uno o varios
nucleótidos con la condición de que se mantenga en general la
actividad biológica de la proteína.
Con el término "derivado" se pretende
incluir cualquiera de las variantes antes descritas en los casos en
que contengan una porción química que normalmente no forma parte de
estas moléculas. Estas porciones químicas pueden incluirse con
diversos propósitos como mejorar la solubilidad de la molécula, su
absorción o su vida media biológica, disminuir la toxicidad o
eliminar o disminuir efectos secundarios no deseados. Además, estas
porciones se pueden emplear con el propósito de marcaje o de unión,
o bien pueden estar incluidos en productos de fusión. En The
Science and Practice of Pharmacy de Remington (1995) es posible
encontrar diferentes porciones capaces de proporcionar los efectos
antes descritos. En la técnica actual se conocen bien varias
metodologías para el acoplamiento de dichas porciones a una
molécula. El término "fragmento" hace referencia a cualquier
segmento de una secuencia de DNA, RNA o aminoácidos identificada o a
cualquier segmento de cualquiera de las variantes o los derivados
antes descritos aquí que mantienen de forma considerable su
actividad biológica (funcional o estructural) como es requisito de
la presente invención.
Los términos "variante", "derivado" y
"fragmento" de la presente invención hacen referencia aquí a
proteínas o moléculas de ácidos nucleicos que pueden ser
aisladas/purificadas, sintetizadas por métodos químicos o
producidas mediante la tecnología del DNA recombinante. Todos estos
métodos son ampliamente conocidos en el ámbito. Como se ejemplifica
más adelante, las secuencias de nucleótidos y los polipéptidos
empleados en la presente invención se pueden modificar, por ejemplo,
mediante mutagénesis in vitro.
Tal como se emplea aquí, el término "región
codificante de la poliproteína del VHC" significa la región de
un virus de la hepatitis C que codifica el marco abierto de lectura
(ORF, siglas en inglés) de la poliproteína. Este ORF puede
codificar proteínas iguales o diferentes a las proteínas del VHC de
tipo salvaje. El ORF también puede codificar exclusivamente una
parte de la proteína funcional codificada por la región codificante
de la poliproteína de tipo salvaje. La proteína allí codificada
también puede proceder de diferentes aislados de VHC y, además, esa
región también puede codificar proteínas que no sean del VHC.
La abreviación "NTR", tal como se emplea
aquí y en el contexto de un polinucleótido, significa una región no
traducida. El término "UTR" también significa región no
traducida. Ambos términos se emplean de forma indis-
tinta.
tinta.
Especialmente, la invención proporciona un
polinucleótido autorreplicante del VHC que contiene un extremo
5'-terminal formado por ACCAGC (ID. de SEC. 8).
Según la invención, se proporciona en especial
un constructo de polinucleótido del VHC que contiene:
- una región no traducible 5' (NTR) que contiene
la secuencia ACCAGC en su extremo 5'-terminal, o
próxima a ella; es decir, en la que la primera A de dicha secuencia
es el nucleótido en posición 1 de la región 5'NTR;
- una región codificante de la poliproteína del
VHC; y
- una región 3'-NTR.
En concreto, la presente invención trata de un
polinucleótido autorreplicante del VHC de la invención que codifica
una poliproteína que contiene una o varias sustituciones de
aminoácidos seleccionadas del grupo formado por:
R(1135)K; S(1148)G;
S(1560)G; K(1691)R;
L(1701)F; I(1984)V;
T(1993)A; G(2042)C;
G(2042)R; S(2404)P;
L(2155)P; P(2166)L y
M(2992)T.
Concretamente, la presente invención versa sobre
un polinucleótido autorreplicante del VHC de la invención que
codifica una poliproteína que contiene cualquiera de las
sustituciones aminoacídicas antes descritas, comprendiendo además
la sustitución aminoacídica E(1202)G.
Por otro lado, la presente invención trata
acerca de un polinucleótido que contiene una mutación G2042C/R.
La presente invención proporciona concretamente
un constructo polinucleotídico del VHC que comprende:
- una región 5'-NTR que contiene
la secuencia ACCAGC en su extremo 5'-terminal;
- una región de poliproteína del VHC que
codifica una poliproteína del VHC que lleva una mutación
G(2042)C o una G(2042)R; y
- una región 3'-NTR.
El constructo polinucleotídico de la presente
invención es preferiblemente una molécula de DNA o RNA. Más
preferiblemente, el constructo es una molécula de RNA. Pero lo más
preferible es que el constructo sea una molécula de DNA.
Más concretamente, la invención trata de una
molécula de RNA codificada por la molécula de DNA seleccionada del
grupo formado por: ID. de SEC. núms. 2,4,5,6,7,24 y 25.
Lo más preferible es que la invención
proporcione una molécula de DNA seleccionada del grupo formado por:
ID. de SEC. núms. 2,4,6,24 y 25.
La invención también trata acerca de un vector
de expresión que contiene el polinucleótido de la invención antes
mencionado en diversas formas de DNA unido funcionalmente a un
promotor.
De un modo preferible, el promotor es
seleccionado del grupo formado por: T3, T7 y SP6.
La invención también versa sobre una célula
huésped transfectada con el polinucleótido autorreplicante o el
vector antes descritos. En concreto, la célula huésped es una línea
celular eucariota. Más concretamente, la línea celular eucariota es
una línea celular hepática. Pero, lo más preferible es que la línea
celular hepática sea Huh-7.
La presente invención proporciona un ensayo de
replicación de RNA que comprende los siguientes pasos:
a) la incubación de la célula huésped antes
descrita en unas condiciones adecuadas para la replicación de
RNA;
b) el aislamiento del RNA celular total de las
células; y
c) el análisis del RNA para medir la cantidad de
RNA del VHC replicado.
De un modo preferible, el análisis de la
cantidad de RNA en el paso c) se lleva a cabo mediante la
amplificación del RNA mediante análisis de RT-PCR
en tiempo real empleando cebadores específicos del VHC para medir la
cantidad de RNA del VHC replicado.
Alternativamente, el constructo comprende un gen
indicador, y el análisis de la cantidad de RNA del paso c) se
realiza evaluando la cantidad de indicador expresado.
La invención también versa sobre un método para
analizar la capacidad de un compuesto de inhibir la replicación del
VHC, que incluye los siguientes pasos:
a) la realización del paso a) como se ha
descrito en el ensayo anterior, en ausencia o presencia del
compuesto;
b) el aislamiento del RNA celular total de las
células;
c) el análisis del RNA para medir la cantidad de
RNA del VHC replicado.
d) la comparación de la cantidad de RNA del VHC
en las células en ausencia o en presencia del inhibidor,
en la que una cantidad reducida de RNA indica la
capacidad del compuesto para inhibir la replicación.
De un modo preferible la línea celular se incuba
con el compuesto a ensayar durante unos 3-4 días a
una temperatura de unos 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo pET9a-EMCV por
ligación de un oligonucleótido ligador 5'
gaattccagatggcgcgcccagatgttaaccagatc
catggcacactctagagtactgtcgac 3' (ID. de SEC. núm. 9) con pET-9a (Novagen) que se digirió con EcoRI y SalI para crear el vector pET-9a-mod. Este ligador contiene los siguientes sitios de restricción: EcoRI, AscI, HpaI, NcoI, XbaI, ScaI, SalI. El IRES del EMCV se amplificó mediante PCR a partir del vector pTM1 con los cebadores 5' cggaatcgt
taacagaccacaacggtttccctc 3' (ID. de SEC. núm. 10) y 5' ggcgtaccatggtattatcgtgtttttca 3' (ID. de SEC. núm. 11) y se ligó dentro del pET-9a-mod a través de EcoRI y NcoI para constituir pET-9a-EMCV.
catggcacactctagagtactgtcgac 3' (ID. de SEC. núm. 9) con pET-9a (Novagen) que se digirió con EcoRI y SalI para crear el vector pET-9a-mod. Este ligador contiene los siguientes sitios de restricción: EcoRI, AscI, HpaI, NcoI, XbaI, ScaI, SalI. El IRES del EMCV se amplificó mediante PCR a partir del vector pTM1 con los cebadores 5' cggaatcgt
taacagaccacaacggtttccctc 3' (ID. de SEC. núm. 10) y 5' ggcgtaccatggtattatcgtgtttttca 3' (ID. de SEC. núm. 11) y se ligó dentro del pET-9a-mod a través de EcoRI y NcoI para constituir pET-9a-EMCV.
La secuencia de NS2 a NS5B del VHC seguida por
la región 3'UTR del VHC se obtuvo a partir del constructo replicón
I377/NS2-3' (Lohmann et al. 1999, núm. de
acceso AJ242651) y fue sintetizada por Operon Technologies Inc. con
un cambio de T por C en el sitio NcoI de NS5B en el nucleótido 8032.
Esta secuencia se liberó de un vector GenOp® (Operon Technologies)
con NcoI y ScaI y se transfirió en
pET-9a-EMCV para formar
pET-9a-EMCV-NS2-5B-3'UTR.
Se obtuvo
pET-9a-HCV-neo por
amplificación del IRES del VHC de un cDNA del VHC aislado de suero
de paciente con los cebadores 5'
gcatatgaattctaatacgactcactataggccagcccccgattg 3' (ID. de SEC. núm.
12), que contiene un promotor T7, y el cebador 5'
ggcgcgccctttggtttttctttgaggtttaggattcgtgctcat 3' (ID. de SEC. núm.
13) y por la amplificación del gen de la neomicina fosfotransferasa
del vector pcDNA 3.1 (Invitrogen) con los cebadores 5'
aaagggcgcatgatt
gaacaagatggattgcacgca 3' (ID. de SEC. núm. 14) y 5' gcatatgttaactcagaagaactcgtcaagaaggcgata 3' (ID. de SEC. núm. 15). Estos dos fragmentos de PCR se mezclaron y se amplificaron con los cebadores 5' gcatatgaattctaatacgactcacta
taggccagcccccgattg 3' (ID. de SEC. núm. 16) y 5' gcatatgttaactcagaagaactcgtcaagaaggcgata 3' (ID. de SEC. núm. 15), se cortaron con EcoRI y HpaI y se transfirieron en pET-9a-mod para formar pET-9a-HCV-neo. La secuencia EMCV-NS2-5B-3'UTR se liberó del pET-9a-EMCV-NS2-5B-3'UTR con HpaI y ScaI y se transfirió en pET-9a-HCV-neo que se digirió con HpaI para formar PET-9a-APGK12. Este inserto se secuenció con cebadores sucesivos específicos empleando un equipo de secuenciación ABI Prism®BigDye^{TM} Terminator Cycle y se analizó con un secuenciador de DNA ABI Prism® 377 y se muestra en el ID. de SEC. núm. 1.
gaacaagatggattgcacgca 3' (ID. de SEC. núm. 14) y 5' gcatatgttaactcagaagaactcgtcaagaaggcgata 3' (ID. de SEC. núm. 15). Estos dos fragmentos de PCR se mezclaron y se amplificaron con los cebadores 5' gcatatgaattctaatacgactcacta
taggccagcccccgattg 3' (ID. de SEC. núm. 16) y 5' gcatatgttaactcagaagaactcgtcaagaaggcgata 3' (ID. de SEC. núm. 15), se cortaron con EcoRI y HpaI y se transfirieron en pET-9a-mod para formar pET-9a-HCV-neo. La secuencia EMCV-NS2-5B-3'UTR se liberó del pET-9a-EMCV-NS2-5B-3'UTR con HpaI y ScaI y se transfirió en pET-9a-HCV-neo que se digirió con HpaI para formar PET-9a-APGK12. Este inserto se secuenció con cebadores sucesivos específicos empleando un equipo de secuenciación ABI Prism®BigDye^{TM} Terminator Cycle y se analizó con un secuenciador de DNA ABI Prism® 377 y se muestra en el ID. de SEC. núm. 1.
Se digirió DNA de
pET-9a-APGK12 con ScaI para la
expresión del replicón completo o con BgIII para la expresión de un
RNA control negativo y truncado. Se analizó el DNA sobre un gel de
agarosa al 1% y se purificó mediante extracción con
fenol/cloroformo. Se produjo RNA empleando un equipo T7 Ribomax®
(Promega) seguido de una extracción con fenol/cloroformo y
precipitación con LiCl_{2} 7,5 M. El RNA se trató con
desoxirribonucleasa I durante 15 min para eliminar el molde de DNA
y se volvió a purificar con una columna RNeasy® (Qiagen). La
integridad del RNA se verificó en un gel desnaturalizante de
agarosa al 1% y formaldehído.
Se cultivaron células Huh-7 de
hepatoma humano (Health Science Research Resources Bank, Osaka,
Japón) en FBS/DMEM al 10%. Las células se cultivaron hasta un 70%
de confluencia, se tripsinizaron, se lavaron con solución salina
tamponada con fosfato (PBS) y se ajustaron a 1x10^{7} células/ml
de PBS. Se transfirieron 800 \mul de células en cubetas de 0,4 cm
y se mezclaron con 15 \mug de replicón de RNA. Se realizó la
electroporación de las células con 960 \muF, 300 V, durante 18 ms
aproximadamente, y estas se distribuyeron en dos placas de cultivo
de tejidos de 15 cm que se colocaron en un incubador de cultivos
tisulares durante 24 horas. La selección de las líneas celulares de
primera o segunda generación que llevan el replicón se llevó a cabo
con medio FBS 10%/DMEM complementado con 1 mg/ml de G418. Durante 3
a 5 semanas se realizó una selección de las células hasta que se
observó la formación de colonias, que se aislaron y expandieron.
Después de la selección con G418 y de la
propagación de las células Huh-7 transfectadas con
RNA de APGK12 (ID. de SEC. núm. 1), se trató con tripsina las
células que formaban una colonia evidente y se transfirieron a
frascos de cultivo de mayor tamaño para establecer líneas celulares.
De cada línea celular se recogieron aproximadamente 10 x 10^{6}
células. Las células se lisaron y se extrajo y purificó el RNA
celular total del modo que indican los procedimientos de
preparación del RNAeasy® de Qiagen. La figura 2 muestra el análisis
de 12 \mug de RNA celular total de diversas líneas celulares
realizado mediante una transferencia Northern en un gel
desnaturalizante de agarosa-
formaldehído.
formaldehído.
La figura 2A es una transferencia Northern (a la
que se ha aplicado una sonda radiactiva de RNA de cadena negativa
específica del VHC) que detecta la presencia de replicón de RNA de
cadena positiva. Los carriles 1 y 2 son controles positivos que
contienen 10^{9} copias de RNA de APGK12 transcrito in
vitro. El carril 2 contiene el RNA transcrito in vitro
mezclado con 12 \mug de RNA celular total procedente de células
Huh-7 vírgenes. El carril 3 es un control negativo
de RNA celular total procedente de células Huh-7 que
no han sido tratadas. Los carriles 4 y 5 contienen RNA celular
procedente de las líneas celulares B1 y B3 resistentes al G418 que
han integrado copias del gen de la neomicina fosfotransferasa en su
DNA. El carril 6 contiene RNA celular total procedente de una línea
celular Huh-7, denominada S22.3, que contiene un
elevado número de copias de replicón de RNA subgenómico del VHC
detectadas por la señal positiva en el rango de las 8 kilobases.
Las otras líneas celulares no presentan RNA de replicón detectable.
En la figura 2B se muestra una transferencia Northern de un
duplicado del gel presentado en la figura 2A, pero con la excepción
de que la transferencia se marcó de forma radiactiva con una sonda
de RNA de cadena positiva específica del VHC para detectar la
presencia de RNA de cadena negativa del VHC (los carriles 1 y 2 son
carriles de controles positivos que contienen 10^{9} copias de
RNA de cadena negativa del VHC genómico completo); solamente el
carril 6, que contiene 12 \mug de RNA celular total de la línea
celular S22.3, alberga replicón de RNA de cadena negativa detectable
en el tamaño esperado de 8 a 9 kilobases. Una estimación
cuantitativa del número de copias de RNA, basada en un análisis
mediante un Phosphorimager de las transferencias Northern, consiste
en aproximadamente 6 x 10^{7} copias de RNA de cadena
positiva/\mug de RNA total y 6x 10^{6} copias de RNA de cadena
negativa/\mug de RNA total. La presencia de intermedio de cadena
positiva y cadena negativa confirma que el RNA subgenómico del VHC
se está replicando de forma activa en la línea celular S22.3.
Se estudió la expresión de proteínas
estructurales del VHC en la línea celular S22.3. La figura 3 muestra
el resultado de un ensayo de inmunofluorescencia indirecta que
detecta la proteína NS4A del VHC en la línea celular S22.3, pero no
en la línea celular B1 carente de replicón (una línea de células
Huh-7 resistentes a G418). Los análisis de
inmunofluorescencia indirecta se realizaron sobre células que se
cultivaron y se fijaron (con paraformaldehído al 4%) sobre
portaobjetos múltiples Lab-tek. Las células se
permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,2% durante 10
minutos seguido de un tratamiento de una hora con leche en polvo
disuelta al 5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El
anticuerpo primario empleado en la detección fue un suero de conejo
que contenía un anticuerpo policlonal creado frente a un péptido que
abarca la región NS4A del VHC. Tras 2 horas de incubación con el
anticuerpo primario, las células se lavaron con PBS y se añadió a
las células un anticuerpo secundario de cabra anticonejo conjugado
con red-fluor Alexa 594 (Molecular Probes)
durante 3 horas. Se eliminó el anticuerpo secundario no unido
mediante lavados con PBS y las células se cubrieron con un
cubreobjetos. La figura 3 (recuadros superiores) muestra los
resultados de la inmunofluorescencia detectada con un microscopio
con filtro específico para fluorescencia; los recuadros inferiores
representan el mismo campo de células visto bajo microscopía de
contraste por interferencia diferencial (DIC). La mayor parte de
las células S22.3 (figura 3A) en el campo de visión dan una tinción
positiva para la proteína NS4A del VHC que se localiza en el
citoplasma, mientras que las células B1 (figura 3B) que no expresan
ninguna proteína del VHC solamente presentan una tinción de fondo.
Una pequeña proporción de las células S22.3 expresan niveles
elevados de NS4A del VHC con una tinción intensa.
La expresión de las proteínas codificadas por el
replicón de RNA bicistrónico se examinó mediante transferencias
Western seguidamente tras la separación mediante
SDS-PAGE de proteínas totales extraídas de: (i)
línea de células Huh-7 vírgenes, (ii) línea celular
B1 de células Huh-7 resistentes a la neomicina y
(iii) la línea celular S22.3. Los recuadros A, B y C de la figura 4
muestran los resultados de transferencias Western a las que se ha
aplicado antisuero policlonal de conejo específico para la neomicina
fosfotransferasa (NPT), la NS3 del VHC y la NS5B del VHC,
respectivamente. La visualización se consiguió mediante detección
autorradiográfica de un anticuerpo secundario de cabra antirratón
conjugado con HRP, reactivo y quimioluminiscente. El recuadro A de
la figura 4 muestra que la línea celular S22.3 de replicón de RNA
expresa la proteína NPT en cantidades mayores que las células B1
(que contienen una copia del gen npt integrada en su DNA), y
que la línea de células Huh-7 vírgenes no produce
la proteína NPT. Los recuadros B y C de la figura 4 muestran que
solamente la línea celular S22.3 produce, respectivamente, las
proteínas NS3 y NS5B del VHC maduras. Las transferencias Western
muestran que la línea celular S22.3, que contiene replicón de RNA
subgenómico del VHC de replicación activa, mantiene la replicación
del RNA mediante la expresión elevada de las proteínas no
estructurales del VHC.
Se extrajo el RNA total de células
Huh-7 que contienen replicón empleando un equipo
RNeasy (Qiagen). El replicón de RNA fue sometido a transcripción
inversa y fue amplificado mediante PCR empleando un equipo OneStep
RT-PCR (Qiagen) y cebadores específicos del VHC
(seleccionados de la secuencia completa descrita en WO 00/66623).
Se amplificaron diez productos de RT-PCR diferentes,
que abarcan la totalidad del replicón bicistrónico de forma
alterna, empleando oligonucleótidos cebadores. Los fragmentos de PCR
se secuenciaron directamente mediante secuenciación por PCR con ABI
Prism®BigDye^{TM} Terminator Cycle y se analizaron con un
secuenciador de DNA ABI Prism® 377. Para analizar la secuencia de
los extremos 3' y 5' del replicón del VHC se siguió un procedimiento
de ligación de RNA/RT-PCR descrito en Kolykhalov
et al. 1996. La secuencia nucleotídica de S22.3 se presenta
como el ID. de SEC. núm. 2.
El RNA total de la línea celular S22.3 se
preparó como se ha descrito anteriormente. El número de copias de
replicón de RNA del VHC se determinó mediante análisis por
RT-PCR Taqman® y se utilizaron 20 \mug del RNA
celular de S22.3 (1 x 10^{9} copias de RNA de VHC) para
transfectar mediante electroporación 8 x 10^{6} células
Huh-7 vírgenes. A continuación, las células
transfectadas se cultivaron en placas de cultivo tisular de 10 cm
con medio DMEM complementado con suero fetal bovino (10% FCS). Se
cambió el medio a DMEM (10% FCS) complementado con 1 mg/ml de G418
24 horas después de la transfección y entonces se cambió cada tres
días. Se formaron 23 colonias visibles tres o cuatro semanas
después de la transfección y la selección con G418. Las colonias
resistentes a G418 se hicieron crecer para constituir líneas
celulares de segunda generación que representaban las primeras
líneas celulares que acumulaban pases seriados de replicones de RNA
de VHC. Tres de esas líneas celulares: R3, R7 y R16 fueron objeto
de análisis posteriores. En primer lugar, se determinó la
eficiencia de la transducción para cada uno de los replicones
adaptados mediante electroporación del RNA celular (extraído de R3,
R7 y R16) en células Huh-7 vírgenes. Tras la
electroporación, la eficiencia de la transducción se determinó como
se ha descrito anteriormente, mediante el recuento de colonias
resistentes a G418 que aparecen tres o cinco semanas después de la
selección con G418 (Tabla 1). En segundo lugar, la secuencia de los
replicones adaptados procedente de pases seriados se determinó a
partir del RNA celular extraído de las líneas celulares con
replicón R3, R7 y R16, tal como se describe en el ejemplo 4 (ID. de
SEC. núms.: 4, 5 y 6). Utilizando pAPGK12 como secuencia de
referencia (ID. de SEC.: 1), los cambios de nucleótidos que se
seleccionaron en el segmento del VHC de los replicones adaptados se
representan en la Figura 5A. Algunos de esos cambios de nucleótidos
son silentes y no provocan cambios en los aminoácidos codificados
mientras que otros provocan la sustitución de un aminoácido. En la
Figura 5B se resumen los cambios de aminoácidos codificados en los
replicones adaptados utilizando como referencia la secuencia de
aminoácidos de pAPGK12. Cabe destacar que la secuencia de
referencia APGK-12 (ID. de SEC. núm.: 1) contiene
una G extra en el extremo 5' (5'-GG) que no se
conserva en el RNA que se replica en las líneas celulares
establecidas. También cabe resaltar que, además del cambio G->A
en el nucleótido 1, también hay una mutación adaptada G->C/R en
el aminoácido 2042 (se muestra como el aminoácido 1233 en el listado
de secuencias dado que el aa 810 de NS2 se denomina aa 1 en el ID.
de SEC.) que puede encontrarse en todos los clones analizados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se modificó el primer nucleótido de la secuencia
de DNA de pAPGK12 de manera que se remplazó el 5'GG por 5'A. El
cambio en pAPGK12 se introdujo remplazando una región
EcoRI-AgeI de la secuencia con un fragmento
EcoRI-AgeI generado por PCR que incluye la mutación.
Los oligonucleótidos utilizados para la amplificación fueron (ID.
de SEC. núm.: 20): 5'-GTG GAC GAA TTC TAA TAC GAC
TCA CTA TAA CCA GCC CCC GAT TGG-3' y (ID. de SEC.
núm.: 21): 5'-GGA ACG CCC GTC GTG GCC AGC CAC
GAT-3' y generaron un fragmento de DNA de 195 pb que
fue digerido posteriormente con EcoRI y AgeI. El
fragmento de restricción se utilizó para remplazar el fragmento
EcoRI-AgeI en pAPGK12 para obtener el plásmido
pAPGK12-5'A.
El clon de cDNA del replicón R3 se obtuvo
mediante RT-PCR a partir de RNA extraído de la línea
celular R3. Se utilizaron los dos oligonucleótidos siguientes: (ID.
de SEC. núm.: 22): 5'-GTC GTC TTC TCT GAC ATG GAG
AC-3' y (ID. de SEC. núm.: 23):
5'-GAG TTG CTC AGT GGA TTG ATG GGC
AGC-3'. El fragmento de PCR de aproximadamente 4400
nt, que empieza en la región codificante de NS2 y se extiende hasta
el extremo 5' de la región codificante de NS5B, se clonó en el
plásmido pCR3.1 mediante TA Cloning (Invitrogen). La región
SacII-XhoI de dicha secuencia R3 se utilizó entonces
para remplazar el fragmento SacII-XhoI presente en el
pAPGK12 y en el pAPGK12-5'A descrito anteriormente.
Como consecuencia, se generaron dos secuencias de cDNA de R3: (I)
R3-Rep-5'G con inicio 5'G (ID. de
SEC. núm.: 7), y R3-Rep-5'A (ID. de
SEC. núm.: 25) con un inicio 5'A. La secuenciación del cDNA de
R3rep reveló cambios únicos de nucleótidos que difieren de la
secuencia pAPGK12 original (véase la Figura 5A). Algunos de esos
cambios son silentes y no cambian el aminoácido codificado,
mientras que otros provocan un cambio de aminoácido (véase la Figura
5B). Las diferencias entre R3 y R3-rep reflejan el
aislamiento de un clon único de cDNA de R3-rep que
codifica cambios nucleotídicos que no se observaron en la
secuenciación del RNA extraído de la línea celular R3.
Se generó RNA de pAPGK12,
pAPGK12-5'A, pR3-Rep y
pR3-Rep5'A por transcripción in vitro
utilizando el equipo T7 Ribomax® (Promega) como se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 1. Las reacciones que contenían moldes
de pAPGK12-5'A y
pR3-Rep-5'A se amplificaron 10 veces
debido a la limitación que presenta la RNA polimerasa comercial
para iniciar la transcripción con 5'A. Los RNA de longitud completa
y los RNA truncados control para cada clon se introdujeron en 8 x
10^{6} células Huh-7 vírgenes mediante
electroporación tal como se describe en el ejemplo 2. El replicón
de RNA se complementó con RNA celular de Huh-7 como
transportador hasta obtener una cantidad total de
15-20 \mug. A continuación, las células se
cultivaron en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al
10% y 0,25 mg/ml de G418 en dos placas de 150 mm. Fue suficiente con
la concentración más baja de G418 para aislar y seleccionar las
líneas celulares que contenían el replicón dado que ninguna de las
células transfectadas con el RNA truncado control produjo colonias
resistentes. En cambio, los RNA de APGK-12
transcritos in vitro que contenían tanto 5'G como 5'A forman
colonias con la misma eficiencia (aproximadamente 80 ufc/\mug en
la Figura 6, recuadros A y B) tras la selección con G418. Se
transfectaron diversas cantidades (desde 0,1 ng a 1 \mug) del RNA
de R3-rep-5'A a células
Huh-7 vírgenes y se determinó una eficiencia en la
formación de colonias de 1,2 x 10^{6} ufc/\mug de RNA (el
recuadro C de la Figura 6 muestra la transfección con 1 \mug de
RNA). De forma similar, se transfectaron diversas cantidades (desde
0,1 ng a 1 \mug) de R3-rep[5'G] que tuvo
como resultado una eficiencia en la formación de colonias de 2 x
10^{6} ufc/\mug de RNA (el recuadro D de la Figura 6 muestra la
formación de colonias con 1 \mug de RNA). Cabe resaltar que, por
primera vez, se ha conseguido que los replicones subgenómicos del
VHC con el nucleótido 5'A se repliquen con la misma eficiencia que
con 5'G. APGK12 con 5'A o 5'G posee la misma eficiencia de
transducción. Cabe destacar también que los mutantes adaptativos
dentro de la región no estructural del VHC codificado por
R3-Rep proporcionan un incremento sustancial de la
eficiencia de transducción tal como muestra el incremento muy
marcado en las unidades formadoras de colonias por \mug de
RNA
transfectado.
transfectado.
Las células S22.3, o líneas celulares que
contuvieran los replicones adaptados, se sembraron en DMEM
complementado con FBS al 10%, PenStrep y 1 \mug/ml de Geneticina.
Al final del periodo de incubación se valoró el número de copias
del replicón mediante RT-PCR a tiempo real con el
sistema ABI Prism 7700 Sequence Detection System. El equipo TAQMAN®
EZ RT-PCR proporciona un sistema para la detección y
el análisis del RNA del VHC (como primero demostraron Martell et
al. 1999 J Clin Microbiol 37:327-332). La
detección directa del producto formado por la reacción en cadena de
la polimerasa por transcriptasa inversa (RT-PCR) sin
procesamiento en dirección 3' se consigue mediante el control de
los incrementos de fluorescencia de una sonda de DNA marcada (Figura
6). La secuencia de nucleótidos de ambos cebadores (adaptada de
Ruster, B. Zeuzem, S. y Roth, W.K., 1995 Analytical Biochemistry
224:597-600) y de la sonda (adaptada de Hohne, M.,
Roeske, H. y Schreier, E. 1998, Poster Presentation: P297 en el
Fifth International Meeting on Hepatitis C Virus and Related
Viruses Molecular Virology and Pathogenesis,
Venecia-Lido, Italia, 25-28 de junio
de 1998) localizados en la región 5' del genoma del VHC son
los
siguientes:
siguientes:
Cebador directo del VHC:
| 5' ACG CAG AAA GCG TCT AGC CAT GGC GTT AGT 3' | (ID. de SEC. núm.: 17) |
\newpage
Cebador inverso del VHC:
| 5' TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT ATC AGG 3' | (ID. de SEC. núm.: 18) |
Sonda del VHC:
| 5' FAM-TGG TCT GCG GAA CGG GTG AGT ACA CC-TAMRA 3' | (ID. de SEC. núm.:19) |
FAM: marcador fluorescente
TAMRA: extintor de fluorescencia
Se prepararon las siguientes reacciones con el
equipo TAQMAN® EZ RT-PCR:
\vskip1.000000\baselineskip
A esta mezcla de reacción, se añadieron 5 \mul
de RNA total extraído de células S22.3 diluido a 10 ng/\mul, para
obtener un total de 50 ng de RNA por reacción. El número de copias
del replicón se valoró mediante una curva estándar construida a
partir de cantidades conocidas de copias del replicón
(complementadas con 50 ng de RNA Huh-7 de tipo
salvaje) que se analizaron en una mezcla de reacción idéntica
(Figura 7).
Los parámetros del termociclador utilizado para
la reacción de RT-PCR en sistema ABI Prism 7700
Sequence Detection System se optimizaron para detectar el VHC:
La cuantificación se basa en el ciclo umbral, en
el que la curva de amplificación cruza un umbral de fluorescencia
definido. La comparación de los ciclos umbral proporciona una medida
altamente sensible de la concentración relativa de molde en
diferentes muestras. El control durante los primeros ciclos, cuando
la fidelidad de la PCR es más alta, proporciona datos precisos para
realizar la cuantificación de forma exacta. La concentración
relativa de molde se puede convertir en número de copias de RNA
utilizando una curva estándar de RNA del VHC con un número de
copias conocido (Figura 7).
Para determinar el efecto de un compuesto
antivírico específico del VHC con proteasa NS3 sobre los niveles de
replicón en células S22.3, estas se sembraron en placas de cultivo
celular de 24 pocillos a una densidad de 5 x 10^{4} células por
pocillo en 500 \mul de DMEM complementado con FBS al 10%, PenStrep
y 1 \mul/ml de Genecitina. Antes de la adición del compuesto, las
células se incubaron en un incubador con CO_{2} al 5% y a 37ºC.
La curva dosis-respuesta del inhibidor se construyó
con 11 concentraciones obtenidas a partir de diluciones a la mitad
seriadas 1:1. La concentración inicial del compuesto A fue de 100
nM. También se incluyó un pocillo control (sin ningún compuesto)
durante la realización del experimento. Las placas de 24 pocillos
se incubaron durante 4 días en un incubador con CO_{2} al 5% y a
37ºC. Tras un periodo de incubación de 4 días, las células se
lavaron una vez con PBS y el RNA se extrajo con el equipo RNeasy®
Mini Kit y Qiashredder® de Qiagen. El RNA de cada pocillo se eluyó
en 50 \mul de H_{2}O. El RNA se cuantificó mediante densidad
óptica a 260 nm en un espectrofotómetro Cary 1E
UV-Visible. Se utilizaron 50 ng de RNA de cada
pocillo para cuantificar el número de copias del replicón de RNA
del VHC tal como se describe en el Ejemplo 6. El nivel de
inhibición (% inhibición) de cada pocillo que contenía el inhibidor
se calculó con la siguiente expresión (CN = número de copias del
replicón del VHC):
Los porcentajes de inhibición calculados se
utilizaron para determinar la CI_{50}, la pendiente (n) y la
inhibición máxima (I_{máx}) mediante el procedimiento NLIN de
regresión no lineal de SAS utilizando la siguiente expresión:
El compuesto A se valoró al menos 4 veces
durante el ensayo. Las curvas de CI_{50} se analizaron
individualmente mediante análisis de regresión no lineal de SAS. La
Figura 8 muestra una curva típica y la Tabla 2 muestra los valores
individuales y promedio de la CI_{50} del compuesto A. La
CI_{50} promedio del compuesto A fue de 1,1 nM en el ensayo de
replicación.
Todavía no se ha conseguido mediante ningún
sistema una propagación ex vivo del virus de la hepatitis C
reproducible y robusta que produzca los niveles necesarios para el
análisis preciso de compuestos antivíricos potenciales. Como una
estrategia alternativa para estudiar los mecanismos moleculares de
la replicación del RNA del virus de la hepatitis C, se han
desarrollado RNA bicistrónicos autorreplicantes que se puedan
seleccionar (Lohmann et al., 1999, Science
285:110-113; Bartenschlager CA 2 303 526). Como
mínimo, estos replicones codifican algunas o todas las proteínas no
estructurales y también un marcador de selección como la neomicina
fosfotransferasa. A pesar de que los niveles intracelulares en la
fase estacionaria de estos replicones de RNA subgenómicos son
moderados o altos, la frecuencia de generación de colonias
resistentes a G418 tras la transfección con el RNA consenso
descrito por Lohmann et al. o Bartenschlager es muy baja. Se
generan menos de 100 colonias cuando se transfectan 8 millones de
células con 1 \mug de replicón de RNA bicistrónico transcrito
in vitro. Lohmann et al. (1999, Science 285:
110-113) observaron por primera vez una eficiencia
baja en la formación de colonias. Desde entonces, Lohmann et
al. (2001), Blight et al. (2000) y Guo et al.
(2001), han aislado RNA subgenómicos con eficiencias marcadamente
mejores en el ensayo de formación de colonias. Lohmann et
al., 1999 describieron primero que la selección de replicones
subgenómicos no debe implicar necesariamente la selección de
mutantes adaptados, dado que el RNA sometido a pases seriados no
demostró una mejora en la eficiencia de transfección. Sin embargo,
en un esfuerzo por caracterizar la función y el estado del RNA del
VHC en replicación, realizamos pases seriados del replicón de RNA
que fue aislado de la primera línea celular seleccionada. Cabe
destacar que se obtuvo un incremento significativo en la eficiencia
de formación de colonias en este experimento, a pesar de que la
cantidad de replicón de RNA era varios órdenes de magnitud inferior
que el utilizado inicialmente para transfectar el RNA transcrito
in vitro. Además, una segunda serie de pases del replicón de
RNA procedente del clon de primera generación en células
Huh-7 vírgenes produjo otro incremento de la
eficiencia en la formación de colonias (Tabla 1).
Con nuestro análisis de RNA del VHC en
replicación identificamos varias mutaciones adaptativas que mejoran
la eficiencia de la formación de colonias hasta 4 órdenes de
magnitud. Se descubrieron mutaciones adaptativas en muchas
proteínas no estructurales, así como en la región 5' no traducida.
La sustitución del doblete 5'-GG por 5'A como el
nucleótido inicial del 5'-UTR del VHC es una
variante del genoma del VHC que no había sido descrita
anteriormente, a pesar de secuenciar innumerables genotipos y
subtipos de todo el mundo. Nuestro replicón original que contenía
el 5'-GG evolucionó hacia variantes con
5'-A o 5'-G que mostraron la misma
eficiencia de transducción. Describimos aquí por primera vez un
genoma del VHC que puede tolerar y mantenerse estable con un
extremo 5'A. Además, tuvimos éxito al reintroducir esa sustitución
puntual de un nucleótido definido en nuestro clon de cDNA y generar
un RNA transcrito in vitro que contiene dicho extremo para
confirmar que un extremo 5'A es igual de eficiente que un extremo
5'G.
Hemos identificado sustituciones adaptativas de
aminoácidos en las proteínas del VHC no estructurales NS3, NS4A y
NS5A en el replicón R3, y una sustitución en NS5B en el clon R7
(véase la Figura 5B). Estas mutaciones, especialmente la
combinación definida en el R3-rep (ID. de SEC. núm.:
7) cuando se reconstituye en un clon de cDNA y se transcribe en un
replicón de RNA, da como resultado un incremento significativo en la
eficiencia de transducción de hasta 20 000 veces respecto al
replicón original de RNA de tipo salvaje APGK12. Sin embargo, los
niveles intracelulares en fase estacionaria de replicón de RNA de
cada uno de los clones aislados fueron comparables. Este resultado
sugiere que el incremento de la eficiencia de replicación de las
mutaciones adaptativas no provoca niveles intracelulares estables
de RNA superiores como resultado de una mayor replicación del RNA,
sino que aumenta la permisividad para establecer el replicón en un
número mayor de células Huh7. Dicho fenotipo se puede manifestar
transitoriamente, a través de un incremento inicial en la cantidad
de replicación de novo que se necesita para sobrepasar el
umbral definido para establecer una replicación persistente de los
RNA dentro de una población de células en división.
Recientemente otros tres grupos también han
identificado otros mutantes adaptativos diferentes. Lohmann et
al. (2000) describieron eficiencias de transducción mejoradas de
hasta 10 000 veces con mutaciones en NS3, NS4B, NS5A y NS5B. Blight
et al. (2000) describieron un aumento en las eficiencias de
transducción de hasta 20 000 veces con una única mutación en NS5A,
mientras que Guo et al. (2001) describieron incrementos en
las eficiencias de transducción de 5000 a 10 000 veces con la
deleción de un único aminoácido en NS5A. Las sustituciones de
aminoácidos que describimos aquí nunca antes habían sido
identificadas como mutaciones adaptativas que mejoran la eficiencia
de la transfección o la replicación del RNA. La mutación E1202G en
NS3 es una excepción que encontramos en los replicones R7 y R16.
Esta adaptación había sido descrita previamente por Guo et
al. (2001) y Krieger et al. (2001). El resto de
mutaciones adaptativas descritas aquí, sin excepción alguna, nunca
han sido publicadas.
El desarrollo de replicones subgenómicos del VHC
susceptibles de selección ha abierto vías potenciales para
investigar la replicación, la persistencia y la patogenia del RNA
del VHC en células en cultivo. No obstante, la baja eficiencia de
transducción obtenida con los replicones que contenían RNA del VHC
descritos inicialmente (Lohmann et al., 1999) demostró que
no resultaban sistemas prácticos para estudios de genética inversa.
Los mutantes adaptativos descritos aquí permiten superar esa baja
eficiencia de transducción. A la luz de descripciones recientes de
mutantes adaptativos realizadas por otros grupos, descubrimos que la
adaptación puede conseguirse a partir de diferentes mutaciones en
distintas proteínas NS del VHC, aunque el nivel de adaptación puede
variar drásticamente. Los replicones que codifican mutantes
adaptativos que se describen aquí son ideales en estudios de
genética inversa para identificar nuevas dianas del VHC o de células
huésped diana que podrían modular la replicación del RNA del VHC o
la formación de colonias con el replicón de RNA del VHC. Los
replicones adaptados y altamente eficientes son herramientas
apropiadas para caracterizar cambios genotípicos o fenotípicos
sutiles que afecten a una eficiencia de transducción fácilmente
cuantificable.
Finalmente, hemos utilizado nuestra línea
celular con el replicón subgenómico del VHC para demostrar una
inhibición muy eficiente de la replicación del RNA del VHC mediante
una pequeña molécula inhibidora específica de la proteasa NS3 del
VHC. Es la primera vez que se demuestra que un antivírico, diseñado
para inhibir específicamente una de las proteínas no estructurales
del VHC, inhibe la replicación del RNA del VHC en cultivo celular.
Además, este compuesto y nuestra línea celular S22.3 validan la
propuesta que la replicación del RNA está dirigida por las
proteínas no estructurales del VHC de la NS3 a la NS5B. El ensayo
que hemos descrito y validado será extremadamente útil para
caracterizar otros inhibidores de la función de proteínas no
estructurales del VHC en cultivo celular de forma altamente
eficiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ago et al. 1999,
Structure 7: 1417-1426
Ausubel et al. 1994,
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York
Bartenschlager, R. et al. 1993, J. Virol., 67, 3835-3844
Behrens et al. 1998, J.
Virol. 72, 2364
Bressanelli et al. 1999,
Proc. Natl. Acad. Sci, USA 96:
13034-13039
Blight et al. 2000,
Science 290: 1972-1974
Cho et al. 1998, J.
Biol. Chem., 273, 15045
Dash et al. 1997, Am. J.
Pathol., 151, 363 - 373
Fourner et al. 1998, J.
Gen. Virol. 79, 2376
Gale Jr. et al. 1997
Virology 230, 217
Grakoui, A. et al. 1993(a),
J. Virol. 67, 1385-1395.
Grakoui, A. et al. 1993(b),
Proc Natl Acad Sci USA, 90,
10583-7
Guo et al. (2001) J.
Virol. 8516-8523
Hijikata, M. et al., 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5547-5551
Hijikata, M. Et al., 1993,
J. Virol. 67, 4665-4675
Ikda et al. 1998, Virus
Res. 56, 157
Ito et al. 1996, J. Gen.
Virol. 77, 1043 - 1054
IUPAC-IUB Biochemical
Nomenclature Commission, 1972, Biochemistry,
11, 1726- 1732
Kolykhalov et al. 1996,
J. of Virology, 7, p. 3363-3371
Khromykh et al. 1997, J.
Virol. 71, 1497
Kim, D.W. et al. 1995,
Biochem. Biophys. Res. Comm., 215,
160-166
Kim et al. 1996,
Cell, 87, 343
Kim et al. 1998,
Structure, 6, 89
Kim et al. 1999, Arch.
Virol, 144, 329-343
Krieger et al. 2001, J.
Virol. 461 4-4624
Kwong, AD. et al., 1998,
Antiviral Res., 40, 1-18
Lanford et al. 1994,
Virology 202,606
Lesburg et al. 1999,
Nat. Struct. Biol. 6: 937-943
Lohmann et al. 1999,
Science 285: 110-113
Lohmann et al. 2001, J.
Virol. 1437-1449
Love, R.A. et al., 1996,
Cell, 87,331 -342
Martell et al. 1999 J.
Clin. Microbiol. 37: 327-332
Mizutani et al. 1996, J.
Virol. 70, 7219 - 7223
Moser et al., 1998, J.
Virol. 72, 5318
Reed et al., 1997, J.
Virol. 71, 7187
Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Labs.
Shimizu et al. 1993,
PNAS, USA, 90, 6037 - 6041
Yanagi et al. 1999,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 2291-95
Yao et al. 1997, Nature
Structural Biology, 4, 463
Yern et al. 1998,
Protein Science, 7, 837
Yoo et al. 1995, J.
Virol., 69, 32 - 38.
<110> BOEHRINGER INGELHEIM (CANADA)
LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MOLÉCULA AUTORREPLICANTE DE RNA DEL
VIRUS DE LA HEPATITIS C
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 13/083
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/257,857
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-12-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para versión 4.0 de
Windows
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8639
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1803)...(8408)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1802)...(8407)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6268
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r = a o g
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4446
\vskip0.400000\baselineskip
<223> r = a o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Lys o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1489
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1802)...(8407)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8648
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1802)...(8407)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8638
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1802)...(8407)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8638
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1802)...(8407)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccagc
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattccaga tggcgcgccc agatgttaac cagatccatg gcacactcta gagtactgtc
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgac
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaatcgtt aacagaccac aacggtttcc ctc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtaccca tggtattatc gtgtttttca
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> VHC
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatatgaat tctaatacga ctcactatag gccagccccc gattg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgcgccct ttggtttttc tttgaggttt aggattcgtg ctcat
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagggcgca tgattgaaca agatggattg cacgca
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatatgtta actcagaaga actcgtcaag aaggcgata
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> VHC
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<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatatgaat tctaatacga ctcactatag gccagccccc gattg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccggggca ctcgcaagca ccctatcagg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marcaje con FAM: marcador
fluorescente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marcaje con TAMRA: extintor de
fluorescencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtctgcgg aacgggtgag tacacc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggacgaat tctaatacga ctcactataa ccagcccccg attgg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaacgcccg tcgtggccag ccacgat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgtcttct ctgacatgga gac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagttgctca gtggattgat gggcagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8638
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VHC
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1802)...(8407)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8638
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<212> DNA
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<213> VHC
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1802)...(8407)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Una polinucleótido autorreplicante del virus
de la hepatitis C (VHC) que contiene una región no traducida (NTR)
5' en la que la guanina situada en la posición 1 de dicha región
está sustituida por adenina.
2. Un polinucleótido autorreplicante del VHC de
acuerdo con la reivindicación 1 que contiene:
- una región 5'-NTR que contiene
la secuencia ACCAGC (ID. de SEC. núm. 8) en la que la primera A es
el nucleótido en la posición 1 de la región 5'NTR;
- una región de poliproteína del VHC que
codifica una pliproteína del VHC; y
- una región 3'-NTR.
3. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 2, en el caso en que dicha proteína comprende una o
varias sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo formado
por: R(1135)K; S(1148)G;
S(1560)G; K(1691)R;
L(1701)F; I(1984)V;
T(1993)A; G(2042)C;
G(2042)R; S(2404)P;
L(2155)P; P(2166)L y
M(2992)T.
4. El polinucleótido del VHC que codifica una
poliproteína que contiene una o varias de las sustituciones
aminoacídicas definidas en la reivindicación 3, y que además
contiene la sustitución aminoacídica E(1202)G.
5. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 3, en el caso en que dicha sustitución es una
mutación G2042C o G2042R.
6. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicha sustitución se selecciona del
grupo formado por: K(1691)R y
G(2042)C.
7. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicha sustitución se selecciona del
grupo formado por: R(1135)K, S(1560)G,
K(1691)R, T(1993)A,
G(2042)C y P(2166)L.
8. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicha sustitución se selecciona del
grupo formado por: R(1135)K, S(1560)G,
K(1691)R, T(1993)A,
G(2042)C, L(2155)P y
P(2166)L.
9. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicha sustitución se selecciona del
grupo formado por: E(1202)G, I(1984)V,
G(2042)C y M(2992)T.
10. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicha sustitución se selecciona del
grupo formado por: S(1148)G, E(1202)G,
L(1701)F, G(2042)R y
S(2404)P.
11. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 2, en el caso en que dicho polinucleótido es una
molécula de RNA codificada por la molécula de DNA seleccionada del
grupo formado por: ID. de SEC. núms. 2, 4, 6, 24 y 25.
12. El polinucleótido del VHC de acuerdo con la
reivindicación 2, en el caso en que dicho polinucleótido es una
molécula de DNA seleccionada del grupo formado por: ID. de SEC.
núms. 2, 4, 6, 24 y 25.
13. Un vector de expresión que contiene el
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2 en forma de DNA
unido funcionalmente a un promotor.
14. Una célula huésped transfectada con una
molécula polinucleotídica autorreplicativa de acuerdo con la
reivindicación 2.
15. Una célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 14, en el caso en que la célula huésped es una línea
celular eucariota.
16. Una célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 15, en el caso en que dicha línea celular eucariota
es una línea celular hepática.
17. Una célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 16, en el caso en que dicha línea celular hepática es
Huh-7.
18. Un ensayo de replicación de RNA que
comprende los siguientes pasos:
a) la incubación de la célula huésped de acuerdo
con la reivindicación 14 en unas condiciones adecuadas para la
replicación de RNA;
b) el aislamiento del RNA celular total de las
células; y
c) el análisis del RNA para medir la cantidad de
RNA del VHC replicado.
19. El ensayo de acuerdo con la reivindicación
18, en el que el análisis de la cantidad de RNA en el paso c) se
lleva a cabo mediante la amplificación del RNA mediante análisis de
RT-PCR en tiempo real empleando cebadores
específicos del VHC para medir la cantidad de RNA del VHC
replicado.
20. El ensayo de acuerdo con la reivindicación
18, en el que dicho polinucleótido codifica un gen indicador, y el
análisis de la cantidad de RNA del paso c) se realiza evaluando la
cantidad de indicador expresado.
21. Un método de análisis de un compuesto para
la inhibición de la replicación del VHC, que incluye los siguientes
pasos:
a) la realización del paso a) de acuerdo con la
reivindicación 18, en ausencia o presencia del compuesto;
b) el aislamiento del RNA celular total de las
células; y
c) el análisis del RNA para medir la cantidad de
RNA del VHC replicado. d) la comparación de la cantidad de RNA del
VHC en las células en ausencia o en presencia del inhibidor, en la
que una cantidad reducida de RNA indica la capacidad del compuesto
para inhibir la replicación.
22. El método de acuerdo con la reivindicación
21, en el que dicha línea celular se incuba con el compuesto a
ensayar durante unos 3-4 días a una temperatura de
unos 37ºC.
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|---|---|---|---|---|
| US20040005549A1 (en) * | 2000-11-07 | 2004-01-08 | Anadys Pharmaceuticals, Inc. | Hepatitis C virus constructs characterized by high efficiency replication |
| WO2002038793A2 (en) * | 2000-11-07 | 2002-05-16 | Anadys Pharmaceuticals, Inc. | Hepatitis c virus constructs characterized by high efficiency replication |
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| EP1423522A2 (en) * | 2001-01-23 | 2004-06-02 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | Hepatitis c virus replicons and replicon enhanced cells |
| WO2003089672A1 (en) * | 2002-04-16 | 2003-10-30 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis c virus assay systems |
| CA2498653C (en) | 2002-10-29 | 2010-12-14 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Inhibitor-resistant hcv ns3 protease |
| US7807455B2 (en) | 2003-02-13 | 2010-10-05 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method to confer cell culture replication activity to different Hepatitis C virus isolates |
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| US20070128625A1 (en) * | 2005-07-25 | 2007-06-07 | Gilead Sciences, Llc | Drug-resistant mutants of hepatitis C virus |
| EP1801116A1 (en) * | 2005-12-21 | 2007-06-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | HCV replicon shuttle vectors |
| WO2008125119A1 (en) * | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Hvidovre Hospital | Adaptive mutations allow establishment of jfh1-based cell culture systems for hepatitis c virus genotype 4a |
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| WO2009080052A1 (en) | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Hvidovre Hospital | Efficient cell culture system for hepatitis c virus genotype 6a |
| KR100945784B1 (ko) | 2008-01-24 | 2010-03-08 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | Ｃ형 간염 바이러스의 중합효소 ｎｓ５ｂ를 저해하는 c형 간염 바이러스 치료제 |
| US8663653B2 (en) | 2008-08-15 | 2014-03-04 | Hvidovre Hospital | Efficient cell culture system for hepatitis C virus genotype 2B |
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| US20100173281A1 (en) * | 2009-01-06 | 2010-07-08 | Roche Palo Alto Llc | HCV NS3 protease replicon shuttle vectors |
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Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6127116A (en) * | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
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| US6689559B2 (en) * | 2001-11-29 | 2004-02-10 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Efficient hepatitis C virus replicon and its use in identifying antiviral compounds |
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