BRPI9701774B1 - Cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela. - Google Patents
Cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela. Download PDFInfo
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Description
cDNA MUTANTE E INFECCIOSO DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA, CONSTRUCTO DE DMA, VÍRUS RECOMBINANTE DE FEBRE AMARELA E VACINA PARA HUMANOS CONTRA INFECÇÕES DE FEBRE AMARELA. A presente invenção refere-se a vacina contra infecções causadas pelo virus da Febre Amarela (YF) e sua preparação pela regeneração do vírus da Febre Amarela, linhagem 17D (YF 17D) a partir do correspondente DNA complementar (cDNA) que está presente nos novos plasmídeos pYF 5'3' IV/G1/2 e pYFM 5.2/T3/27.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Flavivirus consiste de 70 patógenos humanos ou veterinários estreitamente relacionados e que apresentam reatividade sorológica cruzada os quais causam várias doenças sérias, incluindo Dengue, Encefalite Japonesa, Encefalite Transmitida por Carrapato (TBE) e Febre Amarela. Os Flavivirus são vírus esféricos com 40-60 nanômetros de diâmetro com um capsídeo em forma de icosaedro que contém uma molécula de RNA de fita única positiva. 0 vírus da Febre Amarela é o vírus protótipo da família dos Flavivirus com um RNA genômico de 10.862 nucleotídeos (nt) , tendo uma estrutura 5' CAP (118 nt) e uma extremidade 3' não-poliadenilada (511 nt) .
Sua sequência nucleotídica completa, o RNA genômico, foi determinado por Rice, C.M. et al (Rice, C.M.;
Lenches, E.; Eddy, S.R.; Shin, S.J.; Sheets, R.L. and Strauss, J.H. (1985) . "Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution". Science. 229: 726-733. 0 RNA de fita única é também o mensageiro virai e sua translação na célula infectada resulta na síntese de um precursor de uma poliproteína de 3.411 amino ácidos, a qual é clivada por processamento proteolítico para originar 10 polipeptídeos virus- específicos. A partir da extremidade 5', a ordem de codificação'das ■ proteínas é: C; prM/M; E; NS1; N S 2 A; NS2B; NS3; NS4A; NS4B and NS5. As três primeiras proteínas constituem as proteínas estruturais, isto é, elas formam o vírus juntamente com a molécula do RNA encapsulada. 0 restante do genoma codifica as proteinas não- estruturais (NS) numeradas de 1 a 5, de acordo com a ordem de sua síntese. A proteína C, chamada capsídeo, tem um peso molecular variando entre 12 e 14 kDa (12-14 quilodaltons) , a proteína da membrana, M, tem um peso molecular de 8 kDa, e sua precursora (prM} 18-22 kDa, a proteína do envelope, E, tem 52-54 kDa, sendo todas elas codificadas na primeira quarta parte do seu genoma.
Três das proteínas não-estruturais são grandes e têm sequências altamente conservadas dentre os flavivirus, que são: NSi, tem um peso molecular variando entre 3 8 a 41 kDa; NS3, tem 68-70 kDa e NS5, tem 100-103 kDa. Até o momento, não foi identificado qualquer papel relevante para a NS1, no entanto NS3 tem demonstrado ser bifuncional, a primeira função sendo a atividade como protease necessária para o processamento da poliproteína, e a outra é um nucleotídeo trifosfatase/helicase, a qual está associada com a replicação do RNA virai. NS5, a maior e mais conservada proteína, contém padrões de sequência que são característicos das polimerases RNA virais. As 4 menores proteínas, que são NS2A, NS2B, NS4A and NS4B, são pouco conservadas nas suas sequências de amino ácidos, sendo, no entanto, bem conservadas no seu padrão de múltiplas ligações hidrofõbicas. Tem sido verificado que a proteína NS2A é necessária para o processamento apropriado da proteína NS1 e, NS2B está associada com a atividade proteolítica da NS3 e com a produção da NS4B.
Duas linhagens de vírus de Febre Amarela, isoladas em 192 7, deram origens a vacinas com a finalidade de imunização humana. Uma delas, a linhagem Asibi, foi isolada de um jovem africano chamado Asibi por passagem em macaco Rhesus (Macaca mulatta} e, o outro, Vírus Viscerotropo Francês (WF), foi isolado de um paciente originário do Senegal.
Em 1935, a linhagem Asibi foi adaptada para crescer em tecido embrionário de camundongo. Após 17 passagens, o vírus, denominado 17D, foi, adicionalmente, cultivado em tecido embrionário total de galinha, até a passagem 58 e, então, em tecido embrionário de galinha desnervado até a passagem 114.
Theiler e Smith (Theiler, M, and Smith, H.H. (1937) "The effect of prolonged cultivation in vitro upon the pathogenicity of yellow fever vírus". J. Exp, Med. 65:767-786} demonstraram que, neste estágio, havia uma marcante redução nos viscero e neurotropismo virai quando inoculado, intracerebralmente, em macacos. Este vírus foi, posteriormente, subcultivado até as passagens 227 e 229 e os vírus resultantes, sem o soro humano imune, foram usados para imunizar 8 voluntários humanos. Resultados satisfatórios foram demonstrados pela ausência de reações adversas e soroconversão para Febre Amarela em duas semanas.
No final dos anos 3 0 e início dos anos 40, foi feita uma vacinação em massa no Brasil e em vários países da África. Fox, J.P. et al (Fox, F.P. and Penna, H.A. (1943) . "Behavior of 17D yellow fever virus in Rhesus monkeys. Relation to substrain, dose and neural or extraneural inoculation" . Am. J. Hyg. 38: 52-172) descreveu a preparação da vacina a partir de sublinhagens 17D do vírus. Se por um lado, essas sublinhagens distinguiam-se pela sua passagem histórica, por outro elas coincidiam no que diz respeito ao seu uso como inóculos e/ou na produção de vacinas. A substituição de cada sub-linhagem anterior pela próxima era baseada na experiência adquirida durante a produção da vacina, no controle de qualidade e na vacinação humana que, quando havia o aparecimento de sintomas, provocava a descontinuação no uso de uma dada linhagem.
Como mencionado anteriormente, a linhagem Asibi do vírus da Febre Amarela foi subcultivado em tecido embrionário de camundongo e em embrião de galinha total fragmentado com ou sem o tecido nervoso. Essas passagens produziram as linhagens parental: 17D, na passagem 180 (ver figura 1) ; 17DD, na passagem 195 e 17D-204, na passagem 204. A linhagem 17DD foi posteriormente subcultivada até a passagem 241 e submetida a 43 passagens adicionais em ovos de galinha embrionados, sendo a batelada da vacina usada para a purificação do vírus 17DD (passagem 2 84) . A linhagem 17D-204 foi posteriormente subcultivada para produzir a linhagem Colombia 88 a qual, após passagem em ovos de galinha embrionado, deu origem a diferentes lotes semente de vacina, atualmente em uso na França (Instituto Pasteur, na passagem 235) e nos estados Unidos (Connaught, na passagem 234) . Cada uma dessas linhagens 17D-204 foi purificada através da técnica de plaqueamento em diferentes linhas de células e o vírus finalmente amplificado em células SW13 e usado para clonagem e sequenciamento (Rice, C.M.; Lenches, E.;
Eddy, S.R.; Shin, S.J.; Sheets, R.L. and Strauss, J.H. (1985). "Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution". Science. 229: 726-733; Despres, P.; Cahour, A.; Dupuy, A.; Deubel, V.; Bouloy, M,,- Digoutte, J.P.;
Girard, M. (1987) . "High genetic stability of the coding region for the structural proteins of yellow fever strain 17D" . J. Gen. Virol. 68: 2245-2247) . A linhagem 17D-213 foi derivada da 17D-204, o que aconteceu em consequência do uso do lote semente primário (Sl 112-69), originário da Alemanha (FRG (Federal Republic of Germany) 83-66), pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para produzir uma semente (Sl 213/77), na passagem 237, livre de vírus causadores da leucose aviária. A linhagem 17D-213, na passagem 239, foi testada quanto à neurovirulência em macacos (R. S. Marchevsky, personal communication, see Duarte dos Santos et al, 1995) e foi objeto de sequenciamento, juntamente com a linhagem 17DD (na passagem 2 84), tendo sido feita comparação com sequências nucleotídicas de outras linhagens de vírus de Febre Amarela, anteriormente publicadas (Duarte dos Santos et al, 1995) (linhagem Asibi: Hahn, C.S.,- Dalrymple, J.M.; Strauss, J.H. and Rice, C.M. (1987) . "Comparison of the virulent Asibi strain of yellow fever virus with the 17D vaccine strain derived from it". Proc. Natl, Acad. Sei. USA. 84: 2029-2033; linhagem 17D-204, C-204: Rice. C.M.;
Lenches, E.M.; Eddy, S.R.; Shin, S.J.; Sheets, R.L. and Strauss, J.H. (1985). "Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution". Science. 229: 726-733; F- 204: Despres, P.; Cahour, R.; Dupuy, A.; Deubel, V. ,- Bouloy, M.; Digoutte, J.P. and Girard, M. (1987). "High genetic stability of the coding region for the structural proteins of yellow fever virus strain 17D" . J. Gen. Virol. 68: 2245-2247) (ver figura 1).
Foi verificado que havia uma diferença de 67 nucleotídeos, correspondendo a 31 mudanças na sequência de amino ácidos, entre as sequências genômicas Asibi e 17D-204 (ver Hahn, C.S. et al, 1987) . A comparação entre as sequências nucleotídicas das sublinhagens 17DD e 17D-213 (ver Duarte dos Santos et al, 1995) e a sequência nucleotídica da sub-linhagem 17D-204 (ver Rice et al, 1985} indicou que nem todas as mudanças eram comuns às três linhagens e que nem todas foram confirmadas como l7D-específicas. Assim, as mudanças observadas como específicas da sub-linhagem 17D, muito provavelmente, não estão relacionadas com a atenuação, mas podem revelar diferenças no comportamento dessas linhagens nos testes de neurovirulência em macacos. Em consequência disso, o número de mudanças provavelmente associadas com a atenuação virai foi reduzido em 26%, isto é, para 48 mudanças nucleotídicas. Dessas 48 mudanças na sequência nucleotídica que estão espalhadas ao longo do genoma, 2 6 são mutações silenciosas e 2 2 resultam em substituição dos amino ácidos. As mais importantes são as alterações notadas na proteína E em virtude de ser ela o principal alvo para a resposta humoral de neutralização, isto é, ela é a proteína onde estão localizados os epítopos de hemoaglutinação e neutralização e, media o reconhecimento celular receptor e a penetração celular, direcionando, assim, o vírus para células específicas. Mais importante, ainda, é que a proteína E acumula a mais elevada razão de mudanças de amino ácidos não-conservativas para conservativas. De fato, foram observadas onze substituições nucleotídicas no gene da proteína E que resultaram em 8 mudanças de amino ácidos nas posições 52, 170, 173, 200, 299, 305, 331 e 380 (respectivamente, nucleotídeos 1127, 1482, 1491, 1572, 1870, 1887, 1965 e 2112 a partir da extremidade 5' do RNA) .
As alterações nos amino ácidos 52 e 200 estão localizadas no domínio A da proteína E (domínio II na estrutura tridimensional para a proteína E de Plavivirus (Rey, F.A.; Heinz F.X.; Mandl, C.; Kunz, C and Harrison, S.C. (1995). "The envelope glycoprotein from tíck-borne encephalitis virus at 2Ã resolution".
Nature. 375: 291-298), a qual é conservada dentre os Flavivirus e contém epítopos tendo reatívidade cruzada, como demonstrado por Mandl, C.W. et al (Mandl, M.W.;
Guirakhoo, F.; Holzmann, H.; Heinz, F.X. and Kunz, C. (1989). "Antigenic structure of the flavivirus envelope E protein at the molecular levei using tick-borne encephalitis virus as a model". J. Virol. 63: 564-571).
Esse domínio II é altamente reticulado por ligações dissulfídicas e sofre transição em baixo pH, o que esta relacionado com a exposição de ligações de amino ácidos estritamente conservadas e hidrofóbicas, as quais, se supõe, estejam envolvidas na fusão do envelope virai â membrana endossômica.
As alterações nos amino ácidos 299, 305, 331 e 380 estão localizados no domínio B (domínio III na estrutura tridimensional - ver Rey, F.A. et al) . Foi sugerido que este domínio pode estar envolvido na fixação do vírus ao receptor celular, sendo o maior determinante tanto da faixa do hospedeiro e tropismo celular quanto da virulência/atenuação. As 4 mudanças de amino ácidos relatadas estão localizadas na face periférica do domínio III. No vírus de Encefalite Transmitida por Carrapato (TBE), essa área possui um "loop" apertado e contém 4 resíduos adicionais em todas as linhagens oriundas de mosquito. Como os vírus se reproduzem em seus vetores, essa alça é provavelmente o determinante da faixa do hospedeiro. Este "loop" expandido contém uma sequência Arginina-Glicina-Ácido Aspártico (Arg-Gly-Asp) nas três vacinas das linhagens 17D da Febre Amarela. Este padrão de sequência é um reconhecido mediador de um grande número de interações celulares, incluindo o receptor de ligação, e está ausente não só na matriz virulenta da linhagem Asibi mas também em outras 22 linhagens do tipo selvagem do vírus da Febre Amarela (Lepiniec, L.; Dalgarno, L.
Huong, V.T.Q.; Monath, T.P.; Digoutte, J.P. and Deubel, V. (1994). "Geographic distribution and evolution of yellow fever viruses based on direct sequencing of genomic DNA fragments". J. Gen. Virol. 75: 417-423).
Esse fato leva à idéia de que a mutação da Treonina (Thr) para Arginina (Arg), criando o padrão Arg-Gly- Asp, é provavelmente um fator relevante para a obtenção do fenótipo atenuado da linhagem 17D da Febre Amarela.
Confirmando tal hipótese, Lobigs et al (Lobigs, M.;
Usha, R.; Nesterowicz, A.; Marschall, I.D.; Weir, R. C. and Dalgarno, L. (19 90) . "Host cell selection of Murray Valley encephalitis virus variants altered at an RGD sequence in the envelope proteín and in mouse neurovirulence". Virology. 176: 587-595) identificaram um padrão de sequência Arg-Gly-Asp (no amino ácido 390) , o que levou à perda de virulência do vírus da encefalite Murray Valley no camundongo.
As alterações nos amino ácidos 170 e 173 no domínio C (domínio I da proteína E na estrutura tridimensional) situa-se muito próximo da posição onde foi identificado um epítopo de neutralização em relação ao vírus da Encefalite Transmitida por Carrapato (TBE) (ver Mandl, C.W. et al) . Foi verificado que uma mutação na posição 171 da proteína E do vírus TBE afeta o nível de mudança conformacional da ativação -de-fusão dessa proteína e que 2 mudanças observadas no vírus 17D da Febre Amarela podem estar relacionadas com o mesmo fenômeno. É aceitável dizer que uma menor taxa de fusão pode retardar a produção completa do vírus e, assim, levar a uma infecção mais branda do hospedeiro. É sintomático o fato de que o recente desenvolvimento do cDNA infeccioso do vírus da Encefalite Japonesa (JE) feito por Sumiyoshi, H. et al (Sumiyoshi, H. ; Hoke, C.H. and Trent, D.W. (1992). "Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates". J. Virol. 66: 5425-5431) permitiu a identificação de uma mutação (Lys para Glu) no amino ácido 13 6 da proteína E que resultou na perda de neurovirulência no camundongo (ver Sumiyoshi, H. ;
Tignor, G.H. and Shope, R.E. (1996). "Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA". J. Infect.
Dis. 171: 1144-1151) . Isto significa que o domínio I é uma área importante e que contém um determinante crítico da virulência do vírus JE, ao contrário da maioria dos dados obtidos a partir da análise da virulência em diversos outros flavivirus para os quais havia sido sugerido que o domínio III seria o sítio primário dos determinantes da virulência/atenuação.
Apesar disso, tais análises da proteína E fornecem uma base para o entendimento de diversos aspectos da biologia do flavivirus e sugere a possibilidade de engenheirá-los visando o desenvolvimento de novas vacinas de flavivirus vivos. A questão da virulência/atenuação é de especial interesse no desenvolvimento de vacinas pois, em princípio, a atenuação virai pode resultar da modificação genética em um ou mais funções virais. 0 vírus da Febre Amarela é o sistema ideal para o estudo da virulência e atenuação dos flavivirus porque: (i) há uma linhagem virulenta (Asibi) a partir da qual foi derivada uma linhagem, vacinai (17D) extremamente bem caracterizada e, usada com sucesso na vacinação humana durante os últimos 5 0 anos; (ii) há um modelo animal que simula a infecção humana; (iii) as sequências nucleotídicas completas de ambas as linhagens virulenta e atenuada já foram determinadas e (iv) estão disponíveis os clones cDNA dos quais o RNA infeccioso pode ser sintetizado.
Holland, J. et al (Holland, J.; Spindler, K. ;
Horodyski, H. ; Grabau, E.; Nichol, S. and VandePol, S. (1982) . "Rapid evolution of RNA genomes". Science. 215: 1577-1585) demostrou que o genoma de RNA virai evolui rapidamente. Assim, uma dada população virai, incluindo vírus vacinai de Febre Amarela, provavelmente é formada de um setor majoritário da população no qual as variantes genéticas podem ser detectadas. No vírus 17D da Febre Amarela, isso é facilmente visualizado quando o vírus é plaqueado em células cultivadas em um meio semi-sólido. A análise prévia da variabilidade genômica usando o sistema de análise das macro-características {"fíngerprinting") dos oligonucleotídeos sugeriu a existência de um alto grau de similaridade genética entre vacinas produzidas no mundo, com uma estimada homologia de sequência de 98-100%. No entanto, foram detectadas mudanças genéticas as quais podem ter ocorrido dentro de 1- 2 passagens, devido possivelmente a seleção de sub-populações de vírus ou mutações pontuais. Não se sabe, ainda, se o fato das propriedades da vacina do vírus 17D da Febre Amarela estarem fora de alguns requerimentos mínimos é devido â existência de variantes genéticas na população vacinai.
De qualquer forma, a estabilização do genoma 17D da Febre Amarela como DNA não somente reduzirá a acumulação de mutações no genoma virai, à medida em que os lotes semente são produzidos para substituir os anteriores, mas também proporcionarão uma população muito mais homogênea em termos de sequência nucleotídica e, consequentemente, em termos de caracterização fenotípica, incluindo a atenuação em humanos, fornecendo, assim, a necessária padronização do vírus da Febre Amarela para a produção de vacinas. A capacidade de manipulação do genoma de flavivirus através da técnica de clone infeccioso abriu novas possibilidades para o desenvolvimento de vacinas.
Essa capacidade é devida ao fato dos vírus poderem ser recuperados a partir do DNA complementar por transcrição e transfecção, in vitro, do RNA em cultura de células e, desses cDNAs correspondentes ao genoma virai completo permitirem a introdução de modificações genéticas em qualquer sítio particular do genoma virai. 0 estudo pioneiro de Racaniello e Baltimore (Racaniello, V.R. and Baltimore, D. (1981). "Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells". Science. 214: 916-919) foi o primeiro a demonstrar exeqüibilidade do vírus se regenerar a partir de um cDNA clonado. Na patente US 4.719.177, Racaniello e Baltimore descreveram, em detalhes, a produção do cDNA do RNA virai por transcrição reversa do RNA virai e inserção da molécula de cDNA resultante no DNA do vetor recombinante. 0 processo foi dirigido, particularmente, para a produção do DNA complementar de dupla-fita (ds cDNA) de poliovirus. Eles descobriram que o cDNA completo de poliovirus transfectado era também infeccioso.
Adicionalmente, com o desenvolvimento de sistemas de transcrição in vitro (ver Melton, D.A./ Krieg, P.A.;
Rabagliati, M.R.; Maniatis, T.; Zinn, K. and Green, M.R. (1984). "Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter" .
Nucl. Acids. Res. 12: 7035-7056), a síntese do RNA virai completo tornou-se muito mais eficiente, quando comparado com a transcrição do cDNA na célula. Mais que isso, o desenvolvimento de melhores metodologias de transfecção, como lipossomas catiônicos e eletroporação, propiciou o aumento da eficiência da transfecção de RNA em células cultivadas. A construção e clonagem de uma cópia completa e estável de cDNA de dengue em uma cepa de Escherichia coli usando o vetor pBR322 foram descritas por Lai, C.J. et al (Lai, C.J.; Zhao, B. ; Hori, H. and Bray, M. (1991). "Infectious RNA transcríbed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus". Proc. Natl.
Acad. Sei. USA. 88: 5139-5143). Eles verificaram que moléculas de RNA produzidas por transfecção in vitro do molde do DNA clonado completo era infeccioso e que os vírus descendentes, quando recuperados da célula transfectada era indistinguível do vírus parental do qual o clone cDNA foi derivado. No entanto, como mencionado no Pedido de Patente WO 93/06214, esse constucto de DNA infeccioso e os RNA dele transcritos eram patogênicos e os vírus de dengue atenuado gerados dessa forma eram geneticamente instáveis e tinham o potencial de voltar frequentemente à forma patogência.
Para resolver este problema, o Depositante propôs construir sequências de cDNA codificando transcritos de RNA para conduzir à produção de vírus quiméricos de dengue incorporando mutações nos fragmentos de DNA gerados. Uma mutação preferida remove a glicosilação da proteína NS1(1). A construção do molde do cDNA completo da linhagem 17D do vírus da Febre Amarela que pode ser transcrito in vitro para produzir o RNA infeccioso do vírus da Febre Amarela foi descrita por Ríce et al (Rice, C.M.;
Grakoui, A.; Galler, R. and Chambers, T. (1989). "Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation". The New Biologist. 1: 285-296). Em razão da instabilidade dos clones do cDNA completo do vírus da Febre Amarela e dos seus efeitos tóxicos na Escherichia coli, eles desenvolveram uma estratégia na qual os moldes completos para transcrição foram construídos por ligação in vitro de fragmentos de restrição apropriados. Mais que isso, eles descobriram que o vírus da Febre Amarela recuperado a partir do cDNA era indistinguível, pela aplicação de diversos critérios, do vírus parental. 0 cDNA infeccioso de Febre Amarela foi derivado da sub-linhagem 17D-204.
Apesar de ser o vírus da Febre Amarela, gerado a partir do cDNA infeccioso de Febre Amarela conhecido, bastante atenuado, ele não pode ser usado para a vacinação humana devido â sua neurovirulência residual, a qual foi verificada por Marchevsky, R.S. et al (Marchevsky, R.S.; Mariano, J.; Ferreira, V.S.;
Almeida, E.; Cerqueira, M.J.,- Carvalho, R.; Pissurno, J.W.; Travassos da Rosa, A.P.A.; Simões, M.C.; Santos, C.N.D.; Ferreira, I.I.; Muylaert, I.R.; Mann, G.F.,- Rice, C.M. and Galler, R. (1995) . "Phenotypic analysis of yellow fever virus derived from complementary DNA" , Am. J. Trop. Med. Hyg. 52(1): 75-80).
Resumindo, para se obter um vírus de vacina de Febre Amarela usando a técnica do DNA recombinante, é necessário, cumulativamente: (1) modificar geneticamente o cDNA infeccioso de Febre Amarela já conhecido; (2) assegurar que o constructo de DNA infeccioso e os transcritos de RNA gerados dele darão origem a vírus não patogênico e, além disso, não tenham o potencial para voltar à forma patogênica;
(3) que o vírus da Febre Amarela gerado do cDNA clonado, adicionalmente à sua atenuação, mantenha as suas propriedades imunológicas.
Dessa forma, ê necessário desenvolver uma vacina para a imunização humana contra a Febre Amarela que seja imunogênica e sem virulência e, que seja gerada a partir do cDNA infeccioso de Febre Amarela clonado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO É o objetivo da presente invenção fornecer uma vacina contra Febre Amarela que seja segura e eficaz, obtida a partir de um cDNA clonado tendo as características fenotípicas da linhagem 17DD, principalmente sua atenuação e imunogenicidade.
Uma das concretizações da presente invenção se relaciona com o clone infeccioso cDNA de Febre Amarela f enotipicamente semelhante â 17DD, a qual é a sub- linhagem geneticamente mais estável da linhagem 17D do vírus da Febre Amarela.
Em outra concretização da presente invenção, são fornecidos novos plasmídeos que compõem a sequência completa do cDNA infeccioso da Febre Amarela.
Outra concretização se relaciona com o vírus recombinante da Febre Amarela que é regenerado a partir do cDNA infeccioso da Febre Amarela.
Em outra concretização, a presente invenção se relaciona ao processo de produção de uma vacina contra o vírus de Febre Amarela pela transfecção de células hospedeiras e recuperação do vírus fenotipicamente semelhante ao vírus 17DD. O molde de cDNA da presente invenção é resultante de nove mutações que foram introduzidas no cDNA infeccioso denominado YFiv5.2 (see Rice et al, 1989).
Assim, de acordo com a presente invenção, são fornecidos novos plasmídeos, denominados pYF5'3'IV/G1/2 e pYFM5.2/T3/2 7 bem como o processo de sua obtenção para permitir a ocorrência das mencionadas mutações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Explica a história da passagem da linhagem Asibi original da Febre Amarela e a derivação das linhagens 17D da vacina de Febre Amarela.
Figura 2 : Ilustra o uso do vírus 17DD na imunização humana durante o estabelecimento da linhagem 17D no Brasil.
Figura 3: Mostra a analise da glicolisação N-ligada da proteína E virai em gel desnaturante de poliacrilamida.
Figura 4: Mostra a estrutura do plasmídeo pYF5'3'IV/G1/2 tendo as sequências terminais das extremidades 5' e 3' do cDNA infeccioso da presente invenção.
Figura 5: Mostra a estrutura do plasmídeo pYFM5.2/T3/27 tendo a região mediana do genoma do cDNA infeccioso da presente invenção.
Figura 6: Estabelece a completa sequência nucleotídica do cDNA infeccioso da Febre Amarela da presente invenção.
Figura 7: Ilustra a metodologia de regeneração do vírus de Febre Amarela a partir do cDNA clonado da presente invenção.
Figura 8: Exibe a análise comparativa de tamanho, através do plaqueamento, entre os vírus 17D de Febre Amarela.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A execução de testes para determinação do fenótipo do vírus recuperado do cDNA da sub-linhagem 17D-204 descrita por Rice etal., 1989, mostrou que o vírus é apropriado para o mapeamento dos determinantes de virulência sob o ponto de vista da reversão ao fenótipo do tipo selvagem. No entanto, os testes clínicos de neurovirulência mostraram resultados levemente elevados, o que sugere que se deve tomar precaução no seu uso em vacinação humana (Marchevsky et al, 1995). É também digno de nota o fato de que a sub-linhagem 204 do vírus 17D da Febre Amarela, usado na elaboração de bibliotecas de cDNA e de cDNA infeccioso (Rice et al, 1985; 1989), esta estreitamente relacionada, em termos de linhagem e nível da passagem, a outras sub-linhagens 2 04 do vírus da Febre Amarela, o que levou a ocorrência, nos vacinados, de muitos casos de encefalite em decorrência de vacinação (Schoub, B.D.;
Dommann, C.J.; Johnson, S.; Downie, C. and Patel, P.L. (1990) . "Encephalitis in a 13-year old boy following 17D YF vaccine". J. Infection 21: 105-106; Merlo, C., Steffen, R.; Landis, T., Tsai, T. and Karabatsos, N.
(1993). "Possible association of encephalitis and a 17D YF vaccination in a 29-year old traveller". Vaccine. 11: 691) . Em oposição a esse fato, não ocorreu nenhum caso de encefalite pós-vacinação na utilização da sub- linhagem 17DD, mesmo nos primórdios da vacinação (Fox, J.P.; Lennette, E.H.; Manso, C. and Souza Aguiar, J.R. (1942). "Encephalitis in man following vaccination with yellow fever 17D virus. Am. J. Hyg. 36: 17-142; Fox, J.P. and Penna, H.A. (1943). "Behavior of 17D yellow fever virus in Rhesus monkeys. Relation to substrain, dose and neural or extraneural inoculation". Am. J.
Hyg. 38: 52-172) .
Fica evidente, com base na Tabela 1 e figura 2, que a sub-linhagem 17DD foi de longe a mais usada na produção tanto de inóculo quanto de vacina, cora ênfase especial para a sub-linhagem Eplow que continua a ser usada até hoje. A completa sequência nucleotídica de genoma da sub-linhagem 17DD Eplow foi recentemente derivada (Duarte dos Santos et al, 1995) e sua comparação com as sequências disponíveis de outras sub- linhagens, como a 17D-204 (Rice et al, 1985; Despres et al, 1987) e 17D-213 (Duarte dos Santos et al, 1995) fornece uma estimativa da extensão da variabilidade genética dentre essas linhagens. 0 número médio de mudanças nos nucleotídeos, cujas posições de observação foram fixadas, ou na sequência de amino ácidos por passagem do vírus é significativamente mais baixo para a DD, sugerindo que a linhagem 17DD é geneticamente mais estável do que as outras (Galler, R. et al, em preparação) fato esse que é de relevante importância no diz respeito à produção de vacina de Febre Amarela.
Tabela 1: Quantidades estimadas de inóculo e vacina produzidos com diferentes sub-linhagens durante o período de 1937-1942 no Brasil sub-linhagens 17D Período de uso em meses Inóculo (ml) Vacina (ml) 17DRÍ0 8 161 ND
17Dlow 15 132 ND
17D2Rio 12 ND’ ND 17D3Rio 6 ND 4,080 17DDhigh 11 969 36,125 17DDIow 16 365 55,778 17DD1-8 12 Vacina* 33,842 17D-NY102 6 1, 317 2,668 17D-NY104 17 Vacina 14,073 17D-NY318 3 Vacina 1, 820 17D-NY310 3 Vacina 4,457 17DD EP 48 Vacina 11,754 17DD EPIow+ 48 ND 7, 097 17DD EPhigh 2 ND 2 , 781 * Vacina significa que o inóculo para a subsequente produção de vacina foi também um lote de vacina. A quantidade de inóculo nesses casos não estão disponíveis.
Atualmente em uso na produção de vacinas na FIOCRUZ * ND: não disponível.
Assim, de acordo com a presente invenção, foram introduzidas mutações no clone infeccioso do cDNA da Febre Amarela, denominado YFiv5.2, para torná-lo fenotipicamente semelhante ao DD. Essas mutações estão localizadas nas seguintes posições nucleotídicas/genes/amino ácidos: • 1140/E/36 (T (Timina) => Vai (Valina) C (Citosina) => Ala (Alanina) ) , • 1436, 1437/E/155 (G (Guanina), A (Adenina) => Asp (Ácido Aspártico} , —> A (Adenina) , G (Guanina) => Ser (Serina)), • 1946/E/335 (T (Timina) => Ser (Serina) —> C (Citosina) => Pro (Prolina) ) , • 2219, 2220/E/409 (A (Adenina), C (Citosina) => Thr (Treonina) —> G (Guanina) , T (Timina) =i> Vai (Valina) ) , • 8 8Q8/NS5/3 91 (A (Adenina) =» Asn (Asparagina) -» G (Guanina) =í> Ser (Serina) ) , • 9605/NS5/657 (G (Guanina) => Asp (Ácido Aspártico) -» A (Adenina) => Asn (Asparagina)).
Adicionalmente a essas mutações, uma mutação codificante e quatro mutações silenciosas ocorreram fortuitamente nos seguintes nucleotídeos/genes 2356/E
(T (Timina) —» C (Citosina)), 2602/NS1 (T (Timina) —> C (Citosina)), 2677/NSl (C (Citosina) -» T (Timina)), 2681/NSl (G (Guanina) => Ala (Alanina) —> A (Adenina) => Thr (Treonina) ) , e 10722 (G (Guanina) —» A (Adenina)). Finalmente, a mutação ocorrida no nucleotídeo/gene 8656/NS5 (A (Adenína) —> C (Citosina)) foi necessária para criar um sítio BstEII que permite a apropriada ligação e regeneração do genoma completo e, consequentemente, a recuperação do vírus. A criação de um sítio de glicosilação N-ligado no amino ácido E/155 (nt) , a qual está localizada no domínio I (como definido em Rey, F.A. et al) , pode influenciar a atividade fusogênica da proteína E. Esse fenômeno foi observado para o vírus da dengue tipo 2 que teve esse sítio eliminado por mutação, Isso se deve ao fato de que as proteínas E, na ausência de açúcar no meio, têm um elevado nível de pH e, assim, uma tendência a se fundir mais facilmente com a membrana endossômica, permitindo, portanto, o prosseguimento do ciclo virai. Em relação a isso, diferentemente dos vírus 17DD e 17D-213, a vacina do vírus 17D-204 da Febre Amarela consiste de uma população mista de vírus com ou sem aquele sítio de glicosilação (ver Post, P.R.; Santos, C.N.D.; Carvalho, R.; Cruz, A.C.R.; Rice, C.M. and Galler, R. (1992) . "Heterogeneity in envelope protein sequence and N-linked glycosylation among Yellow Fever virus vaccine strains. Virology. 188: 160- 167). Com relação a isso, é sintomático o fato de que o vírus que provocou um caso fatal de encefalite humana pós-vacinal não possuia, em consequência de mutação, o sítio de glicosilação N-ligada (see Jennings, A.D.;
Gibson, C.A.; Miller, B.R.; Mathews, J.H.; Mitchell, C.J.; Roehrig, J.T. ; Wood, D.J.; Taffs, F.; sil, B.K.;
Whitby, S.N.; Monath, T.P.; Minor, P.D.; Sanders, P.G. and Barrett, A.D.T. (1994). "Analysis of a yellow fever virus isolated from a fatal case of vaccine-associated human encephalitis". J. Infect. Dis. 169: 512-518) Uma população isenta deste sítio foi selecionada para a construção do cDNA infeccioso da Febre Amarela. A figura 3 mostra um gel de imunoprecipitação de proteínas virais, metabolicamente marcadas com [35S] metíonine, de duas linhagens de vacina de Febre Amarela e de clones infecciosos de vírus da Febre Amarela. Células VERO foram infectadas a um MOI (multiplicidade de infecção) de 1. A 48 horas de pós-infecção, monocamadas de células foram marcadas, através de técnica de pulso, com [35S] metionine por 1 hora.
Extratos de células contendo detergente foram imuno- precipitadas com antisoro de camundongo hiperimune específico para Febre Amarela (obtido da ATCC
American Type Cell Culture). Todos os imuno- precípitados foram coletados usando sefarose-proteína A. Todas as amostras foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio a 10% e por fluorografia e exposição a -70°C. Os números identificadores dos canais correspondem a: (1) vacina de linhagem 17DD; (2) clone infeccioso A5/2-T3; (3) clone infeccioso A5/T3; (4) vacine de linhagem 17D-213; (5) clone infeccioso Gi/5.2; (6) clone infeccioso A5- T3/27; (7) clone infeccioso G1/2-T3 N/S; (8) clone infeccioso G1/2-T3/27. As posições dos marcadores de peso molecular são mostradas à esquerda e as proteínas virais da Febre Amarela encontram-se à direita. É menos claro o potencial papel desempenhado pelas outras mudanças na sequência da proteína E para a completa atenuação do vírus recuperado do cDNA.
Com relação às 2 alterações na proteína NS5, até o momento não hã analise estrutural disponível, sendo, dessa forma, difícil predizer o efeito causado por qualquer mudança de um amino ácido particular na sua conformação/função. Entretanto, a mutação no amino ácido 657, a partir da extremidade amino da NS5, é somente 8 amino ácidos distante do sítio catalítico putativo da RNA replicase, o padrão Gly-Asp-Asp (Glicina-Ácido Aspártico-Ácido Aspártico), o qual é conservado através das polimerases do RNA virai desde vírus de planta até animais. Não seria surpresa se esta mutação tivesse algo alterado na sua atividade enzimática levando a uma melhor cinética de replicação do RNA na célula infectada e consequentemente um maior título virai.
As mutações nos sítios nucleotídicos 1140, 1436, 1437, 1946, 2219, 2220, 8808 e 9605 foram introduzidas no cDNA infeccioso de Febre Amarela, Yfiv5.2. O cDNA infeccioso de Febre Amarela, na sua versão conhecida, existe na forma de dois plasmídeos tendo as sequências terminais das extremidades 5' e 3' (pYF5'3'IV) e a região genômica mediana (pYFM5.2) como descrito por Rice, C.M, et al (Rice et al, 1989). A construção desses plasmídeos de Febre Amarela requereu a ligação de diversos fragmentos de cDNA presentes em diferentes plasmídeos de biblioteca de cDNA. Os vírus que deram origem a essa biblioteca de cDNA foram purificados duas vezes por plaqueamento em culturas de fibroblastos de embrião de galinha (CEF - "Chiken Embryo Fibroblasts"}, sendo o título amplificado por passagens consecutivas em células Vero, BHK e SW13, uma vez cada (ver Figura 1) . 0 nível de variabilidade genética na população virai utilizada para a extração do RNA não é conhecida.
Entretando, a anãlide da sequência completa de nucleotídeos do cDNA infeccioso final contido nos plasmídeos forneceu a identigficação das mudanças dos nucleotídeos não presentes em qualquer outro vírus 17D para os quais as sequências genômicas estão disponíveis. Devido a problemas relacionados com a estabilidade , foi impossível incluir todo o genoma do vírus da Febre Amarela em um único plasmídeo, tenso sido, assim, estabelecido um sistema de dois plasmídeos e ligação in vitro dos fragmentos de restrição purificados para regenerar o genoma completo (see Rice, C.M. et al, 1989) . 0 plasmídeo pYF5'3'IV contém a sequência da extremidade 5' do vírus da Febre Amarela (nt 1-2271) adjacente ao promotor da polimerase do fago SP6 e a sequência da extremidade 3' {nt 8276-10862) adjacente ao sítio Xhol usado para a produção dos transcritos "run off" (ver figura 2 em Rice, C.M. et al, 1989) . O plasmídeo pYFM5.2 contém o cDNA do vírus 17D de Febre Amarela do nucleotídeo 1372 ao 8704. O plasmídeo pYF5'3'IV/G1/2 é preparado a partir do pYF5'3'IV pela criação de mudanças, na sequência da extremidade 5' do vírus da Febre Amarela, nos nucleotídeos 1140 e 1436/1437, e na sequência da extremidade 3 , nos nucleotídeos 8656 e 9605 (ver Tabela 2) . O restante do plasmídeo consiste de pBR322 com uma deleção desde o sítio Aatll até o sítio Eco0109, o que resultou na destruição de ambos os sítios. Este último plasmídeo contém um único sítio Aatll correspondente ao nucleotídeo 8406 do cDNA do vírus 17D da Febre Amarela. Para consumar as mudanças, foram necessárias duas rodadas separadas das etapas de clonagem/mutagênese para criar mutações relevantes nas proteínas E e NS5. As mutações na proteína E foram introduzidas por clonagem de um fragmento Xbal/PstI no pAlter (Promega, Inc.) e troca de fragmentos de restrição com Apal/NotI. As mudanças na proteína NS5 foram introduzidas por clonagem/mutagênese de um fragmento EcoRI/SstI no pAlter e permutação para retornar ao plasmídeo original usando as mesmas enzimas. A estrutura do plasmídeo pYF5'3'IV/Gl/2 é mostrada na figura 4.
Tabela 2: Modificação genética dos plasmídeos de vírus da Febre Amarela.
Plasmídeo Hudanças Nualeotídicasa YF5'3'IV Gl/2 1140 1436/1437 8656, 9605 YFM5.2 T3/27 1946 (Plasmídeo estenddido por 719 2219/2220 nucleotídeos para um único sítio 8656 Sall - série T3) 8808 a. Todas as mudanças foram confirmadas pela determinação da sequência de nucleotídeos no DNA do plasmídeo e no cDNA do vírus recuperado. 0 plasmídeo pYFM5.2/T3/2 7 é preparado a partir do pYFM5.2 por introdução de mudanças nos nucleotídeos 1946, 2219/2220, 8656 e 8808. Para consumar as mudanças nucleotídicas, foi introduzido, no pYFM5.2, um fragmento AatlI/SalI incluindo os nucleotídeos 8406- 9423 do vírus da Febre Amarela, o que confere ao plasmídeo 719 nucleotídeos a mais do que o seu parental pYFM5.2. Como o Sall também está presente na mesma posição nucleotídica nas sequências do vírus da Febre Amarela do outro plasmídeo do vírus da Febre Amarela (pYF5' 3' IV) , é possível usar a combinação de Apal ou Nsil e Sall para produzir os relevantes fragmentos da enzima de restrição, 0 plasmídeo intermediário pYFM5.2/T3 foi usado para derivar o plasmídeo T3/27 que contém as mudanças nos nucleotídeos 1946 (T—> C) , 2219 (A—> G) e 222 0 (C-> T) , quando comparado ao parental YFiv 5.2 (ver Tabela 3). A estrutura do plasmídeo pYFM5.2/T3/2 7 é mostrada na figura 5.
Tabela 3: Comparação entre as sequências plasmidiais do clone infeccioso da Febre Amarela.
NT/gene YFiv5.2“ DD“ YFxv5.2/DDc KT=>AA 1140/E T C C T=>Val^C=>Ala 143 6, 1437/E G,A A,G A, G G, A=>Asp-»A, G=>Ser 1946/E T C C T=>S—>C=>P 2219, 2220/E A,C G,T G, T A, C=^Thr—>G, T=>Val 2356/E T T C
2602/NS1 T T C
2677/NS1 C C T 2 681/NS1 G G A G=i>Ala—>A=>Thr 8 656/NS5 A A C 8808/NS5 A G G A=^Asn—>G=>Ser 9605/NS5 G A A A=>Asp—>G=>Asn 10454 G A A
10722 G G A a Rice at al (1989) b Duarte dos Santos et al (1995) Ferreira, II and Galler, R. (ainda não publicado). 0 sitio BstEII no nucleotideo 8656 do virus da Febre Amarela foi criado em ambos os plasmídeos do vírus da Febre Amarela e a digestão dos mesmos com Apal ou Nsil e BstEII forneceu os apropriados fragmentos de enzima de restrição para a ligação e regeneração do genoma completo do vírus.
Esta característica constitui outro marcador genética para esta nova versão do cDNA infeccioso de Febre Amarela. A
sequência nucleotídica completa (SEQ ID NO:l) do cDNA infeccioso de Febre Amarela da presente invenção (YFiv5.2/DD) é mostrado na figura 6. O depósito dos plasmídeos pYF5'3'IV/G1/2 e pYFM5.2/T3/27 foi feito junto à American Type Culture Collection, tendo sido identificados pelos números de acesso ATCC 97771 e 97772, respectivamente. A figura 7 mostra a metodologia para a regeneração do vírus da Febre Amarela a partir do DNA complementar clonado. Os plasmídeos Gl/2 e T3/27, mostrados nas figuras 4 e 5 são digeridos com Apal e Sall para produzir os fragmentos de restrição, os quais são purificados, ligados e digeridos com Xhol. 0 DNA resultante corresponde ao molde do cDNA completo do vírus da Febre Amarela o qual pode ser usado para transcrição in vitro com polimerase SP6 para produzir os transcritos do RNA infeccioso na transfecção de células de vertebrados cultivadas. A área escura, na figura, corresponde às sequências do vetor que contém o gene da beta-lactamase e a origem de replicação. A posição do promotor SP6 é mostrada, sendo adjacente ao primeiro nucleotídeo 5 do genoma do vírus da Febre Amarela. Os nucleotídeos 1-1603 {direção descendente até o sítio Apal) e 9424 (Sall) até o 10862 (Xhol) são originários do plasmídeo Gl/2 enquanto os nucleotídeos de 1604 (Apal) até o 9423 (Sall) vêm do plasmídeo T3/27.
Além do pBR 322, outros vetores que propiciem a estabilização do genoma do vírus da Febre Amarela podem ser usados para preparar os plasmídeos da presente invenção. Exemplos específicos são os plasmídeos pBR 325, pBR 327, pBR 328, pUC 7, pUC 8, pUC 9, pUC 19, fagos tais como fago X, fago M13 e semelhantes.
Os moldes foram preparados a partir do pYF5'3'IV/Gl/2 e do pYFM5.2/T3/27 usando Apal/Sall e Nsil/Sall para produzir os fragmentos de restrição para a ligação in vitro. Após a digestão com Xhol para linearizar o DNA ligado, o molde foi usedo para a transcrição in vitro. 0 Vírus foi recuperado após a transfecção, com o RNA, de células animais cultivadas. O vírus regenerado dos plasmídeos pYF5'3'IV/Gl/2 e pYFMS.2/T3/2 7 é aqui referenciado como YFiv5.2/DD.
Ao contrário do vírus 17D recuperado do cDNA original (Yfiv5.2; ver figura 8), o novo vírus, semelhantemente ao YF 17DD e 17D-213, produz grandes placas em células Vero. Em dez passagens consecutivas do vírus em células CEF, o fenótipo do material dessas grandes placas mostrou-se estável. Adicionalmente, não ocorreu alteração da sua neurovirulência em camundongos, quando comparado a outros controles vacinais do vírus 17D da Febre Amarela conhecidos (Tabela 4).
Tabie4: Neurovirulência e neuroinvasão dos vírus 17D da Febre Amarela em camundongo3 vírus rota de inoculação intracerebral intranasal inóculo fPFU/mlb)c mortes tempo médio de sobrevida inóculo fPFU/mI)c mortes tempo médio de sobrevida 17DDd 6.5>d05 7/8 10.43 ±1.13 6.5x106 1/10 30 dias 170-213^ 2x106 8/8 8.50 Ü.07 2.1xl07 2/10 16.5 dias 17D-204/A5-T3f 4.75x10’ 8/8 8.50 d0.93 4.75xl06 0/9 N.A
17D-204 G1/2-T3/278 1.3x10* 8/8 8.50 93 1.3xl07 0/14 N.A a. camundongos suiços, população de Êenótipo semelhante {"inbred"), 3-semanas de idade fYtg). b. pfu = unidade formadora de placa c. inóculo de 20|±L cada i.c e i.n. d. sub-linhagem atualmente usada na produção da vacina de Febre Amarela (YF), cuja sequência serviu de modelo para as modificações genéticas introduzidas no primeiro cDNA infeccioso de Febre Amarela (YF). e. linhagem vacinai usada na cultura de tecido experimental inicial, sendo também a sub-linhagem utilizada pela Organização Mundial da Saúde f. esta sub-linhagem corresponde ao vírus original derivado da primeira versão do cDNA infeccioso de Febre Amarela. g.versão atual da prole de vírus a partir do clone infeccioso cDNA geneticamente modificado. A cultura de células animais usadas na presente invenção pode ser qualquer tipo de célula na qual o virus de linhagem 17D da Febre Amarela possa se reproduzir.
Exemplos específicos incluem Hela (derivada do carcinoma do colo do útero humano) , CV-1 (derivada de rim de macaco), BSC-l (derivado de rim de macaco), RK-13 (derivada de rim de coelho), L929 (derivada de tecido conectivo de camundongo), CE (embrião de galinha), CEF (fibroblasto de embrião de galinha), SW-13 (derivada de carcinoma do córtex da glândula supra-renal humana), BHK-21 (rim de hamster novo) , Vero (rim de macaco verde africano), LLC-MK2 (rim de macaco Rhesus (Macaca mulata)), etc.
Assim, de acordo com uma das concretizações da presente invenção, foi estabelecido um protocolo para a produção de vírus vacinai de Febre Amarela, segundo normas de alta qualidade ("Good Manufacturing Practices" - GMP), por transfecção de células certificadas para a produção de vacina humana e recuperação do vírus semelhante ao 17DD. Este vírus foi então usado na produção de lotes semente primário e secundário em culturas primárias de CEF de acordo com as GMP. 0 vírus resultante dos lotes semente foi testado quanto à neurovirulência em macaco. Este trabalho abre o precedente para a produção de novos flavivirus vivos atenuados, a partir do cDNA clonado, sabendo-se que já estão disponíveis clones infecciosos dos flavivirus, podendo-se citar, em especial, os clones infecciosos do vírus da dengue e da encefalite japonesa. 0 detalhamento dos processos para a produção dos lotes semente original, primário e secundário pode ser encontrado no exemplo 5. A produção de vacina de Febre Amarela baseada no sistema de lote semente surgiu da necessidade de se produzir vírus confiável sob o ponto de vista de vacinação humana. Assim, o conceito do sistema de lote semente foi o primeiro grande impacto no desenvolvimento da vacina de Febre Amarela. No período de 1937-1942, os cientistas que estavam trabalhando com o estabelecimento da produção de vacina de Febre Amarela usaram várias sub-linhagens 17D virais (17D Rio, 17Dlow, 17D2Rio, 17D3Rio, 17DD, 17DDhigh, 17DDlow, EP, EPlow, EPhigh, NY102, NY104, NY 310/318) . À medida que a produção e as campanhas de vacinação prosseguiam e que surgiam complicações de saúde nos vacinados, foi visualizada a possibilidade de seleção fenotípica dos vírus por passagem seriada em cultura de tecido. Em consulta aos registros da produção de vacina na FIOCRUZ, foi verificado que, para todas as sub-linhagens, eram preparados mais inóculos do que o que era realmente usado na produção de vacina e, assim, frascos de passagens específicas estavem normalmente disponíveis {Post, PR. and Galler, R., ainda não publicado). Este procedimento de operação, juntamente com o uso de linhagens múltiplas simultaneamente, permitiu a ininterrupção da produção. No entanto, a observação de complicações pós-vacinais em humanos e também a falha de alguns vírus, quando submetidos a testes de controle de qualidade (neurovirulência em macacos), que foi descrita por Fox et al (1942) e Fox e Penna (1943) , tornou imperativa a redução das variações durante a produção.
Uma das medidas adotadas foi a redução das passagens virais usada na produção pelo estabelecimento do sistema de lote semente no qual o vírus e'amntido em níveis de passagem definidos enquanto é testada a qualidade de uma passagem particular. Os acima citados registros nos permitiram deduzir que o fato primordial que levou a esse desenvolvimento foi a observação de que grande número de passagens da sub-linhagem DD (denominada DDhigh) levou à perda de imunogenicidade dos vacinados humanos com insuficiente proteção da população local contra a Febre Amarela do tipo selvagem (Fox & Penna, 1943) . Esta observação levou os cientistas de volta às passagens iniciais da sub-linhagem DD, mais precisamente nos níveis 229/230, que foi, então, usada para preparar 8 inóculos consecutivos (denominado DD1 até 8). Cada uma dessas sub-linhagens DD foi cultivada para não mais do que 3 0 passagens. Cada passagem foi realmente usada na produção de vacina, mas por diferentes períodos. Esse procedimento produziu vírus confiáveis sob o ponto de vista de vacinação humana. Neste estágio, a sub-linhagem NY104 era uma das que estavam sendo usadas na produção da maoir parte das vacinas. Em consequência dos bons resultados alcançados, essa mudança na operação foi implantada e a NY104 foi a primeira sub-linhagem a ser completamente empregada no sistema de lote semente. É marcante o fato de que, nesta prática, somente 3 lotes semente (E688, E694 e E716) foram utilizados para produzir cerca de 2 milhões de doses de vacina durante dez meses. Infelizmente, algumas bateladas dessas vacinas voltaram a ser extremamente neurotrópicas (Fox et al, 1942; Fox & Penna, 1943) e o uso dessa sub- linhagem foi descontinuado. A próxima linhagem na linha sucessória foi a Eplow que foi usada na sc (sub-cultura) 243 para produzir inóculos em ovos embrionados ao invés de tecido de embrião de galinha sem tecido nervoso.
Houve 150 passagens seriadas do Eplow em ovos embrionados mas somente 7 dessas passagens foram usadas na produção de vacina. 0 vírus produzido desta forma apresentou uma boa performance nos testes de neurovirulência em macaco e em ensaios em humanos. Dessa forma, Eplow na passagem 3 5 em embrião de galinha, foi usado para preparar a vacina EPF374 que mais tarde deu origem aos lotes semente primário e secundário da linhagem DD, que está em uso até hoje, a qual é só duas passagens â frente da semente original durante os últimos 50 anos.
Numa concretização preferida da invenção, culturas primárias de células de fibroblastos de embrião de galinha (CEF) são utilizadas, em todas as etapas de produção, na propagação do vírus vacinai 17D da Febre Amarela em células certificadas para a produção de vacina humana. Há diversos motivos para usar-se células CEF: essas células têm sido utilizadas, por um longo tempo e com sucesso, para a produção de vacina contra sarampo, tendo-se adquirido grande experiência na sua preparação e no controle de sua qualidade; está disponível um grande número de Procedimentos Operacionais Padrão (POPs). Mais do que isso, a produção de vacina de Febre Amarela em culturas de CEF levou a lotes consecutivos de vacina que passaram em todos os testes, incluindo neurovirulência em macacos. A padronização do genoma do vírus 17D da Febre Amarela como DNA não só reduzirá a acumulação de mutações no genoma virai à medida em que lotes semente sejam produzidos para substituir os anteriores mas também fornecerá uma população muito mais homogêncea em termos de sequência nucleotídica e, consequentemente, em termos de marcadores fenotípicos, incluindo atenuação em humanos Como mencionado anteriormente, em uma concretização preferida da invenção, todos os lotes foram preparados em culturas primárias de células CEF usando ovos derivados de granjas SPF ("Specific Pathogen Free"). As culturas de células foram preparadas em um meio apropriado e posteriormente semeadas em frascos de cultura de tecido. Os vírus foram recuperados após incubação, centrifugação e remoção dos restos celulares. Ao sobrenadante contendo os vírus foi adicionado estabilizador, conhecido dos especialistas na técnica, que possui a propriedade de aumentar a estabilidade dos concentrados virais. Todos os vírus foram armazenados a -70°C.
Os seguintes exemplos são ilustrativos da invenção e representam concretizações preferidas. Aqueles devidamente qualificados com relação ao estado da técnica saberão ou estarão aptos a encontrar não mais do que experimentação de rotina para empregar outros materiais ou técnicas apropriadas, tais como os vetores anteriormente citados, cultura de células e métodos de transfecção. EXEMPLO 1 Preparação de DNAs de plasmídeos: a)Derivados do plasmídeo pYF5'3'IV
Como descrito em Rice et al, 1989, o plasmídeo pYF5'3'IV contém a porção 5' terminal da sequência da Febre Amarela (nt 1-2271) adjacente ao promotor SP6 e, a sequência da porção 3' terminal (nt 8276-10862) adjacente ao sítio Xhol, que é usado para linearizar o molde e desta forma, permitir a produção de transcritos "run-off", todos introduzidos na sequência do plasmídeo pBR322. Os plasmídeos originais dos quais a porção 5' terminal da sequência da Febre Amarela foi derivada são: pYF5' ext#20 Cnt 1-536), p28IIX {nt 537-1964), e plOm (nt 1965-2271). p35riI {nt 8276-8732), p34IIT (nt 9658-10223), pYF3'ext.#17 (nt 10224-10708) e pYF3'1#12 (nt 10709- 10862) foram os plasmídeos originais dos quais a porção 3' terminal da sequência da Febre Amarela foi derivada (Rice et al, 1989). 0 plasmídeo pYF5'3'IV contém um sítio único Aatll, correspondente ao nt 8406 do cDNA da linhagem 17D da Febre Amarela. b) Derivados do plasmídeo pYF5'3'IV Gl/2 pYF5'3'IV/Gl/2 foi preparado a partir do pYF5'3'IV, conduzindo-se 2 rodadas separadas de clonagem/mutagênese para criar-se as alterações nos nucleotídeos 1140, 1436/1437 da proteína E, e nos nucleotídeos 8656, 8808 and 9605 da proteína NS5. As primeiras alterações genéticas foram conduzidas pela clonagem do fragmento Xbal/PstI no pAlter (Promega Corp.) e substituição da sequência original pela mutante por troca de fragmentos de restrição usando Apal/NotI. As substituições em NS 5 foram introduzidas por clonagem/mutagênese de um fragmento EcoRI/SstI no pAlter e retornando-o ao plasmídeo original usando as mesmas enzimas. c) Preparação do plasmídeo pYFM5.2 0 plasmídeo pYFM5.2 usado foi também descrito em Rice et al, 1989. Os plasmídeos originais a partir da qual a sequência nucleotídica 1372-8704 do cDNA da linhagem 17D da Febre Amarela foram derivados são: p9i: (nt 1372-1603), plOm (nt 1604-3823), p3ZII (nt 3824- 6901), p9„ (nt 6902-7888) e p35iri Xho"#19 (nt 7889- 8704). p35Iir Xho_#19 foi construído a partir do p35m , no qual uma mutação silenciosa C para T no nucleotídeo 8212 foi introduzida para destruir o sítio Xhol no cDNA da Febre Amarela, permitindo assim o uso de Xhol para linearizar os moldes de DNA e, consequentemente a produção de transcritos "run-off". d) Derivados do plasmídeo pYFMS,2/T3/27 pYFM5.2/T3/27 foi preparado a partir do plasmídeo pYFM5.2 pela introdução do fragmento AatlI/SalI que abrange os nucleotídeos 8406-9423 e pela criação do sítioBstEII no nucleotídeo 8656 da Febre Amarela. Uma segunda mutação foi introduzida na posição 8808 na proteína NS5.
Frente a dificuldade de digestão dos DNAs de plasmídeo com Aatll, pelo fato desta enzima ser muito precisa e cara, criou-se um sítio BstEII no nucleotídeo 8656 da Febre Amarela em ambos os plasmídeos da Febre Amarela, seguindo-se de uma digestão com Apal ou Nsil para produzir os fragmentos da enzima de restrição apropriados para a ligação e regeneração do genoma completo e permitindo assim , a recuperação do vírus.
Esta etapa pode ser também executada quando os fragmentos de restrição são produzidos por digestão com Apal ou Nsil e Sall. A estrutura de cada plasmídeo é mostrada nas figuras 3 e 4 e a sequência completa das sequências codificantes para cada plasmídeo é fornecida na figura 5 .
Uma comparação entre as sequências do plasmídeo do clone infeccioso original da Febre Amarela, da linhagem 17DD da Febre Amarela e do clone do cDNA infeccioso da Febre Amarela, YFiv5.2/DD, são mostrados na Tabela 5. e) Preparação de grandes quantidades de DNA de plasmídeo Para preparar os DNAs dos plasmídeos, a partir de bactéria, é necessário dispor de estoques de E. coli em glicerol contendo cada um dos dois plasmídeos de Febre Amarela. Meio Luria Broth em glicerol a 50% é usado na preparação dos estoques, os quais são estocados à -70°C.
Alíquotas congeladas do pDNA também devem estar disponíveis.
As bactérias são crescidas em 5 ml de LB contendo ampicilina (15 (ig/ml) durante a noite â 37 °C. Isto é usado para inocular na razão 1:10 0, grandes volumes de LB (normalmente 100-200 ml). A uma OD600 de 0,8, adiciona-se cloranf enicol a 250 |ng/ml para a amplificação do DNA do plasmídeo durante a noite. 0 plasmídeo é extraído usando o método da lise alcalina. O precipitado do DNA final é ressuspenso em TE (tampão tris-EDTA) e cloreto de césio é adicionado até ser alcançado um índice de refração de 1,3890. O DNA do plasmídeo é bandeado por ultracentrifuqação por um período de 214 horas. O DNA ligado é recuperado puncionando-se o tubo, extração com butanol e diãlise extensiva.
Os rendimentos são usualmente, 1 mg do pDNA/litro de cultura para o pYF5' 3' IVGl/2 e 0.2 mg/litro para o pYFM5.2/T3/27. EXEMPLO 2 Preparação do molde de DNA: 0 molde a ser usado para a regeneração do vírus da linhagem 17D da Febre Amarela é preparado pela digestão do DNA do plasmídeo com Nsil and Sall (Promega Inc.) nas mesmas condições de tamponamento, como recomendado pelo fabricante. 10 |0,g de cada plasmídeo são digeridos com ambas as enzimas (a quantidade requerida é calculada em termos do número de pmol presente em cada pDNA, com vista a atingir a digestão completa em 2 horas) . A digestão é conferida pela remoção de alíquota (200 ng) e por corrida em gel de TAE/agarose 0,8%. Quando a digestão está completa, as enzimas de restrição são inativadas por aquecimento.
Os fragmentos de DNA são ligados em uma concentração de 2 0 jig/ml para cada fragmento e T4 DNA ligase a 5 U/ml. A ligação procede durante a noite à 15“C. A mistura de ligação ê aquecida a 65°C por 20 minutos para inativar a T4 DNA ligase e, uma alíquota é retirada (2 00 ng).
Digestões adicionais do DNA resultantes da ligação são conduzidas utilizando Xhol e são executadas em condições de tamponamento ajustadas, de acordo com especificações do fabricante (Promega), visando-se linearizar o molde. O produto resultante é posteriormente extraído com a mistura fenol-clorofórmio e, precipitado com etanol. 0 precipitado é lavado com eatanol a 80% e ressuspenso em tampão estéril Tris-EDTA livre de RNase.
Retira-se alíquota do molde para análise em gel de agarose juntamente com marcadores comerciais para quantificação e determinação do tamanho da banda. O molde é estocado à -20 °C até o seu uso para a transcrição in vitro. EXEMPLO 3 Transcrição do RNA a partir do molde do cDNA da presente invenção: Transcritos de RNA foram preparados pelo uso do molde do DNA da presente invenção, em uma maneira similar como a descrita em Konarska et al, 19 84 e em Rice et al, 1987 (Konarska, M.M.; Padgett, R.A.; Sharp, P.A. (1984} "Recognition of cap structure in splicing in vitro of mRNA precursors" . Cell. 38: 731-736; Rice, C.M.; Levis R.; Strauss, J.H.; Huang, H.V. (1987) "Production of infectious RNA transcripts from Sindbis virus cDNA clones: Mapping of lethal mutations, rescue of a temperature-sensitive marker, and in vitro mutagenesis to generate defined mutants. J Virol 61: 3809-3819). A reação ocorreu à 39°C por 1 hora. A mistura é extraída 2 vezes com fenol-clorofórmio e o ácido nucléico recuperado por precipitação com etanol. 0 precipitado é ressuspenso em água estéril livre de RNase e uma alíquota é retirada para determinação da infeccíosidade específica. EXEMPLO 4 Transfecção do RNA: A transfecção das células CEF ê feita com LipofectAMINE'' (Life Technologies catalogue # 18324- 012). Esse produto é uma formulação lipossômica 3:1 (p/p) de lipídio policatiônico (2,3-dioleiloxi-N- [2(sperminocarboxiamido)etil]-N-N,dimetil-2, 3-bis(9- octadeceniloxi)-1-propanaminium trifluoro acetato) e a etanolamina dioleoilfosfatidil (DOPE) neutra em água filtrada com membrana) a uma concentração de 20 ug/ml em PBS livre-de-RNase. PBS - tampão fosfato salino- é preparado e esterilizado em autoclave a 121°C por 20 minutos. A LipofectAMINE' é pipetada em um tubo de poliestireno de 5 ml contendo PBS. Células primárias CEF são semeadas e usadas 24 horas após a semeadura. A mistura de transcrição é gotejada sobre a monocamada de cultura de células. As células são incubadas por 2 0 minutos à temperatura.ambiente Em seguida, a mistura é removida por aspiração, lavada com PBS e incubada por 72 horas no meio 199. O sobrenadante da cultura constituí o estoque virai após a adição de estabilizador, 0 estoque virai é testado quanto â esterilidade, toxicidade, potência e quanto à presença de agentes adventícios. O estoque virai é o lote semente original. A infecciosidade específica dos transcritos é determinada a partir de ensaios nos quais as diluições seriadas do RNA são tranfectadas em células Vero e estas são recobertas com meio semi-sólido. A coloração com cristal violeta para a contagem de placas e determinação da quantidade de RNA, utilizando a medida de densidade óptica (DO) a 260 nm, permite a determinação da infeccisidade específica dos transcritos {PFU/jig RNA total).
Essa determinação é relevante para estabelecer a multiplicidade de eventos da infecção que leva ao estoque original. Ela assegura um número aceitável de eventos equivalentes à infecção com o vírus vivo de maneira a reduzir a probabilidade de acumulação de mutações no genoma virai dado o elevado número de ciclos de replicação devido ao baixo fornecimento de RNA.
Atualmente, há dois métodos para se conseguir uma eficiente transfecção de células cultivadas com RNA. Um deles utiliza a técnica lipídio-mediada e o outro é a eletroporação. No método lipídio-mediado, LipofectAMINE® ou Lipofectin são normalmente usados. Uma série de experimentos usando o RNA virai extraído de células Vero infectadas com YFiv5.2/DD permitiu não só a comparação da eficiência do Lipofectin e Lipof ectAMINEs? como também a determinação da quantidade de RNA que fornece os maiores rendimentos de transfecção {medidos pelos títulos de infecciosidade específica) em relação à concentração de lipídio usado {concentrações variando de 10 to 40 jj.g/m.1) . LipofectAMINE1" é o reagente usado na presente invenção por apresentar a melhor performance. A quantidade de RNA a ser usada não pode ser muito elevada. Há uma quantidade limite de RNA que pode ser misturada com a correspondente quantidade de lipídio para se alcançar a mais elevada eficiência de transfecção, e, em consequência, a maior infecciosidade específica. Na presente invenção, é usada uma relação de reagentes de 0.5-2 jig de RNA total: 10-40 jlg de Lipof ectAMINE'“ por 1 ml de PBS . EXEMPLO 5 Preparação dos lotes semente: Todos os lotes foram preparados em culturas primárias de células CEF usando ovos derivados de granjas SPF ("Specific Pathogen Free"). Os virus foram recuperados pela transferência do sobrenadante em cada frasco de cultura para frascos de centrifuga seguido de centrifugação a baixa velocidade para remover os restos celulares. 0 sobrenadante foi aspirado para dentro de frascos de 1L contendo estabilizador na proporção de 1:1 e congelamento por rotação em banho de gelo seco contendo etanol após a remoção de todas as alíquotas para o controle de qualidade. Todos os vírus são estocados a -70°C.
Preparação do lote semente original: 0 lote semente original consiste do material proveniente de 3 ensaios separados de transcrição/transfecção realizados em dias diferentes com diferentes bateladas de culturas primárias de células CEF. CEF primárias foram semeadas. Um total de 3 frascos de cultura descartáveis de 175 cm2, contendo RNA in vitro transcrito foram transfectados em células CEF usando LipofectAmine"’. Cada frasco de cultura forneceu um total de 80 ml de sobrenadante de cultura. Nas três transfecções separadas realizadas em dias diferentes e, portanto com diferentes lotes de células CEF, os títulos dos lotes semente originais foram: Tl, 104'66 (4,66 Log10 pfu/ml) ; T2, IO4'"87 (4,87 Log10 pfu/ml) e T3, 105'46 (5,46 Log10 pfu/ml}. Cada lote forneceu um volume total de 480 ml de vírus original. Oitenta ml foram usados no controle de qualidade e os restantes 40 0 ml para a preparação do(s) lote(s) semente primário(s).
Preparação do lote semente primário: Dois lotes semente primários foram preparados e identificados como LP1 and LP2. LP1 deriva do lote semente original T3 enquanto LP2 deriva do T2. Cada um foi testado quanto à esterilidade, potência e presença de agentes adventícios, tendo sido obtidos resultados satisfatórios.
Os volumes e títulos obtidos foram: Lote Semente Volume (ml) Título (Log10 pfu/ml) LPl 1200 6.22 LP2 1600 6.20 pfu = unidade formadora de placa Lotes semente secundários: Três lotes semente secondários foram preparados e identificados como LSI, LS2 e LS3. LSI e LS2 derivam do lote semente primário LPl enquanto que LS3 deriva do LP2. Cada um foi testado quanto à esterilidade, potência e presença de agentes adventícios, tendo sido obtidos resultados satisfatórios.
Os volumes e títulos obtidos foram.- Lote Semente Volume (ml) Título (Log10 pfu/ml) LSI 5.200 6,20 LS2 5.600 6,05 LS3 5.200 6,73 Cada um desses lotes semente é suficiente para a produção de vacina de Febre Amarela, usando a atual metodologia de fabricação (ovos embrionados) ou o sistema celular (células CEF), para cerca de 50 anos a uma taxa de pelo menos 50 milhões de doses/ano.
SEQUENCE LISTING <110> Fundação Oswaldo Cruz <120> CDNA mutante e infeccioso do virus da febre amarela, constructo de DNA, virus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela <130> P1008 <140> PI9701774-4 <141> 1997-04-11 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 10862 <212> DNA
<213> virus de febre amarela vacinai 17D-DD <220>
<221> precursor_RNA <222> (1)..(10862) <400> 1 agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60 acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120 gtctggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct gggcgtcaat atggtacgac gaggagttcg 180 ctccttgtca aacaaaataa aacaaaaaac aaaacaaatt ggaaacagac ctggaccttc 240 aagaggtgtt caaggattta tctttttctt tttgttcaac attttgactg gaaaaaagat 300 cacagcccac ctaaagaggt tgtggaaaat gctggaccca agacaaggct tggctgttct 360 aaggaaagtc aagagagtgg tggccagttt gatgagagga ttgtcctcaa ggaaacgccg 420 ttcccatgat gttctgactg tgcaattcct aattttggga atgctgttga tgacgggtgg 480 agtgaccttg gtgcggaaaa acagatggtt gctcctaaat gtgacatctg aggacctcgg 540 gaaaacattc tctgtgggca caggcaactg cacaacaaac attttggaag ccaagtactg 600 gtgcccagac tcaatggaat acaactgtcc caatctcagt ccaagagagg agccagatga 660 cattgattgc tggtgctatg gggtggaaaa cgttagagtc gcatatggta agtgtgactc 720 agcaggcagg tctaggaggt caagaagggc cattgacttg cctacgcatg aaaaccatgg 780 tttgaagacc cggcaagaaa aatggatgac tggaagaatg 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cccatggctg tctccatgac 7560 aggagtcatg agggggaatc actatgcttt tgtgggagtc atgtacaatc tatggaagat 7620 gaaaactgga cgccggggga gcgcgaatgg aaaaactttg ggtgaagtct ggaagaggga 7680 actgaatctg ttggacaagc gacagtttga gttgtataaa aggaccgaca ttgtggaggt 7740 ggatcgtgat acggcacgca ggcatttggc cgaagggaag gtggacaccg gggtggcggt 7800 ctccaggggg accgcaaagt taaggtggtt ccatgagcgt ggctatgtca agctggaagg 7860 tagggtgatt gacctggggt gtggccgcgg aggctggtgt tactacgctg ctgcgcaaaa 7920 ggaagtgagt ggggtcaaag gatttactct tggaagagac ggccatgaga aacccatgaa 7980 tgtgcaaagt ctgggatgga acatcatcac cttcaaggac aaaactgata tccaccgcct 8040 agaaccagtg aaatgtgaca cccttttgtg tgacattgga gagtcatcat cgtcatcggt 8100 cacagagggg gaaaggaccg tgagagttct tgatactgta gaaaaatggc tggcttgtgg 8160 ggttgacaac ttctgtgtga aggtgttagc tccatacatg ccagatgttc tcgagaaact 8220 ggaattgctc caaaggaggt ttggcggaac agtgatcagg aaccctctct ccaggaattc 8280 cactcatgaa atgtactacg tgtctggagc ccgcagcaat gtcacattta ctgtgaacca 8340 aacatcccgc ctcctgatga ggagaatgag gcgtccaact ggaaaagtga ccctggaggc 8400 tgacgtcatc ctcccaattg ggacacgcag tgttgagaca gacaagggac ccctggacaa 8460 agaggccata gaagaaaggg ttgagaggat aaaatctgag tacatgacct cttggtttta 8520 tgacaatgac aacccctaca ggacctggca ctactgtggc tcctatgtca caaaaacctc 8580 aggaagtgcg gcgagcatgg taaatggtgt tattaaaatt ctgacatatc catgggacag 8640 gatagaggag gtcaccagaa tggcaatgac tgacacaacc ccttttggac agcaaagagt 8700 gtttaaagaa aaagttgaca ccagagcaaa ggatccacca gcgggaacta ggaagatcat 8760 gaaagttgtc aacaggtggc tgttccgcca cctggccaga gaaaagagcc ccagactgtg 8820 cacaaaggaa gaatttattg caaaagtccg aagtcatgca gccattggag cttacctgga 8880 agaacaagaa cagtggaaga ctgccaatga ggctgtccaa gacccaaagt tctgggaact 8940 ggtggatgaa gaaaggaagc tgcaccaaca aggcaggtgt cggacttgtg tgtacaacat 9000 gatggggaaa agagagaaga agctgtcaga gtttgggaaa gcaaagggaa gccgtgccat 9060 atggtatatg tggctgggag cgcggtatct tgagtttgag gccctgggat tcctgaatga 9120 ggaccattgg gcttccaggg aaaactcagg aggaggagtg gaaggcattg gcttacaata 9180 cctaggatat gtgatcagag acctggctgc aatggatggt ggtggattct acgcggatga 9240 caccgctgga tgggacacgc gcatcacaga ggcagacctt gatgatgaac aggagatctt 9300 gaactacatg agcccacatc acaaaaaact ggcacaagca gtgatggaaa tgacatacaa 9360 gaacaaagtg gtgaaagtgt tgagaccagc cccaggaggg aaagcctaca tggatgtcat 9420 aagtcgacga gaccagagag gatccgggca ggtagtgact tatgctctga acaccatcac 9480 caacttgaaa gtccaattga tcagaatggc agaagcagag atggtgatac atcaccaaca 9540 tgttcaagat tgtgatgaat cagttctgac caggctggag gcatggctca ctgagcacgg 9600 atgtaacaga ctgaagagga tggcggtgag tggagacgac tgtgtggtcc ggcccatcga 9660 tgacaggttc ggcctggccc tgtcccatct caacgccatg tccaaggtta gaaaggacat 9720 atctgaatgg cagccatcaa aagggtggaa tgattgggag aatgtgccct tctgttccca 9780 ccacttccat gaactacagc tgaaggatgg caggaggatt gtggtgcctt gccgagaaca 9840 ggacgagctc attgggagag gaagggtgtc tccaggaaac ggctggatga tcaaggaaac 9900 agcttgcctc agcaaagcct atgccaacat gtggtcactg atgtattttc acaaaaggga 9960 catgaggcta ctgtcattgg ctgtttcctc agctgttccc acctcatggg ttccacaagg 10020 acgcacaaca tggtcgattc atgggaaagg ggagtggatg accacggaag acatgcttga 10080 ggtgtggaac agagtatgga taaccaacaa cccacacatg caggacaaga caatggtgaa 10140 aaaatggaga gatgtccctt atctaaccaa gagacaagac aagctgtgcg gatcactgat 10200 tggaatgacc aatagggcca cctgggcctc ccacatccat ttagtcatcc atcgtatccg 10260 aacgctgatt ggacaggaga aatacactga ctacctaaca gtcatggaca ggtattctgt 10320 ggatgctgac ctgcaactgg gtgagcttat ctgaaacacc atctaacagg aataaccggg 10380 atacaaacca cgggtggaga accggactcc ccacaacctg aaaccgggat ataaaccacg 10440 gctggagaac cggactccgc acttaaaatg aaacagaaac cgggataaaa actacggatg 10500 gagaaccgga ctccacacat tgagacagaa gaagttgtca gcccagaacc ccacacgagt 10560 tttgccactg ctaagctgtg aggcagtgca ggctgggaca gccgacctcc aggttgcgaa 10620 aaacctggtt tctgggacct cccaccccag agtaaaaaga acggagcctc cgctaccacc 10680 ctcccacgtg gtggtagaaa gacggggtct agaggttaga gaagaccctc cagggaacaa 10740 atagtgggac catattgacg ccagggaaag accggagtgg ttctctgctt ttcctccaga 10800 ggtctgtgag cacagtttgc tcaagaataa gcagaccttt ggatgacaaa cacaaaacca 10860 ct 10862 Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1 lillIMIllllllllBllilBIim 91DB4255F18D3C6E
Campo 2 ifflittiiiRiHiiwiHiiiniiii 1E72D08F8E06B1EA
Outras Informações: - Nome do Arquivo: SEQIDN01_ST25.txt - Data de Geração do Código: 20-06-2011 - Hora de Geração do Código: 09:09:52 - Código de Controle: - Campo 1: 91DB4255F18D3C6E
- Campo 2: 1E72D08F8E06B1EA
Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList)
Claims (13)
1. cDNA mutante e infeccioso do vírus da Febre Amarela caracterizado por ter a seqüência nucleotídica básica determinada pela SEQ ID N0:1.
2. Constructo de DNA caracterizado por consistir de um vetor e de um segmento de DNA tendo as porções terminais 5' consistindo dos nucleotídeos 1 a 2271 e 3' consistindo dos nucleotídeos 8276 a 10862 do cDNA mutante e infeccioso do virus da Febre Amarela definido na reivindicação 1.
3. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato do dito vetor ser selecionado do grupo consistindo de pBR322, pBR325, BR327, pBR328, pUC7, pUC8, pUC9, pUCl9, fago X, fago M13.
4. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato de ter a estrutura do plasmídeo pYF5'3'IV/G1/2 depositado junto à ATCC 'sob o número de acesso ATCC 97771.
5. Constructo de DNA caracterizado pelo fato de consistir de um vetor e um segmento de DNA tendo a região mediana consistindo dos nucleotídeos 1372 a 8704 do cDNA mutante e infeccioso do vírus da Febre Amarela, conforme definido na reivindicação 1.
6. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato do dito vetor ser selecionado do grupo consistindo de pBR322, pBR325, BR327, pBR328, pUC7, pUC8, püC9, pUCl9, fago Xr fago M.13.
7. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de ter a estrutura do plasmídeo pYFM5.2/T3/27 depositado junto à ATCC sob o número de acesso ATCC 97772.
8. Vírus recombinante da Febre Amarela caracterizado pelo fato de ser regenerado do cDNA mutante e infeccioso do vírus da Febre Amarela,, conforme definido na reivindicação 1.
9. Vírus recombinante da Febre Amarela de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato de ser recuperado de uma cultura de células de fibroblasto de embrião de galinha transfectadas com o cDNA definido na reivindicação 1.
10. Vacina para humanos contra infecções de Febre Amarela caracterizado pelo fato de consistir em um vírus recombinante de Febre Amarela, conforme definido na reivindicação 8.
11. Vacina de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do vírus recombinante da Febre Amarela ser recuperado de uma cultura de células de fibroblastos de embrião de galinha transfectadas com o cDNA conforme definido na reivindicação 1.
12. Vacina de acordo com as reivindicações 10 caracterizado pelo fato de compreender um veículo farmaceuticaiaente aceitável, e estando o vírus recombinante de Febre Amarela presente em uma quantidade suficiente para induzir imunidade contra as ditas infecções.
13. Vacina de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelo fato de compreender um estabilizadorfarmaceuticamente aceitável.
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| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 25/08/2015, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
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| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A RPI 2329 DE 25/08/2015, QUANTO AO PRAZO DE VALIDADE. |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 18A ANUIDADE. |
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| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2343 DE 01-12-2015 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |