ES2287342T3 - Prueba basada en nanoparticulas dopadas. - Google Patents

Abstract

Prueba a base de una transferencia de energía por resonancia (RET), que comprende - un primer grupo de moléculas A, que está marcado con, al menos, un donor de energía (donor), y - al menos un segundo grupo de moléculas B, que está marcado con, al menos, un aceptor de energía (aceptor), - comprendiendo el donor una molécula o partícula, que puede excitarse energéticamente por medio de una fuente externa de radiación y capaz de emitir fluorescencia, - el aceptor abarca una molécula o partícula, que puede excitarse por transferencia de energía a través del donor con extinción parcial o completa de la fluorescencia del donor, y - el donor y/o el aceptor abarcan nanopartículas dopadas inorgánicas luminiscentes (nanopartículas dil) con estructura cristalina con una extensión = 10 nanómetros, que se determinan con un desplazamiento de Stockes o de anti-Stockes después de una excitación energética mediante radiación electromagnética.

Description

Prueba basada en nanopartículas dopadas.

La presente invención se refiere a una prueba biotecnológica a base de una transferencia de energía por resonancia (RET), con la que pueden detectarse moléculas biológicas tales como enzimas, anticuerpos, moléculas enlazantes de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos, polinucleótidos o morfolino.

Las pruebas inmunológicas o la detección de los ácidos nucleicos constituyen los fundamentos para muchas aplicaciones en el diagnóstico clínico, en el control de la producción de productos fabricados por biotecnología así como en la investigación. Un método, que se aplica en este caso, es la transferencia de energía por resonancia (RET) entre colorantes.

El principio de la transferencia de energía por resonancia (RET) está basado en una transferencia de energía, en ausencia de radiación, desde un donor capaz de emitir fluorescencia hasta un aceptor, que se encuentra en su proximidad espacial. Con esta tecnología pueden determinarse distancias en el plano molecular en el intervalo comprendido entre 1 y 8 nm aproximadamente. La energía transferida al aceptor puede provocar, por un lado, la relajación (RET) en ausencia de radiación por medio de una conversión interna y conduce, a continuación, simplemente a la extinción (atenuación) de la fluorescencia del donor. Por otro lado, la energía transferida puede emitirse también mediante la fluorescencia del aceptor. En este caso se habla de transferencia de energía por resonancia con fluorescencia (FRET). Estos fenómenos han sido comprendidos perfectamente desde hace mucho tiempo y se explican, en el caso de una interacción dipolo-dipolo entre donor y aceptor, por medio de la teoría de Förster (véase por ejemplo la publicación de J. R. Lakowicz, "Principles of Fluorescence Spectroscopy", Kluwer Academic Press, New York, 1999, páginas 368-445). Mediante la transferencia de energía se reduce la intensidad de la fluorescencia del donor así como su tiempo de extinción y se aumenta, correspondientemente, la fluorescencia del aceptor o se excita o se sensibiliza solamente entonces. La eficiencia E de la transferencia de energía es muy sensible con respecto a la distancia R comprendida entre el donor y el aceptor y disminuye proporcionalmente a R_{0}^{6}/(R_{0}^{6}+R^{6}). El radio medio de acción de la transferencia de energía, con el que la eficiencia es del 50%, se determina por medio de una constante específica del material, del radio de Förster R_{0}, y se encuentra en una escala de un número reducido de nanómetros (menor que 10 nm). En el caso en que se relaje el estado excitado del aceptor en ausencia de radiación, se producirá exclusivamente una reducción hasta la extinción completa de la fluorescencia del donor. A continuación se utilizará el concepto de (F)RET cuando puedan emplearse, alternativamente, los conceptos de RET o de FRET. Los pares de donor-aceptor aptos para la (F)RET se denominarán como pares (F)RET. A continuación se emplearán los conceptos de fluorescencia y de luminiscencia de manera sinónima.

En los sistemas biológicos se utiliza la (F)RET para demostrar la proximidad espacial mutua entre las biomoléculas marcadas o bien de los grupos de moléculas correspondientes. Este método puede servir para demostrar las interacciones entre proteína-proteína, por ejemplo como demostración de la reacción de antígeno-anticuerpo en las inmunorreacciones, de una interacción entre receptor-ligando, para la demostración de una hibridación del ácido nucleico o del enlace de las proteínas sobre los ácidos nucleicos. La detección propiamente dicha se lleva a cabo con ayuda de una medición de la variación de la intensidad o bien de la variación espectral de la fluorescencia del donor o del aceptor o con ayuda de la medición de una variación del tiempo de extinción de la fluorescencia del donor. En la literatura se ha descrito un gran número de aplicaciones a este respecto, tal como la detección de antígenos específicos en pruebas por inmunofluorescencia (US 3 996 345; US 4 160 016; US 4 174 384; US 4 199 559), la determinación del potencial electrostático en regiones específicas, localizadas en la superficie de las proteínas (Yamamoto et al.; J. Mol. Biol. 241, 1994, páginas 714-731) o el procedimiento del cribado químico ultrarrápido -High-Throughput Screening- (Boisclair et al.; J. of Biomolecular Screening 5, 2000, páginas 319-328).

Con los sistemas (F)RET se determinan, también, las distancias absolutas entre dos moléculas o dentro de una biomolécula. Para ello se introducen dos marcas que interaccionan entre sí, de manera medible, en función de su distancia mutua. Las aplicaciones conocidas de este método son el análisis estructural de proteínas y de ADN (Heyduk et al.; SPIE Vol. 3256, 1998, páginas 218-222), la determinación de las distancias dentro de los polipéptidos (Lakowicz et al.; Biophys. Chem. 36, 1990, páginas 99-115), las proteínas) (K. Cai et al.; J. Biol. Chem. 271 1996, páginas 27311-27320), Polynukleotiden (polinucleótidos) (Hochstrasser et al.; Biophys. Chem. 45, 1992, páginas 133-141 y Ozaki et al.; Nucl. Acids Res. 20, 1992, páginas 5205-5214) u otras macromoléculas, la investigación de membranas y de proteínas membranales y su formación (S. Wang et al.; Biochemistry 27, 1988, páginas 2033-2039), la detección (US 4 996 143; US 5 532 129; US 5 565 332) y la cuantificación de los ácidos nucleicos amplificados por medio de RCP (reacción en cadena de la polimerasa) (US 5 538 848; US 5 723 591) por ejemplo en el diagnóstico in vitro, para el análisis genéticos, en la medicina forense, en el análisis de los artículos comestibles y agrarios o en las pruebas de paternidad. El ADN o el ARN se detecta o bien se cuantifica directamente, es decir sin etapas adicionales de separación.

Una determinación cuantitativa del ácido nucleico por medio de la RCP en tiempo real con sistemas (F)RET es la prueba de la 5'-nucleasa, que se denomina TaqMan® (Applied Biosystems Division de la firma Perkin-Elmer Corp., Foster City, USA) (US 5 538 848; US 5 210 015; Holland et al.; Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 1991, páginas 7276-7280; Lee et al.; Nuleic Acids Res. 21, 1993, páginas 3761-3766). El método de los faros moleculares -Molecular Beacons- (Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology 14, 1996, páginas 303-306; US 5 312 728) está basado en un mecanismos similar.

Los materiales clásicos, comercialmente obtenibles para pares (F)RET eficientes son moléculas de colorantes orgánicos tales como por ejemplo la fluoresceína, la cianina o la rodamina. Un inconveniente general de estos colorantes orgánicos, fluorescentes consiste en que presentan, frecuentemente, una estabilidad frente a la luz incidente, que es insuficiente para muchas aplicaciones. Especialmente, en presencia de oxígeno o de radicales pueden dañarse o destruirse de manera irreversible, en parte, ya al cabo de algunos millones de ciclos de absorción de luz/emisión de luz. Además, las moléculas de los colorantes orgánicos, fluorescentes, pueden actuar también de manera fototóxica sobre el material biológico en el medio ambiente. Por un lado, las bandas anchas de emisión de los colorantes orgánicos, fluorescentes, con sus derivados adicionales tienen un efecto desfavorable para la discriminación simultánea de varios colores, que se denomina "multiplexado -Multiplexing-", en el intervalo de las ondas largas del espectro. Por otro lado, constituye un inconveniente su usualmente bajo desplazamiento de Stokes (Stokes-Shift), es decir la diferencia entre el máximo de excitación y el máximo de emisión de un colorante, así como las relativamente estrechas bandas espectrales de excitación, dentro de las cuales es posible una excitación. De este modo tienen que utilizarse, frecuentemente, varias fuentes de luz y/o sistemas filtradores complicados, lo que limita simultáneamente, además, la discriminación de varios colorantes.

Del mismo modo, pueden emplearse proteínas fluorescentes a modo de pares FRET. El proceso FRET involucrado se denomina, en este caso, también como transferencia de energía por resonancia bioluminiscente (BRET). A éste pertenecen la proteína fluorescente de verde GFP (US 5 491 084) y sus variaciones, que tienen otros máximos de absorción o bien de emisión, tales como por ejemplo la proteína fluorescente de amarillo (YFP) o de turquesa (Cyan) (CFP) (US 5 625 048). En este caso, pueden emplearse las GFP como donor y aceptor o en combinación con otro fluoróforo tal como por ejemplo la fluoresceína o la luciferasa (artículo de recopilación: Pollok and Heim; Trends Cell Biol. 9, 1999, páginas 57-60). Es problemática la reducida elección entre las diversas proteínas GFP, que cumplan los requisitos para un par FRET adecuado (diferencia suficientemente grande entre las longitudes de onda de excitación, solapado suficiente de las longitudes de onda de emisión y de excitación del donor y del aceptor). De este modo, únicamente se han podido utilizar hasta ahora, con éxito, dos combinaciones de GFP como par FRET (artículo de recopilación: Pollok and Heim; Trends Cell Biol. 9, 1999, páginas 57-60). Incluso en combinación con otros colorantes o con proteínas bioluminiscentes constituye un factor limitante el reducido número y la gran diferencia de intensidad de las GFP.

Como una alternativa a los colorantes orgánicos se utilizan, también, quelatos metálicos o bien complejos metálicos para la FRET (véase, por ejemplo, la publicación Selvin; IEEE J. of Selected Topics in Quantum Electronics 2, 1996, páginas 1077-1087).

Los quelatos con lantánidos pueden emplearse tanto como pares (F)RET (Clark et al., Anal. Biochem. 210, 1993, página 1 y siguientes), asó como también solamente como donor, que transfiera la energía a los colorantes orgánicos, fluorescentes (Thomas et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 1978, página 5746 y siguientes; S. G. Jones et al.; Journal of Fluorescence 11, 2001, páginas 13-21) o al extintor (Tanaka et al.; J. Photochem. Photobiol. A 74, 1993, página 15 y siguientes, Matko et al.; Biochemistry 31, 1992, página 703 y siguientes).

Los sistemas o bien las pruebas, que están basadas en la transferencia de energía y en los flúorcromos y rn los quelatos con una larga duración de vida, han sido divulgados en una serie de patentes (WO 8 707 955, EP 242 527, EP 439 036, WO 9201225, US 4 822 733, US 5 279 943, US 5 622 821, US 5 656 433, US 5 998 146, US 6 239 271). Éstos aprovechan la fluorimetría estacionaria en el tiempo (Time Gated Fluoremetry) (TGF) y/o la fluorimetría resuelta en el tiempo (Time Resolved Fluoremetry) (TRF) para detectar un analito.

En este caso, se entenderá por TGF un modo de medición, en el que se lleva a cabo la excitación con una fuente luminosa pulsada (láser, lámpara de flash) y se mide la emisión luminosa dentro de una determinada ventana de tiempo, al cabo de un tiempo definido de respuesta, que se presenta a continuación. El tiempo de respuesta es suficientemente largo para comprobar la fluorescencia de larga vida de los quelatos de los lantánidos con una intensidad suficientemente elevada. La fluorescencia de fondo, de vida corta (en la mayoría de los casos < 1 \mus), provocada por la autofluorescencia intrínseca del material biológico, por las impurezas del disolvente o por los materiales del recipiente circundante, se discrimina desde luego casi por completo mediante el tiempo de respuesta. A diferencia de lo que ocurre con el modo TGF, se mide la florescencia como función del tiempo con longitudes de onda fijas, cuando la medición se realice según el modo TRF. En este caso se excita el donor también por medio de una fuente de luz pulsada o bien por medio de una fuente de luz modulada de otro modo.

El inconveniente de los quelatos de los lantánidos o de los complejos metálicos consiste, sin embargo, en su baja estabilidad química para algunas aplicaciones o en que las propiedades de fluorescencia dependen del medio químico circundante a las partículas. Frecuentemente se requieren también etapas adicionales de separación o una formación adicional de complejos, para poder medir la fluorescencia.

Del mismo modo se han observado efectos FRET en el caso de los sistemas marcadores particulares, que están basados en nanocristales semiconductores, que se denominan puntos cuánticos -Quantum Dots-: (Bawendi et al. y C. Kagan et al.; Phys. Rev. Lett. 76, 1996, páginas 1517-1520). Los puntos cuánticos pueden entrar también en interacción con fluoróforos orgánicos (O. Schmelz et al.; Langmuir 17, 2001, páginas 2861-2865).

Pueden aprovecharse los efectos FRET entre los puntos cuánticos entre sí o incluso entre los puntos cuánticos y otras substancias (por ejemplo colorantes). En la publicación WO 00/29617 se divulga que las proteínas y los ácidos nucleicos pueden detectarse con ayuda de puntos cuánticos como marcadores. Especialmente se divulga también su empleo como fluoróforos en las estructuras de ADN con forma de horquilla para el cabello, conocidas como "faros moleculares -Molecular Beacon-".

La publicación US B1 6207392 divulga el empleo en las pruebas con FRET de puntos cuánticos, es decir de nanopartículas semiconductoras, sin dopaje. En la presente invención se reivindican nanopartículas dopadas de manera inorgánica luminiscentes (nanopartículas dil).

El inconveniente de los puntos cuánticos consiste, sin embargo, en que tienen que fabricarse con la máxima precisión. Puesto que las longitudes de onda de emisión de la luz fluorescente dependen del tamaño de los puntos cuánticos, tiene que alcanzarse en una muestra una distribución muy estrecha del tamaño de las partículas. Para garantizar la anchura de banda suficientemente estrecha de la luz fluorescente para el multiplexado -multiplexing-, las diferencias de tamaño entre los puntos cuánticos de un tipo solamente pueden abarcar un pequeño número de Angströms, es decir sólo un número pequeño de monocapas. Esto plantea elevadas exigencias a la síntesis. Además, los puntos cuánticos presentan, normalmente, en función del par electrón-agujero en ausencia de radiación, recombinaciones sobre su superficie con relación a eficiencias cuánticas bajas. Por este motivo deben generarse estructuras de tipo núcleo-envoltura para aumentar las eficiencias cuánticas (Xiaogang Peng et al.; J. Am. Chem. Soc. 119, 1997, páginas 7019-7029), para las cuales se requiere una síntesis complicada.

El tiempo de extinción de la fluorescencia en los puntos cuánticos es, además, de vida muy corta y se encuentra en la región inferior de los nanosegundos. Por lo tanto no son posibles mediciones en el modo TGF y únicamente son posibles mediciones en el modo TRF con un gran coste técnico y de instalación. Otro inconveniente del sistema del punto cuántico consiste en su composición, que muchas veces contiene elementos tóxicos tales como, por ejemplo, cadmio, selenio o arsénico.

Los fosforescentes a nanoescala con un tamaño menor que 50 nm, que se denominan a continuación como nanopartículas dopadas de manera inorgánica, luminiscentes (nanopartículas dil), han sido descritos en muchas ocasiones en las publicaciones científicas.

Las nanopartículas dil publicadas están constituidas por óxidos, sulfuros, fosfatos o vanadatos, que están dopados con lantánidos o bien con Mn, con Al, con Ag o con Cu. Estas nanopartículas dil son fluorescentes debido a su dopaje en un intervalo espectral estrecho. La obtención de las nanopartículas dil siguientes ha sido dada a conocer, entre otras publicaciones en: LaPO_{4}:Ce,Tb; (K. Riwotzki et al.; Angewandte Chemie, Int. Ed. 40, 2001, páginas 573-576); YVO_{4}:Eu, YVO_{4}:Sm, YVO_{4}:Dy (K. Riwotzki, M. Haase; Journal of Physical Chemistry B; Vol. 102, 1998, páginas 10129-10135); LaPO_{4}:Eu, LaPO_{4}:Ce, LaPO_{4}:Ce,Tb; (H. Meyssamy, K. Riwotzki, A. Kornowski, S. Naused, M. Haase; Advanced Materials, Vol. 11, Issue 10, 1999, páginas 840-844); (K. Riwotzki, H. Meyssamy, A. Kornowski, M. Haase; Journal of Physical Chemistry B Vol. 104, 2000, páginas 2824-2828); ZnS:Tb, ZnS:TbF_{3}, ZnS:Eu, ZnS:EuF_{3}, (M. Ihara, T. Igarashi, T. Kusunoki, K. Ohno; Society for Information Display, Proceedings 1999, Session 49.3); Y_{2}O_{3}:Eu (Q. Li, L. Gao, D. S. Yan; Nanostructured Materials Vol. 8, 1999, página 825 y siguientes); Y_{2}SiO_{5}:Eu (M. Yin, W. Zhang, S. Xia, J. C. Krupa; Journal of Luminescence, Vol. 68, 1996, página 335 y siguientes); SiO_{2}:Dy, SiO_{2}:Al, (Y. H. Li, C. M. Mo, L. D. Zhang, R. C. Liu, Y. S. Liu; Nanostructured Materials Vol. 11, Issue 3, 1999, páginas 307-310); Y_{2}O_{3}:Tb (Y. L. Soo, S. W. Huang, Z. H. Ming, Y. H. Kao, G. C. Smith, E. Goldburt, R. Hodel, B. Kulkarni, J. V. D. Veliadis, R. N. Bhargava; Journal of Applied Physics Vol. 83, Issue 10, 1998, páginas 5404-5409); CdS:Mn (R. N. Bhargava, D. Gallagher, X. Hong, A. Nurmikko; Physical Review Letters Vol. 72, 1994, páginas 416-419); ZnS:Tb (R. N. Bhargava, D. Gallagher, T. Welker; Journal of Luminescence, Vol. 60, 1994, página 275 y siguientes). Una recopilación de los materiales luminiscentes conocidos, dopados de manera orgánica, que tienen un tamaño de algunos micrómetros y su empleo como fosforescentes industriales está dada en la publicación Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH, 6th edition, 2001 Electronic Release, capítulo "Luminescent Materials: 1. Inorganic Phosphors".

En muchos casos, una (F)RET entre el donor (sensibilizador) y un aceptor (emisor) es responsable de la emisión luminosa, que se provoca en los fosforescentes luminosos, como los que se utilizan, por ejemplo, para las lámparas con material fluorescente (D. Dexter; J. Chem. Phys. 21, 1953, páginas 836-850, T. Jüstel et al.; Angewandte Chemie, International Edition 37, 1998, páginas: 3084-3103). Puesto que, sin embargo, pueden estar presente en un fluorescente luminoso un donor y un aceptor en una red cristalina común, el sistema (F)RET de los fosforescentes luminosos no puede servir como demostración de una variación parametral debida a un proceso bioquímico.

En la publicación US 5 043 265 se divulga que pueden detectarse macromoléculas biológicas, que están copuladas con partículas fosforescentes luminosas a nanoescala, con ayuda de la medición de la fluorescencia. Se ha indicado que las fluorescencia de las partículas pierde intensidad rápidamente a medida que disminuye el diámetro y que, por lo tanto, las partículas deben tener un tamaño mayor que 20 nm y, preferentemente, incluso mayor que 100 nm.

En la publicación US 5,674,698 se divulgan tipos especiales de fosforescentes luminosos para su empleo como marcadores biológicos. En este caso se trata de "fosforescentes convertidores ascendentes" (upconverting phosphors), que tienen la propiedad de emitir luz por medio de un proceso con dos fotones, que tiene una longitud de onda menor que la luz absorbida. Mediante el empleo de estas partículas puede trabajarse casi en ausencia de fondo puesto que tales autofluorescencias quedan ampliamente reprimidas. Las partículas se fabrican por molienda y subsiguiente recocido. El tamaño de las partículas se encuentra comprendido entre 10 nm y 3 \mum, preferentemente entre 300 nm y 1 \mum. Estas partículas se emplean, en primer lugar, en inmunopruebas (véase por ejemplo la publicación de Niedbala et al.; Analytical Biochemistry 293, 2001, páginas 22-30). El inconveniente de estas partículas reside, por un lado, en la amplia distribución del tamaño, condicionada por el procedimiento de fabricación. Por otro lado, en el caso de las partículas más pequeñas se presentan, frecuentemente, limitaciones cualitativas, provocadas por la fabricación, que se reflejan en el tamaño preferente de las partículas entre 300 nm y 1 \mum. En general, se requiere para la excitación de un proceso con dos fotones, con una intensidad de emisión comparable, una mayor intensidad de excitación que en el caso del proceso con un fotón.

La publicación WO A 98/43072 divulga una prueba (F)RET, en la que los donores están dopados con fosforescentes, que emiten con un desplazamiento anti-Stokes (=up-converting), y que presentan una estructura amorfa o cristalina así como un tamaño desde 10 hasta 100 nm. Se ha descrito únicamente una mezcla de iones de iterbio y de erbio en una matriz amorfa. Sorprendentemente, las nanopartículas cristalinas emiten una fluorescencia claramente mejor que las amorfas. La presente invención se refiere, por lo tanto, a nanopartículas cristalinas.

La publicación US A 5 893 999 divulga partículas con tamaños comprendidos entre 1 nm y 1 \mum, preferentemente entre 1 nm y 100 nm para el empleo como biomarcadores pero, sin embargo, no se refiere a las pruebas con (F)RET.

La publicación US A 6 159 686 divulga fosforescentes como marcadores en pruebas con FRET, que son cristalinos y cuyo tamaño es < 2 \mum, preferentemente < 1 \mum, de forma especialmente preferente comprendido entre 0,1 y 0,3 \mum o que se encuentra por debajo de estos valores. Las partículas de este tamaño tienen tendencia a una elevada sedimentación y presentan una baja velocidad de difusión, lo cual es un inconveniente considerable para las pruebas.

En la publicación US 6 159 686 se han divulgado complejos especiales de fosforescentes-colorantes para la realización de catálisis fotofísica o de la terapia fotodinámica. Los fosforescentes convertidores ascendentes se excitan en primer lugar con luz infrarroja inocua. La energía en el intervalo de la luz visible se transfiere entonces hasta el colorante que, actuando como catalizador, transfiere su energía, a su vez, hasta la molécula diana. Con tales pares constituidos por fosforescentes convertidores ascendentes y por colorantes adecuados, pueden detectarse también analitos diana. Para ello se forma un complejo constituido por el analito diana, el fosforescente y el colorante, en presencia del analito diana, que permite, entonces, una transferencia de energía desde el fosforescente hasta el colorante, debido a la proximidad espacial. Del mismo modo, se ha divulgado en esta patente el empleo de un fosforescente convertidor ascendente con un "marcador adaptado -matched label-" correspondiente en pruebas homogéneas, heterogéneas y competitivas. En este caso, pueden emplearse los fosforescentes tanto como donores así como también como aceptores.

La tarea de la invención consiste en proporcionar una prueba para detectar una molécula diana biológica, que no presente los inconvenientes descritos en el estado de la técnica.

La tarea se resuelve, según la invención, por medio de una prueba basada en la transferencia de energía por resonancia (RET) o basada en la transferencia de energía por resonancia con fluorescencia (FRET), que contiene un primer grupo de moléculas A, que está marcado con, al menos, un donor de energía según la invención y que contiene, al menos, un segundo grupo de moléculas B, que está marcado, respectivamente, con al menos un aceptor de energía.

En el sentido de la invención se entenderá por donor, una molécula o partícula, que se excite energéticamente de manera continua o modulada en el tiempo, por medio de una fuente externa de radiación (radiación electromagnética o radiación en forma de partículas) y que sea capaz de emitir fluorescencia.

En el sentido de la invención se entenderá por aceptor, una molécula o partícula, que se excite por medio de la transferencia de energía a través del donor, que extinga total o parcialmente la fluorescencia del donor y que sea capaz de emitir fluorescencia por si misma, pero sin que esto sea obligatorio. Un donor capaz de emitir fluorescencia se relaja en ausencia de radiación.

El donor y/o el aceptor abarcan nanopartículas dil según la invención con una extensión \leq 10 nanómetros, que emiten rradiación electromagnética con un desplazamiento de Stokes o de anti-Stokes tras una excitación energética.

La ventaja de una prueba basada en nanopartículas dil con una extensión de 10 nanómetros o por debajo de este valor, consiste en que éstas presentan un potencial relativo a los problemas estéricos o a la sedimentación indeseada en una prueba menor que lo que puede suceder en el caso de partículas de mayor tamaño. Además, la cinética de una reacción de enlace (por ejemplo inmunorreacción o hibridación del ADN) o de un proceso bioquímico a ser ensayado, está menos influenciada por la presencia de las nanopartículas dil.

Además, las partículas dil de mayor tamaño presentan inconvenientes a la hora de realizar mediciones según el modo TRF. En el caso de una (F)RET es posible la transferencia de energía únicamente dentro de una distancia que alcanza un pequeño número de nanómetros, por ejemplo desde una partícula dil, que actúe como donor, hasta una molécula, que se encuentre en la proximidad espacial, y que actúe como aceptor. Esto significa, que en el caso de partículas de mayor tamaño, no se encuentra en el radio de acción del aceptor, que se encuentra delante de la superficie de las partículas, una parte significativa del volumen de las partículas y, por lo tanto, está fuera del alcance de los iones para el dopaje en las partículas y, por lo tanto, no participan en la (F)RET. De este modo está menos marcado el efecto de una variación del tiempo de atenuación (modo TRF), provocada por una (F)RET o, bajo ciertas circunstancias, ya no puede ser medida. Por los mismos motivos tampoco sería ya posible una atenuación completa o al menos significativa de la fluorescencia del donor debida al aceptor.

Una RET o una FRET puede llevarse a cabo por medio de una interacción dipolo-dipolo (transferencia de Förster), por medio de una interacción con participación de multipolos superiores o por medio de una migración de las cargas o de los excitones. En el caso de una transferencia de Förster tiene que ser suficientemente grande el solapado espectral entre la emisión del donor y la absorción del aceptor. Puesto que la eficiencia de la transferencia de energía depende de la distancia, puede medirse, de este modo, la distancia comprendida entre el donor y el aceptor.

Preferentemente, al menos uno de ambos participantes (donor o aceptor) es una nanopartícula dopada de manera inorgánica, luminiscente, con un tiempo de extinción prolongado de la fluorescencia (> 5 ns). El otro participante, correspondiente, contiene o bien un cromóforo orgánico, molecular o bien una nanopartícula dopada de manera inorgánica, luminiscente, que presente, preferentemente, un tiempo de extinción de la fluorescencia más corto. La nanopartícula dil con el tiempo de extinción de la fluorescencia prolongado presenta, en este caso, un tiempo de semivida mayor que 5 ns, preferentemente comprendido entre 1 \mus y 50 ms y, de forma especialmente preferente, comprendido entre 100 \mus y 10 ms. En una prueba de esta forma de realización puede excitarse el donor con una fuente de luz pulsada con una longitud de onda adecuada. En el caso de una proximidad espacial mutua, correspondiente, del par donor-aceptor (pequeño número de nanómetros) podrá tener lugar ahora una FRET, es decir que el aceptor, por ejemplo un cromóforo molecular, queda sensibilizado y podrá suministrar su energía por emisión de luz. Puesto que el tiempo de extinción, por ejemplo de la fluorescencia del donor es muy largo, es muy largo también el tiempo de extinción de la fluorescencia sensibilizada del aceptor debido a la FRET y, por lo tanto, es mucho más largo que en el caso de una excitación directa del aceptor por medio de la fuente de luz pulsada. Con una medición de la fluorescencia en el modo TFG puede detectarse, por lo tanto casi en ausencia de fondo, debido al apantallado de la fluorescencia del aceptor de vida corta y, por lo tanto, puede detectarse con elevada sensibilidad la fluorescencia del aceptor sensibilizado. Cuando se utiliza una fuente de luz modulada, con una frecuencia adecuada, podrán llevarse a cabo también mediciones sensibles a las fases. También el donor puede presentar una fluorescencia de vida corta y el aceptor puede presentar una fluorescencia de vida larga, como puede observarse, por ejemplo, en el sistema de nanopartículas dopadas con LaPO_{4}. En este caso actúan como donor aquellas partículas que están dopadas con iones de cerio y como aceptor actúan aquellas partículas que están dopadas con iones terbio.

En otra forma de realización, el donor está constituido por una nanopartícula dil y el aceptor está constituido por un material conductor. Tales materiales pueden ser metales tales como, por ejemplo, el oro (Au), la plata (Ag), el platino (Pt) u óxidos conductores tales como, por ejemplo, el óxido de indio y de estaño (ITO) o polímeros conductores. En este caso pueden presentarse en forma de partículas en estado de nanopartículas o de micropartículas o pueden estar constituidos por una superficie, que también puede estar estructurada.

Las nanopartículas dil, empleadas en la prueba según la invención, están dopadas con iones foráneos de tal manera, que puede excitarse el donor por medio de radiación electromagnética de banda estrecha o de banda ancha, pulsada, modulada o continua, con longitudes de onda en el intervalo de la luz infrarroja, de la luz visible, de los UV, de la luz de rayos X o de la radiación \gamma o de la radiación en forma de partículas como la radiación de electrones o mediante haces de partículas y el aceptor puede detectarse de manera cualitativa y/o cuantitativa con ayuda de la medición temporal o continua de la luz fluorescente específica del material o bien su variación.

La detección de la reacción bioquímica se lleva a cabo con ayuda de la medición de una RET o de una FRET, es decir con ayuda de la medición de la variación de las propiedades luminiscentes (intensidad, espectral o por variación del tiempo de extinción) de las nanopartículas dil y/o de otros cromóforos participantes. De este modo pueden detectarse las variaciones de la distancia entre los participantes intervinientes (F)RET en una prueba.

Mediante la variación del tiempo de extinción del donor puede detectarse la proximidad espacial de un aceptor en un sistema (F)RET. Debido a la presencia de otro canal de extinción, como consecuencia de la transferencia de energía hasta el aceptor, se reduce significativamente el tiempo de extinción de la fluorescencia del donor. Esta variación puede medirse tanto en el caso de la fluorescencia del donor así como también en el caso de la fluorescencia del aceptor sensibilizado (medición en el modo TRF). El tiempo de extinción de la emisión como magnitud observada para la FRET ofrece una alternativa a la medición de las intensidades. Éste constituye una medición independiente de los efectos de la concentración, de la eficiencia cuántica del cromóforo, del marcado incompleto y de la extinción parcial o completa de la fluorescencia del aceptor. Prácticamente cada fotón detectado constituye una contribución a la señal útil. Por la disminución del tiempo de extinción de la fluorescencia del donor puede deducirse la distancia espacial entre el donor y el aceptor en el caso de una transferencia de Förster con empleo de las ecuaciones matemáticas conocidas a este respecto. Una ventaja importante del empleo de las nanopartículas dil consiste en su prolongado tiempo de extinción intrínseco, que, frecuentemente, llega hasta la escala de algunos milisegundos y, por lo tanto, puede detectarse cómodamente con sencillos agentes experimentales.

Las nanopartículas dil tienen una morfología casi esférica con dimensiones en el intervalo desde 1 nm hasta 10 nm y, preferentemente, en el intervalo desde 2 nm hasta 10 nm. Se entenderá por dimensiones, la distancia máxima entre dos puntos situados sobre la superficie de una nanopartícula dil. Las nanopartículas dil pueden tener también una morfología elipsoide o pueden estar talladas con dimensiones que se encuentran en los límites superiores
indicados.

El tamaño de las partículas puede determinarse con ayuda de métodos de ultracentrifugación, mediante la cromatografía de permeación de gel o por medio de microscopia electrónica.

En el sentido de la invención, los materiales adecuados para las nanopartículas dil son nanocristales inorgánicos, cuyas redes cristalinas (material huésped) estén dopadas con iones foráneos. A éstos pertenecen, especialmente, todos los materiales y clases de materiales que encuentren aplicación como los denominados fosforescentes, por ejemplo en pantallas luminiscentes (por ejemplo para tubos de haces de electrones) o como material de revestimiento en lámparas de fluorescencia (para lámparas de descarga de gases), como los que se han citado por ejemplo en la publicación Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH, 6th edition, 2001 Electronic Release, capítulo "Luminescent Materials: 1. Inorganic Phosphors", así como las nanopartículas dil conocidas por el estado de la técnica anteriormente citado. En estos materiales sirven como activadores los iones foráneos para la emisión de luz fluorescente tras la excitación por medio de luz UV, de luz visible o de luz IR, de rradiaciones de rayos X o de radiaciones gamma o por medio de radiación de electrones. En algunos materiales se incorporan también varias especies de iones foráneos en la red huésped para, por un lado, generar activadores para la emisión y, por otro lado, para configurar de una manera más eficiente la excitación del sistema de partículas o para adaptar las longitudes de onda de absorción, por desplazamiento, a las longitudes de onda de una fuente dada de luz de excitación (denominada sensibilizador). La incorporación de varias especies de iones foráneos puede servir también para establecer específicamente una determinada combinación de bandas de fluorescencia, que deban emitirse por una partícula.

El material huésped de las partículas dil está constituido, preferentemente, por compuestos del tipo XY. En este caso X significa un catión de los elementos de los grupos 1a, 2a, 3a, 4a principales, de los grupos 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 7b secundarios o de los lantánidos del Sistema Periódico. En algunos casos X puede ser también una combinación o bien una mezcla de los elementos citados. Y puede ser un anión poliatómico, que contenga uno o varios de los elementos de los grupos 3a, 4a, 5a principales, de los grupos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y/o 8b secundarios así como elementos de los grupos 6a y/o 7a principales. Sin embargo, Y puede ser también un anión monoatómico de los grupos 5a, 6a o 7a principales del Sistema Periódico. El material huésped de las nanopartículas dil puede estar constituido también por un elemento del grupo 4a principal del Sistema Periódico. Como dopaje pueden servir los elementos de los grupos 1a, 2a principales o de los grupos que contienen Al, Cr, Tl, Mn, Ag, Cu, As, Nb, Nd, Ni, Ti, In, Sb, Ga, Si, Pb, Bi, Zn, Co y/o elementos de los lantánidos. También pueden servir como material para el dopaje combinaciones de dos o de varios de estos elementos en concentraciones relativas variables entre sí. La concentración del material para el dopaje en la red huésped está comprendida entre 10^{-5}% en moles y 50% en moles, preferentemente entre 0,01% en moles y 30% en moles, de forma especialmente preferente entre 0,1% en moles y 20% en moles. El material para el dopaje se elegirá de tal manera, que sea largo el tiempo de extinción de la fluorescencia inducida por el mismo (> 100 ns).

Preferentemente, se emplearán como materiales huésped para las nanopartículas dil los sulfuros, los seleniuros, los sulfoseleniuros, los oxisulfuros, los boratos, los aluminatos, los galatos, los silicatos, los germanatos, los fosfatos, los halógenofosfatos, los óxidos, los arseniatos, los vanadatos, los niobiatos, los tantalatos, los sulfatos, los volframatos, los molibdatos, los halogenuros alcalinos así como otros halogenuros o nitruros. Ejemplos de estas clases de materiales se han indicado, junto con los dopajes correspondientes, en la lista siguiente (materiales del tipo B:A con B = material huésped y A = material para el dopaje):

LiI:Eu; NaI:Tl; CsI:Tl; CsI:Na; LiF:Mg; LiF:Mg,Ti; LiF:Mg,Na; KMgF_{3}:Mn; Al_{2}O_{3}:Eu; BaFCl:Eu; BaFCl:Sm; BaFBr:Eu; BaFCl_{0,5}Br_{0,5}:Sm; BaY_{2}F_{8}:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); BaSi_{2}O_{5}:Pb; BaMg_{2}Al_{16}O_{27}:Eu; BaMgAl_{14}O_{23}:Eu; BaMgAl_{10}O_{17}:Eu; BaMgAl_{2}O_{3}:Eu; Ba_{2}P_{2}O_{7}:Ti; (Ba,Zn,Mg)_{3}Si_{2}O_{7}:Pb; Ce(Mg,Ba)Al_{11}O_{19}; Ce_{0,65}Tb_{0,35}MgAl_{11}O_{19}:
Ce,Tb; MgAl_{11}O_{19}:Ce,Tb; MgF_{2}:Mn; MgS:Eu; MgS:Ce; MgS:Sm; MgS:(Sm,Ce); (Mg,Ca)S:Eu; MgSiO_{3}:Mn;
3,5MgO\cdot0,5MgF_{2}\cdotGeO_{2}:Mn; MgWO_{4}:Sm; MgWO_{4}:Pb; 6MgO\cdotAs_{2}O_{5}:Mn; (Zn,Mg)F_{2}:Mn; (Zn_{4}Be)SO_{4}:Mn; Zn_{2}
SiO_{4}:Mn; Zn_{2}SiO_{4}:Mn,As; ZnO:Zn; ZnO:Zn,Si,Ga; Zn_{3}(PO_{4})_{2}:Mn; ZnS:A (A = Ag, Al, Cu); (Zn,Cd)S:A (A = Cu, Al, Ag, Ni); CdBO_{4}:Mn; CaF_{2}:Mn; CaF_{2}:Dy; CaS:A (A = lantánidos, Bi); (Ca,Sr)S:Bi; CaWO_{4}:Pb; CaWO_{4}:Sm; CaSO_{4}:A (A = Mn, lantánidos); 3Ca_{3}(PO_{4})_{2}\cdotCa(F,Cl)_{2}:Sb,M_{n}; CaSiO_{3}:Mn,Pb; Ca_{2}Al_{2}Si_{2}O_{7}:Ce; (Ca,Mg)SiO_{3}:Ce; (Ca,Mg)SiO_{3}:Ti; 2SrO\cdot6(B_{2}O_{3})\cdotSrF_{2}:Eu; 3Sr_{3}(PO_{4})_{2}\cdotCaCl_{2}:Eu; A_{3}(PO_{4})_{2}\cdotACl_{2}:Eu (A = Sr, Ca, Ba); (Sr,Mg)_{2}P_{2}O_{7}:Eu; (Sr,Mg)_{3}(PO_{4})_{2}:Sn; SrS:Ce; SrS:Sm,Ce; SrS:Sm; SrS:Eu; SrS:Eu,Sm; SrS:Cu,Ag; Sr_{2}P_{2}O_{7}:Sn; Sr_{2}P_{2}O_{7}:Eu; Sr_{4}Al_{14}
O_{25}:Eu; SrGa_{2}S_{4}:A (A = lantánidos, Pb); SrGa_{2}S_{4}:Pb; Sr_{3}Gd_{2}Si_{6}O_{18}:Pb,Mn; YF_{3}:Yb,Er; YF_{3}:Ln (Ln = lantánidos); YLiF_{4}:Ln (Ln = lantánidos); Y_{3}Al_{5}O_{12}:Ln (Ln = lantánidos); YAl_{3}(BO_{4})_{3}:Nd,Yb; (Y,Ga)BO_{3}:Eu; (Y,Gd)BO_{3}:Eu; Y_{2}Al_{3}Ga_{2}O_{12}:Tb; Y_{2}SiO_{5}:Ln (Ln = lantánidos); Y_{2}O_{3}:Ln (Ln = lantánidos); Y_{2}O_{2}S:Ln (Ln = lantánidos); YVO_{4}:A (A = lantánidos, In); Y(P,V)O_{4}:Eu; YTaO_{4}:Nb; YAlO_{3}:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); YOCl:Yb,Er; LnlPO_{4}:Ln2 (Lnl, Ln2 = lantánidos o mezclas de lantánidos); A_{x}(PO_{4})_{y}:Ln (A = alcalinotérreo, Ln = lantánidos) LuVO_{4}:Eu; GdVO_{4}:Eu; Gd_{2}O_{2}S:Tb; GdMgB_{5}O_{10}:Ce,Tb; LaOBr:Tb; La_{2}O_{2}S:Tb; LaF_{3}:Nd,Ce; BaYb_{2}F_{8}:Eu; NaYF_{4}:Yb,Er; NaGdF_{4}:Yb,Er; NaLaF_{4}:Yb,Er; LaF_{3}:Yb,Er,Tm; BaYF_{5}:Yb,Er; Ga_{2}O_{3}:Dy; GaN:A (A = Pr, Eu, Er, Tm); Bi_{4}Ge_{3}O_{12}; LiNbO_{3}:Nd,Yb; LiNbO_{3}:Er; LiCaAlF_{6}:Ce; LiSrAlF_{6}:Ce; LiLuF_{4}:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); Li_{2}B_{4}O_{7}:Mn, SiO_{x}:Er,Al (0 \leq x \leq 2).

De forma especialmente preferente, se emplearán como nanopartículas dil los materiales siguientes: YVO_{4}:Eu, YVO_{4}:Sm, YVO_{4}:Dy, LaPO_{4}:Eu, LaPO_{4}:Ce, LaPO_{4}:Tb, LaPO_{4}:Ce,Tb, LaPO_{4}:Ce,Sm, LaPO_{4}:Ce,Dy, LaPO_{4}:Ce,Nd, ZnS:Tb, ZnS:TbF_{3}, ZnS:Eu, ZnS:EuF_{3}, Y_{2}O_{3}:Eu, Y_{2}O_{2}S:Eu, Y_{2}SiO_{5}:Eu, SiO_{2}:Dy, SiO_{2}:Al, Y_{2}O_{3}:Tb, CdS:Mn,
ZnS:Tb, ZnS:Ag, ZnS:Cu. Entre los materiales especialmente preferentes se elegirán, especialmente, aquellos que tengan una estructura de red cúbica de la red huésped, puesto se minimiza que en estos materiales el número de las bandas de fluorescencia individuales. Ejemplos a este respecto son MgF_{2}:Mn; ZnS:Mn, ZnS:Ag, ZnS:Cu, CaSiO_{3}:Ln, CaS:Ln, CaO:Ln, ZnS:Ln, Y_{2}O_{3}:Ln, o MgF_{2}:Ln (Ln = lantánidos).

La superficie de las nanopartículas dil, empleadas según la invención, está preparada de tal manera, que puedan acoplarse moléculas de afinidad sobre esta superficie preparada. La molécula de afinidad entra en interacción con las moléculas diana en la prueba según la invención. Ejemplos de moléculas de afinidad son, por ejemplo, las proteínas, los péptidos, los oligonucleótidos u otras moléculas de ácidos nucleicos o moléculas similares a los ácidos nucleicos, tales como las PNAs o los morfolinos, los oligosacáridos o los polisacáridos, los haptenos, tales como la biotina o la digoxina o los antígenos o los epitopos de bajo peso molecular, sintéticos o naturales.

La preparación de la superficie de las nanopartículas dil puede consistir en la modificación química de la superficie de las nanopartículas dil y/o en que ésta presente grupos reactivos y/o moléculas de conexión unidas de manera covalente o de manera no covalente. También, las moléculas de conexión, enlazadas sobre la superficie de las nanopartículas dil, pueden presentar grupos reactivos.

Tales grupos reactivos, que pueden estar cargados, no cargados o que pueden estar provistos de cargas parciales, pueden estar tanto sobre la superficie de las nanopartículas dil como también pueden ser parte de las moléculas de conexión. Los posibles grupos funcionales reactivos pueden ser grupos amino, grupos de ácidos carboxílicos, tioles, tioéteres, disulfuros, imidazoles, guanidinas, grupos hidroxilo, indoles, dioles vecinales, aldehídos, grupos de alfa-halogenoacetilo, N-maleimidas, organilos de mercurio, halogenuros de arilo, anhídridos de ácidos, isocianatos, isotiocianatos, halogenuros de ácidos sulfónicos, imidoésteres, diazoacetatos, sales de diazonio, 1,2-dicetonas, compuestos de carbonilo alfa-beta-insaturados, ácidos fosfónicos, ésteres del ácido fosfórico, ácidos sulfónicos, azoluros o derivados de los grupos citados.

Como ejemplos de las moléculas de conexión pueden citarse en este caso los derivados del ácido fosfónico, el etilenglicol, los alcoholes primarios, los derivados de amina, los polímeros o los copolímeros, los agentes de copulación polimerizables, las envolturas de sílice y las moléculas en forma de cadena con una polaridad de sentido contrario a la de la superficie de las nanopartículas dil.

También pueden servir como moléculas de conexión las moléculas de ácido nucleico. Éstas forman el enlace con la molécula de afinidad que, por su parte, contiene moléculas de ácido nucleico con la secuencia complementaria de las moléculas de conexión.

El enlace de una molécula de afinidad sobre la molécula de conexión puede llevarse a cabo de manera covalente o de manera no covalente con métodos usuales de la química orgánica tales como la oxidación, la halogenación, la alquilación, la acilación, la adición, la substitución o la amidación del material adsorbido o adsorbible. Estos métodos para el enlace de una molécula de afinidad sobre la molécula de conexión enlazada de manera covalente o no covalente, pueden aplicarse como paso previo a la adsorción de la molécula de conexión sobre la nanopartícula dil o una vez que ya esté adsorbida sobre la nanopartícula dil. Sobre las nanopartículas dil, tratadas de manera correspondiente (por ejemplo con bromuro de trimetilsililo), que tienen una superficie modificada (por ejemplo polar, cargada con mayor intensidad) debido al tratamiento, pueden enlazarse también directamente moléculas de afinidad mediante incubación.

Los grupos de moléculas A y B, que están marcados con el donor o bien con el aceptor, pueden ser parte integrante de una misma molécula y pueden estar acoplados, por ejemplo, con la misma molécula de afinidad. Una variación de la distancia espacial entre ambos grupos de moléculas puede provocarse por medio de una variación de la conformación o por medio de un corte de la molécula. Esta variación de la conformación o este corte de la molécula puede ser el resultado de una interacción de la molécula de afinidad común con una molécula diana.

Del mismo modo, los grupos de moléculas A y B pueden encontrarse sobre moléculas diferentes, estando acoplados los grupos de moléculas A y B respectivamente con moléculas de afinidad propias.

Una variación espacial de la distancia puede provocarse por medio de una interacción de la molécula de afinidad, asociada con los grupos de moléculas A y B, con una molécula diana común o entre sí. Una interacción de este tipo puede comprender, por ejemplo, una interacción entre proteínas, por ejemplo una inmunorreacción de antígenos y de anticuerpos, una hibridación de ácidos nucleicos o la interacción entre ácidos nucleicos y proteínas.

La prueba según la invención puede ser, por ejemplo, una inmunoprueba homogénea para detectar un analito (anticuerpo monoclonal o policlonal, proteína, péptido, oligonucleótido, ácido nucleico, oligosacárido o polisacárido, hapteno o antígeno de bajo peso molecular, sintético o natural) en una muestra corporal (tal como por ejemplo frotis, esputo, punciones de órganos, biopsias, secreciones, licores, bilis, sangre, líquido linfático, orina, heces). En una prueba homogénea no se requieren etapas de lavado o de separación.

La prueba según la invención puede ser también una prueba heterogénea.

La prueba según la invención puede emplearse tanto en solución así como también en sistemas basados en fase fija o bien en sistemas basados en matrices, en los cuales están inmovilizados sobre una superficie hebras de oligonucleótidos o bien de polinucleótidos o anticuerpos o bien antígenos.

Para la prueba según la invención existen diversos grupos de aplicaciones.

Para un grupo de aplicaciones, los participantes de la (F)RET se encuentran sobre la misma molécula, esto significa que ambos participantes de la (F)RET están enlazados con la misma molécula de afinidad por medio de moléculas de conexión correspondientes (ejemplos de aplicación 1a, 1b, 2, 5, 6). Mediante el enlace de una molécula diana sobre la molécula de afinidad se induce una variación de la configuración de la molécula de afinidad, lo cual conduce a una variación espacial de los marcadores entre sí y, por lo tanto, provoca entre los mismos una diferencia medible de la (F)RET.

Los participantes de la (F)RET se encuentran sobre moléculas distintas para otras aplicaciones y están acoplados, respectivamente, con una molécula de afinidad propia (ejemplos de aplicación 3, 4). Las correspondientes moléculas de afinidad pueden elegirse de tal manera, que se produzca una interacción del donor y del aceptor, que se establezca o que se aumente mediante la reacción con la molécula diana y se induzca, de este modo, una variación de la transferencia de energía.

El ejemplo de aplicación 1 se refiere a la interacción en una prueba homogénea de quinasa con participantes de la (F)RET sobre la misma molécula. Una nanopartícula dil y un cromóforo están enlazados por medio de una secuencia péptida. La secuencia péptida contiene una secuencia de reconocimiento específica de la quinasa. Cuando la secuencia péptida sufra una fosforilación en este punto, debido a la quinasa, la presencia del fosfato modificará la configuración de la secuencia péptida y, de este modo, puede medirse la interacción entre los participantes en la (F)RET constituidos por las nanopartículas dil y por el cromóforo.

El ejemplo de aplicación 1b se refiere a una inmunoprueba homogénea con los participantes en la (F)RET sobre una molécula, con la que se detectan interacciones proteína-proteína, representando únicamente un ejemplo, a este respecto, las reacciones de antígeno-anticuerpo. Una nanopartícula dil y un cromóforo están enlazados por medio de una secuencia péptida. La secuencia péptida contiene un epitopo. Si se enlaza sobre el epitopo un anticuerpo reconocible de manera específica por este epitopo, esto modificará la conformación de la secuencia péptida y, por lo tanto, puede medirse la interacción entre los participantes en la (F)RET constituidos por las nanopartículas dil y por un cromóforo.

La molécula a ser detectada puede enlazarse directamente sobre la molécula de afinidad. Sin embargo, puede ser responsable también indirectamente de un enlace de una molécula sobre la molécula de afinidad. Un ejemplo a este respecto sería la medición de las concentraciones en Ca^{2+} en células vivas. Para ello se aprovecha el enlace, dependiente del calcio, de la calmodulina sobre la miosina-cadena ligera-quinasa (MILCK) en la musculatura lisa. El dominio de enlace de la calmodulina de la MLCK actúa como molécula de afinidad y está enlazada con los participantes en la (F)RET. En función de la concentración en Ca^{2+}, la calmodulina se enlaza sobre el dominio de enlace y provoca una variación de la conformación de la sonda detectora y conduce a una variación medible de la (F)RET.

El ejemplo de aplicación 2 se refiere a una inmunoprueba competitiva con participantes en la (F)RET sobre una molécula con la que puede detectarse la concentración en analitos en una muestra corporal. Una nanopartícula dil y un cromóforo se enlazan por medio de una molécula de conexión que contiene al epitopo. El epitopo es una réplica de un epitopo del analito a ser detectado. Una molécula de afinidad se enlaza de manera específica sobre el epitopo. Mediante la adición de una muestra (por ejemplo muestra corporal), que contenga los analitos a ser detectados, se desplazará por el epitopo la molécula de afinidad enlazada con el epitopo, lo que tiene como consecuencia una variación de la conformación de la molécula y, de este modo, una variación medible de la interacción entre los participantes en la (F)RET constituidos por las nanopartículas dil y por el cromóforo. Esta variación de la (F)RET se utiliza para determinar la concentración del analito.

El ejemplo de aplicación 3 se refiere a una inmunoprueba homogénea por saturación con participantes en la (F)RET sobre moléculas diferentes. Las moléculas de afinidad de la nanopartícula dil y del cromóforo pueden reconocer epitopos diferentes de la misma molécula diana de tal manera que, en presencia de la molécula diana se producirá una transferencia de energía medible.

A modo de ejemplo de una inmunoprueba homogénea, en la que se encuentren sobre moléculas diferentes el donor y el aceptor, se citará en este caso la detección de la hCG (gonadotropina corional humana -humanes chorionales Gonadotropin-) en el suero. En este caso se acoplan el donor y el aceptor con anticuerpos, que reconozcan epitopos diferentes de la hCG. Cuando esté presente la hCG en una muestra corporal, se enlazarán sobre los analitos tanto las sondas del donor como la sonda del aceptor. La FRET medible puede traducirse en una concentración del analito en la muestra corporal por medio de una curva de calibración.

El ejemplo de aplicación 4 se refiere a una inmunoprueba competitiva, homogénea, con participantes en la (F)RET y sobre moléculas diferentes. Uno o varios cromóforos están enlazados con una molécula, que corresponde a partes o a la totalidad de la molécula a ser detectada. Una nanopartícula dil está acoplada con una molécula de afinidad, que interaccione de manera específica tanto con la molécula así como también con la molécula a ser detectada. Se produce un enlace entre las moléculas y, de este modo, una (F)RET. Cuando se añada ahora una muestra (por ejemplo muestra corporal) a la molécula a ser medida, se verificará una reacción de desplazamiento en función de la concentración de la molécula a ser detectada en la muestra citada. Esto conduce a una variación medible, en este caso a una reducción de la (F)RET y puede determinarse la concentración de la molécula a ser detectada por medio de una curva de
calibración.

El ejemplo de aplicación 5 se refiere a una prueba homogénea con participantes en la (F)RET sobre una molécula. Una nanopartícula dil y un cromóforo se enlazan por medio de un péptido, a modo de molécula de afinidad. Este péptido puede cortarse por medio de un enzima a ser detectado. Tras el corte no se produce ya la (F)RET.

Una prueba según el ejemplo de aplicación 5 puede emplearse para detectar una actividad enzimática determinada, por ejemplo una proteasa específica del virus HI en una muestra o célula, estando enlazados ambos participantes en la (F)RET por medio de una secuencia de reconocimiento corta de esta proteasa y se separan mutualmente en el espacio debido a la actividad de la proteasa, concretamente debido al corte del péptido. La actividad enzimática a ser detectada puede ser también una endonucleasa de restricción. En este caso ambos participantes en la (F)RET están enlazados por medio de un ácido nucleico.

El ejemplo de aplicación 6 se refiere a una prueba según el método del faro molecular -Molecular Beacon-. Los faros moleculares -Molecular Beacons- son moléculas de ADN, que pueden plegarse por medio de secuencias intramoleculares complementarias para dar lo que se denomina Stem-Loop o estructura en forma de horquilla para el cabello. En un extremo de la secuencia de ADN está acoplada una nanopartícula dil, en el otro extremo se encuentra un cromóforo como extintor de la fluorescencia o extintor -Quencher-. En la estructura en forma de horquilla para el cabello están dispuestos ambos participantes en la (F)RET y son estrechamente vecinales, por lo tanto, la fluorescencia del donor se extingue completamente. La molécula diana, a ser detectada, presenta secuencias, que son complementarias con respecto a la región en forma de bucle de la secuencia del ADN. Puesto que el enlace sobre la molécula diana es energéticamente más favorable, se extinguirá la conformación en forma de horquilla para el cabello, el cromóforo y las partículas dil se desprenden entre sí y se emite fluorescencia de manera medible, puesto que ya no se produce una extinción de la fluorescencia debido a la (F)RET. De este modo pueden ajustarse las propiedades de hibridación de tal manera, que ya un solo apareamiento erróneo de las bases, entre el faro molecular y el ADN diana no conduzca a la apertura de la estructura en forma de horquilla para el cabello. De este modo pueden detectarse incluso diferencias individuales de bases (por ejemplo SNPs, polimorfismos nucleótidos simples -single nucleotide polymorphisms-).

Ejemplos para la unión de las nanopartículas dil con moléculas orgánicas

Ejemplo 1

Enlace de derivados del ácido fosfónico

La modificación química de la superficie de la nanopartícula dil puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el enlace de derivados del ácido fosfónico con grupos reactivos funcionales. En este caso se enlazarán de manera estable sobre la superficie de las nanopartículas dil los derivados del ácido fosfónico o los derivados de los ésteres del ácido fosfónico, tal como por ejemplo el ácido imino-bis(metilenfosfono)carbónico (que puede prepararse por ejemplo mediante reacción de Mannich-Moedritzer, Moedritzer y Irani, J. Org. Chem., 1966, 31, 1603). Este enlace puede tener lugar sobre nanopartículas dil no tratadas o sometidas a un tratamiento previo (por ejemplo con bromuro de trimetilsililo). Los posibles grupos funcionales reactivos, que portan estas moléculas de conexión, que contienen los ácidos fosfónicos o los ésteres del ácido fosfónico, pueden ser grupos amino, grupos de ácidos carboxílicos, tioles, tioéteres, disulfuros, imidazoles, guanidinas, grupos hidroxilo, indoles, dioles vecinales, aldehídos, grupos alfa-halogenoacetilo, N-maleimidas, organilos de mercurio, halogenuros de arilo, anhídrido del ácido, isocianatos, isotiocianatos, halogenuros de ácidos sulfónicos, imidoésteres, diazoacetatos, sales de diazonio, 1,2-dicetonas, compuestos de carbonilo alfa-beta-insaturados, ácidos fosfónicos, ésteres del ácido fosfórico, ácidos sulfónicos, azoluros o derivados de los grupos citados.

Ejemplo 2

Enlace de etilenglicol, de alcoholes primarios, de derivados primarios de amina

Otro ejemplo para el tratamiento superficial de las nanopartículas dil consiste en el calentamiento de las partículas en etilenglicol, con lo que se verifica un enlace estable del etilenglicol sobre las nanopartículas dil, con disociación de las cadenas alquilo. Este tratamiento da como resultado una solubilidad en agua de las partículas. De manera análoga pueden emplearse alcoholes primarios con grupos reactivos funcionales, como los que han sido indicados precedentemente. De manera similar pueden enlazarse también, de manera estable, derivados primarios de amina sobre la superficie de las nanopartículas dil. Los derivados de amina pueden contener, además del grupo amino, los grupos funcionales reactivos anteriormente indicados.

Ejemplo 3

Revestimiento con sílice, con polímeros o con copolímeros y reactivos de copulación, polimerizables

Como otro ejemplo de una modificación química de la superficie de la nanopartícula dil debe citarse el revestimiento de una nanopartícula dil o de un grupo de nanopartículas dil con sílice: la sílice posibilita una conjugación química sencilla de moléculas orgánicas, puesto que la sílice reacciona muy fácilmente con enlazadores orgánicos tales como, por ejemplo, los trietoxisilanos o los clorosilanos. Otro ejemplo de una modificación química consiste en el revestimiento de una nanopartícula dil o de un grupo de nanopartículas dil con polímeros o con copolímeros. Como ejemplos de reactivos de copulación, polimerizables, deben citarse la N-(3-aminopropil)3-mercaptobenzoamidina, la 3-(trimetoxisilil)propilhidrazida y la 3-(trimetoxisilil)propilmaleimida. Del mismo modo puede emplearse, conjuntamente, una pluralidad de diversos reactivos de copulación, polimerizables para dotar a una o a varias nanopartículas dil con una capa de recubrimiento. Ante todo, en el caso de los reactivos de copulación, que presenten únicamente un enlace débil con respecto a las nanopartículas dil, esto puede ser ventajoso. Ejemplos relativos a los reactivos de copulación, que pueden formar tales redes como recubrimiento de una o de varias nanopartículas dil, deben citarse los diacetilenos, los estirenobutadienos, el acetato de vinilo, los acrilatos, las acrilamidas, los vinilos, los estirenos, los óxidos de silicio, los óxidos de boro, los óxidos de fósforo, los boratos, los pirroles, los polipirroles y los fosfatos así como los polímeros de, al menos, algunos de los agentes químicos citados.

Ejemplo 4

Modificación superficial con oxicloruros, así como enlaces no covalentes con moléculas en forma de cadena y reactivos anfífilos

Otra posibilidad para la preparación de la superficie de las nanopartículas dil consiste en transformar en los oxicloruros correspondientes a los compuestos de los metales de transición, de tipo óxido, con los que están compuestas las nanopartículas dil, con cloro gaseoso o con reactivos orgánicos para la cloración. Estos oxicloruros reaccionan, por su parte, con nucleófilos tales como, por ejemplo, los grupos amino con formación de compuestos nitrogenados de los metales de transición. De este modo puede conseguirse, por ejemplo, una conjugación directa de las proteínas a través de los grupos amino de las cadenas laterales de lisina. La conjugación con proteínas, tras la modificación superficial con oxicloruros, puede llevarse a cabo también mediante el empleo de un enlazador bifuncional tal como la hidrazida del ácido maleimidopropiónico.

Para enlaces no covalentes son adecuados especialmente, en este caso, las moléculas en forma de cadena con una polaridad o carga de sentido opuesto a la de la superficie de la nanopartícula dil. Como ejemplos de moléculas de conexión, que están enlazadas de manera no covalente con las nanopartículas dil, deben citarse los detergentes aniónicos, catiónicos o zwitteriónicos, las proteínas ácidas o básicas, las poliaminas, las poliamidas, los ácidos polisulfónicos o los ácidos policarboxílicos. Puede establecerse un enlace con ayuda de la interacción hidrófoba entre las nanopartículas dil y los reactivos anfífilos, que portan un grupo funcional reactivo. Para ello son especialmente adecuadas las moléculas en forma de cadena, que tengan un carácter anfífilo tales como, por ejemplo, los fosfolípidos o los polisacáridos derivatizados, que puedan reticularse entre sí. La adsorción de esta molécula sobre la superficie de la nanopartícula dil puede conseguirse mediante coincubación.

Ejemplo 5

Enlace de moléculas de afinidad sobre nanopartículas dil con moléculas de conexión

En general, pueden emplearse aquellas moléculas de afinidad como las que se utilizan también en el caso de las moléculas colorantes orgánicas, fluorescentes, descritas en el estado de la técnica, para enlazar éstas específicamente sobre la substancia orgánica biológica o de otro tipo, a ser detectada. Una molécula de afinidad puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, otra proteína, un péptido, un oligonucleótido, un plásmido u otra molécula de ácido nucleico, un ácido nucleico péptido -Peptid Nucleic Acid- (PNA) o un morfolino, un oligosacárido o un polisacárido o un hapteno, tal como la biotina o la digoxina o un antígeno de bajo peso molecular, sintético o natural. Una lista de tales moléculas ha sido publicada en la literatura accesible al público, por ejemplo en el "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" (8th edition, 2001, CD-ROM) de R. P. Hauglund, Molecular Probes, Inc..

Para enlazar moléculas de afinidad de manera covalente o de manera no covalente sobre las nanopartículas dil con una molécula de conexión, se aprovecharán los grupos reactivos sobre la superficie de la molécula de afinidad. Los grupos reactivos sobre la superficie de la molécula de afinidad son, en este caso, los grupos amino, los grupos de ácidos carboxílicos, los tioles, los tioéteres, los disulfuros, los imidazoles, las guanidinas, los grupos hidroxilo, los indoles, los dioles vecinales, los aldehídos, los grupos alfa-halogenoacetilo, las N-maleimidas, los organilos de mercurio, los halogenuros de arilo, los anhídridos de ácido, los isocianatos, los isotiocianatos, los halogenuros de los ácidos sulfónicos, los imidoésteres, los diazoacetatos, las sales de diazonio, las 1,2-dicetonas, los compuestos de carbonilo alfa-beta-insaturados, los ácidos fosfónicos, los ésteres del ácido fosfórico, los ácidos sulfónicos, los azoluros o los derivados de los grupos citados. Sobre la superficie de las nanopartículas dil pueden emplearse los grupos funcionales, reactivos, precedentemente citados, de la molécula de conexión, para la conjugación de la molécula de afinidad. Los protocolos para la copulación sobre los grupos reactivos están descritos en la literatura accesible al público, por ejemplo en la publicación "Bioconjugate Techniques" (de Greg T. Hermanson, Academic Press 1996).

Si el donor y el aceptor están contenidos en la misma molécula, podrán enlazarse con el aceptor, de manera covalente o de manera no covalente, sobre la molécula de afinidad, que está acoplada con el donor a través de una o varias moléculas de conexión. Como aceptores pueden emplearse cromóforos, cuyas longitudes de onda de excitación se solapen con las longitudes de onda de emisión del donor correspondiente. Los aceptores pueden ser, por ejemplo, nanopartículas dil, colorantes orgánicos (por ejemplo la fluoresceína, la rodamina, la cianina), pigmentos orgánicos (por ejemplo los perilenos) o materiales conductores (por ejemplo los metales, los óxidos dopados, los polímeros conductores). Estos materiales pueden presentarse bien en forma de sistemas en estado de partículas o bien en forma de superficie lisa o estructurada o bien en forma de recubrimiento superficial. La copulación puede tener lugar a través de los grupos reactivos sobre la molécula de afinidad y/o sobre la molécula del aceptor.

Además de los enlaces covalentes de la molécula de afinidad pueden realizarse enlaces autoorganizados, no covalentes. Como una de las posibilidades se citará en este caso el enlace de simples sondas detectoras con biotina a modo de molécula de conexión con moléculas de afinidad copuladas con avidina o con estreptavidina.

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Ejemplo 6

La obtención de nanopartículas dil constituidas por YVO_{4}:Eu

La primera etapa consiste en la preparación del YVO_{4}:Eu. El YVO_{4}:Eu puede prepararse según el procedimiento indicado en la publicación K. Riwotzki, M. Haase; Journal of Physical Chemistry B; Vol. 102, 1998, página 10130, columna de la izquierda: en un recipiente de teflón se disuelven 3,413 g de de Y(NO_{3})_{3}\cdot6H_{2}O (8,9 mmoles) y 0,209 g de Eu(NO_{3})_{3}\cdot6H_{2}O (0,47 mmoles) en 30 ml de agua destilada. En esta disolución se le añaden, bajo agitación, 2,73 g de de Na_{3}(VO_{4})\cdot10H_{2}O, que se habían disuelto en 30 ml de agua destilada. Al cabo de otros 20 minutos de agitación se dispone el recipiente de teflón en un autoclave y se calienta a 200ºC bajo agitación adicional. Al cabo de 1 hora se retira la dispersión del autoclave y se centrifuga durante 10 minutos a 3.000 g de y se elimina el sobrenadante. El precipitado se recoge en 40 ml de agua destilada. Se añaden 3,220 g de de una solución acuosa del ácido 1-hidroxietan-1,1-difosfónico (al 60% en peso) a la dispersión (9,38 mmoles). Para la eliminación del Y(OH)_{3}, que se ha formado debido al exceso de iones itrio, se ajusta a 0,3 el valor del pH con HNO_{3} y se agita durante 1 hora. En este caso se forma V_{2}O_{5} coloidal, que puede reconocerse por medio de una coloración rojiza de la solución. A continuación se ajusta el valor del pH a 12,5 con NaOH y se agita durante la noche en un recipiente cerrado. La dispersión blanca, resultante, se centrifuga entonces durante 10 minutos a 3.000 g de y el sobrenadante se elimina con sus productos secundarios. El precipitado está constituido por YVO_{4}:Eu y puede recogerse con 40 ml de agua destilada.

Para el aislamiento de las nanopartículas, que tienen un tamaño menor que 30 nm aproximadamente, se centrifuga la dispersión a 3.000 g de durante 10 minutos, el sobrenadante se decanta y se guarda. A continuación se recoge el precipitado nuevamente con 40 ml de agua destilada, se centrifuga durante 10 minutos a 3.000 g de y se decanta el sobrenadante. Éste y el sobrenadante guardado se combinan y se centrifugan durante 10 minutos a 60.000 g. El sobrenadante, resultante en este caso, contiene las partículas deseadas. Tras otra etapa de diálisis contra agua destilada (manguera de diálisis Serva, Heidelberg, MWCO 12 - 14 kD) se obtiene una solución coloidal, a partir de la cual puede obtenerse un polvo redispersable mediante secado con un evaporador por rotación (50ºC).

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Ejemplo 7

La obtención de nanopartículas dil constituidas por LaPO_{4}:Eu^{3+}

La primera etapa consiste en la preparación del LaPO_{4}:Eu. El LaPO_{4}:Eu puede prepararse según el procedimiento indicado en la publicación H. Meyssamy, K. Riwotzki, A. Kornowski, S. Naused, M. Haase; Advanced Materials, Vol. 11, Issue 10, 1999, página 843, columna de la derecha parte inferior hasta página 844, parte superior de la columna izquierda: en un recipiente de teflón se disuelven 12,34 g de de La(NO_{3})_{3}\cdot6H_{2}O (28,5 mmoles) y 0,642 g de de Eu(NO_{3})_{3}\cdot5H_{2}O (1,5 mmoles) en 50 ml de agua destilada y se añaden a 100 ml de NaOH (1 M). A esta solución se le añade, bajo agitación, una solución formada por 3,56 g de de (NH_{4})_{2}HPO_{4} (27 mmoles) en 100 ml de agua destilada. La solución se ajusta a pH 12,5 con NaOH (4 M) y se calienta en un autoclave durante 2 horas a 200ºC bajo viva agitación. La dispersión se centrifuga a continuación durante 10 minutos a 3.150 g de y se elimina el sobrenadante. Para eliminar el La(OH)_{3}, no deseado, se dispersa el precipitado en HNO_{3} (1M) y se agita durante 3 días (pH 1). A continuación se centrifuga la dispersión (3.150 g, 5 minutos) y se retira el sobrenadante. Se añaden, bajo agitación, 40 ml de agua destilada al centrifugado.

La dispersión lechosa contiene, todavía, una ancha distribución de tamaños. Para el aislamiento de las nanopartículas, que sean menores que 30 nm aproximadamente, se efectúan a continuación etapas de centrifugación y de decantación de manera completamente análoga a la del ejemplo 6.

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Ejemplo 8

La obtención de nanopartículas dil constituidas por LaPO_{4}:Ce, Tb

La primera etapa consiste en la preparación del LaPO_{4}:Ce,Tb. Se desgasifican 300 ml de fosfato de trisetilhexilo con una corriente gaseosa seca de nitrógeno. A continuación se añaden y se disuelven 7,43 g de de LaCl_{3}\cdot7H_{2}O (20 mmoles), 8,38 g de de CeCl_{3}\cdot7H_{2}O (22,5 mmoles) y 2,8 g de de TbCl_{3}\cdot6H_{2}O (7,5 mmoles) en 100 ml de metanol. A continuación se eliminan por destilación en vacío el agua y el metanol por calentamiento de la solución a 30ºC hasta 40ºC. A continuación se añade una solución recién preparada, constituida por 4,9 g de ácido ortofosfórico seco (50 mmoles), que se han disuelto en una mezcla formada por 65,5 ml de trioctilamina (150 mmoles) y 150 ml de fosfato de trisetilhexilo. La solución clara tiene que disponerse rápidamente en un recipiente, que debe ser sometido a vacío, y se barre con corriente gaseosa de nitrógeno para minimizar la oxidación del Ce^{3+} durante un aumento de la temperatura. A continuación se calienta la solución a 200ºC. Durante la fase de calentamiento se disocian algunos de los grupos éster el ácido fosfórico, lo cual conduce a una reducción paulatina del punto de ebullición. La fase de calentamiento se concluye cuando la temperatura caiga a 175ºC (aproximadamente a 30 hasta 40 horas). Una vez enfriada la solución hasta la temperatura ambiente, se añade metanol en un exceso 4 veces mayor, lo cual conduce a una precipitación de las nanopartículas. El precipitado se separa, se lava con metanol y se seca.

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Ejemplo 9

La obtención de nanopartículas dil constituidas por LaPO_{4}:Eu^{3+}

Se disuelven 490 mg (5,0 mmoles) del ácido ortofosfórico seco y 6,5 ml (15 mmoles) de trioctilamina en 30 ml de fosfato de trisetilhexilo. A continuación se disuelven 1,76 g de La(NO_{3})_{3}\cdot7H_{2}O (4,75 mmoles) y 92 mg de EuCl_{3}\cdot6H_{2}O (0,25 mmoles) en 50 ml de fosfato de trisetilhexilo y se combinan con la primera solución. La solución resultante se desgasifica bajo vacío y, a continuación, se calienta durante 16 horas, bajo nitrógeno, a 200ºC. Durante la fase de calentamiento se disocian algunos grupos de éster del ácido fosfórico, lo cual conduce a un descenso paulatino del punto de ebullición. La fase de calentamiento se concluye cuando la temperatura haya caído a 180ºC. Una vez enfriada la solución hasta la temperatura ambiente, se añade metanol, lo cual conduce a una precipitación de las nanopartículas. El precipitado se separa con ayuda de una centrífuga, se lava dos veces con metanol y se seca.

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Ejemplo 10

Soluciones de las nanopartículas preparadas en el ejemplo 8 en agua mediante reacción con etilenglicol y con polietilenglicol

Se calientan 50 mg de las nanopartículas de LaPO_{4}:Ce,Tb, preparadas en el ejemplo 8 (\sim 140 nmoles) con 5 ml de etilenglicol (\sim 180 mmoles) (alternativamente pueden emplearse también otros alcoholes, especialmente dioles, preferentemente polietilenglicoles con diversas longitudes de la cadena, HO-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-OH, donde n = 2 - 9) y 5 \mul de ácido sulfúrico (96-98%) bajo agitación y gas inerte durante 3 horas a 210ºC. Las partículas se disuelven a 135ºC. A continuación se aplica un vacío, provocado por la trompa de agua, de 1,5 mbares aproximadamente y se elimina por destilación aproximadamente la mitad del etilenglicol, el residuo permanece claro. A continuación se dializa contra agua durante la noche (manguera de diálisis Spectra/Por, 5-6.000 MWCO, Spektrum, Países Bajos).

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Ejemplo 11

Funcionalización con carboxi por oxidación de las nanopartículas, preparadas en el ejemplo 10

Se añaden a 100 mg (\sim 300 nmoles) en 20 ml de agua de las nanopartículas, preparadas en el ejemplo 10, bajo agitación, en primer lugar 0,5 ml de ácido sulfúrico al 96 - 98%. Se añade, gota a gota, solución de KMnO_{4} 1 mM hasta que ya no se produzca la decoloración del color violeta. A continuación se añade de nuevo la misma cantidad de solución de KMnO_{4} y se deja proseguir la agitación durante la noche a temperatura ambiente (> 12 horas). El permanganato en exceso se reduce mediante la adición, gota a gota, de solución recién preparada de sulfito de sodio 1 mM. Durante la noche se dializa frente a MES 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 6,0 (manguera de diálisis Spectra/Por, 5-6.000 MWCO, Spektrum, Países Bajos).

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Ejemplo 12

Eliminación de las cadenas alquilo del fosfato de trisetilhexilo de la superficie de las nanopartículas, descritas en el ejemplo 8, mediante reacción con bromotrimetilsilano

Se hierven 300 mg de las nanopartículas de LaPO_{4}:Ce,Tb, preparadas en el ejemplo 8 (\sim 850 nmoles) con 2,3 g (15 mmoles) de bromotrimetilsilano, en 100 ml de cloroformo durante 4 horas bajo reflujo, se eliminan por destilación en su mayor parte el exceso de bromotrimetilsilano y el producto intermedio formado y, a continuación, se hidroliza ligeramente de manera amonioalcalina. Para ello se combinan 6 ml de agua con 100 \mul de amoníaco al 25% y se agitan a temperatura ambiente durante la noche. Las partículas se presentan en forma de una emulsión lechosa y se sedimentan en parte al cabo de varias horas.

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Ejemplo 13

La copulación de las nanopartículas, preparadas según el ejemplo 12, con el ácido 11-bis(fosforilmetil)amino-undecanoico y con el 1,4-bis(3-aminopropoxi)-butano

Para la obtención del ácido 11-bis(fosforilmetil)amino-undecanoico se disponen 201 g del ácido 11-aminoundecanoico, 170 g de ácido fosforoso, 200 ml de ácido clorhídrico concentrado y 200 ml de agua y se calientan a 100ºC. A continuación se añaden, gota a gota, en el transcurso de 1 hora, 324 g de formalina (37%) y se continúa agitando a 100ºC durante 1 hora más. Tras enfriamiento hasta la temperatura ambiente se separa el producto mediante filtración por succión y se seca en vacío. Se obtienen 334 g del ácido 11-bis(fosforilmetil)amino-undecanoico, que se caracterizó por medio del análisis elemental (C,H,N,P).

1

Alternativamente, pueden emplearse moléculas de la fórmula siguiente, siendo el resto (R) un alquileno con 1 hasta 17 átomos de carbono, preferentemente con 3 hasta 12 átomos de carbono, o un resto alquilenarileno con 7 hasta 12 átomos de carbono:

2

Se combinan 0,5 g (1,85 mmoles) del ácido 11-bis(fosforilmetil)amino-undecanoico en 2 ml de etilenglicol con 0,894 g (4,375 mmoles) del 1,4-bis(3-aminopropoxi)-butano. Una vez que se ha formado una solución clara (reacción exotérmica), se añaden 35 mg (= 100 nmoles) de las nanopartículas preparadas en el ejemplo 12 aproximadamente a 50ºC y la combinación se calienta a 125ºC. Las partículas se disuelven completamente a 120ºC. Al cabo de 4 horas se presenta una solución clara de color parduzco claro, que permanece clara incluso tras enfriamiento hasta la temperatura ambiente. Durante la noche se dializa contra 2x2 litros de tampón de carbonato de Na 10 mM, pH 8,5 (manguera de diálisis Spectra/Por, 5-6.000 MWCO, Spektrum, Países Bajos). El dializado es claro.

Ejemplo 14

Biotinilado de las nanopartículas preparadas en el ejemplo 13

Se concentran por evaporación en el evaporador rotativo 6,2 ml de las partículas preparadas en el ejemplo 13 (= 5 mg o \sim 15 nmoles) y se concentran en el evaporador rotativo hasta 4,81 mg/ml. Las partículas se incuban por rotación con un exceso molar 20 veces mayor de biotina-X-NHS (éster de N-hidroxi-succinimida del ácido sulfo-biotina-aminocaprónico, Calbiochem, Schwalbach), disuelto en agua, durante 4 horas a temperatura ambiente y, a continuación, se dializa contra tampón PBS (K_{2}HPO_{4} 8 mM; NaCl 150 mM; Na_{2}HPO_{4} 2 mM; pH 7,4) (manguera de diálisis Spectra/Por, 5-6.000 MWCO, Spektrum, Países Bajos). El dializado es ligeramente turbio.

Ejemplo 15

Copulación de un oligonucleótido de ADN sobre las nanopartículas preparadas en el ejemplo 13

Las nanopartículas, preparadas en el ejemplo 13, se activan con un exceso 40 veces mayor de sulfo-SIAB (aminobenzoato de sulfosuccinimidil(4-yodoacetilo), Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn): se retamponan 7,5 mg de las nanopartículas aminofuncionalizadas (\sim 25 nmoles) por medio de una unidad filtrante Centricon (límite de exclusión del peso molecular a 50.000, Millipore, Eschborn) en tampón TSMZ, pH 7,3 (NaCl 0,1 M; trietanolamina-HCl 0,1 M; NaOH 0,02 M; ZnCl_{2} 0,27 mM; Tween 20 al 0,1%; MgCl_{2} 1 mM) y se ajusta a una concentración de aproximadamente 7 mg/ml. A la solución de las partículas se le añaden 50 \mul de una solución de sulfo-SIAB 20 mM en agua y se incuba durante 15 minutos a 25ºC. La reacción se detiene mediante la adición de 12 \mul de glicina 1 M (exceso de 12 veces) y el sulfo-SIAB libre se separa por medio de una columna lista para su utilización Sephadex G25 PD 10 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). Se compró en la firma Interactiva (Ulm) un oligonucleótido de ADN de la secuencia 5'-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-3' con una modificación de tiol en el extremo 5' y con una modificación Dabycl (4-(4-dimetilminofenilazo)benzoilo) en el extremo 3', así como un oligonucleótido de ADN de control, que se diferencia de la sonda únicamente por la ausencia de la molécula de Dabcyl en el extremo 3'. Se mezclan cantidades equimolares del oligonucleótido ADN y de las nanopartículas activadas con SIAB y se incuban durante 3 horas a 25ºC y, a continuación, durante la noche a 4ºC. Las partículas acopladas con el oligonucleótido de ADN se separan de las partículas no acopladas y del oligonucleótido de ADN libre por medio de una FPLC (Cromatografía líquida de resolución rápida -Fast Performance Liquid Chromatography-). Las partículas acopladas se recogen a 4ºC en tris-HCl 50 mM, pH 7,4; BSA al 0,1%. Cuando no esté presente ningún ADN diana, esta molécula se presentará con una estructura en forma de horquilla para el cabello, siendo directamente contiguos los extremos de la molécula y teniendo lugar una FRET. La fluorescencia de la nanopartícula se extingue en este caso por medio de la Dabcyl.

Ejemplo 16

Copulación de anticuerpos monoclonales anti-\beta-hCG sobre las nanopartículas preparadas en el ejemplo 13

En primer lugar se activan las partículas, preparadas en el ejemplo 13, con un exceso molar 30 veces mayor de 2-iminotiolano (2-IT, reactivo de Traut, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn): se transfieren 2 ml (\sim 25 nmoles) de las partículas preparadas en el ejemplo 13 (4 mg/ml) al tampón TSE, pH 8,5 (NaCl 0,04 M; trietanolamina-HCl 0,05 M; NaOH 0,04 M; EDTA 0,5 mM; Tween 20 al 0,1%; pH 8,5). Para ello se centrifugan las partículas durante 3 x 15 minutos a 3.000 g y el precipitado se recoge, tras separación por decantación del sobrenadante, respectivamente con 700 \mul de tampón TSE, pH 8,5. Estas partículas se incuban durante 1 hora a 25ºC con 75 \mul de 2-IT 10 mM (en tampón TSE, pH 8,5) y la reacción se detiene, a continuación, con 9 \mul (exceso de 12 veces) de glicina 1 M. Para la separación del exceso del 2-IT se centrifuga de nuevo durante 3 x 15 minutos a 3.000 g y el precipitado se vuelve a suspender, tras separación por decantación, dos veces en 1 ml de tampón TSE, pH 7,3 (NaCl 0,1 M; trietanolamina-HCl 0,1 M; NaOH 0,02 M; EDTA 1 mM; Tween 20 al 0,1%; pH 7,3), tras la tercera centrifugación se vuelve a suspender en 250 \mul de tampón TSE, pH 7,3. Al mismo tiempo se activa una cantidad equimolar del anticuerpo murino monoclonal específico para \beta-hCG (clon F199C1, Perkin-Elmer Life Sciences - Wallac Oy, Finlandia) con un exceso 40 veces mayor de SMCC (1-carboxilato de N-succinimidil-4-(N-maleimido-metilo)-ciclohexano, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn): se retamponan 750 \mul del anticuerpo anti \beta-hCG (= 25 nmoles a una concentración de 5 mg/ml) mediante una unidad de filtración Centricon (límite de exclusión del peso molecular a 50.000) en tampón TSMZ, pH 7,3 (NaCl 0,1 M; trietanolamina-HCl 0,1 M; NaOH 0,02 M; ZnCl_{2} 0,27 mM; de Tween 20 al 0,1%; MgCl_{2} 1 mM) y se ajusta a una concentración de 7 mg/ml. A la solución de los anticuerpos se le añaden 50 \mul de una solución de SMCC 20 mM en DMF (= 1 mmol) y se incuba durante 30 minutos a 25ºC. La reacción se detiene mediante la adición de 12 \mul de glicina 1 M (exceso 12 veces mayor) y el SMCC libre se separa a través de una columna lista para su utilización de Sephadex G25 PD 10 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). Finalmente, se mezclan cantidades equimolares de la solución de las partículas, activada con 2-IT, y de la solución de los anticuerpos activada con SMCC y se incuban durante 3 horas a 25ºC y, a continuación, durante la noche a 4ºC. Se purifican las partículas acopladas con los anticuerpos de las partículas no acopladas y del anticuerpo libre mediante cromatografía de permeación de gel sobre Superdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). Como tampón eluyente se utiliza MES 0,1M, NaCl 0,5 M, pH 6,0. El tiempo de retención para las nanopartículas dil ampliadas es de 2 horas aproximadamente.

Ejemplo 17

Copulación de las nanopartículas LaPO4: Eu^{3+}, preparadas en el ejemplo 9, con la hIL-2

Se hierven 300 mg de las nanopartículas LaP04: Eu^{3+} (\sim1 \mumol), preparadas en el ejemplo 9, con 2,23 g (15 mmoles) de bromotrimetilsilano en 125 ml de cloroformo durante 4 horas bajo reflujo, el exceso de bromotrimetilsilano y el producto intermedio formado se eliminan por destilación en su mayor parte y, a continuación, se efectúa una ligera hidrólisis amonioalcalina. Para ello se combinan 6 ml de agua con 100 \mul de amoníaco al 25% y se agitan durante la noche a temperatura ambiente. Las partículas se presentan en una emulsión lechosa y se decantan en parte al cabo de varias horas. Se incuban 5 mg de nanopartículas (= 25 mmoles, 106 \mul) de estas nanopartículas, tratadas con bromotrimetilsilano, con proteína humana recombinante IL-2 (R&D Systems, Mineapolis, MN, USA) en tampón de carbonato de Na 10 mM, pH 8,5 en una relación molar de 2:1 durante 1 hora a 37ºC, con aplicación de sacudidas. A continuación se separa la proteína en exceso mediante 6 centrifugaciones durante 10 minutos a 3.000 g y se resuspende, en cada caso, en 1 ml de tampón de carbonato de Na 10 mM, pH 8,5. El conjugado LaPO_{4}: Eu^{3+}/IL-2 se guarda a 4ºC.

Ejemplo 18

Prueba de transferencia de energía homogénea para la detección de la \beta-hCG con las nanopartículas copuladas con los anticuerpos, preparadas en el ejemplo 16 y con los anticuerpos copulados con la fluoresceína como aceptor Copulación de los anticuerpos anti-\beta-hCG con fluoresceína

Para la copulación del anticuerpo anti-\beta-hCG (M15294, Perkin-Elmer Life Sciences - Wallac Oy, Finlandia) con la fluoresceína se utiliza el estuche de muestras moleculares Fluoreporter® FITC para marcar proteínas (Protein Labeling), según las indicaciones del fabricante. Se retamponan 0,5 mg del anticuerpo con ayuda de una unidad filtrante Centricon (límite de exclusión del peso molecular en 50.000) en tampón de bicarbonato 0,2 M, pH 9,0. La solución de los anticuerpos se combina a continuación con un exceso 25 veces mayor de una solución de fluoresceínaisotiocianato 5 mM (FITC) (disuelto en una mezcla formada a partes iguales en volumen de DMF y de tampón de bicarbonato 0,2 M, pH 9,0) y se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente. El exceso de FITC se separa por medio de una columna lista para su utilización Sephadex G25 PD 10 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg), se determina mediante espectroscopia la concentración del anticuerpo y la relación fluoresceína/anticuerpo. El conjugado se combina con un 0,01% de azida de sodio y con un 0,1% de BSA y se conserva a 4ºC.

Realización de la prueba

Se incuban 50 \mul de un patrón de la \beta-hCG procedente de un estuche que puede ser adquirido en el comercio para la medición de la \beta-hCG libre en el suero (A007-101, Perkin-Elmer Life Sciences - Wallac Oy, Finlandia) junto con 100 nmoles del conjugado nanopartícula-anticuerpo, preparado en el ejemplo 16, y 100 nmoles del anticuerpo anti-\beta-hCG copulado con la fluoresceína en 200 \mul de tampón tris-HCl, pH 7,4 en una placa para la microtitulación con 96 pocillos, permeable a los UV (UVStar, Greiner) durante 60 minutos a 25ºC. Los dos anticuerpos anti-\beta-hCG están dirigidos frente a epitopos diferentes de la subunidad de la \beta-hCG. Las muestras se miden a continuación en un espectrómetro de fluorescencia (firma Jobin Yvon, Fluorolog 3) con los ajustes siguientes: excitación pulsada con longitudes de oda de excitación: 280 nm, emisión: 542 nm, anchura de la rendija: 4 nm, tiempo de respuesta (time delay): 50 \mus, velocidad de repetición aproximadamente 25 Hz. Del mismo modo puede determinarse el tiempo de semivida de la línea de emisión del terbio. Para ello se emplearon los ajustes siguientes: excitación: 280 nm, emisión 542 nm, anchura de la rendija 5 nm; tiempo de integración: 0,1 ms. Estas mediciones obtenidas se representan frente a las concentraciones empleadas de la \beta-hCG para el establecimiento de una curva de calibración. El contenido en \beta-hCG de las muestras corporales puede medirse de manera análoga en muestras de suero y puede determinarse la concentración por medio de la curva de calibración.

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Ejemplo 19

Prueba de transferencia de energía competitiva homogénea para la determinación de la hIL-2 con nanopartículas, preparadas en el ejemplo 17, copuladas con la hIL-2 y anticuerpos de cadena anti-hIL-2R\alpha, copulados con Alexa Fluor 680 Copulación del anticuerpo de cadena anti-hIL-2R\alpha monoclonal con Alexa Fluor 680

Se dializa contra PBS 1 mg del anticuerpo monoclonal 7G7B6, que reconoce de manera específica la cadena \alpha del receptor humano de la interleuquina-2 (cadena hIL-2R\alpha) (ATCC, Rockville, USA), se ajusta a una concentración de 2 mg/ml y se marca con el estuche para marcar proteínas Alexa Fluor 680 (Molecular Probes Europe BV, Países Bajos) según las indicaciones del fabricante. Como tampón para la reacción se utiliza tampón de bicarbonato de Na 0,1 M, pH 8,3 y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo copulado se purifica por medio de una columna, que está contenida en el estuche, empleándose como tampón para la elución un tampón PBS con azida de Na 0,2 mM. Para la determinación de la concentración en proteína del anticuerpo copulado se mide la absorción (A) a 280 y a 679 nm en una cubeta de 1 cm y se calcula según la fórmula siguiente:

M = \frac{(A_{280}-(A_{679} \ x \ 0.05)) \ x \ factor \ de \ dilución}{203 \ 000}

siendo 203 000 cm^{-1}M^{-1} el coeficiente de extinción molar de un IgG y siendo 0,05 el factor para la corrección de la absorción del colorante a 280 nm. La concentración del anticuerpo copulado es de 1,27 y se ajusta a 1 mg/ml (\sim 6,5 \muM) con PBS; se ajusta con azida de Na 0,2 mM y se guarda a 4ºC. La eficiencia del marcaje se calcula de la manera siguiente:

Moles \ del \ colorante \ por \ mol \ del \ anticuerpo = \frac{A_{679} \ x \ factor \ de \ dilución}{180 \ 000 \ x \ concentración \ de \ la \ \text{proteína} \ en \ M}

siendo 184 000 cm^{-1}M^{-1} el coeficiente de extinción molar del colorante Alexa Fluor 680 a 679 nm. La relación del conjugado anticuerpo-colorante es de 3,2.

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Realización de la prueba

Se llevan a cabo las diluciones necesarias de los diversos componentes con tampón TSA 50 mM (tris-HCl 50 mM, pH 7,75; NaCl al 0,9%; NaN_{3} al 0,05%). En primer lugar se incuban 40 pocillos de una placa para la microtitulación, permeable a los UV (UVStar, Greiner) durante 1 hora a temperatura ambiente con una solución de BSA al 0,5%, para saturar los enlaces no específicos y, a continuación, se cargan con una mezcla constituida por las nanopartículas preparadas en el ejemplo 17 (conjugado LaPO_{4}: Eu^{3+}/IL-2), anticuerpo de cadena anti-hIL-2R\alpha marcado con Alexa Fluor 680 y proteína hIL-2sR\alpha recombinante (receptor alfa soluble de IL-2 humano, R&D Systems, Mineapolis, MN) con una concentración final respectiva de 40 nM. Se añade a 20 de los pocillos, a concentraciones variables, la proteína hIL-2 no marcada, a los otros 20 se les añade una proteína irrelevante para esta prueba. La concentración se aumenta, respectivamente, en 50 nM, de tal manera, que se ensaya una serie de concentraciones desde 0 hasta 950 nM. El volumen final de la reacción es, en cada caso, de 200 \mul. Se efectúa la incubación durante 45 minutos en la obscuridad, a temperatura ambiente, en un agitador sometido a sacudidas. Las señales se leen con un dispositivo Wallac 1420 Victor^{TM} Multilabel Counter (Perkin-Elmer Life Sciences - Wallac Oy, Finlandia) con los ajustes siguientes: excitación: 340 nm, emisión: 665 nm, tiempo de respuesta (time delay): 50 \mus, ventana temporal (time window): 200 \mus y duración del ciclo (cycling time): 1.000 \mus. Para cada valor se lleva a cabo una doble determinación y se corrige por medio del resultado con una proteína irrelevante para los enlaces no específicos. Los valores medidos se representan en un diagrama frente a la concentración empleada de proteína y proporcionan una curva de calibración, por medio de la cual pueden determinarse las concentraciones de la interleuquina-2 humana, que se miden de manera análoga en muestras corporales humanas.

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Ejemplo 20

Determinación cuantitativa por RCP del ADN bacteriano mediante una transferencia de energía intramolecular con las nanopartículas preparadas en el ejemplo 15

El cebador y la sonda para la determinación cuantitativa del ADN se eligieron específicamente para el gen de polimerasa del ARN de Mycobacterium tuberculosis y se prepararon por Interactiva (Ulm). Los cebadores tienen las siguientes secuencias: hacia adelante: 5'-GGCCGGTGGTCGCCGCG-3', hacia atrás: 5'-ACGTGACAGACCGCC
GGGC-3'.

Prueba para la determinación cuantitativa del ADN bacteriano

Para las reacciones de RCP de 50 \mul se mezclan 50 nM de las nanopartículas preparadas en el ejemplo 15 (copuladas con el oligonucleótido Dabcyl) como sonda, con, respectivamente, 500 nM de ambos cebadores, 2 U de Amplitaq Gold ADN polimerasa (Perkin-Elmer), 250 \muM de dATP, 250 \muM de dCTP, 250 \muM de dGTP, 500 \muM de dUTP, 4 mM de MgCl2, 50 mM de KCl y 10 mM de tris-HCl, pH 8,0. Como matriz para el ADN se amplifica ADN genómico de M. Tuberculosis con los mismos cebadores y se clona en un plásmido con ayuda del estuche de clonación Invitrogen Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen BV/NOVEX, Países Bajos). Para establecer una curva patrón, se emplean 5 concentraciones diferentes del plásmido de ADN de 1 pg hasta 100 ng, así como una reacción sin matriz de ADN. Para cada concentración se emplean 30 reacciones de tal manera, que puede tomarse una muestra para la medición en el espectrómetro después de cada ciclo, a partir del 15º ciclo. El volumen de la reacción es de 50 \mul, la amplificación se lleva a cabo en un dispositivo Thermocycler (PCR-System 2400, Perkin-Elmer) con las siguientes condiciones para la reacción: 10 minutos a 95ºC; 15 - 45 ciclos con 30 segundos a 95ºC, 45 segundos a 56ºC y 30 segundos a 72ºC. Las muestras se miden en un espectrómetro de fluorescencia (firma Jobin Yvon, Fluorolog 3) con los ajustes siguientes: excitación pulsada con longitudes de onda de excitación: 280 nm, emisión: 542 nm, anchura de la rendija: 4 nm, tiempo de respuesta (time delay): 50 \mus, velocidad de repetición 25 Hz aproximadamente. Del mismo modo puede determinarse el tiempo de semivida de la línea de emisión del terbio. Para ello se emplean los ajustes siguientes: excitación: 280 nm, emisión 542 nm, anchura de la rendija 5 nm; tiempo de integración: 0,1 ms. Durante la hibridación de la sonda sobre el ADN diana no tiene lugar ninguna FRET intramolecular entre las nanopartículas y el Dabcyl. Por lo tanto, a medida que aumenta la concentración del ADN diana se torna más intensa la fluorescencia del Tb de la nanopartícula, en comparación con el control sin matriz, prolongándose de manera simultánea, el tiempo de semivida de la duración de vida de la fluorescencia de la nanopartícula frente a los controles sin matriz de ADN. Estas diferencias entre ambos parámetros pueden representarse frente al número de ciclos para el establecimiento de una curva de calibración para cada concentración de matriz de ADN.

Claims (41)

1. Prueba a base de una transferencia de energía por resonancia (RET), que comprende

-

un primer grupo de moléculas A, que está marcado con, al menos, un donor de energía (donor), y

-

al menos un segundo grupo de moléculas B, que está marcado con, al menos, un aceptor de energía (aceptor),

-

comprendiendo el donor una molécula o partícula, que puede excitarse energéticamente por medio de una fuente externa de radiación y capaz de emitir fluorescencia,

-

el aceptor abarca una molécula o partícula, que puede excitarse por transferencia de energía a través del donor con extinción parcial o completa de la fluorescencia del donor, y

-

el donor y/o el aceptor abarcan nanopartículas dopadas inorgánicas luminiscentes (nanopartículas dil) con estructura cristalina con una extensión \leq 10 nanómetros, que se determinan con un desplazamiento de Stockes o de anti-Stockes después de una excitación energética mediante radiación electromagnéti- ca.

2. Prueba según la reivindicación 1, caracterizada porque el aceptor es capaz de emitir fluorescencia.

3. Prueba según la reivindicación 1, caracterizada porque el aceptor se relaja en ausencia de radiación.

4. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la RET está constituida por una transferencia de energía por resonancia con fluorescencia (FRET).

5. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la RET está constituida por una transferencia de Förster o por una transferencia con participación de órdenes multipolares superiores.

6. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la RET está constituida por una migración de cargas o de excitones.

7. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la RET puede detectarse de manera cualitativa y/o cuantitativa con ayuda de la medición temporal o continua de la variación de las propiedades luminiscentes, especialmente de la variación de la intensidad de la luz fluorescente, de la variación espectral de la luz fluorescente o de la variación del tiempo de extinción de las nanopartículas dil y/o de otros donores y/o aceptores, especialmente cromóforos.

8. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque o bien el donor o bien el aceptor, comprende una nanopartícula dil con un tiempo de extinción de la fluorescencia prolongado, que presenta, preferentemente, un tiempo de semivida mayor que 5 ns, especialmente comprendido entre 1 \mus y 50 ms, de forma especialmente preferente, comprendido entre 100 \mus y 10 ms, y respectivamente, el otro comprende o bien, del mismo modo, nanopartículas dil, cuyo tiempo de extinción de la fluorescencia sea más corto que el de las otras nanopartículas dil, o bien comprende un cromóforo orgánico molecular.

9. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el material huésped de las nanopartículas dil contiene compuestos del tipo XY, siendo X un catión constituido por uno o varios elementos de los grupos 1a, 2a, 3a, 4a principales, de los grupos 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 7b secundarios o de los lantánidos del Sistema Periódico y siendo Y o bien un anión poliatómico constituido por uno o varios elementos de los grupos 3a, 4a, 5a principales, de los grupos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y/o 8b secundarios así como uno o varios elementos de los grupos 6a y/o 7 principales o un anión monoatómico de los grupos 5a, 6a o 7a principales del Sistema Periódico.

10. Prueba según la reivindicación precedente, caracterizada porque el material huésped de las nanopartículas dil contiene compuestos del grupo de los sulfuros, de los seleniuros, de los sulfoseleniuros, de los oxisulfuros, de los boratos, de los aluminatos, de los galatos, de los silicatos, de los germanatos, de los fosfatos, de los halógenofosfatos, de los óxidos, de los arseniatos, de los vanadatos, de los niobiatos, de los tantalatos, de los sulfatos, de los volframatos, de los molibdatos, de los halogenuros alcalinos así como de otros halogenuros o nitruros.

11. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque como dopaje se emplean uno o varios elementos del grupo que contiene los elementos de los grupos 1a, 2a principales o que contiene Al, Cr, Tl, Mn, Ag, Cu, As, Nb, Nd, Ni, Ti, In, Sb, Ga, Si, Pb, Bi, Zn, Co y/o elementos de los lantánidos.

12. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque también sirven como material para el dopaje las combinaciones de dos o varios de estos elementos en concentraciones relativas diferentes entre
sí.

13. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la concentración del material para el dopaje en la red huésped está comprendida entre 10^{-5}% en moles y 50% en moles, preferentemente entre 0,01% en moles y 30% en moles, de forma especialmente preferente entre 0,1% en moles y 20% en moles.

14. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se utiliza como material para las nanopartículas dil LiI:Eu; NaI:Tl; CsI:Tl; CsI:Na; LiF:Mg; LiF:Mg,Ti; LiF:Mg,Na; KMgF_{3}:Mn; Al_{2}O_{3}:Eu; BaFCl:Eu; BaFCl:Sm; BaFBr:Eu; BaFCl_{0,5}Br_{0,5}:Sm; BaY_{2}F_{8}:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); BaSi_{2}O_{5}:Pb; BaMg_{2}Al_{16}O_{27}:Eu; BaMgAl_{14}O_{23}:Eu; BaMgAl_{10}O_{17}:Eu; BaMgAl_{2}O_{3}:Eu; Ba_{2}P_{2}O_{7}:Ti; (Ba,Zn,Mg)_{3}Si_{2}O_{7}:Pb; Ce(Mg,Ba)Al_{11}O_{19}; Ce_{0,65}
Tb_{0,35}MgAl_{11}O_{19:Ce,Tb}; MgAl_{11}O_{19}:Ce,Tb; MgF_{2}:Mn; MgS:Eu; MgS:Ce; MgS:Sm; MgS:(Sm,Ce); (Mg,Ca)S:Eu;
MgSiO_{3}:Mn; 3,5MgO\cdot0,5MgF_{2}\cdotGeO_{2}:Mn; MgWO_{4}:Sm; MgWO_{4}:Pb; 6MgO\cdotAs_{2}O_{5}:Mn; (Zn,Mg)F_{2}:Mn; (Zn_{4}Be)
SO_{4}:Mn; Zn_{2}SiO_{4}:Mn; Zn_{2}SiO_{4}:Mn,As; ZnO:Zn; ZnO:Zn,Si,Ga; Zn_{3}(PO_{4})_{2}:Mn; ZnS:A (A = Ag, Al, Cu); (Zn,Cd)S:A (A = Cu, Al, Ag, Ni); CdBO_{4}:Mn; CaF_{2}:Mn; CaF_{2}:Dy; CaS:A A = lantánido, Bi); (Ca,Sr)S:Bi; CaWO_{4}:Pb; CaWO_{4}:Sm; CaSO_{4}:A (A = Mn, lantánido); 3Ca_{3}(PO_{4})_{2}\cdotCa(F,Cl)_{2}:Sb,M_{n}; CaSiO_{3}:Mn,Pb; Ca_{2}Al_{2}Si_{2}O_{7}:Ce; (Ca,Mg)SiO_{3}:Ce; (Ca,Mg)SiO_{3}:Ti; ZSrO\cdot6(B_{2}O_{3})\cdotSrF_{2}:Eu; 3Sr_{3}(PO_{4})_{2}\cdotCaCl_{2}:Eu; A_{3}(PO_{4})_{2}\cdotACl_{2}:Eu (A = Sr, Ca, Ba);
(Sr,Mg)_{2}P_{2}O_{7}:Eu; (Sr,Mg)_{3}(PO_{4})_{2}:Sn; SrS:Ce; SrS:Sm,Ce; SrS:Sm; SrS:Eu; SrS:Eu,Sm; SrS:Cu,Ag; Sr_{2}P_{2}O_{7}:Sn; Sr_{2}
P_{2}O_{7}:Eu; Sr_{4}Al_{14}O_{25}:Eu; SrGa_{2}S_{4}:A (A = lantánido, Pb); SrGa_{2}S_{4}:Pb; Sr_{3}Gd_{2}Si_{6}O_{18}:Pb,Mn; YF_{3}:Yb,Er; YF_{3}:Ln (Ln = lantánido); YLiF_{4}:Ln (Ln = lantánido); Y_{3}Al_{5}O_{12}:Ln (Ln = lantánido); YAl_{3}(BO_{4})_{3}:Nd,Yb; (Y,Ga)BO_{3}:Eu; (Y,Gd)BO_{3}:Eu; Y_{2}Al_{3}Ga_{2}O_{12}:Tb; Y_{2}SiO_{5}:Ln (Ln = lantánido); Y_{2}O_{3}:Ln (Ln = lantánido); Y_{2}O_{2}S:Ln (Ln = lantánido); YVO_{4}:A (A = lantánido, In); Y(P,V)O_{4}:Eu; YTaO_{4}:Nb; YAlO_{3}:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); YOCl:Yb,Er; LnPO_{4}:Ce,Tb (Ln = lantánido o mezclas de lantánidos); LuVO_{4}:Eu; GdVO_{4}:Eu; Gd_{2}O_{2}S:Tb; GdMgB_{5}O_{10}:Ce,Tb; LaOBr:Tb; La_{2}O_{2}S:Tb; LaF_{3}:Nd,Ce; BaYb_{2}F_{8}:Eu; NaYF_{4}:Yb,Er; NaGdF_{4}:Yb,Er; NaLaF_{4}:Yb,Er; LaF_{3}:Yb,Er,Tm; BaYF_{5}:Yb,Er; Ga_{2}O_{3}:Dy; GaN:A (A = Pr, Eu, Er, Tm); Bi_{4}Ge_{3}O_{12}; LiNbO_{3}:Nd,Yb; LiNbO_{3}:Er; LiCaAlF_{6}:Ce; LiSrAlF_{6}:Ce; LiLuF_{4}:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); Li_{2}B_{4}O_{7}:Mn, SiO_{x}:Er,Al (0 \leq x \leq 2).

15. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se utiliza como material para las nanopartículas dil YVO_{4}:Eu, YVO_{4}:Sm, YVO_{4}:Dy, LaPO_{4}:Eu, LaPO_{4}:Ce, LaPO_{4}:Ce,Tb, LaPO_{4}:Ce,Dy, LaPO_{4}:Ce,Nd, ZnS:Tb, ZnS:TbF_{3}, ZnS:Eu, ZnS:EuF_{3}, Y_{2}O_{3}:Eu, Y_{2}O_{2}S:Eu, Y_{2}SiO_{5}:Eu, SiO_{2}:Dy, SiO_{2}:Al, Y_{2}O_{3}:Tb, CdS:Mn,
ZnS:Tb, ZnS:Ag o ZnS:Cu.

16. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se emplea para las nanopartículas dil material con una estructura de red cúbica para la red huésped.

17. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se emplea como material para las nanopartículas dil MgF_{2}:Mn; ZnS:Mn, ZnS:Ag, ZnS:Cu, CaSiO_{3}:Ln, CaS:Ln, CaO:Ln, ZnS:Ln, Y_{2}O_{3}:Ln, o MgF_{2}:Ln (Ln = lantánidos).

18. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el donor y/o el aceptor comprenden nanopartículas dil, que emiten la radiación electromagnética con un desplazamiento de Stockes o anti-Stockes tras una excitación energética con radiación electromagnética con longitudes de onda en el intervalo de la luz infrarroja, de la luz visible, de los UV, de la luz de rayos X o de la radiación \gamma o radiación de partículas como la radiación de electrones.

19. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el donor comprende nanopartículas dil y el aceptor está constituido por un material conductor, preferentemente de metal, especialmente el oro, la plata o el platino, por un óxido conductor, especialmente el óxido de indio y de estaño (ITO) o por un polímero conductor, que se presenta preferentemente en forma de partículas como nanopartículas o micropartículas o como superficies planas, opcionalmente estructuradas.

20. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque consiste en una prueba homogénea sin etapas de lavado ni de separación.

21. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la prueba es una inmunoprueba homogénea para la detección de, al menos, un analito, especialmente de, al menos, un anticuerpo monoclonal o policlonal, de una proteína, de un péptido, de un oligonucleótido, de un ácido nucleico, de un oligosacárido o de un polisacárido, de un hapteno o de un antígeno de bajo peso molecular, sintético o natural, de una muestra, especialmente de un frotis, de una expectoración, de una puntuación de órganos, de una biopsia, de secreciones, de líquidos, de bilis, de sangre, de líquido linfático, de orina y/o de heces.

22. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la superficie de la o de las nanopartículas dil se prepara de tal manera, que se puedan acoplar con la misma las moléculas de afinidad.

23. Prueba según la reivindicación 22, caracterizada porque la superficie de las nanopartículas dil está químicamente modificada y/o presenta grupos reactivos y/o moléculas de conexión, enlazadas de manera covalente o de manera no covalente, pudiendo presentar también, por su parte, las moléculas de conexión, enlazadas, grupos reactivos.

24. Prueba según la reivindicación 23, caracterizada porque los grupos reactivos son grupos amino, grupos de ácidos carboxílicos, tioles, tioéteres, disulfuros, imidazoles, guanidinas, grupos hidroxilo, indoles, dioles vecinales, aldehídos, grupos alfa-halógenoacetilo, N-maleimidas, organilos de mercurio, halogenuros de arilo, anhídridos de ácidos, isocianatos, isotiocianatos, halogenuros de ácidos sulfónicos, imidoésteres, diazoacetatos, sales de diazonio, 1,2-dicetonas, compuestos de carbonilo alfa-beta-insaturados, ácidos fosfónicos, ésteres del ácido fosfórico, ácidos sulfónicos, azoluros y derivados de los grupos citados.

25. Prueba según la reivindicación 23 o 24, caracterizada porque las moléculas de conexión son moléculas de ácido nucleico, derivados del ácido fosfónico, etilenglicol, alcoholes primarios, derivados de amina, polímeros o copolímeros, reactivos de copulación polimerizables, envolturas de sílice y moléculas en forma de cadena con una polaridad de sentido opuesto al de la superficie de las nanopartículas dil.

26. Prueba según la reivindicación 25, caracterizada porque los reactivos de copulación, polimerizables, son el diacetileno, el estirenobutadieno, el acetato de vinilo, los acrilatos, las acrilamidas, los vinilos, los estirenos, los óxidos de silicio, los óxidos de boro, los óxidos de fósforo, los boratos, los pirroles, los polipirroles y los fosfatos así como polímeros de al menos algunos de los agentes citados.

27. Prueba según las reivindicaciones 22 a 26, caracterizada porque las moléculas de afinidad son proteínas, péptidos, oligonucleótidos u otras moléculas de ácido nucleico, o moléculas similares al ácido nucleico, tales como las PNAs o los morfolinos, los oligosacáridos o los polisacáridos, los haptenos, tales como la biotina o la digoxina o los antígenos o los epitopos, sintéticos o naturales, de bajo peso molecular.

28. Prueba según las reivindicaciones 22 a 27, caracterizada porque las moléculas de afinidad pueden entrar en interacción con moléculas diana.

29. Prueba según la reivindicación 28, caracterizada porque la molécula diana es un enzima, un anticuerpo, una molécula enlazante del ácido nucleico, un ácido nucleico, un polinucleótido o morfolino.

30. Prueba según la reivindicación 29, caracterizad porque el enzima es la endonucleasa, la proteasa, la quinasa, la fosfatasa o un aminoácido o un enzima de modificación o de restricción del ácido nucleico.

31. Prueba según una de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizada porque los grupos de moléculas A y B son parte integrante de una misma molécula.

32. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los grupos de moléculas A y B pueden copularse con la misma molécula de afinidad.

33. Prueba según la reivindicación 31, caracterizada porque una interacción de la molécula de afinidad con la molécula diana tiene como consecuencia una variación de la distancia espacial entre los grupos de moléculas A y B.

34. Prueba según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se utiliza para la cuantificación de los ácidos nucleicos.

35. Prueba según una de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizada porque los grupos de moléculas A y B son parte integrante de moléculas diferentes.

36. Prueba según la reivindicación 35, caracterizada porque los grupos de moléculas A y B están copulados, respectivamente, con una molécula de afinidad propia.

37. Prueba según la reivindicación 36, caracterizada porque las moléculas de afinidad, asociadas con los grupos de moléculas A y B, son capaces de interaccionar de manera específica con la misma molécula diana.

38. Prueba según la reivindicación 37, caracterizada porque las moléculas de afinidad, asociadas con los grupos de moléculas A y B, son capaces de interaccionar específicamente entre sí.

39. Prueba según la reivindicación 37 o 38, caracterizada porque una interacción entre las moléculas de afinidad, asociadas con los grupos de moléculas A y B, con la molécula diana común o entre sí tiene como consecuencia una variación de la distancia espacial entre los grupos de moléculas A y B.

40. Procedimiento para detectar una molécula diana, que comprende las etapas que consisten en

-

la preparación de una prueba según una de las reivindicaciones 1 a 34,

siendo los grupos de moléculas A y B, en la prueba, parte integrante de una misma molécula y estando copulados con la misma molécula de afinidad, que es capaz de interaccionar con una molécula diana específica, y una interacción de este tipo provoca la variación de la distancia entre los grupos de moléculas A y B,

-

la adición de una muestra que contenga la molécula diana a ser detectada,

-

la excitación de la prueba con la muestra por medio de una fuente de radiación electromagnética o en estado de partículas,

-

la medición de la radiación electromagnética emitida por la prueba con la muestra,

siendo la intensidad o el espectro de la radiación electromagnética, emitida, o el desarrollo cronológico de la emisión de la radiación electromagnética, una medida de la cantidad de la molécula diana en la muestra.

41. Procedimiento para la detección de una molécula diana, que comprende las etapas constituidas por

-

la preparación de una prueba según una de las reivindicaciones 1 a 30 o 35 a 39,

siendo los grupos de moléculas A y B parte integrante de moléculas diferentes y

siendo capaces de interaccionar específicamente las moléculas de afinidad, asociadas con los grupos de moléculas A y B, con una misma molécula diana o siendo capaces de interaccionar entre sí específicamente las moléculas de afinidad, asociadas con los grupos de moléculas A y B,

y, en ambos casos, una interacción provoca una variación de la distancia entre los grupos de moléculas A y B,

-

la adición de una muestra que contiene una molécula diana a ser detectada,

-

la excitación de la prueba con la muestra por medio de una fuente de radiación electromagnética o en forma de partículas,

-

la medición de la radiación electromagnética emitida por la prueba con la muestra,

siendo la intensidad o el espectro de la radiación electromagnética emitida, o el desarrollo cronológico de la emisión de la radiación electromagnética, una medida de la cantidad de la molécula diana en la muestra.