ES2287610T3 - Metodo para la seleccion de celulas. - Google Patents

Abstract

Un método para la selección de células que producen un producto específico a partir de una mezcla de células, el cual comprende la determinación y la evaluación cuantitativa del rendimiento de producción individual de una célula fijada simple por medio del producto específico enriquecido en ésta, dicha determinación siendo realizada en la célula viable intacta, donde la fijación de la célula es efectuada de una manera sin contacto mediante una caja de campo electrostático, es decir dielectroforesis negativa; caracterizado porque el producto es localizado en la membrana de la célula, es decir es secretado, o es localizado afuera pero en estrecha cercanía de la célula, es decir pericelular.

Description

Método para la selección de células.

La invención se refiere a un método para la selección no invasiva de células vivas simples bajo condiciones suaves a partir de mezclas de células o cultivos de células con respecto a un rendimiento de producción específico. Con este fin, la concentración de sustancias producidas por las células individuales que se convierten en enriquecidas en la membrana celular, tal como los productos del gen reportero (GFP) o específicamente los productos secretados, tal como los anticuerpos, es determinada por métodos de detección microscópicos por fluorescencia.

Antecedentes de la invención

La citometría de flujo en combinación con la clasificación de células selectivas (FACS: Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia) es un método que se estableció hace más de 20 años. El mismo permite la rápida separación y clasificación de un gran número de células (tasas de clasificación de hasta 2000 células/s). Sin embargo, este ha sido predominantemente usado en el campo analítico (diagnósticos médicos). Becton Dickinson, Beckman Coulter o Cytomation ofrecen equipamiento tecnológico apropiado con opciones de clasificación de células lo que facilita al menos una operación antiséptica. Un proceso estéril o incluso de conformación GMP no puede ser asegurada y parece ser muy difícil de realizar también en el futuro. Para asegurar un alto rendimiento de la muestra, es requerido un sistema fluido que fluya rápidamente. Los esfuerzos cortantes que ocurren durante el paso de las células representan un deterioro masivo de las funciones celulares y claramente reducen la viabilidad en las aplicaciones preparativas y puede resultar en cambios largamente perdurables de la morfología celular, crecimiento y productividad u otras funciones específicas. En adición, las células seleccionadas son depositadas; una colección segura de células simples no parece ser realizable técnicamente para estos rendimientos de muestra.

Por otra parte, los sistemas de separación convencionales como los ensayos basados en la placa de microtitulación son conocidos en el arte (por ejemplo, WO 01/32844).

Las células pueden ser cultivadas mientras son embebidas en un medio viscoso (matriz semi-sólida). Mediante un ensayo de secreción, un producto secretado puede ser establemente precipitado en una nube estable alrededor de las células por medio de un sistema de detección acoplado de fluorescencia. Esta nube, la cual exhibe una fluorescencia más fuerte que aquella de las precedentes puede ser utilizada para una evaluación aproximada de las altas productoras. En un segundo paso, las células identificadas como altas productoras mediante un análisis de la imagen pueden ser eliminadas manualmente o automáticamente a través de un capilar de vidrio operado con un micromanipulador y cultivadas después (DE-A-10209788). Sin embargo, este método tiene desventajas relacionadas con la sensibilidad de la detección y un rendimiento de la muestra limitado debido al bajo potencial de automatización.

La compañía Norteamericana One-Cell Systems Inc, comercializa un método especial para la clasificación soportada en los FACS de micro-gotas de gel por FACS. Esto asegura al menos un proceso de selección por clasificación de células, el cual es combinado con la alta velocidad de clasificación de la tecnología FACS. Las células son incluidas en micro-gotas de gel teniendo diámetros de 20-100 \mum. Allí, las mismas secretan su producto, el cual es enlazado a una matriz de agarosa especial a través de un anticuerpo de captura específico del producto. En un segundo paso, el producto enlazado es detectado por un anticuerpo específico del producto marcado de fluorescencia, y el número de células es simultáneamente determinado debido a la localización (Figura Ib). La señal de fluorescencia puede ser usada para la clasificación de las gotas por medio de la tecnología FACS. Subsiguientemente, la matriz es disuelta otra vez, y las células son suspendidas.

En adición, existe también una posibilidad de aislar células que tienen una actividad secretoria específica mediante la separación inmuno-magnética (Miltenyi, Dynal Biotech, Polysciences). Sin embargo, este método tiene la desventaja de que no permite una cuantificación del rendimiento de la secreción y no muestra especificidad por la célula simple.

Finalmente, WO 02/45835 describe un montaje para la fijación de células usando una caja de campo electroestático.

Por lo tanto, existe aún la necesidad de un método que pueda mejorar las propiedades particulares de un cultivo de células, tal como el rendimiento de producción, mediante una selección bien apuntada de células simples y su subsiguiente cultivo adicional en dicho medio de cultivo.

Sumario de la invención

Ha sido encontrado ahora que la concentración del producto y por lo tanto el rendimiento sintético de una célula pueden ser determinados por la cuantificación de los productos expresados de la célula que se adhiere a la membrana celular y de los productos fluorescentes en la célula o membrana celular, por ejemplo, por métodos microscópicos de fluorescencia. Así, la invención se relaciona con un método para la selección de células que producen un producto específico a partir de una mezcla de células, el cual comprende la determinación y evaluación cuantitativa del rendimiento de producción individual de una célula fijada simple por medio del producto específico enriquecido en ésta, dicha determinación siendo realizada en la célula viable intacta, donde la fijación de la célula es efectuada de una manera sin contacto mediante una caja de campo electrostático, es decir dielectroforesis negativa, caracterizado porque el producto es localizado en la membrana de la célula, es decir es secretado, o es localizado afuera pero en estrecha cercanía de la célula, es decir pericelular. Como el método es realizado en la célula viable intacta, la célula se mantiene viable y puede posteriormente ser cultivada.

El método de acuerdo a la invención permite tanto la determinación del rendimiento sintético relativo (realización A) y, debido a la medición espectroscópica de fluorescencia, una determinación exacta y absoluta de la concentración (realización B) de la cual un rendimiento de producción específico absoluto puede ser derivado por una disposición experimental estandarizable y normalizable.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra una selección de la exploración por penetración de la célula del clon de la célula MHZ-2 (Figura lA) y MHZ-4 (Figura 1B).

Figura 2A: Medición comparativa de la formación de la envoltura por medio de la citometría de flujo, midiendo el antecedente de fluorescencia de MHZ-3; medición de FACS de las células no marcadas (MHZ-3).

Figura 2B: Medición de la fluorescencia específica del producto (MHZ-3); medición de FACS de las células del producto específicamente marcadas (MHZ-3);

en cada caso el ensayo de secreción con anti IgG-fab-RhGr de ratón, donde:

superior izquierdo: granularidad de la partícula en trazo de puntos contra tamaño de partícula

superior derecho: autofluorescencia en trazo de puntos contra tamaño de partícula

inferior: histograma de la intensidad de fluorescencia (azul: marcado; rojo: no-marcado)

altura FSC: tamaño de partícula relativo (dispersión hacia delante)

altura SSC: granularidad relativa de las partículas (dispersión de lado)

altura FL1: fluorescencia (canal 1) a 530 nm (BP 30) (excitación: 488/685 nm)

Figura 2C: Medición de la fluorescencia causada por eventos de enlace no específicos

Medición de FACS de las células no específicamente marcadas (MHZ-3) (ensayo de secreción con anti IgG-texas rojo de carnero)

Histograma de intensidad de fluorescencia (azul: marcado; rojo: no marcado)

altura FL2: fluorescencia (canal 2) a 585 nm (BP 42) (excitación: 488/685 nm)

La Figura 3 muestra preparaciones de células fijadas en para-formaldehído registradas con un microscopio de exploración láser confocal (568/590 nm) después de desarrollar el ensayo de secreción y super-impuestas en una imagen de microscopio óptico de transmisión.

La Figura 4 muestra mediciones comparativas de dos clones de hibridomas, MHZ-2 (Figura 4A) y MHZ-4 (Figura 4B). Las series de datos a mano derecha respectivamente muestran la distribución de las cantidades de las moléculas del producto para 50 células medidas, las series de datos a mano izquierda muestran señales de células no marcadas (señales precedentes).

Figura 5: Cultivo de células tratadas y seleccionadas del ensayo comparado con el cultivo de células seleccionadas solamente y control (si el ensayo no es tratado ni seleccionado) durante 168 h bajo condiciones de cultivo estándares como se describió (n = 3).

Descripción detallada de la invención

En el método de acuerdo a la invención, el producto está localizado en la célula, es decir en la membrana de la célula (secretado) o fuera pero en estrecha cercanía de la célula (pericelular). Estas diferentes localizaciones del producto son ilustradas con más detalles en el siguiente dibujo:

100

Fenómeno de fluorescencia con diferentes localizaciones celulares: solamente intracelular (A), intracelular y enlace a la membrana (B), solamente enlace a la membrana (C), y pericelular (D).

La determinación del rendimiento de producción puede ser efectuada mediante el microscopio óptico o mediante métodos espectroscópicos de fluorescencia. Un aspecto importante del método de acuerdo a la invención es el hecho de que la determinación es realizada mientras la célula es fijada (en lo adelante referida como "inmovilizada"). Luego, a partir del rendimiento de producción detectado, una clasificación puede ser inmediatamente realizada a través de valores de umbral definidos en las células a ser seleccionadas y las células no seleccionadas.

Mediante el método de acuerdo a la invención, el producto seleccionado de las proteínas, glicósidos y derivados y productos de combinación de estas clases de sustancias etc. puede ser determinado. Los productos son preferiblemente seleccionados de las proteínas y péptidos, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, citocinas etc., así como derivados glicosilatados de las proteínas y péptidos o derivados proporcionados con marcadores detectables o con dominios fluorescentes. En el método de acuerdo a la invención, el producto puede ser expresado por una célula primaria o como una consecuencia de una manipulación de la célula, es decir, células primarias (es decir, células no manipuladas) o transformantes pueden ser empleados. En el método de acuerdo a la invención, el producto puede ser directamente detectable y, en particular, puede tener un dominio que puede ser detectado por microscopia o espectroscopia de fluorescencia, o puede ser indirectamente detectable mediante el acomplejamiento con un compuesto detector, especialmente un anticuerpo marcado de fluorescencia.

El método de acuerdo a la invención puede comprender adicionalmente un paso de selección en el cual la mezcla de células es preferiblemente guiada a través de un sistema microfluido. En este caso, es preferido que las células individuales sean identificadas como tal a partir de un movimiento del flujo en el sistema microfluido, selectivamente detenidas y medidas mediante el monitoreo continuo de su rendimiento de secreción. De acuerdo a la invención la inmovilización (fijación) de la célula es efectuada de una manera sin contacto mediante una caja de campo electroestático (por ejemplo, por dielectroforesis negativa).

En una realización preferida adicional del método de acuerdo a la invención, el producto en sí mismo puede ser fluorescente y su concentración derivada de la señal de fluorescencia medida. Alternativamente, el producto puede ser cuantificado por la formación del complejo a través de la interacción receptor-ligando, la formación del complejo siendo detectable por espectroscopia de fluorescencia y permitiendo una determinación de la concentración del producto. La formación del complejo es preferiblemente efectuada por una interacción antígeno-anticuerpo que puede ser detectado por espectroscopia de fluorescencia y permite la determinación de la concentración relativa del producto.

El rendimiento de producción específico absoluto (realización B de la invención) puede entonces ser determinado ajustando la concentración relativa del producto con el resultado obtenido en la disposición estandarizada. Las células seleccionadas en el método de acuerdo a la invención pueden ser selectivamente separadas de la corriente de muestra por desviación en un canal ramificado y recogidas en un sistema de cultivo apropiado. Esta desviación en un canal ramificado es preferiblemente efectuada abriendo las compuertas/conductos electroestáticos. La desviación de las células (alta producción) es efectuada estableciendo un valor de umbral específico (que puede variar dependiendo de la capacidad de expresión del tipo de célula etc. y es determinada por el experto en el arte). El hecho de que la colección de las células seleccionadas pueda ser efectuada de una manera estéril es una característica técnica remarcable del método de acuerdo a la invención.

El cultivo de las células es preferiblemente efectuado en un sistema de cultivo el cual es optimizado para el cultivo de células simples o unas cuantas células (para células de mamíferos, por ejemplo, células humanas, murinas y bovinas (primarias, transformadas y/o inmortalizadas)), siendo optimizado por la suplementación, condiciones seleccionadas o formulación especial. El sistema de cultivo puede ser miniaturizado, lo que significa que el volumen de cultivo es reducido. Además, el medio de cultivo puede ser soportado usando una matriz extracelular artificial o biogénica.

El método de acuerdo a la invención es particularmente apropiado para la identificación y selección de células simples que tienen un alto rendimiento de producción o rendimiento secretor y/o optimización de los procesos basados en cultivos de células. Las células simples seleccionadas (separadas) obtenidas por el método de la invención muestran un excelente comportamiento de crecimiento comparable con las células de partida.

La invención es además ilustrada por los siguientes Ejemplos los cuales sin embargo, no pretenden, limitar el alcance de la invención.

Ejemplos Materiales y Métodos

Ensayo: La preparación de las células para el sistema Cytocon en combinación con una medición FCS+ plus fue efectuada por los siguientes pasos:

Eliminar el sobrenadante de las células y determinar el conteo de célula (viabilidad) con el Coulter Z2;

adicionar 1 x 10^{6} células viables a 15 ml de Falcon + 10 ml de PBS y centrifugar a 100 x g durante 10 min;

descargar el sobrenadante excepto un volumen residual mínimo y resuspender la esfera en 5 \mul de RhGr-Fab e incubar a 37 ºC durante 30 min;

adicionar 10 ml de PBS, resuspender y centrifugar a 100 x g durante 10 min;

eliminar el sobrenadante, recoger la esfera en 2 ml de buffer Cytocon II (1:4) llenar la jeringa de inyección (100 \mul).

Líneas celulares: Para los experimentos de selección dentro del alcance de un estudio de factibilidad, dos líneas celulares fueron seleccionadas las que son de importancia en los procesos de producción del Solicitante y por lo tanto han sido caracterizados comprehensivamente (MHZ-2; MHZ-4). Para las mediciones por citometría de flujo, la línea celular MHZ-3 fue empleada. Las líneas celulares MHZ usadas en los procesos de selección descritos abajo son la línea celular de hibridoma de origen del ratón. Las mismas fueron optimizadas por sub-clonación repetida y bien caracterizadas para las tasas de producción y estabilidad clonal. Las mismas son apropiadas para la producción de un anticuerpo monoclonal específico a escala industrial. El anticuerpo secretado es una inmunoglobulina monoclonal de ratón del tipo IgG. En un cultivo de mantenimiento clásico (10^{3} - 10^{6} células/ml) para MHZ-2, los rendimientos de producción son 5-50 ng por 1000 células por día. Esto corresponde a una tasa de producción de IgG específica de 60-600 moléculas por células por s.

En un cultivo de línea celular, las productividades para los clones de células empleados fueron estimadas y basadas en 1-4.10^{7} células/ml del volumen de cultivo. Las concentraciones del producto fueron determinadas por ELISA anti-Fcy específico de ratón.

MHZ-2 40-100 \mug/día

MHZ-4 400-800 \mug/día

La productividad de MHZ-4 es mayor por un factor de hasta 10 comparada con aquella del MHZ-2.

Sistema de detección: Dentro del alcance del estudio de factibilidad, fueron probados varios sistemas de detección para el desarrollo de los ensayos en series de mediciones comprehensivas. Estos fueron los conjugados de anticuerpo comercialmente disponibles para microscopia por inmuno-fluorescencia (IgG texas rojo), proteína A y proteína G recombinante bacteriana, y un producto de escisión de un anticuerpo IgG, una preparación f(ab).

Ejemplo 1 Cuantificación del rendimiento de la secreción mediante exploración por penetración por medio de la capa precipitada

La cuantificación del rendimiento de la secreción fue llevada a cabo midiendo la capa precipitada la cual forma alrededor una célula después de un período de incubación definido. (Junto con las moléculas del producto, las moléculas de detección forman una capa precipitada que rodea la célula y cuya intensidad corresponde a la cantidad del producto secretado. La medición del fenómeno de fluorescencia vinculado a la célula permite una determinación de la tasa de producción específica de la célula). La determinación de la concentración del producto fue realizada, en términos de tecnología de medición, tanto mediante espectroscopia de fluorescencia por medio de la técnica de penetración, pero también mediante espectroscopia de fluorescencia a través de un método de imágenes. Las señales de medición de la capa precipitada fluorescente fueron esencialmente mayores y pueden ser detectadas sin dificultad con el sistema de detección probado. Este método de imágenes proporcionó una velocidad sustancial del proceso de secreción y un método de evaluación simple y seguro. Sin embargo, el mismo no permitió la determinación de la concentración absoluta, sino
meramente una clasificación relativa de las células debido a la evaluación de la brillantez de la imagen o del objeto.

Las células teñidas de acuerdo al protocolo de ensayo estandarizado (2 clones de células de hibridoma) mostraron una fluorescencia específica del producto en forma de una capa. La intensidad de la formación de la capa fue proporcional al rendimiento de secreción actual (medición del producto secretado en el sobrenadante del cultivo de diferentes clones). Con el progreso del tiempo de incubación, la formación de la capa aumentó. Después de detener el tiempo de incubación por el proceso de lavado, esta se mantuvo en un nivel constante por encima de 80 min. Después de un ensayo de secreción, las células mostraron un claro e individualmente distinguible fenómeno de fluorescencia. Puede ser localizada predominantemente siendo extracelular y de enlace a la membrana. Sin embargo, puede también aparecer dimensionalmente doble o granularmente en el citoplasma, como con MHZ-4. La formación de la capa específica y su fluorescencia diferencial fueron detectadas en exploraciones por penetración (Figuras lA y B), en un examen mediante citometría de flujo (FACS; ver Figura 2A-C) y en un microscopio de exploración láser confocal (LSM; ver Figura 3). Las células mostraron una fluorescencia intrínseca. Esto puede ser distinguido a partir de la fluorescencia específica mediante el establecimiento de un valor de umbral.

En la caja de campo, fueron observados artefactos los que tenían una apariencia granular. Esto fue debido a la naturaleza de la dielectroforesis negativa en la caja de campo. Todos los tipos de partículas fueron enriquecidas en la zona de la caja (por ejemplo, también los despojos de las células teñidas y los agregados de prueba) y adheridas a la superficie de la célula. Esto no interfirió con el método de medición y no tuvo influencia en la viabilidad de las células.

Análisis de los datos: Para MHZ-2 y MHZ-4, un ruido de fondo de hasta 10,000 y 50,000 ligandos/célula, respectivamente, fue obtenido a partir de la fluorescencia intrínseca de las células.

Señales de secreción específicas oscilaron desde 10,000 a 50,000 y 50,000 a 200,000 ligandos/célula, respectivamente (ver Figuras 4A y 4B). Una selección de alta productora fue efectuada para MHZ-Z a valores de alrededor de 30,000 y para MHZ-4 a valores de alrededor de 100,000 ligandos/célula.

A partir de mediciones comparativas de ELISA de los sobrenadantes del cultivo establecido de los dos clones seleccionados (anti-Fcy específico de ratón), las siguientes productividades fueron determinadas:

MHZ-2 40-100 \mug/día

MHZ-4 400-800 \mug/día

De acuerdo a esto, la productividad del MHZ-4 fue mayor que aquella del MHZ-2 casi por un factor de 10. Este resultado fue confirmado por el pequeño número de células medidas aquí.

Ejemplo 2 Colección de las células seleccionadas y detección del crecimiento de los clones

Para investigar la capacidad de sub-cultivación y la estabilidad de la productividad mejorada después del proceso de selección los depósitos de las células seleccionadas fueron mantenidos en cultivo durante largo término. Una mezcla de D-MEM/HAMs F-12 (1:1) suplementada con 10% (v/v) de suero fetal de ternero (FCS) y frascos T convencionales fueron usados para el cultivo de las células.

Comportamiento del crecimiento

Células simples seleccionadas de acuerdo al método del Ejemplo 1 fueron depositadas bajo condiciones estériles en placas de 96 cavidades. En los experimentos repetitivos fue mostrado que las células simples pueden ser depositadas en cavidades simples de una placa de 96 cavidades en un volumen de cultivo de 50 \mul con gran precisión.

Se probó que la aplicación del ensayo de secreción en combinación con la deposición de la célula simple era un proceso de tratamiento suave. El comportamiento del crecimiento de las diferentes poblaciones de células tratadas fue probado en varios experimentos de cultivo. El crecimiento de las células tratadas por el ensayo de exploración y/o el proceso de selección fue comparado con las células no tratadas en depósitos de 1,000 o 100 células usando una placa de 24 cavidades y un volumen de cultivo de 1 ml durante 168 h (Fig. 5 A, B).

Al usar 1,000 células por ml se observó un crecimiento reducido de alrededor de un tercio para las células completamente tratadas. Usando 100 células por ml una concentración de células vitales reducida de 5 x l0^{5} comparado con 6 x 10^{5} para las de control no tratadas fue observada.

Sorprendentemente, las células tratadas mostraron una viabilidad aumentada de 92% comparado con 82% en las de control no tratadas después de un tiempo de cultivo de 300 h. Este experimento (crecimiento) del cultivo mostró que las células seleccionadas y depositadas de acuerdo al método descrito anteriormente poseen un comportamiento de crecimiento comparable a aquel de las células conducidas por los métodos de pipeteo convencionales. Los experimentos de crecimiento muestran además un número de células y fases de retardo iniciales comparables con el final del período de cultivo.

Estabilidad del cultivo mejorado después del proceso de selección en cultivos de largo término: Las células fueron seleccionadas usando un dispositivo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, FACS Vantage, BD Bioscience). Primeramente, una parte de la suspensión de células homogénea MHZ-2 (marcada como se describió) fue separada en base a la distribución de la intensidad de fluorescencia. Las intensidades de fluorescencia fueron distribuidas en dos decenios. Un umbral (compuerta, P3) fue definido en la vuelta 200 de la intensidad más baja. Las células de mayor intensidad de fluorescencia fueron clasificadas y depositadas por el dispositivo de clasificación FACS. En dos sesiones 8,700 y 25,200 células fueron preparadas como "altas productoras" (Fig. 5). Una parte de las células de las "bajas productoras" no seleccionadas fue cultivada como control negativo.

La productividad específica fue cuantificada por ELISA y la enumeración de las células en los sobrenadantes de las alícuotas del cultivo después de un corto período de cultivo de 7 días. Al final del cultivo a largo plazo de 71 días (correlacionados a los duplicados de célula 44 y 47 en el cultivo de referencia) la productividad específica fue cuantificada por segunda vez. No se observó ningún aumento en la productividad del depósito de células "altas productoras" expandido. La proporción de la productividad entre bajas y altas productoras fue constante durante el período de cultivo.

Claims (9)

1. Un método para la selección de células que producen un producto específico a partir de una mezcla de células, el cual comprende la determinación y la evaluación cuantitativa del rendimiento de producción individual de una célula fijada simple por medio del producto específico enriquecido en ésta, dicha determinación siendo realizada en la célula viable intacta, donde la fijación de la célula es efectuada de una manera sin contacto mediante una caja de campo electrostático, es decir dielectroforesis negativa;

caracterizado porque el producto es localizado en la membrana de la célula, es decir es secretado, o es localizado afuera pero en estrecha cercanía de la célula, es decir pericelular.

2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, donde:

(i)

la determinación del rendimiento de producción es efectuado por microscopia óptica o por espectroscopia de fluorescencia; y/o

(ii)

la determinación es efectuada con fijación de la célula; y/o

(iii)

la evaluación y una clasificación es inmediatamente realizada a partir del rendimiento de producción determinado a través de valores de umbral definidos en las células seleccionadas y de las células no seleccionadas.

3. El método de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, donde:

(i)

el producto es seleccionado de las proteínas, glicósidos y derivados y productos de combinación de estas clases de sustancias y es preferiblemente seleccionado de las proteínas y péptidos, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, citocinas, así como derivados glicosilatados de las proteínas y péptidos o derivados proporcionados con marcadores detectables o con dominios fluorescentes; y/o

(ii)

el producto es expresado por una célula primaria o como una consecuencia de una manipulación de la célula; y/o

(iii)

el producto es directamente detectable y, en particular, tiene un dominio que puede ser detectado por microscopia o espectroscopia de fluorescencia, o es indirectamente detectable mediante el acomplejamiento con un compuesto detector, especialmente un anticuerpo marcado de fluorescencia.

4. El método de acuerdo a una o más de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho método comprende adicionalmente un paso de selección en el cual preferiblemente la mezcla de células es guiada a través de un sistema microfluido.

5. El método de acuerdo a la reivindicación 4, donde

(i)

las células individuales son identificadas como tal a partir de un movimiento del flujo en el sistema microfluido, selectivamente detenidas y medidas mediante el monitoreo continuo de su rendimiento de secreción; y/o

(ii) la fijación de la célula es efectuada por la interrupción del movimiento del fluido del sistema microfluido.

6. El método de acuerdo a la reivindicación 4 o 5, donde las células a ser seleccionadas son selectivamente separadas de la corriente de muestra por desviación en un canal ramificado y recogidas en un sistema de cultivo apropiado.

7. El método de acuerdo a reivindicación 6, donde

(i)

dicha desviación en un canal ramificado es preferiblemente efectuada abriendo las compuertas/conductos electroestáticos; y/o

(ii)

la recogida de las células seleccionadas es efectuada de manera estéril.

8. El método de acuerdo a la reivindicación 6, donde

(i)

el sistema de cultivo ha sido miniaturizado y el volumen de cultivo reducido; y/o

(ii)

el sistema de cultivo es optimizado para cultivar células simples o unas cuantas células por suplementación, condiciones seleccionadas o formulación especial; y/o

(iii)

el medio de cultivo es soportado usando una matriz extracelular artificial o biogénica.

\newpage

9. El método de acuerdo a una o más de las reivindicaciones 1 a 8 el cual es apropiado para la identificación de células que tienen un alto rendimiento de producción de acuerdo a una clasificación por valores de umbral definidos o el rendimiento de la secreción y/o la optimización de los procesos de producción basados en los cultivos de células.