ES2288034T3

ES2288034T3 - Modificacion de betacelulina.

Info

Publication number: ES2288034T3
Application number: ES99959698T
Authority: ES
Inventors: Takashi Ito; Mitsuyo Kondo; Yoko Tanaka; Masayuki Kobayashi; Koichi Igarashi; Reiko Sasada; Osamu Nishimura
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: DE69936666D1; US6825165B1; EP1148129A1; CA2353909C; EP1148129B1; DE69936666T2; AU1681100A; EP1148129A4; WO2000034478A1; PT1148129E; DK1148129T3; CY1106882T1; CA2353909A1; ATE368111T1

Abstract

Una muteína de betacelulina, o una de sus sales, donde se preserva la actividad promotora de la diferenciación de células a pancreáticas, y se reduce la actividad promotora del crecimiento de células epiteliales; y donde pueden estar deleteados 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de la betacelulina, y donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido del terminal C de la betacelulina, incluyendo el Leu, en 3 del terminal C, han sido deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos, donde la betacelulina es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35.

Description

Modificación de betacelulina.

Campo técnico

La presente invención se relaciona con muteínas (de aquí en adelante, a veces denominadas "moléculas mutadas") que tienen menos actividad promotora del crecimiento celular epitelial (actividad EGF), por ejemplo, para células del músculo liso, y a la vez, que preservan actividad en la diferenciación de betacelulina (BTC) en células \beta pancreáticas (actividad BTC); y además, con un método para su elaboración, etc.

Técnica anterior

La betacelulina humana es un factor de proteína que consiste en 80 aminoácidos cortados de un precursor que consiste en 178 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos entera ha sido identificada (Sasada y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190: 1173 (1993)). La betacelulina endógena aparece en cantidades extremadamente diminutas, y es difícil obtenerla. Sin embargo, se ha revelado un método para la elaboración mediante el uso de una técnica de la ingeniería genética, en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H6-87894, etc. La betacelulina se descubrió en primer lugar como un factor que tiene actividad promotora del crecimiento celular 3T3 de ratón, y posteriormente, se halló que posee actividad promotora del crecimiento celular epitelial pigmentario retiniano y de células del músculo liso vascular (actividad EGF) (Shing y col., Science, 259: 1604 (1993)). Además, la betacelulina actúa sobre células no diferenciadas pancreáticas para favorecer su diferenciación en células \beta pancreáticas que producen insulina (actividad BTC) (Mashima y col., J. Clinic. Invest., 97: 1647 (1996)), y por lo tanto, se considera potencialmente útil como agente profiláctico y terapéutico para la diabetes (tal como diabetes insulinodependiente), y también, para la disfunción pancreática y afecciones similares asociadas con diabetes (Miyagawa y col., Abstracts of the 1997 Japan Diabetes Association Conference, 125).

Sin embargo, ante el hecho de que la betacelulina posee tal actividad promotora del crecimiento celular epitelial pigmentario retiniano y de células del músculo liso vascular, estas actividades han demostrado ser un problema en aplicaciones como agente terapéutico para la diabetes.

Por lo tanto, el potencial de dichos agentes farmacéuticos podría mejorarse si la actividad promotora del crecimiento de células del músculo liso vascular y similares pudiera reducirse, y a la vez, pudiera preservarse la acción en el favorecimiento de la diferenciación de células \beta pancreáticas. No obstante, hasta la fecha, no se conocen dichas muteínas de betacelulina.

Descripción de la invención

Como consecuencia de la vasta investigación de muteínas de betacelulina, los inventores perfeccionaron la presente invención, sobre el descubrimiento y la investigación adicional de muteínas en las cuales las mutaciones de betacelulina permitieran la reducción de la actividad promotora del crecimiento del músculo liso vascular y similares, y a la vez, preservaran la actividad promotora de la diferenciación de células \beta pancreáticas, sin problemas relacionados con la antigenicidad, al administrarse al organismo. Esto es, la presente invención se relaciona con muteínas de betacelulina; con un método para la obtención de dichas muteínas, y similares.

En consecuencia, la presente invención se relaciona con:

1. Una muteína de betacelulina, o una de sus sales, donde se preserva la actividad promotora de la diferenciación de células \beta pancreáticas, y se reduce la actividad promotora del crecimiento de células epiteliales; y donde pueden estar deleteados 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de la betacelulina, y donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido del terminal C de la betacelulina, incluyendo el Leu, en 3 del terminal C, han sido deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos, donde la betacelulina es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35.

2. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con el punto 1 anterior, donde la relación de la actividad promotora de la diferenciación de células \beta pancreáticas a la actividad promotora del crecimiento de células epiteliales es por lo menos el doble, en relación con aquella de la betacelulina.

3. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con el punto 1 anterior, donde se han deleteado 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de la betacelulina.

4. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con el punto 1 anterior, que consiste en: (1) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; (2) una secuencia de aminoácidos en la cual se han deleteado 1 a 30 aminoácidos del terminal N en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; (3) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2; o (4) una secuencia de aminoácidos en la cual se han deleteado 1 a 30 aminoácidos del terminal N en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID
NO: 2.

5. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con el punto 1 anterior, que consiste en: (1) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3; o (2) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4.

6. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con el punto 1 anterior, que consiste en: (1) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37; o (2) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38.

7. Una muteína de betacelulina o una de sus sales, donde se preserva la actividad promotora de la diferenciación de células \beta pancreáticas, y se reduce la actividad promotora del crecimiento de células epiteliales; y donde se han deleteado 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de la betacelulina, y donde se han insertado 1 a 5 residuos de aminoácidos entre los residuos de aminoácidos nros. 22 y 23 del terminal C de la betacelulina, donde la betacelulina es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:
35.

8. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con el punto 7 anterior, que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44.

9. Un método para la elaboración de una muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 8 anteriores, caracterizado por el cultivo de los transformantes que han sido transformados con vectores recombinados que contienen ADN codificador de la muteína de betacelulina de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 8 anteriores, a fin de producir dicha muteína de betacelulina.

10. Una composición farmacéutica que comprende una muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 8 anteriores.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 10 anterior, donde la composición consiste en fármacos profilácticos o terapéuticos para la diabetes.

12. El uso de una muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 8 anteriores, en la elaboración de un agente profiláctico o terapéutico para la diabetes.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la construcción de un plásmido de expresión para betacelulina de 77 residuos (con tres residuos C terminales deleteados).

La Figura 2 ilustra la construcción de un plásmido de expresión para betacelulina de 76 residuos (con cuatro residuos C terminales deleteados).

La Figura 3 ilustra los resultados de la electroforesis de muteínas de betacelulina en el Ejemplo 7.

La Figura 4 ilustra los resultados de la absorción celular de ^{3}H-timidina del Ejemplo 8.

La Figura 5 ilustra los microgramas fluorescentes para células diferenciadas en células \beta del Ejemplo 9.

La Figura 6 ilustra los resultados para la actividad promotora de la diferenciación de células \beta del Ejemplo 12.

La Figura 7 ilustra la construcción de un plásmido de expresión para betacelulina de 2-76 residuos (con un residuo N terminal y cuatro residuos C terminales deleteados).

La Figura 8 ilustra la construcción de un plásmido de expresión para betacelulina de 24-76 residuos (con veintitrés residuos N terminales y cuatro residuos C terminales deleteados).

La Figura 9 ilustra los resultados de la tinción de gel luego de la electroforesis del Ejemplo 19; y

la Figura 10 ilustra un esquema de la construcción del plásmido pTB1976 del Ejemplo de Referencia 1.

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Mejor modo de llevar a cabo la invención

Como se describe con anterioridad, las muteínas de betacelulina de la presente invención tienen menor o atenuada actividad EGF, y a la vez, preservan actividad BTC intacta.

De acuerdo con este documento, el término "betacelulina" significa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la siguiente: SEQ ID NO: 35, como se describe en la referencia de Sasada y col.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 190: 1173 (1993)).

1

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Las muteínas de betacelulina con actividad BTC intacta son aquellas que tienen por lo menos 20%, y preferentemente, por lo menos 50%, de la actividad BTC de betacelulina.

Las muteínas de betacelulina con menor actividad EGF son aquellas que tienen menos o igual al 20%, y preferentemente, menos o igual al 15%, de la actividad EGF de betacelulina.

Ejemplos de muteínas de betacelulina con menor actividad EGF y actividad BTC intacta de la presente invención, preferentemente, incluyen muteínas de betacelulina, o sus sales, en las cuales la relación de la actividad promotora de la diferenciación de células \beta pancreáticas a la actividad promotora del crecimiento celular epitelial es por lo menos el doble, en relación con la de betacelulina.

Ejemplos específicos de muteínas de betacelulina con menor actividad EGF y actividad BTC intacta de la presente invención incluyen muteínas de betacelulina, o sus sales, en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos pueden estar deleteados del terminal N de la betacelulina; y donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido del terminal C, incluyendo el Leu en 3 del terminal C, han sido deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos. Ejemplos más específicos incluyen las muteínas de betacelulina mencionadas anteriormente, o similares, en las cuales 1 a 30 ó 1 a 20 residuos de aminoácidos han sido deleteados del termi-
nal N.

La mencionada "sustitución" con otros residuos de aminoácidos, indicada en la expresión "muteínas de betacelulina en las cuales los residuos están sustituidos con otros residuos de aminoácidos" puede hacer referencia a cualquier tipo de residuo de aminoácido, siempre que la sustitución no comprometa el rasgo característico de la muteína de betacelulina que logra "menor actividad EGF y actividad BTC intacta". Ejemplos específicos de "otros aminoácidos", como se mencionan con anterioridad, incluyen aminoácidos no polares (hidrófobos) (tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina); aminoácidos polares (neutros) (tales como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina); aminoácidos con una carga positiva (básicos) (tales como arginina, lisina e histidina); y aminoácidos con una carga negativa (ácidos) (tales como ácido aspártico y ácido glutámico).

Los que siguen son ejemplos específicos de muteínas de betacelulina en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos pueden estar deleteados del terminal N de la betacelulina, y 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido del terminal C, incluyendo el Leu en 3 del terminal C, han sido deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos.

(1) Muteínas de betacelulina que tienen la siguiente secuencia de aminoácidos, hasta la posición nº 76 del terminal N de betacelulina:

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2

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donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido (Asp Leu Phe Tyr) del terminal C, incluyendo el Leu en 3 del terminal C, han sido deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos u otras cadenas peptídicas, tales como:

((1)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2:

3

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((2)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1:

4

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((3)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8:

5

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((4)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 9:

6

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((5)) muteínas de betacelulina en las cuales el residuo de aminoácido en 3 (Leu) del terminal C de betacelulina está sustituido con otro residuo de aminoácido.

De las anteriores, las muteínas de betacelulina con las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs.: 1 y 2 son particularmente preferidas.

(2) Proteínas de betacelulina en las cuales los residuos de aminoácidos nros. 1 a 30 pueden estar deleteados del terminal N de betacelulina:

7

donde la muteína tiene la siguiente secuencia de aminoácidos del residuo nº 41 al residuo nº 76 del terminal N:

8

y donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido (Asp Leu Phe Tyr) del terminal C, incluyendo el Leu en 3 del terminal C, están deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos, preferentemente:

(i) muteínas de betacelulina en las cuales el primer residuo de aminoácido (Asp) del terminal N de betacelulina puede estar deleteado, donde la muteína tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de los residuos n^{os} 2 a 76 del terminal N:

9

y donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido (Asp Leu Phe Tyr) del terminal C, incluyendo el Leu en 3 del terminal C, están deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos;

(ii) muteínas de betacelulina en las cuales los residuos de aminoácidos n^{os} 1 a 23 del terminal N de betacelulina pueden estar deleteados:

10

donde la muteína tiene la siguiente secuencia de aminoácidos del residuo nº 24 al residuo nº 76 del terminal N:

11

y donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido (Asp Leu Phe Tyr) del terminal C, incluyendo el Leu en 3 del terminal C, están deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos u otras cadenas peptídicas; preferentemente:

((1)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4:

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((2)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3:

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((3)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 13:

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((4)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14:

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((5)) muteínas de betacelulina en las cuales el tercer residuo de aminoácidos del terminal C (Leu) en péptidos parciales representados por la secuencia de aminoácidos desde 31 hasta 80 del terminal N de betacelulina está sustituido con otro residuo de aminoácido;

((6)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37:

17

((7)) muteínas de betacelulina que tienen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38:

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Entre éstas, se prefieren las muteínas de betacelulina con secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 3; 4; 37 y 38. Las muteínas de betacelulina con secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID Nos: 37 y 38 son las más preferidas. Son de mayor preferencia las muteínas de betacelulina con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38.

Entre los ejemplos preferidos de muteínas de betacelulina de la presente invención proporcionados en los puntos (1) y (2) anteriores, los ejemplos especialmente preferidos incluyen muteínas de betacelulina con ((1)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; ((2)) una secuencia de aminoácidos en la cual 1 a 30 aminoácidos del terminal N han sido deleteados en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; ((3)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2; ((4)) una secuencia de aminoácidos en la cual 1 a 30 aminoácidos del terminal N han sido deleteados en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2; ((5)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37; y ((6)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38.

Especialmente preferidas son las muteínas de betacelulina con ((1)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; ((2)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2; ((3)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3; ((4)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4; ((5)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37; y ((6)) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38. Son en particular preferidas las muteínas de betacelulina con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38.

Ejemplos específicos de muteínas de betacelulina de la presente invención, que tienen menor actividad EGF y actividad BTC intacta, incluyen muteínas de betacelulina o sus sales, en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de betacelulina han sido deleteados, y se han insertado 1 a 5 residuos de aminoácidos entre los residuos de aminoácidos n^{os} 22 y 23 del terminal C.

Ejemplos específicos de "aminoácidos" en "muteínas de betacelulina en las cuales se han insertado dichos residuos de aminoácidos" incluyen aminoácidos no polares (hidrófobos) (tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina); aminoácidos polares (neutros) (tales como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina); aminoácidos con una carga positiva (básicos) (tales como arginina, lisina e histidina); y aminoácidos con una carga negativa (ácidos) (tales como ácido aspártico y ácido glutámico). Se prefieren asparagina, prolina y serina. Ejemplos específicos de "cadenas peptídicas" mencionadas con anterioridad se refieren a cadenas peptídicas de dos a cinco de dichos "aminoácidos" unidos, y preferentemente, comprenden cadenas peptídicas que consisten en 2 a 4 residuos de aminoácidos.

Ejemplos de "betacelulina en la cual 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N pueden estar deleteados" incluyen: (1) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 35 mencionada; (2) muteínas de betacelulina en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N han sido deleteados; y (3) muteínas de betacelulina en las cuales se han insertado residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1 a 5 residuos de aminoácidos) en la secuencia de aminoácidos del residuo nº 1 al residuo nº 30 del terminal N de betacelulina.

Las "muteínas de betacelulina en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N han sido deleteados" incluyen: 1) aquellas en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de betacelulina han sido deleteados; y 2) aquellas en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de betacelulina han sido deleteados, y se han agregado otros residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1 a 5 residuos de aminoácidos).

Las "muteínas de betacelulina en las cuales 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N pueden estar deleteados, y se han insertado 1 a 5 residuos de aminoácidos entre el residuo de aminoácido nº 22 del terminal C (es decir, Gln, el residuo de aminoácido nº 58 del terminal N en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35) y el residuo de aminoácido nº 23 (es decir, Thr, el residuo de aminoácido nº 59 del terminal N en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35)" deben ser muteínas de betacelulina en las cuales algunos de 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de betacelulina pueden estar deleteados, y se han insertado 1 a 5 residuos de aminoácidos entre los residuos de aminoácidos n^{os} 22 y 23 del terminal C. Ejemplos específicos
incluyen:

((1)) muteínas de betacelulina en las cuales los residuos de aminoácidos n^{os} 1 a 30 del terminal N de betacelulina han sido deleteados:

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y se han insertado 1 a 5 residuos de aminoácidos entre los residuos de aminoácidos n^{os} 22 y 23 del terminal C; por ejemplo, una muteína de betacelulina con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44:

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Ejemplos preferidos de "muteínas de betacelulina" de la presente invención incluyen las muteínas de betacelulina que tienen una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44.

De acuerdo con la manera convencional para la designación de péptidos, el terminal izquierdo de las muteínas de betacelulina en la presente memoria descriptiva se denomina el terminal N (amino terminal), y el terminal derecho se denomina el terminal C (carboxilo terminal). El terminal C de estas muteínas de betacelulina habitualmente es un grupo carboxilo (-COOH) o carboxilato (-COO), si bien el terminal C también puede ser una amida (-CONH_{2}) o un éster (-COOR). Ejemplos de R en dichos ésteres incluyen grupos alquilo C_{1-6} tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo o n-butilo; grupos cicloalquilo C_{3-8}, tales como ciclopentilo y ciclohexilo; grupos arilo C_{6-12}, tales como fenilo y \alpha-naftilo; fenil-alquilosC_{1-2}, tales como bencilo, fenetilo y benzhidrilo; o grupos aralquilo C_{7-14} tales como \alpha-naftilo-alquilosC_{1-2} tales como grupos \alpha-naftilmetilo y pivaloiloximetilo.

Las muteínas de betacelulina de la presente invención incluyen aquellas con Met agregado al terminal N.

Ejemplos de sales de las muteínas de betacelulina de la presente invención incluyen sales con bases (por ejemplo, metales alcalinos) o ácidos (ácidos orgánicos e inorgánicos) fisiológicamente aceptables; en particular, se prefieren las sales de ácidos fisiológicamente aceptables. Ejemplos de dichas sales incluyen sales con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido hidroclórico, ácido fosfórico, ácido hidrobrómico y ácido sulfúrico); y sales con ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico y ácido bencenosulfónico).

Las muteínas de betacelulina de la presente invención pueden prepararse mediante técnicas de la ingeniería genética, como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H6-87894, o por medio de un tratamiento de proteasa públicamente conocido, preferentemente, un tratamiento de carboxipeptidasa, y aun más preferentemente, un tratamiento de carboxipeptidasa A pancreática bovina, de betacelulina obtenida mediante el cultivo de células tumorales beta. Además, pueden prepararse de acuerdo con la síntesis de péptidos descripta a continuación. Adicionalmente, pueden elaborarse mediante el cultivo de transformantes que contienen ADN codificador de muteínas de betacelulina, como se describe más adelante.

Cuando la betacelulina se elabora a partir de células o tejido de mamífero o humano, las células o el tejido de mamífero o humano deben homogenizarse, y luego, extraerse con ácido o similares, y el extracto debe ser purificado y aislado a través de una combinación de desalado, diálisis, filtración de gel y cromatografía, tal como cromatografía de fase inversa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

Los péptidos pueden sintetizarse, por ejemplo, ya sea mediante la síntesis de fase sólida, ya sea mediante la síntesis de fase líquida. Esto es, se condensan con el resto los péptidos parciales o aminoácidos capaces de componer las muteínas de betacelulina de la presente invención, y, cuando el producto tiene grupos de protección, estos se eliminan, con lo cual puede elaborarse la muteína de betacelulina blanco. Los métodos públicamente conocidos para la condensación y la eliminación de grupos de protección incluyen los siguientes métodos, descritos en las referencias (1) a (5).

(1) M. Bodanzky y M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966).

(2) Schroeder y Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965).

(3) Nobuo Izumiya y col., Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments, Maruzen (1975).

(4) Jimei Yashima y Toshihira Kashiwahara, Basic Biochemical Experiments, Vol. 1, Protein Chemistry IV, 205 (1977).

(5) Sequel Development of Medical Drugs, Vol. 14, Peptide Synthesis, Kadokawa Shoten, Ed. Jimei Yashima.

Después de la reacción, el polipéptido de la presente invención puede ser purificado y aislado mediante una combinación, por ejemplo, con extracción de solvente, destilación, cromatografía de columna, cromatografía líquida y recristalización. Cuando el polipéptido resultante se encuentra en forma libre, puede ser convertido en una sal adecuada por medio de un método públicamente conocido. Alternativamente, cuando se obtiene una forma de sal, esta puede ser convertida en la forma libre por medio de un método públicamente conocido.

Las resinas de unión de péptido comerciales, adecuadas para la formación de amida, pueden usarse para formas de amida de betacelulina. Ejemplos de dichas resinas incluyen resinas de clorometilo, resinas de hidroximetilo, resinas de benzhidrilamina, resinas de aminometilo, resinas de alcohol 4-benciloxibencílico, resinas de 4-metilbenzhidrilamina, resinas PAM, resinas de 4-hidroximetilmetilfenilacetamida-metilo, resinas de poliacrilamida, resinas de 4-(2',4'-dimetoxifenilhidroximetil)fenoxi y resinas de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminoetil)fenoxi. Dichas resinas pueden usarse para la condensación de aminoácidos con grupos funcionales de cadenas laterales adecuadamente protegidos y grupos \alpha-amino sobre resina, de acuerdo con diversos métodos de condensación públicamente conocidos según lo conveniente para la secuencia del péptido propuesto. Después de la reacción, el péptido es cortado de la resina, los diversos grupos de protección son eliminados en forma simultánea, y se produce una reacción para la formación de enlaces de disulfuro intramoleculares, en una solución altamente diluida conforme a lo necesario para obtener las formas de amida blanco.

Si bien para la condensación de dichos aminoácidos protegidos pueden usarse diversos reactivos activadores que pueden emplearse para la síntesis de péptidos, las carbodiimidas son particularmente preferidas. Ejemplos de carbodiimidas incluyen DCC, N,N'-diisopropilcarbodiimida y N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Para la activación con las anteriores, pueden agregarse inhibidores de la racemización (por ejemplo, HOBt y HOOBt) y aminoácidos protegidos, directamente a la resina, o pueden agregarse a la resina en forma de correspondientes anhídridos de ácidos o ésteres de HOBt o ésteres de HOOBt, luego de la activación de los aminoácidos protegidos. Los solventes utilizados para la condensación con resinas o la activación de aminoácidos protegidos pueden seleccionarse adecuadamente de solventes que se sabe pueden ser usados para la condensación de péptidos. Ejemplos incluyen amidas de ácido tales como N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida y N-metilpirrolidona; hidrocarburos halogenados tales como cloruro de metileno y cloroformo; alcoholes, tales como trifluoretanol; sulfóxidos, tales como dimetilsulfóxido; aminas terciarias, tales como piridina; éteres, tales como dioxano y tetrahidrofurano; nitrilos, tales como acetonitrilo y propionitrilo; ésteres, tales como acetato de metilo y acetato de etilo; y mezclas adecuadas de los anteriores. La temperatura de la reacción puede seleccionarse adecuadamente del rango de uso conocido en la formación de enlaces peptídicos, que habitualmente es de alrededor de -20 a 50ºC. Los derivados de aminoácidos activados habitualmente se usan en una cantidad de exceso de 1,5 a 4 veces. Cuando los ensayos de reacción de ninhidrina revelan la condensación insuficiente, la condensación se repite sin la eliminación de los grupos de protección, hasta lograr suficiente condensación. Cuando la reacción repetida no proporciona suficiente condensación, pueden usarse anhídrido de ácido acético o acetilimidazol para la acetilación de los aminoácidos no reaccionados, a fin de evitar la influencia de reacciones subsiguientes.

Ejemplos de grupos de protección para los grupos amino de aminoácidos de materiales iniciales incluyen Z, Boc, pentiloxicarbonilo terciario, isoborniloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, Cl-Z, Br-Z, adamantiloxicarbonilo, trifluoracetilo, ftaloílo, formilo, 2-nitrofenilsulfenilo, difenilfosfinotioílo y Fmoc. Ejemplos de grupos de protección para grupos carboxilo incluyen aquellos en los cuales R es un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo cicloalquilo C_{3-8}, o un grupo aralquilo C_{7-14}; y además, 2-adamantilo, 4-nitrobencilo, 4-metoxibencilo y 4-clorobencilo; grupos fenacilo; y benciloxicarbonilhidrazida, butoxicarbonilhidrazida terciaria y tritilhidrazida.

Los grupos hidroxilo de serina y treonina pueden ser protegidos, por ejemplo, mediante la esterificación o eterificación. Ejemplos de grupos adecuados para la esterificación incluyen grupos alcanoílo inferior, tales como acetilo, grupos aloílo tales como benzoílo, y grupos derivados de carbono, tales como benciloxicarbonilo y etoxicarbonilo. Ejemplos de grupos adecuados para la eterificación incluyen grupos bencilo, tetrahidropiranilo y butilo terciario.

Ejemplos de grupos de protección para grupos hidroxilo fenólico de tirosina incluyen Bzl, Cl_{2}-Bzl, 2-nitrobencilo, Br-Z y butilo terciario.

Ejemplos de grupos de protección para imidazoles de histidina incluyen Tos, 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo, DNP, benciloximetilo, Bum, Boc, Trt y Fmoc.

Ejemplos para grupos carboxilo activados en el material inicial incluyen los correspondientes anhídridos de ácidos, azidas y ésteres activos (ésteres con alcoholes (por ejemplo, pentaclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 2,4-dinitrofenol, alcohol cianometílico, para-nitrofenol, HONB, N-hidroxisuccimida, N-hidroxiftalimida y HOBt)). Ejemplos para grupos amino activados en el material inicial incluyen las correspondientes amidas fosfóricas.

Los métodos para la remoción (eliminación) de grupos de protección incluyen la reducción de contacto directo en un flujo de hidrógeno, en presencia de un catalizador tal como Pd negro o Pd carbono; el tratamiento ácido con fluoruro de hidrógeno anhidro, ácido metanosulfónico, ácido trifluormetanosulfónico, ácido trifluoracético o sus mezclas; tratamiento de base con diisopropiletilamina, trietilamina, piperidina o piperazina; o reducción con sodio en amoníaco líquido. La reacción de eliminación mediante el tratamiento ácido anterior puede efectuarse a una temperatura de -20 a 40ºC, si bien es eficaz la adición de un depurador catiónico, tal como anisol, fenol, tioanisol, meta-cresol, para-cresol, dimetilsulfuro, 1,4-butanoditiol o 1,2-etanoditiol. El 2,4-dinitrofenilo usado como un grupo de protección de imidazol para histidina puede eliminarse mediante el tratamiento con tiofenol, mientras que los grupos formilo usados como grupos de protección de indol para triptófano pueden eliminarse mediante el tratamiento ácido en presencia de los 1,2-etanodiol, 1,4-butanodiol o similares mencionados; y además, pueden eliminarse por medio del tratamiento alcalino con hidróxido de sodio diluido, amoníaco diluido, o similares.

Los métodos para la introducción de grupos de protección en grupos funcionales no involucrados en la reacción; la eliminación de dichos grupos de protección; la activación de grupos funcionales involucrados en la reacción; y similares deben ser efectuadas por medio de métodos públicamente conocidos, o sus modificaciones.

En otro método para la obtención de una forma de amida de muteínas de betacelulina, el grupo \alpha-carboxilo del aminoácido carboxilo terminal es amidado en primer lugar; la cadena peptídica luego es extendida hasta la longitud deseada al lateral del grupo amino; entonces se preparan un péptido, excepto los grupos de protección para los grupos \alpha-amino en el terminal N de la cadena peptídica, y otro péptido o (aminoácido), excepto los grupos de protección para los grupos carboxilo en el terminal C, y se permite la condensación de los dos péptidos en una mezcla de solventes, tal como las mencionadas. Los detalles de la condensación son iguales a los anteriores. Luego de que los péptidos protegidos resultantes de la condensación han sido purificados, pueden eliminarse todos los grupos de protección, por medio de los métodos descritos con anterioridad, a fin de obtener el polipéptido bruto deseado. El polipéptido bruto puede purificarse a través de una variedad de técnicas de purificación conocidas, y las fracciones principales pueden ser liofilizadas, para proporcionar la forma de amida deseada de los polipéptidos.

A fin de obtener la forma de éster de muteínas de betacelulina, los grupos \alpha-carboxilo de los aminoácidos en el terminal carboxilo pasan por la condenación con un alcohol deseado a fin de producir un éster de aminoácido, y la forma de éster deseada del polipéptido entonces puede obtenerse de la misma manera que la forma de amida.

Ejemplos de ADN codificador de las muteínas de betacelulina de la presente invención incluyen cualquier ADN que comprenda ADN codificador de: (1) una muteína de betacelulina en la cual 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de la betacelulina pueden estar deleteados; y donde 1 a 4 residuos de aminoácidos del primer al cuarto residuo de aminoácido del terminal C, incluyendo el Leu en 3 del terminal C, han sido deleteados o sustituidos con otros residuos de aminoácidos; y (2) una muteína de betacelulina en la cual 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de la betacelulina han sido deleteados, y se han insertado 1 a 5 residuos de aminoácidos entre los residuos de aminoácidos n^{os} 22 y 23 del terminal C. Ejemplos específicos incluyen aquellos con una secuencia de bases que codifica una muteína de betacelulina que contiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID. NOs: 1 a 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 44 de la presente invención.

Ejemplos más específicos incluyen: (1) ADN que contiene ADN con una secuencia de bases representada por SEQ ID NOs: 15 a 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, como el ADN que codifica la muteína de betacelulina que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NOs: 1 a 4; SEQ ID NO.: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 13; y SEQ ID NO: 14; (2) ADN que contiene ADN con una secuencia de bases representada por SEQ ID NOs: 42 y 43, como el ADN codificador de una muteína de betacelulina que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NOs: 37 y 38; (3) ADN que contiene ADN con una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 48; (4) ADN de mamíferos que hibrida con una secuencia de los puntos (1) a (3) anteriores, en condiciones rigurosas; y (5) ADN que no forma híbridos con las secuencias especificadas en los puntos (1) a (4), debido a la degeneración del código genético, pero que codifica para un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos. La hibridación puede efectuarse mediante métodos públicamente conocidos, o sus modificaciones. Las condiciones rigurosas descriptas con anterioridad incluyen, por ejemplo, una temperatura de 42ºC; formamida al 50%; 4 x SSPE (1 x SSPE = NaCl, 150 mM; NaH_{2}PO_{4} H_{2}O, 10 mM; EDTA, 1 mM; pH 7,4); solución de Denhardt 5 x; y SDS al 0,1%.

Los vectores de expresión para las muteínas de betacelulina de la presente invención, que se usan cuando las muteínas de betacelulina de la presente invención son elaboradas mediante el cultivo de los transformantes que comprenden ADN codificador de betacelulina, pueden elaborarse, por ejemplo, mediante: (1) el corte de fragmentos de ADN blanco del ADN que codifica una muteína de betacelulina de la presente invención; y (2) la ligación de los fragmentos de ADN corriente descendente de un promotor en un vector de expresión adecuado.

Ejemplos de vectores incluyen plásmidos de E. coli (por ejemplo, pBR322, pBR325, pUC12 y pUC13), plásmidos de Bacillus subtilis (por ejemplo, pUB110, pTP5 y pC194), plásmidos de levaduras (por ejemplo, pSH19 y pSH15), bacteriófagos tales como fagos \lambda, y virus de animales tales como retrovirus, virus de la vacuna y baculovirus.

Ejemplos de promotores que pueden usarse incluyen cualquier promotor adecuado correspondiente al huésped empleado para expresar el gen.

Cuando el huésped es una célula de animal durante la transformación, puede ser beneficioso usar un promotor derivado de SV40, un promotor de retrovirus, promotor de metalotioneína, promotor de choque de calor, promotor de citomegalovirus, promotor SR\alpha, o similares. Ejemplos preferidos para huéspedes de E. coli incluyen el promotor trp, promotor T7, promotor lac, promotor recA, promotor \lambdaPL, promotor lpp y similares; ejemplos preferidos para huéspedes de bacilos incluyen el promotor SPO1, promotor SPO2, promotor penP y similares; y ejemplos preferidos para huéspedes de levaduras incluyen el promotor PHO5, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH1, promotor GAL y similares. Cuando el huésped es una célula de insecto, se prefieren los promotores de polihedrina y promotores P10, etc.

Además de los anteriores, los vectores de expresión también pueden incluir mejoradores, señales de empalme, señales poliA, marcadores de selección, origen SV40 de replicación (de aquí en adelante, a veces denominado SV40ori) y similares, según lo deseado. Ejemplos de marcadores de selección incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) (resistencia a metotrexato (MTX)), el gen de resistencia a ampicilina (Amp^{r}) y el gen de resistencia a neomicina (resistencia G418, a veces denominado Neo). Puede usarse medio libre de timidina para la selección, en particular, en casos donde el gen DHFR se usa como el marcador de selección con células CHO (dhfr^{-}).

Si es necesario, puede agregarse al lateral de terminal N de la muteína de betacelulina una secuencia de señal que adapta el huésped. Ejemplos preferidos incluyen la secuencia de señal phoA, secuencia de señal OmpA, o similares, para huéspedes de E. coli. Ejemplos preferidos incluyen una secuencia de señal de \alpha-amilasa, una secuencia de señal de subtilisina, o similares, para huéspedes de bacilos. Ejemplos preferidos incluyen una secuencia de señal de factor \alpha de apareamiento (mF\alpha), secuencia de señal de invertasa, o similares, para huéspedes de levaduras. Ejemplos preferidos incluyen una secuencia de señal de insulina, secuencia de señal de \alpha-interferón, secuencia de señal de molécula de anticuerpo, o similares, para huéspedes de células de animales.

Un vector construido de esta manera, que contiene ADN codificador de una muteína de betacelulina, puede usarse a fin de elaborar transformantes.

Los huéspedes que pueden usarse incluyen, por ejemplo, E. coli, bacilos, levaduras, insectos o células de insectos y células de animales.

Ejemplos de E. coli incluyen E. coli K12 DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60: 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9: 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120: 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41: 459 (1969)), C600 (Genetics, 39: 440 (1954)) y MM294 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 4174 (1976)).

Ejemplos de bacilos incluyen Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24: 255 (1983)) y 207-21 (Journal of Biochemistry, 95: 87 (1984)).

Ejemplos de levaduras incluyen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R, NA87-11A, DKD-5D y 20B-12.

Ejemplos de insectos incluyen larvas de gusano de seda (Maeda y col., Nature, 315: 592 (1985)).

Ejemplos de células de insectos incluyen, en el caso del virus AcNPV, estirpes celulares establecidas derivadas de larvas de Spodoptera frugiperda (células Sf), células MG1 derivadas de células de la zona embrionaria del tubo digestivo de Trichoplusia ni, células High Five^{TM} derivadas de células de ovario de Trichoplusia ni, células derivadas de Mamesira brassicae y células derivadas de Estigmena acrea. Ejemplos para el virus BmNPV incluyen estirpes celulares establecidas derivadas de Bombyx mori N (células BmN). Ejemplos de células Sf incluyen células Sf9 (ATCC CRL1711) y células Sf21 (J. L. Vaughn y col., In Vitro, Vol. 13, pp. 213-217 (1977)).

Ejemplos de células de animales incluyen células COS-7 de mono, células Vero, células de hámster chino CHO, células de hámster chino CHO con deficiencia del gen DHFR (células dhfr^{-} CHO), células L de ratón, células 3T3 de ratón, células de mieloma de ratón, células HEK293 humanas, células FL humanas, células 293, células C127, células BALB3T3 y células Sp-2/O.

E. coli puede transformarse, por ejemplo, mediante un método descrito en las referencias tituladas: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972), o Gene, 17: 107 (1982).

Los bacilos pueden transformarse, por ejemplo, por medio de un método descrito en la referencia titulada: Molecular & General Genetics, 168: 111 (1979).

Las levaduras pueden ser transformadas, por ejemplo, por un método descrito en la referencia titulada: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978).

Las células de insectos y los insectos pueden transformarse, por ejemplo, por un método descrito en la referencia titulada: Bio/Technology, 6, pp. 47-55 (1988).

Las células de animales pueden ser transformadas, por ejemplo, por medio de un método descrito en la referencia titulada: Virology, 52: 456 (1973).

Ejemplos de métodos para la introducción de vectores de expresión en células incluyen el método de lipofección (P. L. Felgner y col., en: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 84, p. 7413 (1987)); el método de fosfato de calcio (F. L. Graham y A. J. van der Eb, en: Virology, Vol. 52, pp. 456-467 (1973)); electroporación (E. Nuemann y col., en: EMBO J., Vol. 1, pp. 841-845 (1982)) y similares.

De esta manera, pueden obtenerse los transformantes que han sido transformados en vectores de expresión que contienen ADN que codifica las muteínas de betacelulina de la presente invención.

En un método para la expresión estable de las muteínas de betacelulina de la presente invención usando células de animales, se seleccionan por medio de la selección de clones las células que incorporan un vector de expresión introducido en las células de animales mencionadas, en el cromosoma. Específicamente, los transformantes se seleccionan usando los marcadores de selección mencionados, como indicadores. Además, es posible obtener estirpes celulares de animales estables con una alta capacidad de expresión para las muteínas de betacelulina de la presente invención, etc., a través de la repetida selección de clones de células de animales obtenidas usando marcadores de selección de esta manera. Cuando se usa un gen dhfr como un marcador de selección, el cultivo puede llevarse a cabo a medida que la concentración de MTX se incrementa en forma gradual, y pueden seleccionarse las cepas resistentes de manera que la amplificación intracelular de ADN codificador de las muteínas de betacelulina de la presente invención, junto con el gen dhfr, proporcionen una estirpe celular de animal con expresión aún más alta.

Las muteínas de betacelulina de la presente invención pueden ser elaboradas mediante el cultivo de los transformantes mencionados, en condiciones que permitan la expresión del ADN codificador de las muteínas de betacelulina de la presente invención; y la producción y acumulación de las muteínas de betacelulina de la presente inven-
ción.

Cuando se cultivan los transformantes con huéspedes de E. coli o bacilos, los medios líquidos son adecuados para el cultivo, y pueden contener fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, material inorgánico y otros materiales necesarios para el cultivo de los transformantes. Las fuentes de carbono incluyen glucosa, dextrinas, almidones solubles y sacarosa, y las fuentes de nitrógeno incluyen sustancias inorgánicas u orgánicas tales como sales de amonio, nitratos, licor de maíz macerado, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soja y extracto de papa. Ejemplos de materiales inorgánicos incluyen cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio y cloruro de magnesio. Pueden agregarse además levaduras, vitaminas, factores promotores del crecimiento y similares. El pH del medio es, preferentemente, alrededor de 5 a 8.

Un medio preferido para el cultivo de E. coli es medio M9 que contiene glucosa y casaminoácidos (Miller, Journal of Experiments in Molecular Gentics, pp. 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)). Puede agregarse un agente químico tal como ácido 3\beta-indolacrílico,a fin de mejorar el promotor, según lo necesario.

En los casos donde el huésped es E. coli, el cultivo lleva habitualmente alrededor de 3 a 24 horas, a aproximadamente 15 a 43ºC. El cultivo puede ser aireado o agitado, según lo necesario.

En los casos donde el huésped es un bacilo, el cultivo habitualmente lleva alrededor de 6 a 24 horas, a aproximadamente 30 a 40ºC. El cultivo puede ser aireado o agitado, según lo necesario.

Ejemplos de medios para el cultivo de transformantes con huéspedes de levaduras incluyen medio mínimo de Burkholder (K. L. Bostian y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, 4505 (1980), y medio SD con casaminoácido al 0,5% (G. A. Bitter y col.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, 5330 (1984). El pH del medio preferentemente puede ajustarse a entre alrededor de 5 y 8. El cultivo habitualmente lleva alrededor de 24 a 72 horas, a alrededor de 20 a 35ºC. El cultivo puede ser aireado o agitado, según lo necesario.

Ejemplos de medios para el cultivo de transformantes con huéspedes de células de insectos incluyen medio de insectos de Grace (T. C. C. Grace, Nature, 195: 788 (1962), adecuadamente suplementado con aditivos tales como suero bovino inmovilizado al 10%. El pH del medio debe ser ajustado a entre aproximadamente 6,2 y 6,4. El cultivo habitualmente lleva alrededor de 3 a 5 días, a alrededor de 27ºC. El cultivo puede ser aireado o agitado, según lo necesario.

Ejemplos de medios para el cultivo de transformantes con huéspedes de células de animales incluyen medio MEM con aproximadamente 5 a 20% de suero de ternero fetal (Science, 122: 501 (1952), medio DMEM (Virology, 8: 396 (1959), medio RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199: 519 (1967) y medio 199 (Proceedings of the Society for Biological Medicine, 73: 1 (1950). El pH preferentemente puede ser de alrededor de 6 a 8. El cultivo habitualmente se realiza durante 15 a 60 horas, a aproximadamente 30 a 40ºC. El cultivo puede ser aireado o agitado, según lo necesario.

En particular, cuando se usan células CHO (dhfr^{-}) y genes dhfr como marcadores de selección, se utiliza, preferentemente, el medio DMEM que contiene suero de ternero fetal dializado, prácticamente sin timidina.

Las muteínas de betacelulina de la presente invención pueden ser aisladas y purificadas de los cultivos mencionados, por ejemplo, de la siguiente manera.

Cuando las betacelulinas de la presente invención son extraídas de células o células bacterianas cultivadas, las células o células bacterianas se recogen mediante un método públicamente conocido, luego de la finalización del cultivo, y son suspendidas en un regulador adecuado, son disgregadas mediante ultrasonicación, tratamiento de lisozima o mediante congelamiento y descongelamiento, etc., y el extracto bruto de polipéptido luego se obtiene por medio de la centrifugación o filtración. El regulador además puede contener un desnaturalizante de proteína, tal como urea o hidrocloruro de guanidina, o un surfactante, tal como Triton X-100 (marca registrada (^{TM})).

Cuando las muteínas de betacelulina son secretadas en el caldo de cultivo, las células o células bacterianas son separadas del sobrenadante por medio de un método públicamente conocido, luego de la finalización del cultivo, y se recoge el sobrenadante.

Los polipéptidos de la presente invención contenidos en el extracto o sobrenadante de cultivo obtenidos de esta manera pueden purificarse por medio de una combinación adecuada de métodos públicamente conocidos de aislación y purificación. Ejemplos de dichos métodos públicamente conocidos de aislación y purificación incluyen métodos que utilizan el grado de disolución, tales como precipitación de solvente o desalado; métodos que utilizan diferencias principalmente en el peso molecular, tales como diálisis, ultrafiltración, filtración de gel y electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida; métodos que utilizan diferencias en la carga, tales como cromatografía de intercambio iónico; métodos que utilizan afinidad específica, tales como cromatografía de afinidad; métodos que utilizan diferencias hidrófobas, tales como HPLC de fase inversa; y métodos que utilizan diferencias en el punto isoeléctrico, tales como electroforesis de punto isoeléctrico y cromatofocalización.

Cuando las muteínas de betacelulina resultantes de la presente invención se obtienen en forma libre, pueden ser convertidas en una sal por medio de un método públicamente conocido, o sus modificaciones. Alternativamente, cuando se obtienen en forma de una sal, pueden ser convertidas en la forma libre o en otra sal por medio de un método públicamente conocido, o sus modificaciones.

Las muteínas de betacelulina de la presente invención producidas por recombinantes pueden ser modificadas según lo deseado, a través de la acción de enzimas modificadoras de proteínas adecuadas, antes o después de la purificación; o las muteínas de betacelulina pueden ser parcialmente eliminadas. Ejemplos de enzimas modificadoras de proteínas incluyen tripsina, quimotripsina, arginilendopeptidasa, proteína quinasa y glicosidasa.

Las muteínas de betacelulina resultantes pueden ser tratadas en una etapa de replegado, como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989. Las muteínas de betacelulina con un Met N terminal pueden someterse a una reacción para la eliminación del Met del terminal N, como se describe en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989, a fin de eliminar el Met N terminal.

La presencia de las muteínas de betacelulina resultantes de la presente invención puede ser determinada mediante el inmunoensayo enzimático o métodos similares, usando anticuerpos específicos.

Las muteínas de betacelulina o sus sales de la presente invención, o ADN codificador de las muteínas de betacelulina de la presente invención, pueden usarse en la formulación de fármacos para mejorar enfermedades tales como diabetes (por ejemplo, diabetes insulinodependiente (diabetes tipo I), etc.), disfunción pancreática asociada con diabetes, o disfunción pancreática asociada con la secreción de insulina insuficiente senil; y fármacos para enfermedades tales como cáncer pancreático no diferenciado (en particular, fármacos profilácticos y terapéuticos para la diabetes (tal como diabetes insulinodependiente), etc.).

Debido a que las muteínas de betacelulina o sus sales de la presente invención, o su ADN codificador, poseen menor actividad EGF, y no presentan problemas en términos de antigenicidad, pueden ser fármacos seguros y de baja toxicidad. Las muteínas de betacelulina o sus sales de la presente invención, o su ADN codificador, pueden usarse como fármacos para mejorar enfermedades tales como diabetes (por ejemplo, diabetes insulinodependiente), disfunción pancreática asociada con diabetes y disfunción pancreática asociada con la secreción de insulina insuficiente en ancianos, y como fármacos terapéuticos y profilácticos para enfermedades tales como cáncer pancreático no diferenciado.

Las muteínas de betacelulina o sus sales de la presente invención, o su ADN codificador, pueden usarse de manera convencional como los fármacos mencionados. Por ejemplo, pueden administrarse por vía oral en forma de comprimidos recubiertos o con recubrimiento entérico, cápsulas, elíxires, microcápsulas y similares; y pueden administrarse por vía parenteral en forma de inyecciones, tales como soluciones estériles con agua u otros líquidos aceptables para uso farmacéutico, o suspensiones. Dichas preparaciones pueden elaborarse, por ejemplo, mediante la mezcla de los compuestos o sus sales en formulaciones de dosis unitarias necesarias para las preparaciones generalmente reconocidas, junto con portadores, saborizantes, excipientes, vehículos, antisépticos, estabilizadores, aglutinantes y similares, fisiológicamente aceptables. El contenido del ingrediente activo en dichas formulaciones proporcionará una dosis adecuada dentro del rango indicado.

Ejemplos de aditivos que pueden ser miscibles con comprimidos, cápsulas y similares incluyen aglutinantes tales como gelatina, almidón de maíz, goma de tragacanto y goma arábiga; excipientes tales como celulosa cristalina; dilatadores tales como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico; lubricantes tales como estearato de magnesio; edulcorantes, tales como sacarosa, lactosa y sacarina; y saborizantes, tales como menta, aceite de akamono o cereza. En el caso de las formulaciones unitarias en forma de preparaciones de cápsulas, el material puede incluir además un portador líquido tal como un lípido. Las composiciones estériles para inyecciones pueden formularse mediante un método común, tal como la disolución o suspensión de un aceite vegetal producido naturalmente o similares, tales como aceite de sésamo o aceite de coco, y el ingrediente activo en un vehículo, por ejemplo, agua para inyección.

Ejemplos de soluciones acuosas para inyección incluyen solución salina fisiológica, líquidos isotónicos que contienen glucosa u otros coadyuvantes (tales como D-sorbitol, D-manitol y cloruro de sodio). Además, pueden usarse auxiliares de la disolución adecuados, por ejemplo, alcoholes (tales como etanol), polialcoholes (tales como propilenglicol y polietilenglicol) y surfactantes no iónicos (tales como Polysorbate 80^{TM} y HCO-50). Ejemplos de soluciones oleaginosas incluyen aceite de sésamo y aceite de soja. Ejemplos de auxiliares de la disolución incluyen benzoato de bencilo y alcohol bencílico.

Asimismo, pueden combinarse reguladores (tales como reguladores de fosfato y reguladores de acetato de sodio), analgésicos (tales como hidrocloruro de banzalconio y de procaína), estabilizadores (tales como albúmina sérica humana y polietilenglicol), conservantes (tales como alcohol bencílico y fenol), antioxidantes y similares. Las inyecciones habitualmente son envasadas en ampollas adecuadas.

La preparación resultante es segura y tiene baja toxicidad, y en consecuencia, puede ser administrada, por ejemplo, a seres humanos y mamíferos (tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, cerdos, vacas, gatos, perros, monos, papiones sagrados y chimpancés).

La dosificación de la muteína de betacelulina o sus sales de la presente invención varía de acuerdo con la afección del sujeto y otros factores. La dosificación administrada por vía oral para pacientes con diabetes del adulto (por 60 kg de peso corporal), en general, es alrededor de 0,1 a 100 mg por día; preferentemente, alrededor de 1,0 a 50 mg; y aun más preferentemente, alrededor de 1,0 a 20 mg. La dosificación administrada por vía parenteral de una sola vez varía de acuerdo con el propósito de la administración, el órgano blanco, la afección del sujeto, el método de administración y otros factores. Por ejemplo, las inyecciones intravenosas para pacientes con diabetes del adulto (por 60 kg de peso corporal), en general, son de alrededor de 0,01 a 30 mg por día; preferentemente, de alrededor de 0,1 a 20 mg; y aun más preferentemente, de alrededor de 0,1 a 10 mg. La dosificación para otros mamíferos también puede calcularse en términos de 60 kg.

Las abreviaturas para bases, aminoácidos y similares, en la sección de la memoria descriptiva y en las figuras, se sustentan sobre la base de la Comisión IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica (IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature), y de abreviaturas comunes en el campo. A continuación se proporcionan ejemplos. Los isómeros ópticos de aminoácidos son la forma L, a menos que se indique lo contrario.

ADN:: ácido desoxirribonucleico

ADNc:: ácido desoxirribonucleico complementario

A:: adenina

T:: timina

G:: guanina

C:: citosina

EDTA:: ácido etilendiaminatetraacético

APMSF:: hidrocloruro de (p-amidinofenil) metanosulfonilfluoruro

SDS:: dodecilsulfato de sodio

TFA:: ácido trifluoracético

Gly:: glicina

Ala:: alanina

Val:: valina

Leu:: leucina

Ile:: isoleucina

Ser:: serina

Thr:: treonina

Cys:: cisteína

Met:: metionina

Glu:: ácido glutámico

Asp:: ácido aspártico

Lys:: lisina

Arg:: arginina

His:: histidina

Phe:: fenilalanina

Tyr:: tirosina

Trp:: triptófano

Pro:: prolina

Asn:: asparagina

Gln:: glutamina

NMP:: N-metilpirrolidona

\vskip1.000000\baselineskip

Los sustituyentes, los grupos de protección y reactivos utilizados en la memoria descriptiva se representan mediante los siguientes símbolos.

Me:: grupo metilo

Et:: grupo etilo

Bu:: grupo butilo

Ph:: grupo fenilo

TC:: grupo tiazolidina-4(R)-carboxamida

Bom:: benciloximetilo

PAM:: fenilacetamida metilo

Tos:: p-toluensulfonilo

HONB:: N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida

Bzl:: grupo bencilo

Z:: grupo benciloxicarbonilo

Br-Z:: grupo 2-bromobenciloxicarbonilo

Cl-Z:: grupo 2-clorobenciloxicarbonilo

Boc:: grupo t-butiloxicarbonilo

HOBt:: 1-hidroxibenzotriazol

DCC:: N,N'-diciclohexilcarbodiimida

TFA:: ácido trifluoracético

Fmoc:: grupo N-9-fluorenilmetoxicarbonilo

DNP:: grupo dinitrofenilo

Bum:: grupo butoximetilo terciario

Trt:: grupo tritilo

\vskip1.000000\baselineskip

Las SEQ ID NOs: en el Listado de Secuencias de la memoria descriptiva indican las siguientes secuencias.

SEQ ID NO: 1

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-77) de la presente invención.

SEQ ID NO: 2

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-76) de la presente invención.

SEQ ID NO: 3

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-77) de la presente invención.

SEQ ID NO: 4

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-76) de la presente invención.

SEQ ID NO: 5 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-76, 78-80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 6 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-76, 78, 79) de la presente invención.

SEQ ID NO: 7 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-76, 78) de la presente invención.

SEQ ID NO: 8

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-77, 79, 80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 9

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-77, 80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 10 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-76, 78-80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 11 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-76, 78, 79) de la presente invención.

SEQ ID NO: 12 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-76, 78) de la presente invención.

SEQ ID NO: 13

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-77, 79, 80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 14

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-77, 79) de la presente invención.

\newpage

SEQ ID NO: 15

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 16

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 17

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 18

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 19 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 20 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 21 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 22

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 23

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 24 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 25 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 26 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

SEQ ID NO: 27

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

\newpage

SEQ ID NO: 28

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO: 29

Secuencia de bases para el cebador 1 usado en los Ejemplos 1 y 4 a continuación.

SEQ ID NO: 30

Secuencia de bases para el cebador 2 usado en los Ejemplos 1 y 4 a continuación.

SEQ ID NO: 31

Secuencia de bases para el cebador RI-1 usado en los Ejemplos 10 y 27 a continuación.

SEQ ID NO: 32

Secuencia de bases para el cebador RI-3 usado en los Ejemplos 10 y 27 a continuación.

SEQ ID NO: 33

Secuencia de bases para el cebador RI-1Cla usado en los Ejemplos 10 y 27 a continuación.

SEQ ID NO: 34

Secuencia de bases para el cebador RI-3Xho usado en los Ejemplos 10 y 27 a continuación.

SEQ ID NO: 35

Secuencia de aminoácidos para betacelulina.

SEQ ID NO: 36

Secuencia de bases de ADNc codificadora de betacelulina.

SEQ ID NO: 37

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC2-76) de la presente invención.

SEQ ID NO: 38

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC24-76) de la presente invención.

SEQ ID NO: 39

Secuencia de bases del cebador 3 usado en el Ejemplo 13 a continuación.

SEQ ID NO: 40

Secuencia de bases del cebador 4 usado en los Ejemplos 13 y 16 a continuación.

SEQ ID NO: 41

Secuencia de bases del cebador 5 usado en el Ejemplo 16 a continuación.

SEQ ID NO: 42

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

SEQ ID NO: 43

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

\newpage

SEQ ID NO: 44

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC31-58, Asn, Pro, Ser, 59-80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 45 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (Asn, Ser, Asp, Ser, Glu, BTC38-80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 46 (secuencia de referencia)

Secuencia de aminoácidos de muteína de betacelulina (BTC1-58, Asn, Pro, Ser, obliterada-80) de la presente invención.

SEQ ID NO: 47 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

SEQ ID NO: 48

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

SEQ ID NO: 49 (secuencia de referencia)

Secuencia de bases de ADNc codificadora de muteína de betacelulina representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.

SEQ ID NO: 50

Secuencia de bases del cebador BT-95h usado en el Ejemplo de Referencia 1 y en el Ejemplo 22 a continuación.

SEQ ID NO: 51

Secuencia de bases del cebador BT-94h usado en el Ejemplo de Referencia 1 y en el Ejemplo 23 a continuación.

SEQ ID NO: 52

Secuencia de bases del cebador PET-1 usado en el Ejemplo 22 a continuación.

SEQ ID NO: 53

Secuencia de bases del cebador BTC-1 usado en el Ejemplo 22 a continuación.

SEQ ID NO: 54

Secuencia de bases del cebador BTC-2 usado en el Ejemplo 22 a continuación.

SEQ ID NO: 55

Secuencia de bases del cebador BTC-3 usado en el Ejemplo 22 a continuación.

SEQ ID NO: 56

Secuencia de bases del cebador BTC-7 usado en el Ejemplo 23 a continuación.

\vskip1.000000\baselineskip

El transformante E. coli MM294 (DE3)/pTCIIBTC77, obtenido en el Ejemplo 1 a continuación, se registró con el Acceso Nº FERM BP-6584, el 24 de noviembre de 1998, en el National Institute of Biosciences and Human Technlogy (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. Además, se registró con el Acceso Nº IFO 16214, el 2 de Noviembre de 1998, en el Institute for Fermentation (IFO).

El transformante E. coli MM294 (DE3)/pTCIIBTC76, obtenido en el Ejemplo 4 a continuación, se registró con el Acceso Nº FERM BP-6583, el 24 de Noviembre de 1998, en el National Institute of Biosciences and Human Technlogy, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. Además, se registró con el Acceso Nº IFO 16213, el 2 de Noviembre de 1998, en el Institute for Fermentation (IFO).

El transformante E. coli MM294 (DE3)/pTCIIBTC2-76, obtenido en el Ejemplo 13 a continuación, se registró con el Acceso Nº FERM BP-6948, el 24 de Noviembre de 1999, en el National Institute of Biosciences and Human Technlogy, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. Además, se registró con el Acceso Nº IFO 16334, el 9 de Noviembre de 1999, en el Institute for Fermentation (IFO).

El transformante E. coli MM294 (DE3)/pTCIIBTC24-76, obtenido en el Ejemplo 16 a continuación, se registró con el Acceso Nº FERM BP-6949, el 24 de Noviembre de 1999, en el National Institute of Biosciences and Human Technlogy, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. Además, se registró con el Acceso Nº IFO 16335, el 9 de Noviembre de 1999, en el Institute for Fermentation (IFO).

El E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1516 con el plásmido pTB1516 obtenido en la Referencia 1 a continuación se registró con el Acceso Nº FERM BP-3836, el 21 de Abril de 1992, en el National Institute of Biosciences and Human Technlogy, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (NIBH). Además, se registró con el Acceso Nº IFO 15282, el 16 de Abril de 1992, en el Institute for Fermentation.

Ejemplos y referencias se proporcionan a continuación, a fin de ilustrar la presente invención en mayor detalle, si bien el alcance de la presente invención no se limita a estos Ejemplos.

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Ejemplo 1

Construcción de la cepa de expresión de betacelulina de 77 residuos (que carece de tres residuos C terminales)

Se construyó un plásmido de expresión de betacelulina de 77 residuos (que carece de tres residuos C terminales) de la siguiente manera (Figura 1).

Se amplificó el gen estructural de betacelulina de 77 residuos (que carece de tres residuos C terminales) por medio de PCR, a partir del plásmido de expresión de betacelulina pB041 (Seno y col., Growth Factors, 13: 181 (1996)), usando un cebador 1 (5'-CATATGGATGGGAATTCCACCAGAAGTCCTG) que tiene un sitio de disociación NdeI y un codón de inicio adyacente corriente ascendente del gen estructural, y un cebador 2 (5'-GGATCCC
TAGTCAACTCTCTCACACCTTGCTCC) que tiene un codón de detención y un sitio de disociación BamHI luego del ácido aspártico en 77. El gen amplificado de este modo por PCR se ligó al vector pCR2.1, usando un equipo de clonación original TA (de Invitrogen) a fin de preparar pCR2.1/BTC77. Este se introdujo en E. coli JM109, y se seleccionaron transformantes usando resistencia a ampicilina y actividad de \beta-galactosidasa como indicadores. Los transformantes que tenían pCR2.1/BTC77 se cultivaron, y se preparó pCR2.1/BTC77 usando un equipo QIAprep8 Miniprep (de Qiagen).

Se digirió pBR322 con NdeI; los extremos se enromaron con T4 ADN polimerasa (equipo DNA Blunting kit, de Takara Shuzo), y se preparó pBRdesNde que carecía del sitio de reconocimiento NdeI, mediante religación. Se digirió pET3c con Bgl II-EcoRV, y se recuperaron fragmentos de aproximadamente 0,26 kpb; los extremos se enromaron con T4 ADN polimerasa, y se produjo pBR/T7 desNde mediante ligación con el fragmento Scal de pBRdesNde. Se preparó pBR322desBam que carecía del sitio de reconocimiento BamHI de pBR322, mediante mutagénesis dirigida a sitio (Quick Change, de Stratagene). Se ligó el fragmento SphI-EcoRV de pBR322desBam con el fragmento SphI-EcoRV de pBR/T7desNde, para proporcionar el vector de expresión pTCII de resistencia a tetraciclina. Se digirió pCR2.1/BTC77 con NdeI y BamHI, y se efectuó electroforesis de agarosa; se recuperaron aproximadamente 240 pb del gen estructural de betacelulina de 77 residuos, usando el equipo de purificación QIAquick Spin Purification Kit (de Qiagen). El vector de expresión pTCII se digirió con NdeI y BamHI, y se efectuó electroforesis de agarosa; se recuperaron en forma similar bandas de aproximadamente 4,6 kpb. El gen estructural de betacelulina de 77 residuos se ligó con el fragmento Ndel-BamHI del vector de expresión pTCII, y luego se incorporó en E. coli JM109 para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, y los plásmidos se recuperaron nuevamente de la cepa, a fin de proporcionar el plásmido de expresión pTCIIBTC77.

El pTCIIBTC77 resultante se incorporó en E. coli MM294 (DE3) para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, a fin de proporcionar la estirpe de expresión de betacelulina de 77 residuos MM294 (DE3)/pTCIIBTC77.

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Ejemplo 2

Cultivo de la cepa de expresión de betacelulina de 77 residuos

La cepa de expresión de betacelulina de 77 residuos MM294 (DE3)/pTCIIBTC77 se cultivó durante 16 horas a 30ºC en 1 l de medio LB (peptona al 1%; extracto de levadura al 0,5%; cloruro de sodio al 0,5%) que contenía 10 mg/l de tetraciclina. Se usaron 150 ml del cultivo resultante para inocular jarras fermentadoras de 2 l que contenían 1,5 l de medio de fermentación primaria (monohidrogenofosfato de sodio al 1,68%; dihidrogenofosfato de sodio al 0,3%; cloruro de amonio al 0,1%; cloruro de sodio al 0,05%; sulfato de magnesio al 0,024%; Nupol LB-625 al 0,02%; hidrocloruro de tiamina al 0,0005%; glucosa al 1,5%; casaminoácido al 1,0%; extracto de levadura al 1,0%), y el cultivo se inició con aireación y agitación en condiciones de 500 r. p. m., un caudal de aire de 2 l/min, y una temperatura de 37ºC. Cuando la turbiedad del cultivo alcanzó aproximadamente 1200 unidades Klett, se agregaron 5,95 mg/l de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG). Se agregó glucosa al 0,75%, 1 y 2,5 horas después de la adición de IPTG, y el cultivo continuó hasta 9 horas luego del inicio del cultivo. Se centrifugó el caldo de cultivo durante 30 minutos a 10.000 r. p. m., a fin de recoger las células.

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Ejemplo 3

Purificación de betacelulina de 77 residuos-Met

Se agregaron 10 ml de Tris, 0,1 M-HCl (pH 8,0) que contenían EDTA, 1 mM; APMSF, 1 mM; e hidrocloruro de guanidina, 7 M, a 5 g de células obtenidas del Ejemplo 2. La mezcla se agitó durante la noche a 4ºC para la extracción, y luego se centrifugó (20 min a 10.000 r. p. m.). Se agregaron 250 ml de Tris, 50 mM-HCl (pH 8,0) que contenían glutationa de tipo oxidado, 0,5 mM; glutationa de tipo reducido, 1 mM; EDTA, 1 mM; hidrocloruro de arginina, 0,1 M; y urea, 2 M, a 10 ml del sobrenadante resultante para el replegado durante la noche a 4ºC; a continuación, se efectuó la centrifugación (20 min a 10.000 r. p. m.), a fin de lograr 260 ml de sobrenadante. El sobrenadante se concentró usando una membrana YM3 (fracción peso molecular: 3000, de Millipore). Se agregaron 120 ml de urea, 2 M, a 80 ml del concentrado desalado, y el pH se ajustó entonces a 5,0 con ácido hidroclórico. El sobrenadante obtenido luego de 20 min de centrifugación a 10.000 r. p. m. se adsorbió con un caudal de 10 ml/min, en una columna SP-Toyopearl 650 M (2,2 cm x 12 cm, de Tosoh), equilibrada con regulador de acetato de sodio, 50 mM (pH 5,0), y la columna se lavó con el regulador utilizado para la equilibración. A continuación, se efectuó la elución con un gradiente lineal de 0 a 1,0 M de cloruro de sodio. Se recogieron las fracciones que contenían la betacelulina de 77 residuos-Met; un tercio de la fracción se adsorbió en una columna C4P-50 (1,0 cm x 25 cm, de Showa Denko) equilibrada con ácido trifluoracético al 0,1%, y se eluyó la betacelulina de 77 residuos-Met con un gradiente lineal de 13,5 a 21,2% de acetonitrilo. El eluido obtenido por dos más de las mismas operaciones se dializó contra ácido trifluoracético al 0,02%, y se liofilizó. El polvo liofilizado se disolvió en 10 ml de agua destilada, se dejó fluir a través de una columna AG1-X8 (1,0 cm x 10 cm, de Nippon Biorad) tratada con ácido acético, y luego se liofilizó nuevamente, a fin de proporcionar 8 mg de betacelulina de 77 residuos-Met.

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Ejemplo 4

Construcción del plásmido de expresión de betacelulina de 76 residuos (que carece de cuatro residuos C terminales)

Se construyó un plásmido de expresión de betacelulina de 76 residuos (que carece de cuatro residuos C terminales) de la siguiente manera (Figura 2).

Se amplificó el gen estructural de betacelulina de 76 residuos (que carece de cuatro residuos C terminales) por medio de PCR, a partir del pTCII/BTC77 construido en el Ejemplo 1, usando un cebador 1 (5'-CATATGGATGG
GAATTCCACCAGAAGTCCTG) que tiene un sitio de disociación NdeI y un codón de inicio adyacente corriente ascendente del gen estructural, y un cebador 2 (5'-GGATCCCTAAACTCTCTCACACCTTGCTCCAATG) que tiene un codón de detención y un sitio de disociación BamHI luego de la valina en 76. El gen amplificado de este modo por PCR se ligó al vector pCR2.1, usando un equipo de clonación original TA (de Invitrogen) a fin de preparar pCR2.1/BTC76. Este se introdujo en E. coli JM109, y se seleccionaron transformantes usando resistencia a ampicilina y actividad de \beta-galactosidasa como indicadores. Los transformantes que tenían pCR2.1/BTC76 se cultivaron, y se preparó pCR2.1/BTC76 usando un equipo QIAprep8 Miniprep (de Qiagen).

Se digirió pCR2.1/BTC76 con NdeI y BamHI, y se efectuó electroforesis de agarosa; se recuperaron aproximadamente 240 pb del gen estructural de betacelulina de 76 residuos, usando el equipo de purificación QIAquick Spin Purification Kit (de Qiagen). El vector de expresión pTCII obtenido en el Ejemplo 1 se digirió con NdeI y BamHI, y se efectuó electroforesis de agarosa; se recuperaron en forma similar bandas de aproximadamente 4,6 kpb. El gen estructural de betacelulina de 76 residuos se ligó con el fragmento Ndel-BamHI del vector de expresión pTCII, y luego se incorporó en E. coli JM109 para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, y los plásmidos se recuperaron nuevamente de la cepa, a fin de proporcionar el plásmido de expresión pTCIIBTC76.

El pTCIIBTC76 resultante se incorporó en E. coli MM294 (DE3) para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, a fin de proporcionar la cepa de expresión de betacelulina de 76 residuos MM294 (DE3)/pTCIIBTC76.

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Ejemplo 5

Cultivo de la estirpe de expresión de betacelulina de 76 residuos

La estirpe de expresión de betacelulina de 76 residuos MM294 (DE3)/pTCIIBTC76 se cultivó durante 16 horas a 30ºC en 1 l de medio LB (peptona al 1%; extracto de levadura al 0,5%; cloruro de sodio al 0,5%) que contenía 10 mg/l de tetraciclina. El cultivo resultante para inocular tanques fermentadores de 50 l que contenían 20 l de medio de fermentación primaria (monohidrogenofosfato de sodio al 1,68%; dihidrogenofosfato de sodio al 0,3%; cloruro de amonio al 0,1%; cloruro de sodio al 0,05%; sulfato de magnesio al 0,024%; Nupol LB-625 al 0,02%; hidrocloruro de tiamina al 0,0005%; glucosa al 1,5%; casaminoácido al 1,0%; extracto de levadura al 1,0%), y el cultivo se inició con aireación y agitación en condiciones de 210 r. p. m., un caudal de aire de 20 l/min, y una temperatura de 37ºC. Cuando la turbiedad del cultivo alcanzó aproximadamente 1200 unidades Klett, se agregaron 5,95 mg/l de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG). Se agregó glucosa al 0,75%, 2 y 3,5 horas después de la adición de IPTG, y el cultivo continuó hasta 11 horas luego del inicio del cultivo. Se centrifugó el caldo de cultivo durante 30 minutos a 10.000 r. p. m., a fin de recoger 540 g de las células.

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Ejemplo 6

Purificación de betacelulina de 76 residuos-Met

Se agregó 1,0 l de Tris, 0,1 M-HCl (pH 8,0) que contenían EDTA, 1 mM; APMSF, 1 mM; e hidrocloruro de guanidina, 7 M, a 375 g de células obtenidas del Ejemplo 5. La mezcla se agitó durante la noche a 4ºC para la extracción, y luego se centrifugó (20 min a 10.000 r. p. m.). Se agregaron 19 l de Tris, 50 mM-HCl (pH 8,0) que contenían glutationa de tipo oxidado, 0,5 mM; glutationa de tipo reducido, 1 mM; EDTA, 1 mM; hidrocloruro de arginina, 0,1 M; y urea, 2 M, a 1,0 l del sobrenadante resultante para el replegado durante la noche a 4ºC; a continuación, se efectuó la centrifugación (20 min a 10.000 r. p. m.), a fin de lograr 20 l de sobrenadante. El sobrenadante se concentró usando un sistema de casete Pelicon (fracción peso molecular: 5000, de Millipore). Se agregaron 13,2 l de urea, 2 M, a 3,3 l del concentrado desalado, y el pH se ajustó entonces a 5,0 con ácido hidroclórico. El concentrado se adsorbió con un caudal de 30 ml/min, en una columna Poros 50HS (2,2 cm x 12 cm, de Nippon Perceptive), equilibrada con regulador de acetato de sodio, 50 mM (pH 5,0), y la columna se lavó con el regulador utilizado para la equilibración. A continuación, se efectuó la elución con un gradiente lineal de 0,3 a 1,3 M de cloruro de sodio. Se recogieron las fracciones que contenían la betacelulina de 76 residuos; se diluyeron tres veces con agua destilada, luego se aplicaron a una columna TSKgel CM-5PW (2,15 cm x 15 cm, de Tosoh) equilibrada con acetato de sodio, 50 mM (pH 4,5). Las fracciones se eluyeron de la columna TSKgel CM-5PW, sobre la cual se había adsorbido la betacelulina de 76 residuos-Met, con un gradiente lineal de 0,24 a 0,44 M de cloruro de sodio. Se recogieron las fracciones que contenían la betacelulina de 76 residuos-Met y se adsorbieron en una columna TSKgel ODS-120T (2,15 cm x 30 cm, de Tosoh) equilibrada con ácido trifluoracético al 0,1%, y la betacelulina de 76 residuos-Met se eluyó con un gradiente lineal de 17 a 24% de acetonitrilo. El eluido se dializó contra ácido trifluoracético al 0,02% y se liofilizó. El polvo liofilizado se disolvió en 10 ml de agua destilada, se dejó fluir a través de una columna AG1-X8 (1,0 cm x 10 cm, de Nippon Biorad) tratada con ácido acético, y luego se liofilizó nuevamente, a fin de proporcionar 93 mg de betacelulina de 76
residuos-Met.

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Ejemplo 7

Caracterización de muteínas de betacelulina

La muteína de betacelulina de 77 residuos-Met obtenida en el Ejemplo 3 y la muteína de betacelulina de 76 residuos-Met obtenida en el Ejemplo 6 se caracterizaron de la siguiente manera.

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a) Análisis por SDS-PAGE

Las muteínas de betacelulina y betacelulina de 80 residuos-Met preparada por el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989 se suspendieron en regulador de muestra (Tris, 125 mM-HCl, dodecilsulfato de sodio al 1%, glicerol al 15%, 2-mercaptoetanol al 5%, azul de bromofenol al 0,005%), y se sometieron a electroforesis en Multigel 15/25 (Dai'ichi Kagaku Yakuhin). La tinción del gel de electroforesis con Rapid CBB Kanto (Kanto Chemical) reveló una sola banda en prácticamente todos los casos (Figura 3).

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b) Análisis de composición de aminoácidos

Las muteínas de betacelulina se hidrolizaron en la fase gaseosa durante 24 y 48 horas, a 110ºC con ácido hidroclórico, 6 N, que contenía ácido tioglicólico al 4%, y se determinó la composición de aminoácidos con un analizador de aminoácidos (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). Los resultados mostraron que ambas muteínas contenían metionina derivada del codón de inicio ATG, y fueron coherentes con la composición de aminoácidos deducida de las secuencias de bases de ADNc (Tablas 1 y 2).

TABLA 1 Análisis de composición de aminoácidos de betacelulina de 77 residuos

22

TABLA 2 Análisis de composición de aminoácidos de betacelulina de 76 residuos

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23

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c) Análisis de secuencia de aminoácidos N terminal

La secuencia de aminoácidos N terminal se analizó usando un secuenciador de proteína de fase gaseosa (Applied Biosystems, Model 477A). Los resultados mostraron que ambas muteínas fueron coherentes con la composición de aminoácidos deducida de las secuencias de bases de ADNc. Ambas muteínas tenían metioninas N terminales derivadas del codón de inicio ATG, así como también las tenía el tipo de 80 residuos (Tablas 3 y 4).

TABLA 3 Análisis de secuencia de aminoácidos N terminal de betacelulina de 77 residuos

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TABLA 4 Análisis de secuencia de aminoácidos N terminal de betacelulina de 76 residuos

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d) Análisis de aminoácidos C terminales

Los aminoácidos C terminales se determinaron usando un analizador de aminoácidos (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer) por descomposición de hidrazina de fase gaseosa (6 horas a 100ºC). Se detectó ácido aspártico en la betacelulina de 77 residuos-Met, y se detectó valina en la betacelulina de 76 residuos-Met (Tablas 5 y 6).

TABLA 5

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TABLA 6

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Ejemplo 8

Ensayo de la actividad promotora del crecimiento usando células 3T3

Como se describe en la referencia titulada: Molecular Cell Biology, 8: 588 (1988), la actividad promotora del crecimiento se ensayó por medio de la absorción de ^{3}H-timidina en células 3T3 A31-714 Clon 4 estacionarias (International Journal of Cancer, 12: 463) (1973)).

Específicamente, usando medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero bovino al 5%, se inocularon 100 \mul de 3T3 A31-714 Clon 4 suspendidas a 1000 células/ml, en placas de 96 receptáculos, y se cultivaron durante un día a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5%, 95% de aire). Se tomaron 75 \mul del sobrenadante, y se agregaron 100 \mul de medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco libre de suero, a fin de ajustar la concentración sérica a 1%. Después de dos días más de cultivo, se agregaron diversas concentraciones de la betacelulina de 77 residuos-Met preparada en el Ejemplo 3, la betacelulina de 76 residuos-Met preparada en el Ejemplo 6, y la betacelulina de 80 residuos-Met preparada de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989. Dieciséis horas después de la adición de betacelulina, se agregó ^{3}H-timidina (Amersham Pharmacia Biotech) en una cantidad de 0,25 \muCi/receptáculo; después de 4 horas, las células se lavaron tres veces con PBS, se agregaron 100 \mul de SDS al 5%, y las células se lisaron. El lisado celular se transfirió a viales de centelleo. Se agregó 1 ml de centellador A (Wako Pure Chemicals), y se midió la absorción de ^{3}H-timidina en la célula, con un contador de centelleo (Figura 4).

Ejemplo 9

Ensayo de la actividad promotora de la diferenciación de células \beta usando células AR42J

Se suspendieron células de la estirpe celular AR42J derivada de cáncer pancreático inducido por carcinógenos químicos (Christophe, Am. J. Physiol., 266: G963 (1994)), en una concentración de 10^{5} células/ml, usando medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero de ternero fetal al 10% y la betacelulina de 77 residuos-Met preparada en el Ejemplo 3, la betacelulina de 76 residuos-Met preparada en el Ejemplo 6, o la betacelulina de 80 residuos-Met preparada de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989. Se inocularon 500 \mul de estas suspensiones en portaobjetos de recámara, y se incubaron durante 5 días a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5%, aire al 95%). Después de 5 días, las células se lavaron una vez con PBS, se fijaron en formaldehído al 10%, y se trataron durante 5 min con Triton X-100 al 0,1%. Entonces se agregó Block Ace (Snow Brand, Japón) durante 40 minutos de bloqueo a temperatura ambiente. Se agregaron anticuerpos antiinsulínicos (de Advanced Immunochemicals) diluidos con Block Ace al 10%, y se efectuó una reacción en un lapso de 40 minutos, a temperatura ambiente. Se agregó Triton X-100 al 0,1%; la solución de la reacción se dejó reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente, y las células luego se lavaron tres veces con PBS. Se agregaron anticuerpos IgG antirratón marcados con FITC (isotiocianato de fluoresceína) (Cappel) diluidos con Block Ace al 10%, y se produjo una reacción durante 40 minutos. Se agregó Triton X-100 al 0,1%; la solución de la reacción se dejó reposar durante 5 minutos, las células luego se lavaron tres veces con PBS, y entonces se observaron bajo un microscopio fluorescente. Las células teñidas, esto es, las células que se habían diferenciado en células \beta productoras de insulina, se hallaron en todos los casos que involucraron la adición de betacelulina (Figura 5).

Ejemplo 10

Construcción de vector de expresión de gen de fosfatasa alcalina de placenta humana

La actividad promotora de la diferenciación en células \beta también se determinó usando células AR42J transformadas con el vector que tenía fosfatasa alcalina, que había sido ligado como un reportero corriente descendente del promotor de insulina. Específicamente, las células diferenciadas en células \beta mediante la adición de betacelulina producen fosfatasa alcalina. En consecuencia, por medio del ensayo de la actividad de fosfatasa alcalina, la actividad promotora de la diferenciación en células \beta puede ser ensayada cuantitativamente.

Se preparó ADN genómico de manera convencional, de la cola de rata. La región de promotor de insulina de 0,75 kb se amplificó por PCR con un cebador RI-1 (5'-AGAGTCAAGGATCCCCCAACCACT-3') y un cebador RI-3 (5'-AGCTGGTCACTTAGGGCTGGGG-3') sobre la base de la secuencia de bases del promotor de gen de insulina II de rata bien conocido (GenBank: Acceso Nº J00748), usando el ADN genómico como patrón. Además, se llevó a cabo la PCR usando los cebadores RI-1Cla (5'-GAATCGATAGAGTCAAGGATCCCCCA-3') y RI-3Xho (5'-GACTCGAGCTGGTCACTTAGGG-3') usando el producto de PCR como patrón. Los fragmentos de ADN de 0,75 kb amplificados se aislaron, y el plásmido pTB1881 obtenido con la inserción en el vector pT7 Blue (Novagen 69820-1) se usó a fin de secuenciar la secuencia de bases de los fragmentos clonados, lo que confirmó que estos eran el promotor de insulina de rata. El plásmido pTB1881 se digirió con Xhol-ClaI, para proporcionar fragmentos de ADN de 0,73 kb (promotor de insulina de la rata). El plásmido pTB1330 para la expresión de ADNc de 2,0 kb (J. Berger y col., Gene, 66, 1 (1988)) que codificaba fosfatasa alcalina de placenta humana (PLAP) se digirió con Xhol-HindIII. Los fragmentos de ADN de 2,7 kb resultantes (ADNc de PLAP, que contenía un sitio de empalme derivado de SV40 y sitio de adición polyA, ori derivado de pBR322 y gen de resistencia a ampicilina) se aislaron, y el fragmento Xhol-CalI de 0,73 kb de región de promotor de insulina de rata mencionado se ligó por medio de la reacción de T4 ADN ligasa, a fin de proporcionar el plásmido pTB1898.

Ejemplo 11

Construcción de células AR42J de expresión de PLAP

El plásmido pMCneopolyA (Stratagene), que contenía el gen neo^{r} de Tn5, y el plásmido de expresión PLAP pTB1898 se introdujeron en forma simultánea en células AR42J, usando el reactivo de transfección TransiT^{TM}-LT1 (Mirus, PenVera Corporation). Las células con introducción de plásmido luego se cultivaron durante 2 días en DMEM suplementado con suero de ternero fetal al 10%, y el cultivo entonces continuó en medio de selección suplementado con 800 \mug/ml de G418 (geneticina, Gibco BRL). Los clones se aislaron limitando la dilución de las células en cultivo con resistencia G418.

Las células de cada clon se sembraron en placas de 24 receptáculos y se cultivaron durante 4 días con la adición de 20 ng/ml de betacelulina de 80 residuos-Met, o sin dicha adición. Se recogió el sobrenadante y se trató con calor un período de 30 minutos a 65ºC, y entonces se ensayó la actividad de la fosfatasa alcalina en el medio. Se seleccionaron los clones que mostraron mayor actividad de fosfatasa alcalina con la adición de betacelulina de 80 residuos. Los resultados con varios clones se proporcionan en la Tabla 7 a continuación.

TABLA 7

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Ejemplo 12

Ensayo de la actividad promotora de la diferenciación de células \beta usando células AR42J de expresión PLAP

Las células AR42J de expresión PLAP construidas en el Ejemplo 11 se suspendieron en una concentración de 10^{5} células/ml usando medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero de ternero fetal al 10% y diversas concentraciones de la betacelulina de 77 residuos-Met preparada en el Ejemplo 3, la betacelulina de 76 residuos-Met preparada en el Ejemplo 6, o la betacelulina de 80 residuos-Met preparada de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989. Se inocularon 100 \mul de estas suspensiones en placas de 96 receptáculos, y se incubaron durante 5 días a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5%, 95% de aire). Después de 5 días, se tomó el sobrenadante, y se trató durante 30 min a 65ºC; se agregaron 50 \mul a microplacas de 96 receptáculos que contenían 50 \mul de 2XSEAP (dietanolamina, 2 M; MgCl_{2}, 1 mM; homoarginina, 20 mM). Las muestras se mantuvieron durante 10 min a 37ºC; luego se agregaron 10 \mul de 20 mg/ml de ácido p-nitrofenilfosfórico (Sigma), y se produjo una reacción durante un período de 16 horas a 37ºC (Figura 6). La betacelulina de 77 residuos-Met y la betacelulina de 76 residuos-Met mostraron prácticamente la misma actividad promotora en la inducción de la diferenciación, que la betacelulina de 80 residuos-Met.

Ejemplo 13

Construcción de la estirpe de expresión de 2-76 residuos (que carece de un residuo N terminal y tres residuos C terminales)

Se construyó un plásmido de expresión de betacelulina de 2-76 residuos (que carece de un residuo N terminal y tres residuos C terminales) de la siguiente manera (Figura 7).

Se amplificó el gen estructural de betacelulina de 2-76 residuos (que carece de un residuo N terminal y tres residuos C terminales) por medio de PCR, a partir del plásmido de expresión de betacelulina de 76 residuos (que carece de tres residuos C terminales) pTCIIBTC76 (Ejemplo 4), usando un cebador 3 (5'-CAGCATATGGGGAATTCCACCA
GAAGTCCT) que tiene un sitio de disociación NdeI y un codón de inicio adyacente corriente ascendente de la glicina en 2, y un cebador 4 (5'-GGATCCCTAAACTCTCTCACACCTTGCTCCAATG) que tiene un codón de detención y un sitio de disociación BamHI luego de la valina del terminal C. El gen amplificado de este modo por PCR se ligó al vector pCR2.1, usando un equipo de clonación original TA (de Invitrogen) a fin de preparar pCR2.1BTC2-76. Este se introdujo en E. coli JM109, y se seleccionaron transformantes usando resistencia a ampicilina como indicador. Los transformantes que tenían pCR2.1BTC2-76 se cultivaron, y se preparó pCR2.1BTC2-76 usando un equipo QIAprep8 Miniprep (de Qiagen).

Se digirió pCR2.1BTC2-76 con NdeI y BamHI, para electroforesis de agarosa; se recuperaron aproximadamente 230 pb del gen estructural de betacelulina de 2-76 residuos, usando un equipo de extracción de gel QIAGEN (de Qiagen). El vector de expresión pTCII (Ejemplo 1) se digirió con NdeI y BamHI, y se efectuó electroforesis de agarosa; se recuperaron en forma similar bandas de aproximadamente 4,6 kpb. El gen estructural de betacelulina de 2-76 residuos se ligó con el fragmento Ndel-BamHI del vector de expresión pTCII, y luego se introdujo en E. coli JM109 para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, y los plásmidos se recuperaron nuevamente de la cepa, a fin de proporcionar el plásmido de expresión pTCIIBTC2-76.

El pTCIIBTC2-76 resultante se introdujo en E. coli MM294 (DE3) para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, a fin de proporcionar la cepa de expresión de betacelulina de 2-76 residuos MM294 (DE3)/pTCIIBTC2-76.

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Ejemplo 14

Cultivo de la cepa de expresión de betacelulina de 2-76 residuos

La cepa de expresión de betacelulina de 2-76 residuos MM294 (DE3)/pTCIIBTC2-76 se cultivó durante 16 horas a 30ºC en 30 ml de medio LB (peptona al 1%; extracto de levadura al 0,5%; cloruro de sodio al 0,5%) que contenía 10 mg/l de tetraciclina. Se usaron 10 ml del cultivo resultante para inocular cada uno de seis frascos Mayer de 1 l que contenían 200 ml de medio de fermentación primaria (monohidrogenofosfato de sodio al 1,68%; dihidrogenofosfato de sodio al 0,3%; cloruro de amonio al 0,1%; cloruro de sodio al 0,05%; sulfato de magnesio al 0,012%; hidrocloruro de tiamina al 0,0007%; glucosa al 1,5%; Hicase al 1,5%), para la agitación del cultivo a 200 r. p. m. y a una temperatura de 37ºC. Cuando la turbiedad del cultivo alcanzó aproximadamente 160 unidades Klett, se agregaron 5,95 mg/l de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG). Se continuó con el cultivo durante otras 4 horas luego de la adición de IPTG. Se centrifugó el caldo de cultivo durante 30 minutos a 9000 r. p. m., a fin de recoger 5,1 g de células.

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Ejemplo 15

Purificación de betacelulina de 2-76 residuos

Se agregaron 15 ml de Tris, 0,1 M-HCl (pH 8,0) que contenían EDTA, 1 mM; APMSF, 1 mM; e hidrocloruro de guanidina, 7 M, a 5 g de las células obtenidas en el Ejemplo 14. La mezcla se agitó durante la noche a 4ºC para la extracción, y luego se centrifugó (10 min a 9000 r. p. m.). Se agregaron 250 ml de Tris, 50 mM-HCl (pH 8,0) que contenían glutationa de tipo oxidado, 0,5 mM; glutationa de tipo reducido, 1 mM; EDTA, 1 mM; hidrocloruro de arginina, 0,1 M; y urea, 2 M, a 15 ml del sobrenadante resultante para el replegado durante la noche a 4ºC; a continuación, se efectuó la centrifugación (10 min a 10.000 r. p. m.), a fin de lograr 265 ml de sobrenadante. Se agregó 1 l de urea, 2 M, al sobrenadante; entonces se ajustó el pH a 5,0 con ácido acético, y se dejó reposar durante la noche a 4ºC. Luego se centrifugó (10 min a 10.000 r. p. m.), y el sobrenadante resultante se adsorbió con un caudal de 30 ml/min, en una columna Poros 50HS (2,2 cm x 12 cm, de Nippon Perceptive), equilibrada con regulador de acetato de sodio, 50 mM (pH 5,0), y la columna se lavó abundantemente con el regulador utilizado para la equilibración. A continuación, se efectuó la elución con un gradiente lineal de 0,3 a 1,3 M de cloruro de sodio. Se recogieron las fracciones que contenían la betacelulina de 2-76 residuos; se diluyeron al triple con regulador de acetato de sodio, 50 mM (pH 4,5), y luego se aplicaron a una columna TSKgel CM-5PW (0,75 cm x 7,5 cm, de Tosoh) equilibrada con el regulador. Las fracciones se eluyeron de la columna TSKgel CM-5PW, sobre la cual se había adsorbido la betacelulina de 2-76 residuos, con un gradiente lineal de 0,3 a 0,5 M de cloruro de sodio. Se recogieron las fracciones que contenían la betacelulina de 2-76 residuos y se adsorbieron en una columna TSKgel ODS-120T (2,15 cm x 30 cm, de Tosoh) equilibrada con ácido trifluoracético al 0,1%, y la betacelulina de 2-76 residuos se eluyó con un gradiente lineal de 20 a 44% de acetonitrilo. El eluido se liofilizó, y luego se disolvió en 5 ml de agua destilada, se dejó fluir a través de una columna AG1-X8 (1,0 cm x 10 cm, de Nippon Biorad) tratada con ácido acético, y luego se liofilizó nuevamente, a fin de proporcionar 0,7 mg de betacelulina de 2-76 residuos.

Ejemplo 16

Construcción de cepa de expresión de 24-76 residuos (que carece de 23 residuos N terminales y tres residuos C terminales)

Se construyó un plásmido de expresión de betacelulina de 24-76 residuos (que carece de 23 residuos N terminales y tres residuos C terminales) de la siguiente manera (Figura 8).

Se amplificó el gen estructural de betacelulina de 24-76 residuos (que carece de 23 residuos N terminales y tres residuos C terminales) por medio de PCR, a partir del plásmido de expresión de betacelulina de 76 residuos (que carece de tres residuos C terminales) pTCIIBTC76 preparado en el Ejemplo 4, usando un cebador 5 (5'-CAGCATATGGCTAC
CACCACACAATCAAAG) que tiene un sitio de disociación NdeI y un codón de inicio adyacente corriente ascendente de la alanina en 24, y un cebador 4 (5'-GGATCCCTAAACTCTCTCACACCTTGCTCCAATG) que tiene un codón de detención y un sitio de disociación BamHI luego de la valina del terminal C. El gen amplificado de este modo por PCR se ligó al vector pCR2.1, usando un equipo de clonación original TA (de Invitrogen) a fin de preparar pCR2.1BTC24-76. Este se introdujo en E. coli JM109, y se seleccionaron transformantes usando resistencia a ampicilina como indicador. Los transformantes que tenían pCR2.1BTC24-76 se cultivaron, y se preparó pCR2.1BTC24-76 usando un equipo QIAprep8 Miniprep (de Qiagen).

Se digirió pCR2.1BTC24-76 con NdeI y BamHI, para electroforesis de agarosa; se recuperaron aproximadamente 160 pb del gen estructural de betacelulina de 24-76 residuos, usando un equipo de extracción de gel QIAGEN (de Qiagen). El vector de expresión pTCII preparado en el Ejemplo 1 se digirió con NdeI y BamHI, y se efectuó electroforesis de agarosa; se recuperaron en forma similar bandas de aproximadamente 4,6 kpb. El gen estructural de betacelulina de 24-76 residuos se ligó con el fragmento Ndel-BamHI del vector de expresión pTCII, y luego se introdujo en E. coli JM109 para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, y los plásmidos se recuperaron nuevamente de la cepa, a fin de proporcionar el plásmido de expresión pTCIIBTC24-76.

El pTCIIBTC24-76 resultante se introdujo en E. coli MM294 (DE3) para selección de transformantes por resistencia a tetraciclina, a fin de proporcionar la cepa de expresión de betacelulina de 24-76 residuos MM294 (DE3)/
pTCIIBTC24-76.

Ejemplo 17

Cultivo de la cepa de expresión de betacelulina de 24-76 residuos

La cepa de expresión de betacelulina de 24-76 residuos MM294 (DE3)/pTCIIBTC2-76 se cultivó durante 16 horas a 30ºC en 30 ml de medio LB (peptona al 1%; extracto de levadura al 0,5%; cloruro de sodio al 0,5%) que contenía 10 mg/l de tetraciclina. Se usó el cultivo resultante para inocular cinco frascos Mayer de 1 l que contenían 150 ml de medio de fermentación primaria (monohidrogenofosfato de sodio al 1,68%; dihidrogenofosfato de sodio al 0,3%; cloruro de amonio al 0,1%; cloruro de sodio al 0,05%; sulfato de magnesio al 0,012%; hidrocloruro de tiamina al 0,0007%; glucosa al 1,5%; Hicase al 1,5%), para la agitación del cultivo a 200 r. p. m. y a una temperatura de 37ºC. Cuando la turbiedad del cultivo alcanzó aproximadamente 160 unidades Klett, se agregaron 5,95 mg/l de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG). Se continuó con el cultivo durante otras 4 horas luego de la adición de IPTG. Se centrifugó el caldo de cultivo durante 30 minutos a 10.000 r. p. m., a fin de recoger 3,9 g de células.

Ejemplo 18

Purificación de betacelulina de 24-76 residuos

Se agregaron 12 ml de Tris, 0,1 M-HCl (pH 8,0) que contenían EDTA, 1 mM; APMSF, 1 mM; e hidrocloruro de guanidina, 7 M, a los 3,9 g de las células obtenidas en el Ejemplo 5. La mezcla se agitó durante la noche a 4ºC para la extracción, y luego se centrifugó (10 min a 9000 r. p. m.). Se agregaron 200 ml de Tris, 50 mM-HCl (pH 8,0) que contenían glutationa de tipo oxidado, 0,5 mM; glutationa de tipo reducido, 1 mM; EDTA, 1 mM; hidrocloruro de arginina, 0,1 M; y urea, 2 M, a 12 ml del sobrenadante resultante para el replegado durante la noche a 4ºC; a continuación, se efectuó la centrifugación (10 min a 10.000 r. p. m.), a fin de lograr 212 ml de sobrenadante. Se agregó 0,8 l de urea, 2 M, al sobrenadante; entonces se ajustó el pH a 5,0 con ácido acético, y se dejó reposar durante la noche a 4ºC. Luego se centrifugó (10 min a 10.000 r. p. m.), y el sobrenadante resultante se adsorbió con un caudal de 30 ml/min, en una columna Poros 50HS (2,2 cm x 12 cm, de Nippon Perceptive), equilibrada con regulador de acetato de sodio, 50 mM (pH 5,0), y la columna se lavó abundantemente con el regulador utilizado para la equilibración. A continuación, se efectuó la elución con un gradiente lineal de 0,3 a 1,3 M de cloruro de sodio. Se recogieron las fracciones que contenían la betacelulina de 24-76 residuos; se diluyeron al triple con regulador de acetato de sodio, 50 mM (pH 4,5), y luego se aplicaron a una columna TSKgel CM-5PW (0,75 cm x 7,5 cm, de Tosoh) equilibrada con el regulador. Las fracciones se eluyeron de la columna TSKgel CM-5PW, sobre la cual se había adsorbido la betacelulina de 24-76 residuos, con un gradiente lineal de 0,3 a 0,5 M de cloruro de sodio. Se recogieron las fracciones que contenían la betacelulina de 24-76 residuos y se adsorbieron en una columna TSKgel ODS-120T (2,15 cm x 30 cm, de Tosoh) equilibrada con ácido trifluoracético al 0,1%, y la betacelulina de 24-76 residuos se eluyó con un gradiente lineal de 20 a 44% de acetonitrilo. El eluido se liofilizó, y luego se disolvió en 5 ml de agua destilada, se dejó fluir a través de una columna AG1-X8 (1,0 cm x 10 cm, de Nippon Biorad) tratada con ácido acético, y luego se liofilizó nuevamente, a fin de proporcionar 0,4 mg de betacelulina de 24-76 residuos.

Ejemplo 19

Caracterización de muteínas de betacelulina

La muteína de betacelulina de 2-76 residuos obtenida en el Ejemplo 3 y la muteína de betacelulina de 24-76 residuos obtenida en el Ejemplo 6 se caracterizaron de la siguiente manera.

a) Análisis por SDS-PAGE

Las muteínas de betacelulina y betacelulina de 76 residuos preparada en el Ejemplo 6 se suspendieron en regulador de muestra (Tris, 125 mM-HCl, dodecilsulfato de sodio al 1%, glicerol al 15%, 2-mercaptoetanol al 5%, azul de bromofenol al 0,005%) y se sometieron a electroforesis en Multigel15/25 (Dai'ichi Kagaku Yakuhin). La tinción del gel de electroforesis con Rapid CBB Kanto (Kanto Chemical) reveló una sola banda en prácticamente todos los casos (Figura 9).

b) Análisis de composición de aminoácidos

Las muteínas de betacelulina se hidrolizaron en la fase gaseosa durante 24 y 48 horas, a 110ºC con ácido hidroclórico, 6 N, que contenía ácido tioglicólico al 4%, y se determinó la composición de aminoácidos con un analizador de aminoácidos (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). Los resultados mostraron que ambas muteínas eran coherentes con la composición de aminoácidos deducida sobre la base de las secuencias de bases de ADNc (Tablas 8 y 9).

TABLA 8 Análisis de composición de aminoácidos de betacelulina de 2-76 residuos

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TABLA 9 Análisis de composición de aminoácidos de betacelulina de 24-76 residuos

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c) Análisis de secuencia de aminoácidos N terminal

La secuencia de aminoácidos N terminal se analizó usando un secuenciador de proteína de fase gaseosa (Applied Biosystems, Model 477A). Los resultados mostraron que ambas muteínas fueron coherentes con la composición de aminoácidos deducida de las secuencias de bases de ADNc (Tablas 10 y 11).

TABLA 10 Análisis de secuencia de aminoácidos N terminal de betacelulina de 2-76 residuos

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TABLA 11 Análisis de secuencia de aminoácidos N-terminal de betacelulina de 24-76 residuos

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d) Análisis de aminoácidos C terminales

Los aminoácidos C terminales se determinaron usando un analizador de aminoácidos (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer) por hidrazinólisis de fase gaseosa (6 horas a 100ºC). Se detectó valina en ambas muteínas (Tablas 12 y 13).

TABLA 12

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TABLA 13

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Ejemplo 20

1) Ensayo de unión de EGF usando células A431

Se ensayó la actividad promotora del crecimiento celular por medio de la actividad inhibidora de unión a ^{125}I-EGF, empleando células de carcinoma del epitelio escamoso humano A431 (estirpe de expresión de receptor EGF alta).

Específicamente, 100 \mul de células A431 suspendidas en una concentración de 10^{5} células/ml, usando medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternero fetal al 10%, se inocularon en placas de 96 receptáculos y se cultivaron durante 2 días a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5% y 95% de aire). Luego de 2 días, las células se lavaron tres veces con 200 \mul/receptáculo de medio de unión, que comprendía una mezcla equimolar de DMEM y F-12 que contenía HEPES, 20 mM, y albúmina sérica bovina al 0,1%; a continuación, se agregaron 100 \mul de medio de unión que comprendía diversas concentraciones de EGF no marcado, la betacelulina de 2-76 residuos preparada en el Ejemplo 15, la betacelulina de 24-76 residuos preparada en el Ejemplo 18, la betacelulina de 76 residuos-Met preparada en el Ejemplo 6 y la betacelulina de 80 residuos-Met preparada de acuerdo con la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989, y ^{125}I-EGF, 0,25 nM (Amersham Pharmacia Biotech). Las mezclas se dejaron reposar durante 90 minutos a 4ºC, y luego se lavaron tres veces con 200 \mul de medio de unión; se lisaron las células en 200 \mul de solución acuosa de hidróxido de sodio, 0,1 N, que contenía SDS al 1%. El lisado celular luego se transfirió a viales de centelleo; se agregó 1 ml de centellador A (Wako Pure Chemicals), y se ensayó la actividad inhibidora de la unión a ^{125}I-EGF, con un contador de centelleo.

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2) Ensayo de la actividad promotora de la diferenciación de células \beta usando células AR42J de expresión de fosfatasa alcalina de placenta humana

Se suspendieron células AR42J de expresión de PLAP, en una concentración de 10^{5} células/ml, usando medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco, que contenía suero de ternero fetal al 10% y diversas concentraciones de la betacelulina de 2-76 residuos preparada en el Ejemplo 15, la betacelulina de 24-76 residuos preparada en el Ejemplo 18, la betacelulina de 76 residuos-Met preparada en el Ejemplo 6, o la betacelulina de 80 residuos-Met preparada de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989. Se inocularon 100 \mul de estas suspensiones en placas de 96 receptáculos, y se incubaron durante 5 días a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5%, 95% de aire). Después de 5 días, el sobrenadante del cultivo se trató durante 30 min a 65ºC; se agregaron 50 \mul a microplacas de 96 receptáculos que contenían 50 \mul de 2XSEAP (dietanolamina, 2 M; MgCl_{2}, 1 mM; homoarginina, 20 mM). Se agregaron 10 \mul de 20 mg/ml de ácido p-nitrofenilfosfórico (Sigma), y se produjo una reacción durante un período de 16 horas a 37ºC. La relación entre la actividad EGF y la actividad BTC de todas las muteínas disminuyó a alrededor de 5% de aquella de la betacelulina de 80 residuos-Met, y fue aproximadamente la misma que aquella de la betacelulina de 76 residuos-Met, sin influencia evidente por la deleción N terminal.

3) Los resultados de los puntos 1) y 2) anteriores se resumen en la Tabla 14 TABLA 14

35

Ejemplo 21

Construcción de plásmido de expresión de muteína A hBTC50, pTB1985, incorporando 3 residuos derivados de heregulina (Her) entre Cys3-Cys4

Se llevó a cabo PCR con pTB1976 como patrón, usando (1) un cebador lateral 5' PET-1 (5'-GAAATAATTTTGTT
TAACTTTAAGAAGGAG-3') y cebador lateral 3' BTC-1 (5'-AGGAGGGCGTCGAGGGGTTCTGCTCGGCCA-3'); y (2) cebador lateral 5' BTC-2 (5'-TGGCCGAGCAGAACCCCTCGACGCCCTCCT-3') y un cebador lateral 3' BTC-3 (5'-TCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTC-3').

Una mezcla de los productos de PCR de (1) y (2) se usó como patrón para PCR, empleando un cebador lateral 5' BT-95 h y un cebador lateral 3' BT-94h, a fin de proporcionar fragmentos de ADN codificadores de muteína A con 3 aminoácidos (Asn, Pro, Ser) de la secuencia Her insertados entre los Cys3-Cys4 de hBTC50. El fragmento de ADN fue digerido con Ndel y BamHI y luego insertado en la posición Ndel-BamHI de pET-3c, a fin de preparar pTB1985.

Ejemplo 22

Construcción de plásmido de expresión de muteína B hBTC50, pTB1987, con siete residuos N terminales sustituidos con cinco residuos de factor de crecimiento epitelial (EGF) en las posiciones correspondientes

Se usó pTB1976 como patrón en PCR, empleando un cebador lateral 5' BTC-7 (5'-TATACATATGAACAGC
GACTCTGAGTGCCCCAAGC-3') y el cebador lateral 3' BT-94h, a fin de proporcionar fragmentos de ADN codificadores de muteína B donde siete residuos N terminales de hBTC50 estaban sustituidos con cinco residuos EGF correspondientes. El fragmento de ADN fue digerido con Ndel y BamHI, y luego incorporado en la posición Ndel-BamHI de pET-3c, a fin de preparar pTB1987.

Ejemplo 23

Expresión en E. coli

El plásmido pTB1976, plásmido pTB1985 y plásmido pTB1987 preparados en los siguientes Ejemplos de Referencia y en los Ejemplos anteriores se introdujeron en E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) para expresión bajo el control del promotor \Phi10 del fago T7. Los diversos recombinantes de E. coli se cultivaron a 37ºC usando medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 10 \mug/ml de cloranfenicol. Cuando la turbiedad alcanzó 160 unidades Klett, se agregó \beta-D-tiogalactopiranosida de isopropilo a una concentración final de 0,4 mM, y el cultivo continuó durante otras 4 horas a 37ºC. Luego se cosecharon las células mediante la centrifugación y se almacenaron a -80ºC hasta la extracción.

Ejemplo 24

Purificación de hBTC50, Muteína A y Muteína B 4-1) Preparación de cuerpos de inclusión de E. coli

Las células cosechadas de 400 ml de caldo de cultivo se suspendieron en 20 ml de Tris, 10 mM-HCl (pH 8,0), sacarosa al 10% y EDTA, 10 mM, y luego, se efectuaron ciclos de congelado y descongelado. A continuación, las células se dejaron reposar durante 30 minutos en hielo, y se lisaron por completo. Se disgregaron mediante ultrasonicación (3 veces durante 10 segundos) mientras se enfriaban en hielo, y luego se centrifugaron (15 minutos a 9000 r. p. m. y a una temperatura de 4ºC; Beckman), y se recogió el precipitado nuevamente. Estas operaciones de lavado se repitieron tres veces a fin de preparar los cuerpos de inclusión.

4-2) Extracción de proteína y replegado

Los cuerpos de inclusión preparados en el punto 4-1) se suspendieron en 8 ml de guanidina, 7 M-HCl, Tris, 0,1 M-CH_{3}COOH (pH 8,0) y EDTA, 1 mM, y se agitaron moderadamente con una agitadora, durante 1 hora a 4ºC a fin de extraer la proteína recombinada. Se agregó glutationa de tipo reducido a 0,1 M, y se ajustó el pH a 8,4 con solución de NaOH; se sopló gas nitrógeno en el extracto, a fin de desplazar el aire. El extracto se dejó reposar durante 2 horas a temperatura ambiente, y luego se diluyó con 20 volúmenes de Tris, 10 mM-CH_{3}COOH (pH 8,0), fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 0,5 mM, y benzamidina, 1 mM. El extracto diluido se centrifugó (9000 r. p. m., 15 min, 25ºC) a fin de eliminar el material insoluble; se agregó glutationa de tipo oxidado a una concentración de 0,5 mM al sobrenadante, y se dejó reposar la solución durante 16 horas a temperatura ambiente. El sobrenadante (9000 r. p. m., 15 min, 25ºC) se liofilizó y se concentró, y luego se dializó (Spectrapor: MWCO 1.000) contra Tris, 50 mM-CH_{3}COOH (pH 5,5) y EDTA, 1 mM, a 4ºC. Después de la diálisis, el sobrenadante (9000 r. p. m., 15 min, 4ºC) se filtró con una membrana de celulosa de acetato (Millex GV, 0,22 \mum; Millipore) a fin de eliminar el material insoluble.

4-3) Purificación de proteína

La solución que contenía proteína replegada se cargó en una columna de HPLC de intercambio catiónico (250 x 4,1 mm, d. i., Synchrom CM300 Synchropak) equilibrada con acetato de sodio, 50 mM (pH 5,5), y se eluyó con un gradiente de NaCl, 0 a 1 M, a fin de obtener fracciones. Las fracciones eluidas observadas a OD_{280} se cargaron en una columna de HPLC inversa C_{4} (150 x 4,6 mm d. i., Ultron 300 C_{4}: Chromatopacking Center) equilibrada con HCl al 0,1% y CH_{3}CN al 1%, y se eluyeron con un gradiente de CH_{3}CN de 1 a 40%. Las fracciones pico obtenidas mediante la cromatografía de columna entonces se liofilizaron. Los rendimientos de las Muteínas A y B fueron 78,7 y 103,1 \mug, respectivamente.

4-4) Determinación de la pureza de proteína

A fin de determinar la pureza del producto purificado, se cargó el producto en una columna de HPLC de fase inversa C_{18} (150 x 4,6 mm d. i., ODS120T, Tosoh) y se eluyó con un gradiente de CH_{3}CN de 15 a 30%, lo que confirmó la identidad de las proteínas pico de Muteínas A y B. Ambas proteínas tuvieron una pureza de 94% o más.

Ejemplo 25

Ensayo de la actividad promotora del crecimiento celular usando células 3T3

Se ensayó la actividad promotora del crecimiento celular mediante la absorción de ^{3}H-timidina en 3T3 A31-714 Clon 4 estacionarias (International Journal of Cancer, 12: 463 (1973)), de acuerdo con lo descrito en Molecular Cell Biology, 8: 588 (1988).

Se sembraron en placas de 96 receptáculos 100 \mul de 3T3 A31-714 Clon 4, suspendidas en una concentración de 1000 células/ml usando medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero bovino al 5%, y se cultivaron durante un día a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5%, 95% de aire). Se tomaron 75 \mul de sobrenadante, y se agregaron 100 \mul de medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco libre de suero, a fin de ajustar la concentración sérica al 1%. Luego de dos días más de cultivo, se agregaron diversas concentraciones de hBTC50, Muteína A o Muteína B, preparados en los ejemplos anteriores. Luego de 16 horas después de la adición, se agregó ^{3}H-timidina (Amersham Pharmacia Biotech) en una cantidad de 0,25 \muCi/receptáculo; después de 4 horas, las células se lavaron tres veces con PBS. Se agregaron 100 \mul de SDS al 5%, y las células se lisaron. El lisado celular se transfirió a viales de centelleo, y se agregó 1 ml de centellador A (Wako Pure Chemicals). Se ensayó la absorción de ^{3}H-timidina en las células con un contador de centelleo.

La Tabla 15 proporciona los resultados de las concentraciones de hBTC50 y las muteínas que muestran 50% de actividad (ED_{50}), donde 100% es la absorción máxima de la betacelulina de 80 residuos (referencia).

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TABLA 15 Actividad promotora del crecimiento celular

36

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Ejemplo 26

Ensayo de la actividad promotora de la diferenciación de células B usando células AR42J

Se suspendieron células de la estirpe celular AR42J derivadas de cáncer pancreático inducido por carcinógenos químicos (Christophe: Am. J. Physiol., 266: G963 (1994)), en una concentración de 10^{5} células/ml en medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero de ternero fetal al 10% y uno de hBTC50, Muteína A, Muteína B, o la betacelulina de 80 residuos (hBTC80) preparada de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H10-191989. Se inocularon 500 \mul de estas suspensiones en portaobjetos de recámara, y se incubaron durante 5 días a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5%, 95% de aire). Después de 5 días, las células se lavaron una vez con PBS, se fijaron en formaldehído al 10%, y se trataron durante 5 min con Triton X-100 al 0,1%. Entonces se agregó Block Ace (Snow Brand, Japón) durante 40 minutos de bloqueo a temperatura ambiente. Se agregaron anticuerpos antiinsulínicos (de Advanced Immunochemicals) diluidos con Block Ace al 10%, y se efectuó una reacción en un lapso de 40 minutos, a temperatura ambiente. Se agregó Triton X-100 al 0,1%; la solución de la reacción se dejó reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente, y las células luego se lavaron tres veces con PBS. Se agregaron anticuerpos IgG antirratón marcados con FITC (isotiocianato de fluoresceína) (Cappel) diluidos con Block Ace al 10%, y se produjo una reacción durante 40 minutos. Se agregó Triton X-100 al 0,1%; la solución de la reacción se dejó reposar durante 5 minutos, las células luego se lavaron tres veces con PBS, y entonces se observaron bajo un microscopio fluorescente. Las células teñidas, esto es, las células que se habían diferenciado en células \beta productoras de insulina, se hallaron en todos los casos que involucraron la adición de hBTC50 y Muteínas A y B, como en el caso donde se agregó hBTC80.

No hubo diferencias en la incidencia de células productoras de insulina entre hBTC80, hBTC50 y Muteínas A y B.

Ejemplo 27

Ensayo de la actividad promotora de la diferenciación de células \beta usando células AR42J de expresión de PLAP 3-1) Construcción de vector de expresión de gen de fosfatasa alcalina de placenta humana

La actividad promotora de la diferenciación en células \beta también se determinó usando células AR42J transformadas con el vector que tiene fosfatasa alcalina que había sido ligado como un reportero corriente descendente del promotor de insulina. Específicamente, las células diferenciadas en células \beta mediante la adición de betacelulina producen fosfatasa alcalina. En consecuencia, por medio del ensayo de la actividad de fosfatasa alcalina, la actividad promotora de la diferenciación en células \beta puede ser ensayada cuantitativamente.

Se preparó ADN genómico de manera convencional, de la cola de rata. La región de promotor de insulina de 0,75 kb se amplificó por PCR con un cebador RI-1 (5'-AGAGTCAAGGATCCCCCAACCACT-3') y un cebador RI-3 (5'-AGCTGGTCACTTAGGGCTGGGG-3') sobre la base de la secuencia de bases del promotor de gen de insulina II de rata bien conocido (GenBank: Acceso Nº J00748), usando el ADN genómico como patrón. Además, se llevó a cabo la PCR usando los cebadores RI-1Cla (5'-GAATCGATAGAGTCAAGGATCCCCCA-3') y RI-3Xho (5'-GACTCGAGCTGGTCACTTAGGG-3') usando el producto de PCR como patrón. Los fragmentos de ADN de 0,75 kb amplificados se aislaron, y el plásmido pTB1881 obtenido con la inserción en el vector pT7 Blue (Novagen 69820-1) se usó a fin de secuenciar la secuencia de bases de los fragmentos clonados, lo que confirmó que estos eran el promotor de insulina II de rata. El plásmido pTB1881 se digirió con Xhol-ClaI, para proporcionar fragmentos de ADN de 0,73 kb (promotor de insulina de la rata). El plásmido pTB1330 para la expresión de ADNc de 2,0 kb (J. Berger y col., Gene, 66, 1 (1988)) que codificaba fosfatasa alcalina de placenta humana (PLAP) se digirió con Xhol-HindIII. Los fragmentos de ADN de 2,7 kb resultantes (ADNc de PLAP, que contenía un sitio de empalme derivado de SV40 y sitio de adición polyA, ori derivado de pBR322 y gen de resistencia a ampicilina) se aislaron, y el fragmento Xhol-Clal de 0,73 kb de región de promotor de insulina de rata mencionado se ligó por medio de la reacción de T4 ADN ligasa, a fin de proporcionar el plásmido pTB1898.

3-2) Construcción de células AR42J de expresión de PLAP

El plásmido pMCneopolyA (Stratagene), que contenía el gen neo^{r} de Tn5, y el plásmido de expresión PLAP pTB1898 se introdujeron en forma simultánea en células AR42J, usando el reactivo de transfección TransIT^{TM}-LT1 (Mirus, PenVera Corporation). Las células con incorporación luego se cultivaron durante 2 días en DMEM suplementado con suero de ternero fetal al 10%, y el cultivo entonces continuó en medio de selección suplementado con 800 \mug/ml de G418 (geneticina, Gibco BRL). Los clones se aislaron limitando la dilución de las células en cultivo con resistencia G418.

Las células de cada clon se sembraron en placas de 24 receptáculos y se cultivaron durante 4 días con la adición de 20 ng/ml de BTC de 80 residuos, o sin dicha adición. Se recogió el sobrenadante y se trató con calor un período de 30 minutos a 65ºC, y entonces se ensayó la actividad de la fosfatasa alcalina en el medio. Se seleccionaron los clones que mostraron mayor actividad de fosfatasa alcalina con la adición de betacelulina de 80 residuos. El clon AR71-104 se usó más adelante.

3-3) Ensayo de actividad promotora de la diferenciación de células \beta usando células AR42J de expresión PLAP

Las células AR42J de expresión PLAP construidas en el punto 3-2) se suspendieron en una concentración de 3 x 10^{4} células/ml en medio MEM de Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero de ternero fetal al 10% y diversas concentraciones de la hBTC50 o Muteína A o B, preparados anteriormente. Se inocularon 100 \mul de estas suspensiones en placas de 96 receptáculos, y se incubaron durante 5 días a 37ºC en incubadoras de gas dióxido de carbono (gas dióxido de carbono al 5%, 95% de aire). Después de 5 días, se trataron muestras del sobrenadante de cultivo durante 30 min a 65ºC; se agregaron 50 \mul a microplacas de 96 receptáculos que contenían 50 \mul de 2XSEAP (dietanolamina, 2 M; MgCl_{2}, 1 mM; homoarginina, 20 mM). Las muestras se mantuvieron durante 10 min a 37ºC; luego se agregaron 10 \mul de 20 mg/ml de ácido p-nitrofenilfosfórico (Sigma), y se produjo una reacción durante un período de 16 horas a 37ºC. Se determinó la absorbancia a 405 nm (A_{405}).

La Tabla 16 proporciona la concentración de proteína (ED_{50}) necesaria para mostrar 50% de actividad, donde 100% es la absorbancia máxima cuando se agregó hBTC50.

TABLA 16 Actividad que induce la diferenciación en células \beta

37

Ejemplo de Referencia 1

Construcción de plásmido de expresión de betacelulina humana de 50 residuos (hBTC50), pTB1976

El plásmido pTB1516 que incorpora el ADNc de hBTC de 80 residuos (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) H6-87894; Acceso Nº FERM BP-3836, Acceso Nº IFO 15282) se usó como patrón en PCR, empleando el cebador BT-95h (5'-AGCATATGCGGAAAGGCCACTTCTCTAGGT-3') y el cebador BT-94h (5'-CTGGATCC
TAGTAAAACAAGTCAACTCTCT-3'). Los productos de PCR con un codón de inicio de traducción y sitio Ndel en el terminal 5' de la hBTC de tipo 50 residuos C terminales y un codón de detención y un sitio BamHI insertado en el terminal 3' fueron digeridos con Ndel y BamHI, y se insertaron usando el equipo de ligación de ADN, DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara), al sitio Ndel-BamHI del plásmido de expresión pET-3c (Novagen) que tiene el promotor \Phi10 del fago T7, de manera de preparar el plásmido pTB1976 para la expresión de hBTC50. La secuencia de base del ADNc insertado se confirmó por medio de un secuenciador de ADN ABI (ABI377 DNA Sequencer).

La Figura 10 es un esquema de la construcción del plásmido pTB1976.

Aplicabilidad industrial

Las muteínas de betacelulina y sus sales de la presente invención tienen menor actividad EGF y actividad BTC intacta, sin problemas relacionados con la antigenicidad. Por lo tanto, son útiles como fármacos terapéuticos mejorados para la diabetes.

<110> Takeda Chemical Industries, Ltd.

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<120> Muteína de betacelulina

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<130> 2576WO0P

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<150> JP 10-350377

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<151> 09-12-1998

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<150> JP 11-55326

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<151> 03-03-1999

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<160> 56

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<210> 1

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<211> 77

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 1

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38

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<210> 2

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<211> 76

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 2

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39

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<210> 3

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<211> 47

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 3

40

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<210> 4

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<211> 46

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 4

41

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<210> 5

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<211> 79

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 78

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 77

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 7

44

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<210> 8

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<211> 79

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 8

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<210> 9

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<211> 78

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 49

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 10

47

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<210> 11

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<211> 48

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 47

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 49

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 48

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 14

51

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<210> 15

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<211> 231

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 15

52

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<210> 16

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<211> 228

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 16

53

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<210> 17

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<211> 141

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 17

54

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<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catatggatg ggaattccac cagaagtcct g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccctag tcaactctct cacaccttgc tcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagtcaagg atcccccaac cact

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctggtcac ttagggctgg gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatcgatag agtcaaggat ccccca

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactcgagct ggtcacttag gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcatatgg ggaattccac cagaagtcct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccctaa actctctcac accttgctcc aatg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcatatgg ctaccaccac acaatcaaag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

78

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcatatgcg gaaaggccac ttctctaggt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggatccta gtaaaacaag tcaactctct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaataattt tgtttaactt taagaaggag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggagggcgt cgaggggttc tgctcggcca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggccgagca gaacccctcg acgccctcct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatacatatg aacagcgact ctgagtgccc caagc

\hfill

35

Claims

2. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con la reivindicación 1, donde la relación de la actividad promotora de la diferenciación de células \beta pancreáticas a la actividad promotora del crecimiento de células epiteliales es por lo menos el doble, en relación con aquella de la betacelulina.

3. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con la reivindicación 1, donde se han deleteado 1 a 30 residuos de aminoácidos del terminal N de la betacelulina.

4. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en: (1) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; (2) una secuencia de aminoácidos en la cual se han deleteado 1 a 30 aminoácidos del terminal N en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; (3) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2; o (4) una secuencia de aminoácidos en la cual se han deleteado 1 a 30 aminoácidos del terminal N en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2.

5. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en: (1) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3; o (2) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4.

6. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en: (1) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37; o (2) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38.

8. La muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44.

9. Un método para la elaboración de una muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el cultivo de los transformantes que han sido transformados con vectores recombinados que contienen ADN codificador de la muteína de betacelulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, a fin de producir dicha muteína de betacelulina.

10. Una composición farmacéutica que comprende una muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, donde la composición consiste en fármacos profilácticos o terapéuticos para la diabetes.

12. El uso de una muteína de betacelulina o una de sus sales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la elaboración de un agente profiláctico o terapéutico para la diabetes.