ES2288896T3 - Anticuerpo monoclonal especifico para peptido beta-a4 (1-42). - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal que se une de forma específica al péptido aA4 (1-42) asociado a amiloide difuso, amiloide fibrilar, ovillos neurofibrilares, y amiloide vascular, y no a los péptidos aA4 (1-40) ni aA4 (1-43).
Description
Anticuerpo monoclonal específico para péptido
\beta-A4 (1-42).
Esta solicitud se refiere a la enfermedad de
Alzheimer, en particular, a un anticuerpo monoclonal específico
para el péptido \betaA4 derivado de la proteína precursora de
amiloide, células, procedimientos de generar dichos anticuerpos
monoclonales, y a procedimientos para detectar la presencia de
\betaA4 en tejido.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno
cerebral neurodegenerativa progresivo irreversible. Con el
transcurso de los años, la progresión de la AD provoca pérdida de
memoria, demencia y finalmente la muerte. Actualmente es la cuarta
causa principal de muerte en los Estados Unidos y supone
aproximadamente 100.000 muertes anuales. Habitualmente, la AD
afecta principalmente a los ancianos y por lo tanto, con el
envejecimiento de la sociedad moderna, se espera que sea un
problema sanitario creciente en el futuro próximo. Poco después del
inicio de la enfermedad, los pacientes requieren asistencia todo el
día. Esto representa un tremendo problema psicobiológico así como
financiero para nuestra sociedad. Actualmente no existen medios de
diagnóstico, prevención, tratamiento o cura de la AD.
Neuropatológicamente, la AD se caracteriza por
una masiva pérdida neuronal en ciertas zonas del cerebro y por la
deposición de material proteínico en el cerebro de los pacientes de
AD. Estos depósitos son los neurofibrilares intracelulares y las
placas de \beta-amiloide extracelulares. El
principal componente proteínico de la placa de
\beta-amiloide es el péptido \betaA4. El
análisis de la secuencia del material de las placas de
\beta-amiloide purificado y la espectrometría de
masas mostró que la longitud máxima del péptido \betaA4 es de 43
aminoácidos. Habitualmente, sin embargo, pueden también terminar o
bien en la posición 40 o en la posición 42 (Miller y cols., 1993,
Arch. Biochem. Biophys. 301: 41-52). De forma
similar, en el extremo N pueden observarse ciertas irregularidades,
que dan como resultado varias formas diferentes del péptido, que se
inician principalmente en la posición 1, 4 u 11 (Miller y cols.,
1993).
El clonado molecular reveló que el péptido
\betaA4 se deriva de una proteína precursora mucho mayor
denominada "proteína precursora de amiloide" (APP) (Kang y
cols., 1987, Nature 325: 733-736) (Figura 1). La
Figura 1 ilustra la proteína precursora de amiloide (APP) que es
una proteína transmembrana (Tm = región de la membrana) en la que
el extremo N está localizado en la zona extracelular y el extremo C
está localizado en la zona intracelular (citoplasmática). \betaA4
está parcialmente incrustado en la membrana. Se han descrito
diversas isoformas con ayustes alternativos, que sufren grandes
modificaciones postranslacionales (Selkoe, 1994, Arm. Rev. Neurosci.
17: 489-517). La secuencia de \betaA4 en sí está
localizada parcialmente en la zona extracelular y se extiende
parcialmente a la región transmembrana (Figura 2). La Figura 2 (SEC
ID N.º: 3) ilustra la secuencia de \betaA4, que se muestra (zona
demarcada con un círculo) con su extremo C en la región
transmembrana (Tm, area recuadrada) y el extremo N localizado en la
parte extracelular. Los asteriscos indican la localización de las
mutaciones de las familias del gen APP: o bien flanquean la
secuencia de \betaA4 o están centradas en la sección media de la
secuencia de \betaA4. Se indican los tres sitios principales de
escisión (\alpha, \beta y \gamma). Por lo tanto se postuló
que la liberación de \betaA4 se producía a través de la acción
proteolítica de una o más proteasas en el extremo N (corte en
\beta) y en el extremo C (corte en \gamma) del péptido (Figura
2) (Selkoe, 1994). El principal evento durante la secreción de APP
está en el corte en \alpha (posición 16/17 de \betaA4
"1-42"). Esta molécula de APP secretada
(\alphaAPPs) contiene los primeros 16 aminoácidos de la secuencia
de \betaA4 en su extremo carboxilo. El resto de los fragmentos de
APP asociados a la célula (los denominados fragmentos del extremo C
(CTF)) contienen la porción del extremo C de la secuencia de
\betaA4 y abarcan la región citoplasmática de APP. Por lo tanto,
este corte proteolítico produce fragmentos que pueden no procesarse
de tal forma que directa o indirectamente produzcan fragmentos
amiloidógenos (procesamiento no amiloidógeno) (Selkoe, 1994).
Recientemente, se demostró que las líneas
celulares que expresan grandes cantidades de APP a través de una
construcción de ADNc de APP transfectada de forma estable producen
cantidades de picomolares altas a nanomolares bajas de \betaA4 y
lo liberan rápidamente al medio (Shoji y cols., 1992, Science
258:126-129). También se ha encontrado que casi
todos los cultivos celulares primarios y las estirpes celulares
liberan \betaA4 de forma constitutiva (Busciglio y cols., 1993,
PNAS USA 90: 2092-2096). Además, se ha demostrado
que controles sanos así como pacientes de Alzheimer presentan
cantidades nanomolares bajas de \betaA4 en suero y LCR (Seubert y
cols., 1992, Nature 359: 325-327). La mayoría de las
especies de \betaA4 solubles detectadas en estos fluidos
corporales y medios acondicionados era \betaA4
"1-40", lo que no refleja verdaderamente la
composición global que se encuentra en las deposiciones de las
placas de \beta-amiloide. Por lo tanto ya no
podría mantenerse la noción de que la producción y la posterior
liberación de \betaA4 es suficiente y por lo tanto responsable de
la acumulación de placas de \beta-amiloide en el
cerebro de los pacientes de AD; otros factores deben contribuir a
la deposición de las placas \beta-amiloide. Una
hipótesis muy sencilla es que la producción excesiva aguda o
crónica de \betaA4 provoca la mayor carga de amiloide que se
observa en la AD.
El hallazgo de que mutaciones puntuales
específicas en y alrededor de la región \betaA4 del gen APP están
relacionadas con ciertos casos de enfermedad de Alzheimer familiar
(FAD) demostraron inequívocamente que el gen APP es un "gen de
enfermedad" (Goate y cols., 1991, Nature 349:
704-706; Murrell y cols., 1991, Science 254:
97-99; Levy y cols., 1990, Science 248:
1124-1126; Carter y cols., 1992, Nature Genetics 2:
255-256). En las familias en las que la AD se
hereda de forma dominante con una edad específica de inicio, las
mutaciones puntuales del gen APP son necesarias y suficientes para
provocar AD. Aunque la gran mayoría de los casos de enfermedad de
Alzheimer son esporádicos y probablemente multifactoriales, estas
mutaciones familiares de APP pueden enseñarnos mucho sobre la
amiloidogénesis, es decir, la generación del pequeño péptido
\betaA4 a partir del precursor mayor y su posterior deposición en
placas de \beta-amiloide.
La doble mutación en un codón de APP 670/671 (la
"variante sueca", en el extremo N de \betaA4 en APP) provoca
una liberación de 5 a 8 veces mayor de \betaA4 en cultivos
celulares transfectados de forma estable con ese ADNc de APP mutado
(Figura 2) (Citron y cols., 1992; Cai y cols., 1993). Puede
concebirse que esta doble mutación puntual provoque un mayor
procesamiento de APP debido a una mayor proteolisis en el corte en
\beta, que a su vez produce un mayor nivel de \betaA4 liberado.
Una mayor cantidad de monómeros \betaA4, tal como demuestran los
estudios de transfección con la "mutación sueca", puede
explicar la cinética más rápida de la agregación de \betaA4 a las
placas de \beta-amiloide en estas familias.
Otra mutación de una FAD reside en el extremo C
de \betaA4 en la posición 717 ("variante londinense") y no
afecta al nivel de \betaA4 liberado en el cultivo tisular (Figura
2). Recientemente se ha demostrado que esta mutación en 717 cambia
la proporción entre \betaA4
"1-40/1-42" (Suzuki y cols.,
1994, Science 264: 1336-1340). Aunque no está claro
por ahora cómo se produce la generación del extremo C de \betaA4,
dado que esta parte está incrustada en la región transmembrana, es
tentadora la hipótesis de que la "mutación londinense" afecta
a la escisión proteolítica de APP para producir \betaA4.
Posiblemente, esta mutación puntual interfiere con la fidelidad de
la escisión de la proteasa específica en el sitio \gamma.
\betaA4 1-40 muestra, entre otras cosas, una
tremenda diferencia de solubilidad en soluciones acuosas comparado
con \betaA4 1-42 (Burdick y cols., 1992, JBC 267:
546-554). Éste es casi insoluble en agua, mientras
que 1-40 es soluble en agua hasta varios mg/ml
in vitro. Pequeñas cantidades de la forma más larga
1-42 pueden potenciar la precipitación de
1-40 in vitro de forma notable. Una
proporción ligeramente mayor de la especie de \betaA4
1-42 explicaría el temprano inicio de la deposición
de \betaA4 en las placas de \beta-amiloide en
pacientes con esta "mutación londinense". La proporción entre
la especie 1-42 y la especie 1-40
más corta y más soluble también puede ser uno de los factores
críticos en los casos esporádicos de AD (es decir los casos en los
que no se ha identificado predisposición genética). Los anticuerpos
monoclonales que se unen específicamente a la especie
1-42, son por lo tanto de utilidad para investigar
la producción y presencia de la especie \betaA4 que termina en la
posición del aminoácido 42, y pueden usarse como indicador
diagnóstico de la presencia de especies anormales en la AD.
Los análisis bioquímicos recientes con un
anticuerpo que reconoce el \betaA4 que termina en la posición 40,
y un anticuerpo que reconoce la especie de \betaA4 que se extiende
hasta la posición 42 o más, demostró que la contribución de la
especie de \betaA4 más larga puede ser crítica para el inicio de
la enfermedad (Suzuki y cols., 1994). Sin embargo, el anticuerpo
monoclonal de Suzuki no distingue entre \betaA4
1-42, 1-43, y especies más largas
de \betaA4. Este es también el caso para otro anticuerpo
monoclonal publicado, el 2G9 (Yang y cols., 1994, Neuro Report 5:
2117-2120). Por lo tanto, para evitar esta
reactividad cruzada, sería muy útil disponer de anticuerpos que
sean específicos para la especie de \betaA4 que que termina en la
posición 42 y que excluya las otras formas para evitar la
reactividad cruzada con los fragmentos de APP del extremo C
asociados a la membrana, que son productos celulares habituales no
necesariamente asociados a las placas de
\beta-amiloide.
Se ha descrito un anticuerpo monoclonal que
reconoce \betaA4 1-42 (Murphy y cols., 1994, Am.
J. Path. 144: 1082-1088). Sin embargo, no se usó la
especie del péptido \betaA4 1-43 en estos
estudios, por lo tanto no se sabe la especificidad exacta de este
anticuerpo monoclonal en respuesta al péptido 1-43.
Únicamente se realizaron estudios competitivos con péptidos
\betaA4 que terminaban en la posición 40
("1-40"), y en la posición 44
("1-44") y más con este anticuerpo. De forma
importante, se reseñó que el anticuerpo teñía amiloide difuso,
amiloide fibrilar, ovillos neurofibrilares intraneuronales y
extraneuronales, pero no amiloide vascular.
Una prueba diagnóstica bioquímica in
vitro para la enfermedad de Alzheimer está en las primeras
etapas y tampoco existen medios de detectar los individuos con
riesgo de contraer AD. El actual diagnóstico de AD requiere una
evaluación clínica detallada que no puede dar respuestas claras
hasta que se manifiestan síntomas significativos de demencia y
pérdida de memoria. A la vista de las investigaciones a las que se
ha hecho referencia anteriormente, \betaA4 1-42
representa un marcador preclínico para la AD. Así, la identificación
del nivel o de la acumulación de \betaA4 1-42, o
de otras especies que terminan en el residuo 42 y de cómo esta puede
progresar durante el transcurso de la enfermedad, y de cómo se
distribuye en el cerebro, proporcionará valiosas perspectivas para
controlar el curso además de para el diagnóstico específico y el
posible tratamiento de AD.
Sería de utilidad para preparar pruebas
diagnósticas, agentes terapéuticos y ensayos de control de AD contar
con un anticuerpo monoclonal que, al contrario de lo que sucede con
la especificidad de los anticuerpos disponibles actualmente (que
presentan reacción cruzada con 1-43; que se reseña
que no tiñe amiloide vascular), sí tiñe el amiloide vascular y es
específico para el péptido \betaA4 que termina en el residuo 42, y
por lo tanto extiende la capacidad diagnóstica de la técnica, es
decir uno que reconozca el extremo C libre de \betaA4 y tiña
amiloide difuso y fibrilar, ovillos neurofibrilares, y amiloide
vascular. Dicho anticuerpo es el sujeto de la presente
invención.
La presente invención proporciona un anticuerpo
monoclonal que se une de forma específica al péptido \betaA4
(1-42) asociado a amiloide difuso, amiloide
fibrilar, ovillos neurofibrilares y amiloide vascular, y no a los
péptidos \betaA4 (1-40) ni \betaA4
(1-43).
La presente invención proporciona un anticuerpo
monoclonal que es específico para el péptido \betaA4, de forma
específica el extremo C de \betaA4 "1-42" y
tiñe amiloide difuso y fibrilar, ovillos neurofibrilares, y
amiloide vascular. En particular, la presente invención proporciona
un anticuerpo monoclonal que es específico para péptidos \betaA4
en los que el extremo C es el residuo 42 de la secuencia de
aminoácidos de \betaA4. La presente invención comprende además
fragmentos de anticuerpos y construcciones de los mismos que tienen
la misma especificidad de unión. El anticuerpo monoclonal de la
presente invención puede emplearse en usos de diagnóstico,
purificación y terapéuticos.
Una realización de la presente invención engloba
un anticuerpo monoclonal que se une de forma específica al péptido
\betaA4 (1-42) y no a los péptidos \betaA4
(1-40) ni \betaA4 (1-43), que
puede obtenerse inmunizando a un mamífero con el péptido
Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
(SEC. ID. N.º: 1) conjugado con un vehículo inmunológico
adecuado.
La presente invención también proporciona una
proteína que es un fragmento inmunológicamente activo del anticuerpo
monoclonal de la invención.
Se identifica un anticuerpo monoclonal adecuado
como 369.2B, y es producido por la estirpe celular depositada en la
American Type Culture Collección (ATCC) con el número de acceso HB
11829.
La invención además proporciona el uso del
péptido de la SEC ID N.º 1 conjugado con un vehículo inmunológico
adecuado en la fabricación de un medicamento para la generación de
anticuerpos monoclonales y respuesta inmunitaria en un mamífero, en
el que el conjugado peptídico genera un anticuerpo que se une de
forma selectiva al péptido \betaA4 (1-42) y no a
los péptidos \betaA4 (1-40) ni \betaA4
(1-43).
La presente invención también proporciona un
procedimiento de generar el anticuerpo de la invención, que
comprende inmunizar a un mamífero no humano con el péptido
Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
(SEC ID N.º: 1) conjugado con un vehículo inmunológico
adecuado.
La presente invención también proporciona
procedimientos para detectar la presencia de péptidos \betaA4 que
terminan en la posición 42 Ala en un tejido, que comprenden poner en
contacto un muestra de tejido con un anticuerpo monoclonal o
proteína de la presente invención, detectando la presencia de
anticuerpo monoclonal o proteína de forma selectiva. La presente
invención también proporciona procedimientos para la purificación
selectiva de péptidos \betaA4 que terminan en la posición 42 Ala,
que comprenden poner en contacto una muestra a purificar con el
anticuerpo monoclonal o la proteína de la presente invención,
separar el péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala de
la muestra a purificar, y aislar el péptido \betaA4 que termina en
el aminoácido 42 Ala. En una realización adicional, la presente
invención proporciona procedimientos para la detección del péptido
\betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala asociado a la
enfermedad de Alzheimer, que comprenden poner en contacto una
muestra a analizar con un anticuerpo monoclonal o proteína de la
presente invención, y detectar la presencia de péptidos \betaA4
que terminan en el aminoácido 42 Ala.
Así, la presente invención también proporciona
procedimientos para la prevención de la agregación del péptido
\betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala in vitro, que
comprenden la administración de un anticuerpo monoclonal o proteína
de la presente invención. En una realización preferida el anticuerpo
monoclonal es idéntico a 369.2B, o es un fragmento del mismo
inmunológicamente activo con una especificidad de unión
equivalente.
La presente invención así proporciona un medio
para detectar la presencia de péptido \betaA4 que termina en el
aminoácido 42 Ala, que comprende un fragmento inmunológicamente
reactivo del anticuerpo monoclonal de la presente invención. Además
de un medio para prevenir la agregación del péptido \beta4A que
termina en el aminoácido 42 Ala que comprende un fragmento
inmunológicamente reactivo del anticuerpo monoclonal de la presente
invención, la presente invención proporciona un medio para detectar
y controlar el nivel de péptido \betaA4 que termina en el
aminoácido 42 Ala en muestras de tejido o fluidos (por ejemplo
sangre, otros fluidos corporales, cortes de tejidos, tejidos de
biopsias, etc.).
La presente invención también proporciona el
anticuerpo monoclonal o la proteína de la presente invención para
usar en la detección de la presencia del péptido \betaA4 que
termina en el aminoácido 42 Ala.
La presente invención también proporciona el
anticuerpo monoclonal o la proteína de la presente invención para
usar en la prevención de la agregación del péptido \betaA4 que
termina en el aminoácido 42 Ala.
La presente invención también proporciona un kit
para detectar la presencia de péptido \betaA4 que termina en el
aminoácido 42 Ala que comprende el anticuerpo o la proteína de la
invención, y un medio de detectar el anticuerpo o proteína.
La presente invención también proporciona una
formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo o la proteína
de la presente invención. La presente invención también proporciona
el anticuerpo monoclonal o la proteína de la presente invención
para usar en la prevención o tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer.
La presente invención también proporciona el uso
del anticuerpo monoclonal o la proteína de la presente invención en
la fabricación de un kit para el diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer.
Realizaciones específicas preferidas de la
presente invención serán más evidentes a partir de la siguiente
descripción más detallada de ciertas realizaciones preferidas y las
reivindicaciones.
La invención se comprenderá más completamente al
considerar la siguiente descripción detallada, tomada junto con los
dibujos en los que:
La Fig. 1 es una representación esquemática de
la porción \betaA4 de la proteína precursora de amiloide (APP),
su localización relativa a la membrana cellular y los sitios de
escisión \alpha, \beta y \gamma;
La Fig. 2 muestra la porción \betaA4 de APP,
su posición relativa a la región transmembrana de una célula y tres
sitios principales de escisión (\alpha, \beta y \gamma) en
APP;
La Fig. 3 es un diagrama del clon pGK003 que se
usó para generar el péptido \beta4A 1-42;
La Fig. 4A muestra la SDS-PAGE
en un gel de Tris/Tricina al 16%, de \beta4A marcado
radioactivamente traducido in vitro en un sistema de germen
de trigo;
La Fig. 4B muestra la SDS-PAGE
en un gel de Tris/Tricina al 16%, de \beta4A marcado
radioactivamente traducido in vitro en un sistema de germen
de trigo, inmunoprecipitado con MAb 286.8A;
La Fig. 5 es una gráfica que muestra la
immunoprecipitación de \betaA4 (IVT \beta4A) traducido in
vitro con 286.8A;
La Fig. 6 es un diagrama de los péptidos que se
usan para generar la respuesta inmunitaria (inmunógeno) y para
cribar el suero de ratones;
La Fig. 7 es una gráfica que muestra la
inmunoprecipitación de \betaA4 traducido in vitro en
función de la concentración de anticuerpo; -o- 286.8A, -\Delta-
369.2B, -\Box- 369,6;
La Fig. 8 es una gráfica que muestra el % de
diversas secuencias de \betaA4 inmunoprecipitadas mediante el MAb
369.2;
La Fig. 9 es una gráfica que muestra el mapeo de
los epítopos de MAb 369.2 mediante ensayo competitivo, donde
-\sqbullet- es 35-42 (OVA) (péptido \betaA4
35-42 acoplado a ovalbúmina), -\Box- es el péptido
\betaA4 1-42 y -\blacklozenge- es el péptido
\betaA4 1-40;
La Fig. 10 es una fotografía que muestra la
unión de MAb 369.2B a amiloide vascular y otras placas con diversas
morfologías.
Las deposiciones de
\beta-amiloide en el cerebro con enfermedad de
Alzheimer están formadas principalmente por péptidos \betaA4 que
muestran heterogeneidad tanto en el extremo N como en el C. La
principal especie del extremo C, que se identifica mediante
secuenciación peptídica de \beta-amiloide,
purificado a partir de material cerebral postmortem, termina o en
la posición 40 ó 42 del péptido \betaA4 que tiene como máximo 43
residuos de longitud. Los experimentos in vitro con péptidos
\betaA4 sintéticos que terminan o bien en la posición 40 o en la
42 indican profundas diferencias fisicoquímicas. Anteriormente, no
podía determinarse la distribución de estas dos especies de
\betaA4 en tejido postmortem así como su generación in
vitro debido a la falta de anticuerpos específicos contra el
extremo carboxi que fueran capaces de distinguir entre las
subspecies de péptido \betaA4.
Indicios recientes sugieren que la liberación de
\betaA4 es un evento normal en casi en todos los cultivos
celulares. Habitualmente pueden medirse concentraciones de
picomolares altas a nanomolar bajas de \betaA4 en el suero y en
el líquido cefalorraquídeo (Seubert y cols., 1993). Este hallazgo
fue sorprendente porque se había asumido que la producción de
\betaA4 es un evento patológico dado que \betaA4 se deposita
masivamente en forma de placas de \beta-amiloide
en las regiones cortical e hipocámpica del cerebro de los pacientes
de la enfermedad de Alzheimer. El análisis detallado de la secuencia
del \betaA4 liberado por el cultivo celular reveló que la especie
principal termina en la posición 40 (Selkoe, 1994). Las placas de
\beta-amiloide purificadas de cerebro postmortem
muestran una realidad ligeramente diferente: los depósitos de
amiloide de la angiopatía amiloide congófila (CAA) son agregados de
\betaA4 que rodean los vasos sanguíneos y son predominantemente
\betaA4 1-40, mientras que por el contrario, los
núcleos de las placas de \beta-amiloide (APC) que
están presentes en el parénquima cerebral y no están asociados a
los vasos sanguíneos muestran unos extremos N irregulares (que
empiezan lo más habitualmente en los residuos 1, 4 y 11) y terminan
principalmente o bien en la posición 40 ó 42 (Glenner y Wong, 1984,
Biochem. Biophy. Res. Comm. 120: 885-890; Masters y
cols., 1985, PNAS USA 82: 4245-4249; Miller y
cols., 1993). Ocasionalmente se han descrito especies más largas que
terminan en el 43 o que se extienden incluso más (Miller y cols.,
1993). Debido a que la longitud del extremo C hidrófobo es crítica
para la capacidad del péptido de agregarse in vitro (Burdick
y cols., 1992; Jarrett y cols., 1993, Biochem. 32:
4693-4697), es completamente posible que los dos
agregados patológicos diferentes, APC y CAA y otras placas de
\beta-amiloide vasculares puedan justificarse
gracias a las diferentes propiedades de las dos especies
1-40 y 1-42. Este podría ser el caso
también de las denominadas "placas difusas" (Selkoe, 1994) que
se observan con frecuencia en el cerebro de seres humanos ancianos y
que no están asociadas a la AD pero que, sin embargo, se ha
propuesto que son precursoras de los depósitos
\beta-amiloide fibrilar. Se ha sugerido una
agregación no fibrilar de \betaA4 para estas estructuras. Por lo
tanto es de importancia capital determinar la producción específica
de tejido de estas especies más largas de \betaA4 (es decir, las
que terminan en la posición 42) y su aparición patológica en el
cerebro de los pacientes de AD. Recientemente, se han publicado
tres artículos en los que se han descrito anticuerpos que distinguen
las especies 1-42 y 1-40 de
\betaA4 (Suzuki y cols., 1994; Murphy y cols., 1994; Yang y cols.,
1994). Al contrario que los anticuerpos de la presente invención,
los anticuerpos reseñados por Suzuki y cols., y Yang y cols.,
presentan reacción cruzada en un grado significativo tanto con la
especie 1-43 como con la 1-42 el
péptido \betaA4. El anticuerpo de Murphy y cols., aunque no se ha
analizado su unión a la especie 1-43 del péptido
\betaA4, muestra un patrón diferente de unión a los tejidos que
los anticuerpos de la presente invención, y por lo tanto debe
reconocer un epítopo diferente, o modificado, del que reconocen los
anticuerpos de la presente invención.
Las posiciones 29 a 42 del péptido \betaA4
quedan completamente dentro de la putativa región transmembrana de
la proteína precursora de amiloide y son de naturaleza hidrófoba
(Miller y cols., 1993). Los péptidos sintéticos en las secuencias
del extremo C de esta región deben contrarrestar la capacidad de la
secuencia de 34-42 de formar una estructura
inusualmente estable que es casi insoluble en agua y
desnaturalizantes potentes (Halverson y cols., 1990, Biochem. 29:
2639-2644) si van a usarse para provocar una buena
respuesta inmunitaria contra \betaA4 soluble. Los presentes
inventores diseñaron un espaciador hidrófilo de cinco residuos de
longitud que resolvería esos problemas de insolubilidad y que
también separarían el presunto epítopo del vehículo. Para reducir
las probabilidades de reactividad cruzada con la especie de
\betaA4 más corta pero principal, 1-40, los
presentes inventores eligieron un epítopo peptídico mínimo de 8
residuos que corresponde a las posiciones 35-42 de
la secuencia de \betaA4. Toda la secuencia sintética diseñada de
este modo se acopló, mediante un grupo sulfhidrilo libre en un
residuo de cisteína del extremo N, a KLH (hemocianina de la lapa
californiana).
El uso con éxito de espaciadores y residuos
hidrófilos en la producción de anticuerpos contra péptidos está
bien documentado al igual que el uso de estructuras hidrófilas para
solubilizar haptenos insolubles para su conjugación (McMillan y
cols., 1983, Cell 35: 859-863; Makela y Seppala,
1986, en Handbook of Experimental Inmunology. Volumen 1:
Inmunochemistry, Wier, D.M., editor. Blackwell Scientific
Publicaciones, Oxford, páginas 3.1-3.13). El éxito
de este procedimiento para producir anticuerpos específicos puede
atribuirse al menos en parte a la presencia de un extremo carboxilo
cargado libre, especialmente en el contexto de una secuencia
hidrófila, ya que los residuos terminales de los antígenos
peptídicos dan lugar a proporciones significativas de anticuerpos
contra péptidos (Gras-Masse y cols., 1985, en
Synthetic Peptides in Biology and Medicine, Alitalo, K. y cols.,
editores, Elsevier, Ámsterdam, página 105). Esto, junto con el uso
selectivo y novedoso de una secuencia mínima de \betaA4 que se
usa como inmunógeno maximizó la probabilidad de producir un
anticuerpo que podría distinguir entre la especie de \betaA4 que
termina en la posición 42 y las que no. Aunque los estudios
competitivos de péptidos no localizaban exactamente el determinante
antigénico, las secuencias de \betaA4 distintas de
1-42 no se unían de forma eficaz. El hecho de que
1-42 no competía totalmente con \betaA4 traducido
in vitro marcado con ^{35}S-metionina puede
deberse o bien a las propiedades particulares de la molécula misma
o al hecho de que el inmunógeno peptídico 35-42 se
presentó en el contexto de un espaciador y/o vehículo específicos,
o a que un exceso de 200-1000 veces de péptido sin
marcar no es suficiente para inactivar la señal. Los efectos no
específicos de los residuos del extremo N en la actividad antigénica
también están bien documentados (Benjamini y cols., 1968, Biochem.
7: 1261-1264).
El intrigante hallazgo de que
25-35 de hecho potencia la capacidad de 369.2B y
otros anticuerpos de unirse a \betaA4 puede deberse a una
peculiar interacción entre el péptido acortado y la secuencia de
\betaA4 de longitud completa. Se cree que los residuos
26-33 existen en forma de un enrollamiento aleatorio
en solución acuosa (Halverson y cols. 1990) y pueden ser capaces de
interactuar con \betaA4 soluble de tal forma que haga que el
extremo C sea más accesible a los sitios de unión de los
anticuerpos.
El anticuerpo altamente específico de la
presente invención, del que 369.2B es un ejemplo particular, se
produjo contra un péptido \betaA4 sintético que tenía los
residuos 35-42, y no reconoce la especie más corta
de \betaA4 1-40 en solución o en una fase sólida.
Además, tanto 1-40 y 1-43 fueron
incapaces de eliminar por absorción el anticuerpo cuando se usa
inmunocitoquímicamente. Se aplicó un procedimiento de cribado
secundario con capacidad de procesamiento media para el cribado de
sobrenadantes de hibridoma usando \betaA4 traducido in
vitro marcado radiactivamente de forma que los anticuerpos
seleccionados en el cribado primario pudieran seleccionarse además
por su capacidad de inmunoprecipitar \betaA4 soluble. Este
procedimiento puede adaptarse fácilmente a otras
proteínas/anticuerpos de interés. El MAb resultante 369.2B
representa una herramienta superior para investigar el papel de los
péptidos \betaA4 que terminan en la posición 42 in situ, en
tejido postmortem, en animales transgénicos y para la generación
in vitro de péptidos \betaA4 en modelos establecidos de
producción de \betaA4 celular, para uso en el diagnóstico y
terapéutico.
El anticuerpo monoclonal de la presente
invención representa una herramienta importante necesaria para
establecer un kit de prueba diagnóstica. Permite medir/cuantificar
la cantidad del \betaA4 1-42 o de sus derivados
(por ejemplo la especie 4-42 y otras formas
truncadas con el extremo carboxi "42") en fluidos corporales
humanos (LCR, suero, orina, etc.) o en tejidos. También puede
usarse para estudiar el patrón de distribución de
1-42 o de la especie de \betaA4 que termina en
el residuo 42, en cerebros con AD comparando con controles sanos.
Su avidez excepcionalmente alta hace que sea una herramienta
superior y novedosa para dichas pruebas. El anticuerpo monoclonal
que se describe aquí puede usarse también en sistemas de modelos
biológicos como por ejemplo cultivos de células transfectados o
modelos animales (ratones transgénicos), diseñados para medir y/o
influenciar la presencia y/o producción de la especie de \betaA4
que termina en el aminoácido 42. Estos sistemas en modelos
representan un medio para identificar los moduladores selectivos de
la producción de \betaA4 que terminan en la posición del
aminoácido 42 de \betaA4 en sistemas biológicos. Los anticuerpos
de la presente invención proporcionan procedimientos de prevenir la
agregación del péptido \betaA4 debido a que la especificidad del
anticuerpo permitirá la interferencia específica con el residuo del
extremo C libre, interfiriendo así y alterando la agregación que
puede ser patógena en la AD.
De forma sorprendente, el anticuerpo de la
presente invención difiere del de la técnica anterior en que tiñe
amiloide difuso y fibrilar, ovillos neurofibrilares, y amiloide
vascular aunque es específico para el residuo 42 del extremo C
libre del péptido \betaA4. Este patrón de unión único muestra que
el anticuerpo de la presente invención reconoce un epítopo
diferente del de la técnica anterior y que la distribución tisular o
accesibilidad del péptido \betaA4 que reconoce el anticuerpo de
la presente invención es también diferente. Además, la presente
invención proporciona un anticuerpo monoclonal que puede precipitar
el péptido \betaA4 de la solución que no demuestran los
anticuerpos de la técnica anterior. Así, la presente invención
proporciona anticuerpos monoclonales únicos que reconocen un
subconjunto único de especie de \betaA4 que tiene una distribución
tisular distinta que lo más probablemente es un mejor indicador
diagnóstico que los anteriormente disponibles, y una diana única
para la intervención terapéutica.
Así, la presente invención proporciona
anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y construcciones de los mismos
que son específicos para la especie del péptido de \betaA4 en la
que el extremo C termina en el residuo 42. Dichos anticuerpos,
fragmentos de unión y sus construcciones pueden usarse en
procedimientos de diagnóstico, análisis, terapia y purificación
bioquímica que emplean la especificidad de unión de los presentes
anticuerpos monoclonales y su uso en formulaciones
farmacéuticas.
Los siguientes ejemplos explicarán la presente
invención adicionalmente y se muestran a modo de ilustración, no a
modo de limitación. Los siguientes ejemplos ilustran ciertos
aspectos de los procedimientos y composiciones identificados
anteriormente así como los resultados ventajosos.
Los procedimientos generales de clonado y de
biología molecular se encuentran por ejemplo en Sambrook, Fritsch,
y Maniatis, 1989, Molecular Cloning 2ª edición, Cold Spring Harbor
Lab Press. El plásmido pM 11-26, que es un clon
Bluescript KS que contiene 2.415 kb (pares de kilobases) de la
secuencia de APP con un codón de terminación TAG seguido de un
sitio BamHI situado en marco mediante mutagénesis dirigida al sitio
después del codón del aminoácido 42 de la región \betaA4, se
modificó escindiendo un fragmento de 1,8 kb de XbaI/BgI II y
volviendo a ligar el plásmido después de completar los extremos. La
construcción resultante, denominada pGK002, introduce el codón de
iniciación que contiene la secuencia consenso de la secuencia de
\betaA4 inmediatamente aguas abajo del promotor de Bluescript
T7.
El plásmido pGK003 (Fig. 3), que se usó en todas
las traducciones de \betaA4 in vitro en el sistema de
germen de trigo que se describe anteriormente, se preparó
subclonando un fragmento de 590 bp (pares de bases) NotI/Xho I de
pGK002 que contiene toda la secuencia de \betaA4 humano con la
terminación mutagenizada/Bam HI en un vector pSP64 polyA (Promega
Corp.). Para preparar este plásmido, se digirió pGK002 con Not I y
Xho I y el fragmento de 590 bp se completó con Klenow, se aisló y se
ligó con pSP64polyA linearizado con Sma I. La Figura 3 es un
diagrama del Clon pGK003. El marco de lectura abierto de
\betaA41-42 se expresa in vitro a partir
del promotor bacteriano SP6. La región 3' sin traducir
(3'-UT) región de APP se muestra en negro.
El plásmido pGK003 se linearizó con EcoRI y la
digestión completa se confirmó mediante electroforesis en gel de
agarosa. La muestra se extrajo dos veces con fenol/cloroformo,
seguido de dos extracciones con cloroformo y precipitación con
etanol. El sedimento resultante se lavó una vez en etanol al 70%, se
secó parcialmente a vacío y se volvió a suspender en TE a una
concentración de 1 \mug/\mul.
Los transcritos in vitro usando
plantillas linearizadas a 30 \mug/ml se prepararon en tampón de
HEPES 80 mM-KOH (a pH 7,5) que contenía MgCl_{2}
16 mM, espermidina 2 mM, DTT 40 mM, ATP/CTP/GTP/UTP 3 mM, 800
unidades/ml de Inhibidor de ribonucleasas RNAsin (Promega Corp.), 5
unidades/ml de pirofosfatasa inorgánica de levaduras (Sigma Corp.),
y 1800 unidades/ml de RNA polimerasa SP6 (Promega Corp.). La mezcla
de reacción se mantuvo a 37ºC durante 4 horas. El tránscrito
resultante se verificó mediante electroforesis a través de un gel
de agarosa al 1,2%/TBE/EtBr con muestras desnaturalizadas (65ºC x 10
minutos).
\newpage
Los tránscritos se tradujeron usando extracto de
germen de trigo (Sigma Corp.). Resumiendo, los tránscritos se
calentaron (65ºC x 10 minutos), se mezclaron con el extracto de
germen de trigo que contenía KAc, RNAsin, y una mezcla aminoácidos
sin metionina, y se tradujeron a 25ºC durante 1 hora en presencia de
metionina marcada con ^{35}S (Amersham). La traducción de una
proteína \betaA4 de 4 kD (kilodaltons) se verificó mediante
SDS-PAGE usando gel de Tris al 16%/Tricina (Novex).
Los geles se fijaron y las proteínas se visualizaron
fluorográficamente usando un sistema comercial "Amplify"
(Amersham).
La incorporación del marcador a \betaA4
traducido in vitro, que contiene uno residuo de metionina por
molécula, se determinó mediante separación en gel. Se solubilizaron
geles de 2 mm en 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30%, NH_{4}OH
0,75 M hasta la mañana siguiente a 37ºC. Después se añadió un
volumen de 10 ml de un cóctel de centelleo "Ready Value"
(Beckman) y se determinaron las DPM (desintegraciones por minuto)
usando un escintilómetro Beckman LS6000IC en modo auto DPM. Las
reacciones típicas producen \sim250 ng de \betaA4/ml o \sim56
nM.
La transcripción in vitro seguida de la
traducción del clon de \betaA4, pGK003, en un sistema de germen
de trigo produjo una única proteína de producto de 4 kD cuando se
visualizó mediante fluorografía en un gel de SDS de poliacrilamida
y Tris al 16%-Tricina (Figura 4A). La Figura 4A muestra los
resultados de la SDS-PAGE en un gel de Tris al
16%/Tricina. Carril 1: Marcadores de PM alto. Carril 2: Marcadores
de PM bajo. Carril 3: \betaA4 traducido in vitro en un
sistema de germen de trigo. La identidad de este producto de 4 kD
se confirmó mediante inmunoprecipitación con anticuerpos específicos
contra \betaA4 (Figura 4B). La Figura 4B muestra los resultados
de la SDS-PAGE en un gel de Tris al 16%/Tricina.
Carril 1: Marcadores de PM alto. Carril 2: Marcadores de PM bajo.
Carril 3: \betaA4 traducido in vitro a partir de un sistema
de germen de trigo inmunoprecipitado con el MAb 286.8A. La
transcripción y traducción de este así como de otros clones de
\betaA4 en un sistema de lisado de reticulocitos combinado (TnT)
no produjo el mismo rendimiento ni pureza de \betaA4 marcado
radioactivamente (no se muestran los datos). Esto podría deberse a
lo corto del tránscrito o a la peculiar naturaleza del péptido
\betaA4 mismo.
El anticuerpo monoclonal 286.8A, que se produjo
contra el péptido 1-42 en bruto y cubre la región de
3-8 de \betaA4 fue capaz de precipitar esta
proteína de forma dependiente de la concentración (Figura 5). La
Figura 5 representa esta inmunoprecipitación de \betaA4 traducido
in vitro (IVT \betaA4). Se inmunoprecipitaron cantidades
crecientes de IVT \betaA4 con una cantidad fija de 286.8A (7,4
\mug) en 100 \muI de tampón RIPA.
Los péptidos se prepararon mediante
procedimientos estándar de Fmoc en fase sólida (véase por ejemplo
Gras-Masse y cols., 1985).
El Péptido n.º 959, un péptido sintético de 14
residuos que tiene una cisteína en el extremo N unida a un
espaciador hidrófilo DGDGD y los residuos 35-42 de
\betaA4 humano (que daba la secuencia completa: CDGDGDMVGGVVIA
(SEC. ID. N.º: 1)), se acopló a un vehículo de KLH (hemocianina de
lapa californiana) activada con maleimida usando el kit de
conjugación de inmunógenos activados "Imject" disponible
comercialmente (Pierce). Resumiendo, 2 mg de péptido se disolvieron
en 200 \mul de tampón de conjugación y se dejó reaccionar a
temperatura ambiente durante 2 horas con 2 mg de KLH activada con
maleimida reconstituidos. El conjugado se purificó mediante
filtración en gel y se usó como inmunógeno para la producción de
anticuerpos monoclonales usando protocolos estándar tal como se
describe en el Ejemplo 4.
El péptido n.º 958, un péptido sintético de 14
residuos que tiene una cisteína en el extremo N unida a un
espaciador GGGGG y los residuos 35-42 de \betaA4
humano (que daba la secuencia completa: CGGGGGMVGGVVIA (SEC. ID.
N.º: 2)), se acopló a ovalbúmina disolviendo 2 mg de péptido en 200
\mul de guanidina 6 M, fosfato 0,01 M a pH 7,0 y se conjugó como
anteriormente a 2 mg de una ovoalbúmina activada con maleimida
reconstituida. El conjugado purificado se usó en un cribado
mediante ELISA de productos monoclonales de la fusión. Los
anticuerpos cribados de esta forma son específicos para el
determinante "35-42" no para el espaciador, ni
para las porciones del puente de cisteínas ni de vehículo del
inmunógeno.
Figura 6: Ilustra el péptido que se usó para
generar la respuesta inmunitaria (el inmunógeno) y se muestra el
péptido que se usó para cribar el suero de ratones, así como las
fusiones, en la placa de inmunoensayo enzimático (EIA). La
secuencia de \betaA4 35-42 se sintetizó junto con
un espaciador y una cisteína en el extremo C, que después se usó
para acoplarla covalentemente mediante un puente de maleimida a una
gran molécula de vehículo. Tanto el espaciador como la molécula de
vehículo en el péptido inmunógeno y de cribado son diferentes para
poder seleccionar los anticuerpos específicos contra una secuencia
de \betaA4.
Se usa el éster
N-hidroxisuccinimidínico de biotina para biotinilar
el anticuerpo monoclonal 286.8A. Primero se verifica la integridad
del reactivo observando su hidrólisis espontánea en ausencia de las
aminas primarias: se monitoriza una solución de 0,2 mg/ml de
NHS-LC-Biotina (Vector Labs,
Burlingame, CA) en PBS a 260 nm en función del tiempo. Una OD260 de
1,0 después de aproximadamente 2 horas (que aumenta a partir de una
OD260 inicial de 0,55) indica la hidrólisis esperada.
En la reacción de biotinilación se ha encontrado
que una relación molar de 66:1 entre biotina y 286.8A monoclonal a
pH neutro proporciona resultados óptimos cuando se analiza 286.8A
biotinilado en un formato de Elisa. Se añaden 0,6 mg de
NHS-LC-Biotina en H_{2}O a una
concentración de 0,1 mg/ml (en el plazo de 5 minutos a partir de la
disolución) a 1 ml (2 mg) de 286.8A en PBS. Se deja que se produzca
el ataque nucleófilo del éster de NHS a 25ºC durante 4 horas
después de lo cual se añaden 10 mg de glicina en 50 \mul de
H_{2}O para terminar la reacción. La reacción después se
introduce en una columna de desalación de dextrano reticulado de 10
ml equilibraba con PBS y se recogen alícuotas de 0,5 ml. El primer
pico que representa el pico de IgG se agrupa y se almacena a 4ºC
hasta su
uso.
uso.
Se recubren placas de Elisa Corning 25801 de 96
pocillos hasta la mañana siguiente a 4ºC con 100 \mul de 4GB u
otro anticuerpo de captura a 5 \mug/ml habitualmente en H_{2}O o
tampón. La placa después se lava con PBS que contiene Tritón
X-100 al 1% en un Dynatech Ultrawash plus. Después
los pocillos se bloquean durante 90 minutos con 300 \mul de PBS
que contiene Tritón X-100 al 1% y BSA de calidad de
Elisa al 1% (tampón de bloqueo). Después de lavar, se añade el
antígeno o la incógnita diluidos en tampón de bloqueo a los pocillos
por triplicado y se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas.
La placa se lava 2 veces y se añaden 400 ng de 286.8A biotinilado o
de otro anticuerpo de detección. Después de 30 minutos, la placa se
lava más profusamente (lavado 2 veces, remojado de 2 minutos,
lavado 2 veces) y se añaden 100 \mul de complejos de
Avidina-Biotina-Fosfatasa alcalina
previamente formados (Vector Labs). La placa se lava (lavado 2
veces, remojado de 2 minutos, lavado 2 veces, remojado de 5
minutos, 4 lavados) y se añade sustrato MUP a 0,06 mg/ml 1 x tampón
de dietanolamina. Las placas se leen en un Millipore Cytoflour
después de 15 minutos usando un filtro de excitación de 360 nm y un
filtro de emisión de 460 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizó a ratones Balb/c con inoculaciones
múltiples por vía i.p. de péptido n.º 959 conjugado con KLH. Los
esplenocitos de los animales inmunizados se fusionaron con el
mieloma de ratón AG8 usando protocolos estándar (Wundertich y
cols., 1992, J. Inmunol. Methods 147:1-11). Los
sobrenadantes de los hibridomas resultantes se cribaron para
detectar la inmunorreactividad contra el péptido n.º 958 acoplado a
ovoalbúmina usando protocolos estándar de Elisa tal como se
describe anteriormente. Los hibridomas positivos para la expresión
de los MAb inmunorreactivos se clonaron al menos dos veces mediante
dilución limitada y se realizó un análisis del isotipo de los MAb.
Se preparó IgG de MAb purificada a partir de fluido de ascitis
usando cromatografía por afinidad con
Proteína-A.
Después el cribado de la fusión demostró que la
inmunización de los ratones con el péptido n.º 959 conjugado con
KLH y el cribado en formato ELISA de fase sólida con el péptido n.º
958 acoplado a ovoalbúmina produjo seis señales progenitoras
positivas (numeradas de 369.1 a 369.6). Ambos péptidos tienen la
región de \betaA4 de los aminoácidos 35-42,
diferentes espaciadores en el extremo N y una cisteína para el
acoplamiento covalente a las proteínas de vehículo (Figura 6). El
extremo C libre con el grupo carboxi cargado y una longitud limitada
de sólo 8 aminoácidos favorece la generación de anticuerpos que se
dirigen de forma específica contra formas más largas de los
péptidos \betaA4; por lo tanto, los péptidos \betaA4 que
terminan antes del aminoácido 42 no serían reconocidos.
La Figura 6 representa el diagrama de la
estructura del inmunógeno (vehículo-péptido) y el
péptido de cribado (vehículo-péptido de cribado)
que se usa.
Dos de las seis señales parentales finalmente no
pudieron clonarse. De las cuatro restantes, dos dieron señales de
inmunoprecipitación/centelleo superiores a los controles no
inmunitarios normales sólo en un pequeño porcentaje; los otros dos
(identificados como 369.6 y 369.2) mostraron señales del 18% y el
19%, respectivamente. Se llevó a cabo la producción de anticuerpos
monoclonales a partir del fluido de ascitis y la posterior
inmunopurificación de estos clones. La Tabla 1 compara los datos
obtenidos con el IPSA para los sobrenadantes de los hibridomas y
los anticuerpos purificados.
\vskip1.000000\baselineskip
Para desarrollar y cribar anticuerpos
monoclonales que reconocen el péptido \betaA4 en solución en lugar
de cuando está unido a una fase sólida, se desarrolló un ensayo en
el que se cuantifica la inmunoprecipitación de un \betaA4
traducido in vitro (IVT \betaA4) marcado con
^{35}S-metionina. Se permite que una cantidad
estándar de \betaA4 traducido in vitro forme complejos de
anticuerpo/antígeno en una solución que puede optimizarse para
determinar la potencia iónica, el pH, y la composición del
detergente. Después, los complejos inmunitarios se precipitan con
Proteína G (células Omnisorb) y se lavan profusamente, la
radioactividad unida se cuenta en un escintilómetro de líquidos, se
resta el ruido de fondo y se calcula la eficacia de la
precipitación. Este ensayo de inmunoprecapitación/centelleo (IPSA)
permite la rápida identificación y caracterización de anticuerpos,
y se ha usado para analizar una variedad de anticuerpos contra
\betaA4. El ensayo puede aplicarse en general a sobrenadantes de
hibridomas monoclonales así como a suero policlonal para identificar
anticuerpos que pueden usarse para inmunoprecipitaciones.
Habitualmente pueden realizarse 18 IPSA en un día. Por lo tanto
este es un procedimiento de cribado secundario de hibridomas rápido
e
informativo.
informativo.
Resumiendo, se añadieron aproximadamente 1,5 x
10^{5} DPM de \betaA4 traducido in vitro marcado con
^{35}S-metionina (IVT \betaA4) a 10 \mul de 10
x tampón de inmunoprecipitación (NaCl 150 mM, NP-40
al 10%, ácido desoxicólico al 5%, SDS \sim1%, Tris 500 mM a pH
8). A esto, se añadieron 90 \mul de sobrenadante de células
monoclonales de la fusión monoclonal de interés (denominada n.º
369) y se dejaron reaccionar durante 2 horas a 4ºC. El ruido de
fondo se determinó usando 90 \mul de sobrenadante de un clon no
reactivo; el control positivo era 90 \mul de sobrenadante que
contenía anticuerpo monoclonal 286.8A que se había obtenido primero
contra una preparación de \betaA4 (1-42) sintético
en bruto. Después de 2 horas, se añadieron 40 \mul de una
solución al 10% de células Omnisorb (Calbiochem) equilibradas en 1 x
tampón de inmunoprecipitación (tampón de RIPA, NaCl 150 mM,
NP-40 al 10%, ácido desoxicólico al 0,5%, SDS al
0,1%, Tris 50 mM a pH 8) y se dejaron reaccionar durante otras 2
horas más a 4ºC agitando. Las células se sedimentaron mediante
centrifugación durante 5 minutos a 4500 x g y a 4ºC, y se lavaron 3
veces con 800 \mul de tampón de inmunoprecipitación frío. Los
sedimentos se transfirieron cuantitativamente a viales de centelleo
y se contaron en un contador de centelleo Beckman LS6000 en modo
Auto DPM. Se calculó el porcentaje de \betaA4
inmunoprecipitado.
Los ensayos de inmunoprecipitación/centelleo se
realizaron con 1 \mug de anticuerpo monoclonal purificado 369.2B
en un volumen total de 100 \mul x tampón de inmunoprecipitación al
que se añadieron 5 \mug de péptido competitivo. Las incubaciones
y precipitaciones fueron las descritas anteriormente.
La Figura 7 representa el porcentaje de IVT
\betaA4 inmunoprecipitado en función de la concentración de
anticuerpo para los MAb 369.2, 369.6 y el MAb 286.8A. En las
condiciones de este ensayo, 369.2 (y además el subclon 369.2B) es
aproximadamente cuatro veces mejor que 369.6 para inmunoprecipitar
IVT \betaA4 soluble, pero precipita un poco menos de la mitad que
286.8A. La Figura 7 muestra los resultados de la inmunoprecipitación
de \betaA4 traducido in vitro en función de la
concentración de anticuerpo (\mug de anticuerpo/100 \mul de
tampón de RIPA)
donde:
donde:
% de \betaA4
inmunoprecipitado = \frac{\text{(dpm con MAb) - (dpm con control no
o preinmunitario)}}{\text{(dpm totales de} \ \beta \
\text{A4/reacción)}}
Los porcentajes con una concentración de MAb
dada variaban únicamente algunos puntos porcentuales entre los
experimentos.
Se añadieron aproximadamente 1,5 x 10^{5} DPM
de \betaA4 traducido in vitro marcado con
^{35}S-metionina a diversas cantidades de
anticuerpo monoclonal purificado, o bien 369.2B, 369.6, o 286.8A, en
un volumen total de 100 \mul de tampón de inmunoprecipitación, y
se dejaron reaccionar tal como se describe anteriormente. Los
complejos inmunitarios se precipitaron con Omnisorb, se lavaron y se
contaron tal como se describe anteriormente.
Para caracterizar adicionalmente la mejor
estirpe celular, 369.2B, se realizó un ensayo de
inmunoprecipitación/cen-
telleo competitivo (IPSA competitivo). En esta variación se añadió 369.2B a un exceso molar de aproximadamente 200 veces de un péptido competidor marcado al mismo tiempo que \betaA4 1-42 traducido in vitro marcado. Tal como era de esperar, los péptidos de la región de \betaA4 humano, 1-40, 1-11, 1-28, 12-28, así como el péptido inverso 40-1 no compitieron con el \betaA4 traducido in vitro marcado con ^{35}S-metionina en la inmunoprecipitación, mientras que el péptido 1-42 sí (Figura 8).
telleo competitivo (IPSA competitivo). En esta variación se añadió 369.2B a un exceso molar de aproximadamente 200 veces de un péptido competidor marcado al mismo tiempo que \betaA4 1-42 traducido in vitro marcado. Tal como era de esperar, los péptidos de la región de \betaA4 humano, 1-40, 1-11, 1-28, 12-28, así como el péptido inverso 40-1 no compitieron con el \betaA4 traducido in vitro marcado con ^{35}S-metionina en la inmunoprecipitación, mientras que el péptido 1-42 sí (Figura 8).
Estos resultados fueron corroborados en un
formato ELISA en fase sólida: el péptido de cribado acoplado a
ovoalbúmina absorbido que contiene la región de \betaA4
35-42, así como el péptido 1-42
compiten, mientras que 1-40 no (Figura 9). La menor
competitividad del péptido 1-42 comparado con el
35-42 acoplado a ovoalbúmina puede deberse a
factores de conformación y/o solubilidad relacionados con el
determinante antigénico, o quizá simplemente a la estequiometría
particular de la conjugación (ovoalbúmina, un vehículo con peso
molecular de 45 kD comparado con 4 kD del péptido
1-42, y que tiene entre 5 y 15 grupos maleimida
conjugables por mol de vehículo).
La Figura 8 muestra el ensayo de competición de
péptidos por inmunoprecipitación/centelleo para la determinación de
los epítopos de MAb 369.2. El péptido competidor (5 \mug) se
mezcló con \betaA4 traducido in vitro (\sim 1,5 x
10^{5} DPM o \sim200 pg) después se inmunoprecipitó con 2 \mug
de 369.2, donde:
% de \betaA4
inmunoprecipitado = \frac{\text{(dpm con MAb) - (dpm con control no
o preinmunitario)}}{\text{(dpm totales de} \ \beta \
\text{A4/reacción)}}
Los porcentajes con una concentración de MAb
dada variaban habitualmente sólo algunos puntos porcentuales entre
los experimentos.
La Figura 9 muestra la situación de los epítopos
del MAb 369.2 mediante el ensayo competitivo. C369.2 (50 ng de
IgG/100 \mul) se preincubó con o sin competidores peptídicos
sintéticos (22ºC, 1 hora), después se sometió a Elisa contra
35-42 acoplado a ovoalbúmina unido a la placa (200
ng/pocillo). La competición porcentual se calculó relativa a la
unión de MAb en ausencia de competidor, es decir donde:
% de
competición = \frac{\text{(señal sin competidor) - [(señal con
competidor)-(ruido de fondo)}}{\text{(señal sin
competidor)}}
El cuadrado negro es el conjugado peptídico
35-42 (OVA); el cuadrado blanco es el péptido
1-42; y el diamante negro es el péptido
1-40.
A partir de estos datos, los presentes
inventores concluyen que 369.2B monoclonal es específico para el
extremo C del péptido \betaA4 de longitud completa
(1-42). Aunque el determinante antigénico exacto no
se ha localizado exactamente, claramente afecta a los residuos
posteriores al 40 y, dado que el anticuerpo se produjo contra un
péptido sintético corto, es improbable que el determinante afecte a
otros residuos de \betaA4 que pueden estar yuxtapuestos por la
conformación. De forma específica, 369.2B es una herramienta muy
importante en el reconocimiento de la especie \betaA4 que termina
en la posición 42.
Una observación adicional e interesante del
ensayo de competición de péptidos es la capacidad de
inmunoprecipitación mejorada de \betaA4 traducido in vitro
por el decapéptido 25-35. Este fenómeno se observó
también en ensayos que usaban otro anticuerpo monoclonal (es decir,
286.8A) así como un antisuero policlonal de conejo (no se muestran
los datos). Los presentes inventores también saben por otros
experimentos en los que se usaron cantidades variables de
detergente, específicamente SDS, en ensayos de IPSA con MAb 286.8A,
que puede inmunoprecipitarse más \betaA4 con cantidades
crecientes de detergente (no se muestran los datos). De forma
interesante, se ha demostrado que SDS es ineficaz para solubilizar
agregados de \betaA4, al menos tal como se muestra mediante
SDS-PAGE (Burdick y cols., 1992). Sin embargo, no
está completamente claro porqué SDS mejora la capacidad de
inmunoprecipitación de \betaA4.
Los presentes inventores han acometido estudios
inmunocitoquímicos con 369.2B. El patrón de tinción de 369.2B
(dilución de 1/10.000 de una solución de anticuerpo purificado de
ascitis a 22 mg/ml) mostró diferencias interesantes con el
anticuerpo monoclonal 286.8A que los presentes inventores han
demostrado que reconoce el 3-8 de \betaA4 y es
específico para \betaA4 humano (no se muestran los datos). Los
resultados obtenidos a partir de la inmunocitoquímica demostraron
que 369.2B es un anticuerpo excelente (a una dilución de 1/10.000)
para marcar de forma específica los núcleos de las placas de
\beta-amiloide difusas, así como los depósitos de
amiloide fibrilar y los depósitos de amiloide vascular (Figura
10).
La Figura 10 es una fotomicrografía que muestra
las placas de \beta-amiloide, los vasos sanguíneos
y los depósitos perivasculares de \betaA4 en un corte de 10
\mum de grueso embebido en parafina del cerebro de una paciente
de 76 años con enfermedad de Alzheimer. Las secciones de los tejidos
se pretrataron con ácido fórmico al 88% (30 minutos), después se
marcaron usando un kit de
avidina-biotina-peroxidasa (Vector
Laboratories, Burlington, CA) con
níquel-diaminobencidina como cromógeno. El
anticuerpo monoclonal 369.2B marca placas con una variedad de
morfologías, entre otras placas nucleadas, perivasculares, y difusas
(no amiloidóticas). También marca un subconjunto de vasos
sanguíneos amiloidóticos. Estudios adicionales han demostrado
también que el péptido \betaA4 1-43 no es capaz
de competir por la tinción (a un exceso de más de 1000 veces de
péptido), mientras que \betaA4 1-42 suprimió
completamente la señal (Tabla 2). De nuevo, tal como era de esperar,
1-40 ó 40-1 no compitieron por la
tinción. A partir de estos estudios los presentes inventores pueden
concluir ya que este anticuerpo es una herramienta excelente para
las pruebas inmunocitoquímicas. Tal como sugieren los estudios
in vitro que muestran diferencias fisicoquímicas entre
1-40 y 1-42, es posible que estas
dos especies de \betaA4 muestren patrones distintos en el cerebro
con enfermedad de Alzheimer. Con el anticuerpo monoclonal de la
presente invención, los presentes inventores son ahora capaces de
comenzar a responder a esta pregunta. Así, el anticuerpo monoclonal
y los procedimientos de la presente invención son de utilidad para
el uso diagnóstico y terapéutico en todas las metodologías
inmunológicas y relacionadas que pueden aplicarse a la detección,
control, extracción, inhibición y modificación de una única especie
de \betaA4, en el diagnóstico y tratamiento de AD tal como se
define en las reivindicaciones.
Debería entenderse que la descripción anterior
enfatiza ciertas realizaciones específicas de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: König, Gerhard Graham, Paul
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE INVENCIÓN: Anticuerpo monoclonal específico para el péptido \betaA4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Allegretti & Witcoff, Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 10 South Wacker Drive Suite 3000
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 60606
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMATIZADA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release n.º 1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE LEGAL/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: McDonnell, John J
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 26.949
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: 95.216
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 312-715-1000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 312-715-1234
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N.º:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asp Gly Asp Gly Asp Met Val Gly Gly Val
Val Ile Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N.º:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N.º:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Gly Gly Gly Gly Met Val Gly Gly Val
Val Ile Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de escisión
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 4 .. 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcador- Beta /nota- "sitio de escisión beta en APP"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio de escisión
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 20 .. 21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcador- Alfa / nota= "sitio de escisión alfa en APP, residuos 16/17 de \betaA4."
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio de escisión
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 46..47
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcador= gamma /nota= "sitio de escisión gamma en APP"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5 .. 47
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcador- \betaA4/nota= "péptido \betaA4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 33 .. 56
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcador- Tm /nota- "región transmembrana de APP"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.. 32
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcador- Ex. /nota- "parte extracelular del extremo N de APP"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º:3:
Claims (18)
1. Un anticuerpo monoclonal que se une de forma
específica al péptido \betaA4 (1-42) asociado a
amiloide difuso, amiloide fibrilar, ovillos neurofibrilares, y
amiloide vascular, y no a los péptidos \betaA4
(1-40) ni \betaA4 (1-43).
2. Un anticuerpo monoclonal que se une de forma
específica al péptido \betaA4 (1-42) y no a los
péptidos \betaA4 (1-40) ni \betaA4
(1-43), que puede obtenerse inmunizando a un
mamífero con el péptido
Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
(SEC ID N.º: 1) conjugado con un vehículo inmunológico
adecuado.
3. Un anticuerpo monoclonal de la
reivindicación 1 o de la reivindicación 2 que es un anticuerpo de la
clase IgG.
4. Un anticuerpo monoclonal de la
reivindicación 3 que es un anticuerpo de la subclase IgG1 o
IgG2b.
5. Una proteína que es un fragmento
inmunológicamente activo del anticuerpo monoclonal de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un procedimiento de detectar la presencia del
péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala en tejido,
que comprende poner en contacto una muestra de tejido con el
anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4 o la proteína de la reivindicación 5, y detectar la presencia de
dicho anticuerpo monoclonal o proteína.
7. Un procedimiento para purificar de forma
selectiva el péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala,
que comprende poner en contacto una muestra a purificar con el
anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4 o la proteína de la reivindicación 5, separar el péptido \betaA4
que termina en el aminoácido 42 Ala de la muestra a purificar, y
aislar el péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42
Ala.
8. Un procedimiento de detectar péptido
\betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala asociado a la
enfermedad de Alzheimer, que comprende poner en contacto una
muestra a analizar con el anticuerpo monoclonal de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4 o la proteína de la reivindicación 5 y
detectar la presencia del péptido \betaA4 que termina en el
aminoácido 42 Ala.
9. Un procedimiento de prevenir la agregación
del péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala in
vitro, que comprende administrar el anticuerpo monoclonal de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la proteína de la
reivindicación 5.
10. El anticuerpo monoclonal tal como se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la
proteína de la reivindicación 5 para usar en la detección de la
presencia del péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42
Ala.
11. El anticuerpo monoclonal tal como se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la
proteína de la reivindicación 5 para usar en la prevención de la
agregación del péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42
Ala.
12. Un kit para detectar la presencia del
péptido \betaA4 que termina en el aminoácido 42 Ala, que comprende
el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la
proteína de la reivindicación 5, y un medio de detectar el
anticuerpo o proteína.
13. Un procedimiento de obtener el anticuerpo de
la reivindicación 1, que comprende inmunizar a un mamífero no
humano con el péptido
Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
(SEC ID N.º: 1) conjugado con un vehículo inmunológico
adecuado.
14. Uso del péptido de la SEC ID N.º: 1
conjugado con un vehículo inmunológico adecuado en la fabricación
de un medicamento para la generación de una respuesta inmunitaria en
un mamífero, en el que el conjugado peptídico genera un anticuerpo
que de forma selectiva se une al péptido \betaA4
(1-42) y no a los péptidos \betaA4
(1-40) ni \betaA4 (1-43).
15. Una formulación farmacéutica que comprende
el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la
proteína de la reivindicación 5.
16. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 o de la proteína de la reivindicación 5 en
la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de
la enfermedad de Alzheimer.
17. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 o de la proteína de la reivindicación 5 en
la fabricación de un kit para el diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer.
18. El anticuerpo monoclonal tal como se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la
proteína de la reivindicación 5 para usar en la prevención o
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
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