ES2288909T3

ES2288909T3 - Nueva agrecanasa.

Info

Publication number: ES2288909T3
Application number: ES01271116T
Authority: ES
Inventors: Noboru Yamaji; Kouichi Nishimura; Kunitake Abe
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2000-12-18
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2021-12-17
Also published as: JP3800175B2; DE60129736T2; US7094590B2; EP1344821B9; JPWO2002050258A1; AU2002222658A1; US7193073B2; DE60129736D1; WO2002050258A1; EP1344821A4; EP1344821B1; ATE368735T1; US20030185828A1; US20060078957A1; EP1344821A1

Abstract

Un polipéptido que muestra una actividad agrecanasa y que comprende (1) la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 o (2) una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 10 aminoácidos se delecionan, se sustituyen y/o se insertan en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

Description

Nueva agrecanasa.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva agrecanasa.

Técnica anterior

Las enfermedades de las articulaciones son enfermedades que muestran lesión y degeneración del cartílago de las articulaciones como los principales estados mórbidos. Si bien una enfermedad que tiene el número más numeroso de pacientes entre las enfermedades de las articulaciones es la osteoartritis (OA) (Elders M. J., J. Rheumatol., 27, Suppl., 60, 6-8, 2000), los fármacos antiinflamatorios analgésicos y las preparaciones de ácido hialurónico sólo se usan en el procedimiento terapéutico actual como un tratamiento sintomático con el fin de aliviar dolores acompañados por la degeneración de cartílago y la destrucción del cartílago subcondral, de manera que no puede decirse que estén ejerciendo suficientes efectos terapéuticos (Dieppe P., Scand. J. Rheumatol., 29, 279-281, 2000).

El cartílago de las articulaciones es un tejido compuesto principalmente por colágeno de tipo II y agrecano, que es un proteoglicano específico de cartílago, y la degradación y degeneración de ambos se observa en las enfermedades de las articulaciones. Debido a esto, durante mucho tiempo se ha considerado que el control de la degradación y la degeneración de estos componentes de matriz extracelular llevaría al tratamiento de enfermedades de las articulaciones, de manera que positivamente se ha intentado identificar las proteasas afectadas por la degradación (colagenasa y agrecanasa) y seleccionar sus inhibidores y desarrollarlos como medicamentos.

Como las proteasas que tienen actividades de colagenasa, se han identificado las metaloproteasas de matriz (MMP1, MMP8, MMP13, MMP14 y similares), y se han descubierto sus inhibidores selectivos. Sin embargo, a pesar de los intentos para desarrollar un gran número de inhibidores de MMP que tienen actividades de inhibición de colagenasa como fármacos terapéuticos para enfermedades de las articulaciones que incluyen OA y artritis reumatoide (AR), los inhibidores de MMP que van a usarse en estas enfermedades como la indicación todavía no se han puesto en el mercado (Greenwald R. A., Ann. New York Acad. Sci., 878, 413-419, 1999). En tales condiciones, la atención se ha dirigido a la agrecanasa que degrada selectivamente agrecano, que es otro componente constituyente principal del cartílago de las articulaciones.

Se ha descrito un papel relacionado con enfermedades de las articulaciones de una enzima agrecanasa que escinde agrecano en el sitio entre Glu^{373}-Ala^{374} mediante los informes de Sandy y col. y Lohmander y col. declarando que todos los fragmentos del agrecano principal digerido encontrados en el fluido sinovial de pacientes con artritis humana fueron generados mediante la escisión en el sitio de digestión de la agrecanasa (Sandy J.D. y col., J. Clin. Invest., 89, 1512 - 1516, 1992; Lohmander L.S. y col., Arthritis Rheum., 36, 1214 - 1222, 1993). Por otra parte, se ha sabido que en un sistema de cultivo explante in vitro del cartílago de las articulaciones, la degradación del agrecano se produce en primer lugar por la inducción de IL-1 y luego se acelera la degradación de colágeno de tipo II (Dingle L.T. y col., Ann. Rheum. Dis., 34, 303 - 311, 1975; Cawston T.E. y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 215, 377 - 385, 1995; Kozaci L.D. y col., Arthritis Rheum., 40, 164 - 174, 1997). Se ha informado de que la degradación de agrecano también tiene preferencia sobre la degradación de colágeno de tipo II en un modelo de artritis en ratón (van Meurs J.B. y col., Arthritis Rheum., 42, 1128 - 1139, 1999). Estos informes sugieren una posibilidad de que la degradación de colágeno de tipo II pueda controlarse inhibiendo la degradación de agrecano precedente.

Sin embargo, aunque las características bioquímicas muestran que es una metaloproteasa que está localizada sobre el exterior de las células, que las cadenas de azúcar contribuyen a un reconocimiento de sustrato y que una actividad está inducida por IL-1, TNF o ácido retinoico, la agrecanasa no se ha identificado durante mucho tiempo como una causa de enfermedades de las articulaciones. Recientemente se notificaron ADAMTS4 (agrecanasa-11; Tortorella M. D. y col., Science, 284, 1664-1666, 1999) y ADAMTS11 (agrecanasa-2; Abbaszade I. y col., J. Biol. Chem., 274, 23443-23450, 1999) como la proteasa que tiene la actividad agrecanasa. Sin embargo, las expresiones génicas de estas proteasas no aumentan en el cartílago de OA humana y no están inducidas por IL-1, TNF o ácido retinoico (se sabe que estos compuestos inducen la actividad agrecanasa en un sistema de cultivo explante de cartílago articular de rodilla humana) y por tanto se sugirió la presencia de otra proteasa que está relacionada con enfermedades de las articulaciones (Flannery C. R. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 260, 318-322, 1999).

Además, recientemente se han identificado loci cromosomales en los que están localizados los factores genéticos que están relacionados con OA (un locus con susceptibilidad por OA) según una investigación genética de pacientes que padecen OA o familias que tienen un fuerte historial familiar de OA. Por ejemplo, se han informado de 11q (Chapman K. y col., Am. J. Hum. Genet., 65, 167-174, 1999), 4q12-4q21.2, 6q21.1-6q22.1, 16p13.1-16q12.1 y 16q21-16q23 (Loughlin J. y col., Am. J. Hum. Genet., 65, 1795-1798, 1999) como los loci con susceptibilidad por OA.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un documento WO03/027282A describe proteínas que pertenecen a la familia S, concretamente ADAMTS-15, -16, -17, -18 y -19. La nueva agrecanasa causante de enfermedades de las articulaciones, que es útil como una herramienta de selección para un agente para tratar enfermedades de las articulaciones, un polinucleótido novedoso que codifica la agrecanasa y un sistema de selección conveniente para obtener una sustancia útil como un agente para tratar enfermedades de las articulaciones.

Con el propósito de solucionar los problemas anteriormente mencionados, los presentes inventores han realizado estudios intensivos y, como resultado, obtuvieron un gen que codifica una agrecanasa [es decir, MDTS8 (metaloproteasa y desintegrina con 8 repeticiones de trombospondina de tipo 1)] causante de enfermedades de las articulaciones, y se expresó la proteína agrecanasa. Los inventores mostraron que la proteína muestra una actividad agrecanasa, que la expresión de la proteína está inducida por la diferenciación a células del cartílago y que la localización cromosómica de MDTS8 está en el locus que se identifica como un locus susceptible de OA (una de las enfermedades de las articulaciones) y, por tanto, se confirmó que el polipéptido de la presente invención es una agrecanasa causante de enfermedades de las articulaciones y útil como una herramienta de selección para un agente para tratar enfermedades de las articulaciones. Además, los inventores establecieron un procedimiento para detectar si un compuesto que va a probarse inhibe o no una actividad agrecanasa causante de enfermedades de las articulaciones usando la proteína, y un procedimiento para seleccionar un agente para tratar

\hbox{enfermedades de las articulaciones  usando el
procedimiento de detección.}

Por consiguiente, la presente invención se refiere a:

[1] un polipéptido que muestra una actividad agrecanasa y que comprende (1) una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 o (2) una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 10 aminoácidos se delecionan, se sustituyen y/o se insertan en una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2;

[2] el polipéptido del punto [1], que comprende una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y que muestra una actividad agrecanasa;

[3] un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 90% o más de homología con una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y que muestra una actividad agrecanasa;

[4] un polipéptido que está constituido por una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2;

[5] un polinucleótido que codifica el polipéptido de los puntos [1] a [4];

[6] un vector de expresión que comprende el polinucleótido del punto [5];

[7] una célula transfectada con el vector de expresión del punto [6];

[8] un procedimiento para detectar si un compuesto que va a probarse inhibe o no una actividad agrecanasa de un polipéptido de los puntos [1] a [4], que comprende las etapas de:

poner en contacto (1) dicho polipéptido, (2) un polipéptido de sustrato que puede digerirse con agrecanasa, y (3) el compuesto que va a probarse; y

analizar una digestión del polipéptido de sustrato;

[9] un procedimiento para seleccionar una sustancia que inhibe una actividad agrecanasa de un polipéptido de los puntos [1] a [4], que comprende las etapas de:

detectar mediante el procedimiento del punto [10]; y

seleccionar una sustancia que inhibe una actividad agrecanasa;

[10] procedimiento para seleccionar una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones mediante el procedimiento del punto [9]; y

[11] un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une al polipéptido de los puntos [1] a [4].

El término "agrecano" como se usa en este documento significa un proteoglicano que está localizado en una matriz extracelular del cartílago articular y está constituida por una proteína central que comprende dos dominios esféricos (G1 y G2) en el extremo de N, regiones de unión de glicosaminoglicano y un dominio esférico (G3) en el extremo de C, y sulfato de condroitina y queratán sulfato de glicosaminoglicano que modifican la proteína central.

El término "actividad agrecanasa" como se usa en este documento significa una actividad de digerir selectivamente agrecano humano presente en cartílago articular entre el residuo 373 de ácido glutámico y el residuo 374 de alanina (denominado en lo sucesivo "entre Glu^{373}-Ala^{374}").

El término "agrecanasa" como se usa en este documento significa una metaloproteasa que muestra la actividad agrecanasa. La agrecanasa tiene generalmente una secuencia consenso de unión a cinc [es decir, His-Glu-Xaa-Xaa-His (Xaa significa un aminoácido arbitrario.); la secuencia de ID SEC Nº: 24].

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se explicará en detalle en lo sucesivo.

[1] El polipéptido de la presente invención

El polipéptido de la presente invención incluye

(1) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2;

(2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y que muestra la actividad agrecanasa;

(3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 10 aminoácidos se delecionan, se sustituyen y/o se insertan en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y que muestra la actividad agrecanasa (denominada en lo sucesivo una variación funcionalmente equivalente); y

(4) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 90% o más de homología con la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y que muestra la actividad agrecanasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido homólogo).

Entre los polipéptidos (1) a (4) como polipéptido de la presente invención se prefiere un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la que se induce una expresión mediante diferenciación a células de cartílago.

(1) El polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2

Como polipéptido de la presente invención, el más preferido es el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2. El polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 muestra la actividad agrecanasa y es una agrecanasa humana novedosa que está constituida por 1221 residuos de aminoácidos. Como se muestra en el ejemplo 5, la expresión del polipéptido está inducida por la diferenciación a células del cartílago. Además, como se muestra en el ejemplo 6, el gel del mismo está localizado en un cromosoma que está relacionado con osteoartritis (OA) y, por tanto, se considera que el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 es una agrecanasa causante de enfermedades de las articulaciones.

(2) El polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que muestra la actividad agrecanasa

El "polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que muestra la actividad agrecanasa" como el polipéptido de la presente invención incluye, por ejemplo, el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y un polipéptido en el que una secuencia del marcador apropiado o similar se añade al extremo de N y/o el extremo de C del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 (es decir, un polipéptido de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos en el que una secuencia del marcador apropiado o similar se añade al extremo de N y/o al extremo de C de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2).

Como secuencia del marcador puede usarse una secuencia para llevar a cabo rápidamente la confirmación de expresión de polipéptido, confirmación de la localización intracelular del mismo, purificación del mismo o similares. Como secuencia puede mencionarse, por ejemplo, una marca FLAG, una marca de hexa-histidina (es decir, una marca His), una marca de hemaglutinina o un epítopo myc.

No está particularmente limitado un procedimiento para confirmar si un polipéptido que va a probarse muestra o no la "actividad agrecanasa" como se usa en este documento (denominada algunas veces en lo sucesivo un "procedimiento para confirmar la actividad agrecanasa"). Puede confirmarse, por ejemplo, poniendo en contacto un polipéptido que va a probarse (tal como células, un sobrenadante de cultivo de tejido, o un extracto de tejido que contiene el polipéptido de prueba, o una preparación purificada o parcialmente purificada del polipéptido de prueba) con un sustrato de agrecanasa (tal como agrecano humano) en un tampón apropiado [tal como Tris-HCl 50 mmol/l (pH 7,4)], y entonces analizar si el sustrato se digiere o no en el sitio de escisión (por ejemplo, entre Glu^{373}-Ala^{374} en agrecano humano), preferentemente mediante un procedimiento descrito en el ejemplo 4.

El sustrato de agrecanasa no está particularmente limitado, mientras que sea un polipéptido que puede digerirse con agrecanasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido de sustrato), pero puede mencionarse, por ejemplo, agrecano derivado de ser humano u otros animales, un fragmento del agrecano (un fragmento que puede digerirse con agrecanasa) o un polipéptido de fusión del agrecano o el fragmento del mismo y una secuencia del marcador apropiada (tal como una marca FLAG, una marca His, una marca de hemaglutinina o un epítopo myc, preferentemente una marca FLAG o una marca His) (un polipéptido de fusión que puede digerirse con agrecanasa). Más particularmente pueden usarse, por ejemplo, los agrecanos purificados de tejido cartilaginoso de ser humano u otros animales, agrecanos recombinantes (tales como agrecano recombinante obtenido mediante la adición de una marca FLAG al extremo de N y una marca His al extremo de C de agrecano o un fragmento del mismo, respectivamente), agrecanos comercialmente disponibles (SEIKAGAKU CORPORATION), o polipéptidos parciales de estos agrecanos.

Como un procedimiento para analizar si el polipéptido de sustrato se digiere o no por la actividad agrecanasa puede mencionarse, por ejemplo, un procedimiento para analizar un fragmento de polipéptido generado mediante digestión del polipéptido de sustrato con el polipéptido de prueba (tal como un procedimiento para detectar la presencia del fragmento de polipéptido, o un procedimiento para medir una cantidad del fragmento de polipéptido generado), o un procedimiento para analizar el polipéptido de sustrato reducido por la digestión (tal como un procedimiento para detectar la presencia del polipéptido de sustrato, o un procedimiento para medir una cantidad del polipéptido de sustrato reducido).

Por ejemplo, en el caso de usar agrecano humano como polipéptido de sustrato no se limita particularmente un procedimiento para analizar un fragmento de polipéptidos generado mediante digestión de agrecano entre Glu^{373}-Ala^{374}, pero puede usarse, por ejemplo, un procedimiento para determinar una secuencia de extremo en N o una secuencia de extremo en C del fragmento digerido mediante un procedimiento convencional, o más convenientemente, procedimientos inmunológicos tales como ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima) o un procedimiento de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-neoepítopo (Hughes C. E. y col., Biochem. J., 305, 799-804, 1995) que reconoce específicamente una secuencia Asn^{369}-Ile^{370}-Thr^{371}-Gly^{372}-Glu^{373} (la secuencia de ID SEC Nº: 25) en el extremo de C o una secuencia Ala^{374}-Arg^{375}-Gly^{376}-Ser^{377}-Val^{378} (la secuencia de ID SEC Nº: 26) en el extremo de N generada mediante digestión de agrecano entre Glu^{373}-Ala^{374}. Los procedimientos inmunológicos tales como ELISA o un procedimiento de inmunotransferencia pueden llevarse a cabo según, por ejemplo, Migita, S., Konda, S., Honjo, T, Hamaoka, T., "Men-eki Jikken Sousa Hou (Methods in Immulogical Experiments) I, II", Nanko-do, 1995.

Además, en el caso de usar agrecano humano como polipéptido de sustrato, el procedimiento para analizar agrecano humano reducido mediante digestión de agrecano entre Glu^{373}-Ala^{374} no está particularmente limitado, pero puede usarse, por ejemplo, un procedimiento de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-agrecano humano.

Además, en el caso de usar el agrecano recombinante obtenido mediante la adición de una marca FLAG al extremo de N y una marca His al extremo de C de agrecano o un fragmento del mismo, respectivamente, puede usarse ELISA o un procedimiento de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-marca FLAG y/o un anticuerpo anti-marca His como procedimiento para analizar el agrecano recombinante reducido mediante digestión de agrecano entre Glu^{373}-Ala^{374}.

(3) La variación funcionalmente equivalente

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención no está particularmente limitada, mientras que sea un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que preferentemente se delecionan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10, más preferentemente de 1 a 7, lo más preferido de 1 a 5 aminoácidos en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que muestra la actividad agrecanasa (preferentemente que comprende además una secuencia de aminoácidos de la que una expresión está inducida por la diferenciación a células de cartílago). Además, un origen de la variación funcionalmente equivalente no está limitado a un ser humano.

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención incluye, por ejemplo, variaciones humanas del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos de un ser humano (tal como un ratón, una rata, un hámster o un perro), y otros polipéptidos obtenidos modificando artificialmente estos polipéptidos nativos (es decir, variaciones humanas o variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos de un ser humano) o el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 mediante técnicas de ingeniería genética. El término "variación" como se usa en este documento significa una diferencia individual entre los mismos polipéptidos en las mismas especies o una diferencia entre polipéptidos homólogos en varias especies.

Las variaciones humanas del polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 o las variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos de un ser humano pueden obtenerse por aquellos expertos en la materia según la información de una secuencia de bases (por ejemplo, la secuencia de bases de ID SEC Nº: 1) de un polinucleótido que codifica el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2. A este respecto, las técnicas de ingeniería genética pueden realizarse generalmente según procedimientos conocidos (por ejemplo, Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989).

Por ejemplo, una sonda apropiada o cebadores apropiados se diseñan según la información de una secuencia de bases de un polinucleótido que codifica el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2. Un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R. K. y col., Science, 239, 487-491, 1988) o un procedimiento de hibridación se lleva a cabo usando una muestra (por ejemplo, ARN total o una fracción de ARNm, una biblioteca de ADNc o una biblioteca de fagos) preparada a partir de un organismo (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano, un ratón, una rata, un hámster o un perro) de interés y los cebadores o la sonda para obtener un polinucleótido que codifica el polipéptido. Un polipéptido deseado puede obtenerse expresando el polinucleótido resultante en un sistema de expresión apropiado y confirmando que el polipéptido expresado muestra la actividad agrecanasa, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4.

Además, el polipéptido artificialmente modificado mediante técnicas de ingeniería genética puede obtenerse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento. Un gen que codifica el polipéptido se obtiene mediante un procedimiento convencional tal como mutagénesis dirigida al sitio (Mark, D. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984). Un polipéptido deseado puede obtenerse expresando el polinucleótido resultante en un sistema de expresión apropiado y confirmando que el polipéptido expresado muestra la actividad agrecanasa, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4.

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención incluye un polipéptido de fusión que muestra la actividad agrecanasa y que tiene una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se delecionan, sustituyen y/o insertan en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y una secuencia del marcador apropiada o similar se añade al extremo de N y/o el extremo de C de la misma.

Además, como la variación funcionalmente equivalente de la presente invención, un polipéptido que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que preferentemente de 1 a 10, más preferentemente de 1 a 7, lo más preferido de 1 a 5 aminoácidos se delecionan, sustituyen y/o insertan en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y se prefiere que presente la actividad agrecanasa, y lo más preferido un polipéptido que comprende además una secuencia de aminoácidos de la que está inducida una expresión por la diferenciación a células del cartílago.

(4) El polipéptido homólogo

El polipéptido homólogo de la presente invención no está particularmente limitado, mientras que sea un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene el 90% o más de homología con la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, y que muestra la actividad agrecanasa. El polipéptido homólogo de la presente invención puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene preferentemente el 95% o más de homología, más preferentemente el 98% o más de homología, lo más preferido el 99% o más de homología, con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2. Como polipéptido homólogo de la presente invención se prefiere un polipéptido que está constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene el 90% o más de homología (preferentemente el 95% o más de homología, más preferentemente el 98% o más de homología, lo más preferido el 99% o más de homología) y que muestra la actividad agrecanasa.

Además, el polipéptido homólogo de la presente invención más preferido es un polipéptido que muestra la actividad agrecanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos de la que una expresión está inducida por la diferenciación a células de cartílago.

El término "homología" como se usa en este documento significa un valor obtenido por una búsqueda de BLAST [herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales; Altschul, S. F. y col., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)]. La homología en la secuencia de aminoácidos puede calcularse por un algoritmo de búsqueda de BLAST. Más particularmente, puede calcularse usando un programa bl2seq (Tatiana A. Tatusova y Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999) en un paquete de BLAST (edición de sgi32bit, versión 2.0.12; obtenido de NCBI) según un parámetro por defecto. Como parámetro de alineamiento por emparejamiento se usa un programa "blastp". Además, se usan "0" como un valor de coste de inserción en hueco, "0" como un valor de coste de alargamiento del hueco, "SEG" como un filtro para una secuencia de búsqueda y "BLOSUM62" como una matriz, respectivamente.

[2] El polinucleótido de la presente invención

El polinucleótido de la presente invención no está particularmente limitado, mientras que codifique el polipéptido de la presente invención. Como polinucleótido de la presente invención puede mencionarse, por ejemplo, un polinucleótido que comprende la secuencia de bases de ID SEC Nº: 1. Tal polinucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 1 es el más preferido. A este respecto, el término "polinucleótido" como se usa en este documento incluye tanto ADN como ARN.

No está particularmente limitado un procedimiento para producir el polinucleótido de la presente invención, pero puede mencionarse, por ejemplo, (1) un procedimiento que usa PCR, (2) un procedimiento que usa técnicas de ingeniería genética convencionales (es decir, un procedimiento para seleccionar un transformante que comprende un ADNc deseado de cepas transformada con una biblioteca de ADNc), o (3) un procedimiento de síntesis química. Estos procedimientos se explicarán en este orden en lo sucesivo.

En el procedimiento que usa PCR del punto (1), el polinucleótido de la presente invención puede producirse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se extrae ARNm de células o tejido humano que puede producir el polipéptido de la presente invención. Se sintetiza un par de cebadores, entre los cuales se localiza ARNm de longitud completa correspondiente al polipéptido de la presente invención o una región parcial del ARNm, basándose en la secuencia de bases de un polinucleótido que codifica el polinucleótido de la presente invención. El ADNc de longitud completa que codifica el polipéptido de la presente invención o una parte del ADNc puede obtenerse realizando una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (PCR-TI) usando el ARNm extraído como plantilla.

Más particularmente, el ARN total que contiene ARNm que codifica el polipéptido de la presente invención se extrae mediante un procedimiento conocido de células o tejido que puede producir el polipéptido de la presente invención. Como procedimiento de extracción puede mencionarse, por ejemplo, un procedimiento de tiocinato de guanidina-fenol caliente, un procedimiento de tiocinato de guanidina-clorhidrato de guanidina o un procedimiento de tiocinato de guanidina-cloruro de cesio. Se usa preferentemente el procedimiento de tiocinato de guanidina-cloruro de cesio. Las células o tejido que pueden producir el polipéptido de la presente invención pueden identificarse, por ejemplo, mediante un procedimiento de transferencia de Northern usando un polinucleótido o una parte del mismo que codifica el polipéptido de la presente invención o un procedimiento de inmunotransferencia usando un anticuerpo específico para el polipéptido de la presente invención.

A continuación se purifica el ARNm extraído. La purificación del ARNm puede hacerse según un procedimiento convencional. Por ejemplo, el ARNm puede purificarse mediante adsorción y elución usando una columna de oligo (dT)-celulosa. El ARNm puede fraccionarse adicionalmente, por ejemplo, mediante una centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, si es necesario. Alternativamente puede usarse ARNm extraído y purificado comercialmente disponible sin llevar a cabo la extracción del ARNm.

A continuación, la primera cadena de ADNc se sintetiza llevando a cabo una reacción de transcriptasa inversa del ARNm purificado en presencia de un cebador aleatorio, un cebador oligo dT y/o un cebador a medida. Esta síntesis puede llevarse a cabo según un procedimiento convencional. La primera cadena resultante de ADNc se somete a PCR usando dos cebadores entre los cuales se localiza una longitud completa o una región parcial del polinucleótido de interés, amplificándose así el ADNc de interés. El ADN resultante se fracciona, por ejemplo, mediante una electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de ADN de interés puede obtenerse llevando a cabo una digestión del ADN con enzimas de restricción y posterior ligado, si es necesario.

En el procedimiento usando técnicas de ingeniería genética convencionales del punto (2), el polinucleótido de la presente invención puede producirse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

En primer lugar, el ADNc de cadenas sencillas se sintetiza usando transcriptasa inversa de ARNm preparado mediante el procedimiento de PCR anteriormente mencionado como una plantilla, y entonces el ADNc de cadenas dobles se sintetiza a partir del ADNc de cadenas sencillas. Como este procedimiento puede mencionarse, por ejemplo, un procedimiento de nucleasa S1 (Efstratiadis, A. y col., Cell, 7, 279-288, 1976), un procedimiento de Land (Land, H. y col., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266, 1981), un procedimiento de O. Joon Yoo (Yoo, O. J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983) y un procedimiento de Okayama-Berg (Okayama, H. y Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161-170, 1982).

A continuación se prepara un plásmido recombinante que comprende el ADNc de cadenas dobles y se introduce dentro de una cepa de Escherichia coli, tal como DH 5\alpha, HB101 o JM109, transformándose así la cepa. Un transformante se selecciona usando un fármaco de resistencia contra, por ejemplo, tetraciclina, ampicilina o kanamicina como marcador. Si la célula huésped es E. coli, la transformación de la célula huésped puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento de Hanahan (Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166, 557-580, 1983); concretamente, un procedimiento en que el ADN recombinante se añade a células competentes preparadas en presencia de CaCl_{2}, MgCl_{2} o RbCl. Además, como un vector distinto de un plásmido puede usarse un vector de fago tal como un sistema
lambda.

Como procedimiento para seleccionar un transformante que contiene el ADNc de interés de los transformantes resultantes pueden usarse diversos procedimientos tales como (i) un procedimiento para seleccionar un transformante usando una sonda de oligonucleótidos sintéticos, (ii) un procedimiento para seleccionar un transformante usando una sonda producida por PCR, (iii) un procedimiento para seleccionar un transformante usando un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención, o (iv) un procedimiento para seleccionar un transformante usando un sistema de traducción por hibridación selectiva.

En el procedimiento del punto (i) para seleccionar un transformante usando una sonda de oligonucleótidos sintéticos, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se sintetiza un oligonucleótido que se corresponde con la totalidad o una parte del polipéptido de la presente invención (en este caso puede ser o una secuencia de nucleótidos considerando el uso de codones o una pluralidad de secuencias de nucleótidos como combinación de posibles secuencias de nucleótidos y, en este último caso, sus números pueden reducirse incluyendo inosina) y, usando este oligonucleótido como una sonda (marcada con ^{32}P o ^{33}P), se hibrida con un filtro de nitrocelulosa o un filtro de poliamida sobre el que se desnaturalizan y se fijan los ADN de los transformantes, para seleccionar y seleccionar cepas positivas resultantes.

En el procedimiento del punto (ii) para seleccionar un transformante usando una sonda producida por PCR, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se sintetizan oligonucleótidos de un cebador sentido y un cebador antisentido correspondiente a una parte del polipéptido de la presente invención, y un fragmento de ADN que codifica la totalidad o una parte del polipéptido de interés se amplifica llevando a cabo PCR usando estos cebadores en combinación. Como ADN plantilla usada en este procedimiento puede usarse ADNc sintetizado mediante una reacción de transcripción inversa de ARNm de células que pueden producir el polipéptido de la presente invención, o ADN genómico. El fragmento de ADN resultante se marca con ^{32}P o ^{33}P, y un transformante que contiene el ADNc de interés se selecciona llevando a cabo una hibridación de colonias o un hibridación en placa usando este fragmento como sonda.

En el procedimiento del punto (iii) para seleccionar un transformante usando un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

En primer lugar, el ADNc se integra en un vector de expresión y los polipéptidos se producen en un sobrenadante de cultivo, dentro de las células, o sobre la superficie celular de los transformantes. Un transformante que contiene el ADNc de interés se selecciona detectando una cepa que produce el polipéptido deseado usando un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención y un segundo anticuerpo contra el primer anticuerpo.

En el procedimiento del punto (iv) para seleccionar un transformante usando un sistema de traducción por hibridación selectiva, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

En primer lugar, el ADNc obtenido de cada transformante se somete a inmunotransferencia en, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa y se hibrida con ARNm preparado de células que pueden producir el polipéptido de la presente invención, y entonces el ARNm unido al ADNc se disocia y se recupera. El ARNm recuperado se traduce en un polipéptido en un sistema de traducción apropiado de polipéptidos, por ejemplo, inyección en Xenopus oocytes o un sistema sin células tal como un lisado de reticulocitos de conejo o un germen de trigo. Un transformante que contiene el ADNc de interés se selecciona detectándolo con el uso de un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención.

Un procedimiento para recoger el polinucleótido de la presente invención del transformante de interés resultante puede llevarse a cabo según un procedimiento conocido (por ejemplo, Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989). Por ejemplo, puede llevarse a cabo separando una fracción correspondiente al ADN de plásmido de células y cortando la región de ADNc del ADN de plásmido.

En el procedimiento de síntesis química del punto (3), el polinucleótido de la presente invención puede producirse, por ejemplo, uniendo fragmentos de ADN producidos por un procedimiento de síntesis química. Cada ADN puede sintetizarse usando un sintetizador de ADN [por ejemplo, sintetizador de ADN Oligo 1000M (Beckman) o sintetizador de ADN/ARN 394 (Applied Biosystems)].

Además, el polinucleótido de la presente invención puede producirse mediante síntesis química de ácidos nucleicos según un procedimiento convencional tal como un procedimiento de fosfito-triéster (Hunkapiller, M. y col., Nature, 10, 105-111, 1984) basado en la información del polipéptido de la presente invención. A este respecto se conocen los codones para cada aminoácido y opcionalmente pueden seleccionarse y determinarse mediante el procedimiento convencional, por ejemplo, considerando un uso de codones de cada huésped que va a usarse (Crantham, R. y col., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Además, una modificación parcial de codones de estas secuencias de bases puede llevarse a cabo según un procedimiento convencional, tal como mutagénesis dirigida a sitio que usa un cebador comprendido de un oligonucleótido sintético que codifica para una modificación deseada (Mark, D. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).

La determinación de las secuencias de ADN obtenidas mediante los procedimientos anteriormente mencionados puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un procedimiento de modificación química de Maxam-Gilbert (Maxam, A. M. y Gilbert, W., "Methods in Enzymology", 65, 499-559, 1980) o un procedimiento de extremo de cadena de didesoxinucleótido (Messing, J. y Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982).

[3] El vector de expresión y la célula de la presente invención

Se vuelve a integrar un polinucleótido aislado de la presente invención en un ADN de vector apropiado y mediante el vector de expresión resultante puede transfectarse una célula huésped eucariota o procariota. Además, es posible expresar el polinucleótido en una célula huésped deseada introduciendo un promotor apropiado y una secuencia relacionada con la expresión génica dentro del vector.

El vector de expresión de la presente invención no está particularmente limitado, mientras comprenda el polinucleótido de la presente invención. Como vector de expresión puede mencionarse, por ejemplo, un vector de expresión obtenido introduciendo el polinucleótido de la presente invención en un vector de expresión conocido seleccionado apropiadamente según una célula huésped que va a usarse.

La célula de la presente invención no está particularmente limitada, mientras que esté transfectada con el vector de expresión de la presente invención y comprenda el polinucleótido de la presente invención. La célula de la presente invención puede ser, por ejemplo, una célula en la que el polinucleótido se integra en un cromosoma de una célula huésped, o una célula que contiene el polinucleótido como un vector de expresión que comprende el polinucleótido. Además, la célula de la presente invención puede ser una célula que expresa el polipéptido de la presente invención, o una célula que no expresa el polipéptido de la presente invención. La célula de la presente invención puede obtenerse, por ejemplo, transfectando una célula huésped deseada con el vector de expresión de la presente invención.

En las células huésped eucariotas están incluidas, por ejemplo, células de vertebrados, insectos y levadura. Como célula vertebral puede mencionarse, por ejemplo, una célula COS de simio (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), una cepa defectuosa en dihidrofolato reductasa de una célula de ovario de hámster chino (CHO) (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), una célula HEK293 derivada de riñón embrionario humano o una célula 293-EBNA (Invitrogen) obtenida introduciendo un

\hbox{gen EBNA-1 de virus de
Epstein-Barr  en la célula HEK293.}

Como vector de expresión para una célula vertebral puede usarse generalmente un vector que contiene un promotor localizado aguas arriba del gen que va a expresarse, un sitio de corte y empalme de ARN, un sitio de poliadenilación, una secuencia de fin de la transcripción y similares. El vector puede contener adicionalmente un origen de replicación, si es necesario. Como vector de expresión puede mencionarse, por ejemplo, pSV2dhfr que contiene un promotor temprano SV40 (Subramani, S. y col., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS que contiene un promotor del factor de alargamiento humano (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18,5322, 1990), o pCEP4 que contiene un promotor de citomegalovirus (Invitrogen).

Si se usa la célula 293-EBNA como célula huésped, como vector de expresión puede usarse, por ejemplo, pCEP4 (Invitrogen) que contiene un origen de replicación de virus de Epstein-Barr y que puede realizar una replicación autónoma en la célula 293-EBNA.

Si se usa la célula COS como célula huésped, un vector que tiene un origen de replicación SV40 puede realizar un replicación autónoma en la célula COS y tiene un promotor de transcripción, una señal de fin de la transcripción y un sitio de corte y empalme de ARN que pueden usarse como vector de expresión. Como vector puede mencionarse, por ejemplo, pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) o pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987).

El vector de expresión puede incorporarse en células COS, por ejemplo, mediante un procedimiento de DEAE-dextrano (Luthman, H. y Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), un procedimiento de co-precipitación de fosfato de calcio-ADN (Graham, F. L. y van der Ed, A. J., Virology, 52, 456-457, 1973), un procedimiento usando un reactivo de transfección comercialmente disponible (por ejemplo reactivo de transfección FUGENE^{MR} 6; Boeringer Mannheim) o un procedimiento de electroporación (Neumann, E. y col., EMBO J., 1, 841-845, 1982).

Si se usa la célula CHO como célula huésped, una célula transfectada que puede producir establemente el polipéptido de la presente invención puede obtenerse llevando a cabo la co-transfección de un vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención, junto con un vector que puede expresar un neo-gen que actúa como un marcador de resistencia G418, tal como pRSVneo (Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) o pSV2-neo (Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341,1982), y seleccionando una colonia resistente a G418.

La célula de la presente invención puede cultivarse según el procedimiento convencional [por ejemplo, "Shin Seikagaku Jikken Koza 18, Saibou Baiyou Gijyutsu (Japanese Biochemical Society)", Tokyo Kagaku Dojin, 1990], y el polipéptido de la presente invención se produce fuera de las células. Como medio que va a usarse en el cultivo puede seleccionarse apropiadamente un medio comúnmente usado en una célula huésped deseada. En el caso de la célula COS puede usarse, por ejemplo, un medio tal como un medio RPMI-1640 o un medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementándolo con un componente de suero tal como suero bovino fetal (SBF), si es necesario. En el caso de la célula 293-EBNA puede usarse un medio tal como un medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con un componente

\hbox{de suero tal como suero bovino fetal  (SBF) y
G418.}

El polipéptido de la presente invención producido fuera de las células de la presente invención mediante cultivo de las células puede separarse y purificarse de las mismas mediante diversas técnicas de separación conocidas [por ejemplo, Okada, M. y Miyazaki K., "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Jyo.Ge (Revision, Notebook for Protein Experiments)", Yodo-sha 1999] haciendo uso de las propiedades físicas, propiedades químicas y similares del polipéptido. Más particularmente, el polipéptido de la presente invención puede purificarse tratando un líquido de cultivo que contiene el polipéptido de la presente invención con un tratamiento comúnmente usado, por ejemplo un tratamiento con un precipitante de proteínas, ultrafiltración, diversas técnicas de cromatografía líquida tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC), o diálisis, o combinación de las mismas.

Si el polipéptido de la presente invención se expresa como una proteína de fusión con una secuencia del marcador en marco, la identificación de la expresión del polipéptido de la presente invención, purificación del mismo o similares puede llevarse a cabo fácilmente. Como secuencia del marcador puede mencionarse, por ejemplo, una marca FLAG, una marca hexa-histidina, una marca de hemaglutinina o un epítopo myc. Además, insertando una secuencia específica de aminoácidos reconocida por una proteasa tal como enterocinasa, factor Xa o trombina entre la secuencia del marcador y el polipéptido de la presente invención, la secuencia del marcador puede eliminarse por la proteasa.

[4] El procedimiento de detección y el procedimiento de selección de la presente invención

Es posible detectar si un compuesto que va a probarse muestra o no la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención usando el polipéptido de la presente invención. Además, usando este procedimiento de detección de la presente invención es posible seleccionar una sustancia que inhiba la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención. El polipéptido de la presente invención es una proteína de la que una expresión está inducida por la diferenciación a células de cartílago como se describe en el ejemplo 5, y el gen del mismo está localizado en un cromosoma relacionado con osteoartritis (OA) como se describe en el ejemplo 6 y, por tanto, se considera que el polipéptido de la presente invención es una agrecanasa causante de enfermedades de las articulaciones. Por tanto, una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención es útil como sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones. Además, el polipéptido de la presente invención puede usarse per se como una herramienta para seleccionar una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención o una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones (particularmente un agente para tratar osteoartritis).

Los compuestos que van a probarse que pueden aplicarse al procedimiento de detección o procedimiento de selección de la presente invención no están particularmente limitados, pero pueden mencionarse, por ejemplo, diversos compuestos conocidos (incluidos péptidos) registrados en archivos químicos, compuestos obtenidos mediante técnicas de química combinatoria (Terrett, N. K. y col., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995) o técnicas de síntesis convencionales, o péptidos aleatorios preparados mediante el empleo de un procedimiento de expresión en fagos (Felici, F. y col., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) o similares. Estos compuestos conocidos incluyen compuestos (incluidos péptidos) conocidos por mostrar una actividad que inhibe metaloproteasa, pero no se conocen por inhibir la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención. Además, pueden usarse los sobrenadantes de cultivos de microorganismos, componentes naturales derivados de plantas u organismos marinos o extractos de tejido animal como los compuestos de prueba a seleccionar. Además, pueden usarse los compuestos (incluyendo péptidos) obtenidos mediante compuestos químicamente o biológicamente modificados (incluyendo péptidos) seleccionados mediante el procedimiento de selección de la presente invención.

El procedimiento de detección de la presente invención puede llevarse a cabo mediante un procedimiento similar al procedimiento anteriormente mencionado para confirmar la actividad agrecanasa, excepto que el polipéptido de la presente invención, el polipéptido de sustrato y el compuesto de prueba se ponen en contacto entre sí en lugar de poner en contacto el polipéptido de prueba con el polipéptido de sustrato. Concretamente, en el procedimiento de detección de la presente invención es posible detectar si el compuesto de prueba inhibe o no la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención poniendo en contacto el polipéptido de la presente invención, el polipéptido de sustrato y el polipéptido de prueba entre sí y analizando si el polipéptido de sustrato se digiere o no por la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención en presencia del compuesto de prueba (o analizando el grado de digestión). Si el polipéptido de sustrato no se digiere por la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención o se reduce el grado de digestión, es posible confirmar que el compuesto de prueba inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención.

Como polipéptido de sustrato que puede usarse en el procedimiento de detección de la presente invención puede usarse el polipéptido de sustrato previamente descrito en el procedimiento para confirmar la actividad agrecanasa.

En el procedimiento de detección de la presente invención puede usarse como procedimiento para analizar si el polipéptido de sustrato se digiere o no por la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención los procedimientos previamente descritos en el procedimiento para confirmar la actividad agrecanasa. Como procedimientos pueden mencionarse, por ejemplo, un procedimiento para analizar un fragmento de polipéptido generado mediante digestión del polipéptido de sustrato por la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención (tal como un procedimiento para detectar la presencia del fragmento de polipéptido, o un procedimiento para medir una cantidad del fragmento de polipéptido generado), o un procedimiento para analizar el polipéptido de sustrato reducido por la digestión (tal como un procedimiento para detectar la presencia del polipéptido de sustrato, o un procedimiento para medir una cantidad del polipéptido de sustrato reducido).

En el procedimiento de selección de la presente invención es posible seleccionar una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención o una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones basándose en los resultados obtenidos mediante la detección de si el compuesto de prueba inhibe o no la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención usando el procedimiento de detección de la presente invención. Más particularmente, por ejemplo, si el polipéptido de la presente invención, el polipéptido de sustrato y el polipéptido de prueba se ponen en contacto entre sí, una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención o una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones puede seleccionarse basándose en la presencia o grado de digestión del polipéptido de sustrato en presencia del compuesto de prueba. Si el polipéptido de sustrato no es digerido por la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención o se reduce el grado de digestión, es posible confirmar que el compuesto de prueba es una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención o una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones.

[5] El procedimiento para fabricar una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones de la presente invención

La memoria descriptiva describe una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones que comprende, como principio activo, una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención seleccionado mediante el procedimiento de selección de la presente invención.

La memoria descriptiva describe un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones que comprende las etapas de detectar, en una prueba de control de calidad de una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones, si la composición farmacéutica inhibe o no la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención mediante el procedimiento de detección de la presente invención, y preparar un medicamento.

Además, la memoria descriptiva describe un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones, que está constituido por la etapa de preparar un medicamento usando una sustancia obtenida mediante el procedimiento de selección de la presente invención que comprende la etapa de detección.

La preparación que contiene como principio activo una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención puede prepararse usando vehículos, cargas y/u otros aditivos generalmente usados en la preparación de medicamentos, según el principio activo.

Ejemplos de administración incluyen administración por vía oral mediante comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, gránulos finos, polvos, disoluciones orales y similares, y administración parenteral mediante inyecciones (por ejemplo, intravenosas, intramusculares o similares), supositorios, preparaciones transdérmicas, preparaciones de absorción transmucosa y similares. Particularmente, en el caso de péptidos que se digieren en el estómago se prefiere una administración parenteral tal como inyección intravenosa o similar, o técnicas de preparación en las que el polipéptido no se digiere, tal como una técnica de preparación descrita en el documento WO95/28963.

En la composición sólida para uso en la administración por vía oral pueden mezclarse una o más sustancias activas con al menos un diluyente inerte tal como lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinilpirrolidona o silicato de aluminio y magnesio. En el modo usual, la composición puede contener aditivos distintos del diluyente inerte tales como un lubricante, un agente de disgregación, un agente estabilizante o un agente solubilizante o de ayuda en la solubilización. Si es necesario, los comprimidos o píldoras pueden recubrirse con un recubrimiento o una película de azúcar de una sustancia gástrica o entérica.

La composición líquida para administración por vía oral puede incluir, por ejemplo, emulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires, y puede contener un diluyente inerte generalmente usado tal como agua purificada o alcohol etílico. La composición puede contener aditivos distintos del diluyente inerte tales como agentes humectantes, agentes de suspensión, edulcorantes, aromas o antisépticos.

Las inyecciones para administración parenteral pueden incluir disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas asépticas. Ejemplos de diluyentes para uso en las disoluciones y suspensiones acuosas incluyen agua destilada para uso de inyección y solución salina fisiológica. Ejemplos de diluyentes para uso en las disoluciones y suspensiones no acuosas incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal (por ejemplo aceite de oliva), alcoholes (por ejemplo etanol), polisorbato 80 y similares. Una composición tal puede contener además un agente humectante, un agente emulsionante, un dispersante, un agente estabilizante, un agente solubilizante o de ayuda en la solubilización, un antiséptico o similares. Estas composiciones pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de filtro de retención de bacterias, combinación de un germinicida o irradiación. Alternativamente pueden usarse haciéndolas primero en composiciones sólidas estériles y disolviéndolas en agua estéril u otro disolvente estéril para uso de inyección antes de su uso.

La dosis se decide opcionalmente considerando la intensidad de cada principio activo seleccionado por el procedimiento de selección anteriormente seleccionado, o síntomas, edad, sexo o similares de cada paciente que va a administrarse.

Por ejemplo, en el caso de administración por vía oral, la dosificación usual para un adulto (60 kg de peso) es aproximadamente de 0,01 a 1000 mg, preferentemente de 0,01 a 100 mg por día. En el caso de administración parenteral, la dosificación usual es aproximadamente de 0,01 a 1000 mg, preferentemente de 0,01 a 100 mg por día en forma de una inyección.

[6] El anticuerpo y el fragmento del mismo de la presente invención

Puede obtenerse un anticuerpo, tal como un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, que reacciona con el polipéptido de la presente invención administrando directamente el polipéptido de la presente invención o un fragmento del mismo a diversos animales. Alternativamente puede obtenerse mediante un procedimiento de vacunación de ADN (Raz, E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994; o Donnelly, J. J. y col., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996) usando un plásmido dentro del que se inserta un polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención.

El anticuerpo policlonal puede producirse de un suero o huevos de un animal tal como un conejo, una rata, una cabra o un pollo, en que el animal se inmuniza y se sensibiliza mediante el polipéptido de la presente invención o un fragmento del mismo emulsionado en un adyuvante apropiado (por ejemplo adyuvante completo de Freund) mediante administración intraperitoneal, subcutánea o intravenosa. El anticuerpo policlonal puede separarse y purificarse del suero o huevos resultantes según procedimientos convencionales para el aislamiento y purificación de polipéptidos. Ejemplos de los procedimientos de separación y purificación incluyen, por ejemplo, separación centrífuga, diálisis, precipitación con sulfato de amonio o una técnica cromatográfica usando tal como DEAE-celulosa, hidroxiapatito, proteína A agarosa y similares.

El anticuerpo monoclonal puede producirse fácilmente por aquellos expertos en la materia según, por ejemplo, un procedimiento de fusión de células de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975).

Un ratón se inmuniza varias veces por vía intraperitoneal, subcutánea o intravenosa en un intervalo de unas pocas semanas mediante una inoculación repetida de emulsiones en las que el polipéptido de la presente invención o un fragmento del mismo se emulsiona en un adyuvante adecuado tal como adyuvante completo de Freund. Después de la inmunización final se eliminan las células del bazo y a continuación se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas.

Como célula de mieloma para obtener un hibridoma puede usarse una célula de mieloma que tiene un marcador tal como una deficiencia en hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa o timidina cinasa (por ejemplo, línea celular P3X63Ag8.U1 del mieloma de ratón). Como agente de fusión puede usarse polietilenglicol. Como medio para la preparación de hibridomas puede usarse, por ejemplo, un medio comúnmente usado tal como un medio esencial mínimo de Eagle, un medio esencial mínimo modificado por Dulbecco o un medio RPMI-1640 mediante la adición adecuada del 10 al 30% de un suero bovino fetal. Las cepas fusionadas pueden seleccionarse mediante un procedimiento de selección con HAT. Un sobrenadante del cultivo de los hibridomas se barre mediante un procedimiento muy conocido tal como un procedimiento de ELISA o un procedimiento inmunohistológico para seleccionar clones de hibridomas que secretan el anticuerpo de interés. La monoclonalidad del hibridoma seleccionado se garantiza repitiendo el subclonado mediante un procedimiento de dilución limitante. Los anticuerpos en una cantidad que pueden purificarse se producen cultivando los hibridomas resultantes en un medio durante 1 a 4 días, o en la cavidad peritoneal de un ratón de la cepa BALB/c previamente tratada con pristano durante de 10 a 20 días.

Los anticuerpos monoclonales resultantes en el sobrenadante del cultivo o la ascitis pueden separarse y purificarse mediante procedimientos convencionales de aislamiento y purificación de polipéptidos. Ejemplos de los procedimientos de separación y purificación incluyen, por ejemplo, separación centrífuga, diálisis, precipitación con sulfato de amonio o una técnica cromatográfica usando tal como DEAE-celulosa, hidroxiapatito, proteína A agarosa y similares.

Además, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpos que contienen una parte de los mismos pueden producirse insertando la totalidad o una parte de un gen que codifica el anticuerpo monoclonal en un vector de expresión e introduciendo el vector de expresión resultante en células huésped apropiadas (tales como E. coli, levadura o células animales).

Los fragmentos de anticuerpos que comprenden una parte activa del anticuerpo tal como F(ab')_{2}, Fab, Fab' o Fv pueden obtenerse mediante un procedimiento convencional, por ejemplo, digiriendo los anticuerpos separados y purificados (incluyendo anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales) con una proteasa tal como pepsina o papaína, y separando y purificando los fragmentos resultantes mediante procedimientos habituales de aislamiento y purificación de polipéptidos.

Además, un anticuerpo que reacciona con el polipéptido de la presente invención puede obtenerse en forma de Fv o Fab de cadena sencilla según un procedimiento de Clackson y col. o un procedimiento de Zebedee y col. (Clackson, T. y col., Nature, 352, 624-628, 1991; o Zebedee, S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992). Además, puede obtenerse un anticuerpo humanizado inmunizando un ratón transgénico en el que los genes de anticuerpos de ratón están sustituidos con genes de anticuerpos humanos (Lonberg, N. y col., Nature, 368, 856-859, 1994).

Ejemplos

La presente invención se ilustrará ahora adicionalmente mediante, pero ni mucho menos se limita a, los siguientes ejemplos. Los procedimientos se realizaron según los procedimientos conocidos (Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989), a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplo 1

Preparación del vector de expresión que tiene FLAG añadida al extremo C- terminal

Se construye un vector de expresión pCEP4d, en el que la unidad de expresión del virus de Estein-Barr EBNA1 se eliminó, digiriendo el plásmido pCEP4 (fabricado por Invitrogen) con enzimas de restricción ClaI y NsiI, haciendo romo el extremo y autoligándola. El vector de expresión resultante pCEP4d se digirió con enzimas de restricción, NheI y BamHI, y el fragmento de ADN resultante de aproximadamente 7,7 kbp se extrajo de gel de agalosa, a continuación de esto el oligonucleótido de cadenas dobles preparado mediante hibridación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 7 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 8 se insertó para construir el vector de expresión pCEP4d-FLAG. La secuencia de bases del vector de expresión resultante se analizó para confirmar que la secuencia deseada estaba incluida allí dentro.

Se llevó a cabo una PCR usando el vector de expresión pCEP4d-FLAG como plantilla, el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 9 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 10 como cebadores y la polimerasa de ADN PyroBest (PyroBest^{TM}; fabricada por Takara-shuzo). En la PCR se realizó primero una reacción desnaturalizante térmica a 94ºC durante 2 minutos. A continuación se repitió 15 veces una reacción en ciclos compuesta de tratamientos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 30 segundos. A partir de entonces se llevó a cabo una reacción de extensión a 72ºC durante 7 minutos.

Un fragmento de ADN resultante de aproximadamente 0,4 kbp se digirió con una enzima de restricción, SpeI, y se insertó dentro del vector de expresión pCEP4d-FLAG (aproximadamente 7,7 kbp), que había sido digerido con XbaI, para obtener un vector de expresión pCEP4dE2-FLAG. En el vector de expresión resultante pCEP4dE2-FLAG, la secuencia de reconocimiento XbaI, la secuencia de reconocimiento NheI, la secuencia de reconocimiento NotI y la secuencia de reconocimiento BamHI y la marca FLAG se dispusieron desde el promotor hasta aguas abajo del mismo.

Ejemplo 2

Clonado del gen ORF de longitud completa del gen MDTS8 de nueva agrecanasa

Se llevó a cabo una PCR usando la combinación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 3 (que tiene una secuencia de reconocimiento XbaI y un secuencia Kozak añadida al extremo 5') y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 4 (que tiene una secuencia de reconocimiento NotI añadida al extremo 5') como cebadores, una biblioteca de ADNc de placenta humana (ADNc Marathon-Ready^{MR}; fabricado por Clontech) como plantilla y polimerasa de ADN (TaKaRa LA Taq^{MR}; fabricado por Takara-shuzo) como polimerasa de ADN. En la PCR se realizó primero una reacción desnaturalizante térmica a 94ºC durante 2 minutos. A continuación se repitió 45 veces un ciclo compuesto de tratamientos a 98ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 3 minutos. A partir de entonces se llevó a cabo una reacción de extensión a 68ºC durante 7 minutos.

Un producto de PCR resultante, un fragmento de ADN con aproximadamente 2,3 kbp (que tiene la secuencia de reconocimiento XbaI y la secuencia Kozak añadida al extremo 5', y la secuencia de reconocimiento NotI añadida al extremo 3'), se subclonó en un plásmido PCR2.1 (fabricado por Invitrogen) para obtener un clon pMDTS8Cys.

El plásmido pMDTS8Cys resultante se digirió con enzimas de restricción, XbaI y NotI, y un fragmento de ADN resultante de aproximadamente 2,3 kbp se insertó en el sitio XbaI y Not I del plásmido pCEP4dE2-FLAG construido en el ejemplo 1 para obtener un plásmido pCEPdE2-MDTS8Cys-FLAG.

El plásmido pCEPdE2-MDTS8Cys-FLAG resultante se digirió con enzimas de restricción, KpnI y NotI, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 8,3 kbp (denominado en lo sucesivo fragmento A de ADN). Además, el plásmido pCEPdE2-MDTS8Cys-FLAG resultante se digirió con enzimas de restricción, KpnI y SpeI, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kbp (denominado en lo sucesivo fragmento B de ADN).

Se repitieron los procedimientos descritos como antes, excepto que la combinación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 5 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 6 (que tiene una secuencia de reconocimiento NotI añadida al extremo 5') se usó como cebadores, en lugar de la combinación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 3 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 4. Un producto de PCR resultante, un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kbp (que tiene la secuencia de reconocimiento NotI añadida al extremo 3'), se subclonó en el plásmido PCR2.1 (fabricado por Invitrogen) para obtener un clon pMDTS8-3H. El clon pMDTS8-3H resultante se digirió con enzimas de restricción, SpeI y NotI, para obtener un fragmento de ADN con aproximadamente 1,5 kbp (denominado en lo sucesivo fragmento C de ADN).

El fragmento A de ADN anterior, el fragmento B de ADN anterior y el fragmento C de ADN anterior se ligaron para preparar un plásmido pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG. El plásmido pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG resultante contiene un gen que está constituido por las bases de 1 a 3663 en la secuencia de bases de ID SEC Nº: 1, es decir, la secuencia de bases del gen MDTS8 de nueva agrecanasa. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de 1 a 1221 en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 23 añadida al extremo de C de la misma puede expresarse de una célula animal como huésped.

Ejemplo 3

Expresión de la proteína de longitud completa de MDTS8 (MDTS8Full)

Se usó un reactivo de transfección comercialmente disponible (reactivo de transfección FUGENE^{MR} 6; fabricado por Boehringer Mannheim), según un protocolo adjunto al mismo, para introducir el plásmido pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG preparado en el ejemplo 2, o el plásmido pCEP4dE2-FLAG como control, en una célula HEK293-EBNA fabricada por Invitrogen.

Se confirmó la existencia de la proteína deseada en un sobrenadante de un cultivo obtenido de 1 día a 2 días después de la introducción del plásmido mediante un inmunoensayo usando un anticuerpo (anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG de ratón; fabricado por Sigma) contra la marca FLAG añadida al extremo de C. Más particularmente, el sobrenadante del cultivo se sometió a electroforesis en un gel de SDS/acrilamida al 10% - 20%; fabricado por Daiichi Pure Chemicals, y se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante un aparato de transferencia. A la membrana de PVDF resultante se añadió un agente de bloqueo (Block-ace fabricado por Dainippon Pharmaceutical) para realizar un bloqueo. A continuación, los productos sobre la membrana se hicieron reaccionar sucesivamente con el anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG de ratón y un anticuerpo policlonal IgG anti-ratón de conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (fabricado por Zymed o TAGO). Alternativamente, después del bloqueo, los productos sobre la membrana se hicieron reaccionar sucesivamente con anticuerpo M2 biotinilado (fabricado por Sigma) y una estreptoavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (fabricada por Amersham Pharmacia Biotech). Después de la reacción se confirmó una expresión de la proteína deseada mediante un sistema de detección de inmunoensayo comercialmente disponible (sistema de detección de inmunoensayo ECL; fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

Un peso molecular aparente de la proteína detectada sobre el gel de electroforesis de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) fue de aproximadamente 120 a 140 kDa.

Ejemplo 4

Confirmación de la actividad agrecanasa de la proteína de longitud completa de MDTS8 (1) Preparación de agrecano recombinante G1G2

Se llevó a cabo una PCR usando la combinación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 11 preparado basándose en la secuencia de genes de un agrecano humano conocido (Doege K. y col., Biochem. Soc. Trans., 18, 200-202, 1990) y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 12 como cebadores, una biblioteca de ADNc de placenta humana (ADNc Marathon-Ready^{MR}; fabricado por Clontech) como plantilla y una polimerasa de ADN PyroBest^{MR} (fabricada por Takara-shuzo) como la polimerasa de ADN. En la PCR se realizó primero una reacción desnaturalizante térmica a 94ºC durante 1 minuto. A continuación se repitió 40 veces un ciclo compuesto de tratamientos a 98ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 2 minutos. A partir de entonces se llevó a cabo una reacción de extensión a 68ºC durante 7 minutos.

Un producto de PCR resultante, un fragmento de ADN, se digirió con una enzima de restricción, BamHI, y un fragmento de ADN resultante se insertó en el sitio BamHI del plásmido pCEP-SigFla para preparar un plásmido de expresión pCEPrAgg para expresar una proteína (denominada en lo sucesivo un recombinante G1G2) que contiene un dominio globular 1 - dominio globular 2 de agrecano humano y una marca FLAG añadida al extremo de N del dominio globular 1 - el dominio globular 2 y la marca His añadida al extremo de C del dominio globular 1 - el dominio globular 2. El plásmido pCEPSigFla fue un vector de expresión preparado mediante inserción de un oligonucleótido de cadenas dobles que se había preparado hibridando el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 13 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 14 en el sitio HindIII y XhoI del plásmido pCEP4d preparado en el ejemplo 1. El plásmido pCEP-SigFla contuvo una secuencia de señal secretora (Guan X-M. y col., J. Biol. Chem., 267, 21995-21998, 1992) que provenía de hemaglutinina de un virus de gripe, una secuencia de la marca FLAG y una secuencia de reconocimiento BamHI, en el orden anterior, desde el promotor hasta aguas abajo del mismo.

Se introdujo un plásmido de expresión pCEP-rAgg resultante en la célula HEK293-EBNA y el transformante se cultivó durante de 3 a 7 días para expresar la proteína deseada, es decir, el agrecano recombinante G1G2. La proteína deseada se purificó del sobrenadante del cultivo mediante una cromatografía de afinidad haciendo uso de la marca FLAG unida al extremo de N. Más particularmente, el sobrenadante del cultivo se aplicó a M2-agalosa (fabricado por Sigma) empaquetado en una columna, se lavó con 20 mmol/l de tris-HCl (pH 7,4)/150 mmol/l de cloruro sódico (denominado en lo sucesivo TBS), se eluyó con 0,1 mol/l de clorhidrato de glicina (pH 3,0) para fraccionarlo e inmediatamente se neutralizó con 1 mmol/l de tris-HCl (pH 8,0).

(2) Detección de la actividad agrecanasa

Como se describen en el ejemplo 3, el plásmido pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG preparado en el ejemplo 2 del plásmido pCEPdE2-FLAG preparado en el ejemplo 1 como control se introdujo en una célula HEK293-EBNA (fabricada por Invitrogen). A continuación, 16 horas después de la introducción del plásmido, un medio se sustituyó con un medio sin suero. El cultivo continuó durante 34 horas y a partir de entonces se recuperó un sobrenadante del cultivo.

El sobrenadante del cultivo resultante se mezcló con el recombinante G1G2 preparado en el ejemplo 4 (1) y se hizo reaccionar a 37ºC durante la noche. A partir de entonces, como se describe en el ejemplo 3, se llevaron a cabo una SDS-PAGE, una transferencia a una membrana de PVDF y un bloqueo. Entonces, los productos sobre la membrana de PVDF se hicieron reaccionar sucesivamente con el anticuerpo monoclonal BC-3 de ratón (Hughes C.E. y col., Biochemical J., 305, 799-804, 1995) que podía reconocer un neo-epítopo de agrecanasa y un anticuerpo policlonal IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa (fabricado por TAGO). A continuación se usó para la detección un sistema de detección de inmunoensayo (sistema de detección de inmunoensayo ECL; fabricado por Amersham Pharmacia).

Se reveló que, cuando el sobrenadante del cultivo de la célula HEK293-EBNA transfectada con el plásmido pCEPdE2-FLAG (control) se hizo reaccionar con el recombinante G1G2, no se detectó producto de degradación reactivo con el anticuerpo neo-epítopo anti-agrecanasa, mientras que tales productos de degradación se detectaron cuando el sobrenadante del cultivo de la célula HEK293-EBNA transfectada con el plásmido pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG se hizo reaccionar con el recombinante G1G2.

El presente ejemplo muestra que MDTS8 tiene una actividad agrecanasa.

Ejemplo 5

Inducción de la expresión de ARNm de MDTS8, acompañado por diferenciación a células del cartílago (1) Inducción de la diferenciación de células madre mesenquimales a célula del cartílago

Se sabe que una célula madre mesenquimal humana se diferencia de una célula del cartílago cuando se cultiva con gránulo esfeoride con una estimulación de TGF-\beta3 o similar (Pittenger M. F. y col., Science, 284, 143-147, 1999).

Las células madre mesenquimales humanas normales (fabricadas por Bio Whittaker) se cultivaron en un kit de medio de proliferación de células madre mesenquimales humanas (fabricado por Bio Whittaker) para obtener 5x10^{5} células. A continuación se lavaron 2,5x10^{5} células con un medio de inducción de condrogénesis incompleto [DMEM-alto contenido de glucosa (fabricado por LIFE TECHNOLOGIES), 1 mmol/l de piruvato de sodio (fabricado por LIFE TECHNOLOGIES), 0,35 mmol/l de prolina (fabricado por LIFE TECHNOLOGIES), 0,1 \mumol/l de dexametasona (fabricado por Sigma), 0,17 mmol/l de 2-fosfato del ácido ascórbico (fabricado por Sigma) y complemento de cultivo ITS+1 (fabricado por Sigma)], y se suspendió en 500 \muL de un medio de inducción de condrogénesis incompleto [un medio de inducción de diferenciación de cartílago incompleto que contiene 0,01 \mug/ml de TGF-\beta3 (fabricado por Sigma)]. A continuación se transfirió la suspensión a un tubo de polipropileno y se centrifugó a 150 x g durante 5 minutos para obtener un sedimento de células. El sedimento de células resultante se colocó en un aparato de cultivo de células como estaba y se cultivó. El cultivo continuó durante 2 semanas, mientras que el medio se cambió a un medio de inducción de diferenciación de cartílago completo cada 3 ó 4 días, de manera que las células se diferenciaron a células de cartílago.

(2) Confirmación de la diferenciación a células de cartílago

Se preparó un ARN total de cada una de las células madre mesenquimales humanas no diferenciadas y las células inducidas a diferenciación mediante un reactivo de purificación de ARN comercialmente disponible (ISOGEN; fabricado por Nippon Gene). El ARN total resultante se hizo reaccionar con DNasa (fabricada por Nippon Gene) a 37ºC durante 15 minutos. El ARN total resultante tratado con DNasa (0,5 \mug) se convirtió en ADNc mediante un sistema de cadenas sencillas Superscript (para PCR-TI; fabricado por LIFE TECHNOLOGIES).

La diferenciación de las células madre mesenquimales humanas a células de cartílago mediante el tratamiento de inducción de diferenciación como se describe en el ejemplo 5(1) se confirmó mediante un notable aumento de una expresión de ARNm de colágeno de tipo II y colágeno de tipo IX específicamente expresado en células de cartílago, que sigue adelante con la inducción de diferenciación. Más particularmente se usó una PCR cuantitativa usando un detector de secuencias (detector de secuencias Prism7700; fabricado por Applied Biosystems) para medir una cantidad existente y hacer una comparación. Para el colágeno de tipo II, la combinación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 15 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 16 se usó como un conjunto de cebadores, y para colágeno de tipo IX se usó como conjunto de cebadores la combinación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 17 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 18. Se usó un agente de PCR comercialmente disponible (reactivo núcleo para PCR SYBR Green PCR; fabricado por Applied Biosystems) para realizar la PCR. En la PCR se realizó una reacción desnaturalizante inicial a 95ºC durante 10 minutos. A continuación se repitió 45 veces una reacción en ciclos compuesta de tratamientos a 94ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos.

Además, se llevó a cabo una PCR usando ADN de genoma humano como plantilla y el cebador asignado anteriormente en las mismas condiciones para obtener una curva patrón para calcular una cantidad de ARNm expresado. Se llevó a cabo una PCR usando el ADNc como antes y el ADN de genoma humano como plantillas y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 21 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 22 como cebador fijado en las mismas condiciones para calcular una cantidad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humana (g3pdh) expresada como patrón interno. Las cantidades de ARNm existentes de colágeno de tipo II y colágeno de tipo IX se corrigieron basándose en los valores predeterminados de G3PDH.

(3) Expresión del gen de MDTS8 en células del cartílago

El oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 19 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 20 se diseñaron basándose en la secuencia de bases de ID SEC Nº: 1 como un conjunto de cebadores para medir una cantidad de ARNm del gen MDTS8 de la nueva agrecanasa. Se llevó a cabo una PCR usando el anterior conjunto de cebadores, ADNc (correspondiente a 5 ng de ARN total) preparado en el ejemplo 5 (2) como plantilla y una polimerasa de ADN (TaKaRa LA Taq^{MR}; fabricada por Takara-shuzo). En la PCR se realizó primero una reacción desnaturalizante térmica a 94ºC durante 2 minutos. A continuación se repitió 40 veces un ciclo compuesto de tratamientos a 98ºC durante 10 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto.

Se llevó a cabo una PCR para monitorizar la expresión del gen G3PDH usando la combinación del oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 21 y el oligonucleótido que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 22 como conjunto de cebadores, ADNc (correspondiente a 5 ng de ARN total) preparado en el ejemplo 5 (2) como plantilla y una polimerasa de ADN (TaKaRa LA Taq^{MR}; fabricada por Takara-shuzo). En la PCR se realizó primero una reacción desnaturalizante térmica a 94ºC durante 2 minutos. A continuación se repitió 30 veces un ciclo compuesto de tratamientos a 98ºC durante 10 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto.

Se reveló que no se observó un cambio sustancial de la expresión del gen G3PDH acompañada por la diferenciación a células de cartílago, mientras que el ARNm del gen MDTS8 de la nueva agrecanasa de la presente invención no se detectó en las células madre mesenquimales humanas antes de la diferenciación, pero se detectó como una banda de aproximadamente 0,33 kbp en las células del cartílago. Esto muestra que el ARNm del gen MDTS8 de la nueva agrecanasa de la presente invención se expresa en células del cartílago.

Ejemplo 6

Mapeo de cromosomas del gen MDTS8 de la nueva agrecanasa

Se realizó una búsqueda BLAST en GenBank para la secuencia de genes del ORF de longitud completa del gen de la nueva agrecanasa que está constituido por la secuencia de bases de ID SEC Nº: 1 de la presente invención como secuencia de consulta. Se encontró que BAC clona AC026498, AC025284, AC010548 y AC009139 contienen secuencias parciales de MDTS8, y una parte de al menos 24 exones está presente en cada uno de los
clones.

Entonces, mediante la base de datos pública (Human Genome Reconstruction Project; http://hgrep.ims.u-tokyo.
ac.jp/cgi-bin/HTGtool/view.cgi?layer=top) establecida por el Instituto de Ciencias médicas, Universidad de Tokio y RIKEN y publicada en la web se confirmó que los cuatro clones como antes están localizados en el cromosoma 16q. Además, también se confirmó que los cuatro clones como antes contienen marcadores genéticos WI-22533, stSG3069, SGC32952 y stSG62732 que están localizados en el cromosoma 16q.

Posteriormente se realizó mapeo de cromosomas más detallado usando los marcadores WI-22533, stSG3069, SGC32952 y stSG62732 localizados en el cromosoma 16q. Más particularmente, los marcadores de los cuatro genes anteriores se investigaron en otra base de datos pública (The Genome Database; http://www.gdb.org/). Se encontró que cada uno de los cuatro marcadores estaba localizado en 16q22.3-23.1 del mapa físico de cromosomas y, por tanto, el MDTS8 está localizado en 16q22.3-23.1.

Por tanto, se hace patente que la posición cromosómica de MDTS8 pertenece a una región especificada como un locus con susceptibilidad por OA, es decir, una enfermedad de las articulaciones.

Aplicabilidad industrial

El polipéptido de la presente invención es una nueva agrecanasa causante de enfermedades de las articulaciones (particularmente OA) y, por tanto, una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención es útil como una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones.

Según el polipéptido de la presente invención puede proporcionarse un sistema de selección conveniente para un agente para tratar enfermedades de las articulaciones. Concretamente, mediante el procedimiento de detección de la presente invención usando el polipéptido de la presente invención puede seleccionarse una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones mediante selección de una sustancia que inhibe la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención.

Además, puede producirse una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones mediante preparación de un medicamento usando una sustancia seleccionada mediante el procedimiento de selección, como un principio activo, y un vehículo, una carga y/u otros aditivos.

El procedimiento de detección del presente procedimiento puede usarse no sólo para seleccionar una sustancia para tratar enfermedades de las articulaciones, sino también para una prueba de control de calidad de una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones. Concretamente puede producirse una composición farmacéutica para tratar enfermedades de las articulaciones para detectar si un compuesto que va a probarse muestra o no la actividad agrecanasa del polipéptido de la presente invención, mediante el procedimiento de detección de la presente invención, y entonces preparar un medicamento usando la sustancia resultante que inhibe la actividad
agrecanasa.

Además, el polinucleótido, el vector de expresión, las células y el anticuerpo de la presente invención son útiles para producir el polipéptido de la presente invención

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Texto libre en la lista de secuencias

Las características de la "secuencia artificial" se describen en el identificador numérico <223> en la lista de secuencias. Más particularmente, cada una de las secuencias de bases de ID SEC Nº: 3-6 y 9-12 es una secuencia de cebadores artificialmente sintetizada. Cada una de las secuencias de bases de ID SEC Nº: 7, 8, 13, y 14 es una secuencia de ligadores artificialmente sintetizada. La secuencia de bases de ID SEC Nº: 23 es una secuencia artificialmente sintetizada que contiene una secuencia de reconocimiento NotI de la enzima de restricción y una secuencia de marca FLAG.

Como antes, la presente invención se explica con referencia a realizaciones particulares, pero las modificaciones y mejoras obvias para aquellos expertos en la materia están incluidas en el alcance de la presente invención.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> Nueva agrecanasa

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<130> Y0130PCT-661

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<150> JP 2000-384300

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<151> 2000-12-18

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<160> 26

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<210> 1

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<211> 3666

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..... (3666)

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<400> 1

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1

2

3

4

5

6

7

8

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<210> 2

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<211> 1221

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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9

10

11

12

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<210> 3

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebadores artificialmente sintetizada

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctctagacc atggagtgcg ccctcctgct cgcgtgtgcc

\hfill

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

agagcggccg cgcctttata aaacttgcaa gttgaattat c

\hfill

41

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

acggggtttg tgaactagtg ggatgtga

\hfill

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

agagcggccg cgatcttcct tgtgcatgac ttgcagcatt g

\hfill

41

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<210> 7

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de ligadores artificialmente sintetizada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagcgcggc cgcaggatcc gactacaagg acgacgatga caaatgataa

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcttatca tttgtcatcg tcgtccttgt agtcggatcc tgcggccgcg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtct agaagctggg taccagctgc tagc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtgt cgaccggtca tggctgcgc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggatcctt gtagaaactt cagaccatga caactcg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggatcctc aatggtgatg gtgatgatga ccgaagcaga aggcatggtg ccgggacag

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcccaggt caagatggtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcagcacc tgtctcacca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgttgctgg tgaaaagggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggatcccac tggtcctaat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtggaatg tgctctaagt accgaagttg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acactgtgtg tcagcatcat aaatctgtcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacgaattt ggctacagca ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacatggca actgtgagga gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia artificialmente sintetizada que contiene una secuencia de reconocimiento Not I de la enzima de restricción y secuencia de marca FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3).. (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa un aminoácido arbitrario.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Xaa Xaa His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ile Thr Gly Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Gly Ser Val}

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Un polipéptido que muestra una actividad agrecanasa y que comprende (1) la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 o (2) una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 10 aminoácidos se delecionan, se sustituyen y/o se insertan en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

2. El polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que muestra una actividad agrecanasa.

3. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 90% o más de homología con la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que muestra una actividad agrecanasa.

4. Un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

5. Un polinucleótido que codifica el polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 5.

7. Una célula transfectada con el vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para detectar si un compuesto que va a probarse inhibe o no una actividad agrecanasa de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:

poner en contacto (1) dicho polipéptido, (2) un polipéptido de sustrato que puede digerirse con agrecanasa, y (3) el compuesto que va a probarse y analizar la digestión del polipéptido de sustrato.

9. Un procedimiento para seleccionar una sustancia que inhibe una actividad agrecanasa de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:

detectar mediante el procedimiento según la reivindicación 8 y seleccionar una sustancia que inhibe una actividad agrecanasa.

10. Un procedimiento para seleccionar una sustancia según la reivindicación 9, en el que la sustancia es para tratar enfermedades de las articulaciones.

11. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une al polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4.