ES2288976T3 - Esterasa estereoselectiva de aspergillus oryzae. - Google Patents
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Abstract
Esterasa capaz de realizar una hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y con actividad arilesterasa y actividad feruloil esterasa y que es: a) un polipéptido codificado por una parte codificante de la esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia coli con número de depósito DSM 13977; b) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como el péptido maduro mostrado en la SEC ID NO: 2; c) un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) que: i) tiene al menos el 50% de identidad con dicho polipéptido, ii) es immunológicamente reactivo con un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido en forma purificada o iii) es una variante alélica de dicho polipéptido; o d) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos la cual se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con una cadena complementaria de la secuencia de ácidos nucléicos mostrada como los nucleótidos 629911 y 971-2208 de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la mismaque tiene al menos 100 nucleótidos.
Description
Esterasa estereoselectiva de Aspergillus
oryzae.
La presente invención se refiere a una esterasa,
a los métodos de uso y de producción de la misma, y a una secuencia
de codificación de la misma. La esterasa es capaz de realizar la
hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y de hidrolizar
ésteres de ácido ferúlico.
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Es conocida la preparación de ésteres quirales
de altas purezas ópticas por hidrólisis asimétrica con enzimas.
Así, US 4587462 expone la hidrólisis asimétrica de ésteres
alquílicos inferiores de naproxeno con una enzima microbiana,
particularmente una esterasa de separación específica de
Aspergillus oryzae DSM 2808 (ATCC 11492). US 5155028 expone
el seccionamiento de éster enzimático estereoselectivo usando
lipasas, esterasas o proteasas, p. ej. lipasas o esterasas de
Aspergillus o proteasas de Aspergillus oryzae. JP
7-206756 expone el uso de una enzima para preparar
compuestos ópticamente activos. La enzima puede ser una proteasa o
esterasa producida por Aspergillus, p. ej. de
A. oryzae.
A. oryzae.
Enzimas con actividad esterasa de ácido ferúlico
son conocidas, p. ej., de Aspergillus oryzae. M.
Tenkanen;
Biotechnology and Applied Biochemistry, 27 (1), 19-24 (1998); M. Tenkanen et al., J. Biotechnol., 18 (1-2), 69-84
(1991).
Biotechnology and Applied Biochemistry, 27 (1), 19-24 (1998); M. Tenkanen et al., J. Biotechnol., 18 (1-2), 69-84
(1991).
US 5516679 expone una amidohidrolasa de
penicilina V de Fusarium oxysporum.
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Los inventores han aislado una esterasa de
Aspergillus oryzae que es capaz de realizar la hidrólisis
estereoselectiva de ésteres quirales y también tiene actividad de
arilesterasa (EC 3.1.1.2) y actividad feruloil esterasa (EC
3.1.1.73). La nueva esterasa tiene sólo una homología limitada a las
secuencias de aminoácidos conocidas. Los inventores también
aislaron un gen que codificaba la esterasa nueva y la clonaron en
una cepa de E. coli.
Por consiguiente, la invención proporciona una
esterasa que es capaz de realizar una hidrólisis estereoselectiva
de ésteres sustituidos de ácido
3-fenil-propanoico. La esterasa
puede ser un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como el
péptido maduro mostrado en la SEC ID NO: 2.
Además, la esterasa de la invención puede ser un
polipéptido codificado por la parte codificante de la esterasa de
la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en
Escherichia coli número de depósito DSM 13977.
La esterasa puede también ser un análogo del
polipéptido definido anteriormente que:
- i)
- tiene al menos el 50% de identidad con dicho polipéptido,
- ii)
- es immunológicamente reactivo con un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido en forma purificada,
- iii)
- es una variante alélica de dicho polipéptido.
Finalmente, la esterasa de la invención puede
ser un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos
nucléicos que se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con la
cadena complementaria de nucleótidos 572-911 y
971-2208 de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la
misma de al menos 100 nucleótidos.
La secuencia de ácidos nucléicos de la invención
puede comprender una secuencia de ácidos nucléicos que codifica la
esterasa anteriormente descrita, o puede codificar una esterasa y
comprende:
a) la parte codificante de la esterasa de la
secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia
coli DSM 13977,
b) nucleótidos 629-911 y
971-2208 de la SEC, ID Nº: 1 (que codifica el
polipéptido maduro), o
c) un análogo de la secuencia de ADN definida en
a) o b) que codifica una esterasa que es capaz de realizar una
hidrólisis estereoselectiva de ésteres sustituidos de ácido
3-fenil-propanoico y
- i)
- tiene al menos el 60% de identidad con dicha secuencia de ADN, o
- ii)
- se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con la secuencia complementaria de dicha secuencia de ADN.
Otros aspectos de la invención proporcionan un
vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de ADN,
y una célula transformada con la secuencia de ADN o el vector de
expresión recombinante.
Una comparación con secuencias de longitud total
de la técnica anterior muestra que la secuencia más conocida es una
amidohidrolasa de penicilina V de Fusarium oxysporum (US
5516679). La secuencia de aminoácidos madura de la invención tiene
el 48% de identidad con la secuencia conocida, y las secuencias de
ADN correspondientes tienen el 54% de identidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 muestra un mapa de restricción del
plásmido de expresión de esterasa pCaHj585.
\vskip1.000000\baselineskip
La esterasa de la invención puede ser derivada
de cepas de Aspergillus, particularmente cepas de A.
oryzae, con la utilización de sondas diseñadas en base a la
secuencia de ADN en esta especificación.
Una cepa de Escherichia coli conteniendo
un gen que codifica la esterasa fue depositada por los inventores
según las condiciones del tratado de Budapest con el DSMZ -
Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH,
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE el 11 de
enero de 2001 bajo el número de acceso DSM 13977.
El vector de expresión según la invención
normalmente incluye secuencias de control que codifican un
promotor, operador, centro de unión del ribosoma, señal de
iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un marcador
seleccionable, un terminador de la transcripción, un gen represor o
varios genes activadores. El vector puede ser un vector de
replicación autónoma, o puede ser integrado en el genoma de la
célula huésped.
La esterasa de la invención puede ser producida
transformando una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN
que codifica la esterasa, cultivando el organismo transformado bajo
condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperando
la enzima del cultivo.
El organismo huésped puede ser una célula
eucariótica, en particular una célula fúngica, tal como una célula
de levadura o una célula fúngica filamentosa, tal como una cepa de
Aspergillus, Fusarium, Trichoderma o Saccharomyces,
particularmente A. Niger, A. oryzae, F. graminearum, F.
sambucinum, F. cerealis o S. cerevisiae. La producción de
la esterasa en organismos huéspedes de este tipo puede ser
realizada por los métodos generales descritos en EP 238,023 (Novo
Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) o EP 244,234 (Alko).
La esterasa de la invención es capaz de realizar
la hidrólisis estereoselectiva de ésteres incluso de ésteres
sustituidos de ácidos
3-fenil-propanoicos. No hidroliza el
éster etílico de naproxeno.
La esterasa es útil para la preparación de
ésteres o ácidos, enriquecidos ópticamente p. ej. ésteres
sustituidos de ácidos
3-fenil-propanoicos y ácidos
3-fenil-propanoicos sustituidos para
el uso farmacéutico.
La esterasa también tiene actividad de
arilesterasa (EC 3.1.1.2) y actividad feruloil esterasa (EC
3.1.1.73) y es útil en la hidrolización de ésteres feruloílicos en
ácido ferúlico y alcohol. Es útil para la liberación de ácido
ferúlico unido a hemicelulosa para la degradación de la materia
vegetal y de las paredes celulares vegetales, p. ej. como se
describe en GB 2301103 y WO200014234. Puede también ser usada para
la producción de ácido vanílico en analogía con US 5955137.
La hibridación se utiliza para indicar que una
secuencia de ADN dada es análoga a una sonda de nucleótidos
correspondiente a una secuencia de ADN según la invención. Las
condiciones de la hibridación están descritas con detalle más
abajo.
Las condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o
ARN homóloga implica un prerremojo del filtro que contiene los
fragmentos de ADN o ARN para hibridizarse en 5 X SSC (citrato de
solución salina estándar) durante 10 min, y prehibridación del
filtro en una solución de 5 X SSC (Sambrook et al. 1989); 5 X
Solución de Denhardt's (Sambrook et al. 1989); SDS (0.5%) y
100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y
sonicado (Sambrook et al. 1989), seguido de la hibridación
de la misma solución que contiene una sonda cebada de forma
aleatoria (Feinberg, A.P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132:6-13); marcada en
^{32}-P-dCTP (actividad específica
> 1 X 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 60ºC. El
filtro es luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 X SSC; SDS
(0.5%) a una temperatura de 60ºC, más preferiblemente al menos
65ºC, incluso más preferiblemente al menos 68ºC.
Las moléculas que la sonda de oligonucleótidos
hibridiza bajo estas condiciones son detectadas usando una película
de rayos x.
La esterasa y la secuencia de nucleótidos según
la invención preferiblemente tienen homologías a las secuencias
descritas de al menos el 80% de identidad, particularmente al menos
el 90% de identidad o al menos el 95% de identidad, p. ej. al menos
el 98% de identidad.
Para los objetivos de la presente invención, los
alineamientos de las secuencias y el cálculo de los niveles de
identidad fueron realizados usando un alineamiento de Clustal W
(J.D. Thompson et al (1994) NAR 22 (22) págs.
4673-4680), útil tanto para el alineamiento de la
proteína como del ADN. Las matrices de puntuación por defecto
Blosum62mt2 y swgapdnamt son usadas para los alineamientos de las
proteínas y del ADN respectivamente. La penalización por abertura
de espacio es 10 y la penalización por extensión de espacio: 0,1
para las proteínas. - la penalización por abertura de espacio es 15
y la penalización por extensión de espacio es 6,66 para el ADN. Los
alineamientos fueron hechos usando el programa informático allignX
que es un componente del paquete vector NTI Suite 6.0 de Informax,
Inc (www.informax.com))
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Aspergillus oryzae IF04177 fue fermentada
usando un proceso de flujo discontinuo con maltosa/maltodextrina o
glucosa como fuente principal de carbono. El medio continuo
contenía: maltosa/maltodextrina, sulfato de amonio,
dihidrogenfosfato de potasio, extracto de levadura, xilano de haya,
MgSO_{4},7H_{2}O, ácido cítrico, sulfato de potasio, solución de
metal traza y un agente antiespumante. Todos estos componentes
fueron usados en concentraciones todas en la gama de
1-18 g/l de medio final. El pH del medio fue
mantenido en 4.5 en toda la fermentación. El alimento consistió en
maltosa/maltodextrina o glucosa en la gama de 280 g/L. Se inocularon
6.5 kg de medio continuo con 500 ml de cultivo de semillas. Después
de 15-25 horas de fermentación continua la adición
de alimento fue iniciada usando un nivel de adición de alimento de
15-25 g de alimento por hora. Este estado en flujo
discontinuo continuó durante 100-160 horas de
fermentación. El oxígeno disuelto por encima del 50% de saturación
fue mantenido por medio de un control en bucle cerrado del nivel de
agitación. La aireación fue mantenida a 1 volumen de aire por
volumen de medio continuo por hora. Una presión "headspace"
con una sobrepresión de 0.5 bar fue mantenida en toda la
fermentación. Después de la cosecha del caldo, tanto la biomasa como
la materia no disuelta fue eliminada en una fase de filtración. El
sobrenadante fue concentrado mediante la eliminación del agua
mediante ultrafiltración, evaporación o
liofilización.
liofilización.
Ejemplo
2
(2RS) (+/-)
2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato
de etilo (0.5 g) fue agitado con 60 mg de la preparación de
esterasa liofilizada de Aspergillus oryzae en 1 ml de tampón
fosfato 1 M (pH=7) con cosolventes orgánicos (según la tabla a
continuación) a 27ºC. La mezcla reactiva fue vertida en 20 ml de
MeOH después de 4 h para detener las reacciones enzimáticas seguido
del análisis por electroforesis quiral capilar para determinar el
exceso enantiomérico (ee) como sigue:
Se utilizó la electroforesis capilar HP 3D y
80.5/72.0 cm; 50 mM de burbuja capilar HP. El electrolito fue
HS-\beta-CD (Regis) (2%p/v) y
TM-\beta-CD (Sigma) (2%p/v) en un
tampón de borato de 25 mM pH 9.3 (HP). La mezcla reactiva fue
diluida aproximadamente 25 veces en un tampón de borato de 5 mM, pH
9.3 (o concentración final aprox. 0.025 mg/ml - 0.1 mg/ml) e
inyectada (50 mbar en 4.0 segundos). El voltaje aplicado fue 30
kV.
Ejemplo
3
(2R/S) (+/)
2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato
de etilo (5 g) fue añadido a un tampón de fosfato acuoso 0.1 M pH 7
(10 ml). 100 mg de la preparación de esterasa liofilizada de
Aspergillus oryzae fue añadida y la mezcla fue agitada
durante 18 horas a la temperatura ambiente. Durante ese tiempo, el
pH de la mezcla reactiva fue mantenido constante a
pH=6-8 por la adición de NaOH. La mayor parte del
agua fue evaporada al vacío. Se añadió metanol a la pasta restante
para detener la hidrólisis. El precipitado que se formó fue filtrado
y el metanol fue evaporado al vacío. El aceite restante fue
disuelto en agua seguido de la extracción del éster no reaccionado
con éter terc-butilmetílico (TBME)(ee_{ester} =
87%, determinado como en el ejemplo 2). La fase acuosa fue
acidificada hasta pH = 3 y el ácido extraído con TBME. Tras el
secado con Na_{2}SO_{4} y la evaporación del TBME; se obtuvo
1.8 g de ácido
(2S)-2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoico
como un aceite, que cristalizó en reposo (p.f. = 105ºC,
ee_{ácido} = >99%, determinado como en el ejemplo 2).
Ejemplo
4
La fermentación con flujo discontinuo de un
derivado de Aspergillus oryzae IFO4177 fue realizada en un
medio que contenía maltodextrina como fuente de carbono, úrea como
fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación con
flujo discontinuo fue realizada inoculando un cultivo de un frasco
de agitación de A. oryzae en un medio comprendiendo 3,5% de
la fuente de carbono y 0,5% de la fuente de nitrógeno. Después de
24 horas de cultivo a pH 5.0 y 34ºC se inició el suministro
continuo de fuentes de nitrógeno y carbono adicionales. La fuente
de carbono fue mantenida como el factor de limitación y se
estableció que el oxígeno estaba presente en exceso. El cultivo de
flujo discontinuo fue continuado durante 4 días, después de los
cuales la enzima fue recuperada por centrifugado, ultrafiltración,
filtración, filtración del germen y secado por atomización.
El ensayo es un ensayo basado en el indicador
del pH, donde la reducción del pH es medida con
p-nitrofenol, cuando la enzima secciona el éster de
(2RS) (+/)
2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato
de etilo. La capacidad tamponadora de la muestra enzimática en
cuestión tiene que ser baja, puesto que una alta capacidad
tamponadora en la muestra suprimirá la caída del pH.
Se mezclaron 50 \mul de enzima (diluida en 5
mM de BES (Sigma B-6420), pH 7.1) con 100 \mul de
solución de ensayo (una mezcla de 400 \mul de (2RS) (+1)
2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato
de etilo (55 mM en acetonitrilo); 2000 \mul de
p-nitrofenol 5 mM en BES 5 mM, pH 7.1 y 7600 \mul
de BES 5 mM, pH 7.1). Después de un periodo de 5 minutos, la
reducción en la OD_{405} en los siguientes 10 minutos fue
vigilada como una medición de la actividad enzimática. Si la
pendiente de la curva vigilada se desviaba de la linealidad, el
ensayo fue repetido con mayor dilución enzimática.
24 g de un sobrenadante de Aspergillus
oryzae IFO4177 secado por atomización fueron disueltos en 375
ml 5 mM CH_{3}COOH/NaOH, pH 4.0 y el pH fue ajustado hasta pH
4.0. La solución tiene una conductividad de 1 mS/cm. La solución
fue aplicada a una columna de 100 ml de S-Sepharose
FF (Amersham pharmacia Biotech) equilibrada en 25 mM de
CH_{3}COOH/NaOH, pH 4.0. Después del lavado de la columna con el
mismo tampón, la columna fue eluida con un gradiente de NaCl lineal
de 0 a 0.5 M sobre 5 volúmenes de columna. Fracciones (10 ml) de la
columna fueron analizadas para la actividad esterasa y se agruparon
las fracciones 42 - 46. La agrupación 42-46 fue
dializada durante la noche contra 10 mM de KH_{2}PO_{4}/NaOH,
pH 7.0 en un tubo de diálisis y luego aplicada a una columna
Q-Sepharose FF de 40 ml (Amersham pharmacia
Biotech) columna equilibrada en 20 mM de KH_{2}PO_{4}/NaOH, pH
7.0. Después del lavado de la columna con el mismo tampón, la
columna fue eluida con un gradiente de NaCl lineal de 0 a 0.25 M
sobre 5 volúmenes de columna. Se analizó la actividad de las
fracciones de la columna. La actividad fue encontrada en la
fracción no retenida. El pH de la fracción no retenida fue ajustado
hasta pH 8.0 y aplicado a la misma columna
Q-Sepharose FF de 40 ml, pero esta vez equilibrada
en 20 mM de HEPES/NaOH, pH 8.0. Después del lavado de la columna
con el tampón HEPES, la columna fue eluida con un gradiente de NaCl
lineal de 0 a 0.25 M sobre 5 volúmenes de columna. Se analizó la
actividad de las fracciones (4 ml) de la columna fu y se agruparon
las fracciones 18-22. La agrupación
18-22 fue diluida 10 veces con agua desionizada y
aplicada a una columna SOURCE Q de 8 ml (Amersham pharmacia
Biotech) equilibrada en 20 mM de HEPES/NaOH, pH 8.0. Después del
lavado de la columna con el mismo tampón, la columna fue eluida con
un gradiente de NaCl lineal de 0 a 150 mM sobre 30 volúmenes de
columna. Las fracciones (3 ml) 28 y 29 fueron agrupadas y aplicadas
a una columna Superdex75 de 300 ml (Amersham pharmacia Biotech)
equilibrada en 20 mM de HEPES/NaOH; 200 mM de NaCl, pH 8.0. La
columna Superdex75 fue eluida con el mismo tampón y las fracciones
(5 ml) fueron analizadas por su actividad. La actividad enzimática
fue máxima en las fracciones 6 y 7. Las fracciones 5, 6, 7 y 8
fueron concentradas hasta aprox. 70 \mul en 10 kDa unidades
Ultrafuge de polisulfona cortadas (ultrafiltración por
centrifugado). Se aplicaron 10 \mul de cada fracción a un gel de
SDS-PAGE, y se observó que la intensidad de una
banda de \sim70 kDa siguió a la actividad. Las fracciones 6 y 7
fueron usadas para el seccionamiento y la secuenciación de la
proteína de Edman.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
75 \mul de la muestra de enzima purificada
fueron mezclados con 75p1 de tampón de muestra SDS PAGE con DTT y
se incubó a 37ºC durante 20 min. La muestra fue calentada a 95ºC
durante 3 min, enfriada y posteriormente se añadieron 20 \mul de
yodoacetamida 1 M (en 0.5 M tris pH 9.2). Se produjo la incubación
durante 20 min a la temperatura ambiente.
Se cargaron nueve carriles en un gel de
SDS-PAGE de Novex con la muestra (todas). Después
de la actuación, el gel fue teñido según procedimientos estándares
de Novex algunos trozos de gel que contenían la banda de -70 kDa
fueron posteriormente recortados y picados con una cuchilla. Los
trozos de gel fue lavados 2X en 0.5 M de Tris pH 9.2/Acetonitrilo
(ACN) (1:1) durante 45 min a 37ºC. Los trozos del gel fueron
tratados con ACN al 100% durante 10 min para introducir una
disminución de los trozos. El ACN fue eliminado y los trozos
secados en un speed-Vac. de 200 \mul. Se añadió
0.1 M (NH_{4})HCO_{3} y se incubó durante 15 min. El
(NH_{4})HCO_{3} fue eliminado y se añadieron 100 \mul
de ACN. Nuevamente se incubó durante 10 min seguido de la
eliminación del ACN. y secado en un speed-Vac. El
ciclo con alternación de (NH_{4})HCO_{3} y
adición/eliminación de ACN fue repetido 2X. Después de la última
fase de secado se añadieron 25 \mul de 0.1 \mug/\mul de
lisil-endopeptidasa Achromobacter en 0.1 M de Tris
pH 9.2, 10% ACN. Se incubó durante 20 min. Después se añadieron 350
\mul de Tris 0.1 M pH 9.2, 10% ACN. La incubación fue continuada
durante la noche a 37ºC.
Después, se añadieron 40 \mul de ácido
trifluoroacético (TFA) al 10% y después de 10 min de incubación, el
sobrenadante fue eliminado (guardado para su control). La
extracción de los péptidos fue realizada 2 X añadiendo 200 \mul
de TFA (0.1%); ACN (60%) a los trozos de gel e incubándolo durante
45 min a 37ºC. Todos los extractos fueron recogidos (65 \mul+200
\mul+200 \mul) y concentrados en el speed-Vac a
50 \mul. 50 \mul de TFA al 0.1% fueron añadidos y la muestra
resecada hasta 50 \mul.
La muestra fue realizada en
RP-HPLC en una columna C-18 2x50 mM
de Vydac usando un sistema solvente de TFA/ACN (gradiente de 0% a
64% de ACN en 0.1% de TFA durante 31 min; 150 \muL/min, detección
a 214 nm). Se realizaron controles con trozos de gel blanco en
paralelo. Los péptidos seleccionados de la separación fueron
sometidos al análisis de las secuencias por degradación de
Edman.
Los análisis de las secuencias peptídicas
demostraron que se habían obtenido tres secuencias. Las secuencias
determinadas fueron denominadas 161299Afr15 (SEC ID NO: 3);
161299Afr17 (SEC ID NO: 4) y 161299Afr23 (SEC ID NO: 5).
Ejemplo
6
Se encontró que las tres secuencias peptídicas
determinadas en el ejemplo 5 mostraban cierta homología a una
amidohidrolasa de penicilina V de Fusarium oxysporum
(GeneSeqP: WO0290). Así; 161299Afr15 (SEC ID NO: 3); 161299Afr17
(SEC ID NO: 4) y 161299Afr23 (SEC ID NO: 5) podrían ser alineadas
con los aminoácidos 381-398, 349-366
y 181-201, respectivamente, de la GeneSeqP:
WO0290.
En base a este alineamiento, dos cebadores de la
PCR fueron diseñados para amplificar por PCR una parte del gen de
la esterasa de A. oryzae.
Un cebador (B2716F09, SEC ID NO: 6)
correspondiente a la secuencia proteica en la dirección sentido del
péptido 161299Afr23 (aminoácidos 13-21 de la SEC ID
NO: 5) fue sintetizado.
Un cebador (B2716F11, SEC ID NO: 7)
correspondiente a la dirección antisentido fue sintetizado de la
secuencia proteica del péptido 161299Afr15 (aminoácidos
4-12 de la SEC ID NO: 3).
Estos dos cebadores de la PCR fueron usados para
la amplificación de un fragmento del gen de la esterasa de la
siguiente manera:
Se obtuvo ADN genómico a partir de
Aspergillus oryzae IFO 4177 como se describe por Yelton
et al. (M.M. Yelton, J.E. Mamer y W.E. Timberlake (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1470-1474).
El sistema Expand PCR (Roche Molecular
Biochemicals, Basel, Suiza) fue usado para la amplificación según
las instrucciones del fabricante para esta amplificación por PCR y
para otras posteriores. La concentración de magnesio fue mantenida
a 2.5 mM en todas las reacciones de la PCR.
El programa de ciclo térmico siguiente fue
realizado en un variador térmico MJ Research PTC 150:
- 94ºC durante 1 min.
- 1 ciclo
94ºC durante 10 seg.
Desnivel de temperatura a -0,5ºC/sec.
- 50ºC durante 10 seg.
- 40 ciclos
72ºC durante 30 seg.
- 72ºC durante 1 min.
- 1 ciclo.
Un producto de la PCR de aprox. 550 bp fue
detectado en gel de agarosa (1%). Este fragmento fue recuperado y
clonado en el vector pCR4-TOPO según las
instrucciones del fabricante (Invitrogen BV, Groningen,
Holanda).
Un plásmido con un inserto del tamaño previsto,
pCaHj571, fue seleccionado para la secuenciación y fue secuenciado
usando los cebadores siguientes: -48 inverso (SEC ID NO: 8) y -40
universal (SEC ID NO: 9).
Todas las reacciones de la secuencia fueron
realizadas usando kits de secuenciamiento BigDye^{TM} Terminator
de Perkin-Elmer Corporation (EEUU), y las
reacciones fueron realizadas en un secuenciador capilar ABI 3700 de
Perkin-Elmer Corporation según las instrucciones del
fabricante.
La secuencia codificó una secuencia de proteínas
homóloga a la amidohidrolasa de F. oxysporum y también
codificó la secuencia péptida 161299Afr17, y se concluyó de esta
manera que el fragmento amplificado es una parte del gen de la
esterasa. La secuencia del fragmento de la PCR se muestra como la
SEC ID NO: 27.
Una biblioteca de cósmidos de A. oryzae
IFO4177 ha sido preparada previamente como se describe en WO
9801470.
El inserto de pCaHj571 fue marcado con DIG
usando el plásmido como molde en una reacción de PCR con los
cebadores B2716F09 y B2716F11 y el kit de síntesis de sondas PCR
DIG de Roche Molecular Biochemicals según las instrucciones del
fabricante.
El fragmento marcado por DIG fue usado para
sondar filtros de la biblioteca de cósmidos usando las
recomendaciones de Roche Molecular Biochemicals, y las señales de
hibridación fueron visualizadas usando la detección por CSPD según
las instrucciones de Roche Molecular Biochemicals y usando una
cámara fotográfica LAS1000 plus CDC fabricada por Fujifilm.
Un cósmido que dio una señal de hibridación
clara fue aislado y denominado pCaHj577.
Un análisis de southern blot usando ADN genómico
de A. oryzae IFO4177 fue realizado usando la misma sonda,
condiciones de hibridación y método de detección que para el
aislamiento del cósmido. El ADN fue digerido con las enzimas de
restricción BamH I, Bgl II, EcoR I, Hind III, Mlu I, Mun I, Sac I,
SaL I o Xho I. Además se hizo una digestión de Asp 718, y
digestiones dobles de Asp 718 y se elaboró la lista de enzimas
recién indicada.
El southern blot indicó que el extremo 5' del
gen de la esterasa estaba presente en un fragmento de Asp718 de
aprox. 1.4 kb. El extremo 3' del gen resultó estar presente en un
fragmento Mun I - EcoR I de aprox 2 kb.
El extremo 5' y el 3' del gen fue clonado por
PCR inversa de la siguiente manera:
A partir de la secuencia dada en la SEC ID NO:
27, se designaron los cebadores de la PCR siguientes: B2998F06 (SEC
ID NO: 10), B3591G12 (SEC ID. No: 11) y B2998F07 (SEC ID NO:
12).
Para la PCR, el extremo inverso 5' de 500 ng de
pCaHj577 fue digerido con Asp718, y los fragmentos formados fueron
separados en gel de agarosa (1%). Fragmentos de aprox. 1.4 kb
fueron recuperados del gel y disueltos en un volumen total de 0.5
ml. Tampón de ligación y T4 DNA-ligasa (Roche
Molecular Biochemicals) fueron añadidos y la solución fue incubada
a 16ºC durante aprox. 18 horas. La mezcla fue concentrada por
precipitación del etanol y el producto de la ligación fue usado
como molde en una reacción de PCR usando los cebadores B2998F06 y
B3591 G12 y las condiciones de la PCR descritas en la sección
precedente. Un producto de la PCR de aprox. 1 kb fue detectado en
gel de agarosa (1%). Este fragmento fue recuperado y clonado en el
vector pCR4-TOPO. La secuenciación de uno de los
plás-
midos formados demostró que el inserto era el extremo 5' de la esterasa. Este plásmido fue denominado pCaHj578.
midos formados demostró que el inserto era el extremo 5' de la esterasa. Este plásmido fue denominado pCaHj578.
Para la PCR el extremo inverso 3' 500 ng de
pCaHj577 fue digerido con Mun I y EcoR I y los fragmentos formados
fueron separados en gel de agarosa (1%). Los fragmentos de aprox. 2
kb fueron recuperados del gel y disueltos en un volumen total de
0.5 ml. La ligación y concentración fue realizada como con el
extremo 5'. El producto de la ligación fue usado como molde en una
reacción PCR usando los cebadores B2998F06 y B2998F07. Un producto
de la PCR de aprox. 1.1 kb fue detectado en gel de agarosa (1%).
Este fragmento fue recuperado y clonado en el vector
pCR4-TOPO. La secuenciación de uno de los plásmidos
formados demostró que el inserto era el extremo 3' de la esterasa.
Este plásmido fue denominado pCaHj579.
El gen de la esterasa fue secuenciado usando los
plásmidos pCaHj571, pCaHj 577; pCaHj578 y pCaHj579 como moldes y
los cebadores siguientes:
-48 inverso (SEC ID NO: 8), -40 universal (SEC
ID NO: 9), B2998F06 (SEC ID NO: 10), B3591G12 (SEC ID NO: 11),
B2998F07 (SEC ID NO: 12), B3864E07 (SEC ID NO: 13), B3864E08 (SEC.
ID Nº: 14), B3998D09 (SEC ID NO: 15), B3998D10 (SEC ID NO: 16),
B3998D11 (SEC ID NO: 17), y B3591G11 (SEC ID NO: 18).
Todas las reacciones de la secuencia fueron
hechas usando kits de secuenciamiento BigDye^{TM} Terminator de
Perkin-Elmer Corporation (USA), y las reacciones
fueron realizadas en un secuenciador capilar ABI 3700 de
Perkin-Elmer Corporation según las instrucciones del
fabricante.
La secuencia está mostrada junto con la
traducción como la SEC ID NO: 1. Un único intrón fue predicho por
el programa informático NetGene2 (P. G. Koming et. al (1996)
Nucl. Acids. Res. 24:3439-3452).
Por el análisis de la secuencia de proteínas una
secuencia señal secretora fue predicha usando el programa
informático SignalP (H. Nielsen et al (1997) Protein Eng.
10:1-6).
Ejemplo
7
El plásmido de expresión de Aspergillus
pCaHj527 (WO 0070064) consiste en un cassette de expresión basado
en el promotor de la amilasa II de Aspergillus Niger
fusionada a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato
isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador
de amiloglicosidasa de Aspergillus Niger (Tamg). También
está presente en el plásmido el marcador selectivo amdS de
Aspergillus de Aspergillus nidulans que permite el
crecimiento en acetamida como única fuente de nitrógeno y el
marcador URA3 de Saccharomyces cerevisiae que permite el
crecimiento de la cepa DB6507 de Escherichia coli carente de
pyrF (ATCC 35673). La transformación en E. coli
DB6507 usando el gen URA 3 de S. cerevisiae como marcador
selectivo fue hecha de la siguiente manera:
E. coli DB6507 fue hecha competente por
el método de Mandel y Higa (Mandel, M. y A. Higa (1970) J. Mol.
Biol. 45, 154). Los transformantes fueron seleccionados en un medio
M9 sólido (Sambrook et. al (1989) Molecular cloning, a
laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
suplementado con 1 g/l de casaminoácidos; 500 \mug/l de tiamina y
10 mg/l de canamicina.
PCaHj527 fue modificado de la siguiente
manera:
El promotor Pna2/tpi presente en pCaHj527 fue
sometido a mutagenesis dirigida por un simple enfoque de la
PCR.
El nucleótido 134 -144 fue alterado desde la SEC
ID NO: 19 hasta la SEC ID NO: 20 usando el cebador mutagénico
141223 (SEC ID NO: 21).
El nucleótido 423 - 436 fue alterado desde la
SEC ID NO: 22 hasta la SEC ID NO: 23 usando el cebador mutagénico
141222 (SEC ID NO: 24).
El plásmido resultante fue denominado pMT
2188.
El gen de la esterasa fue clonado en pMT2188 de
la siguiente manera:
El gen de la esterasa fue amplificado por PCR a
partir de pCaHj577 usando las condiciones de la PCR descritas en el
ejemplo 6, a excepción de que sólo se usaron 20 ciclos. Los
cebadores fueron los siguientes: B6093H05 (SEC ID NO: 25) y
B6093H03 (SEC ID NO: 26).
El fragmento de la PCR formado fue digerido con
BamH I y Xho I, y el gran fragmento formado fue ligado a pMT2188
digerido con las mismas enzimas. La mezcla de ligación fue
transformada en E. coli DB6507. Se confirmó que un plásmido
de una de las colonias formadas tenía el inserto previsto por el
análisis de restricción y secuenciación del ADN. Este plásmido fue
denominado pCaHj585. Un mapa de restricción de pCaHj585 está
\hbox{mostrado en la figura 1.}
PCaHj585 fue transformado en Aspergillus
oryzae BECh2 (WO 0039322), fermentado y recuperado como se
describe en WO 95/00636.
Ejemplo
8
(2RS) (+/)
2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato
de etilo (0.5 g) fue agitado con 60 mg de la mezcla liofilizada de
la enzima hidrolítica de Aspergillus oryzae en 1 ml de
tampón de fosfato 1 M (pH=7) con cosolventes orgánicos (según la
tabla a continuación) a 27ºC. La mezcla reactiva fue vertida en 20
ml de MeOH después de 4 h para detener las reacciones enzimáticas
seguido del análisis por el método 2 de CCE quiral.
En otro experimento, (2R/S) (+/)
2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato
de etilo (5 g) fue añadido a un tampón de fosfato acuoso 0.1 M pH 7
(10 ml). 100 mg de la mezcla enzimática hidrolítica liofilizada de
Aspergillus oryzae fue añadida y la mezcla fue agitada
durante 18 horas a la temperatura ambiente. Durante este tiempo, el
pH de la mezcla reactiva fue mantenido constante a
pH=6-8 mediante la adición de NaOH. La mayor parte
del agua fue evaporada al vacío. Metanol fue añadido a la pasta
restante para detener la hidrólisis. El precipitado que se formó
fue filtrado y el metanol fue evaporado al vacío. El aceite
restante fue disuelto en agua seguido de la extracción del éster no
reaccionado con TBME (método 2 de CCE: ee_{éster} = 87%). La fase
acuosa fue acidificada hasta pH = 3 y el ácido extraído con TBME.
Después del secado con Na_{2}SO_{4} y evaporación del TBME; se
obtuvieron 1.8 g de ácido
(2S)-2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoico
como un aceite, que cristalizó en reposo (p.f. = 105ºC, método 2 de
CCE: ee_{ácido} = >99%).
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet US4587462[0002]
\bullet US5155028[0002]
\bullet JP7206756[0002]
\bullet US5516679[0004][0012]
\bullet EP238023[0018]
\bullet WO9600787[0018]
\bullet EP244234[0018]
\bullet GB2301103[0021]
\bullet WO200014234[0021]
\bullet US5955137[0021]
\bullet WO0290[0040][0040]
\bullet WO9801470[0052]
\bullet WO0070064[0067]
\bullet WO0039322[0077]
\bullet WO9500636[0077]
\bullet M. TENKANEN, Biotechnology
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19-24 [0003]
\bullet M. TENKANEN et al. J.
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69-84 [0003]
\bulletFEINBERG, A.
PVOGELSTEIN, B. Anal. Biochem., 1983, vol. 132,
6-13 [0023]
\bullet J. D. THOMPSON et al.,
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[0026]
\bulletYELTONM. M. YELTONJ. E.
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\bullet H. NIELSEN et al.,
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[0066]
\bulletMANDEL, MA. HIGA, J.
Mol. Biol., 1970, vol. 45, 154 [0068]
\bulletSAMBROOK. Molecular cloning,
a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989 [0068]
<110> Novozymes A/S
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Esterasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10141
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2346
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (572)..(911)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (572)..(628)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> (31)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es desconocido
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (971)..(2208)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (629)..()
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 161299Afr15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 161299Afr17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
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<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 161299Afr23
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 27
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B2716F09
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgccttca acatgatcaa cctsatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B2716F11
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatsagctggt ccatsagrcc gtgrta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> ()..()
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<223> -48 inverso
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> -40 universal
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttttcccag tcacgac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
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<223> B2998F06
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccgtgatt gaatagaagt gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B3591 G12
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccataatgt acaacggcca gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B2998F07
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgcagata tctcctcttt cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B3864E07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattggtgcc tccaggcacg t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 83864E08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagtgtac tggttttgca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B3998D09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatcaagac atgcaaacgt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 83998D10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggttgct ccactggtgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 83998D11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccagctctt ccggagggac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B3591G11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcaaggt gccgttcact cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pna2/tpi nucleótido
134-144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtactaaaac c
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pna2/tpi nucleótido
134-144 alterado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgttaaatt t
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 141223
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pna2/tpi 423-436
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcaattta aact
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pna2/tpi nucleótido
423-436 alterado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcaattta acgg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 141222
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B6093H05
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<400> 25
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggatcctt caccatgcct tcacttcgcc ggct
\hfill34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B6093H03
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<400> 26
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\hskip-.1em\dddseqskipatctcgagtt taaacacatt gccaggcatt
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
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<212> ADN
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<213> Aspergillus oryzae
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> ()..()
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<223> fragmento de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
Claims (13)
1. Esterasa capaz de realizar una hidrólisis
estereoselectiva de ésteres quirales y con actividad arilesterasa y
actividad feruloil esterasa y que es:
a) un polipéptido codificado por una parte
codificante de la esterasa de la secuencia de ADN clonada en un
plásmido presente en Escherichia coli con número de depósito
DSM 13977;
b) un polipéptido con una secuencia de
aminoácidos como el péptido maduro mostrado en la SEC ID NO: 2;
c) un análogo del polipéptido definido en (a) o
(b) que:
- i)
- tiene al menos el 50% de identidad con dicho polipéptido,
- ii)
- es immunológicamente reactivo con un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido en forma purificada o
- iii)
- es una variante alélica de dicho polipéptido; o
d) un polipéptido que es codificado por una
secuencia de ácidos nucléicos la cual se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC;
SDS (0.5%) con una cadena complementaria de la secuencia de ácidos
nucléicos mostrada como los nucleótidos 629-911 y
971-2208 de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de
la misma que tiene al menos 100 nucleótidos.
2. Esterasa según la reivindicación 1 que ha
sido aislada de una cepa de Aspergillus, preferiblemente
A. oryzae.
3. Polinucleótido que comprende una secuencia de
ácidos nucléicos que codifica la esterasa según la reivindicación 1
o 2.
4. Polinucleótido que comprende:
a) la parte codificante de la esterasa de la
secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia
coli DSM 13977,
b) la secuencia de ácidos nucléicos mostrada
como los nucleótidos 629-911 y
971-2208 de la SEC ID NO: 1,
c) un análogo de la secuencia definida en a) o
b) que codifica una esterasa que es capaz de realizar una
hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y con actividad
arilesterasa y actividad feruloil esterasa y que tiene al menos el
60% de identidad con dicho polinucleótido
- ii)
- se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con una cadena complementaria de dicha secuencia de ADN o una subsecuencia de la misma con al menos 100 nucleótidos,
- iii)
- es una variante alélica de la misma, o
d) una cadena complementaria de a), b) o c).
5. Constructo de ácidos nucléicos que comprende
el polinucleótido según la reivindicación 3 o 4 operativamente
enlazado a una o más secuencias de control capaces de dirigir la
expresión de la esterasa en un huésped de expresión adecuado.
6. Vector de expresión recombinante que
comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación
5, un promotor, y señales de detención transcripcional y
traduccional.
7. Célula huésped recombinante transformada con
el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 6.
8. Método para la producción de una esterasa
comprendiendo el cultivo de la célula huésped según la
reivindicación 7 bajo las condiciones propicias para producción de
la esterasa, y recuperación de la esterasa.
9. Método según la reivindicación precedente
donde la esterasa puede ser derivada del péptido maduro de la SEC
ID NO: 2 o es un derivado análogo, y la célula huésped es una cepa
transformada de A. oryzae.
10. Método para la hidrólisis estereoselectiva
de un éster quiral, comprendiendo el tratamiento del éster con la
esterasa según la reivindicación 1 o 2.
11. Método para producir un éster dicarboxílico
ópticamente activo, comprendiendo la hidrolización estereoselectiva
de una mezcla racémica del éster mediante el tratamiento con la
esterasa según la reivindicación 1 o 2, y recuperación del éster
ópticamente activo.
12. Método para producir un ácido dicarboxílico
ópticamente activo, comprendiendo la hidrolización estereoselectiva
de una mezcla racémica de un éster del ácido mediante el
tratamiento con la esterasa según la reivindicación 1 o 2, y
recuperación del ácido ópticamente activo.
13. Método de hidrolización de un feruloil éster
en ácido ferúlico y un alcohol, comprendiendo el tratamiento del
éster con la esterasa según la reivindicación 1 o 2.
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