JPH08103269A - カルボニルレダクターゼ遺伝子の塩基配列及びその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 カルボニルレダクターゼ（ＡＬＤと略す）活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
を決定し、それを利用して高いＡＬＤ生産性を有し且つ
安定なＡＬＤ産生能を持つ形質転換体を得る。 【構成】 ＡＬＤ活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡの塩基配列を決定し、次にそのコード領域をベ
クターに組み込んで組換え体ＤＮＡを得、次にその組換
え体ＤＮＡで宿主を形質転換した。ＡＬＤ産生能に優れ
た形質転換体を培養し、大量にＡＬＤを得ると共に、効
率よい（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステル
の製造法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、配列表の配列番号１に
示したアミノ酸配列を有し、カルボニルレダクターゼ
（以下、ＡＬＤと略す）活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、そのＤＮＡとベクターよりなる組換え
体ＤＮＡ、その組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた
形質転換体、及び該形質転換体を利用したＡＬＤの製造
法並びに（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステ
ルの製造法に関する。特に、（Ｒ）−γ−置換−β−ヒ
ドロキシ酪酸エステルは、医薬・農薬等の合成原料とし
て有用な化合物であり、例えば、医薬として用いられる
Ｌ−カルニチンの合成に利用可能であることが知られて
いる。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来よ
り、γ−置換アセト酢酸エステルからの（Ｒ）−γ−置
換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの合成を触媒する微生
物起源の酵素として、酵母由来のＬ−β−ヒドロキシア
シルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３５）
（特開昭５９−１１８０９３号公報）及びサーモアナエ
ロビウム・ブロキイ（Thermoanaearobium brockii ）由
来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．
２）（J.A.C.S., 107 ,4028(1985) ）が知られている。

【０００３】しかしながら、前者は反応性や温度安定性
において、又後者は嫌気培養が必要である等著しい不利
な点を有しており、これらを使用した（Ｒ）−γ−置換
−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法は実用的とは言
い難かった。このような点を解決するものとして、本発
明者らは、自然界及び保存菌株を広く検索した結果スポ
ロボロマイセス(Sporobolomyces)属由来の還元型ニコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸（ＮＡＤ
ＰＨ）依存性カルボニルレダクターゼ（ＡＬＤ）を見出
すと共に（特開昭６３−３０４９７９号）、その酵素を
使用すればγ−置換アセト酢酸エステルから選択的に
（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを製造
することが出来ることを見出した（特開昭６３−３０４
９９１号）。

【０００４】このようなＡＬＤを使用して（Ｒ）−γ−
置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを効率よく製造する
ためには、大量のＡＬＤを安価に取得することが必要で
あった。従来この酵素を大量に効率よく得るために、高
生産菌株を土壌などから得る試みが広範囲になされた
り、あるいは既存の生産株の人工突然変異によって育種
改良することがなされてきたが、満足のいく結果は得ら
れていなかった。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】このような状況のもと
で、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、微生物より
ＡＬＤ産生に関与する遺伝子を遺伝子組換えの手法で取
得し、その遺伝子の塩基配列を決定した。本発明者らは
更に研究を進めた結果、ＡＬＤをコードするＤＮＡは、
遺伝子発現制御配列との組み合わせが比較的簡単になし
得ること、その発現の制御が容易化しうること、さらに
は高ＡＬＤ産生形質転換体の育種に使用できるなどの優
れた利点を有すると共に、そのうちの塩基配列を公知の
手法で置換あるいは欠失あるいは付加することが容易に
なるなどのことを見いだして本発明を完成した。

【０００６】即ち、本発明は、（１）配列表の配列番号
１に示したアミノ酸配列を有し、ＡＬＤ活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子ＤＮＡ、（２）上記
（１）のＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体Ｄ
ＮＡ、（３）上記（２）の組換え体ＤＮＡで形質転換せ
しめられた形質転換体、（４）上記（３）の形質転換体
を培養し、次に得られたＡＬＤを採取することを特徴と
するＡＬＤの製造法、及び（５）上記（３）の形質転換
体又はその処理物を、γ−置換アセト酢酸エステルと反
応せしめ、生成した（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ
酪酸エステルを採取することを特徴とする（Ｒ）−γ−
置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法に関する。
本発明は、また、上記（１）のＤＮＡを用いた高発現性
の組換え体ＤＮＡ並びにその製造法、及び上記（１）の
ＤＮＡを用いたＡＬＤ高産生形質転換体の育種法をも提
供する。

【０００７】以下、更に詳細に本発明を説明する。 （１）ＡＬＤ合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡの単
離 本発明の配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有
し、ＡＬＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ（以下、単にＡＬＤ遺伝子とも言う）は、ＡＬＤの合
成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡから製造することが
できる。

【０００８】このＡＬＤの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡとしては、例えばスポロボロマイセス(Sporobo
lomyces)属酵母から得られたものが挙げられる。このス
ポロボロマイセス属酵母としてはＡＬＤ産生スポロボロ
マイセス属酵母であれば特に限定されないが、特に好ま
しいものとしてはスポロボロマイセス・サルモニカラー
(Sporobolomyces salmonicolor) ＩＦＯ１０３８をあげ
ることができる。遺伝子供与体からのＡＬＤ遺伝子を持
つＤＮＡ断片の取得は通常の方法を用いて行うことがで
きる。例えば、常法により作成した遺伝子供与体の染色
体ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーか
ら、精製ＡＲＤの部分アミノ酸配列をもとに合成したＤ
ＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法で目的
の断片を得ることが可能である。

【０００９】また、このＤＮＡは、それが一旦単離取得
されたならば、慣用方法に従ってそのＤＮＡ中の塩基配
列の大部分あるいは一部分を利用して、それをプローブ
として用いて、他の生物を検索して、その生物の保有す
る遺伝子のうちに、ＡＬＤの合成に関与する遺伝情報を
担うものを見つけ出し、次にそのようにして同定された
遺伝子を遺伝子組換え技術の手法を応用して切り出し
て、それを大量に得、それをこのスポロボロマイセス属
酵母に由来するものと同様に用いることは、当業者であ
れば容易に理解し得るところのものである。

【００１０】従って、本発明のＡＬＤの合成に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、スポロボロマイセス
属酵母のみでなく、上記したような手法の適用できる微
生物であってＡＬＤをコードする遺伝子を有するものが
あげられる。この他にも、ＡＬＤ遺伝子を有するもので
あれば、動物、植物、下等生物、高等生物の区別なく利
用することが可能である。

【００１１】（２）ＡＬＤ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
の塩基配列の決定 ＡＬＤ遺伝子を持つＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定
法としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法、ジデオキ
シ・シークエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネ
ーション法等があげられる。このような方法の内には、
適当な制限酵素を作用させ、制限酵素地図を作製した上
で、必要な断片をサブクローン化する方法や、ショット
ガン・クローニング法、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する
方法、核酸分解酵素によりディリーションする方法など
の様々な手法が含まれていることはもちろんである。

【００１２】上記のようにして構造解析されたＤＮＡ
に、ＡＬＤの合成に関与する遺伝子以外の領域が保有さ
れている場合、様々な方法でＡＬＤの合成に不必要な領
域を欠失させることができる。このような方法として
は、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼIII
による欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組換え法
などがあげられる。この際、遺伝子の固有のプロモータ
ーを他のものに変更したり、部位特異的変異を導入して
プロモーターの強度を変化させることは、現在の遺伝子
操作技術では、容易に行いうることであり、従って、そ
のように一部を変更したＤＮＡ断片であっても、ＡＬＤ
活性を示すポリペプチドの産生を担う遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片であれば、全て本発明に含まれることは明白であ
る。

【００１３】一旦、遺伝子の塩基配列が明らかになれ
ば、その機能を損なわない範囲でその塩基の置換を行う
ことは、当該分野において知られた方法を適用して容易
に行うことができる。例えば、相当するアミノ酸をコー
ドする遺伝暗号の縮重を利用したもの、生物の遺伝暗号
の利用率を考慮した変換あるいはＡＬＤの機能に悪影響
を及ぼさないようなアミノ酸配列の変換のための塩基の
置換、付加または欠失処理などがあげられる。更にま
た、このような改変のうちには、ＡＬＤの活性中心のみ
を保存し、その他の部分を大幅に変化させるようにその
ＤＮＡの配列及び長さをかえることも含まれる。

【００１４】従って、本発明のＡＬＤの合成に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡとしては、以上のような改変を施
したものすべてが含まれることは当業者であれば容易に
理解し得るところのものである。以上のような事情に鑑
み、本発明のＡＬＤの合成に関与するＤＮＡは、本発明
の思想を実質的に利用して得られ、本発明のＤＮＡと実
質的に同一の機能を有するものすべてを含有するもので
ある。

【００１５】（３）ＡＬＤ遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡ
の作製 ＡＬＤの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを含む断
片から、適当な手段を施してＤＮＡ合成に不必要な領域
を欠失させたＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに再び組み
込むことにより、宿主細胞に再び導入することが出来
る。本発明の上記ＡＬＤの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡを宿主細胞に導入し、そしてそれをその導入さ
れた宿主細胞内で発現させるために用いられるベクター
ＤＮＡとしては、適当な宿主細胞内で、ＡＬＤ遺伝子を
発現できるものであれば特に制限なく使用し得る。

【００１６】このようなベクターＤＮＡとしては、上記
ＡＬＤの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込
むことの出来るものであり、組換えたベクターＤＮＡで
宿主細胞を形質転換できるものであり、そして得られた
形質転換体の細胞内で導入されたＡＬＤの合成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡの発現ができるものであれば特
に限定されず、如何なるものも使用することが出来る。
このようなベクターＤＮＡとしては、宿主細胞中で自律
複製可能であり、さらに組換え宿主細胞のみを選別でき
るような適当な選択マーカーなどが付与されたものがあ
げられる。さらにまた、このようなベクターＤＮＡは公
知のベクターＤＮＡ等から当業者が容易に製造し得るよ
うなものであってもよい。

【００１７】このようなベクターＤＮＡとしては、例え
ばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベ
クターから選ばれたものがあげられる。また、他の宿主
株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであっ
てもよいし、ランナウェイベクターやスリーパーベクタ
ーなどの遺伝子産物の発現効率を向上せしめるために特
別に工夫されたものであってもよい。さらに、このよう
なベクターＤＮＡは、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒ
ｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモー
ター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、
ＰL プロモーター等の制御因子を適宜付与されたもので
あってもよい。

【００１８】上記ベクターＤＮＡに、上記ＡＬＤの合成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込むには、ま
ず、上記ベクターＤＮＡに適当な制限酵素を作用させ、
得られたベクターＤＮＡ断片を、上記ＡＬＤの合成に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とを混合し、これにＤ
ＮＡリガーゼを作用させることによりなしうる。この
際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラ
ントエンド化等の処理を加えることもできる。このよう
にして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当な宿主細胞の
中に導入される。

【００１９】（４）組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入 上記のようにして作製した組換え体ＤＮＡを導入するた
めの宿主細胞としては、上で得られた組換えベクターで
もって形質転換されて、ＡＬＤ遺伝子を発現させること
ができるようなものであれば、特に制限なく使用するこ
とが出来る。このような宿主細胞としては、本発明の目
的に沿ってＡＬＤ遺伝子の発現を達成し得る限り、グラ
ム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、
下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞で
あろうと植物由来細胞であろうと使用できる。

【００２０】ここで使用することのできる宿主細胞とし
ては、本発明のＡＬＤの合成に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡの発現が達成され得るものがあげられ、このよう
な宿主細胞としては、大腸菌、キサントモナス属細菌、
アセトバクター属細菌、シュードモナス属細菌、グルコ
ノバクター属細菌、アゾトバクター属細菌、リゾビウム
属細菌、アルカリゲネス属細菌、クレブシエラ属細菌、
サルモネラ属細菌及びセラチア属細菌から選ばれたもの
があげられる。

【００２１】ここで使用することの好ましい宿主細胞と
しては、例えば大腸菌があげられる。上記組換え体ＤＮ
Ａを用いて上記宿主細胞を形質転換などをするにあたっ
ては、ＤＮＡ組換技術において広く知られた方法を適用
して行うことができる。このような方法としては、宿主
細胞をコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）状態にして
形質転換用緩衝液中で組換え体ＤＮＡと混合するとか、
ヘルパー・プラスミドを用いて接合伝達により移入する
などの方法があげられる。

【００２２】（５）組換え体によるＡＬＤの製造 本発明により得られたＡＬＤ産生形質転換体は、それを
栄養培地中で培養して得た培養物をそのまま、あるいは
培養物中からＡＬＤを単離して、（Ｒ）−γ−置換−β
−ヒドロキシ酪酸エステルあるいはその誘導体の合成に
用いることができる。

【００２３】ＡＬＤ産生形質転換体は、適当な栄養培地
中で培養することにより、それを大量に得ることができ
る。培養に用いられる培地は微生物の生育に必要な炭素
源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地である。更
に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、好気的
条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の任意の範囲
に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。形質転換体
を用いる場合、使用する菌株に応じて、アンピシリン、
クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加して
もよいし、イソプロピルβ-D(-)-チオガラクトピラノシ
ド〔Isopropyl β-D(-)-Thiogalactopyranoside （ＩＰ
ＴＧ）〕等の誘導剤を用いることもできる。

【００２４】大量に培養して得たＡＬＤ産生形質転換体
の細胞あるいはその培養液よりのＡＬＤの単離精製にあ
たっては、特公昭６３−３０４９９１号に記載の方法と
類似の方法が使用できるほか、その産生量が非常に高い
ことからより簡便な方法が利用できる。このような方法
を行うには、まず、生物体を機械的方法、酵素処理方
法、自己溶解法、超音波処理法などの方法によって破壊
し、粗抽出液を得、ついでこれを硫酸アンモニウム、リ
ン酸ナトリウムなどの塩析剤あるいはアセトン又はエタ
ノールなどの溶媒による蛋白質沈澱法、電気泳動法、ゲ
ル濾過法あるいは分子ふるいクロマトグラフィー法、限
外濾過法、逆相クロマトグラフィ−法、高速液体クロマ
トグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、ア
フィニティクロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフ
ィー法、などの方法を単独あるいは適宜組み合わせて用
いて精製することにより行うことが出来る。

【００２５】（６）（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ
酪酸エステルの製造 こうして得られた組換えＡＬＤは特開昭６３−３０４９
９１号や特開昭６３−３０９１９５号に記載されたよう
にしてγ−置換アセト酢酸エステルから（Ｒ）−γ−置
換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを製造する際に、従来
自然界に見出されている非組換え微生物のＡＬＤと同様
にして用いることができるが、本発明によれば大量かつ
高純度でそのＡＬＤを製造しうるものであることから、
目的（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを
より良好に製造し得る。

【００２６】また、従来自然界に見出されているＡＬＤ
生産性微生物では、γ−置換アセト酢酸エステルから
（Ｓ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを合成
する活性（以下、Ｓ−活性と略す）も同時に存在してい
るために、γ−置換アセト酢酸エステルから（Ｒ）−γ
−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを製造しようとす
る場合、（Ｓ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステ
ルの副生を避けるためにＳ−活性を分離するか、選択的
に不活性化させることが必要であった。本発明の組換え
微生物では、ＡＬＤのみを大量に製造することが出来る
ので、（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステル
を製造する際に、宿主の産生するＳ−活性を除去すると
いう繁雑な操作を省くことが出来る。

【００２７】この方法で用いられるγ−置換アセト酢酸
エステルは、γ位置換基としては、クロル、ブロム、フ
ルオロ、アジド基などであることが好ましく、エステル
基としては炭素数１〜１０のアルキル基であることが好
ましい。本方法で使用される酵素は、酵素活性を発揮し
得る形態であればよく、必ずしも単離されたものに限定
されない。また該酵素は、半精製品でもよく粗抽出液、
さらには培養物、生物体、凍結乾燥生物体、アセトン乾
燥生物体、あるいはそれら生物体の磨砕物等であっても
よい。さらにそれは、酵素自体あるいは生物体のまま公
知の手段で固定化されて用いられてもよい。

【００２８】また、反応温度は１０〜７０℃、好ましく
は２０〜５０℃である。反応時のｐＨは４〜１０、好ま
しくは６〜８に維持する。本反応はバッチ方式で行って
もよく、連続方式で行ってもよい。特開昭６３−３０９
１９５号に記載されているように、本反応を酢酸エチル
等の水と二相を形成しうる有機溶媒と水性媒体からなる
二相系で行うことにより、水性溶媒単独系に比べて高収
率、高純度かつ高濃度の（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロ
キシ酪酸エステルを得ることができる。

【００２９】また、本酵素は補酵素としてＮＡＤＰＨを
要求するため反応液に添加する必要があるが、一般的に
用いられるＮＡＤＰＨ再生系を用いることにより高価な
補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。代表
的なＮＡＤＰＨ再生系としては、グルコースデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＤＨ）、ＧＤＨの基質であるグルコース、お
よびＮＡＤＰ⁺ の添加による方法が挙げられるが、これ
に限らず本反応に好適に利用することができる。

【００３０】更に、本反応は任意の時間だけ反応を行わ
せることによってなしうるが、好適には１〜５０時間、
より好ましくは５〜３０時間反応を行うのがよい。反応
液からの（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステ
ルの精製は常法によって行うことができる。例えば、遠
心分離、濾過などの処理を施して懸濁物等を除去した
後、エーテル、四塩化炭素、ベンゼン、酢酸エチル等の
有機溶媒で抽出し、硫酸ナトリウム等の脱水剤で脱水
後、有機溶媒を減圧下で除去し、必要に応じ更に減圧蒸
留またはクロマト分離等の処理により純度の高い（Ｒ）
−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルが高収率で得
られる。

【００３１】本方法で使用される酵素は、天然のＡＬＤ
のペプチド配列と一致するもののみに限定されず、遺伝
子変換及び遺伝子組換えの手法で得られるＡＬＤ活性を
示すものを言うものと解すべきである。従って、本方法
で使用できる組換えＡＬＤは、天然のＡＬＤのペプチド
配列中のアミノ酸の欠損したもの、あるいはそのペプチ
ド配列中のアミノ酸が他のアミノ酸で置き換えられたも
のをも包含する。

【００３２】以上のように、本発明に従えば、大量のＡ
ＬＤ生産が可能であり、またその生産されたＡＬＤの単
離精製も容易となり、高純度のＡＬＤが得られる。こう
して得られたＡＬＤを利用することにより、（Ｒ）−γ
−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの優れた製造法が
提供される。以下、実施例で本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらにより限定されるものではない。

【００３３】

【実施例】

実施例１ ＡＬＤ遺伝子の塩基配列の決定（ｃＤＮＡ） ｃＤＮＡライブラリーの作成 スポロボロマイセス・サルモニカラーＩＦＯ１０３８の
培養菌体から常法に従ってｍＲＮＡを抽出した。得られ
たｍＲＮＡからGublerらの方法（Gene, 25,263(1983)）
を用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成した。得られた二本鎖
ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩリンカーＤＮＡを付加
後、常法によりＵｎｉ- ＺＡＰ^TMＸＲファージベクター
（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ部位に挿入
した。得られた組換えファージベクターを、常法により
試験管内パッケージングした後、大腸菌ＳＵＲＥ^TM（St
ratagene社製）の形質転換を行い、約２万個からなるｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した。

【００３４】合成オリゴヌクレオチドプローブの作成 文献（FEMS Microbiol.Lett., 70,45-48(1990)）記載の
方法を用いてスポロボロマイセス・サルモニカラーＩＦ
Ｏ１０３８よりＡＬＤを単一に精製した。この精製ＡＬ
Ｄをリジルエンドペプチダーゼを用いて消化し、得られ
たペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。これらの配
列と既知のアルデヒドレダクターゼのアミノ酸配列との
比較により、本酵素のＮ末端側とＣ末端側にそれぞれ位
置すると思われるペプチド断片を特定し、そのアミノ酸
配列をもとに、図１に示すプローブを合成した。プロー
ブ１及び２は、常法に従ってカイネーションにより³²Ｐ
ラベルして、以下の実験に用いた。

【００３５】ｃＤＮＡライブラリーからのＡＬＤ遺伝子
のクローニング 作成したｃＤＮＡライブラリーから、³²Ｐ標識合成ＤＮ
Ａプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションに
より、ＡＬＤ遺伝子を含むファージのプラークのスクリ
ーニングを行った。プラークハイブリダイゼーション
は、Maniatisらの方法（Molecular Cloning,p326(1982)
Cold Spring Harbor Laboratory ）に従って行った。³²
Ｐで標識したプローブ１を用いたハイブリダイゼーショ
ンの結果、５個のポジティブプラークが得られた。次
に、Ｕｎｉ- ＺＡＰ^TMＸＲベクターキット（Stratagene
社製）の使用説明書に従って、上記の５個のポジティブ
プラークから得た組換え体ファージとヘルパーファージ
を宿主大腸菌に共感染させ、ＡＬＤ遺伝子と考えられる
ｃＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に
サブクローニングした。得られた組換え体プラスミドに
ついて種々の制限酵素による解析を行い、最も短いＤＮ
Ａ断片が挿入されていたプラスミドｐＳＡＬ２をＡＬＤ
遺伝子を含むｃＤＮＡクローンとして選択した。ｐＳＡ
Ｌ２の作製法及び構造を図２に示す。

【００３６】塩基配列の決定 この組換えプラスミドｐＳＡＬ２を用いて、Ｍ１３ｍｐ
１８、１９に導入できる種々の制限酵素による解析を行
い、制限酵素切断地図を作成した。次に、この解析の際
に得られた各種ＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１８ＲＦあるい
はＭ１３ｍｐ１９ＲＦ（共に宝酒造株式会社製）のマル
チクローニングサイトに導入することにより、組換え体
ファージを得た。これらのファージを用いて、常法に従
って、一本鎖組換え体ファージを調製し、それぞれの挿
入断片の塩基配列分析をＤｉｄｅｏｘｙ法により行い、
塩基配列を決定した。この配列を配列表の配列番号１に
示す。また、この塩基配列中の構造遺伝子部分を、配列
表の配列番号２に示す。この塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列を精製ＡＬＤのリジルエンドペプチダーゼ消
化ペプチド断片の部分アミノ酸配列と比較した結果を、
図３〜図５に示す。精製ＡＬＤの部分アミノ酸配列は、
塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、その
部分で完全に一致した（図３〜図５のアンダーライン部
分）。

【００３７】実施例２ 組換えプラスミドの作製 大腸菌においてＡＬＤを発現させるために、形質転換に
用いる組換えプラスミドを作製した。まず、ＡＬＤの構
造遺伝子の開始コドンの上流にＳＤ配列を付加したｃＤ
ＮＡを以下の方法により取得した。実施例１で決定され
た塩基配列を基に、ＡＬＤの構造遺伝子の開始コドンの
上流にＳＤ配列を付加したＮ末端側プライマー（ＰＮ）
とＣ末端側プライマー（ＰＣ）を合成した。これら２つ
のプライマーの塩基配列を図６に示す。実施例１で得た
ｍＲＮＡから、Maniatisらの方法（MolecularCloning,p
14.20(1989)Cold Spring Harbor Laboratory ）を用い
てｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡの合成にはＰＣ
をプライマーとして用い、ＰＣＲによる二本鎖ｃＤＮＡ
の合成にはＰＮとＰＣをプライマーとして用いた。得ら
れたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、プラ
スミドｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）のｌａｃプロ
モーターの下流のＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ部位に挿入する
ことにより、組換えプラスミドｐＡＲを得た。ｐＡＲの
作製法及び構造を図７に示す。

【００３８】実施例３ 組換え大腸菌の作製 常法により、実施例３で得た組換えプラスミドｐＡＲ
と、実施例１で得た組換えプラスミドｐＳＡＬ２を用い
て大腸菌ＪＭ１０９（Stratagene社製）の形質転換を行
い、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＡＲ）及びＪＭ１０９
（ｐＳＡＬ２）を得た。こうして得られた形質転換体で
ある大腸菌ＪＭ１０９（ｐＡＲ）及び大腸菌ＪＭ１０９
（ｐＳＡＬ２）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４５５８及びＦＥＲＭ Ｐ−１４５５９として工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【００３９】実施例４ 組換え大腸菌におけるＡＬＤの発現 組換え大腸菌のＡＬＤ活性の測定 実施例３で得た形質転換体をＬＢ培地で培養し、Isopro
pyl β-D(-)-Thiogalactopyranoside （ＩＰＴＧ）によ
る誘導後、集菌し、超音波破砕により無細胞抽出液を得
た。この無細胞抽出液のＡＬＤ活性を、基質としてｐ−
ニトロベンズアルデヒドを用いてＮＡＤＰＨの減少をモ
ニターすることにより測定した（１Ｕは１分間あたりに
１μモルのＮＡＤＰＨを酸化する酵素活性を表す）。結
果を比活性として、ベクタープラスミドのみの形質転換
体と比較して表１に示す。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＡＲ）
をＩＰＴＧで誘導したものは、ＩＰＴＧマイナスと比較
して約３．２倍、ベクターの形質転換体であるＪＭ１０
９（ｐＵＣ１１８）と比較して約７．７倍の活性が得ら
れた。また、ＪＭ１０９（ｐＳＡＬ２）でもベクターの
形質転換体と比較して約２．１倍の活性が得られた。

【００４０】

【表１】

【００４１】免疫学的同等性の確認 上記の発現実験で得られた無細胞抽出液及びスポロボロ
マイセス・サルモニカラーＩＦＯ１０３８から精製した
ＡＬＤのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、
スポロボロマイセス・サルモニカラーＩＦＯ１０３８か
ら精製したＡＬＤを用いて作製した抗ＡＬＤ抗体を用い
てウエスタン・ブロッティングを行った結果と、電気泳
動ゲルのクマシーブルー染色の結果から、図８に示すと
おり、ＩＰＴＧで誘導されている３５ＫＤａ付近のタン
パク質が、スポロボロマイセス・サルモニカラーＩＦＯ
１０３８由来のＡＬＤと免疫学的に等しいものであるこ
とが確認された。また、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＡ
Ｒ）から精製したＡＬＤとスポロボロマイセス・サルモ
ニカラーＩＦＯ１０３８から精製したＡＬＤの免疫学的
同等性を、スポロボロマイセス・サルモニカラーＩＦＯ
１０３８から精製したＡＬＤを用いて作製した抗ＡＬＤ
抗体を用いたオクタロニー二重拡散法により調べたとこ
ろ、両酵素の免疫沈降線は完全にフューズし、その同等
性が確認できた。

【００４２】種々の基質に対する比活性の測定 組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＡＲ）から精製したＡＬＤ
とスポロボロマイセス・サルモニカラーＩＦＯ１０３８
から精製したＡＬＤを用いて、３種の基質に対する活性
比（ｐ−ニトロベンズアルデヒドに対する活性を１００
％とした）を測定した結果を表２に示す。なお、活性測
定はＮＡＤＰＨの減少をモニターすることにより測定し
た。両酵素とも、３種の基質に作用し、その活性比はほ
ぼ等しいことが判明した。

【００４３】

【表２】

【００４４】実施例５ 組換え大腸菌によるγ−置換アセト酢酸エステルからの
（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの合成 実施例３で得た組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＡＲ）を３
リットルのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養し、Ｉ
ＰＴＧで酵素を誘導した後、集菌した。この菌体を０．
９％食塩水で洗浄して得られた湿菌体を以下の反応に用
いた。酵素反応は、２００ｍｌ容の培養器を用い、温度
は３０℃、撹拌は２００ｒｐｍ、ｐＨはＮａＨＣＯ
₃ （２Ｍ）の自動添加により６．０に調整しながら行っ
た。反応開始時の反応液組成を表３に示す。

【００４５】

【表３】 反応開始後、γ−クロルアセト酢酸エチルエステルの添
加を行ったが、その添加時期と添加濃度を表４に示す。

【００４６】

【表４】 また、反応開始後１０時間、２５時間、３４時間及び５
１時間に、グルコースを１００ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤＰ⁺
を０．６ｍｇ／ｍｌ、ＧＤＨを０．４ｍｇ／ｍｌ（すべ
て水相量当たり）ずつ添加した。

【００４７】反応の経時変化を図９に示す。基質である
γ−クロロアセト酢酸エチルエステルと生成物であるγ
−クロロ−β−ヒドロキシ酪酸エチルエステルの酢酸ブ
チル相における濃度は、サンプリングした酢酸ブチル相
を無水硫酸ナトリウムで脱水後、ガスクロマトグラフィ
ー（島津ＧＣ−９ＡＰＦ，ＰＥＧ２０Ｍ×１ｍ，１５０
℃，Ｎ₂ ３０ｍｌ／分）で分析した。反応終了時（７２
時間）において、添加したγ−クロロアセト酢酸エチル
エステルの９６．３％が消費され、その７９．６％がγ
−クロロ−β−ヒドロキシ酪酸エチルエステルに変換さ
れていた。反応開始後７２時間の反応液から遠心で分離
した酢酸ブチル相を、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減
圧蒸留し、ガスクロマトグラフィー（上記条件）、ＩＲ
（島津製作所製ＩＲ−４３５）、ＮＭＲ（日本電子社製
ＰＭＸ６０ＳＩ）で分析したところ、γ−クロロ−β−
ヒドロキシ酪酸エチルエステルであることを確認した。

【００４８】こうして得られたγ−クロロ−β−ヒドロ
キシ酪酸エチルエステルの光学純度は、（＋）−α−メ
トキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸とのエス
テルを合成しジアステレオマー化合物とした後、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離定量する
ことにより算出した。その結果、（Ｒ）−体で、光学純
度はe.e.＝９９％以上であった。 ＨＰＬＣ条件 カラム：Ｐａｒｔｉｓｉｌ ５（４．６φ×２５０ｍ
ｍ，ワットマン社製） 移動相：ヘキサン／テトラハイドロフラン／メタノール
＝６００／１００／１ 流 速：２ｍｌ／分 検 出：２１７ｎｍにおける吸光度

【００４９】

【発明の効果】微生物からのＡＬＤ産生遺伝子のクロー
ニング及びその塩基配列の解析により、高いＡＬＤ産生
能を有する形質転換体を得ることが可能となった。ま
た、この形質転換体を用いることにより、γ−置換アセ
ト酢酸エステルからの（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキ
シ酪酸エステルの合成を効率よく行うことが可能となっ
た。

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：1055 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：スホ゜ロホ゛ロマイセス サルモニカラー(Sporobolomyces salmoni
color) 株名：IFO1038 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：33..1001 特徴を決定した方法：E 配列 GCCAACAACC CCTGCACGCA TCACACATC ATG GTC GGC ACT ACT ACC CTC AAC 53 Met Val Gly Thr Thr Thr Leu Asn 1 5 ACT GGC GCT TCC CTC GAG CTC GTC GGC TAC GGC ACG TGG CAG GCA GCA 101 Thr Gly Ala Ser Leu Glu Leu Val Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Ala 10 15 20 CCG GGC GAG GTG GGC CAG GGC GTC AAG GTC GCC ATC GAG ACT GGA TAC 149 Pro Gly Glu Val Gly Gln Gly Val Lys Val Ala Ile Glu Thr Gly Tyr 25 30 35 CGT CAC CTC GAC CTT GCC AAG GTC TAC TCG AAC CAA CCT GAG GTT GGT 197 Arg His Leu Asp Leu Ala Lys Val Tyr Ser Asn Gln Pro Glu Val Gly 40 45 50 55 GCC GCC ATC AAG GAG GCT GGC GTC AAG CGC GAG GAC CTC TTC ATC ACC 245 Ala Ala Ile Lys Glu Ala Gly Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr 60 65 70 TCG AAG CTC TGG AAC AAC TCG CAC CGC CCG GAG CAG GTC GAG CCT GCC 293 Ser Lys Leu Trp Asn Asn Ser His Arg Pro Glu Gln Val Glu Pro Ala 75 80 85 CTT GAC GAC ACC CTC AAG GAG CTC GGC CTC GAG TAC CTC GAC CTT TAC 341 Leu Asp Asp Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Tyr 90 95 100 CTC ATT CAC TGG CCC GTC GCG TTC CCG CCC GAG GGC GAC ATC ACC CAG 389 Leu Ile His Trp Pro Val Ala Phe Pro Pro Glu Gly Asp Ile Thr Gln 105 110 115 AAC CTC TTC CCG AAG GCC AAC GAC AAG GAG GTC AAG CTC GAC CTG GAG 437 Asn Leu Phe Pro Lys Ala Asn Asp Lys Glu Val Lys Leu Asp Leu Glu 120 125 130 135 GTC AGC CTC GTC GAC ACG TGG AAG GCG ATG GTC AAG CTT CTC GAC ACT 485 Val Ser Leu Val Asp Thr Trp Lys Ala Met Val Lys Leu Leu Asp Thr 140 145 150 GGC AAG GTC AAG GCG ATC GGC GTT TCC AAC TTC GAC GCG AAG ATG GTC 533 Gly Lys Val Lys Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe Asp Ala Lys Met Val 155 160 165 GAC GCC ATC ATC GAG GCT ACC GGC GTG ACC CCC TCC GTC AAC CAG ATC 581 Asp Ala Ile Ile Glu Ala Thr Gly Val Thr Pro Ser Val Asn Gln Ile 170 175 180 GAG CGT CAC CCT CTC CTT CTC CAG CCC GAG CTC ATC GCC CAC CAC AAG 629 Glu Arg His Pro Leu Leu Leu Gln Pro Glu Leu Ile Ala His His Lys 185 190 195 GCC AAG AAC ATT CAC ATT ACC GCA TAC TCT CCT CTC GGT AAC AAC ACC 677 Ala Lys Asn Ile His Ile Thr Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Thr 200 205 210 215 GTC GGC GCG CCT CTT CTT GTC CAG CAC CCG GAG ATC AAG CGC ATC GCC 725 Val Gly Ala Pro Leu Leu Val Gln His Pro Glu Ile Lys Arg Ile Ala 220 225 230 GAG AAG AAC GGC TGC ACG CCC GCT CAG GTC CTC ATT GCC TGG GCC ATC 773 Glu Lys Asn Gly Cys Thr Pro Ala Gln Val Leu Ile Ala Trp Ala Ile 235 240 245 GTT GGC GGC CAC TCG GTT ATC CCC AAG TCG GTC ACC CCC TCC CGC ATT 821 Val Gly Gly His Ser Val Ile Pro Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile 250 255 260 GGC GAG AAC TTC AAG CAG GTC TCG CTC TCG CAG GAG GAC GTC GAT GCC 869 Gly Glu Asn Phe Lys Gln Val Ser Leu Ser Gln Glu Asp Val Asp Ala 265 270 275 GTC AGC AAG CTC GGC GAG GGT TCG GGC CGC AGG CGC TAC AAC ATC CCC 917 Val Ser Lys Leu Gly Glu Gly Ser Gly Arg Arg Arg Tyr Asn Ile Pro 280 285 290 295 TGC ACG TAC TCG CCC AAG TGG GAC ATC AAC GTC TTT GGC GAG GAG GAC 965 Cys Thr Tyr Ser Pro Lys Trp Asp Ile Asn Val Phe Gly Glu Glu Asp 300 305 310 GAG AAG TCG TGC AAG AAC GCC GTG AAG ATC AAG TAGAAGGTCT 1008 Glu Lys Ser Cys Lys Asn Ala Val Lys Ile Lys 315 320 CGGGTCCCGG GTACTCTGTT AAAAGCAATC CCAATCAGTT CGGGGCG 1055 配列番号：2 配列の長さ：972 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：スホ゜ロホ゛ロマイセス サルモニカラー(Sporobolomyces salmoni
color) 株名：IFO1038 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：4..972 特徴を決定した方法：E 配列 ATG GTC GGC ACT ACT ACC CTC AAC ACT GGC GCT TCC CTC GAG CTC GTC 48 Met Val Gly Thr Thr Thr Leu Asn Thr Gly Ala Ser Leu Glu Leu Val 1 5 10 15 GGC TAC GGC ACG TGG CAG GCA GCA CCG GGC GAG GTG GGC CAG GGC GTC 96 Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Ala Pro Gly Glu Val Gly Gln Gly Val 20 25 30 AAG GTC GCC ATC GAG ACT GGA TAC CGT CAC CTC GAC CTT GCC AAG GTC 144 Lys Val Ala Ile Glu Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala Lys Val 35 40 45 TAC TCG AAC CAA CCT GAG GTT GGT GCC GCC ATC AAG GAG GCT GGC GTC 192 Tyr Ser Asn Gln Pro Glu Val Gly Ala Ala Ile Lys Glu Ala Gly Val 50 55 60 AAG CGC GAG GAC CTC TTC ATC ACC TCG AAG CTC TGG AAC AAC TCG CAC 240 Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp Asn Asn Ser His 65 70 75 CGC CCG GAG CAG GTC GAG CCT GCC CTT GAC GAC ACC CTC AAG GAG CTC 288 Arg Pro Glu Gln Val Glu Pro Ala Leu Asp Asp Thr Leu Lys Glu Leu 80 85 90 95 GGC CTC GAG TAC CTC GAC CTT TAC CTC ATT CAC TGG CCC GTC GCG TTC 336 Gly Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Val Ala Phe 100 105 110 CCG CCC GAG GGC GAC ATC ACC CAG AAC CTC TTC CCG AAG GCC AAC GAC 384 Pro Pro Glu Gly Asp Ile Thr Gln Asn Leu Phe Pro Lys Ala Asn Asp 115 120 125 AAG GAG GTC AAG CTC GAC CTG GAG GTC AGC CTC GTC GAC ACG TGG AAG 432 Lys Glu Val Lys Leu Asp Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Thr Trp Lys 130 135 140 GCG ATG GTC AAG CTT CTC GAC ACT GGC AAG GTC AAG GCG ATC GGC GTT 480 Ala Met Val Lys Leu Leu Asp Thr Gly Lys Val Lys Ala Ile Gly Val 145 150 155 TCC AAC TTC GAC GCG AAG ATG GTC GAC GCC ATC ATC GAG GCT ACC GGC 528 Ser Asn Phe Asp Ala Lys Met Val Asp Ala Ile Ile Glu Ala Thr Gly 160 165 170 175 GTG ACC CCC TCC GTC AAC CAG ATC GAG CGT CAC CCT CTC CTT CTC CAG 576 Val Thr Pro Ser Val Asn Gln Ile Glu Arg His Pro Leu Leu Leu Gln 180 185 190 CCC GAG CTC ATC GCC CAC CAC AAG GCC AAG AAC ATT CAC ATT ACC GCA 624 Pro Glu Leu Ile Ala His His Lys Ala Lys Asn Ile His Ile Thr Ala 195 200 205 TAC TCT CCT CTC GGT AAC AAC ACC GTC GGC GCG CCT CTT CTT GTC CAG 672 Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Thr Val Gly Ala Pro Leu Leu Val Gln 210 215 220 CAC CCG GAG ATC AAG CGC ATC GCC GAG AAG AAC GGC TGC ACG CCC GCT 720 His Pro Glu Ile Lys Arg Ile Ala Glu Lys Asn Gly Cys Thr Pro Ala 225 230 235 CAG GTC CTC ATT GCC TGG GCC ATC GTT GGC GGC CAC TCG GTT ATC CCC 768 Gln Val Leu Ile Ala Trp Ala Ile Val Gly Gly His Ser Val Ile Pro 240 245 250 255 AAG TCG GTC ACC CCC TCC CGC ATT GGC GAG AAC TTC AAG CAG GTC TCG 816 Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Gly Glu Asn Phe Lys Gln Val Ser 260 265 270 CTC TCG CAG GAG GAC GTC GAT GCC GTC AGC AAG CTC GGC GAG GGT TCG 864 Leu Ser Gln Glu Asp Val Asp Ala Val Ser Lys Leu Gly Glu Gly Ser 275 280 285 GGC CGC AGG CGC TAC AAC ATC CCC TGC ACG TAC TCG CCC AAG TGG GAC 912 Gly Arg Arg Arg Tyr Asn Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Pro Lys Trp Asp 290 295 300 ATC AAC GTC TTT GGC GAG GAG GAC GAG AAG TCG TGC AAG AAC GCC GTG 960 Ile Asn Val Phe Gly Glu Glu Asp Glu Lys Ser Cys Lys Asn Ala Val 305 310 315 AAG ATC AAG TAG 972 Lys Ile Lys 320

【図面の簡単な説明】

【図１】プラークハイブリダイゼーションに用いたプロ
ーブ１及びプローブ２の塩基配列を示す。

【図２】組換えプラスミドｐＳＡＬ２の作製法及び構造
を示す。

【図３】塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、精製
ＡＬＤのリジルエンドペプチダーゼ消化ペプチド断片の
部分アミノ酸配列と比較した結果を示す。

【図４】図３の続きの配列を示す図である。

【図５】図４の続きの配列を示す図である。

【図６】ｃＤＮＡの合成に用いたＮ末端側プライマー
（ＰＮ）とＣ末端側プライマー（ＰＣ）の塩基配列を示
す。

【図７】組換えプラスミドｐＡＲの作製法及び構造を示
す。

【図８】ＡＬＤを用いて作製した抗ＡＬＤ抗体を用いた
ウエスタン・ブロッティング及び電気泳動ゲルのクマシ
ーブルー染色の結果を示す。

【図９】組換え大腸菌によるγ−クロロアセト酢酸エチ
ルからγ−クロロ−β−ヒドロキシ酪酸エチルの合成に
おける反応の経時変化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 7/62 7432−4Ｂ 41/00 Ｄ 9452−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 守川 忠志 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気化 学工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 三好 照三 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気化 学工業株式会社総合研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
   列を有するカルボニルレダクターゼ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示した塩基配列を
   有し、カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチ
   ドをコードする遺伝子ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２に示した塩基配列を
   有し、カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチ
   ドをコードする遺伝子ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子ＤＮＡを、
   複製可能な発現ベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換え体ＤＮＡで形質転
   換せしめられた形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、次
   に得られたカルボニルレダクターゼを採取することを特
   徴とするカルボニルレダクターゼの製造法。
7. 【請求項７】 請求項５記載の形質転換体又はその処理
   物を、γ−置換アセト酢酸エステルと反応せしめ、生成
   した（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを
   採取することを特徴とする（Ｒ）−γ−置換−β−ヒド
   ロキシ酪酸エステルの製造法。