ES2289235T3 - Nuevo antagonista de leptina. - Google Patents
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Abstract
Antagonista de leptina que consta del ID de Secuencia nº 1.
Description
Nuevo antagonista de leptina.
La presente invención se refiere a un
antagonista o inhibidor de leptina que es indicado por el receptor
de leptina. El antagonista de leptina se enlaza con el receptor de
leptina, pero es incapaz de inducir la transducción de señal
JAK-STAT por medio del receptor de leptina. Al
enlazarse con el receptor de leptina, el antagonista de leptina
perjudica la unión de la leptina con el receptor de leptina y
bloquea la señalización de la leptina.
Tras la escisión del péptido de señal de sus
aminoácidos 21 (Cohen et al., 1996), se segrega leptina
humana madura como proteína de aminoácido 146. con una estructura
típica de de intereleucina de tipo II, consistente en un haz de 4
hélices (hélice 1-4) con una topología
arriba-arriba-abajo-abajo
(Zhang et al., 1997). La leptina es segregada al torrente
sanguíneo sobre todo mediante adipocitos, mientras que
concentraciones sanguíneas de leptina se hallan en correlación con
masa de tejido adiposo blanco. La leptina actúa como una hormona de
homeostasis de energía, que regula el gasto de energía y la ingesta
de alimento.
La leptina lleva a cabo esta función enlazando
con el receptor de leptina en ciertas zonas del hipotálamo, lo que
conduce a la fosforilación de las moléculas STAT que como
consecuencia de ello migran al núcleo de la célula e inducen la
transcripción de diferentes genes.
Además de la adipostática, la leptina tiene
muchas otras funciones: puede inducir la proliferación, la
diferenciación y la activación funcional de las células
hemopoiéticas (Gainsford et al., 1996), e induce la
angiogénesis (Sierra-Honigmann et al.,
1998).
La leptina también interacciona con las
respuestas inmunitarias e inflamatorias (Loffreda et al.,
1998).
Los niveles de leptina aumentan
considerablemente debido a los estímulos inflamatorios o a las
citoquinas proinflamatorias TNF-\alpha e
IL-1 (Grunfeld et al., 1996). La leptina
misma regula la producción de diversas citoquinas in Vitro,
regula el equilibrio del T coadyuvante (Th1/Th2) y puede regular por
completo las respuestas inflamatorias (Loffreda et. Al,
1998); Lord et al., 1998).
El receptor de leptina humana se excpresa en la
superficie celular de muchos tejidos diferentes. Hasta ahora se han
hallado al menos seis variantes diferentes de empalme de leptina
humana. El isoformo más largo del receptor de leptina humana consta
de 1.162 aminoácidos, con una región extracelular entre los residuos
1 y 840, una región transmembrana entre los residuos 841 y 863 y
una región intracelular entre los residuos 864 y 1.162.
La parte extracelular del receptor de leptina
humana contiene al menos 7 dominios estructurales (Fong et
al., 1998).
El dominio 1 (residuos 62-178) y
2 (residuos 235-328) tienen un pliegue de
fibronectina de tipo III y juntos forman un módulo de receptor de
citoquina (CRM) llamado CRM1.
El dominio 3 (residuos 329-427)
tiene un pliegue de tipo inmunoglobulina.
Los dominios 4 (residuos
428-535) y 5 (residuos 536-635)
también tienen un pliegue de fibronectina de tipo III y juntos
forman un segundo módulo de receptor de citoquina (CRM) llamado
CRM2.
Los dominios 6 y 7 tienen una estructura de
dominio de fibronectina de tipo III.
Como todos los miembros de la familia de los
receptores de citoquina de clase I, el receptor de leptina no tiene
actividad de quinasa intrínseca y usa una quinasa citoplásmica
asociada Janus (JAK2 en el caso del receptor de leptina) para la
señalización intracelular (Ghilardi et al., 1997). En un
modelo generalmente aceptado, la unión de la leptina conduce a la
formación de un complejo de receptores, permitiendo la activación
de JAK2 mediante la fosforilación cruzada. Entonces el JAK2
fosforila rápidamente varios residuos de tirosina en el dominio
citosólico del receptor de leptina. Estos residuos residuos de
tirosina fosforilados proporcionan sitios de acoplamiento para SH2
que contienen moléculas señalizadoras. En el receptor de leptina de
ratón, la tirosina 1138 sirve como sitio de unión para el
transductor de señal de señal y activador de transcripción 3
(STAT3) (Baumann et al., 1996). El propio STAT3 es un
sustrato para JAK2
y se dimeriza con la fosforilación, se translocaliza en el núcleo y modula la transcripción de los genes destino.
y se dimeriza con la fosforilación, se translocaliza en el núcleo y modula la transcripción de los genes destino.
El receptor de leptina muestra la semejanza de
secuencia en su mayor grado con los receptores de citoquina de la
familia IL-6 y con el Factor Estimulador de Colonias
de Granulocitos (G-CSF). Las investigaciones sobre
la semejanza estructural de FSSP (Holm y Sander, 1997) revelan que
el mayor grado de semejanza estructural de la leptina se da con las
citoquinas de la familia IL-6 y
G-CSF, y en menor grado con otras citoquinas de
cadena larga, como la hormona del crecimiento y la hormona
somatotrófica. La estructura cristalina del herpesvirus asociado al
sarcoma, de Kaposi, IL-6 (vlL6, IL-6
viral) en un complejo a 2:2 con los tres dominios extracelulares
N-terminales del gp130 humano pone de manifiesto dos
sitios de unión, el sitio de unión II y el sitio de unión III, para
la interacción entre vlL6 y gp130 (Chow et al., 2001). El
sitio de unión II, que consta de residuos en las hélices 1 y 3 de
vlL6, interacciona con el módulo receptor de citoquina (CRM) de
gp130. El sitio de unión III en vlL6 consta de residuos en el
N-terminal de la hélice 4, en el bucle de unión
entre las hélices 3 y 4 y en el bucle de unión entre las hélices 1
y 2, e interacciona con el dominio similar a la inmunoglobulina de
gp130. Se identificó los correspondientes residuos de los sitios II
y III en otros miembros de la familia IL-6 de
citoquinas mediante mutagénesis específica puntual: el
IL-6 humano, el IL-11 humano, el
factor inhibidor de leucemia (LIF), la oncostatina M (OSM) y el
factor neurotrófico ciliar (CNTF) (Kalai et al., 1997; Savino
et al., 1993: Di Marco et al., 1996; Hudson et
al., 1996: Inoue et al, 1995; Barton et al., 1999;
Bravo y Heath, 2000).
El IL-6 contiene un tercer sitio
de unión, el sitio de unión I, para la interacción con el receptor
de IL-6 \alpha. El IL-6 humano
forma un complejo hexamérico a 2:2:2 con sus cadenas de receptor de
gp130 e IL-6 \alpha; cada molécula de
IL-6 une dos moléculas de gp130 por sus sitios de
unión II y III, y una subunidad de receptor \alpha de
IL-6 (IL-R \alpha) por su sitio de
unión I (figura 1). (Boulanger et al. 2003).
La activación del receptor de leptina mediante
la unión de la leptina desempeña un papel en variso procesos
fisiológicos. Se ha descrito diversas formas variantes y mutantes de
leptina que pueden usarse en diferentes aplicaciones. El documento
WO02062833 describe polipéptidos de leptina modificados que son
sustancialmente no inmunogénicos o menos inmunogénicos que
cualquier homólogo no modificado cuando se usan in vivo.
Estos polipéptidos pueden administrarse a seres humanos con fines
terapéuticos. El documento WO09700319 da a conocer polipéptidos de
leptina quiméricos que incluyen leptina o un mutante o una variante
de la misma fusionada con un dominio de inmunoglobulina humana.
Estos derivados quiméricos han prolongado los tipos de compensación
y pueden ser útiles para el tratamiento o profilaxis de la obesidad,
o de enfermedades y estados fisiológicos asociados con la obesidad,
como la arterioesclerosis, la hipertensión y la diabetes de tipo II.
El documento WO09720933 da a conocer variantes mutacionales de la
leptina de los mamíferos. Estas moléculas pueden servir de agonista
o antagonista de la leptina de tipo natural; su capacidad para
inducir la ruta de señalización uniéndose al receptor varía según
las diferentes luteínas. En el documento WO09812224 se describe el
uso de fragmentos, derivados de la leptina, como antagonistas de la
leptina, especialmente para el tratamiento de la diabetes de tipo
II.
Verpfloegen et al. (Febs Letters 405
(1997): 237) dan a conocer un antagonista de la leptina con la
sustitución de aminoácido R128Q que es capaz de unir el receptor de
leptina con la misma afinidad que la leptina de tipo natural sin
inducir señalización intracelular.
No obstante, sigue haciendo falta un mutante de
leptina que sea capaz de unirse al receptor con una afinidad
similar o mayor que la leptina de tipo natural, pero sin que
continúe indicando actividad. Dicho mutante de leptina sería un
poderoso antagonista y se podría usar para el tratamiento de
enfermedades mediadas por leptina.
Para nuestra sorpresa, descubrimos que la
leptina, similar al IL-6 y al G-CSF,
tiene sitios de unión II y III, implicados ambos en la unión con el
receptor de leptina. Como en el caso del G-CSF y de
los miembros de la familia del IL-6, en sitio de
unión II consta de residuos en la hélice 1 (residuos
4-26) y 3 (residuos 71-93). Estos
residuos tienen que ver con la alta afinidad de unión con el módulo
CRM2 del receptor de leptina, mientras que las mutaciones en el
sitio de unión II de la leptina de ratón reducen o incluso suprimen
la afinidad de la leptina mutante con el receptor de leptina de
ratón.
Debido a la reducción de la unión, estos
mutantes muestran una reducción de la inducción de la señalización
JAK-STAT por medio del receptor de leptina.
El sitio de unión III consta de residuos en el
bucle de unión entre las hélices 1 y 2 (residuos
27-50) y de residuos en el
N-terminal de la hélice 4 (residuos
105-122). Las mutaciones en este sitio de unión no
afectan la alta afinidad de unión con el receptor de leptina o con
el módulo CRM2, pero muestran todavía una reducción de la inducción
de la señalización JAK-STAT por medio del receptor
de leptina. La mutación S120AT121A en el sitio de unión III de la
leptina de ratón es incapaz de inducir actividad alguna del
informador JAK-STAT por medio de del receptor de
leptina de ratón, aunque la afinidad de unión de este mutante con el
receptor de leptina o con el CMR2 del receptor de leptina de ratón
es similar a la de la leptina de tipo natural.
Fue aún más sorprendente descubrir que el
mutante de la leptina de ratón S120AT121A puede inhibir la unión de
la leptina de tipo natural con su receptor, y puede inhibir la señal
inducida por la leptina de tipo natural. Esto se debe a que el
mutante de leptina S120AT121A muestra intacto el sitio de unión II y
se une ávidamente con el CMR2 del receptor de leptina, compitiendo
así por la unión con la leptina de tipo natural. A diferencia de la
leptina de tipo natural, no obstante, la unión del mutante
S120AT121A no induce la señalización JAK-STAT.
Un primer aspecto de la invención es un
antagonista de leptina de naturaleza polipeptídica, que comprende
el ID de Secuencia nº 1. A ser posible, dicho antagonista de leptina
debe contener el ID de Secuencia nº 2 o 3, y mejor aún, dicho
antagonista de leptina debe contener el ID de Secuencia nº 4. A ser
posible, dicho antagonista de leptina va unido al receptor de
leptina, sin inducir la ruta de señalización. Una de las
materializaciones elegidas consiste en un antagonista de leptina
según la invención, capaz de unir el receptor de leptina sin
inducir la ruta de señalización, por medio del cual dicho
antagonista muta a aminoácido 120 y/o 121 del ID de Secuencia nº 5.
A ser posible, el aminoácido 120 o el aminoácido 121 mutan a una
alanina. Y mejor aún, ambos aminoácidos cambian a alanina. Otra de
las materializaciones elegidas consiste en un antagonista de
leptina de naturaleza polipeptídica, capaz de unir el receptor de
leptina sin inducir la ruta de señalización, y que contiene el ID
de Secuencia nº 5 o un fragmento funcional. Un fragmento funcional
tal como se usa aquí, es un fragmento que aún se puede unir al
receptor de leptina. También pueden tenerse en cuenta las
modificaciones químicas del antagonista.
Las modificaciones químicas de los polipéptidos
resultan conocidas a los experimentados en la técnica, e incluyen,
pero sin estar limitadas a ellas, modificaciones que se dan
naturalmente, como la glicosilación, la fosforilación o la
ubicuitinilación, y modificaciones artificiales como la PEGilación.
A ser posible, dicha modificación química debe aumentar el tiempo
medio de vida del polipéptido. Y mejor aún, dicha modificación
química es la PEGilación. Dicho fragmento funcional puede usarse
como tal, o bien puede fusionarse con otro polipéptido. En el
último caso, y a ser posible, el polipéptido de fusión debe tener
capacidad antagonística aumentada.
Como posibles socios de fusión, y sin que el
ejemplo sea excluyente, están los polipéptidos que aumentan el
tiempo medio de vida del polipéptido in vivo. Dichos
polipéptidos se dan a conocer, entre otros documentos, en
WO9700319. Por otra parte, el socio de fusión puede captar la
leptina él mismo, aumentando así la actividad de antagonista. Los
polipéptidos que captan la leptina son, como ejemplo no exhaustivo,
los anticuerpos de leptina, a ser posible los anticuerpos de cadena
sencilla, o un dominio del receptor de leptina que se una con la
leptina.
Un socio de fusión ideal para el antagonista es
el dominio de pliegue de tipo inmunoglobulina del receptor de
leptina. Este dominio está implicado en la oligomerización
dependiente de leptina del receptor de leptina y la consiguiente
señalización. Por lo tanto, la fusión de este dominio con el
antagonista producirá un efecto antagonístico aumentado al
interrumpir la oligomerización inducida por leptina del
receptor.
Otro aspecto de la invención es el uso de un
antagonista de leptina según la invención para la preparación de un
fármaco para el tratamiento de las enfermedades inmunitarias y/o
autoinmunitarias mediadas por células T. En efecto, la leptina
mejora las respuestas inmunitarias mediadas por células T mediante
la señalización con la forma larga del receptor de leptina en
linfocitos CD4+T (Lord et al., 1998).
La leptina cambia las respuestas de las células
T a un tipo Th1, con un aumento de secreción de citoquinas
pro-inflamatorias IL-2 e interferón
gamma y una reducción de producción de IL-4. Por
consiguiente, los antagonistas de leptina pueden usarse para
modificar o atenuar las respuestas inmunitarias de células T, como
medicamento para el tratamiento de enfermedades (auto-)inmunitarias
mediadas por células T.
Un aspecto más de la invención es el uso de un
antagonista según la invención para la preparación de un fármaco
para el tratamiento de enfermedades de inflamación intestinal. A ser
posible, la enfermedad de inflamación intestinal elegida
pertenecerá al grupo formado por la enfermedad de Crohn, las colitis
ulcerosa y las enfermedades de infección intestinal. En los
sistemas modelo experimentales con ratones, donde se induce la
colitis aguda y crónica mediante sodio sulfato de dextrano o ácido
sulfónico de trinitrobenceno, los ratones con carencia de leptina
(ratones ob/ob) mostraron una reducción de la gravedad de la colitis
en un 72% y una disminución similar de las citoquinas
pro-inflamatorias en el instestino en comparación
con los ratones de tipo natural (Siegmund et al., 2002). La
administración de leptina a los ratones con carencia de la misma
suprime la resistencia a la colitis inducida experimentalmente
(Siegmund et al., 2002). La administración de la toxina A del
Clostridium Difficile induce colitis severa en los ratones. Los
ratones con carencia de leptina (ob/ob), así como los ratones con
receptor de leptina deficiente (db/db) se hallan protegidos
parcialmente la secreción en inflamación intestinales inducidas por
la toxina A (Mykoniatis et al., 2003). En los ratones ob/ob,
pero no en los db/db, la administración de leptina invierte la
protección contra la secreción en inflamación intestinales inducidas
por la toxina A (Mykoniatis et al., 2003). Por lo tanto,
puede usarse un antagonista de leptina como fármaco para el
tratamiento de enfermedades de inflamación intestinal, como la
enfermedad de Crohn, las colitis ulcerosa y las enfermedades de
infección intestinal.
En el caso de las enfermedades de inflamación
intestinal, un método aconsejable para la administración del
antagonista de leptina según la invención es un sistema de
administración in vivo, tal como se describe en WO09714806.
Por consiguiente, otro aspecto de la invención es una bacteria de
ácido láctico que produce un antagonista de leptina según la
invención. A ser posible, dicha bacteria de ácido láctico debe ser
un lactobacilo, y mejor aún si dicha bacteria de ácido láctico es
un lactococo.
Un aspecto más de la invención es el uso de un
antagonistas de leptina según la invención para la preparación de
un fármaco para el tratamiento de la artritis reumatoide. La
administración a los ratones de BSA desnaturalizado en las rodillas
provoca el desarrollo de artritis inducida por antígenos. Si se
compara con ratones de tipo natural, los ratones con carencia de
leptina (ob/ob) y los ratones con receptor de leptina deficiente
(db/db) desarrollan una artritis menos grave, con una disminución
del IL-1\beta y TNF-\alpha en el
fluido sinovial de la rodilla, una disminución de los niveles de
suero de los anticuerpos de BSA desnaturalizado y una disminución
de la respuesta proliferativa de la célula T específica de los
antígenos (Busso et al., 2002). Por consiguiente, puede
usarse un antagonista de leptina como medicamento para el
tratamiento de la artritis reumatoide.
Otro aspecto de la invención es el uso de un
antagonista de leptina según la invención para la preparación un
fármaco para el tratamiento de la esclerosis múltiple. La aparición
clínica de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE),
un modelo en ratones para la esclerosis múltiple, en ratones
C57BL/6J(H-2b) y
SJL/J(H-2s) susceptibles a la enfermedad va
precedida por un aumento de las concentraciones de leptina en el
suero (Sanna et al., 2003. Este aumento se halla en
correlación con la susceptibilidad a la enfermedad. La inanición
aguda, que reduce los niveles de leptina en el suero, retrasa la
aparición de la enfermedad y atenúa los síntomas de EAE. Los
ratones con carencia de leptina C57BL/6J-ob/ob son
resistentes a la EAE, pero esta resistencia desaparece con la
administración de leptina (Matarese et al., 2001). Estos
datos indican de manera clara que la leptina es un factor necesario
para el desarrollo de la EAE y, de este modo, probablemente también
de la esclerosis múltiple. Por consiguiente, puede usarse un
antagonista de leptina como fármaco para el tratamiento de la
esclerosis múltiple.
Otro aspecto más de la invención es el uso de un
antagonista de leptina según la invención para la preparación de un
fármaco para el tratamiento de la diabetes de tipo I. La diabetes de
tipo I es una enfermedad autoinmunitaria en la que las células
\beta pancreáticas son destruidas por procesos inflamatorios. En
un ratón diabético no obeso (NOD), animal modelo para la diabetes
de tipo I, un aumento del nivel de leptina en el suero precede a la
diabetes en hembras susceptibles, mientras que la inyección de
leptina acelera la destrucción autoinmunitaria de las células
\beta pancreáticas (Matarese et al., 2002). Puede usarse un
antagonista de leptina como fármaco para el tratamiento/prevención
de la diabetes de tipo I.
Un aspecto más de la invención es el uso de un
antagonista de leptina según la invención para la preparación de un
medicamento para prevenir y/o tratar enfermedades caracterizadas por
la toxicidad hepática mediada por células T. Los ratones ob/ob con
carencia de leptina están protegidos contra la hepatitis mediada por
células T, inducida experimentalmentecon ConA o con exotoxina A
Pseudomona aeruginosa (Faggioni et al., 2000). La inyección
de leptina en los ratones con carencia de leptina restablece la
toxicidad hepática de esos componentes (Faggioni et al.,
2000). Por consiguiente, se puede usar un antagonista de leptina
para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades
caracterizadas por la toxicidad hepática mediada por células T. Otro
aspecto más de la invención es una composición farmacéutica que
incluye un antagonista de leptina según la invención, opcionalmente
con un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
Los excipientes adecuados son conocidos a los experimentados en la
técnica, y son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Los
excipientes pueden ser, como ejemplo no exhaustivo, la solución de
Ringer, la solución de dextrosa o la solución de Hank. También
pueden usarse soluciones no acuosas como los aceites fijos y el
etil-oleato. Un excipiente aconsejable es 5% de
dextrosa en solución salina. El excipiente puede contener pequeñas
cantidades de aditivos tales como las sustancias que mejoran la
isotonicidad y la estabilidad química, incluidos los tampones y los
conservantes.
Figura 1: composición del complejo 2:2:2
IL-6: gp130: IL-6R\alpha.
Figura 2: Activación de la luciferasa como
informador mediante leptina WT y el mutante S120AT121A.
Figura 3: Competencia de los mutantes de la
leptina para la unión de Leptina-SEAP con LepR CRM2.
Recuadro interior: unión de Leptina-SEAP con LepR
CMR2 en presencia de un medio no diluido que contiene leptina WT o
la leptina mutante R20N o S120AT121A.
Figura 4: La incubación de las células
transfectadas HEK293T con la leptina WT de ratón HA induce la
actividad de la luciferasa. La coincubación con la leptina de ratón
S120AT121A con etiqueta HA, purificada en la columna de afinidad
anti-HA, provoca una fuerte inhibición de de la
actividad de la luciferasa inducida por leptina, y la actividad de
la luciferasa baja al nivel de las células no estimuladas. 50 \mul
de las células HEK293T fueron diluidos en leptina WT y 50 \mul de
diferentes diluciones de las fracciones 1 (O), 2 (K) y 3 (\Delta)
fueron eluidos a partir de de la columna anti-HA con
1 mgr/ml de péptido HA en tampón de equilibrado. Como control (+),50
\mul de las células HEK293T fueron incubadas con leptina WT y con
50 \mul de diferentes diluciones del tampón de elución (1 mg/1 ml
de péptido HA en tampón de equilibrado).
Las investigaciones sobre la semejanza
estructural de FSSP revelan que el mayor grado de semejanza
estructural de la leptina se da con las citoquinas de la familia
IL-6 y G-CSF, y en menor grado con
otras citoquinas de cadena larga, como la hormona del crecimiento y
la hormona somatotrófica.
Las estructuras cristalinas de la leptina humana
(1ax8), el CNTF humano (1cnt), el IL-6 humano
(1alu), el G-CSF bovino (1bgc), el vlL6 (1i1r), el
lactógeno placentario ovino (1f6f), el LIF de ratón (11ki) y el OSM
humano (1evs) se superpusieron mediante los algoritmos FSSP y
Prosup. Los residuos de leptina humana superpuestos a los residuos
de los sitios de unión II y III en las otras citoquinas se
consideraron como posibles residuos de los sitios de unión II y III
en la leptina humana.
Se construyó una homología modelo para la
leptina de ratón reemplazando residuos no idénticos en la estructura
de la leptina humana mediante el rotamer óptimo del residuo
correspondiente en la leptina de ratón, seguido de minimización de
energía mediante el campo de fuerzas moe y charmm22. Los residuos
alineados con los posibles sitios de unión II o III en la leptina
humana se consideraron como posibles residuos de los sitios de unión
II o III en la leptina humana. Los residuos expuestos a disolvente
en los sitios de unión II y III previstos se mutaron en el vector
de expresión
pMET7-SigK-HA-mLep,
y la leptina mutante se expresó en células
COS-1.
El vector pCDM8 mleptina-AP
contiene la secuencia de la leptina de ratón, seguido de la
secuencia de fosfatasa alcalina humana. De este vector se aisló la
secuencia de tipo natural (wt) de leptina de ratón mediante PCR,
usando el cebo oligomérico delantero de 5'
5'-GCGTCCGGAATCCAGAAAGTCCAGGATG-3',
que contenía un sitio de restricción BspEI, y el cebo inverso de 3'
5'-CGCTCTAGATTAGCATTCAGGGCTAACATCC-3',
que contenía un sitio de restricción XbaI. El plásmido
pMET7-SlgK-HALRio contiene el
péptido de señal SigK, seguido de la secuencia de etiqueta HA y la
secuencia del receptor de leptina de ratón. De este vector se
eliminó la secuencia del receptor de leptina mediante las enzimas de
restricción BspEI y XbaI, y se ligó la secuencia de la leptina de
ratón a este vector abierto. El vector resultante,
pMET7-SigK-HA-mLep,
permite la expresión de una proteína de fusión, consistente en el
péptido de señal SigK, seguido de la secuencia de etiqueta HA,
seguida de un enlace GGSG de 4 aminoácido, seguido de los
aminoácidos 3 a 146 de la leptina de ratón. Al expresarlo en
células eucarióticas, el péptido de señal SlgK se escinde y la
proteína con etiqueta HA se segrega al medio.
Secuencia de aminoácido de la leptina de ratón
SlgK-HA: la flecha indica el sitio de escisión
previsto del péptido de señal Slg-K; los números
encima de la secuencia indican los números de residuo en la leptina
de ratón:
\vskip1.000000\baselineskip
La mutación de leptina de ratón S120AT121A se
introdujo en el
pMET7-SigK-HA-mLep
mediante PCR usando los cebos O-1821 y
O-1822.
La mutación de leptina de ratón R20N se
introdujo en el
pMET7-SigK-HA-mLep
mediante PCR usando los cebos O-1701 y
O-1702.
La mutación de leptina de ratón L13N se
introdujo en el
pMET7-SigK-HA-mLep
mediante PCR usando los cebos O-1769 y
O-1770.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las mutaciones se introdujeron con el
método Quickchange (Stratagene) según las especificaciones del
fabricante.
Secuencia de aminoácido de los mutantes de
leptina de ratón: las flechas verticales indican la posición de las
mutaciones; los números encima de la secuencia indican los números
de residuo en la leptina de ratón:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se sembró células COS-1 a 4 x
10^{5} células/pocillo en placas de 6 pocillos y se las dejó
crecer durante la noche. Luego se transfectó las células usando el
método de transfección polietileneimina (PEI) con el
pMET7-SigK-HA-mLep
o los mutantes R20N, L13N o S120AT121A en este vector.
Se sustituyó el medio tras 4 horas de
transfección y las células se incubaron durante la noche, tras lo
cual se sustituyó el medio por 2 ml de medio
OPTI-MEM (Gibco-BRL). Tras otras 72
horas, se recogió el medio OPTI-MEM que contenía la
leptina segregada etiquetada con HA o el mutante de leptina
etiquetada con HA y se retiró las células mediante centrifugado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembró células COS-1 a 8 x
10^{6} células por matraz de 175 cm^{2} en un medio DMEM. Se
transfectó diez matraces de 175 cm^{2 }con el mutante S120AT121A
pMET7-SigK-HA-mLep
mediante transfección de polietileneimina. Tras 4 horas, se
sustituyó el medio por un medio DMEM fresco y se dejó crecer las
células durante la noche. Luego se sustituyó el medio por 50 ml de
OPTI-MEM y las células se incubaron en este medio
durante otras 72 horas. Se recogió el medio con la leptina de ratón
S120AT121A etiquetada con HA, se lo pasó por un filtro de 0,22
\mum y se le añadió inhibidor de proteasa completo (Roche
Diagnostics).
La leptina de ratón S120AT121A etiquetada con HA
se purificó en una columna de afinidad anti-HA de 1
ml (Roche Diagnostics). Se cargó el medio a un caudal de 0,3
ml/min. Se lavó la columna con 25 ml de tampón de equilibrado (20
mM Tris/HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) + 0.05%
Tween-20, seguido de 10 ml de tampón de equilibrado
sin Tween-20. La leptina de ratón
S120AT121A-HA se eluyó con péptido HA (1 mg/ml) en
tampón de equilibrado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembró células HEK293T en placas de 6
pocillos a 4 x 10^{5} células/pocillo y se las dejó crecer durante
20 horas. Luego se transfectó las células con los plásmidos
pMET7-mLRIo y pXP2d2-rPAP1 mediante
la técnica estándar de precipitación de fosfato de calcio. Un día
después de la transfección, se lavó las células con solución salina
fosfatada y se las cultivó en un medio DMEM complementado con 10% de
suero fetal de ternera y 50 \mug/ml de gentamicina. Dos días
después de la transfección, se disoció las células con tampón
disociador de células (Invitrogen) y se las volvió a suspender en 2
ml de medio DMEM complementado con 10% de suero fetal de ternera y
50 \mug/ml de gentamicina. Se sembró 50 \mul de la suspensión de
células en cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos (Costar).
En cada pocillo se echó 50 \mul de la dilución de medio adecuada,
que contenía o leptina de ratón etiquetada con HA, o leptina de
ratón R20N, o leptina de ratón L13N o leptina de ratón
S120AT121A.
El plásmido pMET7-mLRIo codifica
la forma larga del receptor de leptina de ratón, con una etiqueta
myc de Terminal C. El plásmido pXP2d2-rPAP1 codifica
el gene de la luciferasa, bajo el control del promotor de proteína 1
asociado a la pancreatitis de rata dependiente de STAT3.
La incubación de las células HEK293T
transfectadas con la leptina de ratón de tipo natural etiquetada con
HA provoca la actividad de la luciferasa dependiente de
concentración. La incubación de las células HEK293T transfectadas
con la leptina de ratón etiquetada con HA del mutante R20N, la
leptina de ratón etiquetada con HA del mutante L13N o la leptina de
ratón S120AT121A no provoca un aumento apreciable de la actividad de
la luciferasa en las células transfectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembró 8 x 10^{6} células
COS-1 en un matraz de 175 cm^{2 } y se las dejó
crecer durante la noche en un medio DMEM complementado con 10% de
suero fetal de ternera y 50 \mug/ml de gentamicina.
Se transfectó las células con el
pMET7-mLRCM2-his6 usando el método
de transfección PEI. El pMET7-
mLRCM2-his6 codifica los aminoácidos 407-604, que corresponden al módulo CRM2 del receptor de leptina de ratón, seguido de una etiqueta his6 de Terminal C. Al cabo de 4 horas se sustituyó el medio por un medio DMEM fresco complementado con 10% de suero fetal de ternera y 50 \mug/ml de gentamicina, y se dejó crecer las células durante la noche. Luego se sustituyó el medio por 50 ml de OPTI-MEM y las células se incubaron en este medio durante otras 72 horas. Se recogió el medio con la leptina CRM2 segregada, etiquetada con His, y se retiró las células mediante centrifugado. A este medio se lo denomina medio CRM2-his.
mLRCM2-his6 codifica los aminoácidos 407-604, que corresponden al módulo CRM2 del receptor de leptina de ratón, seguido de una etiqueta his6 de Terminal C. Al cabo de 4 horas se sustituyó el medio por un medio DMEM fresco complementado con 10% de suero fetal de ternera y 50 \mug/ml de gentamicina, y se dejó crecer las células durante la noche. Luego se sustituyó el medio por 50 ml de OPTI-MEM y las células se incubaron en este medio durante otras 72 horas. Se recogió el medio con la leptina CRM2 segregada, etiquetada con His, y se retiró las células mediante centrifugado. A este medio se lo denomina medio CRM2-his.
Se sembró 8 x 10^{6} células
COS-1 en un matraz de 175 cm^{2 }y se las dejó
crecer durante la noche en un medio DMEM complementado con 10% de
suero fetal de ternera y 50 \mug/ml de gentamicina.
Se transfectó las células con el plásmido pCDM8
AP-mlep usando el método de transfección PEI. El
plásmido pCDM8 AP-mlep permite la expresión de una
proteína de fusión que consta de leptina de ratón vinculada al
terminal C de de la fosfatasa alcalina humana segregada (SEAP). Al
cabo de 4 horas se sustituyó el medio por un medio DMEM fresco y se
dejó crecer las células durante la noche. Luego se sustituyó el
medio por 50 ml de OPTI-MEM y las células se
incubaron en este medio durante otras 72 horas. Se recogió el medio
con la leptina-SEAP segregada y se retiró las
células mediante centrifugado. A este medio se lo denomina medio de
leptina-SEAP.
Se dejó cubiertas placas Maxisorp (Nunc) durante
la noche a 6ºC con 0,25 \mug/ml de anticuerpo
anti-His5 (Qiagen). Se lavó las plazas cuatro veces
con solución salina fosfatada pH 7,5 que contenía 0,1% de Tween 20.
Se bloqueó los puntos libres de unión de proteína en las placas
mediante incubación con 1% de caseína en solución salina fosfatada
pH 7,5 que contenía 0,1% de Tween 20. Se incubó las placas durante 2
horas a 37ºC con el medio no diluido que contenía el CMR2 con
etiqueta his del receptor de leptina de ratón. Se lavó las plazas
cuatro veces con solución salina fosfatada pH 7,5 que contenía 0,1%
de Tween 20. Luego se incubó las placas con medio de
leptina-SEAP y diferentes concentraciones bien de
leptina de ratón con etiqueta HA o bien del antagonista de leptina
S120AT121A. La añadidura de la leptina de ratón S120AT121A o de la
leptina WT, pero no del mutante R20N, inhibe la unión de la
leptina-SEAP con el CRM2 con etiqueta his del
receptor de leptina de ratón. Los resultados se muestran en la
Figura 3.
Se sembró células HEK293T en placas de 6
pocillos a 4 x 10^{5} células/pocillo y se las dejó crecer durante
20 horas. Luego se transfectó las células con los plásmidos
pMET7-mLRIo y pXP2d2-rPAP1 mediante
la técnica estándar de precipitación de fosfato de calcio. Un día
después de la transfección, se lavó las células con solución salina
fosfatada y se las cultivó en un medio DMEM complementado con 10% de
suero fetal de ternera y 50 \mug/ml de gentamicina. Dos días
después de la transfección, se disoció las células con tampón
disociador de células (Invitrogen) y se las volvió a suspender en 2
ml de medio DMEM complementado con 10% de suero fetal de ternera y
50 \mug/ml de gentamicina. Se sembró 50 \mul de la suspensión de
células en cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos (Costar).
Un medio OPTI-MEM, que contenía leptina WT con
etiqueta HA (vease ejemplo 4), se diluyó multiplicado por 16 en
OPTI-MEM. Se añadió a las células 50 \mul de este
medio diluido, junto con 50 \mul de dilución de leptina
S120AT121A con etiqueta HA y purificada de anti-HA
(véase ejemplo 5). A continuación las células se incubaron durante
la noche. Se retiró el medio y las células se incubaron con 50
\mul de tampón de lisis (25 mM de Tris, pH 7.8; 2 mM EDTA; 2 mM de
DTT; 10% de glicerol; 1% de Triton X-100) durante
10 minutos. Luego se añadió al lisado 35 \mul de tampón de
sustrato de luciferasa (20 mM de Tricina; 1.07 mM
(MgCO_{3})_{4}Mg(OH)_{2}.5H_{2}O; 2,67
mM de MgSO_{4}. 7H_{2}O; 0,1 mM EDTA; 33,3 mM de DTT; 270 mM de
Coenzima A; 470 mM de Luciferina; 530 mM de ATP; pH final 7.8), y
se midió la emisión de luz en un Contador de Quimiluminescencia Top
Count (Packard).
Los resultados se muestran en la Figura 4. La
incubación de las células HEK293T transfectadas con la leptina de
ratón WT con etiqueta HA induce la actividad de la luciferasa. La
coincubación con el mutante S120AT121A inhibe la actividad de la
luciferasa inducida por leptina. Este efecto inhibitorio no se
aprecia con el mutante L13N ni con el R20N.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo para comodidad del lector y no forma parte del
documento de la patente europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado
al reunir las referencias, no se puede excluir errores u omisiones y
la Oficina Europea de Patentes declina toda responsabilidad a este
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pathogenic T cell responses. (El incremento súbito de leptina anuncia el comienzo de la encefalomielitis autoinmunitaria y se halla en correlación con el desarrollo de respuestas de células T patógenas). J. Clin. Invest., 2003, vol. 111, 241-250.
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\vskip0.400000\baselineskip
<110> VIB vzw
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVO ANTAGONISTA DE LEPTINA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> JTA -leptant -163
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn, versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un antagonista de leptina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser cualquier aminoácido,
excepto S
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser cualquier aminoácido,
excepto T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una R o una W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una G, una A o una R
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una S o una A
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<400> 1
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\sa{Xaa Xaa Glu Val Val Ala Leu Ser Xaa Leu Gln
Xaa Xaa Leu Gln Asp}
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<210> 2
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> un antagonista de leptina
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser cualquier aminoácido,
excepto T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una R o una W
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una G, una A o una R
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
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<223> X puede ser una S o una A
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Xaa Glu Val Val Ala Leu Ser Xaa Leu Gln
Xaa Xaa Leu Gln Asp}
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<210> 3
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> un antagonista de leptina
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<220>
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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
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<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser cualquier aminoácido,
excepto S
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una R o una W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una G, A o una R
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una S o una A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Glu Val Val Ala Leu Ser Xaa Leu Gln
Xaa Xaa Leu Gln Asp}
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<210> 4
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un antagonista de leptina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una R o una W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una G, una A o una R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser una S o una A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Glu Val Val Ala Leu Ser Xaa Leu Gln
Xaa Xaa Leu Gln Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 146
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un antagonista de leptina
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (120)..(120)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser cualquier aminoácido,
excepto S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (121)..(121)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X puede ser cualquier aminoácido,
excepto T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo oligomérico delantero usado en
el ejemplo 2
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtccggaa tccagaaagt ccaggatg
\hfill28
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<210> 7
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<211> 31
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo inverso usado en el ejemplo
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctctagat tagcattcag ggctaacatc c
\hfill31
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leptina de ratón
Sigk-HA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo O-1701
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\hfill40
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo O -1702
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill40
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo O -1821
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagcctca ctctacgccg cggaggtggt ggctttg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo O-1822
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaagccacc acctccgcgg cgtagagtga ggcttcc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo O -1769
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatgacacc aaaaccaaca tcaagacaat tgtcaccagg atc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebo O-1770
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcctggtg acaattgtct tgatgttggt tttggtgtca tcc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mutante de leptina de ratón R20N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mutante de leptina de ratón L13N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
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<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mutante de leptina de ratón
S120AT121A
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<400> 17
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Claims (12)
1. Antagonista de leptina que consta del ID de
Secuencia nº 1.
2. Antagonista de leptina según la
reivindicación 1, que consta de una secuencia seleccionada del grupo
formado por los ID de Secuencia nº 2, 3 y 4.
3. Antagonista de leptina capaz de unir el
receptor de leptina sin inducir la ruta de señalización, que consta
del ID de Secuencia nº 5 o de un fragmento funcional del mismo.
4. Antagonista de leptina según la
reivindicación 3, donde dicho antagonista consta de un residuo A en
la posición 120 y/o la posición 121 del ID de Secuencia nº 5.
5. El uso de un antagonista de leptina según una
de las anteriores reivindicaciones para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades inmunitarias y/o
autoinmunitarias mediadas por células T.
6. El uso de un antagonista de leptina según una
de las reivindicaciones 1-4 para la preparación de
un fármaco para el tratamiento de enfermedades de inflamación
intestinal.
7. El uso de un antagonista de leptina según la
reivindicación 6, donde dicha enfermedad de inflamación intestinal
se selecciona del grupo formado por la enfermedad de Crohn, la
colitis ulcerosa y las enfermedades de infección intestinal.
8. El uso de un antagonista de leptina según una
de las reivindicaciones 1-4 para la preparación de
un fármaco para el tratamiento de la artritis reumatoide.
9. El uso de un antagonista de leptina según una
de las reivindicaciones 1-4 para la preparación de
un fármaco para el tratamiento de la esclerosis múltiple.
10. El uso de un antagonista de leptina según
una de las reivindicaciones 1-4 para la preparación
de un fármaco para el tratamiento de la diabetes de tipo 1.
11. El uso de un antagonista de leptina según
una de las reivindicaciones 1-4 para la preparación
de un fármaco para el tratamiento de la toxicidad hepática mediada
por células T.
12. Composición farmacéutica que consta de un
antagonista de leptina según una de las reivindicaciones
1-4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03102619A EP1508575B1 (en) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | Novel leptin antagonist |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2289235T3 true ES2289235T3 (es) | 2008-02-01 |
Family
ID=34042976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03102619T Expired - Lifetime ES2289235T3 (es) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | Nuevo antagonista de leptina. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1508575B1 (es) |
| AT (1) | ATE364630T1 (es) |
| DE (1) | DE60314412T2 (es) |
| ES (1) | ES2289235T3 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA201991075A1 (ru) * | 2016-11-08 | 2019-10-31 | Антигенсвязывающие белки, которые проявляют антагонизм в отношении лептинового рецептора |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6471956B1 (en) * | 1994-08-17 | 2002-10-29 | The Rockefeller University | Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto |
| WO1997020933A2 (en) * | 1995-12-06 | 1997-06-12 | Schering Corporation | MUTATIONAL VARIANTS OF MAMMALIAN Ob GENE PROTEINS |
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2003
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- 2003-08-21 DE DE60314412T patent/DE60314412T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-21 AT AT03102619T patent/ATE364630T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP1508575B1 (en) | 2007-06-13 |
| DE60314412D1 (de) | 2007-07-26 |
| DE60314412T2 (de) | 2008-02-14 |
| EP1508575A1 (en) | 2005-02-23 |
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