ES2289528T3 - Proteinas de trombopoyetina con propiedades mejoradas. - Google Patents
Proteinas de trombopoyetina con propiedades mejoradas. Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína de fusión de la estructura F - (L)n - M, que tiene esencialmente la misma especificidad y actividad biológica de la TPO humana, que comprende una región constante (F) de una cadena pesada de inmunoglobulina y una molécula de TPO humana (M) en una forma truncada (1-174) modificada por una o más sustituciones de aminoácidos, en donde dicha proteína de fusión es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que la proteína de fusión madre que comprende a la TPO humana no modificada, y dichas sustituciones de aminoácidos han sido llevadas a cabo en una o más de las pistas de la secuencia (i) GEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVM, (ii) PTTAVPSRTSLVLTL dentro de la molécula de TPO natural truncada y que causa una reducción o una eliminación de uno o más de los epítopos de la célula T, que actúan en la molécula madre de fusión no modificada como ligandos de enlazamiento del MHC clase II y estimulan a las células T, dicha región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina se fusionadirectamente (n = 0) o indirectamente (n = 1) a través de una molécula enlazadora (L) a dicha molécula modificada de TPO humana (M).
Description
Proteínas de trombopoyetina con propiedades
mejoradas.
Esta invención se relaciona con trombopoyetina
humana y en particular con formas modificadas de trombopoyetina
(TPO) con propiedades mejoradas. Las proteínas mejoradas contienen
sustituciones de aminoácidos en posiciones específicas dentro de la
molécula de TPO. La invención provee moléculas modificadas de TPO,
preferiblemente proteínas de fusión que contienen regiones
constantes de inmunoglobulina y TPO humana modificada, con actividad
biológica mejorada concomitante con un potencial inmunogénico
reducido en la proteína. Las proteínas mejoradas están destinadas a
uso terapéutico en el tratamiento de enfermedades en humanos.
La trombopoyetina (TPO) es una hormona de
glicoproteína involucrada en la regulación de la producción de
plaquetas. La TPO promueve tanto la proliferación de progenitores
de megacariocitos en la médula ósea como su maduración dentro de
megacariocitos que producen plaquetas.
La TPO tiene un valor terapéutico significativo
en el tratamiento de pacientes con un recuento reducido de
plaquetas. En particular, pacientes con muchos tipos de cáncer
sufren trombocitopenias a causa de la quimioterapia mielosupresora.
La transfusión de plaquetas ha sido históricamente el soporte por
medio del cual se ha mantenido a tales pacientes. La disponibilidad
de TPO purificada de fuentes recombinantes podría mejorar las
opciones disponibles para regímenes de quimioterapia agresiva y de
otros pacientes con riesgo de complicaciones por hemorragia debido
a su trombocitopenia [Prow, D. & Vadhan-Raj, S.
(1998) Oncology 12: 1597-1608].
Al menos dos formas de TPO humana recombinante
han sido desarrolladas por ensayos clínicos. Una versión truncada
que comprende únicamente 163 aminoácidos
N-terminales conjugados con polietilén glicol es
mencionada como un factor de crecimiento y desarrollo de
megacariocito humano recombinante pegilatado
(PEG-rHuMDGF). Una molécula glicosilada y de
longitud completa es mencionada como trombopoyetina humana
recombinante (rh TPO).
Ambas formas de TPO han sido evaluadas en
ensayos Fase I/II, donde fueron suministradas a pacientes con cáncer
antes de recibir quimioterapia con el propósito de promover el
recuento de las plaquetas. Los resultados de estos ensayos han sido
reportados [Basser R.L. y colaboradores (1996) Lancet; 348:
1279-1281; Basser R.L.y colaboradores (1997) Blood;
89: 3118-3128. Errata en 1997; 90: 2513; Fannuchi M.
y colaboradores, (1997), New England Journal of Medicine; 336:
404-409; Vadhan-Raj S. y
colaboradores. (1997) Ann. Intern. Med; 126:673-681
y Vadhan-Raj S. (1998) Semin. Hematol; 35:
261-268].
Se ha encontrado que ambas formas de TPO son
inmunogénicas en una pequeña proporción de individuos y se han
demostrado también anticuerpos de neutralización para ambas
moléculas [Hardy L, y colaboradores (1997) The Toxicologist; 36:
277; Li J, y colaboradores (2001) Blood; 98:
3241-3248; Koren E. (2002) Dev Biol (Basel); 109:
87-95; Basser R.L. y colaboradores (2002), Blood;
99: 2599-2602 y Koren E. (2002) Current
Pharmaceutical Biotechnology; 3:349-360].
Los ensayos clínicos de
PEG-rHuMDGF fueron abandonados en 1998 ya que los
anticuerpos de neutralización podrían enlazarse a TPO endógena
provocando que algunos de los pacientes y los voluntarios normales
involucrados en los ensayos se hicieran dependientes de la
transfusión de plaquetas durante varios años. [Neumann T.A &
Foote M. (2000) Cytokines Cell Mol Ther.: 6;
47-56].
Claramente para estos individuos, se ha montado
una respuesta inmune a la TPO terapéutica a pesar del hecho de que
la TPO está normalmente presente en la circulación. La
característica giratoria que conduce la inducción de una respuesta
inmune es la presencia dentro de la proteína de péptidos que pueden
estimular la actividad de las células T a través de la presentación
sobre moléculas clase II del MHC. Tales secuencias de péptidos son
"epítopos de células T" y se definen comúnmente como cualquier
secuencia de residuos de aminoácido con la habilidad de enlazarse a
moléculas Clase II del MHC. Implícitamente, un "epítopo de célula
T" quiere decir un epítopo que cuando está enlazado a moléculas
del MHC puede ser reconocido por un receptor de una célula T (TCR),
y que puede, al menos en principio, causar la activación de estas
células T atrayendo a un TCR para promover una respuesta de una
célula T. Los pacientes que desarrollan anticuerpos para la TPO
poseen células T que son capaces de reconocer fragmentos de péptido
de la TPO enlazados a moléculas clase II del MHC en su repertorio de
células T.
Hasta la fecha ninguna forma de TPO ha recibido
aprobación reglamentaria como compuesto terapéutico. A partir de lo
anterior, existe claramente una necesidad continuada por análogos de
TPO con propiedades mejoradas. Existe una necesidad particular por
el mejoramiento de las características in vivo cuando se los
administra al individuo humano. En este sentido, es altamente
deseado proveer TPO con un potencial reducido o ausente para
inducir una respuesta inmune y una actividad biológica mejorada en
el individuo humano.
Otros han proveído moléculas y análogos de TPO
[US 5.989.538; US 6.083.913; US 5.879.673] incluidas las formas
modificadas y truncadas químicamente [US 5.989.538] y proteínas de
fusión de TPO [US 6.066.318].
Koren y colaboradores [Solicitud Estadounidense
de Patente No. 20030077756] han identificado secuencias de péptidos
en el dominio C-terminal de TPO humana que son
capaces de interactuar con anticuerpos anti-TPO.
Ninguna de estas enseñanzas reconoce la
importancia de los epítopos de células T para las propiedades
inmunogénicas de la proteína ni han sido concebidos para
influenciar directamente dichas propiedades en una forma específica
y controlada de acuerdo al esquema de la presente invención.
WO 03/104263 describe métodos para la
identificación de epítopos de células T CD4+ en citoquinas que
incluyen TPO. De acuerdo con este método, se definió un epítopo en
los residuos 154-171. Sin embargo, se sugirieron
las sustituciones que conducen a una respuesta inmunogénica alterada
deseada en residuos por fuera del epítopo, en los residuos 138, 139
y 140.
La solicitud de propiedad compartida WO
02/068469 describe los resultados de un análisis de la secuencia
entera de la TPO por la presencia de ligandos potenciales de
enlazamiento clase II del MHC. El análisis se realiza allí
utilizando una simulación por computador de la interacción de
enlazamiento del MCH del péptido. WO 02/068469 también provee
múltiples sustituciones de aminoácidos para lograr romper dichas
secuencias potenciales del epítopo.
La presente invención se relaciona también con
moléculas de TPO en las cuales se han realizado sustituciones de
aminoácidos y/o combinaciones de sustituciones. En el caso presente,
las moléculas de la invención son proteínas de fusión que contienen
una fracción de una región constante de inmunoglobulina humana
enlazada con una muteína de TPO. El enlace al dominio de la región
constante de inmunoglobulina causa que la proteína se convierta en
dimérica y estas moléculas muestran adicionalmente una mayor
actividad.
Esta estructura junto con las sustituciones y
combinaciones de sustituciones en el componente de la TPO confieren
la propiedad de mejorar la actividad biológica de la molécula y
también de lograr un perfil inmunogénico reducido para la
proteína.
La categoría general de "proteínas humanas de
fusión Fc" de la cual las moléculas presentes son ejemplos han
sido previamente descritas [US 5.541.087; US 5.726.044 Lo y
colaboradores (1998), Protein Engineering 11:495 –
500].
La invención provee moléculas de trombopoyetina
humana que contienen sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones
de aminoácidos confieren propiedades mejoradas a la proteína. Las
propiedades mejoradas se relacionan con la actividad biológica
específica de la proteína y también con las propiedades
inmunogénicas de la proteína.
Las moléculas de la invención son proteínas de
fusión que contienen una fracción de región constante de una cadena
pesada de inmunoglobulina humana enlazada con una muteína de TPO
humana derivada de TPO truncada de tipo natural
(1-174).
Las proteínas de la TPO de la invención se
expresan preferiblemente en líneas celulares de mamífero como una
compañera de fusión C-terminal, enlazada a la unidad
Fc de IgG_{4} humana, en donde la porción Fc puede incluir una
región de bisagra.
La secuencia de la TPO preferiblemente se
fusiona al C-terminal de una región Fc modificada de
bisagra/C_{H}2/C_{H}3 de IgG_{4} humana a través de un
enlazador flexible de 15 aminoácidos entre el
C-terminal de la C_{H}3 y el
N-terminal de TPO_{(1-174)}. Las
proteínas de fusión expresadas son diméricas y tienen una
estequiometria de
(bisagra-C_{H}2-C_{H}3-enlazador-TPO_{(1-174)})_{2}.
Las moléculas de la invención tienen
propiedades nuevas. Tales moléculas pueden causar beneficio para un
paciente con trombocitopenia.
Las moléculas de la invención se caracterizan
por las secuencias de la proteína definida aquí como M1 a M67,
F-M1 a F-M67, y
F-L-M1 a
F-L-M67, respectivamente, en donde
M1 a M67 representan las secuencias de proteína de TPO humana
modificada en forma diferente en su forma truncada
(1-174), F-M1 a
F-M67 representan a las respectivas proteínas de
fusión con la porción Fc de IgG_{4} humana u opcionalmente otra
forma de IgG humana, y F-L-M1 a
F-L-M67 representan a las
respectivas proteínas de fusión que contienen una molécula
enlazadora entre la secuencia de Fc y la secuencia de la proteína
de TPO, en donde dicha molécula enlazadora es preferiblemente un
péptido enlazador que contiene de 4 - 20 residuos de
aminoácidos.
Las moléculas de la invención se caracterizan
además por su actividad relativa en un ensayo de proliferación
entre 0,1 y 6,3.
Una molécula más preferida de la invención se
caracteriza por la secuencia de la proteína M67 o
F-M67 o F-L-M67 o
F1-L1-M67, en donde F es una porción
de Fc, preferiblemente derivada de IgG_{4} humana e incluye una
bisagra modificada, y L es un péptido enlazador de 15 residuos
aminoácidos y F1 y L1 son secuencias específicas de acuerdo a las
Tablas A3 y A4. Estas moléculas se caracterizan además por una
actividad relativa de alrededor de 0,4 en un ensayo de
proliferación.
Una molécula preferida adicional de la invención
se caracteriza por las secuencias de la proteína M1,
F-M1, F-L-M1, y
preferiblemente F1-L1-M1 y se
caracteriza además por una actividad relativa de alrededor de 1,0
en un ensayo de proliferación.
Una molécula preferida adicional de la invención
se caracteriza por las secuencias de la proteína M66,
F-M66, F-L-M66 y
preferiblemente F1-L1-M66 y se
caracteriza además por una actividad relativa de alrededor de 0,2
en un ensayo de proliferación.
Las moléculas más preferidas de la invención se
caracterizan aún adicionalmente por contener secuencias que
demostradamente presentan una inmunogenicidad reducida en células
humanas. En particular una inmunogenicidad reducida de acuerdo a lo
medido utilizando un "ensayo de células T" o un "ensayo con
el transcurso del tiempo" como se define aquí.
La presente invención provee formas modificadas
de proteínas de TPO, preferiblemente proteínas de fusión de
inmunoglobulina que tienen la actividad biológica de la TPO humana,
que se espera que muestren propiedades mejoradas in vivo. La
presente invención divulga las regiones principales de la secuencia
primaria de la TPO que son inmunogénicas en el hombre y que provee
una modificación a la secuencia para eliminar o reducir la
efectividad inmunogénica de estos sitios.
En una modalidad, se pueden proveer péptidos
sintéticos que contienen las regiones inmunogénicas en una
composición farmacéutica con el propósito de promover una respuesta
tolerogénica a la molécula completa.
En una modalidad adicional, las moléculas
modificadas de TPO de la presente invención se pueden utilizar en
composiciones farmacéuticas.
En resumen, la invención se relaciona con los
siguientes problemas:
- \bullet
- Una molécula modificada de TPO (M) en una forma truncada (1-174) que tiene esencialmente la misma especificidad y actividad biológica de la TPO humana cuando se la utiliza in vivo conteniendo una o más sustituciones de aminoácidos, en donde dicha molécula modificada de TPO es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que la TPO humana no modificada de los padres y dichas sustituciones de aminoácidos causan una reducción o una eliminación de uno o más epítopos de célula T dentro de la secuencia de la TPO de tipo natural que actúa en la molécula madre no modificada como ligandos de enlazamiento clase II del MHC y estimula a las células T.
- \bullet
- Una molécula modificada de TPO como la especificada que contiene una o más de las sustituciones de aminoácidos que contienen al menos las sustituciones de aminoácidos M55K, A60R y V161A dentro de la secuencia de la TPO.
- \bullet
- Una molécula modificada de TPO humana que tiene la fórmula / estructura (M)
- X^{1} es A, E;
- X^{2} es S, W;
- X^{3} es A o T o K, S o M;
- X^{4} es A, T;
- X^{5} es R, A;
- X^{6} es A o T o Q;
- X^{7} es A o T o I;
- X^{8} es A o T o V;
- X^{9} es A o T o S o L;
- X^{10} es A o L;
- X^{11} es A o S o E;
- X^{12} es N o A o T o R o E o D o G o H o P o K o Q o V;
- X^{13} es A o P,
- y con lo cual simultáneamente X^{1} = E, X^{2} = W, X^{3} = M, X^{4} = T, X^{5} = A, X^{6} = Q, X^{7} = I, X^{8}=V, X^{9} = L, X^{10} = L, X^{11} = E, X^{12} = V y X^{13} = P están excluidos, dichos significados representando a la TPO humana nativa.
- \bullet
- Una molécula modificada de TPO (M) como la especificada que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo que consiste de M1 a M67, en donde M1-M67 se especifican en la Tabla A1.
- \bullet
- Una molécula modificada de TPO (M) como la especificada que tiene una secuencia de proteína de M1, M67 o M68 como se especifica en la Tabla A1.
- \bullet
- Una proteína de fusión de la estructura
F-(L)n-M
- que comprende una molécula modificada de TPO humana (M) como la especificada, fusionada directamente (n = 0) o indirectamente (n = 1) a través de una molécula enlazadora (L) a un dominio (F) de una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada, en donde F es un dominio Fc, que opcionalmente comprende una región de bisagra, en donde esta región de bisagra puede ser modificada.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada en donde el C-terminal del domino de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana (dominio Fc) está enlazada directa o indirectamente al N-terminal de la TPO modificada.
- \bullet
- Una proteína dimérica de fusión que contiene dos cadenas monoméricas de proteína de fusión como la especificada.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada, en donde dicha porción de TPO contiene una o más de las sustituciones de aminoácidos M55K, A60R y V161A dentro del dominio de TPO.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada, en donde dicha porción de TPO tiene la fórmula / estructura (M):
- X^{1} es A, E;
- X^{2} es S, W;
- X^{3} es A o T o K, S o M;
- X^{4} es A, T;
- X^{5} es R, A;
- X^{6} es A o T o Q;
- X^{7} es A o T o I;
- X^{8} es A o T o V;
- X^{9} es A o T o S o L;
- X^{10} es A o L;
- X^{11} es A o S o E;
- X^{12} es N o A o T o R o E o D o G o H o P o K o Q o V;
- X^{13} es A o P,
- y con lo cual simultáneamente X^{1} = E, X^{2} = W, X^{3} = M, X^{4} = T, X^{5} = A, X^{6} = Q, X^{7} = I, X^{8}=V, X^{9} = L, X^{10} = L, X^{11} = E, X^{12} = V y X^{13} = P están excluidos.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada en la Tabla A5 o A6, en donde dicha porción de TPO tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo M1 a M67, en donde M1 - M67 se especifican en la Tabla A1.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada en la Tabla A5 o A6, en donde F tiene la secuencia F1 como la especificada en la Tabla A3.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada en la Tabla A5 o A6, en donde L tiene la secuencia L1 como la especificada en la Tabla A4.
- \bullet
- Una proteína de fusión como la especificada seleccionada del grupo que consiste de un miembro de la Tabla A7.
- \bullet
- Una proteína de fusión seleccionada del grupo que consiste de
- F-M1, FL-M1, F1-L1-M1;
- F-M66, F-L-M66, F1-L1-M66, y
- F-M67, F-L-M67, F1-L1-M67,
- en donde F es una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, F1 es la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina de la Tabla A3, L es una molécula enlazadora, y L1 es el péptido enlazador de la Tabla A4.
- \bullet
- Una molécula modificada de TPO que tiene la actividad biológica de trombopoyetina humana y que comprende un dominio Fc humano y que contiene al menos las sustituciones de aminoácidos A60R y V161A dentro del dominio de la trombopoyetina y siendo caracterizada además por exhibir una actividad relativa de alrededor de 1,0;
- \bullet
- Una molécula modificada de TPO que tiene la actividad biológica de trombopoyetina humana y que comprende un dominio Fc humano y que contiene al menos las sustituciones de aminoácidos M55K, A60R y V161A dentro del dominio de la trombopoyetina y siendo caracterizada además por exhibir una actividad relativa de alrededor de 0,4;
Las proteínas mutantes de la presente invención
se elaboran fácilmente utilizando técnicas de ADN recombinante bien
conocidas en el arte y la invención provee métodos para la
producción recombinante de tales moléculas.
En la medida en que esta invención se relaciona
con TPO modificada, las composiciones que contienen tales proteínas
modificadas de TPO o fragmentos de proteínas modificadas de TPO y
composiciones relacionadas deben ser consideradas dentro del
alcance de la invención. En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con ácidos nucleicos que codifican entidades modificadas
de TPO. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona
con métodos para tratamiento terapéutico de humanos utilizando las
proteínas modificadas de TPO.
En la naturaleza, la proteína madura de TPO es
un polipéptido único de 332 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos
de TPO (descrita como un código de una sola letra) es la siguiente
(M68):
La proteína madura comprende regiones distintas
con el dominio N-terminal altamente conservado entre
ratón y hombre y una homología significativa con la eritropoyetina
y el interferón alfa y el interferón beta [de Sauvage, F.J. y
colaboradores (1994) Nature 369: 533-538; Chang, M.
y colaboradores (1995) J. Biol. Chem. 270:
511-514]. El dominio C-terminal
tiene varios sitios para glicosilación enlazada a N. El dominio
N-terminal es suficiente para el efecto
trombopoyético de la molécula mientras que la región
C-terminal es probablemente importante en mantener
la vida media circulante in vivo [Foster, D. y colaboradores
(1996) Stem Cells 14: 102-107].
El término "TPO" es utilizado aquí para
denotar trombopoyetina humana. En algunos casos el término es
utilizado también aquí en forma más amplia para incluir proteínas
de fusión (ver más adelante) que contienen una fracción TPO y/o más
específicamente una muteína de TPO.
El término "muteína" es utilizado aquí para
denotar una proteína TPO modificada genéticamente para contener una
o más sustituciones de aminoácidos que difieren de la secuencia
nativa anterior.
Además, las muteínas de TPO de la invención
representan cada una, una versión truncada de la secuencia nativa y
comprenden únicamente los residuos 1-174 de la
secuencia anterior abarcando así al dominio completo
N-terminal de la proteína nativa. Las "muteínas
de TPO" y las "proteínas de fusión de TPO" de acuerdo con la
invención se refieren a proteínas que contienen un dominio de TPO
de 174 residuos.
Otras muteínas de TPO y proteínas de fusión de
TPO contienen más o menos 174 residuos de la secuencia de TPO,
pueden ser contempladas y están dentro del alcance de la presente
invención. Por lo tanto las proteínas de fusión de TPO que
contienen los residuos 1-164 ó 1-165
ó 1-166 ó 1-167 ó
1-168 ó 1-169 ó
1-170 ó 1-171 ó
1-172 ó 1-173 pueden ser
contempladas y puede esperarse que tengan propiedades equivalentes a
las de las moléculas preferidas de la invención.
El término "péptido" como se lo utiliza
aquí, es un compuesto que incluye dos o más aminoácidos. Los
aminoácidos se enlazan entre sí por medio de un enlace peptídico.
Un enlace peptídico es el solo enlace covalente entre aminoácidos
en la estructura lineal de la columna vertebral de todos los
péptidos, polipéptidos o proteínas. El enlace peptídico es un
enlace covalente, de estructura plana y químicamente constituye una
amida sustituida. Una "amida" es cualquiera de un grupo de
compuestos orgánicos que contienen la agrupación -CONH-.
Existen 20 aminoácidos diferentes de ocurrencia
natural que están involucrados en la producción biológica de
péptidos, y cualquier número de ellos se pueden enlazar en cualquier
orden para formar una cadena o anillo peptídico. Los aminoácidos de
ocurrencia natural empleados en la producción biológica de péptidos
tienen todos configuración L. Los péptidos sintéticos se pueden
preparar empleando métodos convencionales de síntesis, utilizando
aminoácidos L, aminoácidos D, o diferentes combinaciones de
aminoácidos de las dos configuraciones diferentes. Algunos péptidos
contienen únicamente solamente unas pocas unidades de aminoácidos.
Los péptidos cortos, por ejemplo, que tienen menos de diez unidades
de aminoácidos, son denominados algunas veces como
"oligopéptidos". Otros péptidos contienen un gran número de
residuos de aminoácidos, por ejemplo hasta 100 o más, y son
denominados como "polipéptidos". Por convención, un
"polipéptido" se puede considerar como cualquier cadena
peptídica que contiene tres o más aminoácidos, mientras que
usualmente un "oligopéptido" es considerado como un tipo
particular de polipéptido "corto". Por lo tanto, como se lo
utiliza aquí, se entiende que cualquier referencia a un
"polipéptido" también incluye a un oligopéptido. Además,
cualquier referencia a un "péptido" incluye polipéptidos,
oligopéptidos, y proteínas. Cada ordenamiento diferente de
aminoácidos forma diferentes polipéptidos o proteínas. El número de
polipéptidos, y por lo tanto el número de proteínas diferentes que
se pueden formar es prácticamente ilimitado. Ya que el enlace
peptídico es el único enlazamiento entre aminoácidos, todos los
péptidos, polipéptidos o proteínas tienen terminales
convencionalmente definidos denominados residuo
"N-terminal" y residuo
"C-terminal". El residuo
N-terminal soporta un grupo amino libre, mientras
que el residuo C-terminal soporta un grupo
carboxilo libre.
Todas las secuencias de aminoácidos consecutivos
tienen por lo tanto una orientación N-terminal o
C-terminal. Donde las proteínas de fusión están
constituidas o los diferentes dominios están conectados dentro de
una especie proteína, su orientación relativa pueden ser descrita
como "N-terminal" o
"C-terminal".
El término "proteína de fusión" es
utilizado aquí para referirse a una molécula de proteína que
contiene dos o más dominios de proteína funcionalmente distintos
dentro de una cadena única de polipéptido. Las fracciones de
proteína en la proteína de fusión pueden estar directamente
acopladas o pueden estar unidas a través de un péptido
enlazador.
Un "enlazador" o "péptido enlazador"
se refiere aquí a un segmento de péptido que une dos fracciones de
una proteína de fusión. Un ejemplo de un péptido enlazador es
proveído por la secuencia de aminoácidos
(G)_{4}5(G)_{4}5(G)_{3}SG.
Sin embargo, también se pueden utilizar otros péptidos enlazadores,
preferiblemente que tengan de 4-20 residuos de
aminoácidos de acuerdo con invención. Las proteínas de fusión de la
presente invención contienen tal tipo de enlazador pero no todas
las proteínas de fusión contienen un enlazador.
Las proteínas de fusión se producen comúnmente
por medio de técnicas de ADN recombinante y por lo tanto pueden ser
consideradas como proteínas artificiales que no tienen equivalentes
directos en la naturaleza (las proteínas de fusión naturales pueden
surgir, por ejemplo, a través de una translocación cromosómica, pero
no son consideradas aquí). Un ejemplo de una protección de fusión
es una fusión en la cual se coloca una región Fc de inmunoglobulina
en el N-terminal de otra proteína tal como la TPO.
Tal fusión es llamada una fusión "Fc-X", donde
X es un ligando (tal como TPO) y las proteínas Fc-X
tienen una cantidad de propiedades biológicas convenientes
distintas. En particular, mientras que tales proteínas de fusión
pueden enlazarse aún a los receptores Fc relevantes sobre las
superficies de las células, cuando el ligando se enlaza a su
receptor, se altera la orientación de la región Fc de tal manera
que se activen la fijación del complemento y la citotoxicidad
mediada por la célula que depende el anticuerpo por medio de las
secuencias presentes en el dominio Fc.
El término "inmunoglobulina" se lo utiliza
aquí para referirse a una proteína que consiste de uno o más
polipéptidos sustancialmente codificados por genes que codifican
para la inmunoglobulina. Los genes reconocidos que codifican para
la inmunoglobulina incluyen a los genes de regiones constantes kapa,
lambda, alfa, gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), sigma, epsilon, y
\mu, y en la naturaleza a los múltiples genes de región variable
que codifican para la inmunoglobulina.
El término Fc se lo utiliza aquí para referirse
a un dominio de una región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina.
El término "epítopo de célula T" significa
de acuerdo con la forma de entender esta invención, una secuencia
de aminoácidos que es capaz de enlazarse al MHC clase II, capaz de
estimular a las células T y/o de enlazarse también (sin activar
necesariamente en forma mensurable) a las células T en un complejo
con MHC clase II.
La referencia a "sustancialmente no
inmunogénico" o a "potencial inmunogénico reducido" incluye
inmunogenicidad reducida comparada con una proteína madre o con una
proteína de fusión que contiene secuencias naturales (WT
(wild-type)) o nativas de aminoácidos de la fracción
para análisis.
El término "inmunogenicidad" incluye una
habilidad para provocar, inducir o bien facilitar una respuesta
humoral y/o mediada por células T en un animal huésped y en
particular donde el "animal huésped" es un humano.
Los términos "ensayo de célula T" y
"ensayo de inmunogenicidad" se relacionan con las mediciones
ex vivo de reactividad inmune. Como tal, éstos involucran a
un inmunógeno de prueba, por ejemplo, una proteína o un péptido que
se pone en contacto con células inmunes humanas vivas y se mide su
reactividad. Un parámetro típico de reactividad inducida es la
proliferación. La presencia de determinaciones adecuadas de control
es crítica y está implícita en el ensayo.
"Ensayo con el transcurso del tiempo" se
refiere a un ensayo biológico tal como un ensayo de proliferación
en el cual las determinaciones de actividad se hacen secuencialmente
durante un período de tiempo. En el presente contexto, un "ensayo
de células T con el transcurso del tiempo", se refiere a la
determinación de la proliferación de células T en respuesta a un
inmunógeno de prueba (péptido) en diferentes momentos después de la
exposición al inmunógeno de prueba. Los términos "ensayo de
células T con el transcurso del tiempo" y "ensayo de
inmunogenicidad con el transcurso del tiempo" se pueden utilizar
indistintamente aquí.
Una forma convencional en la cual se expresan
los ensayos de células T es por medio del uso de un "índice de
estimulación" o "SI". El índice de estimulación (SI) se
deriva convencionalmente por división del recuento de proliferación
(por ejemplo, recuentos por minuto de radiactividad si se utiliza
por ejemplo la incorporación de timidina con ^{3}H) medido para
un inmunógeno de prueba tal como un péptido, entre el recuento
medido en la células que no estuvieran en contacto con un
inmunógeno de prueba. Los inmunógenos de prueba (péptidos) que no
evocan respuesta dan un SI = 1,0 aunque en la práctica los valores
del SI en el rango entre 0,8-1,2 no son
extraordinarios. Los inventores han establecido que en la operación
de tales ensayos de inmunogenicidad, un índice de estimulación
igual o superior a 2,0 es una medida útil de una proliferación
inducida significativa.
PBMC significa células mononucleares de sangre
periférica, en particular como las obtenidas a partir de una
muestra de sangre de un donante. Las PBMC se aíslan fácilmente a
partir de muestras de sangre entera utilizando una técnica de
saturación con gradiente de densidad bien entendida en el arte y que
comprende predominantemente linfocitos (células B y T) y monocitos.
Otros tipos de células también están representadas.
"Actividad relativa" significa de acuerdo
con el presente contexto una actividad medida para una proteína de
prueba en cualquier ensayo sencillo expresado en relación con la
actividad medida para una proteína de control positivo en un ensayo
idéntico y usualmente realizado en paralelo. Por lo tanto, si la
proteína de prueba y la proteína de control tienen la misma
actividad medida, se dice que la actividad relativa es 1.
Un "ensayo de proliferación" de acuerdo con
el presente contexto significa un ensayo biológico capaz de proveer
una lectura de la capacidad funcional de la proteína de prueba. En
el presente caso esto significa la habilidad de una muteína dada de
TPO o de una proteína de fusión de TPO para evocar una respuesta
proliferativa específica medible en una célula viva. Los ensayos de
proliferación particularmente adecuados se ejemplifican aquí
utilizando células TF-1 o células
M0-e7. Se pueden contemplar otras células y formatos
de ensayo para proveer también estimaciones cuantitativas de
actividad específica de las moléculas de prueba y permitir
determinaciones de ED_{50}.
En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con ácidos núcleos que codifican entidades modificadas de
TPO. Tales ácidos núcleos están comprendidos preferiblemente dentro
de un vector de expresión. Las secuencias de control que son
adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor,
opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlazamiento
del ribosoma. Las células eucariotas son conocidas por utilizar
promotores, reforzadores y señales de poliadenilación. Tales ácidos
núcleos comprenden en general un medio de selección, típicamente un
gen adicional que codifica a una proteína capaz de mantener la
sobrevivencia de la célula huésped. Un ejemplo de tal gen de
selección es el gen que codifica para la
beta-lactamasa adecuado para algunas células
huésped de E. coli, y este y otros son conocidos en el arte
["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition
(Sambrook y colaboradores, 1989); "Gene Transfer Vectors for
Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987);
"Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel y
colaboradores, eds., 1987)].
Un ácido nucleico está "operativamente
enlazado" cuando está ubicado en una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando un ADN para una
secuencia previa o un líder secretor está operativamente enlazado a
un ADN para un polipéptido si está expresado como una proteína
previa que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o
reforzador está operativamente enlazado a una secuencia de
codificación si afecta la trascripción de la secuencia; o un sitio
de enlazamiento del ribosoma está operativamente enlazado a una
secuencia de codificación si está posicionado para facilitar la
traducción. Generalmente, "operativamente enlazado" significa
que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en
el caso de un líder secretor, contiguas y en el mismo marco de
lectura. Sin embargo, lo reforzadores no tienen que estar contiguos.
El enlazamiento se logra por ligadura en un sitio de restricción
conveniente. Si tales sitios no existen, se utilizan adaptadores o
enlazadores oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica
convencional.
En algunas modalidades el vector de expresión
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica a una
variante de TPO operativamente enlazada a una secuencia de control
de expresión. En varias modalidades, el vector de expresión
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica a una
proteína de TPO seleccionadas del grupo que comprende inclusive M1
a M68. Tal vector de expresión comprenderá al menos al dominio de
codificación de TPO de una de dichas proteínas operativamente
enlazado con un control de expresión adecuado y con secuencias de
selección. Tal vector de expresión incluiría versiones degeneradas
del ácido nucleico en donde degeneración con relación a los
polinucleótidos se refiere al hecho bien reconocido de que en el
código genético muchos aminoácidos son especificados por más de un
codón. La degeneración del código da cuenta de 20 aminoácidos
diferentes codificados por 64 posibles secuencias de tripletas de
las cuatro bases diferentes que comprenden al ADN.
Otro aspecto de la presente invención es una
célula cultivada que comprende al menos uno de los vectores
anteriormente mencionados.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un método para preparar la TPO modificada que comprende el cultivo
de la célula anteriormente mencionada bajo condiciones que permitan
la expresión de la TPO a partir del vector de expresión y purificar
la TPO de la célula.
En aún otro aspecto adicional, la presente
invención se relaciona con métodos para tratamiento terapéutico de
humanos utilizando las composiciones de TPO. Para administración a
un individuo, cualquiera de las composiciones modificadas sería
producida al menos preferiblemente con una pureza del 80% y libre de
pirógenos y de otros contaminantes. Se entiende además que las
composiciones terapéuticas de las proteínas de TPO se pueden
utilizar junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las
composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención se
preparan en forma convencional, conteniendo sustancias que son
comúnmente utilizadas en productos farmacéuticos, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences, (Alfonso R. Gennaro ed.
18^{th} edition 1990), incluidos excipientes, adyuvantes
portadores y amortiguadores. Las composiciones se pueden
administrar, por ejemplo, en forma parenteral, enteral,
intramuscular, subcutánea, intravenosa o a través de otras rutas
útiles para lograr un efecto. Los excipientes convencionales
incluyen sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas
farmacéuticamente aceptables adecuadas para administración
parenteral, enteral, y otras rutas administración que no reaccionan
en forma perjudicial con los agentes. Para aplicación parenteral,
son particularmente adecuadas las soluciones estériles inyectables,
preferiblemente soluciones aceitosas o acuosas, así como
suspensiones, emulsiones o implantes, incluidos los supositorios.
Las ampolletas son unidades de dosificación convenientes. Las
preparaciones farmacéuticas se pueden esterilizar y, si se desea, se
pueden mezclar con estabilizadores, agentes de humectación,
emulgentes, sales para influenciar la presión osmótica,
amortiguadores u otras sustancias que no reaccionan en forma
perjudicial con los compuestos
activos.
activos.
La mayoría de las modalidades de la presente
invención son abarcadas por las secuencias de proteína de la TPO
M1-M67 y las secuencias de la proteína de fusión F -
M1 a F - M 67, o F - L - M1 a F - L - M67, o F1 - L1- M1 a F1 - L1
- M67. Las proteínas son proteínas de fusión del tipo
"Fc-X" en donde X en este caso comprende
muteínas de TPO. Las proteínas de TPO se expresan en líneas
celulares de mamífero como compañeras de fusión
C-terminal, enlazadas a la unidad Fc de IgG_{4}
humana. La secuencia de la TPO se fusiona preferiblemente al
C-terminal de una región Fc modificada de
bisagra/C_{H}2/C_{H}3 de IgG_{4} humana a través de un
enlazador flexible de 15 aminoácidos entre el
C-terminal de la C_{H}3 y el
N-terminal de TPO. En dominio de la TPO comprende
únicamente los residuos 1-174 de la contraparte
nativa. La secuencia de aminoácidos del enlazador era la siguiente:
(G)_{4}S(G)_{4}S(G)_{3}SG.
La proteína de fusión expresada tenía una estequiometría de
(bisagra-C_{H}2-C_{H}3-enlazador-TPO_{(1-174)})_{2}.
Se utilizó Fc-gama 4 humana como
la compañera de fusión en todas las moléculas preferidas, pero se
puede reconocer fácilmente que en principio se podrían utilizar
igualmente otros isotipos. En el caso presente, no son deseables
funciones efectoras inmunes para una molécula terapéutica de TPO. En
contraste con algunos otros isotipos de Fc humana, el isotipo
Fc-gama 4 no soporta la activación del complemento y
la citotoxicidad mediada por la célula que depende del anticuerpo
(ADCC) y por lo tanto fue seleccionada como la compañera de fusión
más preferida.
Donde se ha utilizado la aproximación
"Fc-X" en otras moléculas, tal como por ejemplo
en Fc-IL 10 e IL 10-Fc, la vida
media in vivo en ratones se extendió desde algunos minutos
hasta más allá de 30 horas [Lo K-M, y colaboradores
(1998) Protein Engineering; 11: 495-500; Gillies SD,
y colaboradores (1999) Cancer Research; 59:
2159-2166; Zheng X. X. y colaboradores (1995)
Journal of Immunology; 154: 5590-5600]. En forma
similar, donde se ha utilizado una molécula
"X-Fc" como agente terapéutico en humanos, la
vida media del suelo se registra a los 3 días
[Korth-Bradley JM, y colaboradores (2000) Annals of
Pharmacotherapy; 34:161-164].
Los inventores han proveído proteínas de fusión
de TPO que muestran una mayor actividad comparadas con las
proteínas de fusión que contienen a la fracción de TPO de tipo
natural (WT). Las proteínas de fusión "WT" o "nativas"
construidas aquí han sido denominadas ID 00 (M68, F - M68, F - L -
M68, F1 - L1 - M68).
Utilizando un ensayo de proliferación en células
TF-1, se ha encontrado que la proteína de fusión
nativa tiene un valor de ED_{50} de alrededor de 12,0 ng/ml en
algunas determinaciones y cuando se utilizan células
M0-7e, alrededor de 25,0 ng/ml en algunas
determinaciones.
En contraste, ha sido algo sorprendente
encontrar que la molécula más preferida de la invención (M1,
F-M1, F-L-M1,
F1-L1-M1) tiene un valor de
ED_{50} en células TF-1 de alrededor de 11,5 ng/ml
en algunas determinaciones y cuando se utilizan células
M0-7e un ED_{50} de alrededor de 18,0 ng/ml. dado
que esta molécula es una muteína de TPO, estos resultados indican
que los cambios a la secuencia habían tenido un efecto benéfico
sobre la actividad funcional directa.
La potencia mejorada en la molécula atribuida a
la naturaleza dimérica de la proteína en virtud del dominio Fc se
demuestra por medio de la comparación de los valores de ED_{50}
encontrados utilizando la molécula de TPO humana de tamaño completo
(no enlazadas a Fc) en ensayos de proliferación con base en
TF-1 y E0-7e. En los estudios
actuales, la TPO humana recombinante de longitud completa
(r-hTPO) logra un valor de ED_{50} de alrededor
de 29,5 ng/ml utilizando células TF-1 y de alrededor
de 70,0 ng/ml utilizando células M0-7e. La molécula
más preferida de la invención demuestra por lo tanto una actividad
mejorada aproximadamente entre 2,5-4,0 veces sobre
la r-hTPO.
Un ejemplo adicional de una molécula
especialmente preferida de la invención con actividad
significativamente mejorada proveía por la muteína de la TPO que
contiene el conjunto de sustitución M55K, A60R, V 161A (M67,
F - M67. F - L - M67, F1- L1- M67). Esta proteína es muy potente en el ensayo con TF-1 con una actividad relativa de 0,4. Esta molécula es por lo tanto aún más activa que una proteína de fusión de TPO con un dominio de TPO WT (M68, F - M68. F - L - M68, F1- L1- M68).
F - M67. F - L - M67, F1- L1- M67). Esta proteína es muy potente en el ensayo con TF-1 con una actividad relativa de 0,4. Esta molécula es por lo tanto aún más activa que una proteína de fusión de TPO con un dominio de TPO WT (M68, F - M68. F - L - M68, F1- L1- M68).
Aunque la muteína M55K, A60R, V 161 A (M67, F -
M67. F - L - M67, F1- L1- M67) es claramente una molécula muy
potente, esta muteína no es tan activa como la muteína que contiene
únicamente las sustituciones M55K y A60R (M66, F - M66. F - L -
M66, F1- L1- M68). Esta muteína demuestra una actividad relativa de
0,2 en el ensayo con
TF-1.
TF-1.
Por lo tanto en consecuencia, las proteínas de
TPO M1, M66 y M67 que incluyen sus diferentes estructuras de fusión
como se indicó anteriormente y como se indica más adelante, son
moléculas especialmente preferidas de la invención.
Las muteínas de TPO de la presente invención se
construyeron para ser menos inmunogénicas que la molécula madre. El
diseño de las muteínas individuales se dirigió a partir de
consideraciones inmunológicas así como de los datos de actividad
funcional. Dos regiones de importancia inmunológica dentro del
dominio de N de la molécula se definieron utilizando ensayos de
selección que involucran el uso de preparaciones PBMC a partir de
individuos donantes saludables. Esta aproximación ha probado ser un
método particularmente efectivo para la identificación de tales
péptidos inmunogénicos biológicamente relevantes y se divulga aquí
como una modalidad de la invención. En el presente estudio, el
método ha involucrado el análisis de secuencias de péptidos que se
superponen derivadas de TPO en un esquema para escudriñar y analizar
la secuencia de TPO que comprende los residuos
1-177. Tal examen requirió de síntesis y del uso de
55 péptidos cada uno de 15 residuos de longitud. Los péptidos
sintéticos fueron analizados por su habilidad para evocar una
respuesta proliferativa en células T humanas cultivadas in
vitro. Donde este tipo de aproximación se lleva a cabo
utilizando células T humanas nativas tomadas de donantes sanos, los
inventores han establecido que un índice de estimulación igual o
superior a 2,0 es una medida útil de proliferación inducida.
Se identificaron dos regiones del epítopo en
estos estudios. La región 1 abarca a los residuos
49-75 de la TPO y comprende la secuencia:
GEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVM. La región 2 abarca a los residuos
157-171 de la TPO y comprende la secuencia:
PTTAVPSRTSLVLTL.
Las secuencias de péptidos R1 y R2 representan
la información crítica requerida para la construcción de moléculas
modificadas de TPO en las cuales uno o más de estos epítopos está
contenido. Igualmente, las secuencias de péptidos R1 y R2
representan la información crítica requerida para la producción de
péptidos tolerogénicos. La regiones R1 y R2 del epítopo son cada
una modalidades de la invención.
Bajo el esquema de la presente invención, los
epítopos están acomodados por mutación para dar como resultado
secuencias que ya no son capaces de funcionar como epítopos de
células T. Es posible utilizar métodos de ADN recombinante para
lograr una mutagénesis dirigida de las secuencias objetivo y muchas
de tales técnicas están disponibles y son bien conocidas en el
arte. De manera general, aquí las muteínas de TPO se construyeron
conteniendo mutaciones dentro de las dos regiones inmunogénicas
identificadas, R1 y R2. Se escogieron los residuos individuales con
base en las propiedades de enlazamiento conocidas de las moléculas
HLA-DR ya que ellos tienen una preferencia casi
exclusiva por un aminoácido hidrófobo en el bolsillo 1 y que éste es
el determinante más importante de enlazamiento del péptido
[Jardetzky, T.S. y colaboradores (1990), EMBO J. 9:
1797-1803; Hill, C.M. y colaboradores (1994) J.
Immunol. 152: 2890-2898]. Un análisis mutacional
exhaustivo identificó a aquellos residuos dentro de estas regiones
que podrían ser alterados sin afectar en forma adversa la actividad
de la proteína de fusión. La escogencia de un residuo alterno fue
una comparación encaminada a otras proteínas de TPO de otras
especies. Los residuos ocultos fueron reemplazados ya sea con
alanina o con residuos no hidrófobos tamaño similar mientras que
los residuos expuestos fueron examinados con todas las alternativas
no hidrófobas posibles.
El método general de la presente invención que
conduce a la TPO modificada comprende las siguientes etapas:
- (a)
- determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido o de parte del mismo;
- (b)
- identificar uno o más epítopos potenciales de células T dentro de la secuencia aminoácidos de la proteína por medio de cualquier método incluida la determinación del enlazamiento de los péptidos a moléculas del MHC utilizando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos. Tales variantes de secuencia se crean de tal forma para evitar la creación de nuevos epítopos potenciales de células T por las variaciones de secuencia a menos que dichos nuevos epítopos potenciales de células T sean, a la vez, modificados de tal forma que reduzcan sustancialmente o eliminen la actividad del epítopo de células T; y
- (c)
- construir tales variantes de secuencia por medio de técnicas de ADN recombinante y analizar dichas variantes con el propósito de identificar una o más variantes con propiedades deseables de acuerdo a técnicas recombinante bien conocidas.
Tomadas juntas, los inventores han sido capaces
de definir proteínas mejoradas de TPO que pueden ser descritas por
medio de la siguiente estructura (M):
X^{1} es A, E;
X^{2} es S, W;
X^{3} es A o T o K, S o M;
X^{4} es A, T;
X^{5} es R, A;
X^{6} es A o T o Q;
X^{7} es A o T o I;
X^{8} es A o T o V;
X^{9} es A o T o S o L;
X^{10} es A o L;
X^{11} es A o S o E;
X^{12} es N o A o T o R o E o D o G o H o P o
K o Q o V;
X^{13} es A o P,
y con lo cual simultáneamente X^{1} = E,
X^{2} = W, X^{3} = M, X^{4} = T, X^{5} = A, X^{6} = Q,
X^{7} = I, X^{8}=V, X^{9} = L, X^{10} = L, X^{11} = E,
X^{12} = V y X^{13} = P están excluidos.
o, alternativamente, proteínas de fusión de la
estructura:
F -
(L)n -
M,
en donde M tiene el significado que
se especificó anteriormente, F es una región constante de una cadena
pesada de inmunoglobulina, preferiblemente una porción de Fc, y L
es una molécula enlazadora opcional (n = 0, 1), preferiblemente un
péptido enlazador que tiene 4-20 residuos de
aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc se deriva de IgG_{4}
humana y puede estar enlazada a su N-terminal a una
región bisagra, que puede ser modificada con el propósito de
reducir la inmunogenicidad o para mejorar otras propiedades
deseadas.
Las siguientes figuras, listado de secuencia y
ejemplos son suministrados para ayudar a la comprensión de la
presente invención. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en
los procedimientos expuestos sin apartarse del espíritu de la
invención.
Para ayudar a la comprensión de la invención, la
Tabla 1 expone a continuación una descripción de la proteína de
fusión de las muteínas de la TPO. La derivación y las propiedades de
estas proteínas se divulgan también más completamente en los
ejemplos.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
Identificación de epítopos de célula T en TPO
(1-174). (A) Se analizaron 20 donantes sanos por la
reactividad con 55 péptidos de 15 mer que se superponen (en 12
aminoácidos) derivados de la secuencia de TPO. Los donantes que
respondieron a los péptidos con un SI>2 fueron analizados
adicionalmente graficando la frecuencia de las respuestas del
donante a cada péptido. Se marcaron las regiones prominentes de
inmunogenicidad de acuerdo al número del residuo aminoácido en la
secuencia lineal de la TPO y se determinaron los péptidos que
indujeron respuestas en 10% de los donantes; sin embargo, se
lograron respuestas límite donde los valores individuales de SI
>1,95 (barras sombreadas) y si dos (o más) péptidos adyacentes
indujeron respuestas en 5% de los donantes (Región 1).
(B) Se encerró en un cajón la secuencia madura de TPO con regiones de inmunogenicidad y se la resaltó con negrilla.
(B) Se encerró en un cajón la secuencia madura de TPO con regiones de inmunogenicidad y se la resaltó con negrilla.
Frecuencia de las respuestas observadas con un
SI>2 en cualquier momento a partir de cohortes de 20 donantes
sanos para cualquiera de los péptidos de la región 1 de tipo natural
y de la región 1 modificada (A); o péptidos de la región 2 de tipo
natural y modificados de la región 2 (B).
Inmunogenicidad de péptidos de una variante de
TPO. Se utilizaron dos cohortes de 20 donantes sanos para analizar
la inmunogenicidad de cualquiera de los péptidos de tipo natural de
la región 1 y modificados de la región 1 (A) o péptidos de tipo
natural de la región 1 y modificados de la región 2 (B). La
proliferación de PBMC fue evaluada por medio de la incorporación de
timidina triatada los días 6, 7, 8 y 9 después de la estimulación y
se calcularon los índices de estimulación.
El clon de muteína ID 102
(M53/F1-L1-M53) que contiene una
única sustitución de aminoácidos M55K muestra una mayor actividad
en un ensayo funcional ya sea de la preparación de TPO de control o
de la contraparte de WT que carecen del dominio Fc. La actividad
funcional se grafica como la CPM medida utilizando el ensayo de
proliferación (Ejemplo 4) versus la concentración de la proteína de
TPO añadida. La proliferación se midió en células
TF-1 utilizando sobrenadantes de cultivo de células
HEK 293 transfectadas con muteína de TPO y TPO WT. Se cuantificaron
los sobrenadantes por medio de ELISA para Fc y se diluyó hasta 320
ng/ml. Se tituló la actividad en diluciones seriales 2X.
Las proteínas modificadas de TPO de la presente
invención fueron elaboradas utilizando técnicas convencionales de
ADN recombinante. El dominio N-terminal de la
proteína fue clonado conteniendo los residuos 1-174.
La secuencia de codificación para TPO (1-174) se
clonó a partir de una biblioteca de ADNc de hígado humano utilizando
PCR. Se utilizó un gen de tipo natural tanto como reactivo de
control como molde a partir del cual derivar las proteínas
modificadas de TPO por medio de mutagénesis dirigida al sitio. Los
genes WT y modificados se insertaron en una versión modificada del
vector de expresión pdC-huFc [Lo K-M
y colaboradores, (1998) Protein Eng 11:495-500]. El
gen que codifica para la TPO fue cortado con XmaI y
XhoI y clonado dentro de una preparación cortada en forma
similar del vector que había sido modificado para que la secuencia
de TPO se fusione al C-terminal de una región Fc
modificada de bisagra/C_{H}2/C_{H}3 de IgG_{4} humana a través
de un enlazador flexible de 15 aminoácidos entre el
C-terminal de la C_{H}3 y el
N-terminal de TPO_{(1-174)}. La
secuencia de aminoácidos del enlazador era la siguiente:
(G)_{4}S(G)_{4}S(G)_{3}SG.
La proteína de fusión expresada tenía una estequiometría de
(bisagra-C_{H}2-C_{H}3-enlazador-TPO_{(1-174)})_{2}.
La construcción final utilizada en este estudio fue designada como
Fc-gama
4-enlazador-TPO (ID del clon 00,
M68/F1-L1-M68).
La secuenciación de ADN se llevó a cabo sobre
todas las construcciones. Esto se realizó en forma diligente para
confirmar la introducción de las sustituciones deseadas y establecer
que no se hayan introducido sustituciones extrañas (no deseadas)
por ejemplo por un error de la PCR.
Las variantes de TPO_{(1-174)}
enlazadas a la porción de Fc de IgG_{4} fueron construidas
conteniendo mutaciones dentro de las dos regiones inmunogénicas de
este dominio de la proteína. Se introdujeron sustituciones deseadas
dentro de la secuencia de TPO por medio de PCR de superposición
utilizando polimerasa HiFi Expand. Los ciclos de análisis
mutacional que involucran el análisis de la construcción y de
función identificaron aquellos residuos dentro de estas regiones
que podían ser alteradas sin afectar en forma adversa la actividad
de la proteína enlazada a Fc. El ensayo de proliferación como se
describió aquí (ver Ejemplo 4) era la principal herramienta de
selección en este aspecto; se identificaron un total de 667 muteínas
diferentes en la TPO con actividad funcional positiva (Tabla
2).
Las transfecciones transitorias se hicieron
utilizando células HEK293 (ATCC# CRL-1573) y
Lipocfetamina 2000 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) como lo
describe el fabricante. Los transfectantes estables fueron
elaborados también células HEK293 y seleccionadas en medio que
contenía concentraciones crecientes de metotrexato. Todas las
líneas celulares se mantuvieron en DMEM más FBS al 10% con
antibióticos y antimicóticos. Las proteínas de fusión a través de
cromatografía sobre Prosep-A seguida por
cromatografía de exclusión (SEC). En resumen, se equilibraron
columnas Prosep®-A de 1 ml (Millipore, Watford, Reino Unido) en PBS
pH 7,4 antes de cargarlas con sobrenadantes de cultivo celular
filtrado a través de 0,2 \muM (hasta 500 ml) a los cuales se les
había ajustado el pH con 1/20 volúmenes de Tris-HCl
pH 7,4. Se lavó la columna con 50 ml de PBS pH 7,4 y se eluyó la
proteína de fusión con amortiguador de citrato 0,1 M pH 3,0 y se
recolectaron fracciones de 0,9 ml. Las fracciones fueron
inmediatamente neutralizadas con 0,1 ml de Tris-HCl
1 M pH 8,0. La SEC se realizó con Superdex 200 (Amersham Pharmacia,
Amersham, Reino Unido) en una columna equilibrada de 3.2/30 y se
corrieron en PBS pH 7,4 que contenía Tween 80 al 0,1%. Se
recolectaron las fracciones que expanden al pico principal y se
cuantificaron las proteínas de fusión utilizando coeficientes de
extinción molar a 280 nm, calculadas utilizando un software
Lasergene^{TM} (Dnastar, Madison, WI, Estados Unidos de
América).
Las concentraciones fueron conformadas utilizando un ensayo para proteína BCA (Pierce, Chester, Reino Unido).
Las concentraciones fueron conformadas utilizando un ensayo para proteína BCA (Pierce, Chester, Reino Unido).
Las proteínas de fusión fueron cuantificadas por
medio de la detección de la cantidad de IgG_{4} Fc humana en un
formato de ELISA de la siguiente manera: las placas de ELISA (Dynex
Immulon4) fueron recubiertas con un anticuerpo específico IgG Fc
antihumano monoclonal de ratón en una dilución de 1/1500 en PBS pH
7,4, 100 \mul/pozo, durante 2 horas a 37ºC. Se lavaron las placas
4 veces con 100 \mul/pozo de PBS/Tween 20 al 0,05%. Se diluyeron
estándares de IgG Humana (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido)
hasta 2 \mug/ml en PBS/BSA al 2% y se hicieron duplicados con
diluciones 2X verticalmente hacia abajo de la placa. Se diluyeron
1/100 y 1/500 las muestras del ensayo en PBS/BSA al 2% y se hicieron
ensayos por duplicado. Se incubó la placa durante 1 hora a
temperatura ambiente y se la lavó como anteriormente. Se hizo la
detección utilizando 100 \mul/pozo de un conjugado de peroxidasa
específico para IgG Fc antihumano de cabra (The Binding Site,
Birmingham, Reino Unido) con una dilución de 1/1000 en PBS, se lavó
la placa como anteriormente y se desarrolló color utilizando
SigmaFast OPD, 100 \mul/pozo (Sigma, Poole, Reino Unido). Se
detuvo la reacción de color por medio de la adición de 50 \mul de
ácido sulfúrico 2 M y se midió la absorbancia a 492 nm en una placa
lectora Anthos HTII.
Se comparó la a actividad funcional de las
proteínas de TPO de Fc utilizando un ensayo de proliferación usando
ya sea la línea celular TF-1 de eritroleucemia, o la
línea celular M0-7e megacariocítica [Avanzi GC y
colaboradores, (1988) British Journal of Haematology; 69:
359-366; Jagerschmidt A, y colaboradores, (1998)
Biochemical Journal; 333: 729-734 y Quentmeier H, y
colaboradores, (1996) Leukemia; 10:297-310]. Se
cultivaron las células en RPMI-1640 (Invitrogen,
Paisley, UK) con suero supremo al 10% (Biowhittaker, Wokingham,
Reino Unido), penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Paisley, Reino
Unido), y GM-CSF (Peprotech, Londres, Reino Unido)
en una concentración de 2 ng/ml para TF-1 y 10
ng/ml para M0-7e.
Para el ensayo, se sembraron células
TF-1 o M0-7e de crecimiento
exponencial en placas de 96 pozos a una concentración de 2 x
10^{4} células por pozo, en medio para ensayo suplementado con
cantidades crecientes de medio acondicionado de células HEK293
transfectadas con el vector que contenía la proteína de interés. Se
utilizó TPO recombinante (Peprotech) con una actividad específica
de 1x10^{6} unidades/mg como un reactivo adicional del control
positivo en estos ensayos. Los ensayos se llevaron a cabo con
concentraciones de TPO en el rango entre 0 y 320 ng/ml, con
diluciones seriales dobles por duplicado de r-hTPO
estándar (Peprotech) y diluciones seriales dobles por triplicado de
variantes de la proteína del ensayo en un medio libre de
antibiótico, en forma horizontal a través de una placa de 96 pozos
con fondo en forma de "U". Se incubaron las placas durante 96
horas a 37ºC y luego se añadió durante la noche 1 \muCi de
timidina con ^{3}H. Se cosecharon las células sobre mapas de
filtración y luego se fundió el sólido centelleante sobre la
esterilla utilizando una placa de calentamiento. Se midieron
entonces los recuentos por minuto (CPM) utilizando un contador de
centelleo MicroBeta Tri Lux. Se graficó CPM versus la concentración
de TPO y se determinó el valor de ED_{50}.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un total de 67 variantes diferentes de TPO
demostraron actividad positiva en el ensayo de proliferación. La
actividad positiva se tomó como un valor de actividad relativa menor
a 10. Se determinó la actividad relativa dividiendo el valor de
ED_{50} derivado para la proteína interés por el valor de
ED_{50} derivado para la proteína de fusión de TPO (WT) del
control (M66/F1-L1-M66). De estas
proteínas activas, 31 eran muteínas que contenía una única
sustitución de aminoácidos; 23 contenían 2 sustituciones de
aminoácidos, 7 contenían 3 sustituciones de aminoácidos y 7
contenían cuatro sustituciones de aminoácidos. La secuencia de cada
una de estas muteínas activas de TPO se suministra en
M1-M67 (F1-L1-M67).
Las actividades relativas de cada muteína en funcionamiento se
suministran en la Tabla 2.
Todas las muestras de sangre utilizada en este
estudio se obtuvieron con la aprobación del Addenbrooke's Hospital
Local Research Ethics Committee. El mapeo del epítopo de la célula T
se llevó a cabo utilizando las PBMC humanas aisladas de la sangre
obtenida del National Blood Transfusion Service (Addenbrooke's
Hospital, Cambridge, Reino Unido). Las PBMC de 20 donantes sanos
fueron aisladas por medio de centrifugación en gradientes de
densidad sobre Ficoll y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se
clasificó el tejido de cada donante utilizando un kit para
clasificación de tejido con base en la PCR de Allset^{TM} (Dynal)
y los ensayos con células T se llevaron a cabo seleccionando los
donantes de acuerdo a los haplotipos individuales del MHC. Los
péptidos de 15 mer alternados por tres aminoácidos y la expansión
de la secuencia de la TPO humana entre los residuos
1-177 fueron adquiridos a Pepscan Systems BV (NL).
Utilizando este esquema, se requirieron un total de 55 péptidos para
explorar los residuos de interés de TPO. El número del péptido y de
la secuencia de estos péptidos se suministra en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada muestra de los donantes, las PBMC
fueron descongeladas y resuspendidas en AIM-V
(Invitrogen) que contenía 100 unidades/ml de penicilina, 100 ug/ml
de estreptomicina y glutamina 1 mM. Se incubaron cultivos por
triplicado de 2x10^{5} PBMC/pozo de una placa de 96 pozos de fondo
plano con péptidos con una concentración final de 1 \muM y 10
\muM. Se recogieron los cultivos sobre esterillas filtrantes de
fibra de vidrio utilizando un recolector de placa Tomtec Mach III y
los valores de cpm se determinaron por medio de recuento de
centelleo utilizando un lector de placa Wallac Microbeta
TriLux.
Los resultados de estos ensayos son descritos en
la Figura 1. Se determinaron las regiones de inmunogenicidad
(Figura 1A) por medio de la identificación de los péptidos que
indujeron a los donantes a responder con índices de estimulación
\geq2 y por medio de la determinación de la velocidad de respuesta
del donante para cada péptido. Los péptidos localizados dentro de
dos regiones separadas fueron capaces de inducir la proliferación
de células T. La región 1 abarca a los residuos
49-75 de la TPO/y comprende la secuencia:
GEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVM y equivalente a los péptidos
17-21. Las respuestas del donante a la región 1
están en el rango de 13% a 17%. La región 2 abarca los residuos
157-171 de la TPO y comprende la secuencia:
PTTAVPSRTSLVLTL (péptido 53). La velocidad de
respuesta del donante a la región 2 fue del 13% (Figura 1B). Cada
donante fue también analizado por su habilidad para responder a dos
péptidos de control positivo de la influenza tipo A, la
hemaglutinina, aminoácidos 307-319 [Krieger JI, y
colaboradores (1991) Journal of Immunology; 146:
2331-2340] y clamidia HSP60, aminoácidos
125-140 [Cerrone MC, y colaboradores (1991)
Infection and Immacnity; 59: 79-90]. También se
utilizó como control la hemocianina de lapa ojo de cerradura, un
bien documentado antígeno potente de células T.
Se establecieron cultivos en volumen de
2-4x10^{6} PBMC/pozo a partir de 20 muestras de
donantes sanos en placas de 24 pozos. Se incubaron las células
durante 6 a 9 días con péptidos WT y variantes que abarcan las
regiones inmunogénicas (ver Tabla 4). Se evaluó la proliferación de
células T por medio de la incorporación de timidina tritiada los
días 6,7, 8 y 9. Se evaluó la proliferación en cada punto del
tiempo, resuspendiendo suavemente los cultivos en volumen y
removiendo las muestras de PBMC, que fueron incubadas luego en pozos
por triplicado de una placa de 96 pozos con fondo en forma de U,
con 1 \muCi/pozo de timidina tritiada durante 18 horas como se
describió anteriormente.
Se utilizó un ensayo con el transcurso del
tiempo para analizar péptidos variantes que contienen sustituciones
sobre WT. Las sustituciones se hicieron en ubicaciones clave donde
se esperaba que la sustitución evitara el enlazamiento al MHC clase
II y por lo tanto, la subsiguiente proliferación de células T en el
ensayo. Se hicieron sustituciones particulares con base en la
información de la estructura cristalina del dominio de citoquina de
la TPO [Feese M.D. y colaboradores (2004) Proc. Natl. Acad. Sci
(USA); 101: 1816-1821] y varios modelos de motivos
de enlazamiento del MHC clase II. Las mutaciones favorecidas fueron
grandes residuos básicos tales como arginina o lisina, pero donde
los modelos estructurales predijeron severas afectaciones sobre la
estructura de la proteína utilizamos en cambio alanina. Para la
Región 2 utilizamos cuatro alternativas diferentes para un locus ya
que únicamente identificamos un residuo importante para estudios de
mutagénesis en esa secuencia.
Se sintetizaron los péptidos que contienen las
mutaciones: M55K, T58R A60R, D62R, L69A, L70A para la región 1, y
V161A, V161N, V161R y V161T para la región 2 (Tabla 4).
Los resultados de este análisis se muestran en
las Figuras 2 y 3. Las Figuras 2A y 3A muestran que 15% de los 20
donantes respondieron a la secuencia original de la región 1 y T58R.
En contraste, ninguno de los donantes respondió a las secuencias
mutadas que contenían las mutaciones M55K o A60R. Las Figuras 2B y
3B muestran que 25% de los 20 donantes respondieron a la secuencia
original de la región 2 y V161T. En contraste, ninguno de los
donantes respondió a las secuencias mutadas que contenían las
mutaciones V161A o V161R.
Se analizaron las variantes no inmunogénicas con
actividad proliferativa tanto para la región 1 del epítopo como la
región 2 del epítopo. Se cuantificaron los sobrenadantes por medio
de ELISA de Fc y se diluyó hasta 160 ng/ml. Se tituló la actividad
de la proteína en una dilución serial 2X y se la analizó en el
ensayo de proliferación de células TF-1. Aquellos
cambios que produjeron \geq100% de actividad de tipo natural, y
que abrogaron la respuesta proliferativa tanto a la región 1 como a
la región 2, son las modalidades más preferidas de la presente
invención. Los valores de actividad relativa para todas las muteínas
funcionales se enlistan en la Tabla 2.
Una muteína preferida adicional de TPO es el
clon ID 102 # (M52 / F1-L1-M52) que
contiene la sustitución M55K. La sustitución M55K sorprendentemente
mostró que produce un incremento benéfico en la potencia de la
molécula. Este efecto es demostrado en la Figura 4 en donde se
gráfica la actividad en el ensayo de proliferación de
TF-1 versus la concentración de proteína. El clon de
la muteína ID # 102 mostró una actividad significativamente mayor
en este ensayo funcional que en la contraparte WT o en una
preparación de control de TPO que carece del dominio Fc.
La Tabla 5 provee un listado de las actividades
relativas de las muteínas más preferidas de la invención. Las
actividades relativas se derivan dividiendo los valores de ED_{50}
anotados para la proteína del ensayo, por aquel de la TPO WT
enlazada a Fc gama 4
(M68/F1-L1-M68). Una actividad
relativa de 1,0 o menor representa una proteína con igual o mejor
actividad que WT. Los valores mayores a 1,0 indican una actividad
inferior. La actividad relativa de la TPO humana recombinante WT de
longitud completa (r-hTPO) también es suministrada.
Todos los valores son el promedio de al menos tres determinaciones
separadas.
Un ejemplo adicional de una molécula
especialmente preferida de la invención con actividad
significativamente mejorada suministrada por la muteína de TPO
contiene al grupo de sustitución M55K, A60R, V161A
(M67/F1-L1-M67). Esta proteína es
muy potente en el ensayo de TF-1 con una actividad
relativa de alrededor de 0,4.
Aunque la muteína M55K, A60R, V161A
(M67/F1-L1-M67) es claramente una
molécula muy potente, esta muteína no es tan activa como la muteína
que contiene únicamente las sustituciones M55K y A60R
(M66/F1-L1-M66). Esta muteína
demuestra una actividad relativa de 0,2.
Algunas de las muteínas con dos o más
sustituciones fueron analizadas entonces en los ensayos de
proliferación de TF-1 y M0-7e. Se
encontró que una proteína más preferida de la invención Fc gama
4-L-TPO (A60R V161A)
(M1/F1-L1-M1) retenía actividad
completa. Se comparó la actividad de esta molécula tanto con una
molécula WT TPO 1-174 enlazada a Fc gama 4
(M68/F1-L1-M68), como con una
preparación de (r-hTPO) humana recombinante de
longitud completa (PeproTech, Londres, Reino Unido). Los resultados
se muestran en la Tabla 6.
En células TF-1, la proteína de
fusión nativa, tiene un valor de ED_{50} de 12,0 ng/ml. En células
M0-7e, la proteína de fusión nativa, tiene un valor
de ED_{50} de 25,0 ng/ml. En contraste, ha sido algo sorprendente
encontrar que la molécula más preferida de la invención
(M1/F1-L1-M1) tiene un valor de
ED_{50} en células TF-1 de 11,5 ng/ml y en
células M0-7e un valor de ED_{50} de 18,0 ng/ml.
Dado que esta molécula es una muteína de TPO, estos resultados
indican que los cambios a la secuencia han tenido un efecto benéfico
sobre la actividad funcional directa.
La potencia mejorada en la molécula atribuida a
la naturaleza dimérica de la proteína en virtud del dominio Fc se
demuestra por medio de la comparación de los valores de ED_{50}
encontrados utilizando la molécula de TPO humana de tamaño completo
(no enlazada a Fc) en ensayos de proliferación con base en
TF-1 y E0-7e (Tabla 6). La TPO
humana recombinante monomérica (r-hTPO) logra un
ED_{50} de 29,5 ng/ml utilizando células TF-1 y
de 70,0 ng/ml utilizando células M0-7e. Una molécula
más preferida de la invención demuestra por lo tanto una actividad
mejorada aproximadamente entre 2,5-4,0 veces sobre
la r-hTPO.
La Tabla 6 provee una comparación de los valores
de ED_{50} anotados tanto en células TF-1 como
M0-7e: los valores mostrados son para la muteína de
TPO enlazada a Fc gama 4 A60R V161A
(M1/F1-L1-M1), la contraparte
enlazada a Fc WT (M68/F1-L1-M68) y
una TPO humana recombinante WT de longitud completa
(r-hTPO). Cada valor es el promedio de tres
mediciones separadas.
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Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Una molécula de TPO humana
modificada que tiene la fórmula/estructura (M)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 50 es Ala,
Glu.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)..(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 51 es Ser,
Trp.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (55)..(55)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 55 es Ala o Thr
o Lys, Ser o Met.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 58 es Ala,
Thr.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (60)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 60 es Arg,
Ala.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 61 es Ala o Thr
o Gln.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (63)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 63 es Ala o Thr
o Ile.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(67)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 67 es Ala o Thr
o Val.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (69)..(69)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 69 es Ala o Thr
o Ser o Leu.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 71 es Ala o
Leu.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 72 es Ala o Ser
o Glu.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (161)..(161)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 161 es Asn o Ala
o Thr o Arg o Glu o Asp o Gly o His o Pro o Lys o Gln o Val.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (162)..(162)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la ubicación 162 es Ala o
Pro.
\newpage
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<400> 1
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<210> 2
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 3
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<211> 174
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> TPO humana modificada, forma
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<212> PRT
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<213> Artificial
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truncada 1 - 174
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<213> Artificial
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<400> 108
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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epítopos inmunogénicos con TPO
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epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<223> Péptido utilizado para mapear
epítopos inmunogénicos con TPO
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Región del Epítopo de la Región R1
Inmunogénica de TPO Humana
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R1 Inmunogénica de TPO Humana
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R1 Inmunogénica de TPO Humana
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<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R1 Inmunogénica de TPO Humana
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<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R1 Inmunogénica de TPO Humana
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R1 Inmunogénica de TPO Humana
\newpage
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<400> 132
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<210> 133
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<213> Artificial
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<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R1 Inmunogénica de TPO Humana
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<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región del Epítopo de la Región R2
Inmunogénica de TPO Humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R2 Inmunogénica de TPO Humana
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<210> 136
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R2 Inmunogénica de TPO Humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
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<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R2 Inmunogénica de TPO Humana
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Modificada de la Región
del Epítopo de la Región R2 Inmunogénica de TPO Humana
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<400> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del Enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
Claims (11)
1. Una proteína de fusión de la estructura
F -
(L)n -
M,
que tiene esencialmente la misma
especificidad y actividad biológica de la TPO humana, que comprende
una región constante (F) de una cadena pesada de inmunoglobulina y
una molécula de TPO humana (M) en una forma truncada
(1-174) modificada por una o más sustituciones de
aminoácidos, en donde dicha proteína de fusión es sustancialmente
no inmunogénica o menos inmunogénica que la proteína de fusión madre
que comprende a la TPO humana no modificada, y dichas sustituciones
de aminoácidos han sido llevadas a cabo en una o más de las pistas
de la
secuencia
- (i)
- GEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVM,
- (ii)
- PTTAVPSRTSLVLTL
dentro de la molécula de TPO natural truncada y
que causa una reducción o una eliminación de uno o más de los
epítopos de la célula T, que actúan en la molécula madre de fusión
no modificada como ligandos de enlazamiento del MHC clase II y
estimulan a las células T,
dicha región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina se fusiona directamente (n = 0) o indirectamente (n
= 1) a través de una molécula enlazadora (L) a dicha molécula
modificada de TPO humana (M).
2. Una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 1, en donde F es un dominio Fc.
3. Una proteína de fusión de la reivindicación
1 ó 2, en donde F comprende una región de bisagra.
4. Una proteína de fusión de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el
C-terminal del dominio de la región constante de una
cadena pesada de inmunoglobulina humana se enlaza directamente o
indirectamente al N-terminal de la molécula
modificada de TPO.
5. Una proteína de fusión de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde
dicha molécula modificada de TPO contiene una o más de las
sustituciones de aminoácidos
M55K, A60R y V161A
con las pistas de las secuencias (i) - (ii).
6. Una proteína de fusión de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde
dicha molécula de TPO en dicha proteína de fusión tiene la fórmula
/ estructura:
en
donde
X^{1} es A, E;
X^{2} es S, W;
X^{3} es A o T o K, S o M;
X^{4} es A, T;
X^{5} es R, A;
X^{6} es A o T o Q;
X^{7} es A o T o I;
X^{8} es A o T o V;
X^{9} es A o T o S o L;
X^{10} es A o L;
X^{11} es A o S o E;
X^{12} es N o A o T o R o E o D o G o H o P o
K o Q o V;
X^{13} es A o P,
y con lo cual simultáneamente X^{1} = E,
X^{2} = W, X^{3} = M, X^{4} = T, X^{5} = A, X^{6} = Q,
X^{7} = I, X^{8}=V, X^{9} = L, X^{10} = L, X^{11} = E,
X^{12} = V y X^{13} = P están excluidos.
7. Una proteína de fusión de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde F
está en el dominio Fc de IgG_{4} humana.
8. Una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 7, en donde L es un péptido enlazador que tiene
4-20 residuos de aminoácidos.
9. Una proteína de fusión de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1-8,
seleccionada del grupo que consiste de F - M 1 a F - M67,
F-L-M1 a
F-L-M67, y
F1 -L-M1 a
F1-L1-M67,
en donde F es una región constante de una cadena
pesada de inmunoglobulina, L es un péptido enlazador, F1 es un
dominio Fc de IgG_{4} humana que comprende una región modificada
de bisagra, L1 es un péptido enlazador que tiene la secuencia
GAGGGGSGGGGSGGGSG, y M1-M67 son secuencias
modificadas de TPO como se especifica en la Tabla A1.
10. Una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 9 seleccionada del grupo que consiste de
F-M1,
F-L-M1,
F1-L1-M1
F-M66,
F-L-M66,
F1-L1-M66, y
F-M67,
F-L-M67,
F1-L1-M67.
11. Una proteína de fusión dimérica que
comprende dos cadenas idénticas de una proteína de fusión monomérica
de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones
1-10.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03014331 | 2003-06-26 | ||
| EP03014331 | 2003-06-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2289528T3 true ES2289528T3 (es) | 2008-02-01 |
Family
ID=33547598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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