ES2290142T3

ES2290142T3 - Metodos para replegamiento de proteinas que contiene residuos de cisteina libre.

Info

Publication number: ES2290142T3
Application number: ES01941504T
Authority: ES
Inventors: Mary S. Rosendahl; George N. Cox; Daniel H. Doherty
Original assignee: Bolder Biotechnology Inc
Current assignee: Bolder Biotechnology Inc
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-16
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2021-05-16
Also published as: CN1443194A; US20040018586A1; IL152804A0; US20090269804A1; EP1284987A2; CN1318443C; WO2001087925A3; WO2001087925A2; IL152804A; NZ522847A; US7306931B2; JP4873818B2; DE60129432D1; ATE367398T1; CA2408851A1; JP2004508014A; JP2011173911A; EP1284987B1; US8932828B2; HK1050014A1

Abstract

Método para preparar una forma replegada, soluble de una proteína insoluble o agregada que es un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento y que contiene uno o más residuos de cisteína libre añadidos, que comprende las etapas de: a) hacer que una célula huésped exprese una proteína que contiene uno o más residuos de cisteína libre añadidos que es un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento en una forma insoluble o agregada; b) lisar las células por medios químicos, enzimáticos o físicos; c) solubilizar y reducir la proteína insoluble o agregada exponiendo la proteína insoluble o agregada a un agente desnaturalizante, un agente reductor y un agente bloqueante de cisteína; y d) replegar la proteína reduciendo las concentraciones del agente desnaturalizante y los agente reductores hasta niveles suficientes para permitir que la proteína se renaturalice en una forma soluble, biológicamente activa, en la que dicho agente bloqueante de cisteína forma un disulfuro mixto reversible con al menos un residuo de cisteína libre en dicha proteína.

Description

Métodos para replegamiento de proteínas que contienen residuos de cisteína libre.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos para preparar proteínas y más específicamente a proteínas recombinantes que contienen al menos un residuo de cisteína "libre", es decir, un residuo de cisteína que no participa en un enlace disulfuro.

Antecedentes de la invención

Los productos terapéuticos de proteína deben administrarse generalmente a los pacientes mediante inyección. La mayoría de los productos terapéuticos de proteína se eliminan rápidamente del organismo, necesitando inyecciones frecuentes, a menudo diarias. Existe un considerable interés en el desarrollo de métodos para prolongar las semividas de circulación de los productos terapéuticos de proteína en el organismo, de modo que las proteínas no tengan que inyectarse frecuentemente. Se ha probado que la modificación covalente de proteínas con polietilenglicol (PEG) es un método útil para prolongar las semividas de circulación de proteínas en el organismo (Abuchowski et al., 1984; Hershfield, 1987; Meyers et al., 1991). La unión covalente de PEG a una proteína aumenta el tamaño efectivo de la proteína y reduce su tasa de eliminación del organismo. Las PEG están disponibles en varios tamaños, lo que permite adaptar las semividas de circulación de las proteínas modificadas con PEG a indicaciones individuales mediante el uso de PEG de diferentes tamaños. Otros beneficios in vivo documentados de la modificación con PEG son un aumento en la solubilidad y estabilidad de la proteína y una disminución en la inmunogenicidad de la proteína (Katre et al., 1987; Katre, 1990).

Un método conocido para pegilar proteínas, une covalentemente PEG a residuos de cisteína usando PEG reactivos con cisteína. Están disponibles comercialmente varios PEG altamente específicos, reactivos con cisteína con diferentes grupos reactivos (por ejemplo, maleimida, vinilsulfona) y PEG de diferente tamaño (2-40 kDa, cadena lineal o ramificada). A pH neutro, estos reactivos de PEG se unen selectivamente a residuos de cisteína "libre", es decir, residuos de cisteína no implicados en enlaces disulfuro. Los residuos de cisteína en la mayoría de proteínas participan en enlaces disulfuro y no están disponibles para la pegilación usando PEG reactivo con cisteína. A través de mutagénesis in vitro usando técnicas de ADN recombinante, pueden introducirse residuos de cisteína adicionales en cualquier parte de la proteína. Las cisteínas "libres" o "no naturales" recién añadidas pueden servir como sitios para la unión específica de una molécula de PEG usando PEG reactivo con cisteína. El residuo de cisteína "libre" o "no natural" puede ser una sustitución para un aminoácido existente en una proteína, añadido precediendo al extremo amino-terminal de la proteína madura o después del extremo carboxilo-terminal de la proteína madura, o insertado entre dos aminoácidos normalmente adyacentes en la proteína. Alternativamente, una de las dos cisteínas implicadas en un enlace disulfuro nativo puede delecionarse o sustituirse por otro aminoácido, dejando una cisteína nativa (el residuo de cisteína en la proteína que normalmente formaría un enlace disulfuro con el residuo de cisteína delecionado o sustituido) libre y disponible para la modificación química. Preferiblemente, el aminoácido sustituido por la cisteína sería un aminoácido neutro tal como serina o alanina. Por ejemplo, la hormona de crecimiento humana (HCh) tiene dos enlaces disulfuro que pueden reducirse y alquilarse con yodoacetamida sin alterar la actividad biológica (Bewley et al., (1969)). Cada una de las cuatro cisteínas serían dianas razonables para la deleción o sustitución por otro
aminoácido.

Se sabe que varias proteínas que se producen de manera natural contienen uno o más residuos de cisteína "libre". Ejemplos de tales proteínas que se producen de manera natural incluyen interleucina (IL)-2 humana (Wang et al., 1984), interferón beta (Mark et al., 1984; 1985), G-CSF (Lu et al., 1989) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF, Thompson, 1992). La IL-2, el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) y el interferón beta (IFN-\beta) contienen un número impar de residuos de cisteína, mientras que el factor de crecimiento básico de fibroblastos contiene un número par de residuos de cisteína.

La expresión de proteínas recombinantes que contienen residuos de cisteína libre ha sido problemática debido a la reactividad del sulfhidrilo libre en condiciones fisiológicas. Varias proteínas recombinantes que contienen cisteínas libres se han expresado citoplásmicamente, es decir, como proteínas intracelulares, en bacterias tales como E. coli. Los ejemplos incluyen proteínas naturales tales como IL-2, interferón beta, G-CSF, y muteínas de cisteína diseñadas de IL-2 (Goodson y Katre, 1990), IL-3 (Shaw et al., 1992), proteína de unión al factor de necrosis tumoral (Tuma et al., 1995), factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-I, Cox y McDermott, 1994), proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP-1, Van Den Berg et al., 1997) y proteasa nexina y proteínas relacionadas (Braxton, 1998). Todas estas proteínas eran predominantemente insolubles cuando se expresaban intracelularmente en E. coli. Las proteínas insolubles eran en gran medida inactivas y necesitaban replegarse con el fin de recobrar una actividad biológica significativa. En algunos casos, se usó el agente reductor ditiotreitol (DTT) para ayudar en la solubilización y/o replegamiento de las proteínas insolubles. Las proteínas purificadas, replegadas IL-2, G-SCF e interferón beta son inestables y pierden actividad a pH fisiológico, aparentemente debido a transposiciones de disulfuro que implican al residuo de cisteína libre (Wang et al., 1984; Mark et al., 1984; 1985; Oh-eda et al., 1990; Arakawa et al., 1992). La sustitución del residuo de cisteína libre en estas proteínas por serina, dio como resultado una proteína que era más estable a pH fisiológico (Wang et al., 1984; Mark et al., 1984; 1985; Arakawa et al., 1993).

Un segundo método conocido para expresar proteínas recombinantes en bacterias es secretarlas en el espacio periplásmico o en el medio. Se sabe que ciertas proteínas recombinantes tales como GH se expresan en una forma activa soluble cuando se secretan en el periplasma de E. coli, mientras que son insolubles cuando se expresan intracelularmente en E. coli. La secreción se consigue fusionando secuencias de ADN que codifican para GH u otras proteínas de interés a secuencias de ADN que codifican para secuencias señal bacterianas tales como las derivadas de las proteínas stII (Fujimoto et al., 1988) y ompA (Ghrayeb et al., 1984). La secreción de proteínas recombinantes en bacterias es deseable porque el extremo N-terminal de la proteína recombinante puede mantenerse. La expresión intracelular de proteínas recombinantes requiere que esté presente una metionina N-terminal en el extremo amino-terminal de la proteína recombinante. Normalmente, la metionina no está presente en el extremo amino-terminal de las formas maduras de muchas proteínas humanas. Por ejemplo, el aminoácido amino-terminal de la forma madura de la GH humana es fenilalanina. Debe añadirse una metionina amino-terminal al extremo amino-terminal de una proteína recombinante si no está presente una metionina en esta posición, con el fin de que la proteína se exprese eficazmente en bacterias. Normalmente, se consigue la adición de la metionina amino-terminal añadiendo un codón de metionina ATG precediendo a la secuencia de ADN que codifica para la proteína recombinante. La metionina N-terminal añadida a menudo no se elimina de la proteína recombinante, particularmente si la proteína recombinante es insoluble. Tal es el caso de la HCh, en la que la metionina N-terminal no se elimina cuando la proteína se expresa intracelularmente en E. coli. La metionina N-terminal añadida crea una proteína "no natural" que puede estimular potencialmente una respuesta inmunitaria en un ser humano. En cambio, no hay ninguna metionina añadida en la HCh que se secreta en el espacio periplásmico usando las secuencias señal de stII (Chang et al., 1987) u ompA (Cheah et al., 1994); la proteína recombinante comienza con el aminoácido amino-terminal nativo fenilalanina. La secuencia de la proteína HCh nativa se mantiene porque enzimas bacterianas escinden la proteína stII-HCh (o la proteína ompA-HCh) entre la secuencia señal de stII (u ompA) y el inicio de la proteína HCh
madura.

HCh tiene cuatro cisteínas que forman dos disulfuros. HCh puede secretarse en el periplasma de E. coli usando las secuencias señal de stII u ompA. La proteína secretada es soluble y biológicamente activa (Hsiung et al., 1986). La forma secretada predominante de HCh es un monómero con un peso molecular aparente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) de 22 kDa. HCh recombinante puede aislarse a partir del espacio periplásmico usando un procedimiento de choque osmótico (Koshland y Botstein, 1980), que libera preferentemente proteínas periplásmicas, pero no intracelulares, en el tampón de choque osmótico. La proteína HCh liberada se purifica entonces mediante cromatografía en columna (Hsiung et al., 1986). Se ha secretado un gran número de mutantes de GH en el periplasma de E. coli. Las proteínas mutantes secretadas eran solubles y pudieron purificarse usando procedimientos similares a los usados para purificar GH de tipo natural (Cunningham y Wells, 1989; Fuh et al., 1992). De manera imprevista, cuando se usaron procedimientos similares para secretar variantes de GH que contenían un residuo de cisteína libre (cinco cisteínas; 2N + 1), se descubrió que ciertas variantes de GH recombinantes eran insolubles o formaban multímeros o agregados cuando se aislaron usando procedimientos de choque osmótico y de purificación convencionales desarrollados para GH. Una cantidad muy reducida de las proteínas monoméricas variantes de GH podrían ser detectadas por SDS-PAGE no reducido en los lisados de choque osmótico. Las variantes de GH insolubles o agregadas tienen actividades biológicas reducidas comparadas con HCh soluble, plegada apropiadamente. No se han descrito métodos para el replegamiento de variantes de la hormona de crecimiento secretadas que contienen un residuo de cisteína libre en una forma biológicamente activa.

El interferón alfa (IFN-\alpha2) también contiene cuatro residuos de cisteína que forman dos enlaces disulfuro. Puede secretarse IFN-\alpha2 en el periplasma de E. coli usando la secuencia señal de stII (Voss et al., 1994). Una parte de la proteína secretada es soluble y biológicamente activa (Voss et al., 1994). Puede purificarse IFN-\alpha2 secretado, soluble mediante cromatografía en columna (Voss et al., 1994). Cuando se intentaron procedimientos similares para secretar variantes de IFN-\alpha2 que contenían un residuo de cisteína libre (cinco cisteínas; 2N+1), se descubrió que ciertas de las variantes de IFN-\alpha2 recombinantes eran predominantemente insolubles o formaban multímeros o agregados cuando se aislaron usando procedimientos de purificación convencionales desarrollados para IFN-\alpha2. Las variantes de IFN-\alpha2 insolubles o agregadas tienen actividades biológicas reducidas comparadas con IFN-\alpha2 soluble, plegado apropiadamente. No se han descrito métodos para el replegamiento de variantes de IFN-\alpha2 insolubles, secretadas que contienen un residuo de cisteína libre en una forma biológicamente activa.

El factor estimulante de colonias de granulocitos humano (G-CSF) contiene cinco residuos de cisteína que forman dos enlaces disulfuro. El residuo de cisteína en la posición 17 de la secuencia de la proteína madura está libre. Pérez-Pérez et al. (1995) informaron que G-CSF podría secretarse en el periplasma de E. coli usando una forma variante de la secuencia señal de ompA. Sin embargo, muy poco de la proteína de fusión ompA-G-CSF se procesó correctamente para producir G-CSF madura. El porcentaje de G-CSF procesado correctamente podría mejorarse mediante la expresión conjunta de las proteínas dnaK y dnaJ de E. coli en las células huésped que expresaban la proteína de fusión ompA-G-CSF (Pérez-Pérez et al., 1995). G-CSF correctamente procesado, secretado era en gran medida insoluble en todas las cepas de E. coli examinadas (Pérez-Pérez et al., 1995). G-CSF insoluble posee actividad biológica reducida comparado con G-CSF soluble, plegado apropiadamente. Cuando se intentaron procedimientos similares para secretar G-CSF de tipo natural, las variantes de G-CSF en las que se sustituyó el residuo de cisteína libre por serina [G-CSF (C17S)], y las variantes de G-CSF (C17S) que contenían un residuo de cisteína libre (cinco cisteínas; 2N+1) usando la secuencia señal de stII, se descubrió que las proteínas G-CSF recombinantes eran predominantemente insolubles. No se han descrito métodos para el replegamiento de proteínas G-CSF insolubles, secretadas en una forma biológicamente activa.

El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humano (GM-CSF) contiene cuatro residuos de cisteína que forman dos enlaces disulfuro. Libbey et al. (1987) y Greenberg et al. (1988) informaron que GM-CSF podría secretarse en el periplasma de E. coli usando la secuencia señal de ompA. GM-CSF correctamente procesado, secretado era insoluble (Libbey et al., 1987; Greenberg et al., 1988). GM-CSF insoluble posee actividad biológica reducida comparado con GM-CSF soluble, replegado apropiadamente. Cuando se intentaron procedimientos similares para secretar variantes de GM-CSF que contenían un residuo de cisteína libre (cinco cisteínas; 2N+1) usando la secuencia señal de stII, se descubrió que las proteínas GM-CSF recombinantes también eran predominantemente insolubles. No se han descrito métodos para el replegamiento de proteínas GM-CSF insolubles, secretadas en una forma biológicamente activa.

La patente estadounidense número 5.206.344 y Goodson y Katre (1990) describen la expresión y purificación de una muteína por sustitución de cisteína de IL-2. La muteína de cisteína de IL-2 era insoluble cuando se expresaba intracelularmente en E. coli. Se solubilizó la proteína mediante tratamiento con un agente desnaturalizante [o bien dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS) o bien urea 8M] y un agente reductor [ditiotreitol 100 mM (DTT)], se replegó y se purificó mediante cromatografía de exclusión molecular y HPLC en fase inversa. Se describe la expresión y purificación de muteínas de cisteína de IL-3 en la patente estadounidense número 5.166.322. Las muteínas de cisteína de IL-3 también eran insolubles cuando se expresaban intracelularmente en E. coli. Las proteínas se solubilizaron con un agente desnaturalizante (guanidina) y un agente reductor (DTT), se replegaron y se purificaron mediante HPLC en fase inversa. Las muteínas de cisteína de IL-3 purificadas se mantuvieron en un estado parcialmente reducido mediante la inclusión de DTT en los tampones de almacenamiento. Cuando los inventores usaron sólo un agente desnaturalizante y un agente reductor (DTT) para desnaturalizar y replegar muteínas de cisteína insolubles de GH y G-CSF, se descubrió que las proteínas replegadas eran heterogéneas, comprendiendo especies de múltiples pesos moleculares. De manera similar, cuando los inventores desnaturalizaron y replegaron muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 insolubles, secretadas con sólo un agente desnaturalizante y un agente reductor (DTT), se obtuvieron niveles indetectables de muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 plegado apropiadamente.

Malik et al. (1992) y Knusli et al. (1992) describieron la conjugación de GM-CSF de tipo natural con reactivos de PEG reactivos para amina. El GM-CSF pegilado reactivo para amina comprende una mezcla heterogénea de especies de PEG-GM-CSF de diferente peso molecular modificadas en múltiples residuos de aminoácidos (Malik et al. 1992; Knusli et al., 1992). Las diversas especies de GM-CSF pegiladas reactivo para amina no pudieron purificarse entre sí o de GM-CSF no pegilado mediante métodos de cromatografía convencionales, lo que impidió que se determinaran las mediciones de actividad específica de las diversas isoformas. Clark et al. (1996) describieron la conjugación de GH con PEG reactivo para amina. La GH pegilada reactivo para amina también era heterogénea, comprendiendo una mezcla de especies de múltiple peso molecular modificadas en múltiples residuos de aminoácidos. Las proteínas GH pegiladas reactivo para amina mostraron una actividad biológica significativamente reducida (Clark et al., 1996).

Monkarsh et al. (1997) describieron interferón alfa pegilado reactivo para amina, que también comprendía especies de múltiple peso molecular modificadas en diferentes residuos de aminoácidos. El interferón alfa pegilado reactivo para amina mostró una actividad biológica reducida. Tanaka et al (1991) describieron G-CSF pegilado reactivo para amina, que también comprendía una mezcla heterogénea de especies de diferente peso molecular modificadas en diferentes residuos de aminoácidos. G-CSF pegilado reactivo para amina mostraba una actividad biológica reducida (Tanaka et al, 1991). Kinstler et al (1996) describieron una proteína G-CSF pegilada reactiva para amina que está modificada preferentemente en el residuo de metionina N-terminal no natural. Esta proteína también mostraba una actividad biológica reducida (Kinstler et al, 1996).

Tanto el documento WO 94/12219 A como el documento WO 95/32003A describen el replegamiento de muteínas de cisteína de IGF-I usando un procedimiento esencialmente tal como el que sigue. En primer lugar, se solubiliza la proteína IGF-I insoluble con un agente desnaturalizante (guanidina) y uno reductor (DTT). Esto desnaturaliza y reduce la proteína, pero no bloquea los residuos de cisteína. Tras la etapa de solubilización, se centrifuga la disolución para eliminar las proteínas insolubles. Se repliega la proteína usando un procedimiento en múltiples etapas. En primer lugar, se añade a la mezcla un exceso molar de glutationina oxidada (en relación con el agente reductor). La glutationina oxidada en exceso crea un entorno oxidante y reacciona con todas las cisteínas de la proteína para formar disulfuros mixtos y bloquearlos. La proteína desnaturalizada está completamente oxidada. Se diluye entonces la disolución y se añade un exceso molar (en relación con la glutationina) de un segundo agente reductor que es también un agente bloqueante de cisteína (cisteína). Tras la dilución, la proteína comenzará a replegarse. El segundo agente reductor/agente bloqueante de cisteína (cisteína) favorecerá el intercambio de disulfuro. Finalmente, las cisteínas nativas se reformarán porque son más estables que los disulfuros mixtos. La proteína replegada contendrá los disulfuros nativos y el residuo de cisteína libre, que está en forma de un disulfuro mixto.

El documento EP 0 355 460 A enseña la modificación irreversible de la hormona de crecimiento de tipo natural (conocida también como somatotropina) con yodoacetamida. También se describen mutantes de la hormona de crecimiento, formados mediante la sustitución de residuos de cisteína en la proteína por residuos que no son cisteína.

Tanto el documento EP 0 312 358 A como el documento WO 94/01453 se refieren a la producción de proteínas de tipo natural recombinantes mediante la solubilización de las proteínas con un agente desnaturalizante y un agente oxidante. El agente desnaturalizante preferido es dodecilsulfato de sodio (SDS) y el agente oxidante preferido es cistina.

Por tanto, a pesar del considerable esfuerzo, existe todavía una necesidad de métodos que permitan replegar una proteína insoluble o agregada que contiene uno o más residuos de cisteína libre en una forma soluble, biológicamente activa con alto rendimiento. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas. De manera similar, existe también una necesidad de métodos para generar preparaciones homogéneas de proteínas recombinantes de actuación a largo plazo mediante el aumento del peso molecular de la proteína tal como mediante pegilación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos para obtener formas de proteínas replegadas, solubles que tienen uno o más residuos de cisteína libre y que se expresan mediante una célula huésped en una forma insoluble o agregada. En la presente invención, se proporciona un método para preparar una forma soluble, replegada de una proteína insoluble o agregada que es un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento y que contiene uno o más residuos de cisteína libre añadidos, que comprende las etapas de: (a) provocar que una célula huésped exprese una proteína que contiene uno o más residuos de cisteína libre añadidos que es un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento en una forma insoluble o agregada, (b) lisar las células por medios químicos, enzimáticos o físicos; (c) solubilizar y reducir la proteína insoluble o agregada exponiendo la proteína insoluble o agregada a un agente desnaturalizante, un agente reductor y un agente bloqueante de cisteína; y (d) replegar la proteína reduciendo las concentraciones del agente desnaturalizante y los agentes reductores hasta niveles suficientes para permitir que la proteína se renaturalice en una forma soluble, biológicamente activa, en el que dicho agente bloqueante de cisteína forma un disulfuro mixto reversible con al menos un residuo de cisteína libre en dicha proteína. Opcionalmente, la proteína soluble, replegada se aísla de otras proteínas en la mezcla de replegamiento.

Las células huésped adecuadas incluyen células de bacterias, levaduras, de insectos o de mamíferos. Preferiblemente, la célula huésped es una célula bacteriana, particularmente E. coli.

Preferiblemente, las proteínas solubles, replegadas producidas mediante los métodos de la presente invención son proteínas recombinantes, especialmente variantes de cisteína o muteínas de cisteína de una proteína. Tal como se usa en el presente documento, los términos "variante de cisteína" y "muteína de cisteína" quieren decir que abarcan cualquiera de los siguientes cambios en una secuencia de aminoácidos de una proteína: adición de un residuo de cisteína no natural precediendo al extremo amino- terminal de la proteína madura o siguiendo al extremo carboxilo-terminal de la proteína madura; sustitución de un residuo de cisteína no natural por un aminoácido existente en la proteína; introducción de un residuo de cisteína no natural entre dos aminoácidos normalmente adyacentes en la proteína; o sustitución de otro aminoácido por un residuo de cisteína que se produce de manera natural que forma normalmente un enlace disulfuro en la proteína. Se usan los métodos para producir proteínas que incluyen, sin limitación, GH, G-CSF, GM-CSF e interferón, especialmente alfa interferón, variantes de cisteína de estas proteínas, sus derivados o antagonistas. Otras proteínas para las que son útiles los métodos incluyen otros miembros de la familia del supergén de la GH.

Tal como se usa en el presente documento, el término "agente bloqueante de cisteína" significa cualquier reactivo o combinación de reactivos que de cómo resultado la formación de un residuo de cisteína libre bloqueado reversiblemente en una proteína. Ejemplos de agentes bloqueantes de cisteína útiles incluyen, pero no se limitan a, ditioles tales como cistina, cistamina, glutatión oxidado, ácido ditioglicólico y similares, o tioles tales como cisteína, cisteamina, ácido tioglicólico y glutatión reducido. Preferiblemente, deben usarse los tioles en presencia de un agente oxidante. Los agentes oxidantes útiles incluyen oxígeno, yodo, ferricianuro, peróxido de hidrógeno, ácido dihidroascórbico, tetrationato y O-yodobenzoato. Opcionalmente, puede añadirse un ion metálico tal como cobre (Cu^{++}) o cobalto (Co^{++}) para catalizarla reacción de oxidación. Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría particular, la invención postula que el agente bloqueante de cisteína forma un disulfuro mixto con el residuo de cisteína libre en la proteína, limitando así las posibles transposiciones de disulfuro que podrían producirse implicando al residuo de cisteína libre. El disulfuro mixto estabiliza el residuo de cisteína libre, aumentando significativamente el rendimiento de la proteína replegada apropiadamente, biológicamente activa, soluble. Tal como se usa en el presente documento, agentes reductores tales como DTT y 2-mercaptoetanol no se consideran agentes bloqueantes de cisteína porque no dan como resultado la formación de un disulfuro mixto bloqueado reversiblemente con el residuo de cisteína libre en la proteína. Normalmente, DTT no forma disulfuros mixtos con residuos de cisteína en las proteínas debido a un enlace intramolecular termodinámicamente preferido que se forma tras la oxidación.

También están dentro de la presente invención proteínas diméricas y multiméricas de orden superior formadas mediante la asociación covalente de dos o más de las proteínas replegadas a través de sus residuos de cisteína libre.

Los presentes métodos incluyen además diversos métodos para unir un resto reactivo con cisteína a la proteína replegada para formar una proteína modificada en la que el resto reactivo con cisteína está unido a la proteína replegada a través del/de los residuo(s) de cisteína libre. Un ejemplo de un resto reactivo con cisteína útil que puede unirse a la proteína replegada es un PEG reactivo con cisteína, que puede usarse para formar una proteína pegilada. Tales métodos incluyen (a) aislar la proteína replegada que tiene un residuo de cisteína libre de otras proteínas en la mezcla de replegamiento; (b) reducir, al menos parcialmente, la proteína aislada, replegada con un agente reductor de disulfuro y (c) exponer la proteína a un resto reactivo para cisteína tal como un PEG reactivo con cisteína. Opcionalmente, la proteína modificada puede aislarse de la proteína no modificada. Ejemplos de otros restos reactivos con cisteína útiles son dextranos reactivos con cisteína, hidratos de carbono reactivos con cisteína, poli(N-vinilpirrolidona) reactivas con cisteína, péptidos reactivos con cisteína, lípidos reactivos con cisteína y polisacáridos reactivos con cisteína.

La presente invención incluye además las proteínas solubles, replegadas y sus derivados, incluyendo proteínas pegiladas, preparadas mediante los métodos descritos en el presente documento. Tales proteínas pegiladas incluyen variantes de cisteína, monopegiladas de proteínas GH, G-CSF, GM-CSF e interferón alfa. Tales proteínas pegiladas incluyen también variantes de cisteína de proteínas GH, G-CSF, GM-CSF e interferón alfa modificadas con dos o más moléculas de PEG, en las que al menos una de las moléculas de PEG se une a la proteína a través de un residuo de cisteína libre.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos novedosos para preparar formas solubles, replegadas de proteínas GH, IFN-\alpha2, G-CSF y GM-CSF que tienen al menos un residuo de cisteína libre y que se expresan mediante una célula huésped en una forma insoluble o agregada. La presente invención puede usarse para preparar formas replegadas, solubles de otros miembros de la familia del supergén de la GH que tienen al menos un residuo de cisteína libre y que se expresan mediante una célula huésped en una forma insoluble o agregada. La invención proporciona además proteínas novedosas, particularmente proteínas recombinantes producidas mediante estos métodos novedosos así como derivados de tales proteínas recombinantes. Los métodos novedosos para preparar tales proteínas se consiguen generalmente mediante las etapas de:

(a): provocar que una célula huésped exprese una proteína que tiene uno o más residuos de cisteína libre añadidos que es un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento en una forma insoluble o agregada;

(b): lisar la célula huésped por medios químicos, enzimáticos o físicos;

(c): solubilizar la proteína insoluble o agregada exponiendo la proteína a un agente desnaturalizante, un agente reductor y un agente bloqueante de cisteína; y

(d): replegar la proteína reduciendo las concentraciones del agente desnaturalizante y el agente reductor en la mezcla de solubilización hasta niveles suficientes para permitir que la proteína se renaturalice en una forma soluble, biológicamente activa, en la que dicho agente bloqueante de cisteína forma un disulfuro mixto reversible con al menos un residuo de cisteína libre en dicha proteína.

Opcionalmente, la proteína replegada, soluble puede aislarse de otras proteínas en la mezcla de replegamiento. Se describen con detalle los métodos y otras realizaciones de la presente invención en la solicitud provisional de los EE.UU. con número de serie 60/204.617, presentada el 16 de mayo de 2000.

Tal como se identificó anteriormente, la primera etapa en estos métodos es provocar que una célula huésped exprese una proteína que tiene un residuo de cisteína libre en una forma insoluble o agregada. Las células huésped adecuadas pueden ser procariotas o eucariotas.. Ejemplos de células huésped apropiadas que pueden usarse para expresar proteínas recombinantes incluyen células de bacterias, levaduras, de insectos y de mamíferos. Las células de bacterias son particularmente útiles, especialmente E. coli. Los métodos para provocar que una célula huésped exprese una proteína se conocen bien en la técnica y se proporcionan ejemplos en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término "proteína que tiene un residuo de cisteína libre" significa cualquier proteína o péptido natural o recombinante que contiene 2N+1 residuos de cisteína, en el que N puede ser 0 o cualquier número entero, y cualquier proteína o péptido natural o recombinante que contiene 2N cisteínas, en el que dos o más de las cisteínas normalmente no participan en un enlace disulfuro.

Por tanto, los métodos de la presente invención son útiles para aumentar la expresión, recuperación y purificación de cualquier proteína o péptido que tiene una cisteína libre, particularmente proteínas recombinantes variantes con cisteína añadida (denominadas en el presente documento "muteínas de cisteína" o "variantes de cisteína") que tienen una o más cisteínas libres. Aunque la expresión, recuperación y purificación de una proteína natural que tiene una cisteína libre expresada por su célula huésped natural puede aumentarse mediante los métodos de la presente invención, la descripción en el presente documento se refiere predominantemente a proteínas recombinantes únicamente para fines ilustrativos. Además, las proteínas pueden proceder de cualquier especie animal incluyendo el ser humano, animales de compañía y animales de granja. Las proteínas también pueden derivar de especies vegetales o microbios.

Por consiguiente, la presente invención abarca una amplia variedad de proteínas recombinantes y variantes de cisteína de estas proteínas. Estas proteínas incluyen miembros de la familia del supergén de la GH y variantes de cisteína de estas proteínas. Las siguientes proteínas ("denominadas colectivamente familia del supergén de la GH") están codificadas por genes de la familia del supergén de la GH (Bazán (1990; 1991; 1992); Mott y Campbell (1995); Silvennoinen e Ihle (1996); Martin et al. (1990); Hannum et al. (1994); Blumberg et al., 2001): GH, prolactina, lactógeno placentario, eritropoyetina (BPO), trombopoyetina (TPO), interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidad p35), IL-13, IL-15, IL-19, IL-20, IL-TIF, MDA-7, AK-155, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar, factor inhibidor de la leucemia, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), factor de células madre y el ligando de flt3/fik2. Se anticipa que se identificarán en el futuro miembros adicionales de la familia del supergén de la GH mediante clonación y secuenciación génica. Los miembros de la familia del supergén de la GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares, a pesar del hecho de que generalmente tienen una identidad de la secuencia de ADN o aminoácidos limitada. Las características estructurales compartidas de los miembros de la familia del supergén de la GH, que se describen en Bazán (1990; 1991; 1992), Mott y Campbell (1995) y Silvermoinen e Ihle (1996), permiten que se identifiquen fácilmente nuevos miembros de la familia génica. También abarca esta invención variantes de estas proteínas tales como el antagonista de IL-2 selectivo descrito por Shanafelt et al. (2000).

Otras variantes de proteína que se beneficiarían de la pegilación y que por tanto serían candidatos razonables para modificaciones de cisteína añadida incluyen proteínas o péptidos con poca solubilidad o una tendencia a agregarse, proteínas o péptidos que son aceptables para proteolisis, proteínas o péptidos que necesitan una estabilidad mecánica mejorada, proteínas o péptidos que se eliminan rápidamente del cuerpo, o proteínas o péptidos con propiedades inmunogénicas o antigénicas no deseadas.

Si se desea, pueden construirse generalmente muteínas de cisteína y otros aminoácidos de estas proteínas usando mutagénesis basada en PCR dirigida al sitio tal como se describe en los ejemplos más adelante y en los documentos PCT/US98/14497 (WO-A-99/03887) y PCT/US00/00931 (WO-A00/42175), cada uno de los cuales se incorpora como referencia en su totalidad. Se describen también en general métodos para construir muteínas usando procedimientos de PCR basados en PCR en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications editado por White, B. A- (1993) Humans Press, Inc., Totowa, NJ y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications editado por Innis, M. A et al. (1990) Academic Press, Inc. San Diego, CA.

Pueden usarse métodos conocidos en la técnica para inducir la expresión de una proteína en el citoplasma o para dirigir la secreción de la proteína, dependiendo del origen celular, incluyendo, por ejemplo, los métodos descritos en los ejemplos más adelante. Se ha usado una amplia variedad de péptidos señal satisfactoriamente para transportar proteínas al espacio periplásmico de E. coli. Ejemplos de esto incluyen secuencias señal procariotas tales como la señal de ompA, stiI, PhoA (Denefle et al., 1989), OmpT (Johnson et al., 1996), LamB y OmpF (Hoffman y Wright, 1985), beta-lactamasa (Kadonaga et al., 1984), enterotoxinas LT-A, LT-B (Morioka-Fujimoto et al., 1991), y proteína A de S. aureus (Abrahmsen et al., 1986). Los expertos en la técnica conocen también varias secuencias señal no naturales, sintéticas, que facilitan la secreción de ciertas proteínas.

A continuación, se lisa la célula huésped. La lisis celular puede producirse antes o coincidiendo con los procedimientos de solubilización descritos a continuación. Puede conseguirse la lisis celular mediante, por ejemplo, cizalladura mecánica tal como una cubeta de presión, digestión enzimática, sonicación, homogenización, agitación con vórtex con perlas de vidrio, tratamiento con detergente, disolventes orgánicos, congelación-descongelación, molienda con alúmina o arena, tratamiento con un agente desnaturalizante tal como se define más adelante, y similares (Bollag et al., 1996). Opcionalmente, las células pueden lisarse en presencia de un agente desnaturalizante, un agente reductor de disulfuro, o un agente bloqueante de cisteína. Opcionalmente, puede separarse el material insoluble o agregado de las proteínas solubles mediante diversos métodos tales como centrifugación, filtración (incluyendo ultrafiltración), precipitación, floculación o sedimentación.

A continuación, el material insoluble o agregado (o las células completas sin lisis previa) se hace soluble o monomérico exponiendo el material insoluble o agregado (o las células completas sin lisis previa) a un agente desnaturalizante y a un agente reductor de disulfuro que también es un agente bloqueante de cisteína. Los agentes desnaturalizantes útiles incluyen urea, guanidina, arginina, tiocianato de sodio, extremos en pH (ácidos o bases diluidos), detergentes (SDS, Sarkosyl^{TM}), sales (cloruros, nitratos, tiocianatos, sales de cetilmetilamonio, tricloroacetatos), derivatización química (sulfitolisis, reacción con anhídrido citracónico), disolventes (2-amino-2-mobil-1-propanol u otros alcoholes, DMSO, DMF) o resinas de intercambio aniónico fuertes tales como Q-Sepharose. Las concentraciones útiles de urea son 1-8 M, prefiriéndose concentraciones de 5-9 M. Las concentraciones útiles de guanidina son 1-8 M, prefiriéndose concentraciones de 4-8 M. Los agentes reductores de disulfuro útiles que también son agentes bloqueantes de cisteína incluyen, pero no se limitan a, tioles tales como cisteína, ácido tioglicólico, glutatión reducido y cisteamina. Estos compuestos pueden usarse en el intervalo de 0,5 a 200 mM, prefiriéndose concentraciones de 1,50 mM. La cisteína, glutatión reducido, ácido tioglicólico y cisteamina son agentes reductores preferidos porque también son agentes bloqueantes de cisteína, es decir, interactúan con el residuo de cisteína libre de la proteína para formar un residuo de cisteína libre bloqueado reversiblemente. El uso de un agente reductor de disulfuro que también es un agente bloqueante de cisteína durante la etapa de solubilización reduce el número de compuestos y etapas requeridos en el procedimiento global para el replegamiento de la proteína insoluble o agregada en una forma soluble, activa. Además, el uso de un agente bloqueante de cisteína da como resultado una forma de la proteína replegada que es adecuada para su derivatización en el residuo de cisteína libre usando diversos procedimientos finales de restos reactivos con cisteína descritos más adelante. Preferiblemente, el pH de la mezcla de desnaturalización/reducción está entre pH 6 y pH 10.

La siguiente etapa en el procedimiento es replegar la proteína para obtener la conformación nativa de la proteína y enlaces disulfuro nativos. Se logra el replegamiento reduciendo las concentraciones del agente desnaturalizante y el agente reductor hasta niveles suficientes para permitir que la proteína se renaturalice en una forma soluble, biológicamente activa. Esto puede lograrse mediante diálisis, dilución, filtración en gel, precipitación de la proteína, o mediante inmovilización sobre una resina seguida por lavados con tampón. Las condiciones para esta etapa se eligen para permitir la regeneración del/los enlace(s) nativo(s) de la proteína. Esto puede conseguirse mediante la adición de un agente oxidante, o una mezcla redox de un agente oxidante y un agente reductor, para catalizar una reacción de intercambio de disulfuro. Preferiblemente, se eligen un reactivo o combinación de reactivos que dan como resultado una formación de enlaces disulfuro nativos y un residuo de cisteína libre bloqueado reversiblemente, es decir, el reactivo o combinación de reactivos actúa como agentes bloqueantes de cisteína. Ejemplos de reactivos oxidantes útiles incluyen oxígeno, cistina, glutatión oxidado, cistamina y ácido ditioglicólico. Ejemplos de mezclas redox útiles incluyen cisteína/oxígeno, cisteína/cistina, cisteína/cistamina, cisteamina/cistamina, glutatión reducido/glutatión oxidado y similares. Opcionalmente, puede añadirse un agente reductor tal como DTT o 2-mercaptoetanol a la mezcla de replegamiento para facilitar el intercambio de disulfuro. Opcionalmente, puede añadirse un ion metálico tal como cobre (Cu^{++}) o cobalto (Co^{++}) a la mezcla de replegamiento para facilitar la oxidación de la proteína. Las concentraciones útiles de iones metálicos en la mezcla de replegamiento son de 1 \muM a 1 mM, prefiriéndose una concentración de 40 \muM. Preferiblemente, el pH de la mezcla de replegamiento está entre pH 6 y pH 10.

Alternativamente, el material insoluble o agregado (o las células completas sin lisis celular previa) se hace soluble o monomérico mediante el uso de un agente desnaturalizante y un agente reductor de disulfuro que puede ser o no un agente bloqueante de cisteína. Los agentes desnaturalizantes útiles incluyen, pero no se limitan a los descritos anteriormente. Ejemplos de agentes reductores de disulfuro útiles incluyen, pero no se limitan a, DTT, 2-mercaptoetanol, borohidruro de sodio, fosfinas terciarias y tioles tales como cisteína, glutationina reducida, ácido tioglicólico y cisteamina. Pueden usarse DTT y 2-mercaptoetanol en el intervalo de 0,5-200 mM, prefiriéndose concentraciones de 1-50 mM. La proteína desnaturalizada y reducida se mezcla entonces con un exceso molar (en relación con la concentración del agente reductor) de un reactivo para ditiol que, cuando se reduce, puede actuar como un agente bloqueante de cisteína. Ejemplos de reactivos de ditiol útiles que pueden actuar como agentes bloqueantes de cisteína cuando se reducen incluyen compuestos que contienen enlaces disulfuro tales como cistina, cistamina, glutatión oxidado, ácido ditioglicólico, ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (reactivo de Ellman), disulfuros de piridina, compuestos del tipo R-S-S-CO-OCH_{3}, en los que R es un compuesto orgánico, otros derivados de cistina tales como diformilcistina, diacetilcistina, diglicilcistina, dialanilcistina diglutaminilcistina, cistinildiglicina, cistinildiglutamina, dianhídrido de dialanilcistina, cistina fenilhidantoína, homocistina, ácido ditiodipropiónico, dimetilcistina, o cualquier ditiol o compuesto químico que pueda experimentar una reacción de intercambio de disulfuro. El replegamiento de la proteína se inicia disminuyendo la concentración del agente desnaturalizante (usando los métodos descritos anteriormente) y facilitando el intercambio de disulfuro mediante la adición de un agente reductor tal como cisteína, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, glutatión reducido, ácido tioglicólico u otro tiol. Preferiblemente, se elige un reactivo o combinación de reactivos que dan como resultado la formación de enlaces disulfuro nativos y un residuo de cisteína libre bloqueado reversiblemente. Opcionalmente, puede añadirse un ion metálico tal como cobre (Cu^{++}) o cobalto (Co^{++}) a la mezcla de replegamiento para facilitar la oxidación de la proteína. Opcionalmente, puede añadirse glicerol a la mezcla de replegamiento para aumentar el rendimiento de la proteína replegada. Las concentraciones útiles de glicerol en la mezcla de replegamiento son del 1-50% (volumen/volumen), prefiriéndose un intervalo del 10-20%. Preferiblemente, el pH de la mezcla replegada es de 6-10.

Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría particular, se cree que los agentes bloqueantes de cisteína usados en los presentes métodos se unen covalentemente al residuo de cisteína "libre", formando un disulfuro mixto, estabilizando así el residuo de cisteína libre y evitando la multimerización y agregación de la proteína. Pueden usarse varios compuestos reactivos de tiol como agentes bloqueantes de cisteína para estabilizar proteínas que contienen cisteínas libres. Además de la cisteína, cisteamina, ácido tioglicólico y glutationina reducida, los agentes bloqueantes de cisteína también pueden incluir reactivos que contienen enlaces disulfuro tales como cistina, cistamina, ácido ditioglicólico, glutatión oxidado, ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (reactivo de Ellman), disulfuros de piridina, compuestos del tipo R-S-S-CO-OCH_{3}, otros derivados de cistina tales como diformilcistina, diacetilcistina, diglicilcistina, dialanilcistina diglutaminilcistina, cistinildiglicina, cistinildiglutamina, dianhídrido de dialanilcistina, cistina fenilhidantoína, homocistina, ácido ditiodipropiónico, dimetilcistina, o cualquier ditiol o compuesto químico que pueda experimentar una reacción de intercambio de disulfuro. También pueden usarse haluros de sulfenilo para preparar disulfuros mixtos. Otros agentes bloqueantes de tiol que pueden encontrar uso en la estabilización de proteínas que contienen residuos de cisteína libre incluyen compuestos que pueden reaccionar reversiblemente con tioles libres. Estos agentes incluyen ciertas sales de metales pesados o derivados orgánicos de zinc, mercurio y plata. Se describen otros agentes que forman mercapturos o compuestos reactivos de tiol reversibles por Cecil y McPhee (1959) y Torchinskii (1971).

Opcionalmente, la proteína replegada, soluble que contiene un residuo de cisteína libre se recupera y se aísla de las otras proteínas en la fracción soluble de la mezcla replegada. Tales métodos de recuperación y purificación se conocen o se determinan fácilmente por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, centrifugación, filtración, diálisis, cromatografía, incluyendo procedimientos de cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico, de interacción hidrófoba y de afinidad y similares. Un método adecuado para la recuperación y purificación de una proteína deseada dependerá, en parte, de las propiedades de la proteína y del uso pretendido.

La presente invención también proporciona métodos novedosos para producir proteínas G-CSF biológicamente activas, particularmente variantes de G-CSF, G-CSF (C17S), y G-CSF y G-CSF (C17S) de tipo natural, incluyendo variantes de cisteína (denominadas colectivamente "proteínas G-CSF"), que dan como resultado un aumento significativo en el porcentaje de las proteínas G-CSF recuperadas que se han procesado apropiadamente y son biológicamente activas. Estos métodos novedosos incluyen secretar las proteínas G-CSF en el periplasma de E. coli usando la secuencia señal de stII, desnaturalizar y replegar las proteínas G-CSF insolubles o agregadas y purificar las proteínas G-CSF solubles, replegadas de otras proteínas en la fracción soluble de la mezcla de renaturalización/replegamiento. Las proteínas G-CSF recuperadas carecen del residuo de metionina N-terminal no natural presente cuando las proteínas G-CSF se expresan intracelularmente en E. coli. Informes publicados (Pérez-Pérez et al., 1995) describen la secreción de G-CSF en el periplasma de E. coli usando una secuencia líder de ompA modificada. Sin embargo, muy poca de la proteína de fusión ompA-G-CSF expresada se procesó apropiadamente para producir G-CSF madura. El porcentaje de proteínas G-CSF procesadas apropiadamente pudo aumentarse hasta el 10-30% de las proteínas G-CSF expresadas totales mediante la expresión conjunta de las proteínas dnaJ y dnaK de E. coli. En todos los casos, las proteínas G-CSF secretadas eran en gran medida insolubles y biológicamente inactivas. Los métodos de la presente invención producen al menos el 80-100% de proteínas G-CSF procesadas apropiadamente y no requieren la expresión conjunta de las proteínas dnaJ y dnaK. La presente invención también proporciona, por primera vez, métodos para desnaturalizar y replegar las proteínas G-CSF insolubles, secretadas en una forma biológicamente activa.

Las proteínas purificadas obtenidas según estos métodos pueden procesarse adicionalmente si se desea. Por ejemplo, las proteínas aisladas pueden modificarse en el residuo de cisteína libre con diversos restos reactivos con cisteína. Por ejemplo, las proteínas pueden pegilarse en el residuo de cisteína libre con diversos reactivos de PEG reactivos con cisteína, y posteriormente purificarse como proteínas monopegiladas. Se define que el término "monopegilado" significa una proteína modificada mediante unión covalente de una única molécula de PEG a la proteína. Puede usarse cualquier método conocido por el experto en la técnica para purificar la proteína pegilada de la proteína no modificada y reactivos de PEG sin reaccionar, incluyendo, por ejemplo, los métodos descritos en los ejemplos más adelante y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931. Ejemplos de otros restos reactivos con cisteína útiles son dextranos reactivos con cisteína, hidratos de carbono reactivos con cisteína y poli(vinilpirrolidona) reactivas con cisteína.

La presente invención también proporciona métodos para pegilar muteínas de cisteína de GH, G-CSF, GM-CSF, interferón alfa y otras proteínas que contienen 2N + 1 residuos de cisteína, y otras proteínas que contienen 2N residuos de cisteína en las que dos o más de los residuos de cisteína están libres, particularmente aquellas muteínas y proteínas en las que el residuo de cisteína libre está bloqueado por un disulfuro mixto.

La presente invención se refiere además a variantes de proteína purificada, monopegilada producidas mediante los métodos descritos en el presente documento que son no sólo biológicamente activas, sino que también conservan una alta actividad específica en ensayos de proliferación de células de mamíferos dependientes de proteína. Tales variantes de proteína incluyen, por ejemplo, muteínas de cisteína purificadas, monopegiladas de GCSF, GH, GM-CSF e IFN-\alpha2. Por ejemplo, las actividades biológicas in vitro de ciertas de las variantes de G-CSF monopegiladas descritas en el presente documento son de 3 a 50 veces mayores que la actividad biológica de G-CSF que se ha pegilado usando reactivos de NHS-PEG reactivos para amina.

Existen por encima de 25 genes de IFN-\alpha distintos (Pestka et al., 1987). Los miembros de la familia de IFN-\alpha comparten grados variables de homología de aminoácidos y muestran conjuntos solapantes de actividades biológicas. Están en diversas fases de desarrollo clínico IFN-\alpha recombinantes no naturales, creados uniendo entre sí regiones de proteínas IFN-\alpha diferentes (Horisberger y DiMarco, 1995). También se ha descrito un interferón "consenso" no natural (Blatt et al., 1996), que incorpora el aminoácido más común en cada posición de IFN-\alpha. Los métodos de la presente invención también son útiles para el replegamiento de otras especies de interferón alfa y proteínas interferón alfa no naturales que contienen un residuo de cisteína libre. Los sitios y las regiones útiles para pegilar muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 pueden aplicarse directamente a otros miembros de la familia génica de IFN-\alpha y a IFN-\alpha no naturales. Kinstler et al. (1996) describieron un interferón consenso monopegilado en el que la proteína está preferentemente monopegilada en el residuo de metionina N-terminal, no natural mediante enlaces amina o amida. Se redujo la actividad biológica de la proteína pegilada aproximadamente 5 veces en relación con el interferón consenso no modificado (Kinstler et al., 1996).

En una realización del G-CSF monopegilado, el polietilenglicol se une a la región proximal a la hélice A de G-CSF y el G-CSF monopegilado resultante tiene una CE_{50} inferior a aproximadamente 1000 pg/ml (aproximadamente 50 pM), preferiblemente inferior a aproximadamente 100 pg/ml (aproximadamente 5 pM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 20 pg/ml (aproximadamente 1 pM) y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 15 pg/ml (aproximadamente 0,7 pM). Alternativamente, el resto de polietilenglicol puede unirse al bucle C-D de G-CSF y el G-CSF monopegilado resultante tiene una CE_{50} inferior a aproximadamente 1000 pg/ml (aproximadamente 50 pM), preferiblemente inferior a aproximadamente 100 pg/ml (aproximadamente 5 pM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 20 pg/ml (aproximadamente 1 pM) y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 15 pg/ml (aproximadamente 0,7 pM). Alternativamente, el resto de polietilenglicol puede unirse a la región distal de la hélice D de G-CSF y el G-CSF monopegilado resultante tiene una CE_{50} inferior a aproximadamente 1000 pg/ml (aproximadamente 50 pM), preferiblemente inferior a aproximadamente 100 pg/ml (aproximadamente 5 pM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 20 pg/ml (aproximadamente 1 pM) y lo más preferiblemente de manera aproximada 15 pg/ml (aproximadamente 0,7 pM). Kinstler et al., (1996) describieron G-CSF de tipo natural monopegilado en el que la proteína está monopegilada preferentemente en el residuo de metionina N-terminal, no natural mediante enlaces amina o amida. Se informó que se reducía la actividad biológica de la proteína G-CSF monopegilada aproximadamente en un 30% en relación con G-CSF no modificada, aunque no se proporcionaron las CE_{50} (Kinstler et al., 1996). Kinstler et al. (1996) no determinaron si la modificación de otros aminoácidos en la región proximal a la hélice A en G-CSF con PEG dio como resultado proteínas G-CSF biológicamente activas. Un fin de la presente invención es describir otras posiciones de aminoácidos en la región proximal a la hélice A, y otras regiones, en G-CSF en las que puede unirse PEG, dando como resultado proteínas G-CSF biológicamente activas, monopegiladas.

En una realización del GM-CSF monopegilado, el polietilenglicol se une a la región proximal a la hélice A de GM-CSF y el GM-CSF monopegilado resultante tiene una CE_{50} inferior a aproximadamente 14000 pg/ml (aproximadamente 1000 pM), preferiblemente inferior a aproximadamente 1400 pg/ml (aproximadamente 100 pM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 280 pg/ml (aproximadamente 20 pM) y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 140 pg/ml (aproximadamente 10 pM)). Alternativamente, el resto de polietilenglicol puede unirse al bucle B-C de GM-CSF y el GM-CSF monopegilado resultante tiene una CESA inferior a aproximadamente 14000 pg/ml (aproximadamente 1000 pM), preferiblemente inferior a aproximadamente 1400 pg/ml (aproximadamente 100 pM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 280 pg/ml (aproximadamente 20 pM) y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 140 pg/ml (aproximadamente 10 pM)). Alternativamente, el resto de polietilenglicol puede unirse al bucle C-D de GM-CSF y el GM-CSF monopegilado resultante tiene una CE_{50} inferior a aproximadamente 14000 pg/ml (aproximadamente 1000 pM), preferiblemente inferior a aproximadamente 1400 pg/ml (aproximadamente 100 pM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 280 pg/ml (aproximadamente 20 pM) y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 140 pg/ml (aproximadamente 10 pM).

En una realización de la GH monopegilada, el polietilenglicol se une a la región proximal a la hélice A de GH y la GH monopegilada resultante tiene una CE_{50} inferior a aproximadamente 2000 ng/ml (aproximadamente 100 nM), preferiblemente inferior a aproximadamente 200 ng/ml (aproximadamente 10 nM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 20 ng/ml (aproximadamente 1 nM) y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 2 ng/ml (aproximadamente 0,1 nM).

La presente invención proporciona además variantes de proteína que pueden unirse o conjugarse covalentemente entre sí o a un grupo químico para producir multímeros de orden superior, tales como dímeros, trímeros o tetrámeros. Tales multímeros de orden superior pueden producirse según métodos conocidos por el experto en la técnica o tal como se describe en los ejemplos 2 y 20. Por ejemplo, una conjugación de ese tipo puede producir un aducto de GH, G-CSF, GM-CSF o IFN alfa que tiene un peso molecular superior que la proteína nativa correspondiente. Los grupos químicos adecuados para el acoplamiento son preferiblemente no tóxicos y no inmunogénicos. Estos grupos químicos incluirían hidratos de carbono o polímeros tales como polioles.

El "resto de PEG" útil para unirse a las variantes de cisteína de la presente invención para formar proteínas "pegiladas" incluye cualquier polímero adecuado, por ejemplo un poliol de cadena lineal o ramificada. Un poliol preferido es polietilenglicol, que es un polímero sintético compuesto por unidades de óxido de etileno. Las unidades de óxido de etileno pueden variar de modo que pueden obtenerse variantes de proteína pegilada con pesos moleculares aparentes medidos mediante cromatografía de exclusión molecular que oscilan desde aproximadamente 10.000 hasta más de 500.000 kDa. El tamaño del resto de PEG afecta directamente a su semivida de circulación (Yamaoka et al., 1994). Por consiguiente, podrían diseñarse variantes de proteína con semividas de circulación que difieren para aplicaciones terapéuticas específicas o regímenes de dosificación preferidos variando el tamaño o estructura del resto de PEG. Por tanto, la presente invención abarca variantes de proteína GH que tienen un peso molecular aparente superior a aproximadamente 30 kDa, y más preferiblemente superior a aproximadamente 70 kDa tal como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular, con una CE_{50} inferior a aproximadamente 400 ng/ml (18 nM), preferiblemente inferior a 100 ng/ml (5 nM), más preferiblemente inferior a aproximadamente 10 ng/ml (0,5 nM), e incluso más preferiblemente inferior a aproximadamente 2,2 ng/ml (0,1 nM). La presente invención abarca además variantes de proteína G-CSF que tienen un peso molecular aparente superior a aproximadamente 30 kDa, y más preferiblemente superior a aproximadamente superior a 70 kDa tal como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular, con una CE_{50} inferior a aproximadamente 100 ng/ml (5 nM), preferiblemente inferior a 1000 pg/ml (50 pM), más preferiblemente inferior a 100 pg/ml (6 pM), e incluso más preferiblemente inferior a aproximadamente 15 pg/ml (0,7 pM). La presente invención abarca además variantes de proteína IFN alfa (IFN-\alpha) que tienen un peso molecular aparente superior a aproximadamente 30 kDa, y más preferiblemente superior a aproximadamente 70 kDa tal como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular, con una CI_{50} inferior a aproximadamente 1900 pg/ml (100 pM), preferiblemente inferior a 400 pg/ml (21 pM), más preferiblemente inferior a 100 pg/ml (5 pM), e incluso más preferiblemente inferior a aproximadamente 38 pg/ml (2 pM). La presente invención abarca además variantes de proteína GM-CSF que tienen un peso molecular aparente superior a aproximadamente 30 kDa, y más preferiblemente superior a aproximadamente 70 kDa tal como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular, con una CE_{50} inferior a aproximadamente 14.000 pg/ml (\sim1000 pM), preferiblemente inferior a 1400 pg/ml (\sim100 pM), más preferiblemente inferior a 280 pg/ml (20 pM), e incluso más preferiblemente inferior a aproximadamente 140 pg/ml (\sim1 pM).

El grupo final de PEG reactivo para la modificación de la cisteína incluye pero no se limita a restos de vinilsulfona, maleimida y yodoacetilo. El grupo final de PEG debe ser específico para tioles produciéndose la reacción en condiciones que no son perjudiciales para la proteína.

También pueden prepararse antagonistas de variantes de GHh usando una GH variante con cisteína añadida tal como se describe en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/00/00931. Los estados que se beneficiarían de la administración de un antagonista de la GH incluyen acromegalia, enfermedades oculares vasculares, nefropatía diabética, reestenosis posterior a angioplastia y tumores malignos sensibles a la hormona de crecimiento.

Tal como se usa en el presente documento, el término "derivado" se refiere a cualquier variante de una proteína expresada y recuperada mediante los presentes métodos. Tales variantes incluyen, pero no se limitan a, versiones pegiladas, dímeros y otras variantes de orden superior, variantes de aminoácidos, variantes truncadas, proteínas de fusión, cambios en hidrato de carbono, fosforilación u otros grupos unidos encontradas en proteínas naturales, y cualquier otra variante descrita en el presente documento.

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Los compuestos producidos mediante los presentes métodos pueden usarse para una variedad de usos in vitro e in vivo. Las proteínas y sus derivados de la presente invención pueden usarse para fines de investigación, de diagnóstico o terapéuticos que se conocen para sus homólogos modificados de tipo natural, naturales o conocidos previamente. Los usos in vitro incluyen, por ejemplo, el uso de la proteína para seleccionar, detectar y/o purificar otras proteínas.

Para usos terapéuticos, el experto en la técnica puede determinar fácilmente la dosis, frecuencia de dosificación y vía de administración apropiadas. Los factores para realizar tales determinaciones incluyen, sin limitación, la naturaleza de la proteína que va a administrarse, el estado que va a tratarse, la conformidad potencial del paciente, la edad y peso del paciente y similares. Los compuestos de la presente invención también pueden usarse como vehículos de administración para aumentar la semivida de circulación de los productos terapéuticos a los que están unidos o para dirigir la administración hasta una diana específica dentro del cuerpo.

Los siguientes ejemplos no pretenden ser limitantes, sino sólo un ejemplo de realizaciones específicas de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Replegamiento de la muteína de T3C de la hormona de crecimiento

Métodos para expresar, purificar y determinar la actividad biológica in vivo e in vitro de la hormona de muteínas de la hormona de crecimiento humana (GHh) y de muteínas de cisteína de GHh se describen en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/00/00931. También se describen métodos para construir muteínas de cisteína de GHh en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/00/0931. Un método preferido para expresar GHh en E. coli es secretar la proteína en el periplasma usando la secuencia líder de STII. La GHh secretada es soluble y puede purificarse mediante cromatografía en columna tal como se describe en el documento PCT/US/00/00931. Determinadas muteínas de cisteína de GHh permanecen insolubles cuando se secretan en el periplasma de E. coli usando la secuencia líder de STII. No se han descrito previamente procedimientos para replegar proteínas de GHh secretadas, insolubles. Los siguientes protocolos se desarrollaron para replegar muteínas de cisteína de GHh en una forma biológicamente activa.

La muteína de T3C de GH insoluble (treonina en la posición 3 cambiada por cisteína; descrita en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/00/00931) se expresó en E. coli como una proteína secretada al espacio periplásmico usando la secuencia líder de stII tal como se describe en el documento PCT/US00/00931. Se solubilizó la proteína T3C y se replegó usando los dos siguientes procedimientos, que usan ambos cisteína como un agente reductor y como un agente bloqueante de cisteína para estabilizar el residuo de cisteína libre. Los cultivos (200 ml) de una cepa de E. coli que expresa la muteína de T3C se hicieron crecer y se indujo la expresión de T3C tal como se describe en el documento PCT/US00/00931. Se lisaron las células y se aisló la porción insoluble mediante centrifugación tal como se describe en el ejemplo 14. Se disolvió el material insoluble que contenía T3C en 20 ml de urea 8 M, cisteína 20 mM, Tris 20 mM pH 9 y se mezclo mediante agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se dividió la mezcla de solubilización en dos, diluyéndose la mitad en 50 ml de glicerol al 10%, Tris 20 mM, pH 8 y diluyéndose la otra mitad en 50 ml de TWEEN 20 al 0,5%, Tris 20 mM, pH 8. Se mantuvieron los replegamientos a 4ºC durante 24 horas antes de clarificarse mediante centrifugación y se cargaron en una columna de Q-Sepharose Hi Trap de 5 ml equilibrada previamente en Tris 20 mM, Tween 20 al 0,5%, pH 7,6. Se eluyó T3C soluble, replegada de la columna durante un gradiente de volumen de columna 20 de NaCl 0-300 mM en Tween 20 al 0,5%, Tris 20 mM pH 7, 6. Se analizaron Las fracciones de columna recuperadas mediante SDS-PAGE no reductora. T3C monomérica eluyó a NaCl aproximadamente 160 mM. Se recuperaron aproximadamente 790 \mug de T3C monomérica del replegamiento que contenía glicerol en el tampón de renaturalización. Se recuperaron aproximadamente 284 \mug de T3C monomérica del replegamiento cuando estaba presente Tween 20 en el tampón de renaturalización. Los resultados indican que la proteína T3C monomérica, soluble puede obtenerse mediante cualquier procedimiento de replegamiento/renaturalización. Basándose en los rendimientos de recuperación superiores de proteína T3C monomérica, se uso glicerol como agente estabilizador en los experimentos de replegamiento posteriores.

Ejemplo 2

Comparación de agentes reductores usados para el replegamiento de la muteína de T3C de la hormona de crecimiento

Se hicieron crecer cultivos (200 ml) de una cepa de E. coli que expresaba la muteína de T3C y se expresaron T3C tal como se describe en el documento PCT/US00/00931. Se aisló T3C insoluble lisando las células con tratamiento con detergente/lisozima de las células tal como se describe en los ejemplos 5 y 14. Se suspendió este material en 20 ml de urea 8 M, Tris 20 mM pH 9 y se introdujeron alícuotas en 3 tubos. No se añadió agente reductor al primer tubo ("Replegamiento A"), se añadió DTT 5 mM al segundo tubo ("Replegamiento B") y se añadió cisteína 20 mM al tercer tubo ("Replegamiento C"). Tras una hora de mezcla a temperatura ambiente, se diluyeron las solubilizaciones en 30 ml de glicerol al 10%, Tris 20 mM, pH 8. Se mantuvieron los replegamientos a 4ºC durante la noche. El día siguiente, se clarificaron los replegamientos mediante centrifugación y se cargaron en columnas de Q-Sepharose Hi Trap de 5 ml tal como se describe en el documento PCT/US00/00931. Se analizaron las fracciones recuperadas mediante SDS-PAGE no reductora. La proteína T3C recuperada del "replegamiento A" (agente no reductor) eluyó como varios picos anchos de la columna de Q-Sepharose. Mediante SDS-PAGE, el producto proteico recuperado tenía algo de proteína T3C monomérica presente, pero consistía principalmente de dímeros de T3C agregados (que eluían a NaCl 210 mM) y multímeros de T3C (que eluían en NaCl entre 300 mM y 1000 mM). Se muestran en la tabla 1 las recuperaciones finales de proteínas T3C monoméricas y diméricas. La proteína T3C recuperada del "Replegamiento B" (con DTT 5 mM) eluyó como un único pico ancho de la columna de Q-Sepharose, pero fue heterogéneo mediante análisis por SDS-PAGE no reductora. La banda de T3C monomérica era mucho más ancha que la banda de GHh de pituitaria y comprendía una variedad de especies monoméricas con pesos moleculares diferentes, que probablemente representan isoformas de disulfuro diferentes de T3C. También se detectó una pequeña cantidad de proteína T3C dimérica en varias de las fracciones. El "replegamiento C" (con cisteína como el agente reductor) proporcionó principalmente proteína T3C, que parecía ser una especie homogénea sencilla, tal como se pone en evidencia por la nitidez del pico que eluía de la columna de Q-Sepharose a NaCl 160 mM y por la nitidez de la banda de proteína en el peso molecular correcto (con respecto a la GHh de pituitaria convencional) cuando se analizó mediante SDS-PAGE no reductora. En la tabla 1 se dan las recuperaciones finales de las formas diméricas y monoméricas de T3C de cada uno de los replegamientos. Los datos indican que la solubilización/replegamiento de la proteína T3C en presencia de cisteína da como resultado rendimientos superiores de proteína T3C monomérica soluble que la solubilización/replegamiento de la proteína en ausencia de un agente reductor o en presencia de DTT. Los resultados también indican que la solubilización/replegamiento de la proteína T3C en presencia de cisteína produce una preparación homogénea, más estable de proteína T3C monomérica, que la solubilización/replegamiento de la proteína en ausencia de un agente reductor o en presencia de DTT.

TABLA 1

1

La proteína T3C monomérica recuperada a partir del replegamiento B, que contenía DTT en la mezcla de solubilización, puede convertirse en proteína T3C homodimérica unida a disulfuro, estable colocando la proteína en condiciones que permiten la formación del enlace disulfuro. Éstas incluyen condiciones en las que se añade un agente oxidante a la proteína, o mediante la adición de un segundo reactivo unido a disulfuro que puede experimentar una transposición de disulfuros cuando el pH es casi neutro o básico. Ejemplos de agentes oxidantes que podrían usarse incluyen tetrationato de sodio u oxígeno. Opcionalmente, pueden añadirse cantidades traza de iones de metales divalentes tales como cobre o cobalto para catalizarla reacción. Reactivos unidos a disulfuro útiles incluyen cistina, cistamina, glutatión oxidado, ditioglicolato, u otros ditioles de bajo peso molecular. Alternativamente, puede mantenerse la proteína T3C monomérica a un pH ácido para impedir la agregación y transposiciones de disulfuro no deseadas.

Las muteínas de cisteína de GH replegadas, solubles preparadas según los procedimientos descritos en los ejemplos 1 y 2 pueden purificarse mediante diversos procedimientos cromatográficos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos cromatográficos incluyen intercambio iónico, exclusión molecular, interacción hidrófoba (HIC), cromatografías de afinidad de quelación metálica (IMAC), cromatografía de exclusión molecular (SEC), cromatografía en fase inversa o una combinación de estas técnicas. Como un ejemplo, las muteínas de GH pueden capturarse de la fracción soluble de la mezcla de replegamiento usando una resina de flujo rápido de Q-Sepharose (Pharmacia) equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Puede lavarse la columna con Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 y las proteínas unidas eluidas con un gradiente de sal creciente en volumen 10-20 lineal de NaCl desde 0 hasta 250 mM en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Opcionalmente, puede añadirse glicerol (concentración final al 10%) a los tampones de columna. Pueden identificarse fracciones que contienen las muteínas de GHh mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western. Resinas alternativas que pueden usarse para capturar muteínas de GHh de la fracción soluble de la mezcla de replegamiento/renaturalización incluyen HIC, otras resinas de intercambio fónico o resinas de afinidad.

Pueden purificarse adicionalmente las muteínas de cisteína mediante cromatografía de interacción hidrófoba. Pueden reunirse las fracciones de columna de Q-Sepharose que contienen las muteínas de GH y añadirse NaCl hasta una concentración final de 2 M. Puede cargarse la reunión en una resina de flujo rápido Butil-Sepharose equilibrada previamente en NaCl 2 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5. Pueden eluirse las muteínas de GH de la resina usando un gradiente de sal inverso de NaCl desde 2 M hasta 0 M en fosfato 20 mM, pH 7,5. Pueden identificarse y reunirse las fracciones que contienen las muteínas de GH mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western. Alternativamente las fracciones de Q-Sepharose que contienen las muteínas de GH pueden reunirse y añadirse sulfato de amonio hasta una concentración final de 2 M antes de cargarlas en una columna fenil-Sepharose. Pueden eluirse las muteínas de GH de las resinas usando un gradiente de sal inverso de sulfato de amonio desde 2 M hasta 0 M en fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5. Las fracciones que contienen las muteínas de GH pueden identificarse mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western, y reunirse.

Si se desea una purificación adicional, la reunión de HIC que contiene las muteínas de GH puede cargarse directamente en una resina quelante de níquel (Qiagen) equilibrada en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,5. Tras una etapa de lavado, pueden recuperarse las muteínas de GH usando un gradiente de imidazol de 0 - 30 mM en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 0,5 M NaCl, pH 7,5. GH tiene una elevada afinidad por el níquel, presumiblemente mediante el sitio de unión a metal divalente formado por H18, H21 y E174. Como resultado, puede obtenerse GH en forma sumamente pura usando una columna de quelación metálica (Malsano et al., 1989). Las muteínas de GH se unirán firmemente a la columna de níquel y eluirán a concentraciones de imidazol similares (aproximadamente 15 mM) como GH de ti-
po natural. Alternativamente puede usarse una columna quelante de cobre en lugar de una columna quelante de níquel.

Pueden medirse las actividades biológicas de las muteínas de cisteína de GH purificadas usando el ensayo de proliferación celular descrito en el documento PCT/US00/00931. Pueden determinarse las concentraciones de proteína usando un ensayo de unión a colorante de Bradford (Bio-Rad Laboratories).

Se purificó la muteína de T3C como sigue. Se hizo crecer un cultivo de 600 ml de E. coli y se indujo la expresión de la proteína T3C tal como se describió anteriormente. Se aisló T3C insoluble tratando las células con una mezcla de detergente/lisozima (BPer^{TM}, Pierce) tal como se describe en los ejemplos 5 y 14. Se suspendió el material insoluble en 40 ml de urea 8 M, Tris 20 mM, cisteína 20 mM, pH 9. Tras una hora de mezcla a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla de solubilización en 200 ml de glicerol al 15%, Tris 20 mM, pH 8, sulfato de cobre 40 \muM. Se mantuvo el replegamiento a 4ºC durante la noche. El día siguiente, se clarificó el replegamiento mediante centrifugación y se cargó en una columna de Q-Sepharose Hi Trap de 5 ml equilibrada en glicerol al 10%, Tris 20 mM, pH 8. Se recuperó T3C mediante elución con un gradiente de volumen en columna 20 de NaCl de 0-250 mM en Tris 20 mM, pH 8, glicerol al 10%. Se analizaron las fracciones recuperadas mediante SDS-PAGE no reductora. Se reunieron las fracciones que contenían predominantemente proteína T3C del peso molecular aparente correcto. Las fracciones reunidas produjeron 4,6 mg de proteína T3C purificada. Se usó este material para los estudios de pegilación descritos en el ejemplo 3. Se midió la actividad biológica de la proteína T3C purificada en el ensayo de proliferación de células GH-R4 descrito en los ejemplos 1 y 2 y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931. La proteína T3C estimuló la proliferación de las células GH-R4 con una CE_{50} de 1,35 ng/ml.

Otras muteínas de cisteína de GH que se prepararon mediante este procedimiento incluyen *-1C, P2C, P5C, K38C, Q40C, K41C, S55C, S57C, T60C, Q69C, N72C, N99C, L101C, V102C, Y103C, D130C, S132C, P133C, R134C, T135C, Q137C, K140C, Q141C, T142C, Y143C, K145C, D147C, N149C, S150C, H151C, N152C, D153C, E186C y G187C. Se midieron las actividades biológicas de algunas de las muteínas de cisteína de GH purificadas en el ensayo de proliferación de células GH-R4 descrito en el documento PCT/US00/00931. Las CE_{50} observadas para las muteínas *-1C, P2C, P5C, K38C, Q40C, S55C, N99C, L101C, V102C, Y103C, P133C, Q137C, K140C, Y143C, D147C, N149C, E186C y G187C oscilaban desde 0,7 ng/ml hasta 2,2 ng/ml. Estos valores son casi todos equivalentes a las CE_{50}
observadas para los controles de GH de tipo natural en estos ensayos que oscilaban desde 0,3 ng/ml hasta 1,5 ng/ml.

Ejemplo 3

Métodos generales para la pegilación y la purificación de las formas pegiladas de las proteínas que contienen residuos de cisteína libres

Las proteínas que contienen residuos de cisteína libres pueden pegilarse usando una variedad de reactivos de PEG-maleimida (o PEG-vinilsulfona) reactivos con cisteína que están comercialmente disponibles. Las proteínas recombinantes generalmente se reducen parcialmente con ditiotreitol (DTT), Tris (2-carboxietil)fosfina-HCl (TCEP) o algún otro agente reductor, con el fin de lograr la pegilación óptima de la cisteína libre. La cisteína libre es relativamente no reactiva para PEG reactivo con cisteína, a menos que se realice esta etapa de reducción parcial. La cantidad de agente reductor requerido para reducir parcialmente cada muteína puede determinarse empíricamente, usando un intervalo de concentraciones de agente reductor a diferentes valores de pH y temperatura. Las concentraciones del agente reductor normalmente varían desde 0,5 equivalentes molares hasta un exceso molar de 10 veces. Las temperaturas preferidas son de 4ºC a 37ºC. El pH puede oscilar desde 6,5 hasta 9,0, pero preferiblemente es de 7,5 a 8.5. Las condiciones óptimas también variarán dependiendo del agente reductor y del tiempo de exposición. En las condiciones apropiadas, los disulfuros menos estables (normalmente disulfuros intermoleculares y disulfuros mixtos) se rompen primero, en lugar de los disulfuros naturales termodinámicamente estables. Normalmente, resulta eficaz un exceso molar de 5-10 veces de DTT durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reducción parcial puede detectarse mediante un ligero cambio en el perfil de elución de la proteína a partir de una columna en fase inversa. La reducción parcial también puede detectarse mediante un ligero cambio en el peso molecular aparente mediante análisis de SDS-PAGE no reductor de la muestra de proteínas. Debe tenerse cuidado de no "reducir en exceso" la proteína y exponer los residuos de cisteína adicionales. La reducción en exceso puede detectarse mediante HPLC en fase inversa (la proteína reducida en exceso tendrá un tiempo de retención similar a la proteína completamente reducida y desnaturaliza) y mediante la aparición de moléculas de proteína que contienen dos PEG tras la reacción de pegilación (detectables mediante un cambio en el peso molecular aparente en SDS-PAGE). En el caso de las muteínas de cisteína, la proteína de tipo natural correspondiente puede servir como control, ya que no debe pegilarse en condiciones que no reduzcan los disulfuros intramoleculares naturales. El agente reductor en exceso puede eliminarse antes de la pegilación mediante cromatografía por exclusión de tamaño o diálisis. No es necesario eliminar el TCEP antes de la adición del reactivo de pegilación, ya que no contiene un grupo tiol libre. La proteína parcialmente reducida puede hacerse reaccionar con diversas concentraciones de PEG-maleimida o PEG-vinilsulfona (normalmente PEG: razones molares de la proteína de 1:1, 5:1, 10:1 y 50:1) para determinar la razón óptima de los dos reactivos. La pegilación de la proteína puede monitorizarse por un cambio en el peso molecular, por ejemplo, usando SDS-PAGE. Normalmente, se considera deseable la menor cantidad de PEG que produce cantidades significativas de producto monopegilado sin producir producto dipegilado. En algunos casos, ciertos aditivos pueden potenciar el rendimiento de la pegilación. Estos aditivos incluyen, pero no se limitan a, EDTA, borato, caótropos (urea, guanidina, disolventes orgánicos), detergentes, estabilizadores osmóticos (polioles, azúcares, polímeros, aminoácidos y derivados de los mismos) y otros compuestos iónicos (citrato, sulfatos, fosfatos, aminas cuaternarias, cloruros, nitratos, tiocianatos, etc.). Las concentraciones de EDTA son 0,01 - 10 mM, siendo 0,5 - 1 mM las concentraciones preferidas. Generalmente, la proteína monopegilada puede purificarse a partir de la proteína no pegilada y PEG sin reaccionar mediante cromatografía por exclusión de tamaño, intercambio iónico, afinidad, fase inversa o interacción hidrófoba. Las fracciones enriquecidas para la proteína monopegilada (una única molécula de PEG unida a la muteína de cisteína) pueden identificarse mediante SDS-PAGE y/o inmunotransferencia de tipo Western. Estas fracciones pueden reunirse y almacenarse congeladas. La presencia del resto de PEG generalmente altera la afinidad de la proteína por la resina, permitiendo que la proteína pegilada se separe de la proteína no pegilada. Pueden usarse otros protocolos de purificación, tales como la extracción orgánica en 2 fases o la precipitación con sal. La proteína pegilada purificada puede probarse en los ensayos de proliferación/inhibición celular descritos en los diversos ejemplos proporcionados en el presente documento y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931 para determinar su actividad específica. La eficacia in vivo de las proteínas pegiladas puede determinarse tal como se describe en los ejemplos proporcionados en el presente documento y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931. Pueden llevarse a cabo experimentos para confirmar que la molécula de PEG se une a la proteína en el sitio apropiado. Esto puede llevarse a cabo mediante la digestión química o proteolítica de la proteína, la purificación del péptido pegilado (que tendrá un peso molecular grande) mediante cromatografía por exclusión molecular, intercambio o fase inversa, seguido por la secuenciación de los aminoácidos. El aminoácido acoplado a PEG aparecerá como un blanco en la serie de secuenciación de los aminoácidos.

Se usaron las condiciones siguientes para pegilar la muteína de la GH, T3C, y para purificar la proteína T3C pegilada. Las condiciones iniciales de las reacciones de pegilación se determinaron usando alícuotas de la proteína T3C replegada, preparada tal como se describe en el ejemplo 2 (usando cisteína como agente reductor y como agente bloqueante de cisteína para solubilizar y replegar la proteína), TCEP [Tris (2-carboxietil)fosfina]-HCl como agente reductor y PEG reactivo con cisteína de 5 kDa a partir de Shearwater Polymers (Huntsville, Alabama). Se incubaron alícuotas de dos \mug de T3C purificada con concentraciones crecientes de TCEP a temperatura ambiente en Tris 100 mM, pH 8,5 en presencia de diversas cantidades de maleimida-PEG de 5 kDa o vinilsulfona-PEG de 5 kDa en exceso. Tras 120 minutos, se analizaron inmediatamente alícuotas de las reacciones mediante SDS-PAGE no reductor. A pH 8,5, un exceso molar de 5 veces de TCEP y un exceso molar de 15 veces de PEG con maleimida de 5 kDa o con vinilsulfona de 5 kDa produjo cantidades significativas de la proteína T3C monopegilada tras dos horas sin proteína di o tripegilada detectable. Es necesario reducir parcialmente la muteína T3C muteína mediante tratamiento con un agente reductor tal como TCEP con el fin de pegilarse. La GH de tipo natural no se pegiló en condiciones reductoras parciales idénticas, lo que indica que el resto de PEG se une al residuo de cisteína introducido en la muteína. Estas condiciones se usaron para ampliar a escala la reacción de pegilación para la purificación y la evaluación de la actividad biológica. Se llevó a cabo una reacción de pegilación mayor (300 \mug) durante 2 h a temperatura ambiente, usando un exceso de 5 veces de TCEP y de 15 veces de maleimida-PEG de 10 kDa. Al final del tiempo de reacción, la mezcla de pegilación se diluyó 2X con Tris 20 mM helado, glicerol al 15%, pH 8,0 y se cargó inmediatamente en una columna de Q-Sepharose (1 ml, HiTrap). La T3C pegilada se eluyó de la columna haciendo pasar un gradiente de 20 ml desde 0-0,2 M de NaCl en Tris 20 mM, glicerol al 15%, pH 8. La presencia del resto de PEG disminuye la afinidad de la proteína por la resina, lo que permite que la proteína pegilada se separe de la proteína no pegilada. Las fracciones enriquecidas para la T3C monopegilada (una única molécula de PEG unida al monómero de T3C) se identificaron mediante SDS-PAGE, se reunieron y se congelaron. La proteína T3C monopegilada eluyó en aproximadamente NaCl 80 mM y su peso molecular aparente obtenido mediante SDS-PAGE fue de aproximadamente 30 kDa.

También se prepararon PEG de 10 kDa-T3C, PEG de 20 kDa-T3C y PEG de 40 kDa-T3C mediante el método descrito anteriormente. La actividad biológica de las proteínas PEG-T3C purificadas se midió en el ensayo de proliferación celular descrito en los ejemplos 1 y 2 y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/00/00931 para determinar su actividad específica. Las proteínas PEG-T3C estimularon la proliferación de las células GH-R4 de manera similar a GH de tipo natural y la proteína T3C no pegilada. La CE_{50} para la proteína PEG de 5 kDa-T3C fue de 1,2 ng/ml, la CE_{50} para la PEG de 10 kDa-T3C fue de 1,2 ng/ml y la CE_{50} para la PEG de 20 kDa-T3C fue de 3-4 ng/ml. La CE_{50} para la PEG de 40 kDa-T3C puede determinarse usando el ensayo de proliferación celular descrito en los ejemplos 1 y 2 y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/00/00931. La eficacia in vivo de PEG-T3C y otras muteínas de cisteína de la GH pegiladas puede determinarse tal como se describe en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931 y en el ejemplo 4.

Otros mutantes de cisteína de la GH que se pegilaron y se purificaron según los procedimientos explicados anteriormente incluyen P2C, P5C, S132C, P133C y R134C. Las actividades biológicas de estas muteínas que se modificaron con restos de PEG de 20 kDa se midieron usando el ensayo de proliferación celular descrito en los ejemplos 1 y 2 y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/00/00931. La CE_{50} observada para estas muteínas de cisteína pegiladas osciló desde 1,7 ng/ml hasta 6,0 ng/ml. Estos valores son todos similares, pero ligeramente superiores a las CE_{50} observadas para los ensayos con control de GH de tipo natural que se realizaron en paralelo. Las CE_{50} para estos controles de GH de tipo natural oscilaron desde 0,6 ng/ml hasta 1,2 ng/ml.

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Ejemplo 4

La hormona de crecimiento PEG-T3C estimula el crecimiento somático en ratas deficientes en hormona de crecimiento

A. Se determinó la capacidad de PEG-T3C para estimular el crecimiento somático en ratas sometidas a hipofisectomía (HYPDX), que no pueden sintetizar la hormona de crecimiento debido a la extirpación de sus hipófisis. Se adquirieron ratas Sprague-Dawley macho HYPDX de un proveedor comercial y pesaron aproximadamente 90 g. Las ratas se aclimataron durante 13 días. Los animales que aumentaron en más de 4 g durante su aclimatación se eliminaron del estudio. Se llevaron a cabo mediciones del peso corporal a la misma hora cada día (9:30 AM). Las ratas se aleatorizaron por el peso a diversos grupos de prueba. Había 5 ratas por grupo excepto para el grupo que recibió dosis de PEG de 20 kDa-T3C cada día, en las que sólo había cuatro ratas. Las ratas se pesaron diariamente y diariamente o en días alternos se les administraron inyecciones subcutáneas de placebo (solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 200 \mug/ml de albúmina sérica de rata (Sigma Chemical Company), una hormona de crecimiento humana recombinante comercial, Nutropin®, o diversas dosis de PEG de 20 kDa-T3C preparada tal como se describe en el ejemplo 3. Todas las disoluciones de proteínas se prepararon en PBS que contenía 200 \mug/ml de albúmina sérica de rata. Los animales se trataron durante 9 días consecutivos. En el día 10, los animales se sacrificaron y se recogieron sus tibias. Las tibias se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%. Las tibias fijadas se descalcificaron en ácido fórmico al 5% y se escindieron en el extremo proximal en el plano frontal. Las tibias se procesaron para incluirlas en parafina y se realizaron secciones de 8 micras y se tiñeron con azul de toluidina. Se midió la anchura de la fisis tibial en la tibia izquierda (5 mediciones por tibia). En la tabla 2 se muestran las mediciones de la epífisis tibial y el aumento de peso corporal acumulativo para los diferentes grupos de prueba. Los resultados muestran que PEG de 20 kDa-T3C estimula el aumento de peso corporal y el crecimiento óseo en las ratas con deficiencia en la hormona de crecimiento.

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TABLA 2

2

3

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B. Se llevó a cabo un segundo experimento tal como se describió para el ejemplo 4.A, excepto en que los compuestos de prueba se administraron mediante inyección subcutánea cada día o cada tres días. Además, se probó una dosis de T3C modificada con PEG de 40 kDa. Se adquirieron ratas Sprague-Dawley macho HYPDX de un proveedor comercial y pesaron aproximadamente 100 g. Se llevaron a cabo mediciones del peso corporal a la misma hora cada día. Las ratas se aleatorizaron por el peso a diversos grupos de prueba. Había 5 ratas por grupo excepto para el grupo de prueba que recibió PEG de 40 kDa-T3C. Las ratas se pesaron diariamente y se les administraron diariamente, o cada tres días, inyecciones subcutáneas de placebo (solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 200 \mug/ml de albúmina sérica de rata (Sigma Chemical Company), una hormona de crecimiento humana recombinante comercial, Nutropin®, o diversas dosis de PEG de 20 kDa-T3C o PEG de 40 kDa-T3C. Las proteínas de PEG-T3C se prepararon tal como se describe en el ejemplo 3. Todas las disoluciones de proteínas se prepararon en PBS que contenía 200 \mug/ml de albúmina sérica de rata. Los animales se trataron durante 9 días consecutivos. En el día 10, los animales se sacrificaron y se recogieron sus tibias y se prepararon para la sección, tal como se describe en el ejemplo 4A. En la tabla 3 se muestran las mediciones de las anchuras de la epífisis tibial y el aumento de peso corporal acumulativo para los diferentes grupos de prueba. Los resultados muestran que PEG de 20 kDa-T3C y PEG de 40 kDa-T3C estimulan el aumento de peso corporal y el crecimiento óseo en las ratas con deficiencia en la hormona de crecimiento.

TABLA 3

4

Ejemplo 5

Replegamiento y purificación de muteínas de cisteína de IFN-\alpha2

Los métodos para expresar, purificar y determinar la actividad biológica in vitro e in vivo del interferón alfa 2 (IFN-\alpha2) humano recombinante y de las muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 se describen en el documento PCT/US00/00931. Los métodos para construir las muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 y los sitios preferidos dentro de la proteína IFN-\alpha2 para las ubicaciones de los residuos de cisteína añadidos también se describen en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931. Las siguientes muteínas se han construido en E. coli usando estos métodos: C1S, Q5C, 43C44, N45C, Q46C, F47C, Q48C, A50C, D77C, C98S, Q101C, T106C, E107C, T108C, S163C, E165C, *166C, D2C, L3C, T6C, S8C, T52C, G102C, V103C, G104C, V105C, P109C, L110C, M111C, S160C, L161C, R162C y K164C. Un método preferido para expresar el IFN-\alpha2 en E. coli es secretar la proteína en el periplasma usando la secuencia líder de STII. Una fracción del IFN-\alpha2 secretado es soluble y puede purificarse mediante cromatografía en columna tal como se describe en el documento PCT/US00/00931. Ciertas muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 siguen siendo insolubles cuando se secretan en el periplasma de E. coli usando la secuencia líder de STII. El análisis por SDS-PAGE de los sobrenadantes por choque osmótico de las muteínas demostró que la mayoría tiene niveles reducidos (en comparación con el tipo natural) de la banda de rIFN-\alpha2 de 19 kDa. Los análisis por SDS-PAGE de los lisados de células completas y el material insoluble a partir de los choques osmóticos revelaron que estas muteínas se expresaban en niveles relativamente altos pero que se acumulaban principalmente en una forma insoluble, presumiblemente en el periplasma. Estas proteínas migraban conjuntamente con los patrones de rIFN-\alpha2 de tipo natural en condiciones reductoras, lo que indica que la secuencia líder de STII se había eliminado. En la tabla 4 se resumen las evaluaciones cualitativas de los niveles de expresión relativos. Los procedimientos para replegar las proteínas IFN-\alpha2 secretadas, insolubles, no se han descrito anteriormente. Se desarrolló el siguiente protocolo (denominado en el presente documento "Protocolo I") para expresar y replegar muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 en una forma biológicamente
activa.

Para la expresión de muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 e IFN-\alpha2, normalmente, se hizo crecer un cultivo de 325 ml en un matraz con agitación de 2 litros, o un cultivo de 500 ml en una matraz con agitación con deflectores de 2 litros, a 37ºC en un baño de agua con agitador giratorio a \sim170-220 rpm. Los cultivos se hicieron crecer, se indujeron, se recogieron y se sometieron a choque osmótico tal como se describe en el documento PCT/US00/00931. Los sobrenadantes y sedimentos resultantes se procesaron inmediatamente o fueron almacenados a -80ºC.

Las muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 que se recuperaron como proteínas insolubles en los sedimentos de choque osmótico se desnaturalizaron, se redujeron, y se replegaron en sus conformaciones apropiadas usando el siguiente procedimiento de replegamiento. El sedimento procedente del lisado por choque osmótico se trató en primer lugar con reactivo de extracción de proteína bacteriana B-PER^{TM} tal como se describe por el fabricante (Pierce). B-PER es una mezcla de detergente suave que altera las membranas de E. coli y libera el contenido citoplasmático de las células. El material insoluble se recuperó mediante centrifugación, se resuspendió en agua y se centrifugó de nuevo. El sedimento resultante se solubilizó en 5 ml de guanidina 6 M, cisteína 50 mM en base Tris 20 mM. La mezcla se dejó con agitación durante 30 minutos antes de dializarse durante la noche a 4ºC frente a 400 ml de fosfato de sodio 40 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0. Al día siguiente se reajustó el pH de la mezcla de replegamiento a 3,0 y se centrifugó la mezcla antes de cargarse en una columna de S-Sepharose, seguido por una columna de Cu^{++} IMAC tal como se describe para la purificación de rIFN-\alpha2 a partir del sobrenadante del choque osmótico en el documento PCT/US00/00931. Mediante el uso de estos procedimientos se han replegado seis muteínas de cisteína de IFN-\alpha2: Q5C, C98S, Q101C, T106C, E107C y *166C. Pueden utilizarse procedimientos similares para replegar y purificar IFN-\alpha2 de tipo natural, insoluble.

El análisis por SDS-PAGE no reductor de las muteínas de cisteína purificadas Q5C, C98S, Q101C, T106C, E107C y *166C demostró que las muteínas se recuperaban predominantemente como monómeros, que migraban en el peso molecular esperado de \sim19 kDa. C98S migró con un peso molecular ligeramente superior a las de otras muteínas de rIFN-\alpha2 debido a la ausencia del enlace disulfuro natural Cysl-Cys-98. Algunas de las muteínas purificadas contenían pequeñas cantidades de dímeros de rINF-\alpha2 unidos mediante enlaces disulfuro. Los pesos moleculares de las especies diméricas fueron de aproximadamente 37-38 kDa.

Cuando procesaron varias muteínas de cisteína de INF-\alpha2, se descubrió que ciertas muteínas de cisteína parecían estar presentes tanto en la fracción soluble como en la insoluble tras la lisis celular. Las razones de proteína INF-\alpha2 soluble frente a insoluble variaron de mutante a mutante. Por tanto, se desarrolló un procedimiento alternativo de solubilización/replegamiento (denominado en el presente documento "Protocolo II") que supone una etapa de solubilización de células completas para potenciar la recuperación de muteínas de cisteína de INF-\alpha2. Se encontró una modificación de los métodos de cultivo para mejorar la eficacia del procesamiento de la secuencia líder de STII y se empleó para expresar muteínas de cisteína de INF-\alpha2 para su replegamiento y purificación, tal como se detalla más adelante. En el método modificado, se hicieron crecer cultivos de 325 - 400 ml en medios LB que contenían MES 100 mM, pH 5,0 y ampicilina 100 \mug/ml a 37ºC con agitación vigorosa, por ejemplo, 220-250 rpm en un agitador medioambiental New Brunswick C25KC, hasta una densidad celular de 0,5 - 0,7 de DO a 600 nm. Entonces se indujeron los cultivos mediante la adición de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,5 mM y con la inducción la temperatura se redujo hasta 28ºC y la velocidad del agitador se redujo hasta 140 rpm. Los cultivos inducidos se incubaron durante la noche (14-18 horas) y se recogieron mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se procesaron inmediatamente o se almacenaron a -20ºC o -80ºC hasta el procesamiento. Los sedimentos celulares derivados del cultivo inducido de 325-400 ml se suspendieron en primer lugar en 10 ml de guanidina 8 M, cisteína 20 mM, Mes 20 mM, Tween 20 al 2%, pH 3 y se mezclaron hasta que estuvo presente una suspensión homogénea. Entonces se aumentó el pH hasta entre pH 8-9 y la mezcla de solubilización se agitó durante 3 horas. El lisado celular se diluyó a continuación 1:20 con tampón de renaturalización helado (Tris 20 mM, pH 0,3 M guanidina, urea 1 M, sulfato de cobre 40 \muM, pH 8). La suspensión turbia se dejó estar 1 - 2 días a 4ºC. El replegamiento se aclaró mediante centrifugación seguido por un ajuste del pH a 3 y una segunda roda de centrifugación. El sobrenadante se diluye 1:4 con agua fría y se carga en una columna de S-Seph Hi Trap de 5 ml. La columna de intercambio fónico se eluyó con un gradiente de 100 ml de tampón B al 0-70%, siendo el tampón A Mes 20 mM, pH 5 y siendo el tampón B etilenglicol al 10%, NaCl 500 mM, Mes 20 mM, pH 5. Alternativamente, las muteínas de cisteína de INF-\alpha2 replegadas pueden capturarse a partir de la mezcla de replegamiento usando una columna de HIC, tal como una columna de fenil-Sepharose. En primer lugar, la mezcla de replegamiento se centrifuga, se añade sulfato de amonio al sobrenadante hasta una concentración final del 10%, se vuelve a centrifugar la mezcla y se carga el sobrenadante en una columna de fenil-Sepharose de 10 ml equilibrada en sulfato de amonio al 10%, Tris 20 mM, pH 8. Las muteínas de cisteína de INF-\alpha2 se eluyen de la columna usando un gradiente lineal de 100 ml desde sulfato de amonio al 10%, Tris 20 mM, pH 8 hasta etilenglicol al 30%, Tris 20 mM, pH 8. La cantidad reunida de interferón a partir de una columna de fenil-Sepharose puede purificarse adicionalmente usando una columna quelante de cobre, columna de S-Sepharose o ambas.

Las muteínas de cisteína de interferón también pueden solubilizarse y replegarse usando otros agentes reductores que también actúan como agentes bloqueantes de la cisteína. La sustitución de glutatión, ácido tioglicólico o cisteamina reducidos por cisteína en las mezclas de solubilización/replegamiento produjo variantes de cisteína de INF solubles, replegados, que podían purificarse y pegilarse tras los procedimientos descritos en el ejemplo 7. Cuando no se sustituyó el agente reductor o DTT 20 mM por cisteína en las mezclas de solubilización/replegamiento, los rendimientos de las muteínas de cisteína de IFN solubles, replegadas, se redujeron hasta niveles no detectables cuando se analizó la mezcla de replegamiento mediante HPLC en fase inversa. Adicionalmente, no se recuperó muteína de cisteína de IFN soluble, replegada tras la Cromatografía en S-Sepharose de la mezcla de replegamiento cuando no se sustituyó ningún agente reductor o DTT 20 mM por cisteína en las mezclas de solubilización/replegamiento.

Las siguientes muteínas se expresaron en E. coli, se replegaron y se purificaron usando el protocolo II: C1S, Q5C, 43C44, N45C, F47C, Q48C, A50C, C98S, Q101C, T106C, E107C, S163C, E165C, *166C, D2C, L3C, T6C, S8C, T52C, G102C, V103C, G104C, V105C, P109C, L110C, M111C, S160C, L161C, R162C y K164C. Estos replegamientos se llevaron a cabo a pH 8 o en algunos casos a 7,5.

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Ejemplo 6

Actividades biológicas de muteínas de cisteína de IFN-\alpha2

Las actividades biológicas de las muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 Q5C, C98S, Q101C, T106C, E107C, y *166C purificadas, que se purificaron usando el protocolo I del ejemplo 5, se midieron en el ensayo de inhibición del crecimiento de Daudi descrito en el documento PCT/US00/00931. Se determinaron las concentraciones de proteína usando los kits de ensayo de proteínas de Bradford o BCA (Bio-Rad Laboratories y Pierce). Se analizaron en paralelo rIFN-\alpha2 y rIFN-\alpha2 de tipo natural, comerciales, preparados tal como se describe en el documento PCT/US00/00931, en los mismos días, para controlar la variabilidad entre días en estos ensayos. Las muteínas inhibieron la proliferación de las células de Daudi hasta el mismo grado que las proteínas control rIFN-\alpha2 de tipo natural, dentro del error del ensayo. Las CI_{50} medias para cinco de las muteínas (Q5C, Q101C, T106C, E107C y *166C) fueron similares a las CI_{50} medias de las proteínas rIFN-\alpha2 de tipo natural, oscilando desde 15-18 pg/ml. La CI_{50} media para la proteína C98S fue de 28 pg/ml. Estos datos se resumen en la tabla 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

6

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Se midieron las actividades biológicas de las siguientes muteínas, purificadas usando el protocolo II del ejemplo 5, en el ensayo de inhibición del crecimiento de Daudi descrito en el documento PCT/US00/00931: CIS, D2C, L3C, S8C, N45C, F47C, C98S, V103C, V105C, E107C, M111C, R162C, S163C, K164C, E165C y *166C. En la tabla 5 se enumeran las CI_{50} observadas, junto con las CI_{50} para los controles de la proteína rIFN-\alpha de tipo natural usadas en los mismos experimentos.

TABLA 5

9

Ejemplo 7

Pegilación de muteínas de cisteína de IFN-\alpha2

Las muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 purificadas pueden pegilarse usando los procedimientos descritos en el ejemplo 3 y en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931. Se llevó a cabo un experimento de pegilación a pequeña escala con dos de las muteínas de cisteína de rIFN-\alpha2 purificadas para identificar las condiciones que permitían a las proteínas monopegilarse en el residuo de cisteína libre. Se monitorizó la reducción en exceso de la proteínas mediante SDS-PAGE no reductor, buscando un cambio hacia un peso molecular aparente superior al esperado como resultado de un desplegamiento de la proteína, o en el aspecto de múltiples especies pegiladas generadas como resultado de la reducción del disulfuro natural. Se incubaron alícuotas de un \mug del tipo natural purificado y de las muteínas de rIFN\alpha-2, T106C y E107C, durante 1 hora con un exceso molar de 10 veces de TCEP y un exceso molar de 20 veces de maleimida-PEG de 5 kDa a pH 8,5 a temperatura ambiente. Tras 60 min, se detuvieron las reacciones y se analizaron inmediatamente mediante SDS-PAGE no reductor. Ambas muteínas produjeron la proteína monopegilada en estas condiciones, basándose en el análisis por SDS-PAGE de las mezclas de reacción. Los pesos moleculares aparentes de las proteínas monopegiladas fueron de aproximadamente 28 kDa obtenidos mediante SDS-PAGE no reductor. El rIFN-\alpha2 de tipo natural no mostró pegilación detectable en estas condiciones. Los experimentos control indicaron que era necesario reducir parcialmente a las muteínas de cisteína T106C y E107C con un reductor tal como TCEP para pegilarse. Estos datos indican que la molécula de PEG se une al residuo de cisteína introducido en las proteínas T106C y E107C.

Pueden modificarse cantidades mayores de las muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 con PEG reactivos con cisteína de diversos tamaños y purificarse para obtener material suficiente para las mediciones de la actividad biológica. Para la purificación de las proteínas pegiladas, las reacciones de pegilación más largas deben realizarse tal como se describió anteriormente durante 1 h a temperatura ambiente, diluirse 10X con Mes 20 mM, pH 5,0, ajustarse a pH 3,0 y después cargarse rápidamente en una Columna de S-Sepharose usando condiciones similares a las descritas para la purificación inicial de las muteínas de rIFN-\alpha2. La presencia del resto de PEG disminuye la afinidad de la proteína por la resina, permitiendo que la proteína pegilada se separe de la proteína no pegilada. El cromatograma a partir de la columna de S-Sepharose debe mostrar dos picos principales de proteína. El pico principal que eluye antes (elución a una concentración de NaCl inferior a 230 mM) debe ser la proteína IFN-\alpha monopegilada, lo que puede confirmarse mediante análisis por SDS-PAGE no reductor. El peso molecular aparente del IFN-\alpha monopegilado que se ha modificado con un PEG de 5 kDa que reacciona con cisteína es de aproximadamente 28 kDa mediante SDS-PAGE. El pico principal que eluye después (elución a aproximadamente NaCl 230 mM) debe ser la proteína IFN-\alpha2 sin reaccionar. Las fracciones de los picos que eluyen antes que contienen predominantemente PEG-IFN-\alpha2 pueden reunirse y usarse para realizar mediciones de la actividad biológica. La actividad biológica de las proteínas PEG-IFN-\alpha2 purificadas puede medirse en el ensayo de células de Daudi descrito en el documento PCT/US00/00931. Las concentraciones de las proteínas pueden determinarse usando un ensayo de unión a colorante de Bradford. Las actividades biológicas in vivo de las muteínas de cisteína de IFN-\alpha2 pegiladas pueden determinarse tal como se describe en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US/US00/00931.

Para la pegilación de la muteína Q5C, se diluyó la proteína purificada hasta proteína 100 \mug/ml con Tris 100 mM, pH 8. Se añadió un exceso de 15 veces de maleimida-PEG de 5 kDa seguido por un exceso molar de 10-15 veces de TCEP. También se añadió EDTA (concentración final de 0,5 mM) para inhibir la formación de disulfuro una vez que la proteína está parcialmente reducida. La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente, 2 horas. Un método alternativo, que también dio una buena eficacia de pegilación, supuso adiciones repetidas de los reactivos PEG y TCEP. Se ha encontrado que 3 rondas de adición de reactivo PEG en exceso molar de 10X y TCEP en exceso molar de 10X durante un periodo de 2 horas dio más de un 80% de eficacia de pegilación. Este último procedimiento de adiciones repetidas de los reactivos de PEG y TCEP se utilizó satisfactoriamente para preparar Q5C modificado con PEG de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa. Las proteínas pegiladas se separaron del material de partida Q5C sin reaccionar y los reactivos de pegilación mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando el protocolo de S-Sepharose descrito en el ejemplo 5. Pueden usarse métodos alternativos tales como otros intercambiadores de iones (Q, DEAE, CM), resinas de HIC (fenilo, butilo), columnas de afinidad, columnas de exclusión molecular o resinas quelantes para purificar la proteína pegilada.

La actividad biológica de las proteínas Q5C-PEG de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa purificadas se midió en el ensayo de células de Daudi descrito en el documento PCT/US00/00931. Las concentraciones de las proteínas se determinaron usando un ensayo de unión a colorante de Bradford. Se determinó que las CI_{50} medias para las proteínas Q5C-PEG de 10 kDa, Q5C-PEG de 20 kDa y Q5C-PEG de 40 kDa eran de 70 pg/ml (N = 2 ensayos), 100 pg/ml (N = 8 ensayos) y 108 pg/ml (N = 8 ensayos), respectivamente.

Ejemplo 8

Clonación, expresión y purificación de G-CSF y G-CSF (C17S) de tipo natural

A. Clonación de secuencias de ADN que codifican para G-CSF. Se amplificó un ADNc que codifican para G-CSF mediante PCR a partir de ARN total aislado de la línea celular 5637 de carcinoma de vejiga humana (Colección Americana de Cultivos Tipo). Las células se hicieron crecer en medios RPMI 1640 complementados con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 \mug/ml. Se aisló el ARN de las células usando un kit de aislamiento de ARN RNeasy Mini adquirido de Qiagen, Inc. (Santa Clarita, CA) siguiendo las indicaciones del fabricante. La síntesis de la primera hebra del ADNc monocatenario se llevó a cabo utilizando un kit de síntesis de ADNc de primera hebra para RT-PCR (AMV) de Boehringer Mannheim Corp y se utilizaron hexámeros aleatorios como cebador. Las reacciones de PCR posteriores usando los productos de la síntesis de la primera hebra como molde se llevaron a cabo con el cebador directo BB91 (5> CGCAAGCTTGCCACCATGGCTGGACCTGCCACCCAG >3; SEQ ID NO: 1) y el cebador inverso BB92 (5> CGCGGATCCTCCGGAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG >3; SEQ ID NO: 3). El cebador BB91 hibrida con el extremo 5' de la secuencia codificante para la señal de secreción de G-CSF y el cebador inverso, BB92, hibrida con el extremo 3' de la secuencia codificante de G-CSF. El producto de la PCR resultante de - 640 pb se digirió con Hind III y Bam HI, se purificó en gel y se clonó en el vector pCDNA3.1(+) que se había digerido con Hind III y Bam HI, se trató con fosfatasa alcalina y se purificó en gel. Un clon con la secuencia correcta de ADN (Souza et al., 1986; Nagata et al., 1986a,b) se denominó pCDNA3.1 (+)::G-CSFfus o pBBT165.

Se utilizó PCR para modificar este clon de G-CSF para la expresión periplásmica y citoplasmática en E. coli del G-CSF de tipo natural (tipo natural) y una variante en la que la cisteína libre que se produce de manera natural en la posición 17 se sustituyó por serina (C17S). La proteína de G-CSF de tipo natural contiene 5 cisteínas, dos de las cuales participan en la formación de puentes disulfuro críticos y una cisteína libre (C17) que está parcialmente oculta y no se requiere para la actividad (Ishikawa et al., 1992, Kuga et al., 1989, Lu et al., 1992, Wingfield et al., 1988). Para evitar las posibles dificultades producidas por las cisteínas no emparejadas, se construyó una variante que contenía la sustitución de Cys por Ser en la posición 17 (C17S) como molécula de plataforma. Todas las muteínas de cisteína posteriores se prepararon con la sustitución C17S presente. Se ha notificado que G-CSF (C17S) posee actividad biológica idéntica a G-CSF de tipo natural (Ishikawa et al., 1992, Lu et al., 1992).

El G-CSF secretado no contiene una metionina añadida en el extremo N-terminal y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de G-CSF que se produce de manera natural (Souza et al., 1986). Con el fin de expresar una forma secretada de G-CSF, se utilizó la PCR para fusionar la secuencia líder del gen de la enterotoxina estable térmicamente (STII) de E. coli (Picken et al., 1983) a la secuencia codificante para el G-CSF maduro y se añadió un codón de terminación TAA tras el residuo carboxilo terminal, P174. Al mismo tiempo, también se modificó la parte amino terminal de la secuencia que codifica para G-CSF. Todos los codones para prolina en las posiciones 2, 5, y 10 se cambiaron por CCG, y se introdujo un sitio de restricción Xho I cambiando el codón L18 de TTA a CTC con el fin de facilitar los posteriores procedimientos de mutagénesis.

Estas construcciones se llevaron a cabo en paralelo para los genes de tipo natural y C17S y se emplearon tres reacciones de PCR secuenciales. Para el constructo de C17S, la primera reacción utilizó el cebador directo BB116 (5> GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTGAAGAGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG >3;
SEQ ID NO: 3) y el cebador inverso BB114 (5> CGCGAATTCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG >3; SEQ ID NO: 4) y el ADNC de G-CSF clonado como molde. BB116 hibrida con el extremo 5' de la secuencia codificante del G-CSF maduro e introduce los cambios de codón observados anteriormente en P2, P5, P10 y L18 que no cambian los aminoácidos codificados. También introduce la mutación C17S (TGC => AGC) y cambia el codón de leucina en la posición 15 por el triplete preferido CTG. BB 114 hibrida con el extremo 3' (18 pb) de la secuencia codificante de G-CSF e introduce un codón de terminación de la transcripción TAA inmediatamente tras el residuo carboxilo terminal, P174. BB114 también contiene un sitio Eco RI para fines de clonación. Para el constructo de tipo natural, la primera reacción usó el cebador directo BB 117 (5> GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTTAAGTGCCTCGAG
CAAGTGCGTAAGATCCAG >3; SEQ ID NO: 5) y el cebador inverso BB 114 (secuencia anterior) con el ADNc clonado de G-CSF como molde. BB117 es idéntica a BB116 con dos excepciones; está presente el codón de C17 que se produce de manera natural, TGC, y el codón de L15 usado es CTT. Este CTT crea un sitio de restricción Afl II con el fin de proporcionar un método rápido y conveniente para distinguir los clones de C17 de tipo natural C17 de la variante de C17S. Los clones de C17S llevan el codón CTG en la posición 15 y, por tanto, carecen del sitio de restricción Afl II. El producto de PCR de \sim530 pb a partir de cada una de estas reacciones se purificó en gel y se utilizó como molde para la segunda reacción de PCR.

Para la segunda reacción, se amplificó cada uno de los productos de \sim530 pb purificados en gel con el cebador directo BB115 (5> ATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCGTACGCAACCCCGCTGGGCCCGGCCAGCTCC
CTG >3; SEQ ID NO: 6) y el cebador inverso BB114 (descrito anteriormente). La parte 3' (27 nucleótidos) de BB 115 hibrida con el extremo 5' de la secuencia codificante modificada del G-CSF maduro que es idéntica tanto en los productos de PCR de tipo natural como C17S. El segmento 5' (36 nucleótidos) de BB115 codifica para una parte del péptido líder de STII. Los productos de la PCR de \sim550 pb de cada una de estas reacciones secundarias se purificaron en gel y se usaron como molde para la ronda tercera y final de la PCR.

En la tercera reacción, cada uno de los productos purificados en gel de \sim550 se amplificó con el cebador directo BB11 5> CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG >3; SEQ ID NO: 7) y cebador inverso BB114 (descrito anteriormente). BB11 añade el resto del péptido líder de STII y contiene un sitio Nde I que solapa con el ATG iniciador del líder de STII, así como un sitio Xba I para fines de clonación. Los productos de \sim620 pb de estas reacciones se digirieron con Eco RI y Xba I y se clonaron en el vector plasmídico digerido de manera similar pBC-SK(+) (Stratagene) para su secuenciación.

Para el constructo de tipo natural, se encontró que un clon, denominado pBBT187, contenía la secuencia correcta para el segmento de 620 pb Nde I - Eco RI que contiene la secuencia codificante de STII-G-CSF. Este fragmento se subclonó entonces en el vector de expresión cortado (Nde I + Eco RI) pCYB1 (New England BioLabs). El plásmido resultante se denominó pBBT188. Para el constructo C17S, se encontró que ninguno de los tres clones secuenciados contenía la secuencia correcta; todos tenían uno o más errores. Un clon contenía una única mutación sin sentido en la posición A10 de la secuencia líder de STII; el resto de la secuencia del segmento de 620 pb Nde I - Eco RI era correcto. Se usó la recombinación in vitro entre este clon y el plásmido pBBT188 para generar un constructo de STII-G-CSF(C17S) de la secuencia correcta en pCYB1 pBBT188 y el clon de C17S que contenía la única mutación sin sentido en la posición A10 de la secuencia líder de STII, se digirieron con Bsi WI y Eco RI. El único sitio Eco RI presente en cualquiera de los plásmidos es el que sigue al codón de terminación de la traducción de G-CSF. Bsi WI también corta sólo una vez en un sitio dentro de la secuencia codificante del péptido líder de STII, 7 pb desde el comienzo de la secuencia codificante del GCSF maduro. Por tanto, mediante la sustitución del fragmento Bsi WI - Eco RI de \sim535 pb de pBBT188 por el fragmento Bsi WI - Eco RI de \sim535 pb que tiene la secuencia de constructo de C17S correcta, se generó un pCYB1 derivado del expresado en la secuencia codificante de STII-G-CSF(C17S). Este plásmido se denominó pBBT223.

Para la expresión citoplasmática en E. coli se modificaron los genes STII-G-CSF(C17S) y STII-G-CSF de tipo natural donados mediante PCR para eliminar las secuencias líder de STII y ayudar a un codón de metionina iniciador (ATG) que precede inmediatamente al codón del aminoácido del extremo amino terminal (T1) del G-CSF maduro. Los clones STII-G-CSF(C17S) y STII-G-CSF de tipo natural de secuencia verificada se amplificaron con los cebadores BB166 (5> CGCCATATGACCCCGCTGGGCCCGGCCAG >3; SEQ ID NO: 8) y BB114 (descrito anteriormente). BB166 hibrida con el extremo 5' de la secuencia codificante del G-CSF maduro y codifica para una metionina iniciadora que precede al primer aminoácido del G-CSF maduro. Se incluyó un sitio Nde I, que solapa con el ATG para fines de donación. Los productos de \sim540 pb de estas reacciones de PCR se digirieron con Nde I más Aat II, que corta \sim400 pb tras el sitio Nde I. Estos fragmentos de \sim400 pb se purificaron en gel y se donaron en pBBT187, el constructo pBC-SK(+)::STII-G-CSF descrito anteriormente, que se había cortado con Nde I más Aat II, se trataron con fosfatasa alcalina y purificaron en gel. Se secuenció un clon de Met-G-CSF de tipo natural y uno de Met-G-CSF(C17S) y se encontró que ambos contenían las secuencias correctas. Estos genes de Met-G-CSF de tipo natural y Met-G-CSF(C17S) se subclonaron como fragmentos Nde I - Eco RI en el vector de expresión cortado en Nde I - Eco RI, pCYB1, que se describió anteriormente. Los plásmidos resultantes se denominaron: pBBT225 = pCYB1::Met-G-CSF y pBBT226 = pCYB1::Met-G-CSF(C17S).

B. Expresión de G-CSF de tipo natural y G-CSF (C17S) en E. coli . pBBT225, que codifica para Met-G-CSF de tipo natural, pBBT226 que codifica para Met-G-CSF(C17S) y el vector original pCYB1, se transformaron en E. coli JM109. Los experimentos con estas cepas dieron como resultado la expresión de proteínas de G-CSF. El G-CSF secretado, tanto las formas C17S como de tipo natural, son preferibles porque carecen del residuo de metionina de tipo natural en el extremo N-terminal de las proteínas Met-G-CSF expresadas en el citoplasma.

Para la expresión del G-CSF secretado, se transformaron pBBT188 [pCYBI::STII-G-CSF], pBBT223 [pCYB1::
STII-G-CSF(C17S)] y el vector original pCYB1 en E. coli W3110. Las cepas resultantes se denominaron BOB130: W3110(pCYB1), BOB213: W3110(pBBT188) y BOB268: W3110(pBBT223). En los procedimientos de selección preliminares, las cepas se hicieron crecer durante la noche en caldo Luria (medios LB) que contenían ampicilina 100 \mug/ml a 37ºC en tubos rodantes. Los cultivos saturados durante la noche se diluyeron hasta \sim 0,025 de D.O., a A_{600} en LB que contenían ampicilina 100 \mug/ml y se incubaron a 28, 37 ó 42ºC en matraces con agitación. Normalmente se hizo crecer un cultivo de 25 ml en un matraz con agitación de 250 ml. Cuando la D.O. del cultivo alcanzó \sim0,3 - 0,5, se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión de G-CSF. Para los experimentos iniciales, se tomaron muestras del cultivo a 0, 1, 3, 5 y \sim16 h tras la inducción. Se analizaron las muestras de cultivos inducidos y no inducidos mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) en geles de Tris-glicina - poliacrilamida al 14% y teñidos con azul de Coomassie. Los cultivos inducidos tanto de BOB213 (tipo natural) como de BOB268 (C17S) mostraron una banda aproximadamente a 19 kDa, lo que concuerda con el peso molecular del G-CSF maduro. Esta banda no se detectó en los cultivos no inducidos de BOB213 y BOB268 ni en los cultivos inducidos o no inducidos de BOB130, el control con vector únicamente. Los análisis de inmunotransferencia de tipo Western mostraron que esta banda de \sim19 kDa en los lisados de BOB213 y BOB268 reaccionaba fuertemente con un antisuero anti-G-CSF humano (R&D Systems). Este anticuerpo no reconoció las proteínas en los cultivos no inducidos de BOB213 y BOB268 ni el los cultivos inducidos o no inducidos de BOB130, el control con vector únicamente. Estas inmunotransferencias de tipo Western también mostraron que esta banda de \sim19 kDa migraba conjuntamente con un patrón de G-CSF humano comercial adquirido de R &. D Systems. Este resultado sugiere que el péptido líder de STII se había eliminado, lo que concuerda con que la proteína se había secretado al periplasma. Los estudios de secuenciación del extremo N-terminal presentados en el ejemplo 10 indican que la secuencia señal de STII se había procesado apropiadamente.

Las muestras 16 horas tras la inducción de cultivos a 28ºC y 37ºC también se sometieron a choque osmótico basándose en el procedimiento de Koshland y Botstein (1980). Este procedimiento rompe la membrana externa de E. coli y libera el contenido del periplasma en el medio circundante. La centrifugación posterior separa los componentes periplásmicos solubles (recuperados en el sobrenadante) de los componentes asociados a la célula y periplásmicos insolubles y citoplasmáticos (recuperados en el sedimento). A ambas temperaturas, se recuperaron en el sobrenadante algunas de las proteínas de G-CSF sintetizadas, tanto para el tipo natural mediante BOB213 como para C17S mediante BOB268, pero la mayor parte de las proteínas de G-CSF permanecieron asociadas con el sedimento. Esto indica que aunque la proteína parece procesarse y secretarse hacia el periplasma, se acumula allí principalmente de una forma insoluble.

La selección preliminar de las condiciones de expresión para el G-CSF de tipo natural y la variante C17S demostró que ambas proteínas se expresaban relativamente bien en una variedad de condiciones. Para la expresión y purificación a gran escala, los cultivos se hicieron crecer a 28ºC y se indujeron durante -16 horas.

C. Purificación de G-CSF de tipo natural y G-CSF (C17S). G-CSF (C17S) y de tipo natural se expresaron y se purificaron a mayor escala usando protocolos idénticos. Los cultivos recientes saturados durante la noche de BOB213 (tipo natural) y BOB268 (C17S), se inocularon a \sim 0,05 de D.O. a A_{600} en LB que contenía ampicilina 100 \mug/ml. Normalmente, se hicieron crecer cultivos de 400 ml en un matraz con agitación con deflectores de 2 l a 28ºC en un baño de agua con agitador giratorio a 250 rpm. Cuando los cultivos alcanzaron una densidad de - 0,5 - 0,7 de D.O., se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM. Los cultivos inducidos se incubaron entonces durante la noche durante \sim16 h. Las células se sedimentaron por medio de centrifugación y se congelaron a -80ºC. Los sedimentos celulares se descongelaron y se trataron con 5 ml de reactivo de extracción de proteína bacteriana B-PER^{TM} según los protocolos del fabricante (Pierce). El material insoluble, que contenía la mayor parte de la proteína de G-CSF se recuperó mediante centrifugación y se resuspendió en B-PER. Esta mezcla se trató con lisozima (200 \mug/ml) durante 10 min para alterar adicionalmente las paredes celulares y se añadieron MgCl_{2} (concentración final de 10 mM) y ADNasa libre de proteasa (2 \mug/ml). Se recogió el G-CSF insoluble mediante centrifugación y se lavó mediante resuspensión en agua y centrifugación de nuevo para eliminar la mayor parte de los desechos celulares solubilizados. El sedimento resultante que contenía el G-CSF insoluble se disolvió en 20 ml de urea 8 M, cisteína 25 mM en base Tris 20 mM. Esta mezcla se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, después se diluyó en 100 ml de fosfato de sodio 40 mM, sulfato de cobre 40 \muM, glicerol al 15%, pH 8,0. Esta mezcla de replegamiento se mantuvo a 4ºC durante 2 días. El pH de la mezcla de replegamiento se ajustó entonces a 4,0 con HCl diluido y la mezcla se centrifugó antes de cargarse en una columna de 5 ml de S-Sepharose (Pharmacia HiTrap) equilibrada en fosfato de sodio 40 mM, pH 4,0 (tampón A). Las proteínas unidas se eluyeron con gradiente salino lineal de 0-100%, tampón B (NaCl 500 mM, fosfato de sodio 40 mM, pH 4,0). El G-CSF de tipo natural y el G-CSF (C17S) eluyeron de la columna de S-Sepharose como picos principales individuales a una concentración salina de aproximadamente NaCl 300-325 mM. Las fracciones de la columna se analizaron mediante SDS-PAGE no reductor. Se reunieron las fracciones que contenían G-CSF e impurezas no visibles. Los rendimientos finales de G-CSF tipo natural y G-CSF (C17S), tal como se determinaron mediante el análisis de Bradford, fueron de aproximadamente 1,1 mg y 3,3 mg, respectivamente a partir 400 ml de cultivo. El G-CSF de tipo natural y G-CSF (C17S) purificados migraron conjuntamente en condiciones reductoras y no reductoras de SDS-PAGE. Los pesos moleculares aparentes de G-CSF y GCSF (C17S) reducidos y no reducidos son de aproximadamente 19 y 17 kDa, respectivamente.

D. Actividades biológicas de G-CSF de tipo natural y G-CSF (C17S) in vitro . Se desarrolló un ensayo de proliferación celular usando la línea celular murina NFS60 para medir las actividades biológicas del G-CSF de tipo natural y G-CSF (C17S). La línea celular NFS60 se obtuvo del Dr. J. Ihle de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tennessee, Memphis Tennessee. Esta línea celular prolifera en respuesta a G-CSF o IL-3 humanos o de ratón (Weinstein et al., 1986). Las células se mantuvieron en medios RPMI 1640 complementados con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/mi, estreptomicina 50 \mug/ml e IL-3 de ratón 17-170 unidades/ml (R&D Systems). Se llevaron a cabo ensayos biológicos en medios de mantenimiento celular sin IL-3. En general, los ensayos biológicos se planearon lavando las células NFS60 tres veces con medios RPMI media (sin aditivos) y resuspendiendo las células a una concentración de 0,5-1 x 10^{5}/ml en medios de mantenimiento celular sin IL-3. Se tomaron alícuotas de cincuenta \mul (2,5-5 x 10^{3} células) de la suspensión celular por pocillo de prueba de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano. Se prepararon diluciones seriadas de las muestras de la proteína a probar en medios de mantenimiento sin IL-3. Se analizaron en paralelo las diluciones seriadas del G-CSF humano recombinante (expresado en E. coli; R&D Systems). Se añadieron 50 \mul de las muestras de proteína diluidas a los pocillos de prueba y las placas se incubaron a 37ºC en un incubador de cultivo tisular humidificado en CO_{2} al 5%. Las muestras de proteínas se sometieron a ensayo en pocillos por triplicado. Tras aproximadamente 48-72 h, se añadieron 20 \mul del kit de ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega Corporation) a cada pocillo y las placas se incubaron a 37ºC en el incubador de cultivo tisular durante 1-4 h. Se leyó la absorbancia de los pocillos a 490 nm usando un lector de microplacas. Los pocillos control contenían medios pero no células. Los valores medios de absorbancia para los pocillos control por triplicado se restaron de los valores medios obtenidos de los pocillos de prueba. Se calcularon las CE_{50}, las concentraciones a la mitad de la estimulación máxima, para cada muestra.

La línea celular NFS60 muestra una fuerte respuesta proliferativa frente a G-CSF, tal como se pone de manifiesto mediante el aumento dependiente de la dosis en el número de células y los valores de la absorbancia. El G-CSF comercial y el G-CSF preparado tenían CE_{50} medias de 19 y 10 pg/ml, respectivamente, en el ensayo biológico (tabla 6). Inesperadamente, G-CSF (C17S) tenía una CE_{50} media de 7 pg/ml y era reproduciblememente de 1,5 a 2 veces más potente que el patrón de G-CSF de tipo natural y -3 veces más potente que el patrón de G-CSF de tipo natural comercial en el ensayo biológico (tabla 3). La actividad superior de G-CSF (C17S) fue sorprendente porque se había informado que G-CSF de tipo natural y G-CSF (C17S) tenían actividades idénticas (Lu et al., 1992).

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Ejemplo 9

Construcción, expresión, purificación y actividad biológica de muteínas de cisteína de G-CSF (C17S) A. Construcción de muteínas de cisteína de G-CSF

Se construyeron quince genes de G-CSF mutantes usando procedimientos de mutagénesis basada en PCR dirigida al sitio similares a los descritos en el documento PCT/US00/00931 e Innis et al. (1990) y White (1993). Se construyeron cinco muteínas en la región amino-terminal próxima a la hélice A [*-1C (la adición de un residuo de cisteína en el extremo amino-terminal natural), T1C, L3C, A6C y S7C]; dos muteínas en el bucle B-C [E93C y S96C]; seis muteínas en el bucle C-D [A129C, T133C, A136, A139C, A141C y S142C]; y dos muteínas en la región carboxilo-terminal distal a la hélice D [Q173C y *175C (la adición de un residuo de cisteína al extremo carboxilo-terminal natural)]. Todas las muteínas de cisteína de G-CSF se construyeron basándose en C17S para evitar posibles dificultades y/o ambigüedades que pueden estar provocadas por la cisteína no emparejada normalmente presente en la posición 17 en G-CSF de tipo natural. Se había notificado previamente que G-CSF (C17S) tenía actividad biológica completa (Ishikawa et al., 1992; Lu et al., 1992) y en el sistema de secreción de E. coli de los investigadores se encontró que los rendimientos de C17S purificada son superiores que los de G-CSF de tipo natural purificada. Además, en el ensayo in vitro, la C17S recombinante es más activa que G-CSF de tipo natural producida por los investigadores y una segunda G-CSF de tipo natural recombinante producida por E. coli obtenida de un distribuidor comercial (R&D Systems, Inc.).

El molde usado para las reacciones de PCR mutagénicas fue el plásmido pBBT227 en el que se clonó el gen STII-G-CSF (C17S) a partir de pBBT223 (descrito en el ejemplo 8) como un fragmento Nde I - Eco RI en Puc18 cortado en Nde I - Eco RI. Se digirieron los productos de PCR con endonucleasas de restricción apropiadas, se purificaron en gel y se ligaron a ADN del vector pBBT227 que se había cortado con esas mismas enzimas de restricción, tratado con fosfatasa alcalina, y purificado en gel. Se hicieron crecer los transformantes de estas ligaciones y se aislaron y secuenciaron los ADN de plásmido. Se determinó la secuencia del fragmento de PCR mutagenizado clonado en su totalidad para verificar la presencia de la mutación de interés, y la ausencia de cualquier mutación adicional que podría potencialmente introducirse mediante la reacción PCR o mediante los cebadores oligonucleotídicos sintéticos.

Se construyó la mutación de sustitución por cisteína L3C como sigue. El oligonucleótido directo mutagénico BB172 (5> ACCAACGCGTACGCAACCCCGTGTGGCCCGGCCAGC >3; SEQ ID NO: 9) se diseñó para cambiar el codón CTG para leucina en la posición 3 de G-CSF maduro a una cisteína que codifica para TGT y para extenderse sobre el sitio Mlu I próximo. Se usó este oligonucleótido en PCR con el cebador inverso, no mutagénico BB188 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID NO: 10) que hibrida con las secuencias de ADN que codifican para los residuos de aminoácidos 21 -27 de G-CSF maduro en pBBT227. Se llevó a cabo una reacción PCR de 100 \mul en 1X tampón de PCR Promega que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, cada cebador a 0,4 \muM, cada uno de dATP, dGTP, dTTP y dCTP a 200 \muM, 3 ng de plásmido de molde pBBT227 (descrito anteriormente), 2,5 unidades de Taq polimerasa (Promega), y 0,5 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene). Se llevó a cabo la reacción en un ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 2400. El programa de reacción implicaba: 96ºC durante 3 minutos, 25 ciclos de [95ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos] y un mantenimiento a 4ºC. Se analizó una alícuota de 10 \mul de la reacción PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y se halló que producía un único fragmento del tamaño esperado \sim 100 pb. Se "limpió" lo que quedaba de la reacción usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor y se digirió con Mlu I y Xho I (New England BioLabs) según los protocolos del distribuidor. Tras una etapa de limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se ligaron los productos de digestión con pBBT227 que se había cortado con Mlu I y Xho I, tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y purificado en gel. Se usó la reacción de ligamiento para transformar E. coli y se secuenciaron plásmidos a partir de transformantes resultantes. Se identificó un clon que tenía la mutación L3C y la secuencia correcta a lo largo del segmento Mlu I - Xho I de -70 pb.

Se construyó la mutación de sustitución T1C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para L3C con la siguiente diferencia. El oligonucleótido mutagénico BB171 (5> ACCAACGCGTACG
CATGCCCGCTGGGCCCGGCCAGC >3; SEQ ID NO: 11), que cambia el codón ACC para T1 por un codón TGC para cisteína y se expande sobre el sitio Mlu I próximo, se usó en la reacción PCR en lugar de BB172.

Se construyó la mutación de sustitución Q173C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para L3C con las siguientes diferencias.

El oligonucleótido inverso mutagénico BB185 (5> CGCGAATTC TTAGGGACAGGCAAGGTGGCG >3; SEQ ID NO: 12), que cambia el codón CAG para Q173 por un codón TGT para cisteína y se expande sobre el sitio Eco RI próximo, se usó en la reacción PCR en lugar de BB172. El cebador directo, no mutagénico BB187 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID NO: 13) que hibrida con la secuencia de ADN que codifica para los residuos de aminoácidos 78 - 84 de G-CSF maduro en pBBT227, se usó en lugar de BB188. Se analizó una alícuota de 10 \mul de la reacción PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y se halló que producía un único fragmento del tamaño esperado - 300 pb. Se "limpió" lo que quedaba de la reacción usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor y se digirió con Sty I y Eco RI (New England BioLabs) según las instrucciones del distribuidor. Tras una etapa de limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se pasaron los productos de digestión en un gel de agarosa al 1,5% y se purificó en gel el fragmento de interés Sty I - Eco RI de \sim220 pb usando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor. Se ligó el fragmento purificado en gel con pBBT227 que se había cortado con Sty I y Eco RI, tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y purificado en gel. Se usó la reacción de ligamiento para transformar E. coli y se secuenciaron plásmidos a partir de transformantes resultantes. Se identificó un clon que tenía la mutación Q173C y la secuencia correcta a lo largo del segmento Sty I - Eco RI de \sim220 pb.

También se construyó una mutación que añadía una cisteína que seguía el aminoácido carboxilo-terminal de la secuencia codificante de G-CSF. Este mutante, denominado *175C se construyó usando los protocolos descritos anteriormente para la construcción del mutante Q173C con las siguientes diferencias. El oligonucleótido mutagénico BB186 (5> CGCGAATTCTTAACAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG >3; SEQ ID NO: 14), que inserta el codón TGT para cisteína entre el codón CCC para P174 y un codón de parada TAA y se expande sobre el sitio Eco RI próximo, se usó en la reacción PCR en lugar de BB 185.

Se construyó la mutación de sustitución A6C usando la técnica de "mutagénesis por extensión de solapamiento" tal como se describe en Horton et al. (1993) y el documento PCT/US00/00931. Las reacciones PCR iniciales, o "primarias" para la construcción A6C se realizaron en un volumen de reacción de 50 \mu1 en 1X tampón de PCR de Promega que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, cada cebador a 0,4 \muM, cada uno de dATP, dGTP, dTTP y dCTP a 2001 \muM, 1 ng de plásmido de molde pBBT227, 1,5 unidades de Taq polimerasa (Promega), y 0,25 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene). Se llevaron a cabo las reacciones en un ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 2400. El programa de reacción implicaba: 96ºC durante 3 minutos, 25 ciclos de [95ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos] y un mantenimiento a 4ºC. Los pares de cebadores usados fueron [BB173 x BB188] y [BB174 x BB125]. BB188 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID NO: 10) híbrida con secuencias de ADN que codifican para los residuos de aminoácidos 21 -27 de G-CSF maduro en pBBT227. BB125 (5> CTATGCGGCATCA
GAGCAGATA >3; SEQ ID NO: 17) hibrida con la secuencia del vector pUC18 de \sim20 pb en sentido 5' de la secuencia de G-CSF clonada. BB 173 y BB 174 son oligonucleótidos mutagénicos complementarios que cambian el codón GCC para A6 por el codón TGC para cisteína. La secuencia de BB173 es (5> CCGCTGGGCCCGTGCAGCTCCCTGCCG >3; SEQ ID NO: 15) y la secuencia de BB 174 es (5> CGGCAGGGAGCTGCACGGGCCCAGCGG >3; SEQ ID NO: 16). Se pasaron los productos de PCR en un gel de agarosa al 2%, que mostró que las reacciones PCR de [BB173 x BB188] y [BB174 x BB125] daban productos de los tamaños esperados: -80 pb para [BB173 x BB188] y -140 pb para [BB174 x BB125]. Se eliminaron estos fragmentos del gel, se combinaron, y eluyeron juntos de las láminas de gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor y se recuperaron en 30 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,5). Entonces se "cortaron y empalmaron" juntos estos dos fragmentos mutagenizados en la reacción PCR posterior, o "secundaria". En esta reacción se usaron como moldes 3 \mul de los productos de PCR purificados en gel de las reacciones primarias y BB125 y BB188 se usaron como cebadores. El volumen de reacción fue de 100 \mul y se emplearon 2,5 unidades de Taq polimerasa y 0,5 unidades de Pfu polimerasa. Por lo demás, las condiciones de reacción eran idénticas a las empleadas en las reacciones primarias. Se analizó una alícuota de la PCR secundaria mediante electroforesis en gel de agarosa y se observó la banda esperada de \sim190 pb. Se "limpió" la mayor parte de la reacción PCR secundaria usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen), se digirió con Nde I y Eco I (New England BioLabs) según los protocolos del distribuidor. Tras una limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se ligaron los productos de digestión con pBBT227 que se había cortado con Nde I y Xho I, tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y purificado en gel. Se usó la reacción de ligamiento para transformar E. coli y se secuenciaron plásmidos a partir de transformantes resultantes para identificar un clon que contenía la mutación A6C y que tenía la secuencia correcta a lo largo del segmento Nde I - Xho I de \sim130 pb.

Se construyó la mutación de sustitución S7C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para A6C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB175 (5> CTGGGCC
CGGCCTGCTCCCTGCCGCAG >3; SEQ ID NO: 18) y BB176 (5> CTGCGGCAGGGAGCAGGCCGGGCCCAG >3; SEQ ID NO: 19), que cambian el codón AGC para S7 por un codón TGC para cisteína, sustituyeron a BB173 y BB174 respectivamente en las reacciones PCR primarias.

Se construyó una mutación que añadía un codón de cisteína antes del codón para el resido amino-terminal, T1, de G-CSF maduro y se verificó la secuencia. Esta mutación, denominada *-1C, se construyó usando el protocolo descrito anteriormente para la construcción de A6C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB206 (5> AACCCGTACGCATGTACCCCGCTGGGC >3; SEQ ID NO: 20) y BB207 (5> GCCCAGCGGGG
TACATGCGTACGCGT >3; SEQ ID NO: 21), que insertan un codón TGC para cisteína entre el codón GCA para el residuo carboxilo-terminal de la secuencia líder de STII y el codón ACC para el residuo amino-terminal de G-CSF maduro en pBBT227, sustituyeron a BB173 y BB174 respectivamente en las reacciones PCR primarias. Se llevaron a cabo las reacciones PCR primarias en un volumen de reacción de 20 \mul. Cada cebador estaba presente a 0,5 \muM. La reacción incluía 0,5 ng de plásmido de molde pBBT227, 2 unidades de Taq polimerasa, y 0,25 unidades de Pfu polimerasa. El programa de reacción implicaba: 95ºC durante 3 minutos, 25 ciclos de [94ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos] y un mantenimiento a 4ºC. Se cargaron directamente los productos de las reacciones primarias sobre un gel de agarosa al 2% preparativo. Las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim100 pb para [BB206 x BB188] y \sim125 pb para [BB207 x BB125]. En la PCR secundaria, el volumen de reacción fue de 100 \mul, se usaron 5 \mul de los productos de PCR purificados en gel de las reacciones primarias como molde, BB187 y BB126 se usaron como cebadores, y se emplearon 4 unidades de Taq polimerasa y 0,25 unidades de Pfu polimerasa. Por lo demás, las condiciones de reacción fueron idénticas a las usadas en las reacciones primarias.

Se construyó la mutación de sustitución A129C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para A6C con las siguientes diferencias. Las reacciones PCR primarias emplearon pares de cebadores [BB177 x BB126] y [BB178 x BB187]. El cebador inverso, no mutagénico BB126 (5> TGTGGAATTGTGAGCG
GATAAC >3; SEQ ID NO: 22) hibrida con la secuencia del vector pUC18 de \sim40 pb en sentido 3' de la secuencia de G-CSF clonada. El cebador directo, no mutagénico BB187 (5> GCCATCGCCCTGGATCTTACG >3; SEQ ID NO: 13) hibrida con la secuencia de ADN que codifica para los residuos de aminoácidos 78 - 84 de G-CSF maduro en pBBT227. BB177 y BB178 son oligonucleótidos mutagénicos complementarios que cambian el codón GCC para A129C por un codón TGC para cisteína. La secuencia de BB177 es (5> GGAATGGCCCCTTGCCTGCAGCCCACC >3; SEQ ID NO: 23) y la secuencia de BB178 es (5> GGTGGGCTGCAGGCAAGGGGCCATTCC >3; SEQ ID NO: 24). Los productos de las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim220 pb para [BB177 x BB126] y \sim170 pb para [BB178 x BB187]. La PCR secundaria empleó BB187 y BB126 como cebadores y produjo un producto del tamaño esperado: \sim360 pb. Se digirió este producto con Sty I y Eco RI (New England BioLabs) según los protocolos del distribuidor. Tras una limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se ligaron los productos de digestión con pBBT227 que se habían cortado con Sty I y Eco RI, tratados con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y purificados en gel. Se usó la reacción de ligamiento para transformar E. coli y se secuenciaron plásmidos de transformantes resultantes para identificar un clon que contenía la mutación A129C y que tenía la secuencia correcta a lo largo del segmento Sty I - Eco RI de \sim230 pb.

Se construyó la mutación de sustitución T133C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para A129C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB179 (5> GCCCTG
CAGCCCTGCCAGGGTGCCATG >3; SEQ ID NO: 25) y BB180 (5> CATGGCACCCTGGCAGGGCTGCAGGGC >3; SEQ ID NO: 26), que cambian el codón ACC para T133 por un codón TGC para cisteína, sustituyeron a BB 173 y BB 174 respectivamente en las reacciones PCR primarias. Los productos de las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim205 pb para [BB179 x BB126] y \sim180 pb para [BB180 x BB187].

Se construyó la mutación de sustitución A139C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para A129C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB181 (5> GGTGCCATGCCGTGCTTCGCCTCTGCT >3; SEQ ID NO: 27) y BB182 (5> AGCAGAGGCGAAGCACGGCAT
GGCACC >3; SEQ ID NO: 28), que cambian el codón GCC para A139 por un codón TGC para cisteína, sustituyeron a BB173 y BB174 respectivamente en las reacciones PCR primarias. Los productos de las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim185 pb para [BB181 x BB126] y \sim200 pb para [BB 182 x BB187].

Se construyó la mutación de sustitución S142C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para A129C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB183 (5> CCGGCCTTCGCCTGTGCTTTCCAGCGC >3; SEQ ID NO: 29) y BB 184 (5> GCGCTGGAAAGCACAGGC
GAAGGCCGG >3; SEQ ID NO: 30), que cambian el codón TCT para S142 por un codón TGT para cisteína, sustituyeron a BB173 y BB174 respectivamente en las reacciones PCR primarias. Los productos de las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim180 pb para [BB183 x BB126] y \sim210 pb para [BB184 x BB187].

Se construyó la mutación de sustitución A136C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para A129C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB224 (5> CCCACC
CAGGGTTGCATGCCGGCCTTC >3; SEQ ID NO: 31) y BB225 (5> GAAGGCCGGCATGCAACCCTGGGTGGG >3; SEQ ID NO: 32), que cambian el codón GCC para A136 por un codón TGC para cisteína, sustituyeron a BB173 y BB174 respectivamente en las reacciones PCR primarias. Las reacciones PCR primarias se realizaron en un volumen de reacción de 20 \mul. Cada cebador estaba presente a 0,5 \muM. La reacción incluía 0,5 ng de plásmido de molde pBBT227, 2 unidades de Taq polimerasa, y 0,25 unidades de Pfu polimerasa. Se llevaron a cabo las reacciones en un ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 2400. El programa de reacción implicaba: 95ºC durante 3 minutos, 25 ciclos de [94ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos] y un mantenimiento a 4ºC. Se cargaron los productos de las reacciones primarias sobre un gel de agarosa al 2% preparativo. Las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim195 pb para [BB224 x BB126] y \sim190 pb para [BB225 x BB187]. En la PCR secundaria, el volumen de reacción fue de 100 \mul, se usaron 5 \mul de los productos de PCR purificados en gel de las reacciones primarias como molde, BB 187 y BB126 se usaron como cebadores, y se emplearon 4 unidades de Taq polimerasa y 0,25 unidades de Pfu polimerasa. Por lo demás, las condiciones de reacción fueron idénticas a las usadas en las reacciones primarias.

Se construyó la mutación de sustitución A141C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para A136C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB226 (5> ATGCCGGCCTTCTGCTCTGCTTTCCAG >3; SEQ ID NO: 33) y BB227 (5>CTGGAAAGCAGAGCAGAAGG
CCGGCAT >3; SEQ ID NO: 34), que cambian el codón GCC para A141 por un codón TGC para cisteína, sustituyeron a BB224 y BB225 respectivamente en las reacciones PCR primarias. Los productos de las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim180 pb para [BB226 x BB126] y \sim205 pb para [BB227 x BB187].

Se construyó la mutación de sustitución E93C usando la técnica de "mutagénesis por extensión de solapamiento". Las reacciones PCR primarias para la construcción de E93C se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 20 \mul en 1X tampón de PCR Promega que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, cada cebador a 0,5 \muM, cada uno de dATP, dGTP, dTTP y dCTP a 200 \muM, 0,5 ng de plásmido de molde pBBT227, 2 unidades de Taq polimerasa (Promega), y 0,25 unidades de Pfu polimerása (Stratagene). Se llevaron a cabo las reacciones en un ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 2400. El programa de reacción implicaba: 95ºC durante 3 minutos, 25 ciclos de [94ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos] y un mantenimiento a 4ºC. Los pares de cebadores usados fueron [BB218 x BB211] y [BB219 x BB210]. El cebador inverso, no mutagénico BB211 (5> GGCCATTCCCAGTTCTTC
CAT >3; SEQ ID NO: 35) hibrida con secuencias de ADN que codifican para los residuos de aminoácidos 121 - 127 de G-CSF maduro en pBBT227. El cebador directo, no mutagénico BB210 (5> TTC GTTTTCTCTATCGCTACCAAC >3; SEQ ID NO: 36) hibrida con secuencias de ADN que codifican para los residuos de aminoácidos 13 - 20 del péptido líder de STII en pBBT227. BB218 y BB219 son oligonucleótidos mutagénicos complementarios que cambian el codón GAA para E93 por un codón TGT para cisteína. La secuencia de BB218 es (5> CTGCAGGCCCTGTGTGG
GATCTCCCCC >3; SEQ ID NO: 37) y la secuencia de BB219 es (5> GGGGGAGATCCCACACAGGGCCTGCAG >3; SEQ ID NO: 38). Se cargaron directamente los productos de las reacciones primarias sobre un gel de agarosa al 2% preparativo que mostró que las reacciones PCR daban productos de los tamaños esperados: \sim115 pb para [BB218 x BB211] y \sim325 pb para [BB219 x BB210]. Se eliminaron estos fragmentos del gel, se combinaron, y eluyeron juntos de las láminas de gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor y se recuperaron en 30 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,5). En la reacción PCR secundaria, se usaron como molde 5 \mul de la combinación de productos de PCR purificados en gel de las reacciones primarias y BB211 y BB210 se usaron como cebadores. El volumen de reacción fue de 100 \mul y se emplearon 4 unidades de Taq polimerasa y 0,25 unidades de Pfu polimerasa. Por lo demás, las condiciones de reacción fueron idénticas a las usadas en las reacciones primarias. Se analizó una alícuota de la PCR secundaria mediante electroforesis en gel de agarosa, y se observó la banda esperada de \sim415 pb. Se "limpió" la mayor parte de la reacción PCR secundaria usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen), se digirió con Sty I y Xho I (New England BioLabs) según los protocolos del distribuidor. Tras una limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se ligaron los productos de digestión con pBBT227 que se había cortado con Sty I y Xho I, tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y purificado en gel. Se usó la reacción de ligamiento para transformar E. coli y se secuenciaron plásmidos a partir de transformantes resultantes para identificar un clon que contenía la mutación E93C y que tenía la secuencia correcta a lo largo del segmento Sty I - Xho I de \sim260 pb.

Se construyó la mutación de sustitución S96C y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para E93C con las siguientes diferencias. Los cebadores mutagénicos complementarios BB220 (5>CTG GAA GGG ATC TGC CCC GAG TTG GGT >3; SEQ ID NO: 39) y BB221 (5> ACC CAA CTC GGG GCA GAT CCC TTC CAG >3; SEQ ID NO: 40), que cambian el codón TCC para S96 por un codón TGC para cisteína, sustituyeron a BB218 y BB219 respectivamente en las reacciones PCR primarias. Los productos de las reacciones primarias dieron productos de los tamaños esperados: \sim110 pb para [BB220 x BB211] y \sim330 pb para [BB221 x BB210].

Para la expresión en E. coli como proteínas secretadas al espacio periplásmico, los genes STII-G-CSF (C17S) que codifican para las muteínas se eliminaron de los derivados de pBBT227 basados en pUC18 como fragmentos Nde I - Eco RI de \sim600 pb, se subclonaron en el vector de expresión pCYB1 y se transformaron en W3110 de E. coli.

Usando procedimientos similares a los descritos en el presente documento, se pueden construir muteínas de cisteínas de G-CSF y G-CSF (C17S). Las muteínas de cisteína pueden ser mutaciones de sustitución que sustituyen la cisteína por un residuo amino natural en la secuencia codificante de G-CSF, mutaciones de inserción que insertan un residuo de cisteína entre dos aminoácidos que se producen de manera natural en la secuencia codificante de G-CSF, o mutaciones de adición que añaden un residuo de cisteína que precede al primer aminoácido, T1, de la secuencia codificante de G-CSF o añaden un residuo de cisteína tras el residuo de aminoácido, P174, de la secuencia codificante G-CSF. Pueden sustituirse los residuos de cisteína por cualquier aminoácido, o insertarse entre dos aminoácidos cualquiera, en cualquier lugar en la secuencia codificante de G-CSF. Los sitios preferidos para sustituir o insertar residuos de cisteína en G-CSF están en la región que precede a la hélice A, el bucle A-B, el bucle B-C, el bucle C-D y la región distal a la hélice D. Otros sitios preferidos son los tres primeros o últimos aminoácidos de las hélices A, B, C, y D. Además de las mutaciones descritas anteriormente, otros residuos preferidos en estas regiones para crear sustituciones de cisteína son P2, G4, P5, S8, L9, P10, Q11, S12, T38, K40, S53, G55, I56, W58, A59, P60, L61, S62, S63, P65, S66, Q67, A68, Q70, A72, Q90, A91, L92, G94, 195, S96, E98, G100, G125, M126, Al27, Q131, Q134, G135, S142, A143, Q145 y P174. Todas las variantes descritas en este ejemplo se proporcionan en el contexto de la secuencia proteica natural o una proteína variante en la que se ha cambiado el residuo de cisteína "libre" que se produce de manera natural (cisteína-17) por otro aminoácido, preferiblemente serina o alanina.

También se pueden construir muteínas de G-CSF y G-CSF (C17S) que contienen una cisteína libre sustituyendo otro aminoácido por uno de los residuos de cisteína que se producen de manera natural en G-CSF que normalmente forma un enlace disulfuro. El residuo de cisteína que se produce de manera natural que normalmente forma un enlace disulfuro con el residuo de cisteína sustituido ahora está libre. Puede sustituirse el residuo de cisteína por cualquiera de los otros 19 aminoácidos, pero preferiblemente por un residuo de serina o alanina. Estas variantes se proporcionan en el contexto de la secuencia proteica natural o una proteína variante en la que se ha cambiado el residuo de cisteína "libre" (cisteína-17) que se produce de manera natural por otro aminoácido, preferiblemente serina o alanina. También puede introducirse un residuo de cisteína libre en G-CSF mediante la modificación química de un aminoácido que se produce de manera natural usando procedimientos tales como los descritos por Sytkowski et al.
(1998).

Usando procedimientos similares a los descritos en los ejemplos 8, 9, 10, 11 y 13, se pueden expresar las proteínas en E. coli, purificar las proteínas, pegilar las proteínas y medir sus actividades biológicas en bioensayos in vitro e in vivo. Pueden expresarse las proteínas citoplásmicamente en E. coli o como proteínas secretadas al espacio periplásmico. También pueden expresarse las muteínas en células eucariotas tales como células de insecto o de mamífero, usando procedimientos similares a los descritos en el documento PCT/US00/00931, o procedimientos relacionados bien conocidos por los expertos en la técnica. Si se desea la secreción de células eucariotas, puede usarse la secuencia señal de G-CSF natural, u otra secuencia señal para secretar las proteínas de células eucariotas.

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B. Expresión y purificación de muteínas de cisteína de G-CSF (C17S)

Se hicieron crecer, se indujeron y se recogieron cepas de E. coli que expresan 13 muteínas de G-CSF (C17S)
(*-1C, T1C, L3C, A6C, S7C, E93C, A129C, T133C, A136C, A139C, A141C, Q173C y *175C) usando los protocolos descritos en el ejemplo 8 que se emplearon para BOB213 (de tipo natural) y BOB268 (C17S). Todas las muteínas eran muy insolubles. Se replegaron las muteínas y se purificaron usando los protocolos descritos en el ejemplo 8 para G-CSF de tipo natural y G-CSF (C17S). El análisis por SDS-PAGE no reductor reveló que las 13 muteínas de cisteína purificadas se recuperaban predominantemente como monómeros, migrando a aproximadamente 17 kDa. Las muteínas purificadas migraron de manera conjunta con G-CSF (C17S) y G-CSF de tipo natural, con la excepción de la muteína *-1C, que migró ligeramente más despacio que G-CSF de tipo natural. Todas las muteínas salvo una se eluyeron de la columna de intercambio iónico a una concentración de sal similar a la de G-CSF (C17S) y G-CSF de tipo natural. La única excepción, E93C, se eluyó más tarde durante el gradiente (concentración de NaCl de aproximadamente 400 mM), posiblemente debido a la sustitución de cisteína por el aminoácido cargado, ácido glutámico.

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C. Actividades biológicas de muteínas de cisteína de GCSF (C17S)

Se sometieron a ensayo las 13 muteínas de cisteína de G-CSF (C17S) purificadas en el ensayo de proliferación celular DE NFS60 descrito en el ejemplo 8. Se determinaron las concentraciones de proteína usando un kit de ensayo de proteína de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Se analizaron en paralelo G-CSF (C17S) y G-CSF de tipo natural y G-CSF de tipo natural comercial preparados por los investigadores los mismos días para controlar la variabilidad entre días en los ensayos. Las 13 muteínas estimularon la proliferación de las células NFS60 en el mismo grado que las proteínas control G-CSF de tipo natural, dentro del error del ensayo. Las CE_{50} medias para las 13 muteínas variaron desde 5-9 pg/ml. Las CE_{50} medias para las muteínas de cisteína fueron similares a la CE_{50} media de la proteína control de G-CSF (C17S) y de 1,5 a 2 veces menor, es decir, más potente, que la CE_{50} media para la proteína control G-CSF de tipo natural de los investigadores y \sim3 veces menor que la CE_{50} media para la proteína de G-CSF de tipo natural comercial. Estos datos se resumen en la tabla 6.

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TABLA 6

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D. Construcción de mutantes de cisteína de GCSF dobles

Pueden construirse mutantes múltiples que contienen dos o más residuos de cisteína libres o bien mediante rondas secuenciales de mutagénesis usando los procedimientos descritos en los ejemplo 9, 14 y 15, o bien alternativamente mediante la recombinación in vitro de mutantes individuales para construir plásmidos de expresión recombinantes que codifican para muteínas que contienen dos o más residuos de cisteína libres. Los mutantes múltiples preferidos serían aquellos que combinasen dos o más muteínas de cisteína conservando cada una su actividad cuando se pegilaran. Ejemplos serían L3C más T133C, L3C más *175C y T133C y *175C. Pueden deducirse otros mutantes múltiples preferidos basándose en los datos de la tabla 3 y tabla 4, e incluirían combinaciones que contienen dos o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en L3C, T133C, A141C y *175C.

Los investigadores construyeron los siguientes mutantes de cisteína de G-CSF dobles: L3C/T133C, L3C/*175C, y T133C/*175C. Para producir L3C/TI33C, se digirió el derivado L3C de pBBT227 (G-CSF C17S en pUC18) con Xho I y Eco RI, y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. Se extrajo el ADN usando el kit de limpieza de PCR de Qiagen, y se llamó vector G-CSF L3C X-R1-Cip. A continuación, se digirió el derivado T133C de pBBT227 con Xho I y Eco RI, y se purificó en gel el fragmento de \sim480 pb y se ligó con el vector G-CSF L3C X-R1-Cip. Se transformó JM109 de E. coli con la reacción de ligamiento y se identificaron los clones que tenían la secuencia correcta.

Para producir L3C/*175C, se digirió el derivado *175C de pBBT227 con Xho I y Eco RI, y se purificó en gel el fragmento de \sim480 pb y se ligó con el vector G-CSF L3C X-R1-Cip (véase anteriormente). Se transformó JM109 de E. coli con la reacción de ligamiento y se identificaron los clones que tenían la secuencia correcta.

Para producir T133C/*175C, el derivado T133C de pBBT227 sirvió como molde en una reacción PCR usando el cebador de oligonucleótido mutagénico inverso BB186 (5> CGC GAA TTC TTA ACA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG >3; SEQ ID NO: 14) y el oligonucleótido no mutagénico directo BB125, que hibrida con las secuencias del vector pUC18 en sentido 5' del inserto de G-CSF. La PCR fue una reacción de 50 \mul llevada a cabo en 1X tampón de PCR Promega que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, cada cebador a 0,4 \muM, cada uno de dATP, dGTP, dTTP y dCTP a 200 \muM, 0,5 ng de fragmento de molde, 1 unidad de Taq polimerasa (Promega), y 0,1 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene). La reacción se llevó a cabo en un ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 2400. El programa de reacción implicaba: 95ºC durante 5 minutos, 22 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos], un mantenimiento de 7 min a 72ºC y un mantenimiento a 4ºC. Se analizaron veinte \mul de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, y se aisló el fragmento de \sim630 pb del gel. Se digirió este fragmento con Xho I y Eco RI, se extrajo usando el kit de limpieza de PCR Qiagen. Se ligó este ADN a un vector preparado digiriendo el derivado T133C de pBBT227 con Xho I y Eco RI, tratando con fosfatasa alcalina de intestino de ternero y extrayendo usando el kit de limpieza de PCR Qiagen. Se transformó JM109 de E. coli con la reacción de ligamiento y se identificaron los colones que tenían la secuencia correcta.

Ejemplo 10 Pegilación, purificación y actividad biológica de muteínas de cisteína de G-CSF

A. Estudios de pegilación preliminares. Se determinaron las condiciones iniciales de reacción de pegilación usando T1C como la proteína de prueba, TCEP [Tris (2-carboxietil)fosfina]-HCl como el agente reductor y PEG sensibles a cisteína de 5 kDa de Shearwater Polymers, Inc. La sobre-reducción de la proteína se monitorizó mediante SDS-PAGE no reductora, buscando un desplazamiento superior al peso molecular aparente esperado como resultado de desplegamiento de la proteína, o la aparición de múltiples especies pegiladas generadas como resultado de reducción disulfuro nativa. Se incubaron alícuotas de un \mug de T1C purificadas con concentraciones crecientes de TCEP a temperatura ambiente en Tris 100 mM, pH 8,5 en presencia de cantidades variables de maleimida-PEG de 5 kDa o vinilsulfona-PEG de 5 kDa en exceso. Tras 60 min, las reacciones se analizaron inmediatamente mediante SDS-PAGE no reductora. Las cantidades de TCEP y reactivo PEG particular que produjeron proteína T1C monopegilada, sin modificar el G-CSF de tipo natural, se usaron para experimentos adicionales. Los experimentos de titulación indicaron que a pH 8,5, un exceso molar de TCEP de 10 veces y un exceso de maleimida-PEG de 5 kDa de 20 veces producían cantidades significativas de proteína T1C monopegilada (peso molecular aparente de 28 kDa mediante SDS-PAGE) sin proteína di o tripegilada detectable. G-CSF (C17S) y G-CSF de tipo natural no se modificaron en condiciones de pegilación idénticas. Se usaron estas condiciones de reacción para aumentar la escala de pegilación de las otras muteínas de G-CSF. Los experimentos control indicaron que la proteína T1C necesitaba reducirse parcialmente mediante tratamiento con un reductor tal como TCEP con el fin de pegilarse.

B. Preparación y purificación de muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas: Se pegilaron alícuotas de 200 a 300 \mug de las 13 muteínas de cisteína de G-CSF purificadas con maleimida-PEG de 5 kDa para proporcionar suficiente material para la purificación y caracterización. También se llevaron a cabo las mayores reacciones de pegilación durante 1 h a temperatura ambiente, usando las condiciones descritas anteriormente. Estas condiciones de reacción produjeron proteína monopegilada para todas las muteínas. Se han purificado once de las muteínas monopegiladas usando el procedimiento descrito a continuación. Al final del tiempo de reacción, la mezcla de pegilación se diluyó 10X con fosfato de sodio 40 mM (monobásico) y se ajustó el pH hasta 4,0 antes de cargarse rápidamente en una columna de S-Sepharose (1 ml, HiTrap) usando condiciones similares a las descritas para la purificación inicial de las muteínas de G-CSF (gradiente de 20 ml, NaCl 0-0,5 M en fosfato de sodio 40 mM pH 4). La presencia del resto PEG disminuyó la afinidad de la proteína por la resina, permitiendo que la proteína pegilada se separe de la proteína no pegilada. Los cromatogramas de las columnas de S-Sepharose mostraron dos picos de proteína principales que se eluían a aproximadamente NaCl 275 mM y NaCl 300-325 mM NaCl para la mayoría de muteínas. Se determinó mediante SDS-PAGE que el pico principal de elución temprana era la muteína de G-CSF (C17S) monopegilada. Se determinó que el pico principal que eluía más tarde era muteína de G-CSF (C17S) sin reaccionar. La muteína de PEG-E93C se eluyó a aproximadamente NaCl 325 mM frente a aproximadamente NaCl 400 mM de la proteína E93C sin reaccionar. Las fracciones del pico de elución temprana que contenían predominantemente la muteína de G-CSF (C17S) monopegilada se combinaron y usaron para mediciones de actividad biológica. También se pegilaron cinco muteínas de cisteína (L3C, T133C, A141C, Q173C y *175C) usando un PEG-maleimida de 20 kDa y los procedimientos de pegilación y purificación descritos anteriormente. Las proteínas pegiladas de 20 kDa se eluyeron de la columna de S-Sepharose a aproximadamente NaCl 250 mM. Los análisis por SDS-PAGE indicaron que las proteínas pegiladas purificadas contenían menos del 10%, y probablemente menos del 5%, de proteína sin pegilar. Las muteínas de cisteína necesitaban reducirse parcialmente mediante tratamiento con un reductor tal como TCEP con el fin de pegilarse. G-CSF (C17S) y G-CSF de tipo natural no se pegilaron en condiciones parcialmente reductoras idénticas, lo que indica que el resto de PEG se une al residuo de cisteína introducido en las muteínas.

C. Purificación y pegilación de muteína de cisteína de G-CSF L3C: Se llevaron a cabo los perfiles temporales de las reacciones de plegamiento y pegilación para L3C. Se encontró que el replegamiento para esta muteína particular era completo en 4 horas. Se monitorizó la evolución de la reacción de replegamiento mediante HPLC de fase inversa (columna C4). Los rendimientos fueron de \sim10 mg/400 ml de cultivo hecho crecer tal como se describió en el ejemplo 8. Se llevaron a cabo los perfiles temporales para la pegilación de la muteína L3C con PEG de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa. Las condiciones de reacción de pegilación fueron tal como se describió anteriormente en el ejemplo 10, con la excepción de que se incluyó EDTA 0,5 mM en los tampones de pegilación. Para reacciones de 0,5 - 1 mg, tiempos de reacción superiores de 2-4 h a temperatura ambiente produjeron cantidades superiores de producto pegilado. Las eficacias de pegilación fueron del \sim80% con el tiempo prolongado. Se llevaron a cabo reacciones de pegilación mayores (hasta 5 mg) con igual eficacia. Se purificó la proteína pegilada de la proteína no pegilada en una columna de S-Sepharose de 5 ml usando la metodología de purificación descrita previamente en el ejemplo 10. La proteína pegilada de 20 kDa se eluyó a NaCl \sim200 mM, mientras que la proteína PEG de 40 kDa y la proteína PEG de 10 kDa se eluyeron a \sim150 mM y -220 mM, respectivamente. La muteína L3C de G-CSF sin pegilar se eluyó a \sim260 mM. La presencia de EDTA redujo significativamente la formación de dímeros de proteína en la reacción de pegilación.

D. Secuenciación N-terminal de PEG-L3C de 20 kDa. El aminoácido N-terminal de G-CSF natural es treonina (Souza et al., 1986). La secuenciación N-terminal de la proteína PEG-L3C de 20 kDa purificada usando química de degradación de Edman automatizada produjo la secuencia TPXGPAS, que indica que el extremo N-terminal está procesado correctamente y es coherente con el tercer residuo que se está pegilando; los aminoácidos pegilados aparecen en blanco en series de secuenciación, tal como se indica por la X.

E. Determinación estructural de muteínas de cisteína de G-CSF pegilada mediante análisis de dicroísmo circular (DC): Se llevó a cabo un análisis de DC en un espectropolarímetro Jasco 720 CD en una celda de 300 \mul de camino óptico de 1 cm a temperatura ambiente. Se recogieron los datos a 260 nm-200 nm a una sensibilidad de 50mº y 32 acumulaciones. Se llevó a cabo la experimentación inicial con la muteína L3C y proteína PEG-L3C de 10K. Ambas tenían un espectro DC muy similar al hallado en la bibliografía para G-CSF de tipo natural. Pueden realizarse análisis similares en otras muteínas de cisteína de G-CSF y sus derivados pegilados.

F. Actividades biológicas de muteínas de cisteína de G-CSF (C17S) pegiladas: Se midieron las actividades biológicas de las 11 muteínas de cisteína de PEG-G-CSF (C17S) de 5 kDa purificadas y 5 muteínas de cisteína PEG-G-CSF (C17S) de 20 kDa purificadas en el ensayo de proliferación celular de NFS60 descrito en el ejemplo 8. Se determinaron las concentraciones de las proteínas usando un ensayo de unión a colorante de Bradford. Todas las muteínas de cisteína de G-CSF (C17S) pegiladas mostraron curvas de respuesta a la dosis similares y alcanzaron el mismo nivel de estimulación de crecimiento máximo que G-CSF (C17S), dentro del error del ensayo. Las CE_{50} medias para las muteínas de cisteína modificadas con PEG de 5 kDa se encontraban en el intervalo desde 2-11 pg/ml. Estas muteínas pegiladas eran de 1,5 a 2 veces más potentes que la G-CSF de tipo natural de los investigadores y \sim 3 veces más potentes que la G-CSF de tipo natural comercial en el bioensayo. Las CE_{50} medias para las muteínas de cisteína modificadas de 20 kDa se encontraban en el intervalo desde 9 hasta 14 pg/ml. Las actividades biológicas de las muteínas de cisteína G-CSF (C17S) pegiladas eran iguales a, o superiores a, las de G-CSF de tipo natural. Toda la actividad estimulante de la célula NFS60 de PEG-L3C de 5 kDa podría suprimirse mediante un anticuerpo monoclonal de neutralización frente a G-CSF (R & D Systems, Inc.), lo que indica que la actividad que promueve el crecimiento se debe a la proteína PEG-L3C G-CSF y no a un contaminante en la preparación de proteína. Se resumen los datos de actividad biológica en la tabla 7. Se determinó que la CE_{50} de L3C modificada con PEG de 40 kDa -PEG era de 30-50 pg/ml usando el ensayo de proliferación de células NFS60.

Las actividades biológicas de las muteínas de cisteína de G-CSF (C17S) pegiladas descritas en el presente documento son superiores a las actividades de proteínas de G-CSF pegiladas descritas anteriormente, de las que todas tienen actividades biológicas que disminuyen con respecto a G-CSF de tipo natural (Tanaka et al., 1991; Kinstler et al., 1996a; Bowen et al., 1999). Tanaka et al. (1991) notificaron que G-CSF modificada con un NHS-PEG de 10 kDa sensible a amina consistía en especies de múltiples pesos moleculares y múltiples isoformas modificadas en diferentes grupos lisina o el aminoácido N-terminal. Se determinó que la actividad biológica de esta mezcla de NHS-PEG disminuía aproximadamente 3 veces con respecto a G-CSF sin modificar (Tanaka et al., 1991; Satake- Ishikawa et al., 1992). Bowen et al. (1999) notificaron que una variante de G-CSF modificada con PEG sensibles a amina de 5 kDa, 10 kDa y 20 kDa disminuía aproximadamente 6 veces, 10 veces y 20 veces con respecto a G-CSF sin modificar. Bowen et al. (1999) purificaron una especie de un único peso molecular de la variante de G-CSF pegilada con un PEG sensible a amina de 20 kDa y hallaron que su actividad biológica disminuía aproximadamente 4 veces con respecto a G-CSF sin modificar. Aunque la especie de un único peso molecular aislada por Bowen et al. (1999) correspondía a la variante de G-CSF modificada con una única molécula de PEG, la preparación de PEG-proteína era heterogénea debido a que la molécula de PEG estaba unida a la proteína en múltiples sitios. Kinstler et al. (1996) purificaron una especie de Met-G-CSF pegilada que se modifica preferentemente en el residuo de metionina amino-terminal no natural de Met-G-CSF expresada por E. coli (expresada citoplásmicamente) por medio de uniones amina o amida. Esta proteína Met-G-CSF pegilada tenía sólo el 68% de la actividad biológica in vitro de Met-G-CSF de tipo natural (Kinstler et al., 1996).

TABLA 7

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Ejemplo 11

El uso de un agente bloqueante de cisteína mejora la recuperación de muteínas de cisteína de G-CSF plegadas de manera apropiada

G-CSF (C17S/Q173C) y G-CSF de tipo natural insolubles, expresadas por E. coli se replegaron mediante procedimientos que variaban la cantidad y tipo de agente reductor y la presencia o ausencia de cantidades catalíticas de sulfato de cobre. Se eligió ditiotreitol (DTT) 5 mM como el agente reductor convencional basándose en una referencia bibliográfica que describe su uso en un protocolo de replegamiento optimizado para G-CSF (Kuga et al., 1989). Lu et al. (1992) describe un protocolo para replegar/renaturalizar G-CSF insoluble que no tiene agente reductor presente durante la etapa de solubilización pero contiene sulfato de cobre 40 \muM en los tampones de renaturalización.

Se hicieron crecer cultivos (400 ml) de E. coli y se indujo la expresión de cada proteína de G-CSF tal como se describe en el ejemplo 8. Se lisaron las células y se aisló la parte insoluble mediante centrifugación tal como se describe en el ejemplo 8. El material insoluble, que contenía una gran parte de las proteínas de G-CSF insolubles, se suspendió en 20 ml de urea 8 M, Tris 20 mM, pH 8 y se agitó hasta homogeneidad. Se colocaron alícuotas de la mezcla en 6 tubos. Se añadieron DTT 5 mM o cisteína 25 mM a ciertos tubos tal como se describió en la tabla 6. Tras una hora se diluyeron las mezclas de solubilización en 25 ml de fosfato de sodio 40 mM, glicerol al 15%, pH 8 con y sin sulfato de cobre 40 \muM. Se dejaron reposar los replegamientos a 4ºC durante dos días. En este momento se ajustó el pH de cada uno hasta 4. Se centrifugaron los replegamientos, se cargaron los sobrenadantes en una columna de S-Sepharose y se purificaron las proteínas de G-CSF y Q173C de tipo natural tal como se describe en el ejemplo 8. Se combinaron las fracciones de la columna en base al análisis por SDS-PAGE no reductor, tal como se describe en el ejemplo 8. Se muestra la cantidad de cada proteína recuperada tras la cromatografía en la tabla 5.

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TABLA 8

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Tal como se muestra en la tabla 8 los mayores rendimientos de G-CSF de tipo natural y de muteína de cisteína de G-CSF se lograron cuando se usó cisteína como el agente reductor durante la etapa de solubilización. La presencia de sulfato de cobre (40 \muM) parece que potenció de manera marginal las recuperaciones cuando se usó junto con un agente reductor. El análisis por SDS-PAGE no reductor de proteínas de G-CSF de tipo natural recuperadas usando los protocolos de replegamiento A-F mostró que cada una contenía predominantemente una especie de un único peso molecular del tamaño esperado para G-CSF monomérico (aproximadamente 17 kDa en condiciones no reductoras). Por el contrario, cuando las combinaciones de la columna de S-Sepharose de los replegamientos A-D de G-CSF (C17S/Q173C) se analizaron mediante SDS-PAGE no reductora, la banda de producto final era ancha y contenía varias especies con peso molecular aparente diferente en el intervalo monomérico. Presumiblemente las especies monoméricas, de peso molecular diferente, representan distintas isoformas disulfuro de la proteína de G-CSF (C17S/Q173C). La proteína de G-CSF (C17S/Q173C) recuperada a partir de los replegamientos E y F apareció como una única banda pronunciada que migraba de manera conjunta con G-CSF de tipo natural, lo que indica que se había recuperado una única especie plegada predominante. Los datos muestran que la adición de cisteína durante las etapas de solubilización y replegamiento aumenta significativamente el rendimiento de la proteína de G-CSF (C17S/Q173C) plegada de manera apropiada. Sin querer limitarse a ninguna teoría particular, los investigadores postulan que la cisteína añadida forma un disulfuro mixto con el residuo de cisteína libre en la muteína. El disulfuro mixto limita posibles transposiciones de disulfuro que podrían producirse implicando el residuo de cisteína libre. La cisteína puede ser más eficaz que DTT porque DTT normalmente no forma disulfuros debido a un enlace intramolecular termodinámicamente preferido que se forma tras la oxidación.

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Ejemplo 12

Comparación de estabilidades de proteínas de G-CSF preparadas en presencia y ausencia de cisteína

Proteínas de G-CSF (C17S/Q173C) y G-CSF de tipo natural preparadas tal como se describió en el ejemplo 11 usando el procedimiento de replegamiento A (sin agente reductor, sin sulfato de cobre) y el procedimiento de replegamiento F (cisteína 25 mM, sulfato de cobre 40 \muM) se colocaron a 50ºC a pH 4 y pH 8. A los 0, 5 minutos, 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 5, y 20 horas, se centrifugaron las muestras de proteínas para eliminar cualquier precipitado de proteína desnaturalizada. Se eliminaron alícuotas de los sobrenadantes y se congelaron. Al final del experimento, se analizaron todas las alícuotas mediante SDS-PAGE no reductora para determinar qué parte de la muestra de proteína de G-CSF original permanecía en la disolución y era monomérica. Se determinó la semivida en disolución de cada proteína basándose en las intensidades de banda relativas tal como se visualizan en el gel. Se muestran los resultados en la tabla 9.

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TABLA 9 Estabilidad de proteínas de G-CSF preparadas usando diferentes procedimientos de reglamiento/renaturalización

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Los resultados muestran que G-CSF de tipo natural tiene una semivida en disolución mas larga a pH 4 que a pH 8, que es coherente con los resultados notificados previamente por Arakawa et al.(1993). La semivida en disolución de G-CSF de tipo natural no era sustancialmente diferente si la proteína se había replegado usando el procedimiento de replegamiento A o F. Por el contrario, G-CSF (C17S/Q173C) tenía una semivida en disolución mucho más larga cuando la proteína se replegaba usando el procedimiento F (>20 horas) en lugar del procedimiento A (<30 minutos). Por tanto, además de aumentar la recuperación de muteínas de cisteína de G-CSF plegadas de manera apropiada, el uso de cisteína en el proceso de solubilización/replegamiento aumenta la estabilidad térmica del producto final.

Pueden realizarse estudios adicionales para comparar las estabilidades de muteínas de cisteína de G-CSF con respecto a las de G-CSF de tipo natural. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una matriz de experimentos exponiendo las proteínas a diversos pH, temperaturas y concentraciones en suero. En diversos momentos, puede monitorizarse la integridad de las proteínas mediante ensayos tales como, pero sin limitarse a, el ensayo de actividad biológica de proliferación de células NFS60 in vitro descrito en el ejemplo 8, cromatografía de exclusión molecular, dicroísmo circular, ensayos ELISA y análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

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Ejemplo 13

Eficacia in vivo de muteínas de cisteína de PEG-G-CSF

Grupos de tres ratas Sprague Dawley macho, que pesaban \sim 320 g cada una, recibieron una única inyección intravenosa (vena lateral de la cola) de G-CSF recombinante de tipo natural (preparada por Bolder BioTechnology), Neupogen® (un G-CSF recombinante vendido por Amgen, Inc.) o PEG-L3C a una dosis de 100 \mug/kg. Se determinaron las concentraciones de proteína usando un ensayo de unión a colorante de Bradford. En momentos seleccionados se extrajeron muestras de sangre (de 0,3 a 0,4 ml) de las ratas en los tubos anticoagulantes con EDTA. Se enviaron las alícuotas de las muestras de sangre a una empresa comercial para un hemograma completo (CBC). Se centrifugó lo que quedaba de la muestra de sangre y se congeló el plasma a -80ºC. Se extrajeron muestras sanguíneas a 0,25, 1,5, 4, 8, 12, 16, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 h tras la inyección. Se obtuvo una muestra inicial a la hora 0, \sim 24 h antes de la inyección de los compuestos de prueba. Las tablas 10 y 11 muestran los recuentos de glóbulos blancos totales y neutrófilos sanguíneos medio para los diferentes grupos de prueba a lo largo del tiempo. Los tres compuestos de prueba estimularon un aumento en los glóbulos blancos periféricos y neutrófilos sobre los valores de referencia. Los recuentos de glóbulos blancos y los recuentos de neutrófilos para los grupos de prueba que recibieron G-CSF recombinante de tipo natural y Neupogen® mostraron un máximo a las 24 h tras la inyección y volvieron a los valores iniciales a las \sim48 h. Por el contrario, los recuentos de glóbulos blancos y neutrófilos para las ratas que recibieron PEG-L3C mostraron un máximo a las \sim48-72 h tras la inyección y no volvieron a los valores iniciales hasta \sim120 h tras la inyección. Los niveles máximos de glóbulos blancos y neutrófilos observados en las ratas que recibían PEG-L3C eran significativamente superiores que los de los grupos que recibían G-CSF recombinante de tipo natural o Neupogen® (p<0,05). Los datos indican que PEG-L3C puede estimular un aumento en los glóbulos blancos y neutrófilos circulantes, y que el aumento absoluto en los recuentos de glóbulos blancos y neutrófilos es superior y dura más que lo observado con G-CSF de tipo natural o Neupogen®. Pueden llevarse a cabo experimentos similares para demostrar la eficacia de otras muteínas de cisteína pegiladas (versiones C17 o C17S). También pueden realizarse estudios similares usando la vía subcutánea para la administración de proteínas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 10 Efecto de G-CSF, Neupogen® y PEG-L3C sobre los recuentos de neutrófilos sanguíneos tras la administración intravenosa única de las proteínas (100 \mug/kg)

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TABLA 11 Efecto de G-CSF, Neupogen® y PEG-L3C sobre los recuentos de neutrófilos sanguíneos tras la administración intravenosa única de las proteínas (100 \mug/kg)

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Pueden cuantificarse los niveles proteicos de muteína de cisteína de G-CSF pegilada y G-CSF en plasma usando kits de ELISA para G-CSF disponibles comercialmente (R & D Systems, Inc.). Pueden llevarse a cabo experimentos de titulación para determinar la sensibilidad relativa de ELISA para detectar G-CSF de tipo natural, muteínas de cisteína de G-CSF sin modificar y muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas. Pueden llevarse a cabo estudios similares usando la vía subcutánea de administración de proteínas.

Las concentraciones plasmáticas de las proteínas a partir del experimento de eficacia señalado anteriormente en el ejemplo 13 se midieron usando kits de ELISA para G-CSF humano adquirido de R & D Systems, Inc. Se muestran los resultados en la tabla 12. Los resultados indican que PEG de 20 kDa-L3C tiene una semivida en circulación significativamente superior que G-CSF de tipo natural o Neupogen® tras la administración intravenosa de las proteínas a las ratas.

TABLA 12

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Puede medirse la eficacia in vivo de las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas (versiones C17 o C17S) en roedores normales o neutropénicos tales como ratones o ratas, lo que demuestra que las proteínas estimulan aumentos en los niveles de neutrófilos circulantes y granulopoyesis comparados con animales tratados con vehículo. G-CSF estimula los niveles de neutrófilos en roedores normales y neutropénicos a una dosis de 100 \mug/kg (Kubota et al., 1990; Kang et al., 1995). Para demostrar la eficacia en ratones normales, grupos de 5 ratones (que pesan 20 g cada uno) pueden recibir inyecciones subcutáneas de G-CSF, muteínas de cisteína de PEG-G-CSF o placebo (disolución de vehículo) a intervalos especificados durante hasta cinco días. Los ratones normales tales como los ratones ICR pueden adquirirse de un distribuidor comercial. El día 6 pueden sacrificarse los animales y tomarse muestras de sangre para un análisis de hemograma completo (CBC). Pueden recogerse los tejidos hematopoyéticos (hígado y bazo), pesarse y fijarse en formalina para análisis histopatológicos para buscar la evidencia de un aumento de granulopoyesis. Puede extraerse la médula ósea de diversos huesos largos y el esternón para preparaciones de partículas unitarias y análisis histopatológico para buscar evidencia de un aumento de granulopoyesis. Deben realizarse comparaciones entre grupos usando una prueba de la T de Student para comparaciones individuales y un análisis de varianza unilateral para comparaciones múltiples. Debe considerarse significativo P < 0,05. Las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas deben estimular aumentos mayores en los niveles de neutrófilos circulantes y granulopoyesis en los ratones comparado con los ratones tratados con vehículo. Puede someterse a prueba la eficacia de las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas modificadas con PEG de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa o 40 kDa cuando se administra una vez, una vez al día, en días alternos o cada tres días. En experimentos iniciales, grupos diferentes de ratones pueden recibir inyecciones subcutáneas de 0,0032, 0,016, 0,08, 0,4 y 2 \mug por inyección de las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas. Los ratones control pueden recibir sólo disolución de vehículo. Grupos adicionales pueden recibir G-CSF de tipo natural (2 \mug/cada día (DE) durante 5 días) y 2 \mug/inyección de G-CSF de tipo natural usando el mismo régimen de dosificación que las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas.

También puede demostrarse la eficacia de las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas en ratones neutropénicos. Puede inducirse la neutropenia mediante tratamiento con ciclofosfamina (CPA; 100 mg/kg), que es un agente quimioterápico mielosupresor usado comúnmente y relevante para la práctica clínica con seres humanos. El G-CSF acelera la recuperación de los niveles de neutrófilos normales en animales tratados con ciclofosfamida (Kubota et al., 1990; Kang et al., 1995; Matsuzaki et al., 1996). Los ratones pueden recibir una inyección intraperitoneal de ciclofosfamida (\sim 20 g) el día 0 para inducir neutropenia. Los animales deben dividirse en diferentes grupos, que deben recibir inyecciones subcutáneas de G-CSF, muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas o placebo a intervalos especificados durante hasta cinco días. Un grupo control no debe recibir ciclofosfamida pero debe recibir inyecciones de placebo. Puede someterse a prueba la eficacia de las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas modificadas con PEG de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa o 40 kDa cuando se administra una vez, en días alternos o cada tres días. En experimentos iniciales, grupos diferentes de ratones pueden recibir inyecciones subcutáneas de 0,0032, 0,016, 0,08, 0,4 y 2 \mug por inyección de las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas. Los ratones control pueden recibir disolución de vehículo únicamente. Grupos de control adicionales pueden recibir G-CSF de tipo natural (2 \mug/cada día (DE) durante 5 días) y 2 \mug/inyección de G-CSF de tipo natural usando el mismo régimen de dosificación que las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas. Los días 0-10, pueden sacrificarse cinco ratones por grupo y analizarse muestras de sangre y de tejido tal como se describió anteriormente para los experimentos con ratones normales. Las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas deben estimular un aumento acelerado en los niveles de neutrófilos circulantes y la granulopoyesis en los ratones comparado con el grupo control inyectado con CPA, inyectado con vehículo.

Alternativamente, puede demostrarse la eficacia de muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas en estudios de neutropenia en un modelo de rata. G-CSF acelera la recuperación de los niveles de neutrófilos normales en ratas tratadas con agentes quimioterápicos mielosupresores. En este caso, grupos de ratas Sprague Dawley (que pesan \sim300 g cada una) pueden recibir una dosis intraperitoneal de CPA (100 mg/kg) el día 0 para inducir neutropenia. Los animales pueden dividirse entonces en tres grupos, los que recibieron inyecciones subcutáneas de G-CSF, muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas o placebo a los intervalos especificados durante hasta 10 días. Un grupo control puede recibir inyecciones de placebo en lugar de ciclofosfamida. En experimentos iniciales, la eficacia de las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas modificadas con PEG de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa puede medirse llevando a cabo dosis subcutáneas de \sim0,1 \mug-500 \mug/kg (siendo el intervalo de preferencia de 1-100 \mug/kg) cuando se administran las dosis una vez cada día, en días alternos o cada tres días. Un grupo control adicional puede recibir G-CSF de tipo natural (100 \mug/kg) disponible comercialmente cada día durante 5 días y otro grupo control puede recibir G-CSF de tipo natural con la misma dosis y régimen de dosificación que con los mutantes de cisteína de G-CSF pegilados. Las ratas control pueden recibir disolución de vehículo únicamente. Los días 0-6, 8, 10, 12 y 14 pueden tomarse muestras de sangre para análisis de CBC. A la finalización del transcurso de tiempo, pueden sacrificarse las ratas para la recogida de tejidos hematopoyéticos y médula ósea para investigar evidencia de un aumento de granulopoyesis. Los mutantes de cisteína de G-CSF pegilados deben estimular un aumento acelerado en los niveles de neutrófilos circulantes y granulopoyesis en las ratas comparado con el grupo control inyectado con CPA, inyectado con vehículo.

Ejemplo 14

Clonación, expresión, purificación y actividad biológica de GM-CSF de tipo natural

A. Clonación de secuencias de ADN que codifican para GM-CSF. Se clonó GM-CSF humano mediante RT-PCR de ARN total aislado de la línea celular 5637 de carcinoma de vejiga humano (obtenida de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Se amplificó un ADNc que codifica para G-CSF mediante PCR a partir de ARN total aislado de la línea celular 5637 de carcinoma de vejiga humano (Colección Americana de Cultivos Tipo). Se hicieron crecer las células en medios RPMI 1640 complementados con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 \mug/ml. Se aisló ARN de las células usando un kit de aislamiento de ARN RNeasy Mini adquirido de Qiagen, Inc. (Santa Clarita, CA) siguiendo las directrices del fabricante. Se logró la síntesis de la primera hebra de ADNc de monocatenario usando un kit de síntesis de ADNc de primera hebra para RT-PCR (AMV) de Boehringer Mannheim Corp y se usaron hexámeros aleatorios como cebador. Se llevaron a cabo reacciones de PCR posteriores usando los productos de la síntesis de primera hebra como molde con el cebador directo BB267 (5 > GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT G > 3; SEQ ID NO: 75) y el cebador inverso BB268 (5 > CTT GTA GTG GCT GGC CAT CAT G > 3; SEQ ID NO: 76). El cebador BB268 hibrida con el extremo 5' de la secuencia codificante para la señal de secreción de GM-CSF y el cebador inverso, BB268, híbrida con el extremo 3' de la secuencia codificante de GM-CSF. Se digirió el producto de PCR resultante de \sim 450 pb con Hind III y Bam HI, se purificó en gel y se clonó en el vector pCDNA3.1(+) que se había digerido con Hind III y Bam HI, tratado con fosfatasa alcalina, y purificado en gel. Un clon con la secuencia de ADN correcta se denominó pCDNA3.1(+)::GM- CSFfus o pBBT267. Se usó PCR para modificar este clon de GM-CSF para determinar la expresión periplásmica en E. coli. Cuando se expresa en E. coli, mediante la secreción hacia el periplasma, el GM-CSF no contiene una metionina N-terminal añadida y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al GM-CSF que se produce de manera natural (Lee et al., 1985). Con el fin de expresar una forma secretada de GM-CSF, se usó PCR para fusionar la secuencia líder del gen de enterotoxina (STII) estable térmicamente de E. coli (Picken et al., 1983), precedida por un sitio de restricción Nde I, para la secuencia codificante amino-terminal de GM-CSF maduro. Además, se añadió un codón de terminación TAA, seguido inmediatamente por un sitio de restricción Eco RI, tras el residuo carboxilo-terminal, E127. Al mismo tiempo, se cambiaron todos los codones para prolinas en las posiciones 2, 6, 8, 12, 117 y 124 por CCG, y se cambió el codón para leucina en la posición 114 por CTG. La reacción de PCR usó el cebador directo BB300 (5> CGC AAC GCG TAC GCA GCA CCG GCC CGC TCG CCG AGC CCG AGC ACG CAG CCG TGG GAG >3; SEQ ID NO: 77) y el cebador inverso BB301 (5> CGC GAA TTC TTA CTC CTG GAC CGG CTC CCA GCA GTC AAA CGG GAT GAC CAG CAG AAA >3; SEQ ID NO: 78) con pBBT267 como molde. Se digirió el producto de PCR resultante de \sim 400 pb con Mlu I y Eco RI, se purificó en gel, y se clonó en pBBT227 que se describió en el ejemplo 9 anteriormente. Se digirió el ADN de pBBT227 con Mlu I y Eco RI, se trató con fosfatasa alcalina, y se extrajo en un gel de agarosa al 1%. Se purificó el fragmento de vector de
\sim 2,4 kb y se usó en el ligamiento. Los recombinantes resultantes llevan una secuencia líder de STII completo hibridado con GM-CSF y este constructo "stII-GM-CSF" puede eliminarse como un fragmento Nde I - Eco RI de \sim 450 pb. Un clon con la secuencia correcta se denominó pUC18::stII-GM-CSF. Para los estudios de expresión del fragmento Nde I - Eco RI de este plásmido se subclonó en el vector pBBT257, que se describe más adelante. Se introdujo el plásmido resultante, pBBT257; stII-muGM-CSF, o pBBT271 en W3110 de E. coli para su expresión.

Se derivó el plásmido pBBT257 del vector de expresión pCYB1 (New England BioLabs) delecionando el gen de resistencia a ampicilina de pCYB1 y sustituyéndolo con el gen para resistencia a tetraciclina derivado el vector de clonación clásico pBR322 (Bolívar et al, 1977). Tanto en pBBT257 como en pCYB1, la expresión del gen clonado está bajo el control del promotor tac, que está regulado por el producto del gen lac^{Iq} nacido de plásmido. Estos vectores permiten que se expresen los genes como proteínas sin fusionar o como fusiones para un dominio de unión a quitina; se crearon los constructos de manera que las proteínas se expresan como proteínas sin fusionar. Se construyó el plásmido pBBT257 tal como sigue. El gen de resistencia a tetraciclina (gen Tc^{R}) del plásmido pBR322 (adquirido de New England bioLabs) se amplificó mediante PCR usando los cebadores BB228 (5> CGC GCT GCA GTT CTC ATG TTT GAC AGC TTA TCA TC >3; SEQ ID NO: 41) y BB229 (5 > CGC GCT GCA GAT TTA AAT TAG CGA GGT GCC GCC GGC TTC CAT > 3; SEQ ID NO: 42). El cebador directo BB228 hibrida con los nucleótidos de 1 a 25 de la secuencia de pBR322 (Nº de registro de GenBank J01749), que están situados en 5' con respecto al gen Tc^{R} e incluyen la parte "-35" del promotor del gen Tc^{R}. El oligonucleótido BB228 contiene un sitio Pst I añadido con fines de clonación. El cebador inverso BB229 hibrida con los nucleótidos de 1277 a 1300, que están situados inmediatamente en 3' del codón de terminación de la traducción que sigue a la secuencia codificante del gen Tc^{R}. BB229 contiene un sitio Dra I añadido para fines de clonación. La reacción de PCR de 40 \mul se llevó a cabo en KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton® X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM e incluía dNTP a 200 \muM cada uno, 20 pmol de cada cebador, 0,5 ng de ADN de pBR322, 2,5 unidades de Taq polimerasa (Promega), y 0,5 unidades de PFU polimerasa (Stratagene). La reacción de PCR consistió en: 95ºC durante 3 minutos, 25 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 90º segundos] seguido por una retención a 4ºC. El producto resultante de \sim1300 pb se purificó en gel, se digirió con Pst I y Dra I y se usó en una reacción de ligamiento tal como se describe más adelante. Se digirió el ADN de pCYB 1 con Pst I y Swa I y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero según los protocolos del distribuidor (New England BioLabs). Pst I y Swa I cada uno cortan el vector una vez y flanquean el gen de resistencia a ampicilina (Ap{R}). Se limpiaron los productos de digestión usando un kit de limpieza de PCR Qiaquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor y posteriormente se extrajo en un gel de agarosa al 1%. El fragmento de vector de \sim5,3 kb, delecionado para el gen Ap^{R}, se purificó en gel y se ligó con el producto de PCR cortado de Pst I - Dra I que contenía el gen Tc^{R}. Tanto Dra I como Swa I generan productos de digestión con extremos romos que pueden ligarse juntos. Se usó la reacción de ligamiento para transformar E. coli DH5\alpha y se seleccionaron transformantes resistentes a tetraciclina. Se analizaron posteriormente tres aislados y se encontró que todos eran sensibles a ampicilina. Los productos de digestión por endonucleasa de restricción obtenidos a partir de estos tres aislados también eran coherentes con la deleción del fragmento de Pst I y Swa I de 1500 pb que contenía el gen Ap^{R} y su sustitución por el fragmento Pst I - Dra I de \sim1300 pb que lleva el gen Tc^{R}. Un aislado, denominado pBBT257, se eligió para su uso en la expresión de proteínas recombinantes.

B. Expresión de GM-CSF de tipo natural en E. coli . Para la expresión del GM-CSF secretado, se transformaron pBBT271 [pBBT257:: STII-GM-CSF] y el vector original pBBT257 en E. coli W3110. Las cepas resultantes de denominaron BOB340: W3110(pBBT257) y BOB350: W3110(pBBT271). Se inocularon cultivos recientes saturados durante la noche a \sim 0,05 de D.O. a A_{600} en LB que contenía tetraciclina 10 \mug/ml. Se hicieron crecer estos cultivos de 100 ml en un matraz con agitación con deflectores de 500 ml a 28ºC en un baño de agua con agitador giratorio a \sim250 rpm. Cuando el cultivo alcanzó una densidad de - 0,6 de D.O., se añadió IPTG hasta una concentración de 0,5 mM y se incubó entonces el cultivo inducido durante la noche durante \sim16 h. Las muestras de cultivos inducidos y no inducidos se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) en geles de poliacrilamida de Tris-glicina al 16% colados previamente y se tiñeron con azul de Coomassie. El cultivo inducido de BOB350 (GM-CSF) dio una banda. a aproximadamente 14 kDa, lo que concuerda con el peso molecular de GM-CSF maduro. No se detectó esta banda en un cultivo no inducidos de BOB350 o en cultivos inducidos o no inducidos de BOB340, el control con vector únicamente. Los análisis de inmunotransferencia de tipo Western mostraron que esta banda de \sim14 kDa reaccionaba intensamente con un antisuero anti-GM-CSF humano (R&D Systems). Este antisuero no reconoció proteínas en cultivos no inducidos de BOB340 y BOB350 o en el cultivo inducido de BOB340, el control con vector únicamente. Estas inmunotransferencias de tipo Western también demostraron que esta banda de \sim14 kDa migraba de manera conjunta en un GM-CSF convencional humano derivado de E. coli, comercial adquirido de R & D Systems. Este resultado sugiere que se ha eliminado el péptido líder de STII, lo que concuerda con la proteína que se ha secretado al periplasma. Estudios de secuenciación en el extremo N-terminal presentados más adelante indican que la secuencia señal de STII se procesó de manera apropiada.

También se sometieron a choque osmótico las muestras tras la inducción de 16 horas de estos cultivos basándose en el procedimiento de Koshland y Botstein (1980). Este procedimiento rompe la membrana exterior de E. coli y libera contenido del periplasma en el medio circundante. La centrifugación posterior separa los componentes periplásmicos solubles (recuperados en el sobrenadante) de componentes asociados a célula, periplásmicos insolubles y periplásmicos solubles (recuperados en el sedimento). Se recuperó poca cantidad de la proteína de GM-CSF sintetizada en el sobrenadante. La mayor parte de GM-CSF permaneció asociado con el sedimento. Esto indica que aunque parece que la proteína se procesa y se secreta al periplasma, se acumula allí principalmente en una forma insoluble. Otros han notificado resultados similares para el GM-CSF secretado al periplasma de E. coli (Libby et al., 1987; Greenberg et al., 1988).

C. Purificación de GM-CSF de tipo natural. Se expresó GM-CSF de tipo natural y se purificó a una escala mayor usando los siguientes protocolos. Se inoculó un cultivo reciente saturado durante la noche de BOB350 (de tipo natural) a una D.O. \sim 0,05 a A_{600} en LB que contenía tetraciclina 10 \mug/ml. Se hizo crecer el cultivo de 400 ml en un matraz con agitación con deflectores de 2 l a 28ºC en un baño de agua con agitador giratorio a \sim250 rpm. Cuando el cultivo alcanzó una densidad de - 0,6, de D.O. se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM. Entonces se incubó el cultivo inducido durante la noche durante \sim16 h. Se sedimentaron las células mediante centrifugación y se congelaron a -80ºC. Se descongeló el sedimento celular y se trató con 5 ml de reactivo de extracción de proteína bacteriana B-PER^{TM} según los protocolos del fabricante (Pierce). La parte insoluble, y la mayor parte de la proteína de GM-CSF, se recuperaron mediante centrifugación y se resuspendieron en B-PER. Se trató esta mezcla con lisozima (200 \mug/ml) durante 10 min para alterar adicionalmente las paredes celulares, y se añadieron MgCl_{2} (10 mM final) y ADNasa libre de proteasa (2 \mug/ml). Se recogió el GM-CSF insoluble mediante centrifugación y se lavó, mediante resuspensión en agua y centrifugación de nuevo, para eliminar la mayoría del residuo celular solubilizado. Para el replegamiento, el sedimento resultante que contenía GM-CSF insoluble se disolvió en 10 ml de urea 8 M, cisteína 25 mM en base Tris 20 mM. Se agitó esta mezcla durante 30 min a temperatura ambiente después se diluyó en 100 ml de Tris 20 mM, sulfato de cobre 40 \muM, glicerol al 15%, pH 8,0. Se mantuvo esta mezcla de replegamiento a 4ºC durante 2 días y después de centrifugó y cargó en una columna de 5 ml de Q-Sepharose (Pharmacia HiTrap) equilibrada en Tris 20 mM, pH 8,0 (tampón A). Se eluyeron las proteínas unidas con un gradiente salino el tampón B al 0-35% (NaCl 1 M, Tris 20 mM, pH 8). Se analizaron las fracciones de la columna mediante una SDS-PAGE no reductora. El GM-CSF eluyó a aproximadamente NaCl 230 mM. Se combinaron las fracciones que contenían principalmente GM-CSF.

Se diluyó el combinado de Q-Sepharose con un volumen igual de sulfato de amonio al 30% y se calentó hasta temperatura ambiente antes de cargarse en una columna Phenyl HP de 1 ml (Pharmacia HiTrap) equilibrada previamente con sulfato de amonio al 15% en fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5. Se recuperó GM-CSF purificado de la columna mediante elución con un gradiente salino inverso (sulfato de amonio al 15% hasta sulfato de amonio al 0% en fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5). El perfil de elución de la columna Phenyl HP para GM-CSF mostró un pico principal individual, que eluía a aproximadamente sulfato de amonio 6,5%. Se analizaron las fracciones de columna a través del pico mediante SDS-PAGE no reductora. Se combinaron las fracciones que contenían GM-CSF y contaminantes no visibles. El rendimiento final de GM-CSF de tipo natural tal como se determinó mediante análisis de Bradford, fue de aproximadamente 2,6 mg a partir del cultivo de 400 ml. La secuenciación N-terminal de GM-CSF de tipo natural usando química de degradación de Edman automatizada produjo la secuencia APARSPS, que ajusta de manera idéntica los siete primeros aminoácidos de GM-CSF humano maduro, e indica que el extremo N-terminal se procesa correctamente (Lee et al., 1985). GM-CSF de tipo natural purificado y GM-CSF disponible comercialmente (expresado por E. coli; R&D Systems) migraron de manera conjunta en condiciones reductoras y no reductoras tal como se mostró mediante análisis por inmunotransferencia de tipo Western. Ambas proteínas mostraron el desplazamiento de movilidad esperado hacia un peso molecular aparente en condiciones reductoras debido a la alteración de los enlaces disulfuro intramoleculares.

D. Actividades biológicas in vitro de GM-CSF de tipo natural. Se desarrolló un ensayo de proliferación celular usando la línea celular eritroleucémica TF-1 humana (Kitamura et al., 1989) para medir la actividad biológica de GM-CSF de tipo natural. Se obtuvo la línea celular TF-1 humana de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Se mantuvieron las células en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 \mug/ml y GM-CSF humano recombinante 2 ng/ml (derivado de E. coli; R&D Systems). En general, se fijaron los bioensayos lavando las células TF-1 tres veces con medio RPMI 1640 (sin aditivos) y resuspendiendo las células a una concentración de 1 x 10^{5}/ml en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 \mug/ml (medio de ensayo). Se tomaron alícuotas de cincuenta \mul (5 x 10^{3} células) de la suspensión celular por pocillo de prueba de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano. Se prepararon diluciones seriadas de las muestras de proteína que iban a someterse a prueba en los medios de ensayo. Se analizaron en paralelo las diluciones seriadas de GM-CSF humano recombinante (expresado por E. coli; R&D Systems). Se añadieron cincuenta \mul de las muestras de proteína diluidas a los pocillos de prueba y se incubaron las placas a 37ºC en un incubador de cultivo tisular humidificado de CO_{2} al 5%. Se sometieron a ensayo las muestras de proteína en pocillos por triplicado. Tras\sim 3 días, se añadieron 20 \mul de una mezcla de MTS/PMS (CellTiter 96 AQueous One Solution, Promega) a cada pocillo y se incubaron las placas a 37ºC en el incubador de cultivos tisulares durante 1-4 h. Se registró la absorbancia de los pocillos a 490 nm usando un lector de microplacas. Los pocillos control contenían medio pero no células. Se restaron los valores de absorbancia media para los pocillos control por triplicado de los valores medios obtenidos para los pocillos de prueba. Se calculó la CE_{50}, la concentración a la mitad de la estimulación máxima, para cada muestra para comparar las actividades biológicas de las proteínas.

La línea celular TF-1 muestra una respuesta proliferativa fuerte frente a GM-CSF, tal como se pone en evidencia mediante un aumento dependiente de la dosis en el número de células y los valores de absorbancia. El GM-CSF comercial y el GM-CSF preparado tenían CE_{50} de 97 y 105 pg/ml, respectivamente, en el bioensayo (tabla 13).

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Ejemplo 15

Construcción, expresión, purificación y actividad biológica de muteínas de cisteína de GM-CSF

A. Construcción de muteínas de cisteína de GM-CSF. Se construyeron trece genes de GM-CSF mutantes usando mutagénesis basada en PCR dirigida al sitio tal como se describe de manera general por Innis et al., (1990) y Horton et al, (1993) y en el ejemplo 9. Se construyeron cinco muteínas en la región de aminoácidos proximal a la hélice A [*-1C (la adición de un residuo de cisteína en el extremo amino-terminal natural), A1C, A3C, S5C y S7C]; una muteína en el bucle B-C; tres muteínas en el bucle C-D [E93C, T94C y T102C]; y tres muteínas en la región carboxilo-terminal distal a la hélice D [V125C, Q126C y *128C (la adición de un residuo de cisteína al extremo carboxilo-terminal natural)]. También se construyó una muteína en un posible sitio de glucosilación unido en N, que está localizado en el extremo distal de la hélice A. El molde usado para las reacciones de PCR mutagénicas fue el plásmido pBBT268 en el que se clonó el gen STII-GM-CSF como un fragmento Nde I - Eco RI en pUC18. Se digirieron los productos de PCR con endonucleasas de restricción apropiadas, se purificaron en gel y se ligaron con el ADN de vector pBBT268 que se había cortado con esas mismas enzimas de restricción, tratado con fosfatasa alcalina, y purificado en gel. Se hicieron crecer transformantes de estos ligamientos y se aislaron los ADN de plásmido y se secuenciaron. Se determinó que la secuencia del fragmento de PCR mutagenizado clonado entero verificaba la presencia de la mutación de interés, y la ausencia de cualquier mutación adicional que potencialmente podría introducirse por la reacción de PCR o por los cebadores oligonucleotídicos sintéticos.

Para la expresión en E. coli como proteínas secretadas al espacio periplásmico, los genes STII-GM-CSF que codifican para las 13 muteínas se eliminaron de los derivados de pBBT268 basados en pUC18 como fragmentos Nde I - Eco RI de \sim450 pb, se subclonaron en el vector de expresión pBBT257, y se transformaron en W3110 de E. coli.

Usando procedimientos similares a los descritos aquí, se pueden construir otras muteínas de cisteína de GM-CSF. Las muteínas de cisteína pueden ser mutaciones de sustitución que sustituyen cisteína por un residuo de amino natural en la secuencia codificante de GM-CSF, mutaciones de inserción que insertan un residuo de cisteína entre dos aminoácidos que se producen de manera natural en la secuencia codificante de GM-CSF, o mutaciones de adición que añaden un residuo de cisteína que preceden el primer aminoácido, A1, de la secuencia codificante de GM-CSF o añaden un residuo de cisteína tras el residuo de aminoácido terminal, E127, de la secuencia codificante de GM-CSF. Los residuos de cisteína pueden sustituirse por cualquier aminoácido, o insertarse entre dos aminoácidos cualesquiera, en cualquier lugar en la secuencia codificante de GM-CSF. Los sitios preferidos para sustituir o insertar residuos de cisteína en GM-CSF están en la región que precede a la hélice A, el bucle A-B, el bucle B-C, el bucle C-D, y la región distal a la hélice D. Otros sitios preferidos son los tres primeros o últimos aminoácidos de las hélices A, B, C, y D. Se describen en la tabla 13 algunas posiciones preferidas para las mutaciones de cisteína. Otras posiciones preferidas incluyen R67C, G68C, L70C, R30C, T32C, A33C, E35C, N37C, T39C, E45C, D48C, Q50C, E51C, Q99C, T98C, E113C y E127C. Además de las mutaciones descritas anteriormente, se describen en el documento PCT/US98/14497 otros residuos preferidos en estas regiones para crear sustituciones de cisteína.

También se pueden construir muteínas de GM-CSF que contienen una cisteína libre sustituyendo otro aminoácido por uno de los residuos de cisteína que se producen de manera natural en GM-CSF que normalmente forma un enlace disulfuro. El residuo de cisteína que se produce de manera natural que normalmente forma un enlace disulfuro con el residuo de cisteína sustituido ahora está libre. El residuo de cisteína puede sustituirse con cualquiera de los otros 19 aminoácidos, pero preferiblemente con un residuo de serina o alanina. También puede introducirse un residuo de cisteína libre en GM-CSF mediante modificación química de un aminoácido que se produce de manera natural usando procedimientos tales como los descritos por Sytkowski et al. (1998).

También pueden construirse mutantes múltiples que contienen dos o más residuos de cisteína libres añadidos o bien mediante rondas secuenciales de mutagénesis usando los procedimientos descritos en los ejemplos 8, 9, 14 y 15 o bien alternativamente mediante recombinación in vitro de mutantes individuales para construir plásmidos de expresión recombinantes que codifican para muteínas que contienen dos o más cisteínas libres. Los mutantes múltiples preferidos serían aquellos que combinasen dos o más muteínas de cisteína que conservan cada una alta actividad cuando se pegilan por ejemplo A3C más S69C, S69C más E93C, y A3C más E93C. Pueden deducirse otros mutantes múltiples preferidos basándose en los datos de la tabla 9 y tabla 10 e incluirían combinaciones que contienen dos o más mutaciones del grupo incluyendo *-1C, A1C, A3C, S5C, S7C, S69C y E93C.

Usando procedimientos similares a los descritos en los ejemplo 14 - 16, se pueden expresar las proteínas en E. coli, purificar las proteínas, pegilar las proteínas y medir sus actividades biológicas en un bioensayo in vitro. Pueden expresarse las proteínas citoplásmicamente en E. coli o como proteínas secretadas al espacio periplásmico. Las muteínas también pueden expresarse en células eucariotas tales como en células de insecto o de mamífero, usando procedimientos similares a los descritos en el documento PCT/US00/00931, o procedimientos relacionados bien conocidos por los expertos en la técnica. Si se desea la secreción a partir de células eucariotas, la secuencia señal de GM-CSF natural, u otra secuencia señal, pueden usarse para secretar las proteínas de las células eucariotas.

B. Expresión y purificación de muteínas de cisteína de GM-CSF. Se hicieron crecer las cepas de E. coli que expresaban las 13 muteínas de cisteína de GM-CSF, se indujeron y se recogieron usando los protocolos descritos para GM-CSF de tipo natural en el ejemplo 14. Se replegaron las muteínas y se purificando usando los protocolos descritos para GM-CSF de tipo natural en el ejemplo 14. La muteína eluyó de la columna de Q-Sepharose a aproximadamente NaCl 200-230 mM y de la columna Phenyl HP a aproximadamente sulfato de amonio al 6-8%. Se recuperaron las muteínas predominantemente como monómeros, con pesos moleculares aparentes de \sim 14 kDa mediante SDS-PAGE no reductora.

C. Actividades biológicas de muteínas de cisteína de GM-CSF. Se sometieron a ensayo las 13 muteínas de cisteína de GM-CSF purificadas en el ensayo de proliferación de células TF-1. Se determinaron las concentraciones de proteína usando un kit de ensayo de proteínas Bradford (Bio-Rad Laboratories). Se analizaron en paralelo en los mismos días GM-CSF de tipo natural comercial y GM-CSF de tipo natural preparada por los investigadores para controlar la variabilidad entre días en los ensayos. Las 13 muteínas estimularon la proliferación de las células TF-1 en el mismo grado que las proteínas control de GM-CSF de tipo natural. Las CE_{50} medias para las 13 muteínas oscilaron desde 80 hasta 134 pg/ml (tabla 13).

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TABLA 13

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Ejemplo 16

Pegilación, purificación y actividad biológica de muteínas de cisteína de GM-CSF

A. Estudios preliminares de pegilación. Se determinaron las condiciones de la reacción de pegilación inicial usando A1C, S7C y S69C como las proteínas de prueba, TCEP [Tris(2-carboxietil)fosfina]-HCl como el agente reductor y PEG reactivos con cisteína de 5 kDa cisteína de Shearwater Polymers. Se incubaron alícuotas de tres \mug de las muteínas de cisteína purificadas o GM-CSF de tipo natural con concentraciones crecientes de TCEP a temperatura ambiente en Tris 100 mM, pH 8,5 en presencia de maleimida-PEG de 5 kDa o vinilsulfona-PEG de 5 kDa en exceso (formas lineales de un polímero de polietilenglicol compuesto por un peso molecular promedio de 5 kDa con un grupo maleimida o vinilsulfona reactivo en uno de los extremos del polímero). Los grupos maleimida y vinilsulfona reaccionan con nucleófilos de Michael, con una alta selectividad por los grupos mercaptano tales como los contenidos en las cadenas laterales de las cisteínas. Tras 90 min., se analizaron inmediatamente las reacciones mediante SDS-PAGE no reductora. Se eligieron las cantidades de TCEP y reactivo de PEG particular que produjeron cantidades significativas de proteína de cisteína monopegilada, sin modificar el GM-CSF de tipo natural para su uso en experimentos posteriores. Los experimentos de valoración indicaron que a un pH de 8,5, un exceso molar de 15 veces de TCEP y un exceso molar de 20 veces de maleimida-PEG de 5 kDa produjeron cantidades significativas de proteína A1C monopegilada y proteína S7C monopegilada sin proteína di ni tripegilada detectable. En el caso de S69C de GM-CSF, se prefirió vinilsulfona-PEG de 5 kDa con respecto a maleimida-PEG de 5 kDa, y produjo cantidades significativas de proteína S69C monopegilada. El GM-CSF de tipo natural recombinante no era reactivo con los PEG, ni siquiera en presencia de un exceso molar de 50 veces de TCEP. Los experimentos control indicaron que es necesario que se reduzcan parcialmente las muteínas para pegilarse.

B. Preparación y purificación muteínas de cisteína de GM-CSF pegiladas: Se pegilaron alícuotas de 200 a 300 \mug de 10 muteínas de cisteína de GM-CSF purificadas para proporcionar suficiente material para la purificación y caracterización. Las mayores reacciones de pegilación también se realizaron durante 1,5 h a temperatura ambiente. Para cada uno de los mutantes, se usó un exceso de 15 veces de TCEP y un exceso de 20 veces de maleimida-PEG de 5 kDa. La única excepción fue S69C en la que se usó vinilsulfona-PEG de 5 kDa. Estas condiciones de reacción produjeron la proteína monopegilada para las diez muteínas. Al final del tiempo de reacción, se diluyó la mezcla de pegilación 20X con Tris 20 mM enfriado en hielo, pH 8,0 antes de cargarse rápidamente en una columna de Q-Sepharose (1 ml, HiTrap) usando condiciones similares a las descritas para la purificación inicial purificación de las muteínas de GM-CSF (gradiente de 25 ml, NaCl 0-0,35 M en Tris 20 mM, pH 8). La presencia del resto de PEG disminuye la afinidad de la proteína por la resina, permitiendo que se separe la proteína pegilada de la proteína no pegilada. Los análisis por SDS-PAGE no reductor de las reacciones de pegilación mostraron que la única especie pegilada detectable era el monómero de muteína de cisteína de PEG-GM-CSF, que migra con un peso molecular aparente de \sim 26 kDa. El cromatograma de la columna de Q-Sepharose mostró dos picos principales de proteína. Se determinó que el pico principal que eluye antes (NaCl 160-200 mM) era proteína de GM-CSF monopegilada mediante SDS-PAGE. Se determinó que el segundo pico principal (NaCl 200-230 mM) era proteína de GM-CSF sin reaccionar. Se reunieron las fracciones del pico que eluye antes que contienen muteína de cisteína de GM-CSF monopegilada predominantemente y se usaron para las mediciones de actividad biológica. Todas las muteínas de GM-CSF estaban pegiladas y se purificaron mediante un protocolo idéntico. Las proteínas pegiladas presentaron pesos moleculares aparentes similares mediante SDS-PAGE, excepto para las muteínas PEG-E93C y PEG-T94C, que presentaron pesos moleculares aparentes ligeramente inferiores. También se han pegilado cuatro de las muteínas de cisteína en la región N-terminal (*-1C, A1C, A3C y S7C) a pequeña escala usando maleimida-PEG de 10 y 20 kDa. Estas reacciones se realizaron con 3 \mug de cada muteína usando las condiciones descritas anteriormente, y se analizaron mediante SDS-PAGE. Cada una de estas proteínas reaccionó rápidamente con los reactivos de PEG de 10 kDa y 20 kDa, produciendo la proteína monopegilada. También se preparó una PEG de 40 kDa-A3C siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Se amplió
a escala este protocolo para proporcionar mayores cantidades de la proteína PEG de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa-A3C.

C. Actividades biológicas de muteínas de cisteína de GM-CSF pegiladas: Se purificaron cantidades suficientes de 7 muteínas (*-1C, A1C, A3C, S5C, S7C, S69C y E93C) modificadas con un PEG de 5 kDa para mediciones precisas de la concentración de proteína y la actividad biológica específica. Se midieron las actividades biológicas de las 7 muteínas de cisteína de PEG de 5 kDa-GM-CSF purificadas en el ensayo de proliferación de células TF-1. Se determinaron las concentraciones de las proteínas usando un ensayo de unión a colorante de Bradford. Todas las muteínas de cisteína de GM-CSF pegiladas mostraron curvas de dosis-respuesta similares y alcanzaron el mismo nivel de máxima estimulación de crecimiento que el GM-CSF de tipo natural. Las CE_{50} medias para las muteínas de cisteína de PEG-GM-CSF oscilaron desde 80 - 123 pg/ml (tabla 14).

TABLA 14 Actividades biológicas de muteínas de cisteína de GM-CSF

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Se midieron las actividades biológicas de la muteína A3C muteína modificada con moléculas de PEG de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa en el ensayo de proliferación de células de TF-1. Se determinaron las concentraciones de las proteínas usando un ensayo de unión a colorante de Bradford. Cada una de las proteínas de PEG-A3C estimuló la proliferación de células TF-1. Las CE_{50} medias para las muteínas de cisteína de PEG de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa-A3C fueron de 78 +/- 3 pg/ml, 113 +/- 5 pg/ml y 300 +/- 50 pg/ml, respectivamente (N = 4 ensayos para cada proteína).

D. Pesos moleculares aparentes de A3C modificada con PEG K de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa: Se determinaron los pesos moleculares aparentes de las proteínas A3C de GM-CSF pegiladas mediante HPLC de exclusión molecular (SEC) usando una columna Bio-Sil SEC-400-5 de Biorad en un HPLC System Gold de Beckman. Se usó un gradiente isocrático que consistía en solución salina tamponada con fosfato como eluyente. Se usaron los tiempos de retención para cada proteína para calcular los pesos moleculares basándose en una curva patrón generada con patrones de proteínas para filtración en gel (BioRad Laboratories, Richmond, CA). Las proteínas pegiladas presentaron un aumento drástico de los pesos moleculares aparentes con respecto al GM-CSF no pegilado (tabla 15). Los PEG mayores aumentaron el peso molecular aparente de la proteína más que los PEG más pequeños. Se registraron datos similares para las muteínas de cisteína pegiladas de GH, IFN-\alpha2, y G-CSF.

TABLA 15 Pesos moleculares aparentes de muteínas de cisteína de GM-CSF pegiladas mediante cromatografía de exclusión molecular

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Ejemplo 17

Clonación, expresión, purificación y actividad biológica de GM-CSF murino de tipo natural y muteínas de cisteína de GM-CSF murino

Se clonó y secuenció un ADNc que codifica para el GM-CSF de ratón maduro mediante RT-PCR de ARN total aislado de la línea celular EL4.IL-2 de ratón (nº de catálogo TIB-181) obtenida de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD). Se hicieron crecer las células en medios DMEM complementados con un 10% de FBS, penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 \mug/ml. Se indujeron las células durante 6 ó 24 h con PHA-L 1 \mug/ml (Sigma-Aldrich Chemical Company, nº de catálogo L-4144) y PMA 10 ng/ml (Sigma-Aldrich Chemical Company, nº de catálogo P-1585) en medio DMEM, 10% de FBS, penicilina 50 unidades/mi, estreptomicina 50 \mug/ml a 37ºC antes del aislamiento del ARN. Se aisló el ARN de las células usando un minikit de aislamiento de ARN RNeasy adquirido a Qiagen, Inc. (Santa Clarita, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó la síntesis de la primera hebra de ADNc monocatenario usando un kit de síntesis de ADNc de 1ª hebra para RT-PCR (AMV) de Boehringer Mannheim Corp y se usaron hexámeros aleatorios como el cebador. Se llevó a cabo una reacción de PCR posterior usando los productos de la síntesis de la primer hebra como molde, con el cebador directo BB481 [5> GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC ACC CGC TCA CCC ATC ACT >3; SEQ ID NO: 43] y el cebador inverso BB482. BB481 híbrida con los 24 nucleótidos que codifican para los primeros ocho aminoácidos de GM-CSF de ratón maduro. BB481 también añade, inmediatamente en 5' a esta secuencia, nucleótidos que se solapan con las secuencias que codifican para los 4 aminoácidos carboxilo-terminales de la secuencia señal stII de E. coli descrita anteriormente en el ejemplo 7 y por Picken et al. (1983). Estos 11 nucleótidos incluyen un sitio de restricción Mlu I. BB482 [5> GCG GAA TTC TTA TTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTC AAA GGG >3; SEQ ID NO: 44] híbrida con los nucleótidos que codifican para los diez aminoácidos carboxilo-terminales de GM-CSF ratón y añade un codón de terminación de la traducción TAA y un sitio de restricción Eco RI inmediatamente tras la secuencia codificante. Tanto la muestra de ARN 5 de 6 h como la de 24 h produjeron un producto de RT-PCR de GM-CSF. El producto de PCR de - 400 pb resultante a partir de la muestra de ARN de 6 h se digirió con Mlu I y Eco RI, se purificó en gel, y se clonó en pBBT227 [pUC18::stII-G-CSF(C17S)] que se describió en el ejemplo 8 anterior. Se digirió ADN de pBBT227 con Mlu I y Eco RI, se trató con fosfatasa alcalina, y se corrió en un gel de agarosa al 1%. Se purificó el fragmento de vector de - 2,4 kb y se usó en ligamiento. Los productos recombinantes resultantes llevan una secuencia líder de stII completo fusionada a GM-CSF murino y este constructo de "stII-muGM-CSF" puede escindirse como un fragmento Nde I - Eco RI de \sim 450 pb. Un clon con la secuencia correcta (Gough et al, 1984) se designó como pUC18:stII-muGM-CSF o pBBT435. Para estudios de expresión, se subclonó el fragmento Nde I - Eco RI de pBBT435 en el vector de expresión pEBT257, que se describió en el ejemplo 14 anterior. Se introdujo el plásmido resultante, pBBT257::stII-muGM- CSF, o pBBT456 en W3110 de E. coli para su expresión. Se expresó y purificó GM-CSF de ratón de tipo natural usando los protocolos para la expresión y purificación de GM-CSF humano descritos en el ejemplo 14 anterior.

Pueden construirse genes de GM-CSF de ratón mutante usando mutagénesis basada en PCR dirigida al sitio tal como se describe en general por Innis et al., 1990) y Horton et al., (1993) y en los otros ejemplos anteriores. Se construyó una muteína, T3C, en la región amino-terminal próxima a la hélice A. Se llevó. a cabo la reacción de PCR mutagénica usando el plásmido pBBT435 (descrito en el ejemplo 17) como molde y el cebador directo BB504 [5> GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC TGC CGC TCA CCC ATC ACT >3; SEQ ID NO: 45] y el cebador inverso BB482 [5> GCG GAA TTC TTA TTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTC AAA GGG >3; SEQ ID NO: 46]. BB504 cambia el codón ACC para treonina en la posición 3 de GM-CSF de ratón maduro por un codón TGC para cisteína. Se digirió el producto de PCR de \sim 400 pb resultante con Mlu I y Eco RI, se purificó en gel, y se clonó en pBBT435 que se digirió con Mlu I y Eco RI, se trató con fosfatasa alcalina, y se purificó en gel. Un clon con la secuencia correcta se designó como pUC18::stII-muGM-CSF(T3C). Para estudios de expresión, se subclonó el fragmento Nde I - Eco RI de este plásmido en el vector de expresión pBBT257, que se describió en el ejemplo 14 anterior. Se introdujo el plásmido resultante, pBBT257:::stII-muGM-CSF(T3C), o pBBT469 en JM109 de E. coli para su expresión. Se expresó y purificó la muteína T3C de GM-CSF de ratón usando los protocolos para la expresión y purificación de GM-CSF humano descritos en el ejemplo 14 anterior.

Usando procedimientos similares a los descritos en el presente documento, y en los ejemplos 9 y 15 anteriores, pueden construirse otras muteínas de cisteína de GM-CSF de ratón. Las muteínas de cisteína pueden ser mutaciones de sustitución que sustituyen cisteína por un residuo amino natural en la secuencia codificante de GM-CSF, mutaciones de inserción que insertan un residuo de cisteína entre dos aminoácidos que se producen de manera natural en la secuencia codificante de GM-CSF de ratón, o mutaciones de adición que añaden un residuo de cisteína precediendo al primer aminoácido de la secuencia codificante de GM-CSF de ratón o añaden un residuo de cisteína tras el residuo de aminoácido terminal de la secuencia codificante de GM-CSF de ratón. Los residuos de cisteína pueden sustituirse por cualquier aminoácido, o insertarse entre dos aminoácidos cualesquiera, en cualquier lugar en la secuencia codificante de GM-CSF de ratón. Los sitios preferidos para la sustitución o inserción de residuos de cisteína son en la región que precede a la hélice A, el bucle A-B, el bucle B-C, el bucle C-D, y la región distal a la hélice D. Otros sitios preferidos son los primeros o últimos tres aminoácidos de las hélices A, B, C, y D. También pueden construirse muteínas que contienen una cisteína libre sustituyendo otro aminoácido por uno de los residuos de cisteína que se producen de manera natural en GM-CSF que normalmente forma un enlace disulfuro. El residuo de cisteína que se produce de manera natural que forma normalmente un enlace disulfuro con el residuo de cisteína sustituido está ahora libre. El residuo de cisteína puede sustituirse por cualquiera de los otros 19 aminoácidos, pero preferiblemente por un residuo de serina o alanina. También puede introducirse un residuo de cisteína libre en GM-CSF mediante modificación química de un aminoácido que se produce de manera natural usando procedimientos tales como los descritos por Sytkowski et al. (1998).

También pueden construirse mutantes múltiples que contienen dos o más residuos de cisteína libre añadidos o bien mediante tandas secuenciales de mutagénesis usando los procedimientos descritos en los ejemplos 9 y 15 anteriores o bien alternativamente mediante recombinación in vitro de mutantes individuales para construir plásmidos de expresión recombinantes que codifican para muteínas que contienen dos o más cisteínas libres. Los mutantes múltiples serían aquellos que combinasen dos o más muteínas de cisteína que conservan cada una actividad específica elevada, o completa, cuando se pegilan.

Usando procedimientos similares a los descritos en los ejemplos 12-14, 15 y 16, pueden expresarse, purificar y pegilar muteínas de GM-CSF de ratón y medirse las actividades biológicas de estas proteínas en un bioensayo in vitro y modelos de eficacia in vivo. Pueden expresarse las proteínas en el citoplasma en E. coli o como proteínas secretadas en el espacio periplásmico. También pueden expresarse la muteínas en células eucariotas tales como células de insecto o de mamífero, usando procedimientos similares a los descritos en el documento PCT/US00/00931, o procedimientos relacionados bien conocidos por los expertos en la técnica. Si se desea la secreción desde células eucariotas, puede usarse la secuencia señal natural de GM-CSF, u otra secuencia señal, para secretar las proteínas desde células eucariotas.

Las muteínas de cisteína de proteína de GM-CSF de ratón de tipo natural purificadas, y las formas pegiladas de las muteínas de cisteína pueden someterse a ensayo para determinar la actividad biológica con un ensayo de proliferación celular usando la línea celular NFS60 tal como se describe en los ejemplos 8 y 9 anteriores.

Se aislaron el GM-CSF de tipo natural murino y la muteína de cisteína de GM-CSF T3C murina a partir de E. coli siguiendo el procedimiento descrito para GM-CSF de WT humano (ejemplos 14-16) con la excepción de que se usó sulfato de amonio al 30% para unir las proteínas murinas a una columna de fenil-Sepharose en lugar de al 15% tal como se describe para GM-CSF humano. El mutante de cisteína T3C murino se pegiló fácilmente con reactivos de PEG-maleimida de 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa usando los protocolos descritos anteriormente para muteína de cisteína A3C de GM-CSF humana. Pueden medirse las actividades biológicas de estas proteínas pegiladas en el ensayo de proliferación de células NFS60 tal como se describe en los ejemplos 8 y 9.

Ejemplo 18

Expresión en E. coli y purificación de eritropoyetina humana de tipo natural

A. Expresión de eritropoyetina mediante secreción en E. coli . Se amplificó el ADN que codifica para la eritropoyetina (Epo) humana de tipo natural mediante PCR a partir del plásmido pBBT358 (véase a continuación), que contiene un gen para Epo en el vector pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que se ha usado para la expresión de Epo en células de insecto. El gen para Epo en pBBT358 es similar al ADNc natural, excepto por las tres mutaciones silenciosas en los codones para los aminoácidos 84 y 85 (de Epo madura) que crean un sitio de restricción Xho I para facilitar el proceso de mutagénesis.

Se incorporaron las tres mutaciones que crearon el sitio Xho I usando la técnica de "mutagénesis por extensión de solapamiento" tal como se describe en Horton et al. (1993) y el documento PCT/US00/00931. Se realizaron las reacciones de PCR iniciales, o "primarias" para la construcción de Xho I en un volumen de reacción de 50 \mul en 1X tampón de PCR de Promega que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, cada cebador a 0,4 \muM, cada uno de dATP, dGTP, dTTP y dCTP a 200 \muM, 1 ng de plásmido molde pBBT132 (el gen Epo-Flag de tipo natural clonado como un fragmento Bam HI - Eco RI en pUC19, (descrito en el documento PCT/US00/00931), 2 unidades de Taq Platinum (BRL), y 0,25 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene). Se realizaron las reacciones en un ciclador térmico GeneAmp® PCR System 2400 de Perkin-Elmer. El programa de reacción implicaba: 95ºC durante 5 minutos, 25 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos], una espera de 7 min. a 72ºC y una espera a 4ºC. Los pares de cebadores usados fueron [BB361 x BB125] y [BB362 x BB126]. BB361 (5>GTTGGTCAAC TCGAGCCAGC CGTGGGAG>3; SEQ ID NO: 79] hibrida con secuencias de ADN que codifican para los residuos de aminoácido 81-89 de Epo madura. BB125 (5> CTATGC GGCATCAGAGCAGATA >3; SEQ ID NO: 17) hibrida con la secuencia de vector pUC19 de \sim20 pb en sentido 3' de la secuencia de Epo clonada. Se corrieron los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,5%, se escindieron de gel, y se aislaron usando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor. Entonces se sometieron a "corte y empalme" dos fragmentos mutagenizados, juntos en la reacción de PCR posterior, o "secundaria". En esta reacción, se usaron 0,3 \mul de cada uno de los productos de PCR purificados en gel de las reacciones primarias como molde y se usaron BB125 y BB126 como cebadores. El volumen de reacción fue de 50 \mul y se emplearon 2,5 unidades de Taq polimerasa y 0,5 unidades de Pfu polimerasa. Por lo demás, las condiciones de reacción fueron idénticas a las usadas en las reacciones primarias. Se analizó una alícuota de la PCR secundaria mediante electroforesis en gel de agarosa y se observó la banda esperada de \sim 190 pb. Se "limpió" la masa de la reacción de PCR secundaria usando la purificación de PCR QIAquick (Qiagen), se digirió con Kpn I y Stu I (New England BioLabs) según los protocolos del distribuidor. Tras una limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se ligaron los productos de digestión con pBBT138 (el gen Epo-Flag de tipo natural clonado como un fragmento Bam HI - Eco RI en pBlueBac 4.5, (documento PCT/US00/00931)), que se había cortado con Kpn I y Stu I, se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y se purificó en gel. Se usó la reacción de ligamiento para transformar E. coli y se secuenciaron los plásmidos a partir de los transformantes resultantes para identificar un clon que contiene el sitio Xho I y que tiene la secuencia correcta a lo largo del segmento Kpn I - Stu I de 433 pb. Este clon se designa como pBBT358.

Para la expresión de Epo fusionado al péptido señal STII, (una secuencia peptídica que dirige la secreción de la proteína madura en el periplasma de E. coli), los oligonucleótidos usados en la reacción de PCR fueron BB583 (5>CCAACGCGTA CGCAGCCCCA CCACGCCTCATC>3; SEQ ID NO: 46), que hibrida con la región codificante N-terminal del gen, y o bien BB585 (5> CCGGAATTCT TAACGGTCAC CTGTGCGGCA GGC >3; SEQ ID NO: 47) o bien BB586 (5> CCGGAATTCT TAGTCACCTG TGCGGCAGGC >3; SEQ ID NO: 48), que híbrida con la región codificante C-terminal del gen. BB585 incluye el codón para Arg166, el aminoácido C-terminal pronosticado por la secuencia de ADNc, mientras que BB586 deleciona el codón de Arg166 y codifica para Asp165 como el aminoácido C-terminal. Se digirieron los productos de PCR de - 600 pb resultantes con Mlu I y Eco RI y se clonaron en un vector de pBBT227 digerido de manera similar (ejemplo 9) para producir fusiones entre la secuencia líder de STII y la secuencia codificante amino terminal de Epo de tipo natural. El gen formado mediante PCR usando BB583 y BB585 se denomina STII-Epo de longitud completa (STII-Epo-FL), y el gen formado mediante PCR usando BB583 y BB586 se denomina STII-Epo-des Arg (STII-Epo-dR). Se subclonaron entonces los clones STII-Epo-FL y STII-Epo-dR con la secuencia correcta como fragmentos Nde I - Eco RI en pBBT257 (descrito en el ejemplo 14) para producir pBBT477 y pBBT478, respectivamente.

Se transformaron pBBT477 y pBBT478 en JM109 para producir cepas de BOB578 y BOB579. Se hicieron crecer estas cepas, junto con BOB490 (pBBT257/JM109) durante la noche en caldo Luria (medios LB) que contiene tetraciclina 10 \mug/ml a 37ºC en tubos cilíndricos. Los cultivos saturados durante la noche se diluyeron hasta una D.O. de \sim 0,025 a A_{600} en medio LB que contenía tetraciclina 10 \mug/ml y se incubaron a 37ºC en matraces con agitación. Normalmente se hizo crecer un cultivo de 25 ml en un matraz con agitación de 250 ml. Cuando las D.O. de los cultivos alcanzaron -0,3 - 0,5, se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión o bien de Epo de tipo natural o bien de Epo des Arg166. Para los experimentos iniciales, se tomaron muestras de los cultivos a 4 y \sim19 h tras la inducción. Se analizaron las muestras mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre geles de Tris-glicina poliacrilamida al 14% colados previamente y se tiñeron con azul de Coomassie. Los cultivos inducidos tanto de BOB578 como de BOB579 mostraron una banda a aproximadamente 20 kDa, que concuerda con el peso molecular de Epo de tipo natural. Esta banda no se detectó en el cultivo inducido de BOB490, el control con sólo vector.

B. Expresión de met-eritropoyetina en el citoplasma de E. coli Tal como se describió en el ejemplo 18. A., se amplificó el ADN que codifica para la eritropoyetina (Epo) humana de tipo natural mediante PCR a partir del plásmido pBBT358, que contiene un gen para Epo de tipo natural. Para la expresión de met-Epo en el citoplasma de E. coli, los oligonucleótidos usados en la reacción de PCR fueron BB584 (5> TTC GCT AGC ATG CAT GAC CTG CAG GAG GAA ATT TAA ATG GCC CCA CCA CGC CTC ATC >3; SEQ ID NO: 49), que hibrida con la región codificante N-terminal del gen, y o bien BB585 (5>CCGGAATTCT TAACGGTCAC CTGTGCGGCA GGC>3; SEQ ID NO: 47) o bien BB586 (5>CCGGAATTCT TAGTCACCTG TGCGGCAGGC >3; SEQ ID NO: 48), que se describieron anteriormente. Se digirieron los productos de PCR de - 600 pb resultantes con Mlu I y Eco RI y se clonaron en un vector de pBBT227 digerido de manera similar (ejemplo 9) para producir genes que codifican para metionil-Epo. El gen formado mediante PCR usando BB583 y BB585 se denomina met-Epo de longitud completa (met-Epo-FL), y el gen formado mediante PCR usando BB583 y BB586 se denomina met-Epo-des Arg (met-Epo-dR). Se subclonaron entonces los clones de Met-Epo-FL y met-Epo-dR con la secuencia correcta como fragmentos Nde I- Eco RI en pBBT257 (descrito en el ejemplo 14) para producir pBBT479 y pBBT480, respectivamente.

Se transformaron pBBT479 y pBBT480 en JM109 para producir cepas de BOB580 y BOB581. Los experimentos de expresión con estas cepas, junto con BOB490 (pBBT257/JM109) fueron los mismos que los descritos anteriormente para los constructos de STII-Epo. Los cultivos inducidos tanto de BOB580 como de BOB581 mostraron una banda a aproximadamente 20 kDa, que concuerda con el peso molecular de Epo de tipo natural. Esta banda no se detectó en el cultivo inducido de BOB490, el control con sólo vector.

Ejemplo 19

Construcción, expresión en E. coli, purificación y actividad biológica de muteínas de cisteína de eritropoyetina

A. Construcción de muteínas de cisteína de Epo. Se describen métodos para la construcción de muteínas de cisteína de Epo usando procedimientos de mutagénesis basados en PCR dirigidos al sitio y sitios preferidos para las ubicaciones de muteínas de cisteína en EPO en los documentos PCT/US00/00931, PCT/US98/14497, e Innis et al. (1990) y White (1993) y los diversos ejemplos proporcionados en el presente documento. Además, L80 es otro sitio preferido para una muteína de sustitución de cisteína.

La eritropoyetina recombinante y las muteínas de cisteína de eritropoyetina pueden expresarse en E. coli usando los procedimientos descritos en el ejemplo 18 para EPO de tipo natural. Las células se lisan usando B-per (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante y se aísla la porción insoluble mediante centrifugación. Se solubilizó el sedimento usando cisteína 20 mM, guanidina 6 M, Tris 20 mM. Se agitó la mezcla durante 1-2 horas a temperatura ambiente antes de diluirse a 1:20 (v/v) con 20 m de Tris, pH 8, 40 \mum de sulfato de cobre, lauroilsarcosina al 2%. Se deja asentar la renaturalización a 4ºC durante 24-48 horas. Las muteínas de cisteína de EPO y EPO replegadas se purifican usando una columna de S-Sepharose equilibrada en Mes 20 mM, pH 5, Tween al 0,01% y glicerol al 20% (tampón A). Puede eluirse EPO a partir de la columna de S-Sepharose usando un gradiente lineal de NaCl 0-1 M en tampón A. Las columnas secundarias para la purificación adicional de la EPO recombinante, si fuesen necesarias, incluyen, SEC, azul-Sepharose, hidroxiapatita, o resinas HIC (fenilo, butilo).

Ejemplo 20

Construcción de trímeros unidos por disulfuro y multímeros de orden superior unidos por disulfuro de muteínas de cisterna

Pudieron construirse variantes de GH que tienen más de una cisteína "libre" y usarse para producir multímeros de GHh unidos por disulfuro de orden superior tal como se describe en el documento PCT/US00/00931. Tal variante pudo expresarse en E. coli, replegarse y purificarse y tal como se describió en los ejemplos 1 y 2 y en el documento PCT/LTS/00/00931. Después pudieron emplearse etapas de procesamiento adicionales para inducir la formación de un enlace disulfuro tal como se describió en el ejemplo 2 y en el documento PCT/US00/00931. En tales condiciones, algunas variantes de GHh que tenían una cisteína libre, tal como T3C, se convirtieron prácticamente de manera cuantitativa en dímeros unidos por disulfuro. En las mismas o similares condiciones, la formación de disulfuro intermolecular por una variante de GHh que tenía dos cisteínas libres, por ejemplo, un mutante doble que combinó T3C y otra muteína de cisteína, daría como resultado una polimerización moléculas de GHh y la longitud de la cadena de tales polímeros sería, en principio, ilimitada. La longitud de la cadena podría limitarse, y hasta cierto punto controlarse mediante la adición a la reacción polimerización de moléculas de GHh que tienen sólo una cisteína libre tal como la variante T3C y/u otras muteínas de cisteína. La formación de enlaces disulfuro entre el polímero creciente y una molécula que tiene sólo una cisteína libre "tapará" o impedirá la extensión adicional de uno de los dos sitios de polimerización en el polímero naciente. Una reacción posterior de una segunda molécula de GHh que tiene sólo una cisteína libre con el otro sitio de polimerización de ese polímero naciente termina la polimerización y fija la longitud de esa cadena polimérica. La longitud promedio de polímero puede controlarse mediante la estequiometría de los reactivos, es decir, la razón de moléculas de GHh con dos cisteínas libres con respecto a moléculas de GHh con una cisteína libre. Razones inferiores favorecerían la obtención de polímeros más cortos en promedio y razones superiores favorecerían la obtención de polímeros más largos en promedio. Se podrían construir polímeros "ramificados" más complejos a partir de reacciones que implican variantes de GHh con 3 o más cisteínas libres con variantes de GHh que tienen sólo una cisteína libre.

Las clases de tamaño discreto de determinados polímeros podrían purificarse posteriormente mediante métodos cromatográficos tales como cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, y similares. Pueden usarse procedimientos similares a los descritos para GH para producir dímeros unidos por disulfuro y multímeros de orden superior de G-CSF, interferón alfa, GM-CSF y otras proteínas.

Ejemplo 21

Clonación, expresión y purificación de endostatina humana de tipo natural

A. Secuencias de clonación de ADN que codifican para endostatina. Se amplificó un ADNc que codifica para endostatina mediante PCR de una biblioteca de ADNc de hígado fetal humano (Clontech). Se llevaron a cabo reacciones de PCR con el cebador directo BB383 (5> GCTAACGCGTACGCACACAGCCACCGCGACTTCCAGCCG >3; SEQ ID NO: 50) y el cebador inverso BB384 (5> CGGAATTCCTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT >3; SEQ ID NO: 51). El cebador BB383 hibrida con el extremo 5' de la secuencia codificante de endostatina humana y el cebador inverso, BB92, hibrida con el extremo 3' de la secuencia codificante de endostatina. Se digirió el producto de PCR de \sim 600 pb resultante con Mlu I y Eco RI y se clonó en un vector de pBBT227 digerido de manera similar (ejemplo 9) para producir una fusión entre la secuencia líder de STII y la secuencia codificante amino terminal de endostatina humana. Tras confirmar su secuencia, se modificó el gen para la expresión intracelular mediante amplificación por PCR con el cebador directo BB434 (5'> GTGCACCATA TGAAGAAGAA CATCGCATTC CTGCTGGCTA GCATGCATGA CCTGCAGGAG GAAATTTAAA TGCACAGCCA CCGCGACTTC >3'; SEQ ID NO: 52) y BB384 (SEQ ID NO: 51). BB434 fusiona un codón de metionina (met) al extremo amino-terminal de endostatina. Se digirió el fragmento de 630 pb resultante con Nde I y Sac II y se clonó en un plásmido de STII-endostatina-pUC18 digerido de manera similar descrito anteriormente. Se subclonó entonces un clon de met-endostatina con la secuencia correcta (pBBT370) como un fragmento Nde I - Eco RI en pBBT257 (descrito en el ejemplo 14) para producir
pBBT371.

B. Expresión de met-endostatina de tipo natural en E. coli . Se transformaron pBBT371, que codifica para Met-endostatina de tipo natural, y pBBT257, el vector original, en JM109 de E. coli para producir cepas de BOB460 y BOB490, y en W3110 para producir cepas de BOB461 y BOB340. Se hicieron crecer estas cepas durante la noche en caldo Luria (medios LB) que contenía tetraciclina 10 \mug/ml a 37ºC en tubos cilíndricos. Los cultivos saturados durante la noche se diluyeron hasta una D.O. de - 0,025 a A_{600} en tetraciclina 10 \mug/ml en LB y se incubaron a 37ºC en matraces con agitación. Normalmente se hizo crecer un cultivo de 25 ml en un matraz con agitación de 250 ml. Cuando las D.O. de los cultivos alcanzaron -0,3 - 0,5, se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión de met-endostatina humana. Para los experimentos iniciales, se tomaron muestras de los cultivos a 0, 4 y \sim19 h tras la inducción. Se analizaron las muestras mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre geles de Tris-glicina poliacrilamida al 14% colados previamente y se tiñeron con azul de Coomassie. Los cultivos inducidos tanto de BOB460 como de BOB460 mostraron una banda a aproximadamente 20 kDa, que concuerda con la endostatina humana madura. Esta banda no se detectó en cultivos inducidos de BOB460 y BOB461 o en cultivos inducidos o no inducidos de BOB490 y BOB340, los controles con sólo vector. La banda de \sim20 kDa migró conjuntamente con endostatina humana preparada comercialmente adquirida de Calbiochem.

Ejemplo 22

Construcción, expresión, purificación y actividad biológica de muteínas de cisteína de endostatina humana A. Construcción de muteínas de cisteína de endostatina

Se construyeron once genes de endostatina humana mutantes usando procedimientos de mutagénesis basada en PCR dirigida al sitio similares a los descritos en el documento PCT/US00/00931 e Innis et al. (1990) y White (1993). Se construyeron cuatro muteínas [*-1C, H2C, R5C y F7C] en la región amino terminal (los residuos de aminoácidos se numeran restando 130 de los residuos numerados en Hohenester et al. (1998)); tres muteínas estaban en los residuos codificados por secuencias alrededor del centro del gen [G90C, G98C y H112C]; y tres muteínas estaban en la región carboxilo terminal [L154C, R157C y S162C]. Se construyó una muteína adicional en un residuo dentro del sitio activo de la endostatina. Ésta pudo servir como una proteína control en el bioensayo.

La fuente de fragmentos de molde usados para las reacciones de PCR mutagénicas fue el plásmido pBBT370. Se digirieron los productos de PCR con endonucleasas de restricción apropiadas, se extrajeron usando el kit de limpieza de PCR Qiagen y se ligaron con el ADN de vector de pBBT370 que se había cortado con esas mismas enzimas de restricción, se trató con fosfatasa alcalina, y se extrajo usando el kit de limpieza de PCR Qiagen. Se hicieron crecer los transformantes de estos ligamientos y se asiló se aislaron los ADN de plásmidos y se secuenciaron. Se determinó la secuencia de todo el fragmento de PCR mutagenizado clonado para verificar tanto la presencia de la mutación de interés como la ausencia de cualquier otra mutación adicional que pudiese introducirse potencialmente por la reacción de PCR o por los cebadores de oligonucleótidos sintéticos.

Se construyó la mutación de sustitución de cisteína *-1C usando tres amplificaciones de PCR tal como sigue. Se diseñó el oligonucleótido directo mutagénico BB531 (5> GAGGAAATTT AAATGTGCCA CAGCCATCGCGACTT
CC >3; SEQ ID NO: 53) para insertar un codón de cisteína TGC entre el codón de metionina ATG N-terminal y el primer codón de histidina CAC del cebador. Se usó este oligonucleótido en la PCR nº 1 con el cebador inverso, no mutagénico BB126 (5> TGTGGAATTG TGAGCGGATA AC >3; SEQ ID NO: 54) que hibrida con secuencias de vector de pUC18 dentro de 60 pb en sentido 3' de la secuencia codificante de endostatina. El molde para esta PCR fue un fragmento Nhe I - ApaL I de 1264 pb purificado derivado de pBBT370. Este fragmento contiene toda la secuencia codificante de endostatina y 670 pb de la secuencia de pUC18 en sentido 3' del gen de endostatina, incluyendo la secuencia con la que híbrida BB126. La PCR nº 1 fue una reacción de 25 \mul llevada a cabo en 1X tampón de PCR Promega que contiene MgCl_{2} 1,5 mM, cada cebador a 0,4 \muM, cada uno de ATPd, GTPd, TTPd y CTPd a concentración 200 \muM, 0,5 ng de fragmento de molde, 1 unidad de Taq Polimerasa (Promega), y 0,1 unidades de Pfu Polimerasa (Stratagene). La reacción se llevó a cabo en un ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 2400. El programa de reacción implicaba: 95ºC durante 5 minutos, 22 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos], una espera de 7 min. a 72ºC y una espera a 4ºC.

Se realizó la PCR nº 2 usando el oligonucleótido inverso, mutagénico BB532 (5> GGAAGTCGCG ATGGCTGT
GG CACATTTAAA TTTCCTC >3; SEQ ID NO: 55), que es el complemento inverso de BB531, y el cebador no mutagénico BB125 (5> CTATGCGGCA TCAGAGCAGAT >3; SEQ ID NO: 17), que hibrida con secuencias de pUC18 de 40 pb en sentido 5' del sitio Nde I. El molde para la PCR nº 2 fue un fragmento Ssp I - Eco RI de 990 pb purificado de pBBT370 que contenía toda la secuencia codificante de endostatina y 367 pb de secuencia de pUC18 en sentido 5' del sitio Nde I en el extremo 5' del 5fragmento génico de endostatina, incluyendo la secuencia con la que híbrida BB125. Los componentes y el programa para la PCR nº 2 son los mismos que para la PCR nº 1. Se analizaron alícuotas de 10 \mul de las PCR nº 1 y nº 2 mediante electroforesis en gel de agarosa y se encontró que cada una había producido un único fragmento del tamaño esperado.

La PCR nº 3 fue una reacción en 50 \mul llevada a cabo usando cebadores no mutagénicos BB125 y BB126. El molde para esta PCR fue 1 \mul de PCR nº 1 y 0,3 \mul de PCR nº 2. Los componentes de la PCR nº 3 fueron los mismos que en las reacciones 1 y 2. El programa de reacción implicaba: 95ºC durante 5 minutos, 23 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 min], una espera de 7 min. a 72ºC y una espera a 4ºC. Se analizó una alícuota de 10 \mul de la PCR nº 3 mediante electroforesis en gel de agarosa y se encontró que había generado un fragmento de 740 pb, tal como se esperaba. El resto de la reacción se "limpió" usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) según el protocolo del distribuidor y se digirió con Nhe I y BsrG I (New England BioLabs) según los protocolos del distribuidor. Tras una etapa adicional de limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se ligaron los productos de digestión con pBBT370 que se había cortado con Nhe I y BsrG I, se trataron con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y se "limpiaron" usando el kit de purificación de PCR QIAquick. Se usó la reacción de ligamiento para transformar JM109 de E. coli y se secuenciaron los plásmidos de los transformantes resultantes. Se identificó un clon que tenía la mutación *-1C mutación y la secuencia correcta a lo largo del segmento Nhe I - BsrG I de 205 pb.

Se construyeron las mutaciones de sustitución H2C, R5C, F7C, y R28C (es decir, cambiando histidina en la posición 2 por cisteína, etc.) y se verificó la secuencia usando los protocolos detallados anteriormente para *-1C, excepto que se usaron diferentes oligonucleótidos mutagénicos (tabla 16). Los oligonucleótidos mutagénicos directos se usaron siempre junto con el cebador inverso, no mutagénico BB126 y el fragmento Nhe I - ApaL I de 1264 pb purificado como molde, y los oligonucleótidos mutagénicos inversos se usaron siempre junto con el cebador directo, no mutagénico BB125 y el fragmento Ssp I - Eco RI purificado de 990 pb como molde.

TABLA 16 Oligonucleótidos usados para construir muteínas de cisteína de endostatina

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Se construyeron las muteínas G90C y G98C mediante métodos similares a los descritos para *-1C, excepto que los oligonucleótidos mutagénicos fueron diferentes (tabla 16) y el molde para la PCR nº 3 fueron 0,5 \mul de PCR nº 1 y 0,5 \mul de PCR nº 2. Además, tras la "limpieza", se digirió la PCR nº 3 con BsrG I y Bsu36 I (New England BioLabs) y tras una etapa limpieza adicional, se ligaron los productos de digestión con pBBT370 que se había cortado con BsrG I y Bsu36 I, se trataron con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y se "limpiaron" usando el kit de purificación de PCR QIAquick.

Se construyeron las muteínas L154C, R157C, y S162C mediante métodos similares a los descritos para *-1C, excepto que los oligonucleótidos mutagénicos fueron diferentes (tabla 16) y el molde para la PCR nº 3 fueron 0,3 \mul de la PCR nº 1 y 1 \mul de la PCR nº 2. Además, tras la "limpieza" se digirió la PCR nº 3 con Bsu36 I y Eco RI y tras una etapa de limpieza adicional, se ligaron los productos de digestión con pBBT370 que se había cortado con Bsu36 I y Eco RI, se trataron con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y se "limpiaron" usando el kit de purificación de PCR QIAquick.

Se construyó la muteína H112C mediante métodos diferentes en varios aspectos de los descritos para *-1C. En primer lugar, la secuencia del oligonucleótido directo mutagénico usado en la PCR nº 1 fue diferente (tabla 16) y el volumen de la reacción fue de 50 \mul en vez de 25 \mul. No se llevaron a cabo las PCR nº 2 y PCR nº 3, porque no fueron necesarias. En su lugar, tras analizar una alícuota de 10 \mul mediante electroforesis en gel, esta reacción se trató de la misma manera a como se trata normalmente la PCR nº 3. Es decir, el resto de la reacción se "limpió" usando purificación de PCR QIAquick y se digirió con Bsu36 I y Eco RI (New England BioLabs) según los protocolos del distribuidor. Tras una etapa de limpieza adicional usando el kit de purificación de PCR QIAquick, se ligaron los productos de digestión con pBBT370 que se había cortado con Bsu36 I y Eco RI, se trataron con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England BioLabs) y se "limpiaron" usando el kit de purificación de PCR QIAquick. Se usó la reacción de ligamiento para transformar JM109 y se secuenciaron los plásmidos de E. coli a partir de los transformantes resultantes.

B. Expresión de muteínas de cisteína de met-endostatina en E. coli

Se subclonó cada clon de muteína de cisteína de met-endostatina como un fragmento de Nde I - Eco RI en pBBT257 (descrito en el ejemplo 14) para generar un conjunto de plásmidos de expresión que se transformaron en JM109 para producir las cepas usadas en estudios de expresión.

Se hicieron crecer estas cepas durante la noche en caldo Luria (medios LB) que contiene tetraciclina 10 \mug/ml a 37ºC en tubos cilíndricos. Los cultivos saturados durante la noche se diluyeron hasta una D.O. - 0,025 a A_{600} en tetraciclina 10 \mug/ml en LB y se incubaron a 37ºC en matraces con agitación. Normalmente se hizo crecer un cultivo de 25 ml en un matraz con agitación de 250 ml. Cuando una D.O. de un cultivo alcanzó -0,3 - 0,5, se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión de la muteína de cisteína de endostatina específica para esa tinción. Se recogieron muestras de preinducción, posinducción de 4 horas, y posinducción de 16 horas. Se analizaron las muestras mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) en geles de tris-glicina poliacrilamida al 14% colados previamente y teñidos con azul de coomassie. Los cultivos inducidos de cada una de las cepas de muteína de cisteína de endostatina mostró una banda a aproximadamente 20 kDa, que concuerda con la endostatina humana madura. Esta banda no se detectó en cultivos no inducidos o en cultivos inducidos o no inducidos de BOB490, el control con sólo vector. La banda de \sim20 kDa migró conjuntamente con endostatina humana preparada comercialmente adquirida de Calbiochem.

C. Expresión y purificación de endostatina y muteínas de cisteína de endostatina

Se sedimentó E. coli que contiene endostatina expresada de tipo natural o muteína de cisteína de endostatina R5C mediante centrifugación y se congeló a -80ºC. Se tamizaron los sedimentos celulares y se trataron con 5 ml de reactivo de extracción de proteínas bacterianas B-PER* según los protocolos del proveedor (Pierce). El material insoluble, que contenía la masa de la proteína endostatina, se recuperó mediante centrifugación y se volvió a suspender en B-PER. Se trató esta mezcla con lisozima (200 \mug/ml) durante 10 min. para romper adicionalmente las paredes celulares, y se añadieron MgCl_{2} (concentración final 10 mM) y ADNasa libre de proteasa (2 \mug/ml). Se recogió la endostatina insoluble mediante centrifugación y se lavó, mediante resuspensión en agua y nueva centrifugación, para eliminar la mayoría de los residuos celulares solubilizados. Para el replegamiento, se disolvió el sedimento resultante que contiene endostatina insoluble en 20 ml de urea 8 M, cisteína 10 mM en base Tris 20 mM. Se agitó esta mezcla durante 120 min a temperatura ambiente. Se añadió cistina hasta obtener una concentración final de 10 mM antes de la solubilización se diluyó en 200 ml de urea 5 3 M enfriada en hielo, sulfato de cobre 40 \muM, Tris 20 mM, pH 7,5. Se agitó lentamente esta mezcla replegada a 4ºC durante 3 días. El pH de la mezcla replegada se ajustó entonces hasta 5,0 con HCl diluido y se centrifugó la mezcla antes de cargarse en una columna de 5 ml S-Sepharose (Pharmacia HiTrap) equilibrada en fosfato de sodio 40 mM pH 5,0 (tampón A). Se eluyeron las proteínas unidas con un gradiente salino lineal desde 0-100% de tampón B (NaCl 500 mM, sulfato de sodio 20 mM, pH 5,0). Se reunieron las fracciones de S-Sepharose que contenían predominantemente endostatina ajustándose su pH hasta 7,4 antes de cargarse en una columna de Heparina-Sepharose (Hi trap), equilibrada previamente en Tris 20 mM, pH 7,4. Se eluyó la columna con un gradiente salino de NaCl 0-1 M. Se reunieron las fracciones de la columna de Heparina con endostatina pura y se congelaron. También se han purificado parcialmente los mutantes de cisteína de endostatina G90C, G98C, H112C, y R157C usando el protocolo anterior, con la etapa de columna de heparina omitida.

La muteína de cisteína de endostatina R5C se pegiló usando un exceso 15X de PEG maleimida de 5 kDa y un exceso de 10 - 15 veces de TCEP. La reacción proporcionó proteína R5C monopegilada.

D. Bioensayo de endostatina

Endostatina recombinante de tipo natural replegada y la muteína de cisteína de endostatina R5C replegada demostraron ser biológicamente activas usando el ensayo de inhibición de MMP-2 descrito por Kim, et al. (2000).

También puede medirse la actividad biológica de las proteínas en un ensayo de inhibición de proliferación de células endoteliales. La inhibición de la proliferación de células endoteliales in vitro puede llevarse a cabo tal como sigue. Cinco mil células HMVEC-L (Clonetics) pueden sembrarse en placa sobre placas de cultivo de 96 pocillos gelatinizadas e incubarse (37ºC, CO_{2} al 5%) durante 24 h en 100 \mul de medio HMVEC-L que contiene FGFb. Después se sustituye el medio con 20 \mul de medio que contiene diluciones en serie de endostatina, muteínas de cisteína de endostatina o muteínas de cisteína de endostatina pegiladas, y se incuban durante 20 min. Se añaden entonces ochenta \mul de medio HMVEC-L recién preparado que contiene FGFb al pocillo. Tras 72 h., pueden determinarse los números de células. Las diversas proteínas de endostatina inhibirán la proliferación de las células endoteliales, tal como se demostró por las disminuciones dependientes de dosis en los números de células endoteliales al final del ensayo.

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Ejemplo 23

Replegamiento de muteínas de cisteína de angiostatina recombinante

La angiostatina es totalmente activa cuando no está glucosilada y por tanto, no necesita un sistema de expresión eucariota para su producción. La secuencia codificante para la angiostatina humana, que consiste en las primeras cuatro subunidades kringle de plasminógeno humano, pueden amplificarse por PCR a partir de un molde de ADNc de plasminógeno humano (disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD). La angiostatina de tipo natural y las muteínas de cisteína de angiostatina pueden secretarse a partir de E. coli fusionando secuencias de señal bacterianas tales como las de las proteínas STII u ompA sobre el extremo N-terminal de la angiostatina madura con el fin de transportar la proteína en el espacio periplásmico. Este método también se ha usado satisfactoriamente para fragmentos de angiostatina (kringle (K)1, K2, K3, y K2-3, (Cao et al., (1996)). Alternativamente, pueden expresarse angiostatina y muteínas de cisteína de angiostatina citoplasmáticamente en E. coli. u otra célula huésped. La angiostatina tiene 26 cisteínas que forman 13 disulfuros. Por tanto, los protocolos de replegamiento convencionales sin una cisteína añadida bloqueando serán posiblemente insatisfactorios con una proteína rica en cisteína tal como la angiostatina. Los sitios preferidos para la introducción de residuos de cisteína en angiostatina incluyen K97C (un residuo de cisteína que se añaden sobre el extremo N-terminal de la angiostatina madura), T365C, 371C, S460C, A463C, y *466C (un residuo de cisteína añadido al extremo C-terminal de la proteína de angiostatina madura.

Las células bacterianas que expresan angiostatina recombinante o las muteínas de cisteína angiostatina pueden escindirse usando Bper tal como describe el protocolo del fabricante (Pierce). La parte insoluble puede aislarse mediante centrifugación. El sedimento puede solubilizarse usando una mezcla de cisteína 20 mM, guanidina 6 M, base Tris 20 mM. La mezcla puede agitarse durante 2 horas a temperatura ambiente antes de diluirse 10 veces en Tris 20 mM. El producto replegado puede mantenerse a 4ºC durante 1-2 días. Al final de este tiempo, la mezcla replegada puede centrifugarse y la proteína de angiostatina (o muteínas de cisteína) pueden purificarse usando una columna de lisina-Sepharose. La mezcla replegada puede cargarse directamente en la columna que se ha equilibrado previamente en Hepes 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4 angiostatina (o una muteína de cisteína de angiostatina) puede liberarse de la resina usando un gradiente de ácido E-aminocaproico 0-12 mM. Puede lograrse una purificación adicional, si fuese necesario, usando diversas resinas de intercambio fónico o resinas HIC.

Ejemplo 24

Mapeado de péptidos de proteínas pegiladas

En muchos casos, pueden usarse mapas de péptidos para verificar el sitio de pegilación. Normalmente se digiere la proteína pegilada específicamente de manera que la muteína de cisteína está presente en un péptido sin ningún otro residuo de cisteína. La presencia de un PEG unido covalentemente al péptido cambiará drásticamente el tiempo de retención cuando se someta a ensayo a la mezcla de digestión mediante HPLC en fase inversa. Cuando se digiere GH con tripsina usando condiciones de la bibliografía (Clark et al., 1996), pueden aislarse 21 péptidos trípticos posibles (T1-T21, numerados consecutivamente). T1, que representa los residuos 1-8 que incluye la mutación T3C, se desplaza hasta un tiempo de retención ligeramente menor para el mutante de cisteína (61 minutos) frente al tipo natural (64 minutos) o la hormona de crecimiento pituitaria. Cuando está pegilado con un PEG de 5 K, el péptido T1 se mueve hasta el extremo del cromatograma con un tiempo de retención superior a 100 minutos. Cuando se digiere GH con endoproteasa Lys-C, 10 péptidos (L1-10, numerados consecutivamente), representando L1 los residuos 1-38 eluye a aproximadamente 59 minutos para el GH de tipo natural y a aproximadamente 61 minutos para la muteína T3C. Cuando está pegilado con un PEG de 20 K, L1 falta del cromatograma. Estos datos confirman que el resto PEG está de hecho unido al residuo de cisteína en la posición 3 tal como se pronosticó en vez de a una cisteína nativa. La digestión enzimática y el análisis de HPLC en FI de muteínas de cisteína de IFN (tripsina y endoproteasa Glu-C), GMCSF (endoproteasa Glu-C), y G-CSF (endoproteasa Lys-C) antes y después de la pegilación también mostraron datos que estaban en concordancia con un único sitio de pegilación en el residuo de cisteína recién introducido.

Ejemplo 25

Movilización de células progenitoras de sangre periférica iniciada mediante muteínas de cisteína de PEG-G-CSF y PEG-GM-CSF

El tratamiento con G-CSF recombinante y GM-CSF recombinante ha demostrado movilizar células progenitoras de sangre periférica (PBPC) que dan lugar a una producción e inserción de neutrófilos y plaquetas tras la quimioterapia. La mejora de la movilización de PBPC (y potencialmente las tasas de inserción) pueden evaluarse en presencia de las muteínas de cisteína de G-CSF y GM-CSF pegiladas. Pueden proporcionarse a las cepas de ratón sometidas a esplenectomía que tienen perfiles de células medulares y cinéticas de proliferación bien definidas una(s) dosis subcutánea(s)
o intravenosa(s) única(s) o diaria(s) (hasta 7 días) de G-CSF (de tipo natural o Neupogen®) o muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas. Cada experimento puede contener también un grupo de ratones tratados sólo con un vehículo, que consiste en albúmina de suero de ratón suspendido en una solución salina isotónica. Tras el tratamiento, puede recogerse sangre periférica mediante punción cardiaca y recogerse en tubos que contienen EDTA. Puede realizarse un análisis por CBC. Pueden recogerse células de médula espinal lavando los contenidos del fémur y la médula. Pueden determinarse números de cuentas celulares mediante tinción con violeta de cristal y enumeración por hemacitómetro. Pueden aislarse células de baja densidad usando un fraccionamiento de sangre por gradiente de densidad y usarse en los ensayos de células progenitores. El protocolo para los ensayos de células progenitores se explica en Briddell, et al (1993). Básicamente, un sistema basado en agar de doble capa (Bradley et al, 1978) puede usarse para las células progenitoras tanto primitivas (células de formación de colonias potenciales de alta proliferación) como maduras (células formadoras de colonias de granulocitos-macrofágos. Un sistema de ensayo basado en metilcelulosa desarrollado por Iscove et al (1974) puede usarse para evaluar la formación de la colonia de eritroides. Las muteínas de cisteína de G-CSF pegiladas aumentarán la movilización de las células progenitoras y células madre. Pueden realizarse estudios similares con muteínas de cisteína de GM-CSF pegiladas y el GM-CSF de tipo natural. Por último, puede investigarse la eficacia del transplante en ratones irradiados letalmente y la capacidad para acelerar el procedimiento de inserción en presencia de G-CSF pegilado y muteínas de cisteína de GM-CSF pegiladas.

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<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccatcgccc tggatcttac g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgaattct taacagggct gggcaaggtg gcgtag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctgggcc cgtgcagctc cctgccg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcagggag ctgcacgggc ccagcgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatgcggca tcagagcaga ta

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgggcccgg cctgctccct gccgcag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcggcagg gagcaggccg ggcccag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacccgtacg catgtacccc gctgggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccagcggg gtacatgcgt acgcgtt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtggaattg tgagcggata ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaatggccc cttgcctgca gcccacc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgggctgc aggcaagggg ccattcc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccctgcagc cctgccaggg tgccatg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catggcaccc tggcagggct gcagggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgccatgc cgtgcttcgc ctctgct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcagaggcg aagcacggca tggcacc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggccttcg cctgtgcttt ccagcgc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctggaaa gcacaggcga aggccgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccacccagg gttgcatgcc ggccttc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggccggc atgcaaccct gggtggg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgccggcct tctgctctgc tttccag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggaaagca gagcagaagg ccggcat

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccattccc agttcttcca t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcgttttct ctatcgctac caac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcaggccc tgtgtgggat ctccccc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggggagatc ccacacaggg cctgcag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggaaggga tctgccccga gttgggt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acccaactcg gggcagatcc cttccag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgctgcag ttctcatgtt tgacagctta tcatc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgctgcag atttaaatta gcgaggtgcc gccggcttcc at

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgacgcgta cgcagcaccc acccgctcac ccatcact

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattct tatttttgga ctggtttttt gcattcaaag gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgacgcgta cgcagcaccc tgccgctcac ccatcact

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaacgcgta cgcagcccca ccacgcctca tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattct taacggtcac ctgtgcggca ggc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattct tagtcacctg tgcggcaggc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcgctagca tgcatgacct gcaggaggaa atttaaatgg ccccaccacg cctcatc

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaacgcgt acgcacacag ccaccgcgac ttccagccg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaattcct cgagctactt ggaggcagtc atgaagct

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaaattt aaatgtgcca cagccatcgc gacttcc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtggaattg tgagcggata ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagtcgcg atggctgtgg cacatttaaa tttcctc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaaattt aaattgcagc catcgcgact tccag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggaagtcg cgatggctgc acatttaaat ttcctc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcacagcc actgcgactt ccagccg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggctggaag tcgcagtggc tgtgcat

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccaccgcga ctgtcaaccg gtgctccac

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggagcacc ggttgacagt cgcggtggc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgcggggc atctgcggcg ccgacttcca g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggaagtcg gcgccgcaga tgccccgcat g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctctgttc tcgtgctctg agggtcc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaccctcag agcacgagaa cagagcc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctgaagc cctgcgcacg catcttc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagatgcgt gcgcagggct tcagcgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgtcctga ggtgcccgac ctggccccag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccaggcct ccagcctctg cgggggcagg ctc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gag cctgccc ccgcagaggc tggaggcctg gcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctggggg gctgcctcct gggccagagt gccgcg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggcactc tggcccagga ggcagccccc cagcag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcctggggc agtgcgcagc gagctgccat c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatggcagct cgctgcgcac tgccccagga g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacactgctg ctgagatgaa t

\hfill

21

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<210> 76

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 76

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cttgtagtgg ctggccatca tg

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22

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<210> 77

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 77

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cgcaacgcgt acgcagccacc ggcccgctcg ccgagcccga gcacgcagcc gtgggag

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57

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<210> 78

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 78

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cgcgaattct tactcctgga ccggctccca gcagtcaaac gggatgacca gcagaaa

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57

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<210> 79

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 79

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gttggtcaac tcgagccagc cgtgggag

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28

Claims

1. Método para preparar una forma replegada, soluble de una proteína insoluble o agregada que es un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento y que contiene uno o más residuos de cisteína libre añadidos, que comprende las etapas de:

a): hacer que una célula huésped exprese una proteína que contiene uno o más residuos de cisteína libre añadidos que es un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento en una forma insoluble o agregada;

b): lisar las células por medios químicos, enzimáticos o físicos;

c): solubilizar y reducir la proteína insoluble o agregada exponiendo la proteína insoluble o agregada a un agente desnaturalizante, un agente reductor y un agente bloqueante de cisteína; y

d): replegar la proteína reduciendo las concentraciones del agente desnaturalizante y los agente reductores hasta niveles suficientes para permitir que la proteína se renaturalice en una forma soluble, biológicamente activa, en la que dicho agente bloqueante de cisteína forma un disulfuro mixto reversible con al menos un residuo de cisteína libre en dicha proteína.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento se secreta por la célula huésped.

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento se expresa por la célula huésped como una proteína intracelular.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa (b) de lisado comprende lisar la célula huésped en presencia del agente bloqueante de cisteína usado en la etapa (c).

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa (b) de lisado comprende lisar la célula huésped en presencia de un agente desnaturalizante.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa (b) de lisado comprende lisar la célula huésped en presencia de un agente desnaturalizante y el agente reductor usado en la etapa (c).

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa (b) de lisado comprende:

1): lisar la célula huésped; y

2): separar las proteínas solubles de las proteínas insolubles o agregadas.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho agente reductor y dicho agente bloqueante de cisteína de dicha etapa (c) son el mismo compuesto.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho agente bloqueante de cisteína se selecciona del grupo que consiste en cisteína, cisteamina, glutatión reducido o ácido tioglicólico.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho agente bloqueante de cisteína de la etapa (c) es un ditiol que, cuando se reduce, actúa como un agente bloqueante de cisteína.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicho ditiol se selecciona del grupo que consiste en cistina, cistamina, glutatión oxidado o ácido ditioglicólico.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el agente reductor es ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha etapa (d) de replegamiento comprende replegar la proteína en presencia de glicerol.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha etapa (d) de replegamiento comprende replegar la proteína en presencia de un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en oxígeno, ditiol, yodo, peróxido de hidrógeno, ácido dihidroascórbico, tetrationato u O-yodobenzoato.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la etapa (d) de replegamiento comprende replegar la proteína en presencia de un ion metálico.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho ion metálico es Cu^{++} o Co^{++}.

17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha etapa (d) de replegamiento comprende replegar la proteína en presencia del agente bloqueante de cisteína usado en la etapa (c).

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha etapa (d) de replegamiento comprende replegar la proteína en presencia de un agente desnaturalizante.

19. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha etapa (d) de replegamiento comprende replegar la proteína en presencia de un ditiol.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicho ditiol se selecciona del grupo que consiste en cistina, cistamina, ácido ditioglicólico o glutationina oxidada.

21. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha etapa (d) de replegamiento se produce en presencia de un agente reductor.

22. Método según la reivindicación 21, en el que dicho agente reductor se selecciona del grupo que consiste en cisteína, DTT, 2-mercaptoetanol, glutatión reducido, cisteamina, ácido tioglicólico u otro tiol.

23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicha proteína insoluble o agregada es una proteína recombinante.

24. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que dicha proteína insoluble o agregada es una variante de cisteína de un miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento, o un derivado o un antagonista del mismo.

25. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en la hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placentario, eritropoyetina, trombopoyetina, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina-5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-9, interleucina-10, interleucina-11, interleucina-12 (subunidad p35), interleucina-13, interleucina-15, IL-19, IL-20, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar, factor inhibidor de la leucemia, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, factor estimulante de las colonias de granulocitos, factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos, cardiotrofina-1, factor estimulante de las colonias de macrófagos, factor de células madre y ligando de flt-3, en el que el miembro contiene una o más cisteínas libres añadidas.

26. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es la hormona de crecimiento.

27. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es interferón alfa.

28. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es interferón \alpha \alpha2.

29. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es la hormona estimuladora de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).

30. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es la hormona estimuladora de colonias de granulocitos (G-CSF).

31. Método según la reivindicación 30, en el que la proteína de G-CSF contiene un aminoácido que no es cisteína sustituido por la cisteína 17.

32. Método según la reivindicación 31, en el que el aminoácido que no es cisteína se selecciona del grupo que consiste en serina y alanina.

33. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es interleucina-11 (IL-11).

34. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es interferón beta.

35. Método según la reivindicación 25, en el que el miembro de la familia del supergén de la hormona de crecimiento es interferón gamma.

36. Método según cualquier reivindicación precedente, que comprende además la etapa de:

e): aislar la proteína replegada, soluble de otras proteínas en la mezcla de replegamiento de la etapa (d).

37. Método según cualquier reivindicación precedente, en el que el agente desnaturalizante se selecciona del grupo que consiste en urea, guanidina y spxKOSYL^{TM}.

38. Método según la reivindicación 36, que comprende además la etapa de:

e): unir un resto reactivo con cisteína a dicha proteína aislada de la etapa (e) para formar una proteína modificada con cisteína.

39. Método según la reivindicación 38, que comprende las etapas de:

: reducir la proteína soluble aislada, replegada con un agente reductor de disulfuro; y

: exponer la proteína a un resto reactivo con cisteína para obtener una proteína modificada con cisteína;

: en el que el resto reactivo con cisteína se une al menos a una cisteína libre añadida en la proteína replegada aislada.

40. Método según la reivindicación 39, en el que el resto reactivo con cisteína es un polietilenglicol, dextrano, hidrato de carbono, poli(N-vinilpirrolidona), péptido, lípido o polisacárido reactivos con cisteína.

41. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en el que el resto reactivo con cisteína es un polietilenglicol.