ES2290449T3

ES2290449T3 - Acido nucleico de cea modificado y vectores de expresion.

Info

Publication number: ES2290449T3
Application number: ES03719662T
Authority: ES
Inventors: Mark Parrington; Linong Zhang; Beni Rovinski; Linda R. Gritz; Trish Greenhalgh
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2023-04-09
Also published as: WO2003085087A3; AU2003223527A1; US20070082391A1; CN1658899A; PT1496939E; EP1496939A4; EP1496939A2; DE60315628D1; EP1864691A1; WO2003085087A2; CY1109926T1; DE60315628T2; WO2003085087A8; US7786278B2; EP1864691B1; AU2003223527B2; ATE369895T1; CN1658899B; EP1496939B1; ATE517122T1

Abstract

Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico CEA (6D)-1, 2 como se ilustra en la SEC. ID. nº: 24.

Description

Ácido nucleico de CEA modificado y vectores de expresión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido y a la utilización del ácido nucleico o polipéptido para prevenir y/o tratar el cáncer. En particular, la invención se refiere a vectores mejorados para la inserción y expresión de genes extraños que codifican antígenos tumorales para su utilización en el tratamiento inmunoterapéutico del cáncer.

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Antecedentes de la invención

Se ha producido un aumento importante en los últimos años en el desarrollo de vacunas contra el cáncer con antígenos asociados al tumor (TAA) debido a los grandes avances en la identificación de moléculas basadas en las características de expresión en los tumores primarios y en las células normales con ayuda de varias técnicas tales como la microselección por alta densidad, SEREX, inmunohistoquímica (IHC), RT-PCR, hibridación in situ (ISH) y microscopía por captura con láser (Rosenberg, Immnunity, 1999; Sgroi et al., 1999, Schena et al., 1995, Offringa et al., 2000). Los TAA son antígenos expresados o sobreexpresados por las células tumorales y podrían ser específicos para uno o varios tumores, por ejemplo el antígeno CEA se expresa en los cánceres colorrectal, de mama y pulmonar. Sgroi et al. (1999) identificaron varios genes expresados de manera diferenciada en células de carcinoma invasivo y metastásico con la utilización combinada de microdisección por captura con laser y microselecciones de ADNc. Varios sistemas de administración como ADN o virus podrían utilizarse para la vacunación terapéutica contra los cánceres humanos (Bonnet et al., 2000) y pueden provocar respuestas inmunitarias y también destrucción de la tolerancia inmunitaria contra los TAA. Las células tumorales pueden resultar más inmunógenas insertando transgenes que codifican moléculas coestimulantes para linfocitos T tales como B7.1 o citocinas IFNgamma, IL2, GM-CSF, etc. La coexpresión de TAA y una citocina o una molécula coestimulante puede desarrollar la vacuna terapéutica eficaz (Hodge et al., 95, Bronte et al., 1995, Chamberlain et al., 1996).

Existe una necesidad en la técnica de reactivos y metodologías útiles para estimular una respuesta inmunitaria destinada a impedir o tratar los cánceres. La presente invención proporciona dichos reactivos y metodologías que supera muchas de las dificultadas encontradas por otros al intentar tratar cánceres tales como el cáncer. En particular, la presente invención proporciona una nueva secuencia de codificación para CEA. Esta secuencia nucleotídica, CEA(6D)-1,2, incluye las modificaciones de la secuencia que eliminan la expresión de las formas truncadas de CEA como se expresa en los vectores de expresión. Dicha secuencia modificada es deseada por los expertos en la materia para mejorar los protocolos de expresión e inmunización para CEA.

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Sumario de la invención

En la presente memoria se describe una diana inmunógena para la administración a un paciente para impedir y/o tratar el cáncer. En particular, como se describe en la presente memoria la diana inmunógena es un antígeno tumoral CEA ("TA") y/o un antígeno asociado a la angiogénesis ("AA"). En una forma de realización, la diana inmunógena es codificada por una secuencia nucleotídica de CEA modificada (CEA(6D)-1,2) que mejora la expresión de CEA en las células transfectadas. Se describe que el TA y/o AA se administran a un paciente como un ácido nucleico contenido en el plásmido u otro vector de administración, tal como un virus recombinante. El TA y/o AA puede también administrarse en combinación con un estimulante inmunitario, tal como una molécula coestimulante o adyuvante. Se proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica CEA (6D)-1,2 como se ilustra en la SEC. ID. nº: 24.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1. A. Ilustración del plásmido p3'H6MCEA que comprende la secuencia de codificación de CEA con la modificación 6D bajo el control del activador H6 parcial. B. Ilustración del plásmido pSE1544.9 (pUC18-mCEA repetición 1).

Figura 2. Ilustración del plásmido pSE1616.44 (repetición 1 modificada por pUC18mCEA).

Figura 3. Ilustración del plásmido pSE1658.15 (repetición 1 modificada por p3'H6MCEA).

Figura 4. Ilustración del plásmido pBSmCEA.

Figura 5. Ilustración del plásmido pSE1686.1 (repetición 2 modificada por pUC18mCEA).

Figura 6. Ilustración del plásmido pSE1696.1 (repetición 2 modificada por pUC18mCEA).

Figura 7. Ilustración del plásmido p3'H6modMCEA-repeticiones 1ª y 2ª.

Figura 8. Ilustración del plásmido PNVQH6MCEA (6D1ª Y 2ª).

Figura 9A-D. Comparación de la secuencia nucleotídica de CAP(6D) y CAP(6D)1,2. Las diferencias entre las secuencias están subrayadas.

Figura 10. Análisis por PCR para confirmar la presencia de CAP(6D)-1,2 en ADN NYVAC.

Figura 11. Inmunotransferencia que ilustra la falta de CEA truncado en las células que expresan CAP(6D)-1,2.

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Descripción detallada

La presente invención proporciona reactivos y metodologías útiles para tratar y/o prevenir el cáncer.

En una forma de realización, la presente invención proporciona la inducción o aumento de una respuesta inmunitaria contra uno o más antígenos tumorales ("TA") para prevenir y/o tratar el cáncer. Se describe cómo pueden combinarse uno o más TA. Se describe cómo la respuesta inmunitaria procede de la expresión de un TA en una célula hospedadora después de la administración de un vector de ácido nucleico que codifica el antígeno tumoral o el propio antígeno tumoral en forma de péptido o polipéptido, por ejemplo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "antígeno" es una molécula (tal como un polipéptido) o una parte de ésta que produce una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se le ha administrado el antígeno. La respuesta inmunitaria puede incluir la producción de anticuerpos que se unen a por lo menos un epítopo del antígeno y/o la generación de una respuesta inmunitaria celular contra las células que expresan un epítopo del antígeno. La respuesta puede ser una mejora de una respuesta inmunitaria actual, por ejemplo dando lugar a la producción de anticuerpo aumentada, a la producción de anticuerpos con afinidad aumentada para el antígeno o una respuesta celular aumentada (es decir, aumento de linfocitos T). Un antígeno que produce una respuesta inmunitaria puede calificarse alternativamente como que es inmunógeno o como un inmunógeno. Al describir la presente invención, un TA puede denominarse "diana inmunógena".

TA incluye tanto los antígenos asociados al tumor (TAA) como los antígenos específicos para el tumor (TSA), donde una célula cancerosa es la fuente del antígeno. Un TAA es un antígeno que se expresa en la superficie de una célula tumoral en cantidades mayores que las que se observan en las células normales o un antígeno que se expresa en las células normales durante el desarrollo fetal. Un TSA es un antígeno que es exclusivo de las células tumorales y no se expresa en las células normales. TA incluye además los TAA o los TSA, los fragmentos antigénicos de los mismos y las versiones modificadas que conservan su antigenicidad.

Los TAA se clasifican típicamente en cinco categorías según su modelo de expresión, función u origen genético: antígenos de cáncer de testículos (CT) (es decir, MAGE, NY-ESO-1); antígenos de la diferenciación de melanocitos (es decir, Melan A/MART-1, tirosinasa, gp100); antígenos mutacionales (es decir, MUC-1, p53, CDK-4); "auto" antígenos sobreexpresados (es decir HER-2/neu, p53); y, antígenos víricos (es decir, HPV, EBV). Con objeto de poner en práctica la presente invención, un TA adecuado es cualquier TA que provoque o mejore una respuesta inmunitaria antitumoral en un hospedador al que se ha administrado TA. Los TA adecuados incluyen, por ejemplo, gp100 (Cox et al., Science, 264:716-719 (1994)), MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med., 180:347-352 (1994)), gp75 (TRP-1) (Wang et al., J. Exp. Med., 186:1131-1140 (1996)), tirosinasa (Wolfel et al., Eur. J. Immunol., 24:759-764 (1994); documento WO 01/75117; WO 01/75016; WO 01/75007, NY-ESO-1 (documento WO 98/14464; WO 99/18206), proteoglucano de melanoma (Hellstrom et al., J. Immunol., 130:1467-1472 (1983)), antígenos de la familia MAGE (es decir, MAGE-1,2,3,4,6,12, 51; Van der Bruggen et al., Science, 254:1643-1647 (1991); patentes U.S. nº 6.235.525; CN 1319611), antígenos de la familia BAGE (Boel et al., Immunity, 2:167-175 (1995)), antígenos de la familia GAGE (es decir, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med., 182:689-698 (1995); patente U.S. nº 6.013.765), antígenos de la familia RAGE (es decir, RAGE-1; Gaugler et al., Immunogenetics, 44:323-330 (1996); patente U.S. nº 5.939.526), N-acetilglucosaminiltransferasa-V (Guilloux et al., J. Exp. Med., 183:1173-1183 (1996)), p15 (Robbins et al., J. Immunol. 154:5944-5950 (1995)), \beta-catenina (Robbins et al., J. Exp. Med., 183:1185-1192 (1996)), MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7976-7980 (1995)), cinasa-4 dependiente de ciclina (CDK4) (Wolfel et al., Science, 269:1281-1284 (1995)), p21-ras (Fossum et al., Int. J. Cancer, 56:40-45 (1994)), BCR-abl (Bocchia et al., Blood, 85:2680-2684 (1995)); p53 (Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11993-11997 (1995)), p185 HER2/neu (erb-B1; Fisk et al., J. Exp. Med., 181:2109-2117 (1995)), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Harris et al., Breast Cancer Res. Treat., 29:1-2 (1994)), antígenos carcinoembrionarios (CEA) (Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:982-990 (1995) patentes U.S. nº 5.756.103; nº 5.274.087; nº 5.571.710; nº 6.071.716; nº 5.698.530; nº 6.045.802; EP 263933; EP 346710; y, EP 784483); mucinas mutadas asociadas al carcinoma (es decir productos génicos MUC-1; Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662 (1993)); productos génicos de EBNA de EBV (es decir, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Surveys, 13:53-80 (1992)); proteínas E7, E6 de papilomavirus humano (Ressing et al., J. Immunol., 154:5934-5943 (1995)); antígeno específico de la próstata (PSA; Xue et al., The Prostate, 30:73-78 (1997)); antígeno membranario específico de la próstata (PSMA; Israelí, et al., Cancer Res., 54:1807-1811 (1994)); epítopos o antígenos idiotípicos, por ejemplo idiotipos de inmunoglobulina o idiotipos del receptor de linfocitos T (Chen et al., J. Immunol., 153:4775-4787 (1994)); KSA (patente U.S. nº 5.348.887), kinesina 2 (Dietz, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 7 de septiembre de 2000; 275(3):731-8), HIP-55, factor antiapóptico TGF\beta-1 (Toomey, et al., Br. J. Biomed Sci. 2001; 58(3):177-83), proteína tumoral D52 (Bryne J. A., et al., Genomics, 35:523-532 (1996)), H1FT, NY-BR-1 (documento WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87, NY-BR-96 (Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, en Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, Nueva York, NY), AAC2-1, o AAC2-2, incluyendo el "tipo natural" (es decir normalmente codificado por el genoma, natural), modificado, y las versiones mutadas así como otros fragmentos y derivados de éstos. Alguno de estos TA puede utilizarse solo o en combinación con otro en un protocolo de coinmunización.

En determinados casos, puede ser beneficioso para coinmunizar pacientes tanto con TA como con otros antígenos, tales como los antígenos asociados al angiogénesis ("AA"). Un AA es una molécula inmunógena (es decir, péptido, polipéptido) asociada con las células implicadas en la inducción y/o desarrollo continuado de los vasos sanguíneos. Por ejemplo, un AA puede expresarse en una célula endotelial ("EC"), que es un componente estructural principal de los vasos sanguíneos. Cuando el cáncer es cáncer, se prefiere que el AA se encuentre dentro o cerca de los vasos sanguíneos que aporta un tumor. La inmunización de un paciente contra un AA preferentemente da como resultado una respuesta inmunitaria anti-AA con lo que los procesos angiógenos que se producen cerca o dentro de los tumores se impiden y/o inhiben.

Los AA a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (es decir, VEGF; Bernardini, et al., J. Urol., 2001, 166(4): 1275-9; Starnes, et al. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 2001, 122(3): 518-23), el receptor VEGF (es decir, VEGF-R, flk-1/KDR; Starnes, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 2001, 122(3): 518-23), los receptores de EPH (es decir, EPHA2; Gerety, et al. 1999, Cell, 4: 403-414), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (es decir, EGFR; Ciardeillo, et al. Clin. Cancer Res., 2001, 7(10):2958-70), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (es decir, bFGF; Davidson, et al. Clin. Exp. Metastasis 2000, 18(6): 501-7; Poon, et al. Am. J. Surg., 2001, 182(3):298-304), el factor de crecimiento de células procedentes de plaquetas (es decir, PDGF-B), el factor de crecimiento celular endotelial procedente de plaquetas (PD-ECGF; Hong, et al., J. Mol. Med., 2001, 8(2):141-8), los factores de crecimiento transformantes (es decir, TGF-\alpha; Hong, et al., J. Mol. Med., 2001, 8(2):141-8), endoglina (Balza, et al. Int. J. Cancer; 2001, 94: 579-585), proteínas Id (Benezra, R. Trends Cardiovasc. Med., 2001, 11(6):237-41), proteasas tales como uPA, uPAR y metaloproteinasas de matriz (MMP-2, MMP-9; Djonov, et al. J. Pathol., 2001, 195(2):147-55), óxido nítrico sintasa (Am. J. Ophthalmol., 2001, 132(4):551-6), aminopeptidasa (Rouslhalti, E. Nature Cancer, 2: 84-90, 2002), trombospondinas (es decir, TSP-1, TSP-2; Álvarez, et al. Gynecol. Oncol., 2001, 82(2):273-8; Seki, et al. Int. J. Oncol., 2001, 19(2):305-10), k-ras (Zhang, et al. Cancer Res., 2001, 61(16):6050-4), Wnt (Zhang, et al. Cancer Res., 2001, 61(16):6050-4), cinasas dependientes de ciclina (CDK; Drug Resist. Updat. 2000, 3(2):83-88), microtúbulos (Timar, et al. 2001, Path Oncol. Res., 7(2):85-94), proteínas del choque térmico (es decir, HSP90 (Timar, supra)), factores de unión a la heparina (es decir, heparinasa; Gohji, et al., Int. J. Cancer, 2001, 95(5):295-301), sintasas (es decir, ATP sintasa, timidilato sintasa), receptores de colágeno, integrinas (es decir, \alpha\mu\beta3, \alpha\mu\beta5, \alpha1\beta1, \alpha2\beta1, \alpha5\beta1), el proteoglucano de superficie NG2, AAC2-1 (SEC. ID. nº: 1), o AAC2-2 (SEC. ID. nº: 2), entre otros, incluyendo las versiones mutadas modificadas naturales (es decir, codificadas normalmente por el genoma natural) así como otros fragmentos y derivados de los mismos. Cualquiera de estas dianas puede ser adecuada para poner en práctica la presente invención ya sea sola o en combinación con otro u otros
agentes.

En determinadas formas de realización, se utiliza una molécula de ácido nucleico que codifica una diana inmunógena. La molécula de ácido nucleico puede comprender o estar constituida por una secuencia nucleotídica que codifica una o más dianas inmunógenas, o fragmentos o derivados de los mismos, tales como los contenidos en una inserción de ADN en un depósito ATCC. La expresión "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o de ARN. La expresión comprende las moléculas formadas a partir de cualquiera de los análogos básicos conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboxi-metilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inopina, N6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonil-metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina, entre
otros.

Una molécula de ácido nucleico aislada es la que: (1) se separa de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales en los que se encuentra en forma natural cuando el ácido nucleico completo se aísla de las células de la fuente; (2) no se une a todo o a una porción de un polinucleótido al que la molécula de ácido nucleico está unida en la naturaleza; (3) está operativamente unida a un polinucleótido al que no se une en la naturaleza; y/o (4) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia polinucleotídica mayor. Preferentemente la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención está sustancialmente exenta de cualquier o cualesquiera otra(s) molécula(s) de ácido nucleico contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su medio natural que interferirían con su utilización en la producción de polipéptidos o su utilización terapéutica, de diagnóstico, profiláctica o de investigación. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que se produce en la naturaleza" o "natural" o "hallado en la naturaleza" cuando se utilizan junto con los materiales biológicos tales como las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células huésped, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no son manipulados por el hombre. Asimismo, "que no se produce en la naturaleza" o "no natural" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre.

La identidad de dos o más ácidos nucleicos o moléculas polipeptídicas se determina comparando las secuencias. Como es conocido en la técnica, "identidad" significa el grado de secuencia sin relación entre las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos determinado por la compatibilidad entre las unidades que construyen las moléculas (es decir, restos de nucleótidos o de aminoácidos). La identidad mide el porcentaje de compatibilidades idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones gap (si existen) dirigidas por un modelo matemático particular o un programa informático (es decir, un algoritmo). La identidad entre las secuencias de ácido nucleico puede también determinarse por la capacidad de la secuencia relacionada para hibridarse con la secuencia de ácido nucleico o con la molécula de ácido nucleico aislada. Al definir dichas secuencias, la expresión "condiciones muy severas" y "condiciones moderadamente severas" se refieren a los procedimientos que permiten la hibridación de cadenas de ácidos nucleicos cuyas secuencias con complementarias, y para excluir la hibridación de ácidos nucleicos significativamente incompatibles. Ejemplos de "condiciones muy severas" para la hibridación y lavado son el cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M a 65-68ºC o cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y formamida al 50% a 42ºC (véase por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach cáp. 4 (IRL Press Limited)). La expresión "condiciones moderadamente severas" se refiere a las condiciones en las que un ADN doble con un grado mayor de desemparejamiento de los pares de bases que podría producirse en "condiciones muy severas" es capaz de formarse. Las condiciones moderadamente severas a título de ejemplo son cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M entre 50 y 65ºC o cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y formamida al 20% entre 37 y 50ºC. A título de ejemplo, las condiciones moderadamente severas de 50ºC en el ión sodio 0,015 M permitirán aproximadamente el 21% de desemparejamiento. Durante la hibridación, pueden incluirse otros agentes en la hibridación y los tampones de lavado con objeto de reducir la hibridación no específica y/o de fondo. Ejemplos son la albúmina de suero bovino al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, dodecilsulfato sódico al 0,1%, NaDodSO_{4}, (SDS), ficoll, solución de Denhardt, ADN del esperma de salmón sometido a ultrasonidos (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano, aunque pueden utilizarse también otros agentes adecuados. La concentración y tipos de estos aditivos pueden cambiarse sin afectar sustancialmente la severidad de las condiciones de hibridación. Los experimentos de hibridación se realizan normalmente a pH entre 6,8 y 7,4; sin embargo, a las condiciones de fuerza iónica típicas, la velocidad de hibridación es casi independiente del
pH.

En las formas de realización preferidas de la presente invención, se utilizan vectores para transferir una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido para una célula. Un vector es cualquier molécula utilizada para transferir una secuencia de ácido nucleico a una célula huésped. En determinados casos, se utiliza un vector de expresión. Un vector de expresión es una molécula de ácido nucleico que es adecuada para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de las secuencias de ácido nucleico transferidas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción y corte y empalme, si están presentes los intrones. Los vectores de expresión comprenden típicamente una o más secuencias flanqueantes operativamente unidas a una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido. Las secuencias adyacentes pueden ser, por ejemplo, homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie de célula huésped o de la cepa), híbridas (es decir, una combinación de secuencias adyacentes procedentes de más de una fuente) o sintéticas.

Una secuencia adyacente puede preferentemente efectuar la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia de codificación y está operativamente unida a una secuencia de codificación. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión operativamente unida se refiere a la unión de los elementos del polinucleótido en una relación funcional. Por ejemplo, un activador o potenciador está operativamente unido a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia de codificación. Sin embargo, una secuencia adyacente no requiere necesariamente estar contigua a la secuencia de codificación, con tal que funcione correctamente. Por lo tanto, por ejemplo, la intervención de secuencias no traducidas todavía transcritas puede estar presente entre una secuencia activadora y la secuencia de codificación y la secuencia activadora puede incluso considerarse operativamente unida a la secuencia de codificación. Asimismo, una secuencia potenciadora puede estar situada corriente arriba o corriente abajo de la secuencia de codificación y afectar la transcripción de la secuencia.

En determinadas formas de realización, se prefiere que la secuencia adyacente sea una zona reguladora de la transcripción que dirija la expresión génica de alto nivel en la célula diana. La zona reguladora de la transcripción puede comprender, por ejemplo, un elemento activador, potenciador, silenciador, represor, o combinaciones de los mismos. La zona reguladora de la transcripción puede ser constitutiva, específica para el tejido, específica para el tipo de célula (es decir, la zona se dirige a niveles superiores de transcripción en un tipo de tejido o célula en comparación con otro), o regulable (es decir, sensible a la interacción con un compuesto tal como tetraciclina). La fuente de una zona reguladora de transcripción puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que la secuencia adyacente funcione en una célula produciendo la transcripción de un ácido nucleico dentro de la célula. Puede utilizarse una amplia variedad de zonas reguladoras de la transcripción en la puesta en práctica de la presente invención.

Las zonas reguladoras de la transcripción adecuadas incluyen el activador CMV (es decir, precoz inmediato a CMV); activadores de genes eucarióticos (es decir, el gen de ovoalbúmina de pollo inducible por estrógeno, los genes de interferón, el gen de tirosina aminotransferasa inducible por glucocorticoides y el gen de timidina cinasa); y los activadores del gen del adenovirus precoz y tardío principal; la zona del activador precoz SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-10); el activador contenido en la repetición terminal larga 3' (LTR) del virus del sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-97); el activador de timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78:1444-45); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); los vectores de la expresión procariótica tales como el activador de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 75:3727-31); o el activador tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80:21-25). Las zonas de control de la transcripción de tejido y/o específicas de las células incluyen, por ejemplo, la zona de control del gen de elastasa I que es activa en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la zona de control del gen de insulina que se activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); la zona de control del gen de inmunoglobulina que es activa en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); la zona de control del virus del tumor de mama de ratón en las células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); la zona de control del gen de albúmina en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); la zona de control del gen de la alfa-feto-proteína en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); la zona de control del gen de alfa 1-antitripsina en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); la zona de control del gen de beetiquetalobina en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 2315:338-40;Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la zona de control del gen de la proteína básica mielina en los oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); la zona de control del gen de la cadena-2 ligera de miosina en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); la zona de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78) y el activador de tirosinasa en las células de melanoma (Hart, I. Semin. Oncol. Febrero de 1996; 23(1):154-8; Siders, et al. Cancer Gene Ther. septiembre-octubre de 1998; 5(5):281-91), entre otros. Otros activadores adecuados son conocidos en la técnica.

Como se describió anteriormente, los potenciadores pueden también ser secuencias adyacentes adecuadas. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, normalmente de 10 a 300 bp de longitud, que actúan sobre el activador para aumentar la transcripción. Los potenciadores son típicamente independientes de la orientación y de la posición habiendo sido identificados tanto 5' como 3' para las secuencias de codificación controladas. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles en los genes de mamífero (es decir, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Asimismo, el potenciador SV40, el potenciador del activador precoz de citomegalovirus, el potenciador de polioma y los potenciadores de adenovirus sirven con las secuencias activadoras eucarióticas. Aunque como potenciador puede ser cortado y empalmado en el vector en una posición 5' o 3' en la secuencia de codificación del ácido nucleico, se sitúa típicamente en el punto 5' del activador. Otros potenciadores son conocidos en la materia y serían aplicables a la presente invención.

Mientras se preparan los reactivos de la presente invención, pueden necesitarse células para ser transfectadas o transformadas. La transfección se refiere a la absorción de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula ha sido transfectada cuando el ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. Numerosas técnicas de transfección son bien conocidas en la técnica (es decir, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986); y Chu et al., 1981, Gene 13:197). Dichas técnicas pueden utilizarse para introducir uno o más grupos de ADN exógenos en células huésped adecuadas.

Se describe que la transfección de una célula da como resultado la transformación de esta célula. Una célula se transforma cuando existe un cambio en una característica de la célula, que se transforma cuando ha sido modificada por contener un nuevo ácido nucleico. Después de la transfección, el ácido nucleico transfectado puede recombinarse con el de la célula interactuando físicamente en un cromosoma de la célula; puede mantenerse temporalmente como elemento episómico sin ser replicado, o puede replicarse independientemente como plásmido. Una célula se transforma establemente cuando el ácido nucleico se replica con la división de la célula.

Se describe también que las dianas inmunógenas se aíslan en forma de polipéptido. Un polipéptido se considera aislado cuando: (1) se ha separado de por lo menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales que se encuentran en la naturaleza cuando se aíslan de la célula original; (2) no está unido (por interacción covalente o no covalente) a toda o a una parte de un polipéptido al que el "polipéptido aislado" está unido en la naturaleza; (3) está operativamente unido (por interacción covalente o no covalente) a un polipéptido con el que no está unido en la naturaleza; o, (4) no se produce en la naturaleza. Preferentemente, el polipéptido aislado está sustancialmente exento de cualquier otro polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su medio natural que interferirían con su utilización terapéutica, de diagnóstico, profiláctica o de
investigación.

Los polipéptidos diana inmunógenos pueden ser polipéptidos maduros, como se define en la presente memoria, y pueden o no presentar un resto de metionina aminoterminal, dependiendo del procedimiento por el que se preparen. Además se contemplan los polipéptidos relacionados tales como, por ejemplo, fragmentos, variantes (es decir, alélica, de corte y empalme), ortólogos, homólogos y derivados, por ejemplo, que poseen por lo menos una característica o actividad (es decir, actividad, antigenicidad) de la diana inmunógena. Asimismo se relacionan los péptidos, que se refieren a una serie de restos de aminoácidos contiguos que tienen una secuencia correspondiente a por lo menos una parte del polipéptido del que procede su secuencia. En las formas de realización preferidas, el péptido comprende aproximadamente 5 a 10 aminoácidos, 10 a 15 aminoácidos, 15 a 20 aminoácidos, 20 a 30 aminoácidos o 30 a 50 aminoácidos. En una forma de realización más preferida, un péptido comprende 9 a 12 aminoácidos, adecuados para la presentación en las moléculas NHC de clase I, por ejemplo.

Un fragmento de un ácido nucleico o polipéptido comprende un truncamiento de la secuencia (es decir, ácido nucleico o polipéptido) en el terminal amino (con o sin una secuencia principal) y/o el terminal carboxi. Los fragmentos pueden incluir también variantes (es decir, alélica, de corte y empalme), ortólogos, homólogos y otras variantes que presentan una o más adiciones o sustituciones de aminoácidos o deleciones internas en comparación con la secuencia precursora. En las formas de realización preferidas, los truncamientos y/o deleciones comprenden aproximadamente 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos o más. Los fragmentos de polipéptido así producidos modo comprenderán aproximadamente 10 aminoácidos, 25 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos, 60 aminoácidos, 70 aminoácidos o más. Dichos fragmentos de polipéptidos pueden comprender opcionalmente un resto de metionina aminoterminal. Se apreciará que dichos fragmentos puedan utilizarse, por ejemplo, para generar anticuerpos o respuestas inmunitarias celulares a polipéptidos diana
inmunógenos.

Una variante es una secuencia que presenta una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones en la secuencia en comparación con la presente secuencia. Las variantes pueden producirse de forma natural o construirse artificialmente. Dichas variantes pueden prepararse a partir de las correspondientes moléculas de ácido nucleico. En las formas de realización preferidas, la variante presenta de 1 a 3, o de 1 a 5, o de 1 a 10, o de 1 a 15, o de 1 a 20, o de 1 a 25, o de 1 a 30, o de 1 a 40, o de 1 a 50, o más de 50 sustituciones, inserciones, adiciones y/o deleciones de amino-
ácidos.

Una variante alélica es la de varias formas alternas naturales posibles de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo o una población de organismos. Una variante de corte y empalme es un polipéptido generado a partir de uno de varios transcritos de ARN procedentes del corte y empalme de un transcrito primario. Un ortólogo es una secuencia de ácido nucleico o polipéptido similar de otra especie. Por ejemplo, las versiones de ratón y humana de un polipéptido diana inmunógeno pueden considerarse ortólogos entre sí. Un derivado de una secuencia es el que procede de una secuencia precursora a las secuencias que presentan sustituciones, adiciones, deleciones o variantes químicamente modificadas. Las variantes pueden también incluir proteínas de fusión, que se refiere a la fusión de una o más de las primeras secuencias (tales como un péptido) en el terminal amino o carboxi de por lo menos una u otra secuencia (tal como un péptido heterólogo).

"Similitud" es un concepto relacionado con la identidad, con la excepción de que la similitud se refiere a una medida de la relación que incluye tanto compatibilidades idénticas como compatibilidades de sustitución conservadoras. Si dos secuencias polipeptídicas tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos, y las restantes son todas sustituciones no conservadoras, entonces el porcentaje de identidad y similitud sería en ambas del 50%. Si en el mismo ejemplo, existen cinco posiciones más cuando existen sustituciones conservadoras, entonces el porcentaje de identidad continúa siendo del 50%, pero el porcentaje de similitud sería del 75% (15/20). Por lo tanto, en los casos en los que existen sustituciones conservadoras, el porcentaje de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el porcentaje de identidad entre estos dos polipéptidos.

Las sustituciones pueden ser conservadoras, no conservadoras o cualquier combinación de las mismas. Las modificaciones conservadoras de aminoácidos para la secuencia de un polipéptido (y las correspondientes modificaciones de los nucleótidos codificantes) pueden producir polipéptidos con características funcionales y químicas similares a las de un polipéptido precursor. Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido natural con un resto no natural de modo que exista poco o ningún efecto sobre el tamaño, polaridad, carga, hidrofobia o hidrofilia del resto de aminoácido en esta posición y, en particular, no produzca disminución de la inmunogenicidad. En la Tabla I se presentan sustituciones de aminoácidos conservadoras
adecuadas.

TABLA I

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Un experto será capaz de determinar variantes adecuadas de polipéptido utilizando técnicas bien conocidas. Para identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad biológica (es decir, unión por MHC, inmunogenicidad) un experto en la materia puede dirigir áreas que no se considera que sean importantes para esta actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares de la misma especie o de otras especies, un experto en la materia puede comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con dichos polipéptidos similares. Al realizar dichos análisis, se pueden identificar restos y partes de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. Se apreciará que los cambios en las áreas de la molécula que no se conservan en comparación con dichos polipéptidos similares es menos probable que afecten desfavorablemente la actividad biológica y/o la estructura de un polipéptido. Asimismo, los restos requeridos para la unión a MHC son conocidos, y pueden modificarse para mejorar la unión. Sin embargo, las modificaciones que se producen en la disminución de la unión a MHC no serán apropiadas en la mayoría de las situaciones. Un experto en la materia conocería también que, incluso en las zonas relativamente conservadas, se pueden sustituir químicamente aminoácidos similares para los restos naturales mientras se conserva la actividad. Por consiguiente, incluso en las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservadoras sin destruir la actividad biológica o sin afectar desfavorablemente la estructura del polipéptido.

Otras variantes de polipéptido preferidas incluyen variantes de glucosilación en las que el número y/o de secuencias de glucosilación han sido alteradas en comparación con la presente secuencia de aminoácidos. En una forma de realización, las variantes de polipéptido comprenden un número mayor o menor de secuencias de glucosilación unidas por N que la presente secuencia de aminoácidos. Una secuencia de glucosilación unida por N se caracteriza por la secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en las que el resto de aminoácidos denominado X puede ser cualquier resto de aminoácidos excepto prolina. La sustitución de restos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona una secuencia nueva con potencial para la adición de la cadena de carbohidrato unida por N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan la secuencia eliminarán una cadena de carbohidratos unida por N existente. También se proporciona una transposición de cadenas de carbohidrato unidas por N en la que se eliminan una o más secuencias de glucosilación unidas por N (típicamente las naturales) y se crean una o más secuencias nuevas unidas por N. Para afectar la glucosilación unida por O de un polipéptido, se modificarían los restos de serina y/o treonina.

Las variantes adicionales preferidas incluyen las variantes de cisteína, en las que uno o más restos de cisteína se eliminan o se sustituyen con otro aminoácido (p. ej., serina) en comparación con el conjunto de la secuencia de aminoácidos presente. Las variantes de cisteína son útiles cuando los polipéptidos deben replegarse en una configuración biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente presentan restos de cisteína más escasos que la proteína natural, y presentan típicamente un número impar para minimizar las interacciones que proceden de las cisteínas no emparejadas.

Como se describe también, los polipéptidos aislados de la presente invención incluyen los segmentos del polipéptido de fusión que ayudan a la purificación de los polipéptidos. Las fusiones pueden realizarse en el terminal amino o en el terminal carboxi de la presente variante de polipéptido de ésta. Las fusiones pueden dirigirse sin enlazador o molécula adaptadora o pueden ser mediante un enlazador o molécula adaptadora. Un enlazador o molécula adaptadora puede ser uno o más restos de aminoácidos, típicamente desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 restos de aminoácidos. Un enlazador o molécula adaptadora puede también denominarse con un punto de escisión para la endonucleasa de restricción del ADN o para una proteasa que permita la separación de los grupos fusionados. Se apreciará que una vez construido los polipéptidos de fusión pueden derivarse según los procedimientos descritos en la presente memoria. Los segmentos de fusión adecuados incluyen, entre otros, dominios metálicos de unión (p. ej., un segmento de poli-histidina), dominios de unión de inmunoglobina (es decir, proteína A, proteína G, linfocito T, linfocito B, receptor de Fc o dominios de unión del anticuerpo proteína complementaria), dominios que se unen al azúcar (p. ej., un dominio que se une a maltosa) y/o un dominio "etiqueta" (es decir, por lo menos una parte de \alpha-galactosidasa, una etapa de péptido etiqueta, un péptido T7 etiqueta, un péptido FLAG u otros dominios que pueden purificarse utilizando compuestos que se unen al dominio, tal como anticuerpos monoclonales). Esta etiqueta está fusionada típicamente con el polipéptido en la expresión del polipéptido, y puede servir como medio para la purificación por afinidad de la secuencia del polipéptido de interés a partir de la célula huésped. La purificación por afinidad puede realizarse, por ejemplo, por cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz con afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente de la secuencia purificada del polipéptido de interés por varios medios tales como utilizando determinadas peptidasas para la escisión. Como se describe a continuación, pueden realizarse fusiones entre un TA y componentes coestimulantes tales como las quimiocinas CXC10 (IP-10), CCL7 (MCP-3) o CCL5 (RANTES), por ejemplo.

Un motivo de fusión puede aumentar el transporte de una diana inmunógena para un compartimento del tratamiento por MHC, tal como un retículo endoplásmico. Estas secuencias, denominadas secuencias de transducción o transcitosis, incluyen secuencias procedentes de VIH (véase Kim et al. 1997 J. Immunol. 159:1666), Drosophila antennapedia (véase Schutze-Redelmeier et al. 1996 J. Immunol. 157:650) o la proteína period-1 humana (hPER1; en particular, SRRHHCRSKAKRSRHH).

Además, el polipéptido o variante del mismo puede fusionarse a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o un polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los péptidos heterólogos y los polipéptidos incluyen, pero no se limitan a: un epítopo que permita la detección y/o aislamiento de un polipéptido de fusión; una proteína receptora transmembranaria o una parte de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio transmembranario e intracelular; un ligando o una parte del mismo que se une a una proteína receptora transmembranaria; una enzima o una parte de la misma que es catalíticamente activa; un polipéptido o péptido que favorece la oligomerización, tal como un dominio cremallera de leucina; un polipéptido o péptido que aumenta la estabilidad, tal como una zona constante de inmunoglobulina; y un polipéptido que presenta una actividad terapéutica diferente del polipéptido o variante de la misma.

Puede presentar ventajas combinar una secuencia de ácido nucleico que codifica una diana inmunógena, polipéptido o derivado de la misma con uno o más componente(s) coestimulante(s) tales como las proteínas de la superficie de la célula, citocinas o quimiocinas en una composición de la presente invención. El componente coestimulante puede estar incluido en la composición como polipéptido o como ácido nucleico que codifica el polipéptido, por ejemplo. Las moléculas coestimulantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos que se unen a miembros de la familia CD28 (es decir, CD28, ICOS; Hutloff, et al. Nature 1999, 397: 263-265; Peach, et al. J. Exp. Med. 1994, 180: 2049-2058) tales como los polipéptidos B7.1 que se unen a CD28 (CD80; Schwartz, 1992; Chen et al., 1992; Ellis, et al. J. Immunol., 156(8): 2700-9) y B7.2 (CD86; Ellis, et al., J. Immunol., 156(8): 2700-9); polipéptidos que se unen a miembros de la familia de las integrinas (es decir, LFA-1 (CD11a/CD18); Sedwick, et al. J. Immunol. 1999, 162: 1367-1375; Wülfing, et al. Science 1998, 282: 2266-2269; Lub, et al. Immunol. Today 1995, 16: 479-483) incluyendo los miembros de la familia ICAM (es decir, ICAM-1, -2 ó -3); los polipéptidos que se unen a los miembros de la familia CD2 (es decir, CD2, la molécula de activación de linfocitos señalizadora (CDw150 o "SLAM"; Aversa, et al. J. Immunol. 1997, 158: 4036-4044)) tal como CD58 (LFA-3; ligando CD2; Davis, et al. Immunol. Today 1996, 17: 177-187) o ligandos de SLAM (Sayos, et al. Nature 1998, 395: 462-469); los polipéptidos que se unen al antígeno estable al calor (HSA o CD24; Zhou, et al. Eur. J. Immunol. 1997, 27: 2524-2528); los polipéptidos que se unen a los miembros de la familia del receptor TNF (TNFR) (es decir, 4-1BB (CD137; Vinay, et al. Semin. Immunol. 1998, 10: 481-489), OX40 (CD134; Weinberg, et al. Semin. Immunol. 1998, 10: 471-480; Higgins, et al. J. Immunol. 1999, 162: 486-493), y CD27 (Lens, et al. Semin. Immunol. 1998, 10: 491-499)) tal como 4-1BBL (ligando 4-1BB; Vinay, et al. Semin. Immunol. 1998, 10: 481-48; DeBenedette, et al. J. Immunol. 1997, 158: 551-559), factor-1 asociado a TNFR (TRAF-1; ligando 4-1BB; Saoulli, et al., J. Exp. Med. 1998, 187: 1849-1862, Arch, et al. Mol. Cell Biol. 1998, 18: 558-565), TRAF-2 (4-1BB y ligando OX40; Saoulli, et al. J. Exp. Med. 1998, 187: 1849-1862; Oshima, et al. Int. Immunol. 1998, 10: 517-526, Kawamata, et al. J. Biol. Chem. 1998, 273: 5808-5814), TRAF-3 (4-1BB y ligando OX40; Arch, et al. Mol. Cell Biol. 1998, 18: 558-565; Jang, et al. Biochem. Biophys Res. Commun. 1998, 242: 613-620; Kawamata S., et al. J. Biol. Chem. 1998, 273: 5808-5814), OX40L (ligando OX40: Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161: 6510-6517), TRAF-5 (ligando OX40; Arch, et al. Mol. Cell Biol. 1998, 18: 558-565; Kawamata, et al. J. Biol. Chem. 1998, 273: 5808-5814), y CD70 (ligando CD27; Couderc, et al. Cancer Gene Ther., 5(3): 163-75). CD154 (ligando CD40 o "CD40L"; Gurunathan, et al. J. Immunol., 1998, 161: 4563-4571; Sine, et al. Hum. Gene Ther., 2001, 12: 1091-1102) pueden ser también adecuados.

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Una o más citocinas pueden también ser componentes coestimulantes adecuados o "adyuvantes", ya sea como polipéptidos o que están codificados por ácidos nucleicos contenidos dentro de las composiciones de la presente invención (Parmiani, et al. Immunol. Lett. 15 de septiembre de 2000; 74(1): 41-4; Berzofsky, et al. Nature Immunol. 1: 209-219). Las citocinas adecuadas incluyen, por ejemplo, interleucina-2 (IL-2) (Rosenberg, et al. Nature Med. 4: 321-327 (1998)), IL-4, IL-7, IL-12 (revisado por Pardoll, 1992; Harries, et al. J. Gene Med. Julio-Agosto de 2000; 2(4):243-9; Rao, et al. J. Immunol. 156: 3357-3365 (1996)), IL-15 (Xin, et al. Vaccine, 17:858-866, 1999), IL-16 (Cruikshank, et al. J. Leuk. Biol. 67(6): 757-66, 2000), IL-18 (J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001. 127(12): 718-726), GM-CSF (CSF (Disis, et al. Blood, 88: 202-210 (1996)), factor-alfa de la necrosis tumoral (TNF-\alpha) o interferón-gamma (INF-\gamma). Otras citocinas pueden también ser adecuadas para poner en práctica la presente invención, como se conoce en la técnica.

Pueden utilizarse también quimiocinas. Por ejemplo, las proteínas de fusión que comprenden CXCL10 (IP-10) y CCL7 (MCP-3) fusionadas a un autoantígeno tumoral se ha demostrado que producen inmunidad antitumoral (Biragyn, et al. Nature Biotech. 1999, 17: 253-258). Las quimiocinas CCL3 (MIP-1\alpha) y CCL5 (RANTES) (Boyer, et al. Vaccine, 1999, 17 (supl. 2): S53-S64) pueden también ser de utilización en la puesta en práctica de la presente invención. Otras quimiocinas adecuadas son conocidas en la técnica.

Es también conocido en la técnica que los mecanismos inmunitarios reguladores supresores o negativos pueden bloquearse, produciendo aumento de las respuestas inmunitarias. Por ejemplo, el tratamiento con anti-CTLA-4 (Shrikant, et al. Immunity, 1996, 14: 145-155; Sutmuller, et al. J. Exp. Med., 2001, 194: 823-832), anti-CD25 (Sutmuller, supra), anti-CD4 (Matsui, et al. J. Immunol., 1999, 163: 184-193), la proteína de fusión IL13Ra2-Fc (Terabe, et al. Nature Immunol., 2000, 1: 515-520), y combinaciones de la misma (es decir, anti-CTLA-4 y anti-CD25, Sutmuller, supra) se ha demostrado que aumentan las respuestas inmunitarias antitumorales y serían adecuadas en la puesta en práctica de la presente invención.

Cualquiera de estos componentes puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes. Por ejemplo, se ha demostrado que una combinación de CD80, ICAM-1 y LFA-3 ("TRICOM") puede potenciar las respuestas inmunitarias contra el cáncer (Hodge, et al. Cancer Res. 59: 5800-5807 (1999). Otras combinaciones eficaces incluyen, por ejemplo, IL-12 + GM-CSF (Ahlers, et al. J. Immunol., 158: 3947-3958 (1997); Iwasaki, et al. J. Immunol. 158: 4591-4601 (1997)), IL-12 + GM-CSF + TNF-\alpha (Ahlers, et al. Int. Immunol. 13: 897-908 (2001)), CD80 + IL-12 (Fruend, et al. Int. J. Cancer, 85: 508-517 (2000); Rao, et al. supra), y CD86 + GM-CSF + IL-12 (Iwasaki, supra). Un experto en la materia conoce las combinaciones adicionales útiles para llevar a cabo la presente invención. Además, el experto conocerá los reactivos adicionales o los procedimientos que pueden utilizarse para modular dichos mecanismos. Estos reactivos y procedimientos, así como otros conocidos por los expertos en la materia, pueden utilizarse en la puesta en práctica de la presente invención.

Las estrategias adicionales para mejorar la eficacia de la inmunización basada en ácido nucleico pueden también utilizarse incluyendo, por ejemplo, la utilización de replicones víricos de autorreplicación (Caley, et al. 1999. Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, et al. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner, et al. 2000. Cancer Res. 60: 51-55), optimización del codón (Liu, et al. 2000. Mol. Ther., 1: 497-500; Dubensky, supra; Huang, et al. 2001. J. Virol. 75: 4947-4951), electroporación in vivo (Widera, et al. 2000. J. Immunol. 164: 4635-3640), incorporación de motivos estimulantes de CpG (Gurunathan, et al. Ann. Rev. Immunol., 2000. 18: 927-974; Leitner, supra), secuencias para la dirección de las series de reacciones del tratamiento endocítico o con ubiquitina (Thomson, et al. 1998. J. Virol. 72: 2246-2252; Velders, et al. 2001. J. Immunol. 166: 5366-5373), regímenes de refuerzo primario (Gurunathan, supra; Sullivan, et al. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, et al. 1998. Vaccine, 16: 439-445; Amara, et al. 2001. Science, 292: 69-74), y la utilización de vectores de administración a las mucosas tales como Salmonella (Darji, et al. 1997. Cell, 91: 765-775; Woo, et al. 2001. Vaccine, 19: 2945-2954). Otros procedimientos son conocidos en la técnica tales como los que se describen a continuación.

Agentes quimioterapéuticos, radiación, compuestos antiangiógenos u otros agentes pueden también utilizarse en el tratamiento y/o prevención del cáncer utilizando dianas inmunógenas (Sebti, et al. Oncogene 27 de diciembre de 2000; 19(56):6566-73). Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, los agentes quimioterapéuticos útiles incluyen ciclofosfamida, doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, navelbina, capecitabina y mitomicina C, entre otros. La combinación de agentes quimioterapéuticos se ha demostrado eficaz incluyendo ciclofosfamida + metrotexato + 5-fluorouracilo; ciclofosfamida + doxorrubicina + 5-fluorouracilo; o, ciclofosfamida + doxorrubicina, por ejemplo. Otros compuestos tales como prednisona, un taxano, navelbina, mitomicina C o vinblastina se han utilizado por varias razones. Una mayoría de los pacientes de cáncer de mama presentan tumores positivos receptores de estrógeno (ER+) y en estos pacientes, la terapia endocrina (es decir, tamoxifeno) se prefiere sobre la quimioterapia. Para dichos pacientes, tamoxifeno o, como segunda terapia lineal, se prefieren progestinas (acetato de medroxiprogesterona o acetato de megestrol). Los inhibidores de aromatasa (es decir, aminoglutetimida y análogos de los mismos tales como letrozol) disminuyen la disponibilidad del estrógeno necesaria para mantener el crecimiento tumoral y pueden utilizarse como terapia endocrina de segunda o tercera línea en determinados pacientes.

Otros cánceres pueden requerir diferentes regímenes quimioterapéuticos. Por ejemplo, el cáncer colorrectal metastático se trata típicamente con Camptosar (irinotecan o CPT-11), 5-fluorouracilo o leucovorin, solos o en combinación con otro. Los inhibidores de proteinasa e integrina tales como los inhibidores de MMP marimastato (British Biotech), COL-3 (Collagenex), Neovastat (Aeterna), AG3340 (Agouron), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb), CGS 27023A (Novartis) o los inhibidores de integrina Vitaxin (Medimmune) o MED1522 (Merck KgaA) pueden también ser adecuados para su utilización. Como tales, el direccionamiento inmunológico de las dianas inmunógenas asociadas con el cáncer colorrectal podría realizarse en combinación con un tratamiento utilizando estos agentes quimioterapéuticos. Asimismo, los agentes quimioterapéuticos utilizados para tratar otros tipos de cánceres son bien conocidos en la técnica y pueden combinarse con las dianas inmunógenas descritas en la presente memoria.

Muchos agentes antiangiógenos son conocidos en la técnica y serían adecuados para la administración conjunta con las vacunas de diana inmunógena (véase, por ejemplo, Timar, et al. 2001. Pathology Oncol. Res., 7(2): 85-94). Dichos agentes incluyen, por ejemplo, agentes fisiológicos tales como factores de crecimiento (es decir, ANG-2, NK1,2,4 (HGF), factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta)), citocinas (es decir, interferones tales como INF-\alpha, -\beta, -\gamma, factor 4 de plaquetas (PF-4), PR-39), proteasas (es decir, AT-III escindida, fragmento de colágeno XVIII (Endostatina)), fragmento de plasmina HmwKallicrein-d5 (Angiostatina), protrombina-F1-2, TSP-1), inhibidores de proteasa (es decir, inhibidor tisular de metaloproteasas tales como TIMP-1, -2 o -3; maspin; inhibidores del activador del plasminógeno tales como PAI-1; factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF)), Tumstatina (disponible en ILEX, Inc.), productos de anticuerpo (es decir, los anticuerpos que se unen al colágeno HUIV26, HUI77, XL313; anti-VEGF; anti-integrina (es decir, Vitamina, (Lxsys))), y glucosidasas (es decir, heparinasa-I, -III). Agentes "químicos" o fisiológicos modificados conocidos o que se cree que presentan potencial antiangiógeno incluyen, por ejemplo, vinblastina, taxol, ketoconazol, talidomida, dolestatina, combrestatina A, rapamicina (Guba, et al. 2002, Nature Med., 8: 128-135), CEP-7055 (disponible en Cephalon, Inc.), ácido acético de flacona, Bay 12-9566 (Bayer Corp.), AG3340 (Agouron, Inc.), CGS 27023A (Novartis), derivados de tetraciclina (es decir, COL-3 (Collagenix, Inc.)), Neovastat (Aeterna), BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb), 5-FU a baja dosis, metrotexato a baja dosis (MTX), irsofladina, radicicol, ciclosporina, captopril, celocoxib, polisacárido sulfatado D45152, proteína catiónica (Protamina), péptido catiónico-VEGF, Suramin (naftilurea polisulfonada), compuestos que interfieren con la función o producción de VEGF (es decir, SU5416 o SU6668 (Sugen), PTK787/ZK22584 (Novartis)), Distamicina A, angiozima (ribozima), isoflavinoides, derivados de estaurosporina, genisteína, EMD121974 (Merck KcgaA), tirfostinas, isoquinolonas, ácido retinoico, carboxiamidotriazol, TNP-470, octreotida, 2-metoxiestradiol, aminoesteroles (es decir, escualamina), análogos de glutatión (es decir, N-acetil-L-cisteína), combrestatina A-4 (Oxigene), agentes de bloqueo del receptor Eph (Nature, 414:933-938, 2001), Rh-angiostatina, Rh-endostatina (documento WO 01/93897), péptido cíclico RGD, accutina-disintegrina, benzodiazepanos, anti-avb3 Ab humanizado, Rh-PAI-2, amilorida, p-amidobenzamidina, anti-uPA ab, anti-uPAR Ab, L-fanilalanin-N-metilamidas (es decir, Batimistat, Marimastat), AG3340 y minociclina. Muchos otros agentes adecuados son conocidos en la técnica y serían suficientes para poner en práctica la presente invención.

La presente invención puede también utilizarse en combinación con procedimientos "no tradicionales" de tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se ha demostrado recientemente que la administración de determinadas bacterias anaeróbicas puede ayudar a disminuir el crecimiento tumoral. En un estudio, se modificó Clostridium novyi para eliminar un gen de toxina llevado a cabo en un episoma de fago y administrado a ratones con tumores colorrectales (Dang, et al. P.N.A.S. USA, 98(26): 15155-15160, 2001). En combinación con la quimioterapia, el tratamiento demostró que produce necrosis tumoral en animales. Los reactivos y metodologías descritos en esta aplicación pueden combinarse con dichas metodologías de tratamiento.

Los ácidos nucleicos que codifican dianas inmunógenas pueden administrarse a pacientes por cualquiera de varias técnicas disponibles. Varios vectores víricos que han sido utilizados con éxito para introducir un ácido nucleico a un huésped incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), herpes virus y poxvirus viruela, entre otros. Se entiende en la técnica que muchos de dichos vectores víricos están disponibles en la técnica. Los vectores de la presente invención pueden construirse utilizando técnicas recombinantes habituales ampliamente disponibles para un experto en la materia. Dichas técnicas pueden encontrarse en referencias de la biología molecular corriente tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego,
CA).

Los vectores retrovíricos preferidos son derivados de lentivirus así como derivados de retrovirus murino o aviar. Ejemplos de vectores retrovíricos adecuados incluyen, por ejemplo, el virus de la leucemia murina de Molones (MoMuLV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), el virus del tumor de mama murino (MuMTV), SIV, BIV, HIV y el virus del sarcoma de Rous (RSV). Numerosos vectores retrovíricos pueden incorporar secuencias de ácido nucleico exógenas múltiples. Ya que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren asistencia con objeto de producir partículas de vector infecciosas. Esta asistencia puede proporcionarse por, por ejemplo, estirpes celulares colaboradoras que codifican genes estructurales de retrovirus. Las estirpes celulares colaboradoras adecuadas incluyen \psi2, PA317 y PA12, entre otras. Los viriones del vector producidos utilizando dichas estirpes celulares pueden utilizarse a continuación para infectar una estirpe celular de tejido, tal como las células NIH 3T3, para producir grandes cantidades de viriones retrovíricos híbridos. Los vectores retrovíricos pueden administrarse por los procedimientos tradicionales (es decir, inyección) o por implantación de una "estirpe celular productora" en la proximidad de la población de células diana (Culver, K., et al., 1994, Hum. Gene Ther., 5 (3): 343-79; Culver, K., et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59: 685-90); Oldfield, E., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (1): 39-69). La estirpe celular productora se modifica genéticamente para producir un vector vírico y libera partículas víricas en la proximidad de la célula diana. Una parte de las partículas víricas liberadas se pone en contacto con las células diana e infecta aquellas células, liberando de este modo un ácido nucleico de la presente invención para la célula diana. Después de la infección de la célula diana, se produce la expresión del ácido nucleico del vector.

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Se ha demostrado que los vectores adenovíricos son especialmente útiles para la transferencia génica en las células eucarióticas (Rosenfeld, M., et al., 1991, Science, 252 (5004): 431-4; Crystal, R., et al., 1994, Nat. Genet., 8 (1): 42-51), el estudio de la expresión génica eucariótica (Levrero, M., et al., 1991, Gene, 101 (2): 195-202), el desarrollo de vacunas (Graham, F. y Prevec, L., 1992, Biotechnology, 20: 363-90), y en modelos animales (Stratford-Perricaudet, L., et al., 1992, Bone Marrow Transplant., 9 (supl. 1): 151-2; Rich, D., et al., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (4): 461-76). Las vías experimentales para administrar Ad recombinante a tejidos diferentes in vivo han incluido la instilación intratraqueal (Rosenfeld, M., et al., 1992, Cell, 68 (1): 143-55) la inyección intramuscular (Quantin, B., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 89 (7): 2581-4), la inyección intravenosa periférica (Herz, J., y Gerard, R., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90 (7): 2812-6) y la inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle, G., et al., 1993, Science, 259 (5097): 988-90), entre otras.

El virus adenoasociado (AAV) demuestra infectividad de alto nivel, amplio intervalo de huésped y especificidad en la integración en el genoma de la célula huésped (Hermonat, P., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 81 (20): 6466-70). Y el virus del herpes simple tipo-1 (HSV-1) es todavía otro sistema de vector atractivo, especialmente para su utilización en el sistema nervioso debido a su propiedad neurótropa (Geller, A., et al., 1991, Trends Neurosci., 14 (10): 428-32; Glorioso, et al., 1995, Mol. Biotechnol., 4 (1): 87-99; Glorioso, et al., 1995, Annu. Rev. Microbiol., 49: 675-710).

El poxvirus es otro vector de expresión útil (Smith, et al. 1983, Gene, 25 (1): 21-8; Moss, et al., 1992, Biotechnology, 20: 345-62; Moss, et al., 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38; Moss, et al. 1991, Science, 252: 1662-1667). Los poxvirus que se demuestra que son útiles incluyen vacunas, NYVAC, avipox, viruela aviar, viruela de los canarios, ALVAC y ALVAC(2), entre otros.

NYVAC (vP866) procedía de la cepa de la vacuna de Copenhague del virus de la vacuna eliminando seis zonas no esenciales del genoma que codifican factores de virulencia conocidos o potenciales (véase, por ejemplo, las patentes U.S. nº 5.364.773 y nº 5.494.807). Los loci de detección se modificaron también genéticamente como loci del receptor para la inserción de genes extraños. Las zonas eliminadas son: gen de timidina cinasa (TK; J2R); zona hemorrágica (u; B13R+B14R); una zona corporal de tipo inclusión (ATI; A26L); gen de hemoaglutinina (HA; A56R); zona del gen del intervalo del huésped (C7L-K1L); y, subunidad grande, ribonucleótido reductasa (I4L). NYVAC es una cepa del virus de la vacuna modificado genéticamente que se generó mediante la deleción específica de dieciocho marcos de lectura abiertos que codifican los productos génicos asociados a la virulencia y a la gama de huésped. Se ha demostrado que NYVAC sirve para expresar los TA (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 6.265.189). NYVAC (vP866), vP994, vCP205, vCP1433, placZH6H4Linversa, pMPC6H6K3E3 y pC3H6FHVB se depositaron también con el ATCC bajos las estipulaciones del tratado de Budapest, números de registro VR-2559, VR-2558, VR-2557, VR-2556, ATCC-97913, ATCC-97912 y ATCC-97914, respectivamente.

Los virus recombinantes basados en ALVAC (es decir, ALVAC-1 y ALVAC-2) son también adecuados para su utilización en la puesta en práctica de la presente invención (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.756.103). ALVAC(2) es idéntico a ALVAC(1) excepto que el genoma de ALVAC(2) comprende la vacuna E3L y los genes de K3L bajo el control de los activadores de la vacuna (patente U.S. nº 6.130.066; Beattie et al. 1995a, 1995b, 1991; Chang et al., 1992; Davies et al., 1993). Tanto ALVAC(1) como ALVAC(2) se ha demostrado que sirven para expresar las secuencias de ADN extraño, tales como las TA (Tartagua et al., 1993 a,b; patente US nº 5.833.975). ALVAC se depositó bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, número de registro ATCC VR-2547.

Otro vector de poxvirus útil es TROVAC. TROVAC se refiere a una viruela aviar atenuada que se aisló clonada en placa procedente de la cepa de la vacuna FP-1 de los virus de la viruela aviar que está autorizada para la vacunación de pollitos de 1 día. TROVAC fue asimismo depositada bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest con el número de registro 2553 de la ATCC.

Los vectores de plásmido "no víricos" pueden también ser adecuados en la puesta en práctica de la presente invención. Los vectores del plásmido preferidos son compatibles con células huésped de bacteria, insecto y/o de mamífero. Dichos vectores incluyen, por ejemplo, PCR-II, pCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBAcII, Invitrogen), pDSR-alfa (PCT pub. nº WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY) así como los derivados del plásmido Bluescript® (un fagómido basado en COLE-1 de número de copia grande, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), clonar los productos de la PCR ampiados con Taq (por ejemplo, kit de clonación TOPO^{TM} TA, derivados de plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA). Los vectores bacterianos pueden también utilizarse con la invención actual. Estos vectores incluyen, por ejemplo, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille calmette guérin (BCG) y Streptococcus (véase por ejemplo, los documentos WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796; y WO 92/21376). Muchos otros vectores y sistemas de expresión de plásmido no vírico son conocidos en la técnica y podrían utilizarse con la presente invención.

Las técnicas de administración de ácido nucleico adecuadas incluyen complejos ADN-ligando, complejos adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación con CaPO_{4}, técnicas de cañón génico, electroporación y sistemas de dispersión coloidal, entre otros. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocapsulares, microesferas, lentejas y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. El sistema coloidal preferido de la invención es un liposoma, que son vesículas de membrana artificial útiles como vehículo de administración in vitro e in vivo. El ARN, ADN y los viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso y liberarse a las células en una forma biológicamente activa (Fraley, R., et al., 1981, Trends Biochem. Sci., 6: 77). La composición de liposoma es normalmente una composición de fosfolípidos, particularmente de fosfolípidos de temperatura alta de la fase de transición, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. Pueden utilizarse también otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposoma incluyen los compuestos de fosfatidil, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en los que el grupo lípido contiene de 14 a 18 átomos de carbono, particularmente de 16 a 18 átomos de carbono y está saturado. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen la fosfatidilcolina del huevo, la dipalmitoilfosfatidilcolina y la diestearoilfosfatidilcolina.

Para reforzar la respuesta inmunitaria puede administrarse también una diana inmunógena en combinación con uno o más adyuvantes. Se proporcionan adyuvantes a título de ejemplo en la Tabla 1 a continuación:

TABLA 1 Tipos de adyuvantes inmunológicos

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Las dianas inmunógenas de la presente invención pueden utilizarse también para generar anticuerpos destinados a su utilización en análisis de identificación o para inmunoterapia. Otras utilizaciones resultarán evidentes para un experto en la materia. El término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo, como se conocen en la técnica incluyendo Fab, Fab_{2}, anticuerpos de una sola cadena (Fv por ejemplo), anticuerpos humanizados, anticuerpos híbridos, anticuerpos humanos, producidos por varios métodos como se conocen en la técnica. Los procedimientos de preparación y utilización de varios tipos de anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la materia y serían adecuados para poner en práctica la presente invención (véase, por ejemplo, Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow et al. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol nº 1, 1998; Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975)); Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332:323-329 (1988); Presta (Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Verhoeyen et al. (Science, 239:1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995); así como las patentes U.S. nº 4.816.567; nº 5.545.807; nº 5.545.806; nº 5.569.825; nº 5.625.126; nº 5.633.425 y nº 5.661.016). Los anticuerpos o derivados de los mismos pueden también conjugarse con grupos terapéuticos tales como fármacos o toxinas citotóxicos, o fragmentos activos de los mismos tales como la cadena A de la difteria, la cadena A exotoxina, la cadena A de ricino, la cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina, entre otros. Los agentes citotóxicos pueden incluir asimismo radioquímicos. Los anticuerpos y sus derivados pueden incorporarse en las composiciones de la invención para su utilización in vitro o in vivo.

Los ácidos nucleicos, proteínas o derivados de los mismos que representan una diana inmunógena pueden utilizarse en análisis para determinar la presencia de un estado patológico en un paciente, para pronosticar, o para determinar la eficacia de un régimen quimioterapéutico u otro tratamiento. Los perfiles de expresión, llevados a cabo como se conoce en la técnica, pueden utilizarse para determinar el nivel relativo de expresión de la diana inmunógena. El nivel de expresión puede correlacionarse a continuación con los niveles básicos para determinar si una enfermedad determinada está presente en el paciente, el pronóstico del paciente, o si un régimen de tratamiento determinado es eficaz. Por ejemplo, si el paciente está siendo tratado con un régimen quimioterapéutico determinado, una disminución del nivel de expresión de una diana inmunógena en los tejidos del paciente (es decir, en la sangre periférica) pueden indicar que el régimen está disminuyendo la carga de cáncer en este hospedador.

Asimismo, si el nivel de expresión está aumentando, puede necesitarse utilizar otra modalidad terapéutica. En una forma de realización, las sondas de ácido nucleico correspondientes a un ácido nucleico que codifica una diana inmunógena pueden unirse a un biochip, como se conoce en la técnica, para la detección y cuantificación de la expresión en el huésped. Asimismo es posible utilizar ácidos nucleicos, proteínas, derivados de los mismos, o anticuerpos contra éstos como reactivos en análisis de identificación de fármacos. Los reactivos pueden utilizarse para determinar el efecto de un fármaco experimental en la expresión de la diana inmunógena en una estirpe celular, o una célula o tejido de un paciente. La técnica de perfil de la expresión puede combinarse con técnicas de identificación de alta resolución que permitan la identificación rápida de compuestos útiles y controlar la eficacia del tratamiento con un fármaco experimental (véase por ejemplo, Zlokarnik, et al., Science 279, 84-8 (1998)). Los fármacos experimentales pueden ser compuestos químicos, ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos o derivados de los mismos, si son naturales o sintéticos. Pueden utilizarse fármacos experimentales identificados de este modo, entre otras utilizaciones, como composiciones farmacéuticas para la administración a pacientes o para su utilización en análisis de identificación adicionales.

La administración de una composición de la presente invención a un hospedador puede realizarse utilizando cualquiera de entre una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia. La composición o composiciones puede(n) procesarse según los procedimientos convencionales de farmacia para producir agentes medicinales destinados a la administración a pacientes, incluyendo el hombre y otros mamíferos (es decir, una "composición farmacéutica"). La composición farmacéutica se prepara preferentemente en forma de una dosis unitaria que contiene una cantidad dada de ADN, partículas de vector vírico, polipéptido o péptido, por ejemplo. Una dosis diaria adecuada para un ser humano u otro mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la enfermedad del paciente y de otros factores, pero, una vez más, puede determinarse utilizando procedimientos rutinarios.

La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral, parenteral, por atomización para inhalación, por vía rectal, por vía intranodal, o por vía tópica en formulaciones de dosis unitarias que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente convencionales. La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a uno o más materiales de la formulación adecuados para llevar a cabo o aumentar la administración de un ácido nucleico, polipéptido o péptido como composición farmacéutica. Una "composición farmacéutica" es una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico o polipéptido. Las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren cada una a la cantidad de un ácido nucleico o polipéptido utilizado para provocar o potenciar una respuesta inmunitaria eficaz. Se prefieren que las composiciones de la presente invención proporcionen la producción o aumento de una respuesta inmunitaria antitumoral en un huésped que proteja al huésped del desarrollo de un tumor y/o permita al huésped eliminar un tumor existente en el cuerpo.

Para la administración oral, la composición farmacéutica puede ser de cualquiera de las diversas formas incluyendo, por ejemplo, una cápsula, un comprimido, una suspensión o líquido, entre otros. Los líquidos pueden administrarse por inyección como composición con vehículos adecuados incluyendo solución salina, dextrosa o agua. El término parenteral tal como se utiliza en la presente memoria incluye la administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, por infusión o intraperitoneal. Los supositorios para administración rectal del fármaco pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado tal como manteca de cacao y polietilenglicoles que son sólidos a las temperaturas ordinarias pero líquidos a la temperatura rectal.

El régimen de dosificación para inmunizar un huésped o si no tratar un trastorno o una enfermedad con una composición de la presente invención está basado en una variedad de factores, incluyendo el tipo de enfermedad, la edad, peso, sexo, estado médico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y el compuesto concreto empleado. Por ejemplo, un vector vírico de la viruela puede administrarse a una composición que comprende 1 \times 10^{6} partículas infecciosas por dosis. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero puede determinarse de forma rutinaria utilizando los procedimientos habituales.

Un régimen de refuerzo de una sola dosis puede utilizarse también (documento WO 01/30382 A1) en el que el inmunógeno objetivo se administra inicialmente en una etapa de cebado en una forma seguida por una etapa de refuerzo en el que el inmunógeno objetivo se administra en otra forma. La forma del inmunógeno objetivo en las etapas de cebado y de refuerzo es diferente. Por ejemplo, si la etapa de cebado utilizó un ácido nucleico, el refuerzo puede administrar en forma de péptido. Asimismo, cuando una etapa de cebado utilizó un tipo de virus recombinante (es decir, ALVAC), la etapa de refuerzo puede utilizar otro tipo de virus (es decir, NYVAC). Este método de sonda-refuerzo de administración ha demostrado ser válido para provocar respuestas inmunológicas potentes.

Aunque las composiciones de la invención pueden administrarse como un único agente farmacéutico activo, pueden también utilizarse en combinación con una u otras composiciones o agentes más (es decir, otras dianas inmunógenas, moléculas coestimulantes, adyuvantes). Cuando se administra como una composición, los componentes individuales pueden formularse como composiciones independientes administradas al mismo tiempo o en diferentes momentos, o los componentes pueden combinarse como una única composición.

Las preparaciones inyectables, tales como las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables, pueden formularse según los procedimientos conocidos utilizando agentes de dispersión o de humectación adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable puede ser también una solución o suspensión inyectable esterilizada en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable. Los vehículos y disolventes adecuados que pueden emplearse son el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico, entre otros. Por ejemplo, un vector vírico tal como un poxvirus puede prepararse en NaCl al 0,4%. Además, se emplean convencionalmente los aceites estables, esterilizados, como medio disolvente o en suspensión. Con este objeto, puede emplearse cualquier aceite estable blando, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos pueden tales como el ácido oleico encuentran utilización en la preparación de inyectables.

Para la administración tópica, una dosis tópica adecuada de una composición puede administrarse una a cuatro veces al día, y preferentemente dos o tres. La dosis puede administrarse también días alternativos durante los que no se aplica. Las composiciones adecuadas pueden comprender del 0,001% al 10% p/p, por ejemplo, del 1% al 2% en peso de la formulación, aunque pueden comprender como mucho el 10% p/p, pero preferentemente no más del 5% p/p, y más preferentemente del 0,1% al 1% de la formulación. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen las preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel (p. ej., linimentos, lociones, pomadas, cremas o pastas), o gotas adecuadas para la administración a los ojos, oído o
nariz.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse también en forma sólida (incluyendo gránulos, polvos o supositorios). Las composiciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, etc. Las formas galénicas sólidas para administración oral pueden incluir cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede administrarse por lo menos con un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas unitarias pueden comprender también, como en la práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, p. ej., agentes lubricantes tal como el estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras las formas de dosificación pueden comprender también agentes tamponantes. Los comprimidos y píldoras pueden prepararse además con recubrimiento entérico. Las formas galénicas líquidas para la administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes utilizados normalmente en la técnica, tal como el agua. Dichas composiciones pueden comprender también adyuvantes, tales como humectantes, edulcorantes, saborizantes y agentes perfumantes.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico o polipéptido de la presente invención pueden adoptar alguna de las varias formas y pueden ser administradas por alguna de las varias vías. En las formas de realización preferidas, las composiciones se administran por vía parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea) para provocar una respuesta inmunitaria en el hospedador. Alternativamente, la composición puede administrarse directamente en un ganglio linfático (intranodal) o masa tumoral (es decir, administración intratumoral). Por ejemplo, la dosis podría administrarse por vía subcutánea los días 0, 7 y 14. Los procedimientos adecuados para la inmunización que utilizan las composiciones que comprenden los TA son conocidas en la técnica, como se presenta para p53
(Hollstein et al., 1991), p21-ras (Almoguera et al., 1988), HER-2 (Fendly et al., 1990), antígenos asociados al melanoma (MAGE-1; MAGE-2) (van der Bruggen et al., 1991), p97 (Hu et al., 1988) y antígeno carcinoembrionario (CEA) (Kantor et al, 1993; Fishbein et al., 1992; Kaufman et al., 1991), entre otros.

Las formas de realización preferidas de las composiciones administrables incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos en preparaciones líquidas tales como suspensiones, jarabes o elixires. Las preparaciones inyectables preferidas incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos adecuados para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa tales como suspensiones o emulsiones esterilizadas. Por ejemplo, un poxvirus recombinante puede ser una mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado tal como agua esterilizada, solución salina fisiológica, glucosa o similares. La composición puede también proporcionarse en forma liofilizada para redisolver, por ejemplo, en tampón salino acuoso isotónico. Además, las composiciones pueden administrarse conjuntamente o administrarse sucesivamente con otros agentes antineoplásicos, antitumorales o anticancerosos y/o con agentes que reduzcan o alivien los efectos de la enfermedad de agentes antineoplásicos, antitumorales o anticancerosos.

Se proporciona también un kit que comprende una composición de la presente invención. El kit puede incluir un recipiente por separado que contiene un portador, diluyente o excipiente adecuado, el kit puede incluir también un agente anticanceroso, antitumoral o antineoplásico adicional y/o un agente que reduzca o alivie los efectos de la enfermedad de agentes antineoplásicos, antitumorales o anticancerosos para la administración conjunta o sucesiva. Además, el kit puede incluir instrucciones para mezclar o combinar los ingredientes y/o la administración.

Una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas se conseguirá a partir de los ejemplos siguientes, proporcionados a título ilustrativo.

Ejemplos

Ejemplo 1

A. Modificación de la repetición 1 de mCEA (6D)

Se ha documentado la presencia de formas truncadas de CEA en las células después de la expresión de CEA recombinante. Este estudio se publica para generar las secuencias de ácido nucleico que codifican CEA que no dan como resultado la expresión de CEA truncada después de la expresión en las células. La generación y expresión de una nueva secuencia de ácido nucleico codifica CEA, CAP(6D)-1,2, se describe a continuación.

El plásmido p3'H6MCEA se obtuvo de Virogenetics, Inc. Este plásmido contiene el gen MCEA con la modificación 6D bajo el control del activador H6 parcial (Fig. 1A). El fragmento NruI-BamHI de 912 bp procedente de p3'H6MCEA se clonó en pUC18 para formar el plásmido pSE1544.9 (pUC18-mCEA repetición 1; Fig. 1B).

Los oligos 7254-7526, 7528-7533, 7535-7537 y 7567-7568 purificados por OPC se quinasaron e hibridaron para crear dos fragmentos que se ligaron para dar como resultado la repetición 1 de mCEA modificada sintética de 464 bp flanqueada por las secuencias AccI y BamHI. Este fragmento de la repetición 1 modificado sintético se clonó en pSE1544.9 AccI-BamHI para crear pSE1616.44 (repetición 1 modificada de pUC18-mCEA; Fig. 2). El fragmento EcoRV-BamHI de 904 bp de pSE1616.44 se volvió a clonar en p3'H6MCEA EcoRV-BamHI para formar pSE1658.15 (repetición 1 modificada de p3'H6MCEA; Fig. 3).

B. Modificación de la repetición 2 de mCEA(6D)

Se creó el fragmento de la repetición 2 modificado sintético utilizando un procedimiento denominado corte y empalme génico por extensión del solapamiento (SOE) y se clonó en pBluescript-SK+, generando pBSmCEA (Fig. 4). Los oligos utilizados para la modificación de la repetición 2 se presentan a continuación (apartado IV, B). Los dos clones diferentes (PBS-mCEA-3 y PBS-mCEA-8) contenían varias mutaciones puntuales.

El fragmento BamHI-EcoRI de 697 bp de PBS-mCEA-3 se clonó en pUC18 BamHI-EcoRI para crear pSE1671.8. El fragmento SpeI-Bsu361 de 591 bp de PBS mCEA-8 se clonó en pSE1671.8 SpeI-Bsu361, generando el plásmido denominado pSE1681.1. La muetiquetaénesis por PCR de dos secuencias, que utiliza el kit de la muetiquetaénesis dirigida por la secuencia Quikchange de Straetiquetaene con los oligos 7751 (GGACGGTAGTGTATGATGGAGA
TAGTTGGGTCGTCTGGGCC) y 7760 (CAGAATGAATTATCCGTTGATCACTCC), se realizó para corregir las dos mutaciones puntuales restantes pSE1681.1. El clon corregido se denominó pSE1686.1 (repeticón 2 modificada de pUC18 mCEA; Fig. 5).

Como se mencionó anteriormente, un codón de alanina estaba ausente en el terminal 5' de la segunda repetición en el plásmido p3'H6MCEA que contenía CEA. Para preservar la consistencia de la secuencia de aminoácidos de CEA, el codón de alanina presente en el plásmido pSE1686.1 que contiene la segunda repetición modificada de CEA se modificó genéticamente. Esto se realizó utilizando los oligos 7802 (CGTGACGACGATTACCGTGTATGAGC
CACCAAAACCATTCATAAC) y 7803 (GTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCATACACGGTAATCGTCGTCACG) y el kit de muetiquetaénesis dirigida al sitio a la secuencia Quikchange de Straetiquetaene. El plásmido resultante, pSE1696.1 (repetición 2 modificada de pUC18 mCEA; Fig. 6) se confirmó por secuenciado.

\newpage

El fragmento Bsu36I-BamHI de 694 bp de pSE1696.1 se clonó en la secuencia Bsu36I-BamHI de Pse1658.15 para combinar las repeticiones 1 y 2 modificadas. El plásmido generado se denominó p3'H6modMCEA-repeticiones 1ª y 2ª (Fig. 7).

C. Construcción del plásmido donante pNVQH6MCEA(6D1ª y 2ª) de ALVAC

El fragmento NruI/XhoI de 2,2 kb de p3'H6modMCEA-repeticiones 1ª y 2ª se clonó en la secuencia NruI/XhoI de pNVQH6LSP-18, generando pNVQH6MCEA (6D1ª y 2ª; Fig. 8). La secuencia de CEA modificada ("CAP(6D)-1,2") contenida dentro de pNVQH6MCEA se presenta en la Fig. 9.

D. Expresión de CEA modificada

Para determinar la estabilidad de la secuencia CAP(6D)-1,2 en la expresión en una célula, el gen junto con el activador H6 adyacente se amplió por PCR utilizando pNVQH6MCEA(6D1ª y 2ª) como plantilla y dos oligos (8034LZ:CTGGCGCGCCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG; y 8035LZ:CTGGTACCAGAAAAACTATATCAG
AGCAACCCCAAC). El producto de PCR se clonó a continuación en un plásmido donante NYVAC TK denominado pLZTK1 que contiene los genes marcadores LacZ y K1L. Este vector se preparó específicamente para la generación de virus recombinante en NYVAC utilizando el procedimiento de identificación azul/blanco. Después de la recombinación in vitro entre el plásmido donante pLCTK1mCEA (6D1ª y 2ª) y NYVAC, la secuencia CAP(6D)-1,2 extraña y los genes marcadores se integran en el genoma de NYVAC. Las placas que contienen NYVAC recombinante intermedio tanto con LacZ como con mCEA aparecieron azules. Se llevaron a cabo a continuación varias rondas de purificación en placa. El segundo episodio de recombinación expulsó los genes marcadores resultantes en las placas blancas finales que contienen recombinantes con solamente la secuencia CAP(6D)-1,2 pero no genes marcadores (Fig. 10).

Las placas blancas recombinantes y las placas azules se seleccionaron para la confirmación de la secuencia CAP(6D)-1,2. Se realizó la infección utilizando el virus de las placas respectivas y se recogieron las células tres días después de la infección para preparar ADN celular o lisado celular. Para el aislamiento del ADN de NYVAC recombinante, se utilizó el reactivo DNAzol® (GibcoBRL). PCR (condiciones de PCR: 95ºC (5 min.) \rightarrow [95ºC(30 s.) \rightarrow 49ºC(30 s.) \rightarrow 72ºC(1 min.)] 30 ciclos \rightarrow 72ºC (7 min.) \rightarrow 4ºC) se realizó para confirmar la existencia de la secuencia CAP(6D)-1,2 en el genoma recombinante de NYVAC. Los cebadores utilizados fueron 7569LZ (cebador transcrito 5' ttggatccatggagtctccctcggcc 3') y 7570LZ (cebador complementario 5' ttggatccctatatcagagcaacccc 3'), que pudo ampliar la longitud total de 2106 bp de CAP(6D)-1,2.

Todas las placas blancas recombinantes finales PRBC-III-2, 3, 6, 8, 9, 10 demostraron la banda de secuencia CAP(6D)-1,2 de 2,1 kb en PCR. PRBC-III-N1 fue una placa azul tanto con genes marcadores como con la secuencia CAP(6D)-1,2 todavía en el genoma vírico en la banda de la secuencia CAP(6D)-1,2 se amplió también en la PCR. La banda PCR destacada ampliada procedente del ADN vCP 307 (que contiene CEA natural integrada en el genoma de ALVAC) se truncó CEA a 1,2 kb con una banda de CEA completa muy débil. La muestra de células solamente (ninguna infección vírica) se utilizó como referencia negativa y el plásmido pLZTK1MCEA (6D1ª y 2ª) se utilizó como referencia positiva en la reacción de PCR. Los resultados de PCR presentaron claramente la CAP(6D)-1,2 completa en el genoma vírico recombinante sin ninguna otra forma truncada de CEA visible. Este resultado indicó que CAP(6D)-1,2 había aumentado la estabilidad relativa al CEA natural en el genoma de ALVAC.

La expresión de la proteína se analizó también por inmunotransferencia para confirmar la ausencia de la proteína CEA truncada en las células que expresan CAP(6D)-1,2 (Fig. 11). Para el aislamiento del lisado celular, se lavaron en primer lugar las células con PBS seguido de la adición de tampón de lisis (Reporter Gene Assay; Boehriner Mannheim) y agitación durante 15 minutos. El lisado celular se centrifugó a 13.000 rpm y se recogió el sobrenadante para el análisis por transferencia Western. Las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida al 10% y se introdujeron a 125 voltios. La proteína se transfirió a continuación a una membrana filtrante PVDF (Immobilon-P, Millipore). Un anticuerpo monoclonal CEA de ratón unido a HRP (1:1000; Fitzgerald) se utilizó para detectar la expresión de mCEA con el aumento del reactivo de quimioluminiscencia (ADN Thunder^{TM}; NEN^{TM} Life Science Products).

Las seis placas blancas recombinantes CAP(6D)-1,2 finales (PRBC-III-2,3,6,8,9,10) y una placa azul intermedia (pRBC-III-N1) presentaba solamente una banda CEA sin ninguna otra forma truncada (Fig. 11). En cambio, la proteína de las placas vCP307 (ALVAC recombinante que expresa CEA natural) presentó un producto CEA truncado claro a \sim60 kDa además de la CEA completa. La exposición prolongada de la película verificó la ausencia de algunos polipéptidos de CEA truncados en los recombinantes CAP(6D)-1,2. CEF se utilizó como referencia negativa.

En conclusión, se generaron recombinantes CAP(6D)-1,2 con la mCEA en lugar de la CEA natural para impedir la expresión de las versiones múltiples de CEA. CAP(6D)-1,2 expresada a partir de NYVAC recombinante se demostró eficaz para eliminar la versión truncada de CEA tanto por PCR como por transferencia Western.

Aunque la presente invención se ha descrito desde el punto de vista de las formas de realización preferidas, se apreciará que resultrarán evidentes variaciones y modificaciones para los expertos en la materia. Por consiguiente, se pretende que las reivindicaciones comprendan la totalidad de dichas variaciones equivalentes que están comprendidas dentro del alcance de la invención como se reivindica.

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SEC. ID. nº: 1; secuencia nucleotídica AAC2-1

1

2

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SEC. ID. nº: 2; marco de lectura abierto AAC2-2

3

\newpage

SEC. ID. nº: 3; 7524

102

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SEC. ID. nº: 4; 7526

103

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SEC. ID. nº: 5; 7528

104

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SEC. ID. nº: 6; 7533

105

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SEC. ID. nº: 7; 7535

106

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SEC. ID. nº: 8; 7537

107

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SEC. ID. nº: 9; 7567

108

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SEC. ID. nº: 10; 7568

109

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SEC. ID. nº: 11; 7576

110

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SEC. ID. nº: 12; 7587

111

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SEC. ID. nº: 13; 7677

112

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SEC. ID. nº: 14; 7678

113

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SEC. ID. nº: 15; 7679

114

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SEC. ID. nº: 16; 7680

115

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SEC. ID. nº: 17; 7681

116

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SEC. ID. nº: 18; 7682

117

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SEC. ID. nº: 19; 7683

118

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SEC. ID. nº: 20; 7684

119

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SEC. ID. nº: 21; 7685

120

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SEC. ID. nº: 22; 7686

121

\newpage

SEC. ID. nº: 23; CEA-CAP6D

4

\newpage

SEC. ID. nº: 24; CAP6D-1,2

6

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Listado de secuencias

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<110> Aventis Pasteur, Limited

\hskip1cm

Therion Biologics, Inc.

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<120> Ácido nucleico de CEA modificado y vectores de expresión

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<130> P021352EP CLM

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<140> EP 03719662.3

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<141> 2003-04-09

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US03/10916

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<151> 2003-04-09

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/372,972

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-04-09

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 33

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<170> Patente en versión 3.1

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<210> 1

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<211> 3564

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la secuencia desconocida: secuencia nucleotídica AAC2-1"

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1663)..(163)

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<223> n es dudoso

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<400> 1

7

8

9

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<210> 2

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<211> 1444

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<221> fuente

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<213> Secuencia artificial

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<223> /nota = "Descripción de la secuencia desconocida: secuencia nucleotídica AAC2-2"

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<400> 2

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10

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<210> 3

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<211> 65

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7524"

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<400> 3

122

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<210> 4

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<211> 70

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7526"

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<400> 4

123

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<210> 5

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<211> 70

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7528"

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<400> 5

124

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<210> 6

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<211> 70

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7533"

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<400> 6

125

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<210> 7

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<211> 70

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7535"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7537"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7567"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7568"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7576"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7587"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

131

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7677"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7678"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

133

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7679"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

134

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7680"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

135

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7681"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7682"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

137

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7683"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

138

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7684"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

139

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7685"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: 7686"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcaggttc acaggtgaag gccacagcat ccttgtcctc cacgggt

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: CEA-CAP6D"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Secuencia CEA modificada (CAP(6D)-1,2) contenida dentro de PNVQH6MCEA"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Arg Arg His His Cys Arg Ser Lys Ala Lys Arg Ser Arg His His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7751"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacggtagt aggtgtatga tggagatata gttgggtcgt ctgggcc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7760"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaatgaat tatccgttga tcactcc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7802"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtgacgacg attaccgtgt atgagccacc aaaaccattc ataac

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Oligo 7803"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttatgaatg gttttggtgg ctcatacacg gtaatcgtcg tcacg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Cebador transcrito 8034LZ"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggcgcgcc ttctttattc tatacttaaa aagtg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Cebador transcrito 8035LZ"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggtaccag aaaaactata tcagagcaac cccaac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Cebador transcrito 7569LZ"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatccat ggagtctccc tcggcc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Cebador complementario 7570LZ"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatccct atatcagagc aacccc

\hfill

26

Claims

1. Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico CEA (6D)-1,2 como se ilustra en la SEC. ID. nº: 24.

2. Vector de expresión según la reivindicación 1, en el que el vector es un plásmido o un vector vírico.

3. Vector de expresión según la reivindicación 2, en el que el vector vírico se selecciona de entre el grupo constituido por poxvirus, adenovirus, retrovirus, herpesvirus y virus adenoasociados.

4. Vector de expresión según la reivindicación 3, en el que el vector vírico es un poxvirus seleccionado de entre el grupo constituido por vacunas, NYVAC, avipox, viruela de los canarios, ALVAC, ALVAC(2), viruela aviar y TROVAC.

5. Vector de expresión según la reivindicación 4, en el que el vector vírico es un poxvirus seleccionado de entre el grupo constituido por NYVAC, ALVAC y ALVAC(2).

6. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos un antígeno adicional asociado al tumor.

7. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos una secuencia nucleica que codifica un antígeno asociado a la angiogénesis.

8. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un componente coestimulante.

9. Composición farmacéutica que comprende un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Utilización de un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un medicamento destinado a prevenir o tratar el cáncer.

11. Molécula de ADN aislada que comprende la secuencia CEA(6D)-1,2 ilustrada en la SEC. ID. Nº: 24.

12. Utilización de una composición según la reivindicación 9 para la preparación de un medicamento destinado a prevenir o tratar el cáncer.

13. Vector de expresión según la reivindicación 8, en el que el componente coestimulante es B7.1.