ES2290466T3 - Metodos y materiales para la produccion de acido d-lactico en levadura. - Google Patents
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Abstract
Una célula de levadura recombinante de una especie que no acumula de forma natural piruvato, que comprende al menos un gen de D-lactato deshidrogenasa exógeno integrado en su genoma, en la que el gen de D-lactato deshidrogenasa está unido de forma operativa a secuencias promotoras y terminadoras funcionales.
Description
Métodos y materiales para la producción de ácido
D-láctico en levadura.
El ácido láctico es una molécula orgánica que
puede producirse por síntesis química o por procesos de fermentación
en microorganismos (biosíntesis). Las ventajas que puede tener un
enfoque biosintético sobre un enfoque sintético químico para la
fabricación de un producto orgánico incluyen un rendimiento más
eficaz del producto, una producción más rápida, pureza isomérica, y
un coste menor.
El ácido D- (o R-) láctico es un elemento
esencial en la fabricación materiales biológicamente activos,
incluyendo herbicidas y productos farmacéuticos. Sin embargo,
nuevos procesos que rebajen el coste del ácido
D-láctico podrían permitir su penetración y la
extensión de su uso en mercados químicos mayores incluyendo, por
ejemplo, plásticos. El ácido D-láctico puede
convertirse en D-lacturo, un condensado cíclico del
ácido D-láctico, que tiene muchas aplicaciones
potenciales, incluyendo la fabricación de películas, fibras, y otras
aplicaciones poliméricas. El D-lacturo puede
polimerizarse a poli (D-lacturo)
(D-PLA), un polímero que tiene propiedades
similares al poli (L-lacturo)
(L-PLA), que se usa para diversas aplicaciones
poliméricas. El PLA altamente cristalino como el que produce
actualmente Cargill Dow contiene en su mayoría el
L-esteroisomérico. Esta resina con alta cantidad de
isómero L se usa más comúnmente en el mercado de fibras de PLA por
causa de su capacidad para aumentar la resistencia de la fibra, la
resistencia a la rotura, y aumentar su temperatura útil por encima
de la temperatura de transición vítrea del L-PLA,
cuando se le aplican grandes tensiones. Podría esperarse que un
polímero con un contenido igualmente alto de isómero D tuviera
propiedades similares. Además, un polímero con alto contenido en
isómero D pueden mezclarse con un polímero con alto contenido del
isómero L para formar un estéreo-complejo que tenga
una temperatura de fusión significativamente más alta (de hasta
aproximadamente 230ºC). Esta temperatura de fusión más alta permite
usar el PLA en aplicaciones donde se necesite una mejor resistencia
al calor. Un ejemplo de dicha aplicación es en ciertas aplicaciones
de ropa, donde se necesita una temperatura de fusión aumentada para
producir tejidos resistentes al planchado.
El ácido D-láctico también es un
intermedio químico industrial útil que se usa en aplicaciones
herbicidas y farmacéuticas. Por ejemplo, el ácido
D-láctico es un intermedio en la fabricación de
herbicidas fenoxipropiónico y ariloxifenoxipropiónico.
Los procesos bio-sintéticos
conocidos para producir ácido láctico tienen ciertas limitaciones.
Por ejemplo, los organismos que producen ácido láctico natural
tales como Lactobacilli pueden producir grandes cantidades
de ácido L-láctico en condiciones de fermentación.
Sin embargo, estos organismos requieren un medio de fermentación
complejo para producir de forma eficaz. La complejidad del medio de
fermentación aumenta los costes en materia prima y hace más difícil
y caro separar el ácido láctico del medio. Además, los procesos de
fermentación que usan estos organismos son propensos a la infección
por otras especies no productoras de ácido láctico. No existe un
método económico para eliminar de forma selectiva las cepas no
deseadas.
Es necesario mantener el pH en la fermentación
cuando se usan estos organismos, puesto que los entornos de bajo pH
en la propia bacteria y en el caldo pueden inhibir la proliferación
de las bacterias o causar la muerte celular. Esto se consigue
añadiendo agentes neutralizantes tales como carbonato cálcico al
caldo de fermentación para formar lactato de calcio. Para recuperar
el ácido láctico, es necesario tratar el lactato de calcio con un
ácido fuerte tal como ácido sulfúrico, que reacciona con el lactato
de calcio para formar ácido láctico y yeso (sulfato de calcio). La
incapacidad estos organismos para funcionar a un pH bajo conduce por
lo tanto a gastos adicionales en materias primas y para la
eliminación de los subproductos no deseados (yeso).
En el documento japonés Kokai Nº
2002-136293A se describe una levadura manipulada
genéticamente que se cree que produce ácido
D-láctico. El hospedador de la levadura es de un
tipo especial que "acumula" piruvato, es decir, produce
cantidades significativas de piruvato que no se metabolizan
adicionalmente.
Dequin et al. (BIO/TECHNOLOGY, 1994, vol.
2, Nº 2, páginas 173-177) muestran la expresión de
L-lactato deshidrogenasa a partir de
Lactobacillus casei en la levadura Saccharomyces
cerevisiae a partir de un plásmido. Análogamente, Chelstowska
et. al. (YEAST, 1999, vol. 15, Nº 13, págs.
1377-1391) muestran la expresión de
D-lactato deshidrogenada DLD2 y DLD3 de levadura a
partir del plásmido en la levadura S. cerevisiae.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en
la técnica de procesos biosintéticos para preparar ácido
D-láctico con un organismo que: 1) permita fabricar
ácido D-láctico a buenos rendimientos y
productividades; 2) requiera preferiblemente solamente un medio de
fermentación simplificado, y 3) permita preferiblemente un pH bajo
y/o un medio de fermentación a alta temperatura que pueda eliminar
la contaminación a partir de cepas de microorganismos no
deseados.
En un aspecto, esta invención proporciona
células de levadura recombinantes de una especie que no acumula de
forma natural piruvato, que comprende al menos un gen de
D-lactato deshidrogenasa exógeno integrado dentro
de su genoma, en el que gen de D-lactato
deshidrogenasa se une de forma operativa a secuencias promotoras y
terminadoras funcionales.
La invención también proporciona ácidos
nucleicos recombinantes que codifican un gen de
D-lactato deshidrogenasa unido de forma operativa a
secuencias promotoras y terminadoras funcionales. Los ácidos
nucleicos recombinantes de la invención permiten la expresión del
gen de D-lactato deshidrogenasa en una célula de
levadura recombinante.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para producir ácido D-láctico que comprende
fermentar células de la invención en condiciones que permitan la
biosíntesis del ácido D-láctico.
Las células de levadura transformadas son
capaces de producir ácido D- láctico en rendimientos comercialmente
significativos. Las células pueden tolerar bien la presencia de
ácido D-láctico y pueden seguir produciendo
eficazmente cuando el caldo de fermentación contenga una
concentración significativa de ácido D-láctico. Este
efecto es inesperado, ya que el ácido L-láctico y
el ácido D-láctico tienden a ser inhibidores del
crecimiento y de la supervivencia de algunos microorganismos (véase
Lett. Appl. Microbiol. 2002; 35(3): 176-80;
Susceptibility of Escherichia coli 0157 and
non-0157 isolates to lactate. McWilliam Leitch EC,
Stewart CS. Appl. Environ. Microbiol. Septiembre de 2002.;
68(9): 4678-8). En algunos casos las células
eucariotas y bacterianas han demostrado responder de forma
diferente al ácido D-láctico que al ácido
L-láctico (véase Uribarri J, Oh MS, Carroll HJ,
Medicine (Baltimore) marzo de 1998; 77(2):
73-82, "D-lactic acidosis: a
review of clinical presentation, biochemical features, and
pathophysiologic mechanisms"; cf. Leite et al, supra).
Las realizaciones preferidas específicas de la
presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente
descripción más detallada de algunas realizaciones preferidas y de
las reivindicaciones.
La Fig. 1 es un mapa del plásmido de pNC2, que
comprende el promotor PGK y el terminador GAL10, ambos
de S. cerevisiae.
La Fig. 2 es un mapa del plásmido de pNC4, que
comprende el promotor PDC1 y el terminador GAL10,
ambos de S. cerevisiae.
La Fig. 3a es un mapa de fragmento de
restricción NotI de una secuencia de 1,235 kb obtenida de ADN
cromosómico de S. cerevisiae amplificado por PCR, que
comprende el promotor PGK y el terminador GAL10 (S.
cerevisiae), y un sitio de clonación múltiple entre el promotor
y el terminador.
La Fig. 3b es un mapa del fragmento de
restricción NotI de una secuencia de 1,235 kb obtenida de ADN
cromosómico de S. cerevisiae amplificada por PCR, que
comprende el promotor PDC1 y el terminador GAL10
(S. cerevisiae), y un sitio de clonación múltiple entre el
promotor y el terminador.
La Fig. 4 es un mapa del plásmido de pVR24, que
comprende L-LDH de B. megaterium unido
de forma funcional al promotor PGK y al terminador
GAL10, de S. cerevisiae.
La Fig. 5 es un mapa del plásmido de pVR22, que
comprende el marcador de resistencia a G418 unido de forma funcional
al promotor PGK y al terminador GAL10, de S.
cerevisiae.
La Fig. 6 es un mapa del plásmido de pNC7, que
comprende el gen de LDH de B. megaterium unido de
forma funcional al promotor PGK y al terminador GAL10,
de S. cerevisiae.
Las Fig. 7A/B son: A) un mapa del plásmido de
pSO21, que comprende el PDC1 de K. marxianus; y B) un
mapa del plásmido de pSO27, que comprende un fragmento de 3,3 kb de
PDC1 (K. marxianus) que contiene una región 5' cadena
arriba del locus de PDC1; y
La Fig. 8 es un mapa del plásmido de pSO28 que
comprende una deleción en la región codificante de PDC1
contenido en pSO21, y el gen de resistencia a G418 unido de forma
funcional al promotor PGK y al terminador GAL10, de
S. cerevisiae.
La Fig. 9 es un mapa del plásmido de pSO29, que
comprende una deleción en la región codificante de PDC1
contenida en pSO21 y el gen de resistencia a zeocina unido de forma
funcional al promotor TEF1 y al terminador Tcyc1 de
S. cerevisiae (de pTEF1/Zeo; Invitrogen).
La Fig. 10 es un mapa del plásmido de pPS1, que
comprende el gen de resistencia a higromicina (hph) de E.
coli unido de forma funcional al promotor PDC1 y al
terminador GAL10 de S. cerevisiae.
La Fig. 11a es un mapa del plásmido de pVR43,
que comprende el gen de D-LDH de L.
helveticus.
La Fig. 11b es un mapa del plásmido de pVR44,
que comprende el gen de D-LDH de L.
helveticus con los sitios XbaI y BamHI en el
extremo 5' y 3' del gen respectivamente.
La Fig. 12 es un mapa del plásmido de pVR47, que
comprende el gen de D-LDH de L.
helveticus unido de forma funcional al promotor PGK y al
terminador GAL10 de S. cerevisiae.
La Fig. 13 es un mapa del plásmido de pVR48, que
comprende el gen de D-LDH de L.
helveticus unido de forma funcional al promotor PGK y al
terminador GAL10 de S. cerevisiae y el gen de
resistencia hph unido de forma funcional al promotor
PDC1 y al terminador GAL10 de S.
cerevisiae.
La Fig. 14 es un mapa del plásmido de pCA50, que
comprende una casete de expresión insertada entre las regiones
flanqueantes 3' y 5' del locus de PDC1 (K. marxianus),
que contiene el gen de D-LDH de L.
helveticus unido de forma funcional al promotor PGK y al
terminador GAL10 de S. cerevisiae, y el gen de
resistencia hph unido de forma funcional al promotor
PDC1 y al terminador GAL10 de S.
cerevisiae.
La Fig. 15 es un mapa del plásmido de pVR29, que
comprende el marcador de resistencia a G418 unido de forma funcional
al promotor PGK y al terminador GAL10 de S.
cerevisiae.
La Fig. 16a es un mapa del plásmido de pBH5a,
que comprende un flanco 5' del locus de PDC1 (K.
marxianus) y por separado, el gen de resistencia a G418 unido de
forma funcional al promotor PDC1 y al terminador GAL10
de S. cerevisiae.
La Fig. 16b es un mapa del plásmido de pBH5b que
comprende las regiones de flanqueo del extremo 3' y 5' del locus de
PDC1 (K. marxianus) y por separado, el gen de
resistencia a G418 unido de forma funcional al promotor PDC1
y al terminador GAL10 de S. cerevisiae.
La Fig. 16c es un mapa del plásmido de pBH5c,
que comprende el locus de PDC1 del K. marxianus.
La Fig. 17 es una mapa del plásmido de pBH6, que
comprende el gen de D-LDH de L.
helveticus situado entre las regiones de flanqueo 5' y 3' del
locus de PDC1 (K. marxianus) y por separado el gen de
resistencia a G418 unido de forma funcional al promotor PDC1
y al terminador GAL10 de S. cerevisiae.
Las células de levadura de la invención se
proporcionan a partir de una especie que, antes de la recombinación
como se describe en este documento, no acumulaba piruvato. Por "no
acumula" piruvato, se entiende que la especie no produce al
menos 10 g/l ácido pirúvico cuando se cultiva de acuerdo con el
método que se muestra en la Realización 5 del documento japonés
Kokai 2000-78996. Generalmente, una célula de
levadura no acumulará piruvato cuando contiene de forma natural una
ruta metabólica activa que metaboliza el piruvato en diversos
metabolitos tales como etanol, acetato o biomasa. Dichas células de
levadura metabolizan el piruvato lo suficientemente rápido para que
exista poco piruvato dentro de la célula en cualquier momento y se
secrete poco piruvato por la célula. Las células de levadura
preferidas tienen de forma natural uno o más genes de piruvato
descarboxilasa (PDC) activos que producen proteína de piruvato
descarboxilasa, que convierte el piruvato en etanol. Se prefieren
aún más aquellas células de levadura que muestran el fenotipo
Crabtree negativo, en el que la ruta metabólica aerobia de la
célula (respiración y ciclo del TCA) no se inhibe mediante la
presencia de una alta concentración de glucosa. Los ejemplos de
células de levadura adecuadas incluyen aquellas de los géneros
Candida, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula.
Las células de los géneros Candida y Kluyveromyces se
prefieren particularmente. Las células especialmente preferidas son
C. sonorensis, K. lactis, K. theromotolerans y K.
marxianus. Las células más preferidas son C. sonorensis y
K. marxianus.
Las células de levadura recombinantes de la
invención contienen al menos un gen de D-LDH exógeno
integrado en su genoma. Lactobacillus helveticus, Lactobacillus
johnsonii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii,
Lactobacillus plantarum y Lactobacillus pentosus son
cepas que tienen D-lactato deshidrogenasas
adecuadas que pueden obtenerse mediante, entre otras, técnicas
genéticas recombinantes para su uso en este documento. Un gen de
D-lactato deshidrogenasa preferido es la
D-lactato deshidrogenasa de L. helvelticus.
La célula puede contener múltiples genes de LDH exógenos, es decir,
al menos dos de dichos genes, preferiblemente aproximadamente
2-10 de dichos genes, más preferiblemente
2-5 de dichos genes. Los genes de LDH insertados,
pueden ser todos el mismo gen, o pueden estar constituidos por dos o
más tipos diferentes de gen de LDH.
Un gen, promotor o terminador se considera que
es "exógeno" para fines de esta invención si (1) no se
encuentra en el genoma de la célula sin modificar, y (2) no es
homólogo del material genético presente en el genoma de la célula
sin modificar. Como se usa en este documento un gen, terminador o
promotor es "nativo" para la especie de levadura si se
encuentra (aparte de mutaciones de individuo a individuo que no
afectan a su función) dentro del genoma de las células sin
modificar de esta especie de levadura.
El gen de D-LDH exógeno se une
de forma operativa a secuencias promotoras y terminadoras
funcionales. Por "unido de forma operativa" se entiende, en el
contexto esta invención, que el promotor o terminador, cualquiera
que sea el caso, funciona después de la integración en el genoma de
la levadura para controlar el inicio y el fin, respectivamente, de
la transcripción del gen de D-LDH.
Como se usa en este documento, el término
"promotor" se refiere a una secuencia no transcrita situada
cadena arriba (es decir 5') del codón de inicio de la traducción de
un gen estructural (generalmente en aproximadamente 1 a 1.000 pb,
preferiblemente 1-500 pb, especialmente
1-100 pb) y que controla el inicio de la
transcripción de un gen estructural. El promotor puede ser nativo
para la célula hospedadora o puede ser exógeno. Los promotores
pueden ser aquellos que controlan la expresión de genes que están
implicados en el metabolismo central del carbono, por ejemplo,
promotores glicolíticos o promotores del gen del ciclo del TCA. Los
promotores adecuados incluyen los ejemplos no limitantes de
promotores de genes de levadura de fosfoglicerato quinasa
(PGK), gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa (TDH), piruvato descarboxilasa (PDC1),
triosa fosfato isomerasa (TP1), factor potenciador de la
transcripción 1 (TEF-1),
purina-citosina permeasa (PCPL3), y alcohol
deshidrogenasa (ADH). Los promotores preferidos de la
invención incluyen los promotores TEF-1 (S.
cerevisiae), PGK (S. cerevisiae) y PDCI (S. cerevisiae, K.
marxianus).
En realizaciones en las que se desea integrar
el(los) genes de D-LDH en un locus diana del
genoma de la célula de levadura, la secuencia promotora es homóloga
a la secuencia promotora del gen al que se dirige la inserción. El
gen diana es preferiblemente un gen de piruvato descarboxilasa
(PDC). Los genes diana ventajosos adicionales incluyen alcohol
deshidrogenasa (ADH),
oroditina-5'-fosfato descarboxilasa
(ura3), y 3-isopropilmalato deshidrogenasa
(leu2).
Análogamente, el término "terminador" se
refiere a una secuencia no transcrita situada cadena abajo (es
decir, 3') del codón de terminación de la transcripción de un gen
estructural (generalmente a aproximadamente 1 a 1.000 pb, más
típicamente 1-500 pares de bases y especialmente
1-10 pares de bases) y que controla el fin de la
transcripción del gen estructural. El terminador puede ser exógeno o
nativo a la especie de levadura. Los terminadores exógenos
adecuados incluyen los terminadores GAL10 y CYC-1 de
S. cerevisiae o de otras especies de levadura.
Como con los promotores, en algunas
realizaciones, la secuencia terminadora es homóloga a una secuencia
terminadora del gen diana.
Un gen, promotor, terminador u otro material
genómico se considera que es "homólogo" a otro material
genético si es idéntico, es decir tiene al menos el 90%, 91% ,92%
,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o aproximadamente el 99% de
identidad en la secuencia de nucleótidos con respecto al otro
material genético o si no es idéntico, es lo suficientemente
similar al mismo, para conservar su función. Por lo tanto, se
considera que el material genético es "homólogo" incluso si
contiene diferencias debidas a, por ejemplo, mutaciones puntuales,
deleciones o adiciones de pares de bases, siempre que estas
mutaciones, deleciones o adiciones no afecten a la función del
material genético. En el caso de las secuencias de flanqueo, la
homología se establece si la secuencia es lo suficientemente
similar a una secuencia de flanqueo del gen nativo de modo que la
secuencia de flanqueo pueda encajar en un único suceso de
cruzamiento con la secuencia de flanqueo del gen nativo.
El término "identidad", como se conoce en
la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o
más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido
nucleico, según lo determinado comparando las secuencias de los
mismos. En la técnica, "identidad" también significa el grado
de relación de las secuencias entre moléculas de ácido nucleico o
polipeptídico, según sea el caso, de acuerdo con lo determinado
mediante el emparejamiento entre hileras de dos o más nucleótidos o
dos o más secuencias de aminoácidos. "Identidad" mide el
porcentaje de emparejamientos idénticos entre la más pequeña de dos
o más secuencias con alineamientos de huecos (si hubiera alguno)
conseguido mediante un modelo matemático o programa informático
particular (es decir, "algoritmos").
El término "similitud" se usa en la técnica
con respecto a un concepto relacionado, pero al contrario que
"identidad", "similitud" se refiere una medición de la
relación, que incluye emparejamientos idénticos y emparejamientos
de sustituciones conservativas. Si dos secuencias polipeptídicas,
tienen, por ejemplo 10/20 aminoácidos idénticos, y el resto son
todos sustituciones no conservativas, entonces, el porcentaje de
identidad y similitud serían los dos del 50%. Si en el mismo
ejemplo, hay 5 posiciones más donde existen sustituciones
conservativas, entonces el porcentaje identidad sigue siendo el
50%, pero el porcentaje de similitud sería del 75% (15/20). Por lo
tanto, en los casos donde hay sustituciones conservativas, el
porcentaje de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el
porcentaje de identidad entre estos dos polipéptidos.
La identidad y la similitud de polipéptidos y
ácidos nucleicos relacionados pueden calcularse fácilmente mediante
métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitación,
los descritos en los documentos COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY,
(Lesk, A.M. ed.), 1988, Oxford University Press, New York;
BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.);
1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,
Parte. 1, (Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana
Press, New Jersey; von Heinje, G. SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR
BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER (Grisbskov,
M. y Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New Cork;
Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math, 48: 1073; y
Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge
University Press.
Los métodos preferidos para determinar la
identidad se diseñan para dar el mayor emparejamiento entre las
secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad se
describen en programas informáticos disponibles para el público.
Los métodos de programa informáticos preferidos para determinar la
identidad entre dos secuencias incluyen, aunque sin limitación, el
paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al.,
1984, Nucl. Acid. Res., 12: 386; Genetics Computer Group,
University of Wisconsin, Madison WI), BLASTP, BLASTN, y FASTA
(Altschul et. al., 1990, J. Mol. Biol., 215:
403-410). El programa BLASTX está disponible para el
público del National Center for Biotechonology Information (NCBI) y
de otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH
Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, supra).
También puede usarse el muy conocido algoritmo de
Smith-Waterman para determinar la identidad.
Algunos esquemas de alineamiento para alinear
dos secuencias de aminoácidos o de polinucleótidos pueden dar como
resultado el emparejamiento de solamente una corta región de las dos
secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una
identidad de secuencia muy alta incluso aunque no exista una
relación significativa entre las dos secuencias de longitud
completa. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método de
alineamiento seleccionado (programa GAP) dará como resultado un
alineamiento que abarque al menos 50 aminoácidos adyacentes del
polipéptido diana. En algunas realizaciones, el alineamiento puede
comprender al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110 ó 120 aminoácidos del
polipéptido diana. Si los polinucleótidos se alinean usando GAP, el
alineamiento puede abarcar al menos aproximadamente 100, 150 ó 200
nucleótidos, que pueden ser adyacentes.
Por ejemplo, usando el algoritmo informático GAP
(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI),
dos polipéptidos para los que se determinará el porcentaje de
identidad de secuencia se alinean para un emparejamiento óptimo de
sus aminoácidos respectivos (el "tramo emparejado", según lo
determinado por el algoritmo), en algunas realizaciones, una
penalización de apertura de hueco (que se calcula como tres veces
la diagonal media; donde la "diagonal media" es la media de la
diagonal de la matriz de la comparación que se usa; la
"diagonal" es el valor o número asignado a cada emparejamiento
de aminoácidos perfecto en la matriz de comparación particular) y
una penalización de extensión del hueco (que es normalmente un
décimo de penalización de apertura de hueco), así como un matriz de
comparación tal como PAM250 o BLOSUM 62 se usan junto con el
algoritmo. En algunas realizaciones, también se usa una matriz de
comparación patrón (véase Dayhoff et al., 1978, Atlas of
Protein Sequence and Structure, 5: 345-352 para la
matriz de comparación PAM 250; Heinkoff et al, 1992, Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915-10919 para la matriz
de comparación BLOSUM 62) junto con el algoritmo.
En algunas realizaciones, los parámetros para
una comparación de secuencia polipéptídica incluyen los
siguientes:
- Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48: 443-453;
- Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra;
- Penalización de hueco: 12
- Penalización de longitud del hueco: 4
- Umbral de similitud: 0
El programa GAP puede ser útil con los
parámetros anteriores. Para secuencias de nucleótidos, los
parámetros pueden incluir una penalización de hueco de 50 y una
penalización de longitud del hueco de 3, que es una penalización de
3 para cada símbolo en cada hueco. En algunas realizaciones, los
parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto
para comparaciones de polipéptidos (junto con ninguna penalización
para huecos finales) usando el algoritmo GAP.
Las células de levadura pueden tener otras
diversas modificaciones con respecto a su genoma natural. Por
ejemplo, la célula de levadura puede contener diversos genes
marcadores de selección, como se sigue describiendo a continuación,
junto con secuencias promotoras y/o terminadoras asociadas. La
célula de levadura puede tener además un gen de PDC delecionado o
una alteración en un gen de PDC. Un método para delecionar el PDC
junto con la inserción del gen de D-LDH en el locus
del gen de PDC se describe más completamente a continuación. Otros
métodos para delecionar o alterar la actividad del PDC se describen
en el documento de Porro, "Development of metabolically
engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production
of lactic acid", Blotechnol. Prog. mayo-junio de
1995; 11(3): 294-8; Porro et al.,
"Replacement of a metabolic pathway for
large-scale production of lactic acid from
engineered yeasts", App. Environ. Microbiol. septiembre de 1999:
65-(9):4211-5; Blanchi et. al., "Efficient
homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective in
pyruvate utilization and transformed with the heterologus LDH
gene", App. Environ. Microbiol. diciembre de 2001;
67(12)5621-5; y WO 99/14335.
Las células de levadura recombinantes de la
invención pueden prepararse mediante la inserción de un fragmento
de ácido nucleico que contenga el gen de D-LDH unido
de forma operativa a una secuencia promotora. El fragmento
típicamente forma parte de un ácido nucleico recombinante que
también puede contener, y preferiblemente contiene, otros
elementos, incluyendo (a) una secuencia terminadora; (b) uno o más
gen(es) marcador(es) de selección (incluyendo un
promotor y un terminador asociados); (c) una o más secuencias de
flanqueo homólogas para insertar el fragmento en un locus
particular en el genoma de la célula hospedadora; (d) uno o más
sitios de restricción que permiten cortarlo para formar un
fragmento lineal que contenga el gen de LDH, sus promotores y sus
secuencias de flanqueo, genes marcadores y promotores y
terminadores asociados, etc., para la inserción en el genoma de la
célula de levadura; y/o (e) una porción estructural. La expresión
"ácido nucleico recombinante" se usa en este documento para
referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico,
plásmido o virus) usada para transferir información codificante de
la proteína a la célula hospedadora. Los métodos para transformar
células se conocen bien en la técnica, y pueden incluir aquellos
ejemplos no limitantes tales como electroporación, métodos basados
en cloruro de calcio o acetato de litio. El ADN usado en las
transformaciones puede cortarse con enzimas de restricción
particulares o puede no cortarse.
Como se usa este documento, la expresión
"genes marcadores de selección" se refiere al material genético
que codifica una proteína necesaria para la supervivencia y/o para
el cultivo de una célula hospedadora que se cultiva en un medio de
cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos
codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u
otras toxinas, por ejemplo, zeocina (gen sh ble de
Streoptoalloteichus hindustanus), G418 (gen de resistencia a
kanamicina de Tn903), higromicina (gen de resistencia al antibiótico
aminoglicósido de E. coli), ampicilina, tetraciclina o
kanamicina para células hospedadoras; (b) complementan deficiencias
auxótrofas de la célula y/o suministran nutrientes críticos no
disponibles en medios sencillos, tales como deficiencia del
aminoácido leucina (gen Leu2 de K. marxianus); o un gen ura3
de K. marxianus que proporciona uracilo a células negativas
para orotidina 5' fosfato descarboxilasa. Los marcadores
seleccionables preferidos incluyen los ejemplos no limitantes del
gen de resistencia a zeocina, gen de resistencia a G418, y el gen de
resistencia a higromicina.
Las porciones estructurales se obtienen
convenientemente de vectores de levadura disponibles en el
mercado.
Los métodos adecuados para trasformar células de
levadura para insertar un gen de LDH exógeno se describen en los
documentos WO 00/1738A1 y WO 02/42471A1. Los métodos descritos en
estos documentos son aplicables en general para fabricar las
células de levadura recombinantes de esta invención, con la
sustitución de los genes de L-LDH descritos en estos
documentos con un gen de D-LDH.
Los términos "transformantes" y
"transformación" como se usan en este documento se refieren a
un cambio en las características genéticas de una célula, y una
célula se ha transformado cuando se ha modificado para que contenga
un nuevo ácido nucleico. Por lo tanto, una célula se transforma
cuando se modifica genéticamente a partir de su estado nativo. Por
ejemplo, después de la transfección, el ADN transformante se
recombina preferiblemente con ADN genómico celular integrándose
físicamente en un cromosoma de la célula. Como alternativa, y al
menos de forma transitoria (por ejemplo, en 48-96
horas de transformación celular), el ácido nucleico puede mantenerse
de forma transitoria como un elemento episomal sin replicarse, o
puede replicarse de forma independiente como plásmido. Se considera
que una célula se ha transformado de forma estable, cuando el ADN se
integra en el cromosoma y se replica junto con la división de la
célula.
La expresión "transfección" se usa para
referirse a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula
\alpha, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN
exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. Se
conocen varias técnicas de transfección en la técnica. Véase por
ejemplo, Graham et. al., 1973. Virology 52: 456; Sambrook
et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold
Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier y Chu et al., 1981,
Gene 13: 197. Dichas técnicas pueden usarse para introducir una o
más especies de ADN exógeno en células hospedadoras adecuadas.
Pueden integrarse en múltiples genes de
D-LDH mediante múltiples transformaciones. Sin
embargo, es posible construir un ácido nucleico recombinante que
contenga múltiples genes de D-LDH, permitiendo de
este modo que se inserten múltiples genes de LDH en una única
etapa.
Un método de transformación de particular
interés dirige la inserción del gen de D-LDH en el
locus de un gen diana de origen natural. Un gen diana es cualquier
gen que se desea reemplazar por el gen de LDH. Un gen diana
preferido es un gen de piruvato descarboxilasa, ya que el reemplazo
de este gen altera una ruta competidora que produce etanol. Además,
el gen del piruvato tiende a estar activo en especies de levadura,
de modo que la inserción del gen de LDH en el genoma bajo el
control de los promotores y terminadores PDC tiende a producir un
mutante que expresa bien LDH. ADH, Leu2 y Ura3 son genes diana
preferidos adicionales.
Preferiblemente, las células de levadura de la
invención se transforman con ácidos nucleicos recombinantes de la
invención, y se seleccionan mediante el cultivo de un medio
selectivo en el que el marcador seleccionable en el ácido nucleico
recombinante permite el crecimiento preferencial de los
transformantes. Las células transformadas se cultivan
preferiblemente después de la selección en condiciones no
selectivas. En estas condiciones, se obtienen células de levadura
recombinantes que tienen el gen de D-LDH exógeno que
comprende el ácido nucleico recombinante integrado en el locus
genético del gen diana en el cromosoma de la levadura. Ya que se han
obtenido de acuerdo con los métodos de esta invención, estas
células tienen delecionado el gen diana, y el gen de
D-LDH exógeno, integrado, se inserta en el locus
del gen diana de modo que se una de forma operativa y bajo el
control transcripcional de las secuencias de control de la
expresión (tales como la secuencia promotora y terminadora) del gen
diana. Cuando el gen diana es un gen de PDC, las células en las que
se produce la deleción de PDC no crecen bien en condiciones
anaerobias. Por lo tanto, las colonias de las células identificadas
y seleccionadas pueden seleccionarse exponiéndolas a condiciones
anaerobias. Las colonias que no crecen se identifican como aquéllas
en las que se ha producido la deleción de PDC. Análogamente, la
integración dirigida en cualquier otro gen diana puede
identificarse mediante el fenotipo asociado con la deleción de cada
uno de los genes diana.
La célula de levadura resultante carece del gen
diana, y contiene un gen de D-LDH exógeno integrado
en el genoma de la célula de levadura en el locus del gen diana. El
gen de LDH está bajo control transcripcional de una secuencia
promotora y una secuencia terminadora que son homólogas a la
secuencia promotora y terminadora del gen diana.
Las secuencias promotoras y terminadoras del
D-LDH pueden ser aquellas que estaban presentes en
las secuencias de flanqueo contenidas en el ácido nucleico
recombinante que se usó para transformar la célula, o pueden ser
aquellas que estaban originalmente presentes en el genoma de la
célula en el sitio de integración. También es posible que el
terminador del gen diana se conserve con la deleción de la secuencia
terminadora que estaba presente en el vector de integración.
La secuencia de flanqueo puede estar
inmediatamente adyacente al gen de D-LDH, o separada
de este gen por una secuencia intermedia de pares de bases, tal
como 1-1.000, preferiblemente 1-100
pares de bases. Las secuencias de flanqueos usadas en los ácidos
nucleicos recombinantes de esta invención son preferiblemente
homologadas a las secuencias de flanqueo correspondientes del gen
diana. Las longitudes de las secuencias de flanqueo típicas son
desde aproximadamente 50 a aproximadamente 4.000 pares de bases,
preferiblemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.000
pares de bases, y especialmente de hasta aproximadamente 1.200 pares
de bases. Las secuencias de flanqueo contienen preferiblemente una
secuencia promotora (terminadora en el caso de una secuencia de
flanqueo cadena abajo), cada una homóloga a la del gen diana. En
realizaciones preferidas, las secuencias de flanqueo son
homologadas a y comprenden secuencias promotoras y terminadoras,
respectivamente, para levadura nativa. Más preferiblemente, la
integración del ácido nucleico recombinante en el locus del gen
diana en el ADN cromosómico del genoma de la levadura da como
resultado que el gen de D-LDH exógeno codificado
por éste, está bajo el control transcripcional de las secuencias
reguladoras de la expresión del gen nativo que comprenden dichas
secuencias de flanqueo.
Pueden obtenerse secuencias de flanqueo
adecuadas identificando el sitio de integración pretendido en el
genoma de la célula de levadura, clonando las secuencias que
flanquean a este sitio (usando cualquier método convencional) y
uniendo esas secuencias en la posición deseada en el ácido nucleico
recombinante.
Además, el ácido nucleico recombinante incluye
preferiblemente uno o más genes marcadores de selección, que están
más preferiblemente bajo el control transcripcional de sus propias
secuencias promotora y terminadora. En esta realización, las
secuencias promotoras y terminadoras de los genes marcadores
preferiblemente no son secuencias promotoras y terminadoras para el
gen diana. El(los) gen(es) marcador(es) de
selección y sus promotores y terminadores respectivos
preferiblemente no interrumpen la secuencia de: secuencia de
flanqueo cadena arriba - gen de LDH - secuencia de flanqueo cadena
bajo del ácido nucleico recombinante. El(los) gene(s)
marcador(es) de selección y sus promotores y terminadores
respectivos están situados preferiblemente en el ácido nucleico
recombinante cadena arriba (5') de la secuencia de flanqueo cadena
arriba.
Un gen diana es cualquier gen que se desea
reemplazar por el gen de LDH. Un gen diana preferido es un gen de
piruvato descarboxilasa, ya que el reemplazo de este gen altera una
ruta competidora que produce etanol. Además, el gen de piruvato
tiende a ser activo en especies de levaduras, de modo que la
inserción del gen de LDH en el genoma bajo el control de los
promotores y terminadores de PDC tiende a producir un mutante que
expresa bien LDH. Los genes diana preferidos adicionales incluyen
alcohol deshidrogenasa (ADH), oroditina 5'-fosfato
descarboxilasa (ura3) y 3-isopropilmalato
deshidrogenada (leu2).
La célula de levadura resultante carece del gen
diana, y contiene un gen de D-LDH exógeno integrado
en el genoma de la célula de la levadura en el locus del gen diana.
El gen de D-LDH está bajo el control transcripcional
de una secuencia promotora y una secuencia terminadora que son cada
una homólogas a las secuencias promotoras y terminadoras,
respectivamente, del gen diana.
En esta realización, las secuencias promotora y
terminadora de LDH pueden ser aquellas que estaban presentes en el
ácido nucleico recombinante que se usó para transformar la célula, o
pueden ser aquellas que estaban originalmente presentes en el
genoma de la célula en el sitio de integración. Después del primer
suceso de cruzamiento, el gen de D-LDH insertado se
une de forma operativa a las secuencias promotoras y terminadoras
que estaban presentes en el vector de integración. Después del
segundo suceso de cruzamiento, cualquiera de o las dos secuencias
promotora y terminadora pueden reemplazarse por el promotor y/o
terminador de PDC nativo. Por ejemplo, puede conservarse el
promotor PDC nativo con deleción de la secuencia promotora que se
suministra con el vector de integración. También es posible que el
terminador de PDC nativo se conserve con deleción de la secuencia
terminadora que estaba presente en el vector de integración.
La célula de levadura transformada de la
invención es útil para producir ácido D-láctico a
partir de azúcares en un proceso de fermentación. La célula
preferiblemente contiene un gen de L-LDH no
funcional, o si contiene un gen de L-LDH funcional,
su actividad es tal que al menos el 90%, preferiblemente al menos el
95%, más preferiblemente al menos el 99,0%, y aún más
preferiblemente al menos el 99,5% del ácido láctico producido por la
célula es el isómero D.
La fermentación puede realizarse usando
cualquier método de fermentación conveniente. Típicamente, a la
célula se le suministra un hidrato de carbono que es capaz de
metabolizar a piruvato, y se le expone a condiciones en las que se
produce la fermentación. El medio de fermentación también contiene
nutrientes (tales como fuentes de nitrógeno, fósforo, azufre,
minerales traza, etc.) que favorecen la viabilidad de las
células.
Los hidratos de carbono particulares que pueden
usarse dependen de la célula hospedadora particular, y de si la
célula hospedadora se ha manipulado para metabolizar cualquier
hidrato de carbono particular a piruvato. Se prefieren azúcares de
hexosa tales como glucosa y fructosa, oligómeros de glucosa tales
como maltosa, isomaltosa, maltotriosa, almidón y sacarosa,
maltodextrinas y xilosa (un azúcar de pentosa). Los hidratos de
carbono preferidos incluyen galactosa, manosa y arabinosa.
La temperatura durante la fermentación puede ser
desde aproximadamente temperatura ambiente, más preferiblemente
desde aproximadamente 30ºC, más preferiblemente desde
aproximadamente 35ºC, a aproximadamente 55ºC, más preferiblemente
hasta aproximadamente 50ºC, aún más preferiblemente hasta
aproximadamente 45ºC. La temperatura máxima dependerá en parte de
la célula hospedadora particular. Cuando la célula hospedadora es
K. marxianus, por ejemplo, la célula recombinante puede
tolerar temperaturas relativamente altas (tales como por encima de
40ºC y de hasta 50ºC, especialmente de hasta 45ºC). Otras especies
hospedadoras preferidas, C. sonorensis, pueden tolerar
temperaturas de hasta aproximadamente 40ºC. Esta tolerancia a altas
temperaturas proporciona la posibilidad de realizar la fermentación
a dichas altas temperaturas (reduciendo de este modo los costes de
refrigeración) sin una pérdida de productividad significativa. Otra
ventaja proporcionada por la buena tolerancia a altas temperaturas
es que sí la fermentación se contamina con un microorganismo no
deseado, en muchos casos el microorganismo no deseado puede
destruirse de forma selectiva calentando el medio de fermentación a
40ºC o más, especialmente 45ºC o más, sin dañar de forma
significativa a las células deseadas de la invención.
Durante la fermentación, la concentración de
células en el medio de fermentación está típicamente en el intervalo
de aproximadamente 1-150, preferiblemente de
aproximadamente 3-10, aún más preferiblemente de
aproximadamente 3-6 g de células secas/litro de
medio de fermentación.
Durante la fase de producción de la
fermentación, en algunos casos puede ser preferible operar en
condiciones microaerobias en lugar de estrictamente anaerobias. Las
condiciones de aireación óptimas pueden establecerse para cada
microorganismo midiendo los índices específicos de captación de
oxígeno (OUR) y correlacionando estos índices con los índices de
rendimiento, consumo de sustrato y el índice al que se produce el
producto de fermentación deseado. En muchos casos, los índices y el
rendimiento se optimizan dentro de un intervalo particular de OUR.
Para levaduras que tienen una alteración de PDC, los valores de OUR
óptimos tienden a estar dentro del intervalo de aproximadamente 0,8
a aproximadamente 3,5 mmol O_{2}/peso seco de células/hora. El
OUR se refiere al índice al que se consume oxígeno por las células
durante la fermentación, y se expresa en unidades (mmoles o gramos)
de oxígeno por peso seco de células por unidad de tiempo, tal como
mmoles de O_{2}/peso seco de células/hora. El consumo de oxígeno
se determina convenientemente midiendo el oxígeno introducido en la
fermentación y el oxígeno eliminado de la fermentación. Pueden
usarse mediciones de OUR como una base para controlar las
condiciones de aireación (particularmente el índice de introducción
de gas, la agitación, la proporción de oxígeno en el gas de
aireación, etc.) durante la fase de producción de una fermentación
para mantener el OUR dentro del intervalo que es óptimo para el
organismo particular. La concentración de oxígeno disuelto en el
caldo se mantiene simultáneamente a menos del 1% de saturación,
particularmente a menos de 10 micromoles de O_{2}/l. En un
proceso particularmente preferido, se realiza una fase de cultivo
de la fermentación de modo que la concentración de oxígeno disuelto
en el caldo se reduce a menos del 1% de saturación, particularmente
menos de 10 micromoles de O_{2}/l durante un período de tiempo,
tal como aproximadamente 15-90 minutos, antes del
comienzo de la fase de producción (es decir, cambiando desde
condiciones aerobias en la fase de cultivo a condiciones
microaerobias en la fase de producción).
A medida que se produce ácido
D-láctico, el pH del medio de fermentación tiende a
caer, a menos que se añada una base para neutralizar todo o parte
del ácido a medida que se forma. En una realización del proceso de
fermentación, se añade un agente neutralizante tal como carbonato
cálcico, hidróxido de calcio, carbonato sódico, hidróxido de sodio,
amoníaco, hidróxido de amonio y similares al caldo de fermentación
para mantener el pH dentro de un intervalo deseado, típicamente
desde aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0, especialmente
desde aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5. Cuando se añade
dicha base, se forma la sal de lactato correspondiente. La
recuperación del ácido láctico implica por lo tanto regenerar el
ácido láctico libre. Esto se realiza típicamente separando las
células y acidulando el caldo de fermentación con un ácido fuerte
tal como ácido sulfúrico. Se forma un subproducto de sal (yeso en
el caso en el que una sal de calcio es en el agente neutralizante y
ácido sulfúrico es el agente acidulante), que se separa del ácido
láctico. Después se recupera el ácido láctico a través de técnicas
tales como extracción de líquido-líquido,
destilación, absorción, etc., tal como se describe en los
documentos T.B. Vickroy, Vol. 3, Capítulo 38 de Comprehensive
Biotechonology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon,
Oxford, 1985; R. Datta, et. al., FEMS Microbiol. Rev., 1995;
16: 221-231; Patente de Estados Unidos Nº.
4.275.234, 4.771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406, y
5.831.122, y Solicitud de Patente Internacional Nº WO 93/00440.
Como alternativa, puede permitirse que el pH de
la fermentación caiga a medida que se produce ácido láctico por las
células. De este modo, el pH del caldo de fermentación puede entrar
en el intervalo de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5,0,
preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4,2, más
preferiblemente desde aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3,86
(el pKa del ácido láctico), especialmente desde aproximadamente 2,0
a por debajo del 3,86 debido a la producción de ácido láctico. La
realización de la fermentación de esta manera puede proporcionar
varios beneficios, si se consiguen una productividad y un
rendimiento aceptables. Los costes de agente neutralizante se
reducen o se eliminan. Si el pH de fermentación (al final de la
fermentación) está por debajo del pKa del ácido láctico, el ácido
láctico existirá principalmente en forma ácida. Esto permite
eliminar la etapa de acidulación, ahorrando etapas adicionales del
proceso, costes de acidulación y costes de eliminación de desechos
de subproductos de sales. Por lo tanto, un proceso especialmente
preferido incluye seguir con la fermentación hasta que el pH del
caldo de fermentación caiga por debajo de 3,86. El ácido láctico
puede separarse del caldo de fermentación resultante usando métodos
tales como los que se describen en el documento WO 99/19290.
La capacidad de la célula de resistir un entorno
de bajo pH proporciona otro mecanismo por el cual puede eliminarse
la contaminación por microorganismos no deseados. El cultivo que
contiene la célula de la invención puede someterse a condiciones de
pH reducidas, tales como un pH de aproximadamente 1,
5-4, 2, preferiblemente de aproximadamente 2,0 a
3,86, durante un periodo de tiempo suficiente para destruir a los
microorganismos contaminantes que no sean tolerantes al ácido.
Para ser útiles en el mercado, las levaduras
recombinantes de la invención deben mostrar varias características.
La levadura debe convertir una proporción significativa del hidrato
de carbono en ácido láctico (es decir, producir un alto rendimiento
del producto). Debe mostrar una productividad altamente específica,
es decir, producir una gran cantidad de ácido láctico por peso de
célula por unidad de tiempo. Preferiblemente será tolerante a un pH
de fermentación por debajo de aproximadamente 5,0, preferiblemente
de aproximadamente 1,5 a 4,2, especialmente de 2,0 a 3,86, mientras
proporciona buenos rendimientos y productividades en estas
condiciones. La célula preferiblemente también es tolerante a altas
concentraciones de ácido D-láctico y/o sales de
ácido D-láctico, a valores de pH de
5,0-8,0 y preferiblemente a valores de pH de 1,5 a
5,0, preferiblemente de 1,5 a 4,2 y especialmente 2,0 a 3,86. Esta
última propiedad permite que el proceso de fermentación use altas
concentraciones del hidrato de carbono de
partida.
partida.
En general, es deseable que el proceso de
fermentación que emplea la célula recombinante de la invención
proporcione alguna o todas de las siguientes características:
- A.
- un rendimiento de al menos 30, preferiblemente al menos 40, más preferiblemente al menos 60, aún más preferiblemente al menos 75 gramos de ácido láctico por gramo de hidrato de carbono. El rendimiento teórico deseado es del 100%, pero los límites prácticos del rendimiento son aproximadamente del 98% (g/g). B. una productividad específica de al menos 0,1, preferiblemente al menos 0,3, más preferiblemente al menos aproximadamente 0,4, especialmente al menos aproximadamente 0,5 gramos de ácido D-láctico/gramo de células/hora. Es deseable que las productividades específicas sean lo más altas posible. C. Un título (concentración máxima de ácido D-láctico) de al -15 gramos/litro de medio de fermentación, preferiblemente al menos 20 g/l, más preferiblemente al menos 40 g/l, aún más preferiblemente al menos 80 g/l, hasta 150 g/l, preferiblemente hasta aproximadamente 120 g/l. La temperatura del medio de fermentación afecta en parte al extremo superior de títulos alcanzables fácilmente, ya que las soluciones de ácido láctico altamente concentrado (es decir, por encima de aproximadamente 150 g/litro) tienden a volverse muy viscosas o a gelificar a temperaturas por debajo de aproximadamente 35ºC. El uso de una temperatura de fermentación alta, tal como de aproximadamente 35-50ºC, permite altos títulos sin gelificación o formación de viscosidad indebida.
Se ha descubierto que las células recombinantes
de la invención proporcionen rendimientos de hasta el
92-98%, productividades volumétricas de
1,5-2,2 g/l/h y títulos de 81-90 g/l
cuando se usan en una fermentación neutra (pH
5,0-8,0) sobre glucosa. En fermentaciones a pH
bajos, en las que se deja caer el pH hasta aproximadamente 3,0, se
ha descubierto que las células de la invención proporcionan
rendimientos del 80% o más y títulos de 1,2-3,3
g/l. En todos los casos estos resultados se han obtenido sin
optimización de las condiciones de fermentación.
Además, el proceso de fermentación de la
invención alcanza preferiblemente una alta productividad en volumen.
La productividad en volumen se expresa como la cantidad del
producto producido por unidad de volumen de medio de fermentación
por unidad de tiempo, típicamente gramo de producto/litro de
medio/hora de tiempo. Las productividades en volumen de al menos
1,5 g/l/h, preferiblemente al menos 2,0 g/l/h, más preferiblemente
de al menos 2,5 g/l/h son deseables. A las densidades celulares
preferidas de hasta 3-6 g de célula/litro de medio
de fermentación, las productividades máximas tienden hasta
aproximadamente 5,0 g/l/h, y más típicamente hasta aproximadamente
4,0 g/l/h. Es muy preferible realizar la fermentación de modo que se
consigan estas productividades de volumen cuando el pH y la
temperatura del medio, o ambos estén en los intervalos descritos en
el párrafo anterior.
El ácido láctico producido de acuerdo con la
invención es útil para producir lacturo, un anhídrido cíclico de
dos moléculas de ácido láctico. Dependiendo del esterisómetro del
ácido láctico, el lacturo puede ser D-lacturo
(preparado a partir de dos moléculas de ácido
D-láctico), L-lacturo (preparado a
partir de dos moléculas de ácido L-láctico), o
D-L-lacturo (preparado a partir de
una molécula de ácido L-Láctico y una de ácido
D-láctico). Un método adecuado para producir
lacturo a partir de ácido láctico es mediante un método de
polimerización/despolimerización como se describe en el documento
USP 5.142.023 de Gruber et al.
El lacturo, a su vez, es particularmente útil
como monómero para la producción de polímeros y copolímeros de
polilacturo (PLA). Los procesos para prepararlos se describen
también en el documento USP 5.142.023 de Gruber et al. Los
productos de PLA preferidos son polímeros estables a la fusión como
se describen en el documento USP 5.338.822 de Gruber et al.
El PLA puede ser semi-cristalino o amorfo.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
algunas realizaciones de la invención y no limitan su alcance
o
espíritu.
espíritu.
El plásmido de expresión pNC2 (Fig. 1), se
generó combinando el promotor PGK1 de S. cerevisiae y
el terminador GAL10 de S. cerevisiae en el vector
estructural pGEMSZ (+) (Promega, Wisconsin). El promotor
PGK1 de S. cerevisiae y el terminador GAL10
estaban separados por una región poli-enlazadora con
los sitios de restricción XbaI, EcoRI y BamHI
para insertar genes particulares a expresar entre el promotor y el
terminador de la levadura.
Se usó un promotor de PGK1 de S.
cerevisiae que tenía las secuencias siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Éste se obtuvo mediante un fragmento de
restricción del plásmido pBFY004. Como alternativa, puede obtenerse
mediante amplificación por PCR usando ADN cromosómico de S.
cerevisiae como plantilla y cebadores diseñados en base a la
secuencia:
El terminador GAL10 de S.
cerevisiae usado tenía la secuencia siguiente:
\newpage
Esta secuencia se obtuvo como un fragmento de
restricción del plásmido pBFY004. Como alternativa, puede obtenerse
mediante amplificación por PCR usando ADN cromosómico de S.
cerevisiae como plantilla y cebadores diseñados en base a la
secuencia:
El plásmido pNC4 que contenía una casete de
expresión basada en el promotor PDC1 y el terminador
GAL10 de S. cerevisiae se construyó y se usó como
vector de expresión general. Muchos de los genes marcadores se han
expresado bajo este promotor. El plásmido pNC4 se muestra en la Fig.
2.
La estructura del plásmido de pNC4 es pGEM5Z (+)
(Promega Corporation; Masidon, WI). El promotor PDC1 de
S. cerevisiae se amplificó por PCR usando los cebadores
PSPDCS1 (5'-CCA TCG ATA ACA AGC TCA TGC AAA
GAG-3'; SEC ID Nº 3) y PSPDCAS2
(5'-GCT CTA GAT TTG ACT GTG TTA TTT
TGCG-3'; SEC ID Nº 4) y usando ADN cromosómico de
la cepa GY5098 de S. cerevisiae como plantilla. Se realizó el
termociclado mediante 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a
56ºC, 1 minuto a 72ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos
a 72ºC usando la ADN polimerasa Pfu Turbo (Stratagene).
El terminador GAL10 de S.
cerevisiae se obtuvo como se ha descrito anteriormente. La Fig.
3A SEC ID Nº 41 y 3B SEC ID Nº 42 representan el fragmento que
comprende el promotor PGK1 y el terminador GAL10 con
múltiples sitios de clonación, y el promotor PDC1 y el
terminador GAL10 con múltiples sitios de clonación.
El ADN de B. megaterium que codifica el
gen de L-LDH se aisló de la siguiente de
manera. Se obtuvo B. megaterium a partir de la American Type
Culture Collection (ATCC Nº de Acceso 6458) y se cultivó en
condiciones convencionales. El ADN genómico se purificó a partir de
estas células usando un kit "Easy-DNA" de
Invitrogen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los cebadores
se diseñaron en base de la secuencia disponible en el Genbank para
el L-LDH de B. megaterium (Genbank Nº
de acceso M22305). Las reacciones de amplificación por PCR se
realizaron usando tampón de Perkin Elmer (MgCl_{2} 1,5 mM) y
polimerasa AmpliTaq Gold. Cada reacción contenía ADN genómico de
B. megaterium a una concentración de 6 ng/\mul, cada uno
de los 4 dNTP a una concentración de 0,2 mM, y cada uno de los dos
cebadores de amplificación BM1270 y BM179 a una concentración de 1
\muM, donde estos cebadores tienen la secuencia:
| BM1270: | 5'-CCT GAG TCC ACG TCA TTA TTC-3'; | SEC ID Nº 5 y |
| BM179: | 5'-TGA AGC TAT TTA TTC TTG TTAC-3'; | SEC ID Nº 6 |
Se realizaron las reacciones de acuerdo con las
siguientes condiciones de termociclado: incubación inicial durante
10 minutos a 95ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30
segundos a 50ºC y 60 segundos a 72ºC. Se purificó y aisló un
fragmento fuerte del producto (1.100 pb) usando electroforesis en
gel de agarosa, se clonó y se secuenció. La secuencia resultante
podía traducirse en un polipéptido que mostraba una homología
excelente con los genes conocidos que codifican
L-LDH (por ejemplo, Genbank Nº de Acceso
M22305).
La secuencia codificante para el gen que
codifica LDH de B. megaterium se unía de forma
operativa a un promotor del gen de la fosfoglicerato quinasa
(PGK) y un terminador transcripcional del gen GAL10,
ambos de la levadura S. cerevisiae. Se diseñaron dos
cebadores de oligonucleótidos, Bmeg5' y Bmeg3', en base a esta
secuencia para introducir sitios de restricción en los extremos de
la secuencia codificante del gen:
| Bmeg5': | 5'-GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TAC ACC-3'; | SEC ID Nº 7 y |
| Bmeg3': | 5'-ATGG ATC CTT ACA CAA CAA AAG CTC TGT CGC-3': | SEC ID Nº 8 |
Esta relación de amplificación se realizó usando
concentraciones de dNTP y cebadores, descritas anteriormente usando
polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) en el tampón suministrado por el
fabricante. El termociclado se realizó mediante una incubación
inicial durante 3 minutos a 25ºC, seguida de 20 ciclos de 30
segundos a 95ºC, 30 segundos a 50ºC y 60 segundos 72ºC, seguida de
una incubación final durante 9 minutos a 72ºC. El producto se
digirió mediante enzimas de restricción XbaI y BamHI
y se ligó en los sitios XbaI y BamHI del plásmido
pNC2. Este ligamiento dio como resultado que el promotor PGK
y el terminador GAL10 se unían de forma operativa a la
secuencia codificante de LDH de B. megaterium,
identificada como pVR24 (Fig. 4).
El marcador de resistencia a G418 se clonó en el
promotor PDC1 de S. cerevisiae y las construcciones
se denominaron pVR22 (se muestra en la Fig. 5). El terminador
GAL10 de S. cerevisiae se usó en este plásmido como
terminador para el gen de resistencia a G418. El gen de resistencia
a G418 se amplificó mediante PCR usando Polimerasa Pfu Turbo
(Stratagene) con cebadores 5'-GCT CTA GAT GAG CCA
TAT TCA ACG GGA AAC (fragmento 5' G; SEC ID Nº 9) y
5'-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC
(fragmento 3' G; SEC ID Nº 10) y el plásmido, pPIC9K (Invitrogen,
Carlsbad, CA), como plantilla. El termociclado se realizó incubando
inicialmente la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95ºC,
después mediante 35 ciclos de de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a
40ºC, 2 minutos a 72ºC, seguido de una incubación final de 10
minutos a 72ºC. El producto de PCR se digirió con BamHI y
XbaI y se aisló un fragmento de 821 pb y se ligó al fragmento
de 4.303 pb de BamHI-XbaI de pNC2. El plásmido
resultante tenía el promotor PGK y el terminador GAL10 unidos de
forma funcional al gen de resistencia a G418 y se llamó pVR22, y se
muestra esquemáticamente en la Fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pNC7 (Fig. 6) se construyó de la
siguiente manera. Se aisló la casete de expresión que contenía el
gen de LDH de B. megaterium bajo el control
transcripcional del promotor PGK y del terminador
GAL10 (S. cerevisiae) a partir de pVR24 en forma de
fragmento NotI, y se ligó en el plásmido pNC3 que se cortaba
con NotI, para dar pNC7. pNC3 se construyó ligando todo el
plásmido pKD1 (véase el documento de
Wesolowski-Louvel et. al., Nonconventional
Yeasts in Biotechnology; "Kluyveromyces lactis", págs.
139-201; K. Wolf ed.;
Springer-Verlag, Berlín 1996) linealizado con
Sph1 en el único sitio Sph1 de pTEF1/Zeo
(Invitrogen);
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pNC7 se transformó en K.
marxianus de tipo silvestre (cepa CD21) usando métodos
convencionales para dar una cepa recombinante NC39 que tenía el gen
de L-LDH de B. megaterium en un
plásmido pKD1 de copias múltiples.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSO21 se construyó utilizando los
cebadores SO-M2 5'-CTT CCA GTC CAG
CAG GTC GAC CAG-3'; SEC ID Nº 11, y
SO-M1 5'-GTC CAG CAT GTC GAC
CAG-3'; SEC ID Nº 12. Se usó ADN genómico de K.
marxianus (cepa CD21) como plantilla y los cebadores descritos
anteriormente usando metodologías de PCR convencionales y se obtuvo
un fragmento de 5,5 kb consecuente con el gen de PDC1 de K.
marxianus junto con su promotor, terminador y región grande
cadena arriba y cadena bajo del gen. El fragmento de 5,5 kb se clonó
en el plásmido pCRII (Invitrogen) para dar el plásmido pSO21 (Fig.
7a). El plásmido pSO27 (Fig. 7b) se sintetizó mediante amplificación
del PCR de fragmento de PDC1 de 3,3 kb (gen de PDC1,
promotor) a partir de pSO21 usando los cebadores
SO-M4 5'-GAA CGA AAC GAA CTT CTC
TC-3'; SEC ID Nº 13, y SO-M5
5'-CTT GGA ACT ACT TCT TGT CAG
TG-3'; SEC ID Nº 14, usando metodologías de PCR
convencionales. El fragmento resultante se purificó y se aisló
mediante electroforesis en gel, y se ligó posteriormente en pCRII
(Invitrogen) para dar
pSO27.
pSO27.
pSO28 (Fig. 8) se construyó digiriendo pSO27,
que alojaba a PDC1, con Bbsl para delecionar 417 pb
de la región codificante de PCD1. Las protuberancias
nucleotídicas resultantes se rellenaron con ADN polimerasa
Pfu (Stratagene). Este fragmento (ca. 2,9 kb) se ligó en un
fragmento NotI de extremo Pfu romo de pVR22 (Ejemplo
1C) que contiene el promotor PGK de S. cerevisiae y el
gen de resistencia a G418 seguido del terminador GAL10 de
S. cerevisiae.
Análogamente, se construyó pSO29 (Fig. 9)
digiriendo pSO27 con BbsI para delecionar 417 pb de la región
codificante de PDC1. Las protuberancias nucleotídicas se
rellenaron con ADN polimerasa Pfu (Stratagene). Este
fragmento se ligó en un fragmento Xhol/Xbal de extremo
Pfu romo de pTEF1/Zeo (Invitrogen) que contiene el
promotor TEF1 de S. cerevisiae y el gen de resistencia
a zeocina seguido de un terminador CYC1 de S.
cerevisiae.
Estas construcciones se realizaron para diseñar
diversas casetes de integración útiles para crear cepas de K.
marxianus que tengan un genotipo nulo para pdc1, con
diversos genes de selección integrados. En primer lugar se
seleccionan los transformantes para verificar la inserción de la
construcción en el locus de PDC1, y después se selecciona su
incapacidad para producir etanol y su incapacidad para crecer en
condiciones anaerobias. El suceso de recombinación preferido es un
doble cruzamiento en un PDC1 en el genoma. Sin embargo,
puede producirse un suceso de recombinación sencillo o doble, o
incluso puede ocurrir una mutagénesis de inserción de ADN.
\newpage
La cepa NC39 se seleccionó como hospedador de
transformación porque contiene el plásmido pNC7 en el hospedador
como un plásmido de replicación que contiene el
L-LDH en la estructura del pKD 1, cuya
presencia puede aumentar la probabilidad de una deleción en
PDC1 (véase, Chen XJ, et. al., Curr. Genet., agosto de
1989; 16(2):
95-8).
95-8).
Se cultivó NC39 durante una noche en YPD con 100
\mu/ml de zeocina (Invitrogen) para conservar el plásmido pNC7, y
la transformación se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo
de transformación química de levadura. Las células se cultivaron
durante una noche en 5 ml de medio YPD a 30ºC, con agitación a 250
rpm. El cultivo se diluyó con 50 ml de YPD, hasta una DO_{600} de
aproximadamente 0,2. Después el cultivo se incubó a 30ºC, con 250
rpm, hasta que la DO_{600} era de aproximadamente 3,0.
Después se recogieron las células mediante
centrifugado a 2.500 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en
50 ml de agua estéril. Las células se recogieron mediante
centrifugado a 2.500 rpm durante 5 min. El centrifugado de
resuspensión se repitió una vez. Después de esta etapa, el sedimento
celular se resuspendió en 1,0 ml de Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM,
acetato de litio 20 mM, pH 7,5. En un tubo de microcentrífuga se
añadieron: 4,0 \mug de un fragmento de ADN de pSO28 lineal
cortado con Sacl/Apal que contenía el marcador de
selección de G418 y la región de flanqueo de PDC1, 25 \mul
de ADN vehículo (Colette - 10 mg/ml sand solicited) y 500 \mul de
las células NC39 preparadas se añadieron y se mezclaron mediante
agitación con vórtice. A esto se le añadieron 3 ml de PEG al 40%,
Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, acetato de litio 20 mM, pH 7,5 y se
mezcló mediante agitación con vórtice. Después se incubó esta mezcla
durante 30 minutos a 30ºC, con agitación a 250 rpm. Después del
período incubación, se añadieron 350 \mul de DMSO y se mezclaron
mediante la inversión de los tubos. Las células se sometieron
después a un choque de calor a 42ºC durante 15 minutos, seguido de
una rápida refrigeración con hielo durante aproximadamente 3
minutos. Las células se sedimentaron mediante un golpe de
centrifuga de 10 segundos a 14.000 rpm y se retiró el sobrenadante.
Las células resuspendieron en 1 ml de YPD. Se permitió recuperar a
las células mediante una incubación durante 4 h a 30ºC, con
agitación a 250 rpm. Después del periodo de recuperación, las
células se sedimentaron y se retiró el sobrenadante. En este punto
las células se resuspendieron en un volumen final de aproximadamente
500 \mul de YPD. Se sembró una alícuota (20 \mul) de la
suspensión celular en una placa de selección y se sembraron
alícuotas de 100 \mul en otras 6 placas de selección. Se permitió
a las placas incubar a 30ºC hasta que se observó el crecimiento de
colonias.
Las placas usadas para esta transformación
contenían 300 \mug/ml de agente de selección (G418). Los
transformantes que crecían en estas placas primarias se trasladaron
después con pinzas a placas secundarias con la misma concentración
de agente de selección. Las colonias que crecían en estas placas
secundarias se seleccionaron mediante PCR, usando métodos
convencionales, para sucesos de integración en PDC1 usando un
cebador 3' cadena abajo y fuera del fragmento de integración (SO454
5'-CCA TCC GAA GAA GTC GAT CTC-3';
SEC ID Nº 15) y el cebador 5' que estaba dentro del gen de
resistencia a G418 (SO285 5'-CTT GCC ATC CTA TGG AAC
TGC-3'; SEC ID Nº 16). Mediante este análisis de
PCR solamente 1 de las 200 colonias era positiva. Se usó un análisis
de PCR adicional, usando métodos de PCR convencionales y cebadores
de PDC1 dirigidos al fragmento de Bbsl delecionado
del pSO27 (-SO2740 5'-GAA GGC TGG GAA TTG AGT
GA-3': SEC ID Nº 17 y -SO244 5'-GCT
CCA TCT GAA ATC GAC AG-3'; SEC ID Nº 18) para
confirmar la presencia de PDC1 de tipo silvestre intacto.
El único transformante positivo se aisló como
una única colonia, se usó para producir una solución madre de
glicerol, y se identificó como CD181. Después se recuperó la cepa
del plásmido pNC7 cultivando sin presión de selección, seguido de
la siembra de las células cultivadas en placas de agar YPD que
comprendía G418 (300 \mug/ml). Se tomaron cuatro colonias y se
ensayó su sensibilidad a zeocina y la carencia de producción de
ácido L-láctico. Las cuatro colonias mostraban
sensibilidad a zeocina y habían perdido la capacidad de producir
ácido L-láctico. Se seleccionó una única colonia y
se usó para producir una solución madre de glicerol, y se identificó
como CD 186.
Para crear una cepa de K. marxianus con
un fenotipo PDC- (sin producción de etanol y sin crecimiento en
condiciones anaerobias), era necesaria otra transformación de CD186.
Se transformó CD186 de acuerdo con el protocolo anterior, con 6,8
\mug de un fragmento de ADN de pSO29 linealizado, cortado con
NheI/NotI, que contenía el marcador de selección de
zeocina y la deleción en la región PDC1.
Los transformantes resultantes se sembraron en
placas de agar YPD que comprendían 300 \mug/ml de zeocina. Los
transformantes que crecían en estas placas primarias se sembraron
con pinzas en placas secundarias con 300 \mug/ml de G418 y 300
\mug/ml de zeocina. Las colonias que crecían en estas placas
secundarias se seleccionaron para la integración en el locus de
PDC1 mediante PCR, que ensayaba la ausencia del PDC1
del tipo silvestre, usando cebadores que están presentes en el
fragmento BbsI delecionado de pSO27, -SO2740
5'-GAA GGC TGG GAA TTG AGT GA-3';
SEC ID Nº 17 y SO2444 5'-GCT CCA TCT GAA ATC GAC
AG-3'; SEC ID Nº 18.
Se descubrió que 8 colonias tenían deleciones en
PDC1. Esto se verificó mediante análisis de PCR que mostraba
la deleción esperada para el PDC1 de tipo silvestre, y el
fenotipo de PDC (sin producción de etanol en cultivo anaerobio). Se
aislaron colonias sencillas de estos ocho transformantes y se
introdujeron en la colección Cargill Dow Culture. Estas 8 cepas
nulas para pdc1 de K. marxianus se nombraron CD214,
CD215, CD216, CD217, CD218, CD219, CD220 y CD221. Se ensayó en
CD215 la producción de etanol inoculando una colonia en 50 ml de
medio YPD en un matraz de agitación de 250. El cultivo se incubó a
30ºC con agitación a 70 rpm y un análisis de HPLC de las muestras no
detectó etanol.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un ácido nucleico recombinante que
otorgaba resistencia a higromicina a células de levadura
transformada, que permitía la selección de transformantes de
células de levadura que comprendían una construcción de ácido
nucleico recombinante que codificaba una proteína útil para la
síntesis de un producto orgánico. El marcador de resistencia a
higromicina (hph de E. coli) se clonó bajo el control
transcripcional del promotor PDC1 de Saccharomyces
cerevisiae.
El gen hph de E. coli que otorga
la resistencia a higromicina B se amplificó por PCR usando los
cebadores 5'HYGXBA1 (5'-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT
GAA CTC AC-3'; SEC ID Nº 19) y 3'HYGBAMH1
(5'-CGC GGA TCC CTA TTC CTT TGC CCT CGG
AC-3'; SEC ID Nº 20) y el plásmido pRLMex30 (véase,
por ejemplo, Mach et al. 1994, Curr. Genet. 25,
567-770; Rajgarhian et. al., solicitud de
Patente de Estados Unidos Nº 10/154.460, presentada el 23 de mayo
de 2002, incorporada como referencia en su totalidad) como
plantilla. El gen hph también puede obtenerse usando los
mismos cebadores con ADN cromosómico de E. coli como
plantilla. Se realizó un termociclado mediante 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 56ºC, 3 minutos a 72ºC, seguido de una
incubación final de 7 minutos a 72ºC usando ADN polimerasa Pfu
Turbo (Stratagene). El producto de PCR se separó mediante
electroforesis en un gel de agarosa 0,8% y se aisló el producto de
1.026 pb. El producto de PCR se digirió con XbaI
y BamHI y se ligó en el plásmido pNC4 cortado con XbaI y BamHI para dar el plásmido pPSI (véase Fig. 10).
y BamHI y se ligó en el plásmido pNC4 cortado con XbaI y BamHI para dar el plásmido pPSI (véase Fig. 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló D-LDH de
Lactobacillus helveticus de la siguiente manera. Las células
del Lactobacillus helveticus se obtuvieron de la American
Type Culture Collection (ATCC Nº de Acceso 10797) y se cultivaron
en condiciones convencionales. El ADN genómico se purificó a partir
de estas células usando el protocolo siguiente:
- 1.
- Se usó una única colonia de 5 \mul de una solución madre de glicerol de bacterias del ácido láctico para inocular 2 alícuotas de 50 ml de caldo MRS estéril en matraces estériles de 250 ml. El cultivo se incubó con agitación a 37ºC durante 48 horas a 170 rpm.
- 2.
- El cultivo se transfirió a tubos de 50 ml estériles con tapón azul y se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento celular se resuspendió en 50 ml de solución de sacarosa al 12,5% p/v y se centrifugó de nuevo a 3.000 rpm durante 10 minutos. Los sedimentos se resuspendieron y se combinaron en 5 ml de sacarosa al 12,5% p/v en un tubo de tapón azul estéril de 50 ml de Falcon (Nº de Cat. 29050). A la suspensión celular se le añadieron 5 ml de suspensión TES (TES es: Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 50 mM (pH 0,8), NaCl 50 mM filtrado en condiciones estériles). Se añadieron otros 5 ml de solución de sacarosa al 25% p/v y después se mezcló. Se añadió polvo de lisozima (300 mg) a la suspensión y se agitó con vórtice para mezclarlo. Una vez mezclado minuciosamente, se añadieron 25 \mul de una solución de mutanolisina (concentración de la solución madre 2,2 mg/ml) a la mezcla. La suspensión se incubó durante una noche (\sim10-12 h) a 37ºC.
- 3.
- Después de la incubación durante una noche, se añadieron 2,5 ml de una solución de SDS al 20% y 168 \mul de una solución de Proteinasa K (concentración de la solución madre de 28 mg/1,4 ml). El tubo se mezcló mediante inversión, pero no se agitó. El tubo se incubó a 50ºC durante 1 hora. En este punto el material de la membrana celular parecía romperse y la solución se volvía translúcida. Se añadió NaCI suficiente para obtener una concentración de 0,15 M en la solución. La solución se mezcló minuciosamente mediante inversión.
- 4.
- La mezcla se transfirió a un tubo Oakridge de 50 ml (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA) o se repartió entre dos tubos y se trató con un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). La mezcla se agitó y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos.
- 5.
- El sobrenadante acuoso se retiró a un tubo Oakridge transparente y se le añadió un volumen igual de cloroformo. La solución se mezcló agitando y se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos.
\newpage
- 6.
- El sobrenadante se extrajo mediante aspiración con sifón y se colocó en otro tubo. Al sobrenadante se le añadieron 25 \mul de ARNasa (concentración de la solución madre de 100 mg/ml), que se mezclo mediante inversión. El tubo se incubó desde 37ºC durante 15 minutos. Se añade ARNasa libre de ADNasa en exceso, para degradar rápidamente el ARN.
- 7.
- Finalmente, se añadieron 2,5 volúmenes de EtOH a la mezcla dispensándolo cuidadosamente a o largo de las paredes del tubo. La capa de EtOH no se mezcló. El ADN que se forma en el interfaz líquido se enrolló alrededor de una pipeta de vidrio y se lavó en EtOH al 70%. El ADN se secó al aire y se resuspendió en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 (tampón de elución en la mayoría los kits de Qiagen) en un tubo de microcentrífuga. El tubo se incubó a 50ºC hasta que el ADN se disolvió.
Se diseñaron cebadores en base a la secuencia
disponible del Genbank para D-LDH del L.
helvelticus (Genbank Nº de Acceso U07604 o Nº X66723 (SEC ID Nº
43)). Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron usando
polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, WI, USA). Cada reacción contenía
ADN genómico de L. helveticus a una concentración de 500 ng,
cada uno de los 4 dNTP a una concentración de 0,2 mM y cada uno de
los cebadores de amplificación VR150 5'-GGT TGG ATT
TAT GAC AAA GGT TTT GCTT-3': SEC ID Nº 21) y VR153
5'-AAT TAA AAC TTG TTC TTG TTC AAA GCA
ACT-3'; SEC ID Nº 22) a 1 \muM. Las reacciones se
realizaron de acuerdo con las siguientes condiciones de ciclado:
una incubación inicial durante 10 minutos a 25ºC, seguido de 35
ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 51ºC y 60 segundos a
72ºC. Un fragmento fuerte del producto de 1.027 pb se purificó en
gel usando procedimientos convencionales y se clonó en TA en el
vector de clonación PCR -BlunfII topo (Invitrogen, Carlsbad, CA).
El plásmido resultante se secuenció y se denominó pVR43 (se muestra
en la Fig. 11a). La secuencia resultante podría traducirse a un
polipéptido que mostraba una homología excelente con el gen
codificante de D-LDH de L. helveticus
conocido en el Genbank (Nº Acceso U07604 o Nº X66723).
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron cebadores para introducir sitios
XbaI y BamHI en el extremo 5' y 3' del gen de
D-LDH para clonarlo en pNC2. La reacciones
de amplificación por PCR se realizaron usando polimerasa Pfu Turbo
(Stratagene, Wisconsin, USA). Cada reacción contenía pVR43 (que
alojaba al D-LDH de L. helvelticus) (5
ng) cada uno de los 4 dNTP a una concentración de 0,2 mM y cada uno
de los cebadores de amplificación VR165 5'-CGT CTA
GAT TTA TGA CAA AGG TTT TGCT-3'; SEC ID Nº 23 y
VR166 5'-GCG GAT CCT TAA AAC TTG TTC TTG TTC
AA-3'; SEC ID Nº 24 a 1 mM. Las reacciones se
realizaron de acuerdo con las siguientes condiciones ciclado: una
incubación inicial durante 10 minutos a 95ºC, seguido de 35 ciclos
de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 60 segundos a 72ºC. Un
fragmento fuerte de producto de 1.035 pb se purificó en gel usando
procedimientos convencionales y se clonó en TA usando el vector de
clonación PCR-BluntII topo (Invitrogen, Carlsbad,
CA). El plásmido resultante se secuenció y se denominó pVR44 (véase
la Fig. 11b). Esta secuencia podía traducirse a un polipéptido que
mostraba una homología excelente con el gen codificante de
D-LDH de L. helveticus conocido y
tenía los sitios XbaI y BamHI en el extremo 5' y 3'
del gen de D-LDH.
El plásmido pNC2 se digirió con XbaI y
BamHI. Los extremos 5'-fosfato del pNC2
linealizado se desfoforilaron usando fosfatasa alcalina de camarón
(Roche Diagnostics, USA) siguiendo el protocolo del fabricante.
También se digirió pVR44 con XbaI y BamHI y el gen de
D-LDH de L. helveticus de 1.027 pb se
aisló mediante electroforesis en gel (gel de agarosa al 0,8%). Los
dos fragmentos se ligaron y el plásmido resultante, llamado pVR47
(véase la Fig. 4), se secuenció. El plásmido pVR47 tenía el promotor
PGK y el terminador GAL10 de S. cerevisiae
unidos de forma funcional (es decir, activos durante la
transcripción en una célula de levadura) al gen de
D-LDH de L. helvelticus, como se
muestra en la Fig. 12 (SEC ID Nº 43).
Se dirigió pPS1 con SphI y el fragmento
de 2.259 kpb que contenía el gel de resistencia de higromicina se
expresó bajo el control del promotor PDC1 y el terminador
GAL10 de S. cerevisiae se aisló mediante
electroforesis usando un gel de agarosa al 0,8%. Se digirió pVR47
con SphI y los extremos 5'-fosfato del
plásmido linealizado se desfoforilaron usando fosfatasa alcalina de
camarón (Roche Diagnostics, USA) siguiendo el protocolo de
fabricante. Los dos fragmentos se ligaron y el plásmido resultante
se secuenció y se denominó pVR48 (se muestra en la Fig. 13). El
plásmido contiene el gen de D-LDH de L.
helvelticus y las casetes del marcador de resistencia a
higromicina adyacentes
entre sí.
entre sí.
Se aisló un fragmento de 4,54 kpb que contenía
la casete del gen de resistencia D-LDH:HPH de
L. helveticus a partir de pVR48 digiriendo el plásmido con
SstI y ApaI. El fragmento se aisló mediante
electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8%. Este fragmento
se usó para trasformar el mutante de Kluyveromyces marxianus
nulo para pdc1 (CD215; véase Ejemplos 1F, 1G) usando un
protocolo de electroporación, que se describe a continuación:
Se usó una única colonia de K. marxianus
para inocular 50 ml de YPD (que comprende 10 g/l de extracto de
levadura, 20 g/l de peptona, 20 g/l de glucosa y agar al 2%) en un
matraz de agitación con un tabique deflector hasta una DO_{600}
de 0,1. El cultivo se incubó 16 horas a 30ºC con 250 rpm hasta una
DO_{600} final de 10. Las células de 10 ml se recogieron mediante
centrifugado y se lavaron una vez con tampón de electroporación
(EB, Tris-Cl 10 mM, sacarosa 270 mM, MgCl_{2} 1
mM, pH 7,5). Las células se resuspendieron en tampón de incubación
(IB; YPD + DTT 25 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0) y se incubaron a 30ºC con
250 rpm durante 30 minutos. Después se recogieron las células
mediante centrifugado y se lavaron una vez con EB. Las células se
resuspendieron en 1 ml de EB, y 400 ml de estas células se
transfirieron a una cubeta de electroporación de 0,4 cm (BioRad;
Hercules, CA).
Se añadieron 2 \mug del fragmento
SstI/ApaI de 4,54 kpb a la cubeta y las células se
electroporaron a 1,8 kV, 1.000 Q, 25 \muF. Las células se
transfirieron a 1 ml de YPD en un tubo Falcon con tampón de rosca
de 50 ml y se incubaron a 30ºC con 250 rpm durante 4 h antes de
sembrarlas en placas selectivas sobre YPD que contenía 200
\mug/ml de higromicina. Los transformantes se cultivaron a 37ºC
durante tres días. Los transformantes que eran resistentes a
higromicina se resembraron en placas selectivas recién preparadas
que contenían 200 \mug/ml de higromicina.
Verificación de la integración del fragmento en
el genoma de CD21 de K. marxianus realizada usando dos
conjuntos de cebadores de PCR:
- 1.
- Se diseñó un conjunto de cebadores para que fuera homólogo al gen de D-LDH de L. helvelticus y un cebador inverso homólogo al gen de resistencia a higromicina. Los cebadores VR161 5'-AGT TGG TGT ATT TAA CAA GG-3'; SEC ID Nº 25 y VR142 5'-GTG ACA CCC TGT GCA CGG CGG GAG ATG-3'; SEC ID Nº 26 se diseñaron para amplificar un producto de 1.748 kb entre D-LDH de L. helvelticus y el gen de resistencia a higromicina en cepas que tengan la casete y no deben amplificar ningún fragmento en las cepas que no tengan la casete. El termociclado se realizó en colonias transformantes usando Taq ADN polimerasa (Qiagen, USA) incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 2 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos 94ºC, 30 segundos 43ºC, 3 minutos a 72ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos a 72ºC.
- 2.
- Se diseñó un segundo conjunto de cebadores para que fueran homólogos a la región promotora PGK y un cebador inverso homólogo al D-LDH de L. helvelticus. Los cebadores VR173 5'-GCG ACG GCT CAC AGG TTT TG-3'; SEC ID Nº 27 y VR170 5'-CTT GTC TTG ACG TAA TAC ACG TGC AGC-3'; SEC ID Nº 28, se diseñaron para amplificar un producto de 0,75 kb entre promotor PGK y el gen de D-LDH de L. helveticus en cepas que tengan la casete y no deben amplificar ningún fragmento en cepas que no tengan la casete. El termociclado se realizó en colonias transformantes usando Taq ADN polimerasa (Qiagen, USA) incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 2 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 1 minuto a 72ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos a 72ºC. De los transformantes analizados, diez y nueve producían los productos de PCR esperados.
La pureza óptica del ácido
D-láctico producido por los transformantes se
determinó usando el kit de detección de ácido
D-láctico de Boehringer Mannheim (Roche Diagnostics,
USA). Se siguió el protocolo del fabricante y se indicó que seis de
los diez y nueve transformantes producían ácido
L-láctico al 0%.
El análisis de cromatografía de gases (GC) del
sobrenadante de los transformantes indicaba que las cepas producían
más del 99% de ácido D-láctico.
La separación y cuantificación de enantiómeros
"D" y "L" de ácido láctico se realiza usando un método de
cromatografía de gas quiral. El método establecido implica la
hidrólisis catalizada con una base de muestras en metanol, seguido
de la acidificación con ácido sulfúrico para catalizar la
esterificación y la posterior extracción de enantiómeros de lactato
de metilo en cloruro de metileno. Después se analizó la capa
orgánica mediante cromatografía de gases (GC) usando un detector de
ionización de llama (FID) [Hewlett Packard 6890 con un conjunto de
inyector con o sin división de flujo en modo de división,
autoinyección, y un detector FID]. La separación de los
enantiómeros de lactato de metilo se consigue usando una columna de
capilaridad quiral [30 metros x 0,25 mm de diámetro interno,
columna de capilaridad de \beta-Dex de 325 (grosor
de la película de 0,25 mm), Supelco (Nº 24308). Los porcentajes
relativos normalizados del ácido láctico "D" y "L" se
obtienen a partir de este método.
Las muestras para análisis por GC se preparan
pesando una cantidad de la muestra (1,000 g) en un vial de vidrio
de 20 ml, al que se le añaden 4 ml de metanol. El vial se tapa y se
añaden lentamente 150 \mul de ácido sulfúrico concentrado. El
vial se coloca a 65ºC en una estufa/agitador
Reati-therm durante 10 minutos. Después se añade
agua desionizada (5 ml) al vial seguido de la adición de 10 ml de
cloruro de metileno. El vial se tapa y se agita vigorosamente.
Usando una jeringa de plástico desechable equipada con un filtro de
punta de tubo, se retira una porción de la capa orgánica del fondo
y la capa orgánica del fondo restante se transfieren a un vial de
GC de 2 ml para su inyección en el cromatógrafo de gases.
\vskip1.000000\baselineskip
Los 6 transformantes que producían ácido
D-láctico ópticamente puro, se denominaron CD554,
CD555, CD556, CD557, CD558 y CD559. Estas cepas se cultivaron en
matraces de agitación con tabique deflector de 250 ml que contenían
50 ml de YPD, suplementado con 100 g/l de glucosa, y se inocularon a
partir de placas de agar YPD. Los cultivos se incubaron durante 16
horas a 30ºC con agitación a 250 rpm hasta una DO_{600} de 0,1.
Después de determinar que la glucosa residual permanecía en cada
matraz y que las células estaban en una fase de crecimiento
exponencial, se recogieron 4 g/l de equivalentes en peso seco de
células mediante centrifugado y se resuspensión en matraces de
agitación con tabique deflector de 250 ml que contenían 50 ml de YPD
suplementado con aproximadamente 100 g/l de glucosa y 55 g/l de
CaCO_{3}. Los cultivos se colocaron a 30ºC con 70 rpm. Se
extrajeron muestras en diversos intervalos de tiempo y las células
se eliminaron mediante filtración. El sobrenadante del cultivo se
analizó para detectar glucosa, D-lactato, piruvato y
etanol mediante HPLC (se describe a continuación).
Los métodos de HPLC utilizados en los siguientes
experimentos emplean una columna de Análisis Bio-Rad
Fast Acid combinada con una columna de Análisis Rezex Fast Fruit,
conteniendo cada una resina de estirenodivinil benceno en su forma
de hidrógeno. Los componentes orgánicos se cuantifican con un
detector Refractive Index combinado con un detector de UV a 220 nm,
usando ácido isobutírico como patrón interno. Las muestras se
preparan pesando una cantidad conocida de muestra y diluyéndola en
presencia de un patrón interno. La solución resultante se inyecta
dentro de un sistema de HPLC y se cuantifica usando patrones
conocidos.
Bajo estas condiciones de cultivo, las cepas
CD554, CD555, CD556, CD557, CD558 y CD559 produjeron más del 99% de
ácido D-láctico, con un rendimiento del
92-98% basado en la glucosa, un título de ácido
D-láctico que variaba de entre
82-90 g/l, y una productividad volumétrica mayor de
2,2 g/l/h a 30ºC.
El plásmido pCA50 se construyó ligando el
fragmento NgoMIV/PsiI de 4,7 kb del plásmido pVR48
(Ejemplo 1K) en la estructura del plásmido pBH5c (descrito en el
Ejemplo 3B; Fig. 16c) cortado con MscI y SgrAI. El fragmento de
pVR48 contenía el gen de D-LDH de L.
helveticus impulsado por el promotor PGK de S.
cerevisiae, seguido de la secuencia de terminación de la
transcripción GAL10 de S. cerevisiae. Esta casete de
expresión se sitúa adyacente al gen de la resistencia a higromicina
(hph), impulsado por el promotor PDC1 de S.
cerevisiae, seguido del terminador GAL10 (S.
cerevisiae). El fragmento pVR48 se ligó en la estructura de
pBH5c generando el plásmido pCA50, en el que la construcción de
D-LDH:hph está flanqueada por las secuencias
inmediatamente cadena arriba y cadena abajo del locus de PDC1
de K. marxianus (Fig. 14).
El plásmido pCA50 se digirió con SbfI y
BseRI para generar el fragmento de 6.272 pb. Se aislaron 2,5
\mug de este fragmento y se purificaron mediante electroforesis en
gel para usarlos para la transformación.
K-marxianus de tipo silvestre (CD21) se
transformó con el fragmento purificado usando el protocolo de
electroporación descrito en el ejemplo 1M. Las células transformadas
se sembraron en placas de selección de YPD que contenían 150
\mug/ml de higromicina para seleccionar células que contenían una
integración aleatoria del fragmento de pCA50 en el genoma, o una
sustitución homóloga del locus de PDC1 de tipo silvestre, con el
fragmento. Se aislaron las colonias después de 3 días de cultivo a
30ºC y se sembraron en estrías en YPD recién preparado con 150
\mug/ml de higromicina para confirmar el fenotipo.
Las colonias se ensayaron mediante PCR para
identificar aquellas que contenían la sustitución homóloga del
locus de PDC1 de tipo silvestre con el fragmento de pCA50. Las
células se resuspendieron en la reacción de PCR para proporcionar
ADN de plantilla. El cebador 5' oCA85 5'-GGA CCG ATG
GCT GTG TAG AA-3', SEC ID Nº 29, se diseñó para
amplificar el extremo 3' del gen hph. El cebador 3' oCA80
5'-TCG CTT ACC TCG GTA CAG AA-3';
SEC ID Nº 30, se diseñó para amplificar la secuencia cadena abajo
del locus de PDC1 de K. marxianus, que no está contenida en
la construcción de pCA50. El ensayo de amplificación usó como sonda
Taq polimerasa (Qiagen) para la secuencia diana empleada y las
siguientes condiciones de reacción de PCR: etapa de fusión inicial
a 95ºC durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos de amplificación de
30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC, y 3 minutos a 72ºC, seguido
de 10 minutos a 72ºC.
Las células transformadas que tenían un suceso
de sustitución homóloga generaron un producto de PCR de 2,5 kb. Los
sucesos de integración aleatoria no generaron un producto de PCR con
los cebadores oCA85 y oCA80. Las cepas CD597 a CD601 eran positivas
para este producto de PCR de 2,5 kb.
La cepa CD587 pdc1\Delta::
Lh-D-LDH (del Ejemplo 3E) es
el resultado de un suceso de sustitución de dos etapas en
comparación con las cepas CD597, CD599 y CD600 pdc1\Delta::
Lh-D-LDH, generada por un
suceso de sustitución de etapa única (del Ejemplo 2A) para
determinar si estas cepas producían títulos de ácido láctico
similares independientes del método de generación.
La biomasa se generó en matraces de agitación
con tabique deflector mediante el cultivo durante una noche a 37ºC
a 225 rpm de agitación en YPD + 100 g/l de glucosa y + 50 g/l de
CaCO_{3}. Los matraces de producción se inocularon con 2 g/l de
peso seco de células a partir de los matraces de agitación de
biomasa durante una noche. Las condiciones de producción eran
medios YPD + 100 g/l de glucosa y + 50 g/l de CaCO_{3} con
agitación a 70 rpm en matraces de agitación con tabique deflector a
35ºC. Las muestras se tomaban en diversos puntos temporales: la
biomasa y el CaCO_{3} se eliminaron mediante filtración y se
analizó la glucosa, lactato, EtOH y piruvato en los filtrados
mediante HPLC (Ejemplo 1M).
Después de 54 horas, CD587, CD589 y CD590 habían
consumido 85-88 g/l de glucosa, produciendo 81 g/l
de lactato y 2,5 g/l de piruvato. Estos títulos de lactato
representan un rendimiento de lactato del 92-95% en
glucosa y una productividad volumétrica de más de 1,5 g/l por hora
durante la microaerobiosis. Estos resultados muestran que los
transformantes de D-LDH pueden producir ácido
D-láctico. El análisis enzimático del ácido láctico
producido mediante estas cepas mostró que el ácido láctico era ácido
D-láctico más del 99% enantioméricamente puro.
Estos resultados muestran que los transformantes
de D-LDH generados usando una estrategia de
sustitución génica de etapa única (CD597, CD599 y CD600) pueden
producir ácido D-láctico de forma similar a la cepa
de sustitución de dos etapas, CD587.
El marcador de resistencia a G418 (pVR22;
Ejemplo 1C) se clonó en pnNC2 (Ejemplo 1A) y la construcción se
denominó pVR29 (Fig. 15). El promotor PGK de S.
cerevisiae y el terminador GAL10 de S. cerevisiae
se usaron para expresar el gen de resistencia a G418. El gen de
resistencia a G418 se amplificó mediante PCR usando la polimerasa
Pfu (Stratagene, Madison, WI) con cebadores 5' - GCT CTA GAT GAG CCA
TAT TCA ACG GGA AAC (fragmento 5'G; SEC ID Nº 9) y 5' - ATG GAT CCT
TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC (fragmento 3' G; SEC ID Nº 10) y el
plásmido pVR22 (Ejemplo 1C) como plantilla. Como alternativa, puede
usarse también el plásmido pPIC9K (Invitrogen, Carlsbad, CA) como
plantilla. El termociclado se realizó incubando inicialmente la
mezcla de reacción durante 5 minutos a 95ºC, seguido de 35 ciclos
de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 49ºC, y 2 minutos a 72ºC,
seguido de una incubación final durante 10 minutos a 72ºC. El
producto de PCR se digirió con BamHI y XbaI y se aisló un
fragmento de 821 pb y se ligó al fragmento
BamHI-XbaI de 4.303 pb de pNC2. El plásmido
resultante, pVR29 (Fig. 15), contenía el promotor PGK y el
terminador GAL10 unidos de forma operativa (es decir, activos
para la transcripción en una célula de levadura) al gen de
resistencia a G418.
La secuencia de ADN que flanqueaba al gen de
PDC1 de K. marxianus se clonó en el plásmido pVR29
(Ejemplo 3A; Fig. 15) para generar un ácido nucleico recombinante
para la integración de ADN dirigida en el locus de PDC1. La
construcción resultante se denominó pBH5a Fig. 16a). pBH5a comprende
un sitio de restricción SbfI que permite que los genes
clonados se unan de forma operativa al promotor PDC1.
Un fragmento de ADN de 1.254 pb inmediatamente
cadena arriba de PDC1 se amplificó mediante PCR mediante los
cebadores 5'-CAA GAA GGT ACC CCT CTC TAA ACT TGA
ACA-3' (5'-Flanco 5'; SEC ID Nº 31)
y 5'-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTT
GG-3' (5'-Flanco 3'; SEC ID Nº 32) y
el plásmido pSO21 (Fig. 7B, Ejemplo 1F) como plantilla. El
termociclado se realizó incubando inicialmente la mezcla de reacción
durante 2 minutos a 94ºC, después mediante 35 ciclos de 30 segundos
a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 1,5 minutos a 72ºC, seguido de una
incubación final de 7 minutos a 72ºC. El producto de PCR de 1.254 pb
se separó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se
aisló. El producto de PCR y el pVR29 (Fig. 15A) se digirieron ambos
con Kpnl y SbfI. El producto de PCR digerido se ligó
con el pVR29 de 5.067 pb para dar el pBH5a de 6.315 pb (véase Fig.
16A). El plásmido resultante contiene un gen de resistencia a G418
unido de forma operativa al promotor PDC1 y al terminador
GAL10 de S. cerevisiae y un fragmento de ADN de 1.240
pb homólogo al ADN inmediatamente cadena arriba del gen de
PDC1.
Un fragmento de ADN de 535 pb inmediatamente
cadena bajo de PDC1 se amplificó por PCR con cebadores
5'-CCA AGC CCT GCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA
GA-3' (3'-Flanco 5': SEC ID Nº 33) y
5'-CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAA
CAA-3' (3'-Flanco 3': SEC ID Nº 34)
usando el plásmido pSO21 (Fig. 7A) como plantilla. El termociclado
se realizó incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 2
minutos a 94ºC, después amplificando mediante 35 ciclos de 30
segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 45 segundos a 72ºC, seguido
de una incubación final de 4 minutos a 72ºC. El producto de PCR se
separó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y el
producto de 535 pb se aisló. El producto de PCR se digirió con
SbfI y MIuI. El fragmento de 529 pb se ligó con el
fragmento de SbfI-Mlul de pBH5a para dar el plásmido
pBH5b. pBH5b contiene 1,2 kb de ADN inmediatamente cadena arriba y
0,5 kb de ADN inmediatamente cadena abajo de PDC1 con un
único sitio SbfI situado entre las secuencias de flanqueo de
pdc1, también incluye un marcador de resistencia a G418
seleccionable unido de forma operativa al promotor PDC1 y al
terminador GAL10 de S. cerevisiae y se muestra
esquemáticamente en la Fig. 16b.
Una porción del locus de PDC1 (K.
marxianus) se subclonó también en el plásmido comercial pUC19
(Invitrogen) para generar pBH5c, de la siguiente manera. El
plásmido que el pSO21 se digirió con Nhe I y Nde I y
el fragmento de ADN de 3.339 pb que contenía 486 pb de ADN
inmediatamente cadena arriba de PDC1, la secuencia completa de
PDC1, y 1.127 pb de ADN inmediatamente cadena arriba de PDC1 se
aislaron siguiendo la separación por electroforesis en un gel de
agarosa al 0,8%. El pUC 19 se digirió con XbaI y NdeI
y el fragmento de ADN de 2.452 pb se aisló después de una
separación por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. El pUC
19 digerido y el locus de PDC1 se ligaron de forma conjunta
para dar el pBH5c de 5.791 pb, y que se muestra esquemáticamente en
la Fig. 16c.
El gen de D-LDH de pVR48
(Ejemplo 1K) se clonó en el sitio SbfI de pBH5b para crear un
ácido nucleico recombinante capaz de integrar al
D-LDH en el locus de PDC1 de K.
marxianus y expresar D-LDH bajo el
control el promotor y terminador del PDC1 endógeno.
El gen de D-LDH se amplificó por
PCR usando los cebadores 5'-TTT TTA CCT GCA GGC TAG
ATT TAT GAC AAA GG-3'
(Lh-D-LDH 5'; SEC ID Nº 35) y
5'-TCT ACC CCT GCA GGA AAA CTT GTT CTT GTT
CA-3'
(Lh-D-LDH 3'; SEC ID Nº 36)
usando pVR47 (Ejemplo 1J) como plantilla. El termociclado se realizó
mediante 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 1,5
minutos a 72ºC, seguido de una incubación final durante 4 minutos a
72ºC usando el sistema Failsafe PCR System (Epicentre, Madison,
WI). El producto de PCR se separó mediante electroforesis en un gel
de agarosa al 0,8% y el producto de 1.028 pb se aisló. El producto
de PCR se digirió con SbfI y se ligó con el pBH5b digerido
con SbfI de 6.844 pb para dar el plásmido pBH6 de 7.872 pb.
pBH6 contiene el gen de D-LDH unido de forma
operativa al promotor y terminador PDC1, junto con un
marcador de resistencia a G418 unido de forma operativa al promotor
PDC1 y al terminador GAL10 de S. cerevisiae que
se muestra esquemáticamente en la Fig. 17.
El plásmido de integración pBH6, que contiene
D-LDH se transformó en K. marxianus de
tipo silvestre (CD21). Todo el plásmido se integró en el locus de
PDC1 mediante una única recombinación homologada entre el
ADN de flanqueo de PDC1 inmediatamente cadena arriba del gen
de D-LDH de pBH6 y el ADN inmediatamente
cadena arriba del gen de PDC1 del cromosoma. La cepa
resultante contiene la copia de tipo silvestre de PDC1, así
como una única copia de pBH6 integrada en el locus de
PDC1.
Se usó CD21 para inocular 50 ml de YPD,
suplementado con 100 g/l de glucosa en un matraz de agitación con
tabique deflector de 250 ml hasta una DO_{600} de 0,1. El cultivo
se incubó durante 16 horas a 30ºC con 250 rpm hasta una DO_{600}
de 12. Las células de 10 ml de cultivo se recogieron mediante
centrifugado y se lavaron una vez con tampón de electroporación
(EB; Tris-Cl 10 mM, sacarosa 270 mM, MgCl_{2} 1
mM, pH 7,5). Las células se resuspendieron en tampón de incubación
(YPD + DTT 25 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0) y se incubaron a 30ºC con
250 rpm durante 30 minutos. Las células se recogieron mediante
centrifugado y se lavaron una vez con EB. Las células se
resuspendieron en 1 ml de EB, y 400 \mul de esta suspensión se
transfirieron a una cubeta de electroporación de 0,4 cm. Se
añadieron 12 \mug de pBH6 sin cortar en un volumen de 50 \mul a
la cubeta y las células se electroporaron a 1,8 kV, 1.000 \Omega,
25 \muF. Las células se transfirieron a 1 ml de YPD en un tubo
Falcon con tapón de rosca de 50 ml y se incubaron a 30ºC con
agitación a 250 rpm durante 4 h antes de sembrarlas en placas
selectivas de YPD que contenían 300 \mug/ml de G418. Los
transformantes se cultivaron a 37ºC durante 2 días. Los
transformantes que crecieron se sembraron en estrías en placas de
selección recién preparadas.
La verificación de la integración apropiada de
pBH6 en el locus de PDC1 mediante una recombinación
homologada entre el ADN que flanqueaba a PDC1 inmediatamente
cadena arriba del gen de D-LDH de pBH6 y del
ADN inmediatamente cadena arriba del gen de PDC1 en el
cromosoma de K. marxianus se evaluó usando cebadores
5'-AAG CAC CAA GGC CTT CAA CAG-3'
(Cromosoma de PDC1 5'; SEC ID Nº 37) y 5'-CTT
GTC TTG ACG TAA TAC ACG TGC AGC-3'
(D-LDH 3': SEC ID Nº 38) diseñados para
amplificar un producto de 2,7 kb entre el ADN cromosómico cadena
arriba del gen de PDC1 y fuera de la homología incorporada en
pBH6, y el gen de D-LDH. El termociclado se
realizó incubando la mezcla de reacción durante 2 minutos a 94ºC,
seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 3
minutos a 72ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos a 72ºC.
Siete de los diez transformantes analizados dieron el producto de
PCR de 2,7 kb esperado. Dos productos eran el resultado del
análisis de PCR, usando cebadores diseñados para amplificar el locus
de PDC1 5'-CGC AAA GAA AAG CTC CAC
ACC-3' (PDC1 5'; SEC ID Nº 39) y
5'-CCC ATA CGC TTA TAA TCC CCC-3'
(PDC1 3'; SEC ID Nº 40), una banda de 1,7 kb correspondiente a
PDC1, y una banda de 1,0 kb correspondiente a
D-LDH. El termociclado se realizó incubando
la mezcla de reacción durante 2 minutos a 94ºC seguido de 35 ciclos
de amplificación de 30 segundos 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 2 minutos
a 72ºC, y mediante una incubación final de 5 minutos a 72ºC. Se usó
un análisis de transferencia de Southern usando una sonda diseñada
para detectar el gen de resistencia a G418 para una verificación
adicional de un suceso de integración de copia única. Uno de los
siete transformantes analizados mostraba el patrón de formación de
bandas adecuado coherente con la integración de la copia de pBH6.
La cepa con una copia de pBH6 situada en el locus de PDC1, de
acuerdo por con lo verificado por el análisis de PCR y de Southern,
se denominó CD588.
Estos resultados demuestran que la integración
dirigida del ADN de pBH6 transformado en el locus de PDC1 de
CD21 de K. marxianus de tipo silvestre se ha producido a
través de una única recombinación homóloga entre las secuencias del
promotor PDC1. Estos resultaron confirman también que el pBH6
está presente en un única copia en la cepa CD588.
Se propagó CD588 en medios no selectivos durante
varias rondas de crecimiento para promover una segunda recombinación
homóloga entre las secuencias terminadoras de PDCI del pBH6
integrado y el terminador PDC1 nativo. Un suceso de segunda
recombinación homóloga en las secuencias terminadoras dio como
resultado una cepa en la que el gen de PDC1 estaba
sustituido con el gen de D-LDH. Esta cepa no
tiene el gen marcador de resistencia a G418 debido a la pérdida del
gen G418, junto con el gen de PDC1, que se produce como
resultado del segundo suceso de recombinación. La cepa resultante
en la que PDC1 se sustituye con D-LDH
mostraba un fenotipo sensible a G418 junto con carencia de
crecimiento en anaerobiosis.
CD588 se sembró en placas de agar YPD y se
cultivó durante una noche a 37ºC. Se transfirió una masa de colonias
a placas de agar YPD recién preparadas. Esto se repitió cuatro
veces. Después de la quinta ronda de cultivo no selectivo en placas
de agar YPD, se inocularon 6 matraces de agitación con tabique
deflector de 250 ml que contenían 50 ml de YPD suplementado con 100
g/l de glucosa y 42 g/l CaCO_{3} hasta una DO_{600} de 0,1 con
células de CD588 de la quinta ronda de siembra en placas no
selectivas. Los matraces de agitación se cultivaron a 30ºC con 250
rpm durante 16 horas. Después se diluyeron los cultivos y su se
usaron para colocar colonias únicas en placas de agar YPD. Además,
un frotis de colonias de la quinta ronda de placas de cultivo no
selectivas se suspendió en 1 ml de PBS (solución salina tamponada
con fosfato) y posteriormente se diluyó y se usó para sembrar
colonias únicas en placas de agar de YPD. Las colonias únicas
resultantes de esta ronda de siembra en placa, se sembraron en
placas de agar YPD y se dejaron en una cámara anaeróbica. Después
del cultivo durante dos días a 37ºC, se abrió la cámara anaeróbica
y las colonias que crecían en anaerobiosis se marcaron. Las placas
se incubaron otro día a 37ºC. Las colonias que crecían en aerobiosis
pero no en anaerobiosis se transformaron a placas por triplicado
para seleccionarlas. Las placas usadas para estas condiciones de
selección eran placas de YPD (aeróbicas) placas de YPD (anaeróbicas)
y placas de YPD suplementadas con 300 \mug/ml de G418. Se
identificaron tres transformantes con el fenotipo deseado que tenían
sensibilidad a G418 y carecían de crecimiento en anaerobiosis.
Estos transformantes se denominaron CD587, CD589 y CD590.
La confirmación de la sustitución de PDC1
con D-LDH se realizó usando cebadores
5'-CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3'
(PDC1 5'; SEC ID Nº 39) y 5'-CCC ATA CGC TTA
TAA TCC CCC-3' (PDC1 3': SEC ID Nº 40),
diseñados para amplificar el locus de PDC1, usando ADN
cromosómico de CD587, CD589 y CD590 como plantillas. El
termociclado se realizó incubando inicialmente la mezcla de reacción
durante 2 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a
94ºC, 30 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC y una incubación final de
5 minutos a 72ºC. El ADN cromosómico de las tres cepas produjo un
único producto de PCR de 1,0 kb correspondiente a
D-LDH. El análisis de transferencia de
Southern usando una sonda diseñada para hibridar con el gen G418
indicaba la ausencia del gen G418. Además, el análisis de Southern
con una sonda para la región codificante de PDC1 no mostraba
ninguna banda. Las sondas diseñadas para hibridar con las regiones
inmediatamente cadena arriba y cadena abajo de PDC1 dieron
bandas con tamaños coherentes con la sustitución de PDC1 con
D-LDH.
Estos resultados demuestran que el gen de
PDC1, junto con la estructura del plásmido pBH6 que contiene
el marcador de resistencia a G418 unido de forma operativa al
promotor PDC1 y al terminador GAL10 de S.
cerevisiae, se perdían en el cromosoma de CD588 a través de un
segundo suceso de recombinación homólogo que se producía entre los
dos terminadores de pdc1 presentes en el locus de PDC1
de CD588. Este segundo suceso de recombinación proporciona una cepa
en la que el gen de PDC1 se había sustituido exactamente con
el gen de D-LDH flanqueado por sitios
SbfI.
La cepa CD588 Pdc+
Lh-D-LDH y las cepas CD587,
CD589 y CD590 Pdc- Lh-D-LDH
se cultivaron en matraces de agitación con tabiques deflectores de
250 ml que contenían 50 ml de YPD suplementado con 100 g/l de
glucosa y 50 g/l de CaCO_{3} seguido de la inoculación hasta una
DO_{600} de 0,1 a partir de placas de agar YPD durante 16 horas a
30ºC con 250 rpm. Después de asegurarse de que la glucosa residual
seguía en cada matraz y de que las células estaban en fase de
crecimiento exponencial, se recogieron 4 g/l de equivalentes en peso
seco de células mediante centrifugado y se resuspendieron en
matraces de agitación con tabique deflector de 250 ml que contenían
50 g/l de YPD suplementado con 100 g/l de glucosa y 50 g/l de
CaCO_{3}. Los cultivos se colocaron a 30ºC con 70 rpm. Las
muestras se extrajeron en diversos intervalos de tiempo y las
células se eliminaron por filtración. El sobrenadante del cultivo
se analizó para presencia de glucosa, lactato, pirvuato y etanol
mediante HPLC (descrito anteriormente en el ejemplo 1M).
Después de 23 horas, la cepa CD588 Pdc+
Lh-D-LDH había consumido 127
g/l de glucosa, y producido 33 g/l de lactato, 37 g/l de etanol, y
0,2 g/l de piruvato. Las cepas CD587, CD589 y CD590 Pdc-
Lh-D-LDH habían consumido
40-43 g/l de glucosa, produciendo
36-39 g/l de lactato y 1,0-1,3 g/l
de piruvato.
Después de 54 horas, CD587, CD589 y CD590 habían
consumido 85-88 g/l de glucosa, y producido 81 g/l
de lactato, y 2,5 g/l de piruvato. Esos títulos de lactato
representan un rendimiento de lactato del 92-95% en
glucosa y una productividad volumétrica mayor de 1,5 g/l/h durante
la fase de producción en microareobiosis. Después 54 horas, se
formó un precipitado de lactato de calcio insoluble ("en forma de
torta") debido a los altos niveles de D-lactato
producido en los cultivos, lo que impedía el análisis adicional. El
análisis enzimático y de cromatografía de gases, de acuerdo con el
ejemplo 1L, mostraba que más del 99% del lactato producido era
D-lactato. No se detectó etanol en los cultivos de
CD587, CD589 y CD590, lo que era coherente con la sustitución de
PDC1 con LDH.
Estos resultados muestran que los transformantes
de D-LDH pueden producir ácido
D-láctico. La producción de ácido láctico con un
PDC1 funcional dio como resultado la producción
aproximadamente igual de ácido láctico y etanol, demostrando que el
D-LDH puede competir con el PDC1
nativo por el piruvato. Al sustituir el PDC1 con
D-LDH de L. helveticus, el título de
ácido láctico se incrementó en dos veces, dando como resultado
títulos y rendimientos más altos que el máximo teórico. Además,
estas cepas no producían etanol, lo que demostraba la sustitución
de PDC1 con D-LDH. Los análisis
enzimáticos del ácido láctico producido por estas cepas mostraron
que el ácido láctico era ácido D-láctico
enantioméricamente puro en más del 99%.
\vskip1.000000\baselineskip
El K. marxianus de tipo silvestre CD21,
la cepa CD588 PDC+ Lh D-LDH y las cepas CD558
y CD587 Pdc-Lh D-LDH, se inocularon a una
DO_{600} de 0,1 a partir de placas de agar YPD y se cultivaron
durante 16 horas a 33ºC con 250 rpm en matraces de agitación con
tabique deflector de 250 ml que contenían 50 ml de YPD suplementado
con 100 g/l de glucosa y 50 g/l de CaCO_{3 .} Después de
determinar que la glucosa residual seguía en cada matraz y que las
células estaban consecuentemente en fase de crecimiento exponencial,
se recogieron 4 g/l de equivalentes en peso seco de células
mediante centrifugado y se resuspendieron en matraces de agitación
con tabique deflector de 250 ml que contenían 50 ml de YPD
suplementado con 100 g/l de glucosa y 50 g/l de CaCO_{3.} Los
cultivos se incubaron a 37ºC, 42ºC ó 50ºC con 70 rpm. Se extrajeron
muestras en diversos intervalos de tiempo y las células se
eliminaron mediante filtración. El sobrenadante de cultivo se
analizó para la presencia de glucosa, lactato, piruvato, acetato,
glicerol y etanol mediante métodos de HPLC (del Ejemplo 1M).
Después de 23 horas, la cepa CD588 PDC+ Lh
D-LDH, que fermentaba a 37ºC, había consumido
115,5 g/l de glucosa, y producido 16,2 g/l de lactato, 37,6 g/l de
etanol, 7,6 g/l de glicerol, 2,6 g/l de acetato y 0,2 g/l de
piruvato. Después de 47 horas a 37ºC, las cepas CD558 y CD587 PDC-
Lh D-LDH habían consumido
99-105 g/l de glucosa y producido
90-99 g/l de lactato, 2,7-3,5 g/l de
piruvato y 1,2-1,4 g/l de acetato. Por el
contrario, la cepa CD21 de tipo silvestre consumió 115,5 g/l de
glucosa y produjo principalmente etanol (43,5 g/l) y una pequeña
cantidad de lactato (1,7 g/l).
Después de 23 horas, la cepa CD588 PDC+ Lh
D-LDH, que fermentaba a 42ºC, había consumido
115,5 g/l de glucosa, y producido 12,8 g/l de lactato, 34,7 g/l de
etanol, 6,9 g/l de glicerol, 3,0 g/l de acetato, y 0,3 g/l de
piruvato. Después de 47 horas a 42ºC, las cepas CD558 y CD587 PDC-
Lh D-LDH habían consumido 80 g/l de glucosa
y producido 75 g/l de lactato, 2,5 g/l de etanol y 1,5 g/l de
acetato. Por el contrario, la cepa CD21 de tipo silvestre consumió
115,5 g/l de glucosa y produjo principalmente etanol (39,7 g/l) y
una pequeña cantidad de lactato
(1,0 g/l).
(1,0 g/l).
Después de 47 horas, la cepa CD588 PDC+ Lh
D-LDH, que fermentaba a 50ºC, había consumido
49,6 g/l de glucosa, y producido 6,8 g/l de lactato, 9,5 g/l de
etanol, 4,5 g/l de glicerol y 0,8 g/l de acetato. Después de 47
horas a 50ºC, las cepas CD558 y CD587 PDC- Lh
D-LDH habían consumido 15 g/l de glucosa y
producido 10 g/l de lactato, 1,2-1,4 g/l de
piruvato y 1,6-1,7 g/l de acetato. Por el contrario,
la cepa CD21 de tipo silvestre consumió 70,5 g/l de glucosa y
produjo principalmente etanol (13,6 g/l) y una pequeña cantidad de
lactato (0,5 g/l).
Estos resultados demuestran que los
transformantes D-Ldh+ pueden producir ácido
D-láctico a temperaturas de hasta 50ºC. El ácido
láctico producido por estas cepas es ácido D-láctico
enantioméricamente puro en más del 99%, de acuerdo con lo
determinado mediante análisis enzimático. Aunque los índices
globales de consumo de glucosa y producción de lactato disminuyen
al aumentar la temperatura, el rendimiento de lactato a partir de
glucosa permanece entre el 88-100% para las cepas
CD558 y CD587 PDC-
Lh-D-LDH.
La cepa CD21 de K. marxianus de tipo
silvestre, la cepa CD588 PDC+
Lh-D-LDH y las cepas CD558 y
CD587 PDC- Lh-D-LDH hasta
una DO_{600} de 0,1 a partir de placas de agar YPD y se cultivaron
durante 16 horas a 30ºC con agitación a 250 rpm, en matraces de
agitación con tabique deflector de 250 ml que contenían 50 ml de
YPD suplementado con 100 g/l adicionales de glucosa. Después de
determinar que la glucosa residual permanecía en cada matraz y que
las células estaban consecuentemente en fase de crecimiento
exponencial, se recogieron 4 g/l de equivalentes en peso seco de
células mediante centrifugado y se resuspendieron en 250 ml en
matraces de agitación con tabique deflector de 250 ml que contenían
50 ml de YPD suplementado con 40 g/l de glucosa por duplicado. Los
cultivos se colocaron a 37ºC con 70 rpm. Se extrajeron muestras en
diversos intervalos de tiempo y las células se eliminaron mediante
filtración. Se analizaron los sobrenadantes de cultivo para la
presencia de glucosa, lactato, piruvato, acetato, glicerol y etanol
mediante HPLC.
Después de 23 horas, la cepa CD588 PDC+ Lh
D-LDH, había consumido 58,9 g/l de glucosa, y
producido 0,9 g/l de lactato, 0,2 g/l de piruvato, 2,6 g/l de
glicerol, y 0,6 g/l de acetato. El pH del cultivo final medido era
de 4,6. El etanol era el producto principal de esta fermentación, a
24-24,7 g/l. Después de 23 horas, las cepas CD558 y
CD587 PDC- Lh D-LDH habían consumido 4,1 g/l de
glucosa y producido entre 2,5 g/l de lactato, 1,0 g/l de piruvato,
0,8 g/l de glicerol y 0,4 g/l de acetato. El pH del cultivo final
para las cepas CD587 y CD558 variaba entre
3,31-3,65. El lactato era el producto principal de
la fermentación, a un nivel que variaba entre
1,2-3,3 g/l. La cepa CD21 de tipo silvestre consumió
58,9 g/l de glucosa en 23 horas y produjo en su mayor parte etanol
(12,8-20,4 g/l) y una pequeña cantidad de lactato
(1,2-1,3 g/l) con un pH final de 4,65.
Estos resultados muestran que los transformantes
de D-Ldh+ producen ácido D-láctico a
valores de pH de hasta 3,31. Los análisis enzimáticos del ácido
láctico producido por estas cepas mostraron el ácido láctico es
ácido D-láctico enantioméricamente puro en más del
99%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la producción de ácido
D-láctico a partir de D-xilosa en
tres cepas de K. marxianus manipuladas en relación con la
CD21 (de tipo silvestre), incluyendo la CD558 (nula para PDC1
que contenía D-LDH de L. helveticus
integrado aleatoriamente), CD587
(PDC1::Lh-D-LDH), y CD558
(que contenía D-LDH de L.
helveticus). Los siguientes resultados demuestran que las cepas
manipuladas pueden producir ácido D-láctico a partir
de un sustrato sin glucosa.
Se cultivaron células de las cepas CD21, CD558,
CD587 y CD588 en placas de agar YPD + 20 g/l de
D-xilosa y se usaron para inocular matraces de
agitación con tabique deflector que contenían 100 ml de medio de
cultivo que contenía 20 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de
peptona, 17 g/l de CacO_{3} y 50 g/l de D-xilosa.
Los matraces de agitación inoculados se incubaron a 35ºC y se
agitaron a 250 rpm. Se tomaron muestras de los matraces y se midió
la DO_{600 nm} para controlar el crecimiento del cultivo y la
utilización del azúcar. Después de aproximadamente 36 horas, se
recogieron las células mediante centrifugado y se determinó el peso
seco celular (CDW) de cada cultivo. A matraces de agitación con
tabique deflector por duplicado que contenían 20 g/l de extracto de
levadura, 10 g/l de peptona y 50 g/l de D-xilosa se
les añadieron 3,0 g/l de CDW de células de cada cepa. Los matraces
se incubaron a 35ºC con agitación a 70 rpm. Se tomaron muestras en
varios puntos temporales para análisis de HPLC y cuantificación de
los componentes del medio, incluyendo xilosa,
D-lactato, xilitol, y etanol.
El principal componente orgánico producido por
las cepas CD558 y CD587 era ácido D-láctico, que
alcanzaba un título mayor medio de 13,7 g/kg. Esto da como
resultado un rendimiento de ácido D-láctico a partir
de D-xilosa de aproximadamente el 33%. El
componente orgánico principal producido por la cepa CD21 es xilitol,
que alcanzaba un título mayor medio de 25,0 g/kg. Esto da como
resultado un rendimiento de xilitol, a partir de
D-xilosa de aproximadamente el 50%. El componente
orgánico principal producido por la cepa CD588 era xilitol, que
alcanzaba un título mayor medio de 19,6 g/kg. Esto da como
resultado un rendimiento de xilitol medio a partir de
D-xilosa de aproximadamente el 44%. El análisis de
HPLC no detectó producción de glicerol, ácido cítrico, piruvato,
ácido succínico, o acetato en ninguna de las cepas.
\newpage
Los plásmidos se contienen un gen de
D-LDH de B. megaterium para la integración
dirigida en el locus del gen de PDC1 de C. sonorensis
se preparan de la siguiente manera:
El plásmido pMI257 (aplicación de Candida) se
linealiza con Ncol y las protuberancias 5' se llenan
parcialmente con ADN polimerasa I, fragmento de Klenow, y una
mezcla de dATP, dCTP y dTTP, omitiendo el dGTP de la reacción. A
esto le sigue la retirada de las extensiones de cadena sencilla
mediante el tratamiento con nucleasa de fríjol mungo. Después el
ADN se digiere con BamHI y el fragmento de 9.200 pb se aísla
a partir de un gel de agarosa al 0,8% después de la separación
mediante electroforesis. El plásmido pVR47 (Ejemplo 1J) que contiene
D-LDH de B. megaterium se genera a partir de
AND genómico de B. megaterium y se muestra en la Fig. 12. El
fragmento de 1.203 pb que contiene el LDH de B. megaterium se
corta a partir de pVR47 mediante XbaI y digestión seguida
del llenado de las protuberancias 5' mediante ADN polimerasa I,
fragmento de Klenow y cada uno de los 4 dNTP y digestión mediante
BamHI. El fragmento de 9.000 pb NcoI (romo) -
BamHI de pMI257 y el fragmento de 976 pb de XbaI
(romo) - BamHI de pVR47 se ligan y el plásmido resultante se
denomina pMIXXX, que se muestra en la Fig. 18. pMI1000 contiene, en
este orden, el promotor PDC1 de C. sonorensis, el
promotor PGK1 de C. sonorensis unido de forma
operativa al gen MEL5 de S. cerevisiae, el promotor
PGK1 de C. sonorensis unido de forma operativa al
D-LDH de B. megaterium y el
terminador PDC1 de C. sonorensis. PMI1000 se digiere
con NotI para escindir el fragmento de 7.300 pb que está
compuesto por las casetes de expresión de MEL5 y LDH flanqueadas por
las regiones 5' y 3' de PDC1. Este fragmento de 7.500 pb se
usa para transformar C. sonorensis (llenado de Candida) y
los transformantes se seleccionan en placas de YPD suplementado con
X-\alpha-gal a una concentración
de 40 \mug/ml. Los transformantes se cultivan en placas de agar
YPD suplementado con X-\alpha-gal
(40 \mug/ml).
<110> Cargill Dow Polymers LLC
\hskip1cmRajgarhia, Vineet
\hskip1cmAsleson, Catherine
\hskip1cmOlson, Stacey
\hskip1cmSuominem, Pirkko
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y Materiales para la
Producción de Ácido D-Láctico en Levadura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
00-1237-Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/384.333
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-05-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 848
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PSPDCS1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatcgataa caagctcatg caaagag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PSPDCAS2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagatt tgactgtgtt attttgcg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador BM1270
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgagtcca cgtcattatt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador BM179
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaagctatt tattcttgtt ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Bmeg5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagatg aaaacacaat ttacacc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Bmeg3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggatcct acacaaaagc tctgtcgc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de cebador 5' G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagatg agccatattc aacgggaaac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de cebador 3' G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggatcctt agaaaaactc atcgagcatc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttccagtcc agcaggtcga ccag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccagcatg tcgaccag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacgaaacgm aacttctctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggaactt cttgtcagtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO4549
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatccgaag aagtcgatct c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO285
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgccatcc tatggaactg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO2740
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggctggg aattgagtga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO2444
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccatctg aaatcgacag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador HYGXBA1 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagctctaga tgaaaaagcc tgaactcac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador HYGBAMH1 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccc tattcctttg ccctcggac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttggattt atgacaaagg ttttgctt
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaaaact tgttcttgtt caaagcaact
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR165
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtctagatt tatgacaaag gttttgct
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR166
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatcctt aaaacttgtt cttgttcaa
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR161
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttggtgta tttaacaagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgacaccct gtgcacggcg ggagatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR173
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgacggctc acaggttttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgtcttga cgtaatacac gtgcagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oCA85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaccgatgg ctgtgtagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oCA80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgcttacct cggtacagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' Flanco 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagaaggta cccctctcta aacttgaaca
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' Flanco 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaattcctg caggtgcaat tatttggttt gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' Flanco 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagccctg caggagaggg agaggataaa ga
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' Flanco 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtaacgc gtgtacaagt tgtggaacaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5'
Lh-D-LDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttacctg caggctagat ttatgacaaa gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3'
Lh-D-LDH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctacccctg caggaaaact tgttcttgtt ca
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' del Cromosoma de PDC1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcaccaag gccttcaaca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' D-LDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgtcttga cgtaatacac gtgcagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' PDC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaaagaaa agctccacac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' PDC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccatacgct tataatcccc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1253
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
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<211> 1314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1014
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus helveticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
<110> Cargill Dow LLC
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y Materiales para la
Producción de Ácido D-Láctico en Levadura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3J336220 004 EP ECT GPO/HW/SG
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> us 60/384.333
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-05-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 848
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PSPDCS1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatcgataa caagctcatg caaagag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PSPDCAS2
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagatt tgactgtgtt attttgcg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador BM1270
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgagtcca cgtcattatt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador BM179
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaagctatt tattcttgtt ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Bmeg5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagatg aaaacacaat ttacacc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Bmeg3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggatcct acacaaaagc tctgtcgc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de cebador 5' G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagatg agccatattc aacgggaaac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de cebador 3' G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggatcctt agaaaaactc atcgagcatc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttccagtcc agcaggtcga ccag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccagcatg tcgaccag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacgaaacgm aacttctctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO-M5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggaactt cttgtcagtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO4549
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatccgaag aagtcgatct c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO285
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgccatcc tatggaactg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO2740
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggctggg aattgagtga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SO2444
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccatctg aaatcgacag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador HYGXBA1 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagctctaga tgaaaaagcc tgaactcac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador HYGBAMH1 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccc tattcctttg ccctcggac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttggattt atgacaaagg ttttgctt
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaaaact tgttcttgtt caaagcaact
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR165
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtctagatt tatgacaaag gttttgct
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR166
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatcctt aaaacttgtt cttgttcaa
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR161
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttggtgta tttaacaagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgacaccct gtgcacggcg ggagatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR173
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgacggctc acaggttttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador VR170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgtcttga cgtaatacac gtgcagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oCA85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaccgatgg ctgtgtagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oCA80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgcttacct cggtacagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' Flanco 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagaaggta cccctctcta aacttgaaca
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' Flanco 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaattcctg caggtgcaat tatttggttt gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' Flanco 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagccctg caggagaggg agaggataaa ga
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' Flanco 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtaacgc gtgtacaagt tgtggaacaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5'
Lh-D-LDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttacctg caggctagat ttatgacaaa gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3'
Lh-D-LDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctacccctg caggaaaact tgttcttgtt ca
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' del Cromosoma de PDC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcaccaag gccttcaaca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' D-LDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgtcttga cgtaatacac gtgcagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' PDC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaaagaaa agctccacac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' PDC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccatacgct tataatcccc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1014
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus helveticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Una célula de levadura recombinante de una
especie que no acumula de forma natural piruvato, que comprende al
menos un gen de D-lactato deshidrogenasa exógeno
integrado en su genoma, en la que el gen de
D-lactato deshidrogenasa está unido de forma
operativa a secuencias promotoras y terminadoras funcionales.
2. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 1, que es de los géneros Candida o Kluyveromyces.
3. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 2, en la que la célula es de las especies C.
sonorensis o K. marxianus.
4. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 1, en la que la secuencia promotora es al menos el
90% homóloga a un promotor que es nativo de la especie de
levadura.
5. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 4, en la que la secuencia terminadora es al menos el
90% homóloga a un terminador que es nativo de la especie de
levadura.
6. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 4, en la que la especie de levadura contienen un gen
de PDC nativo que tiene un promotor PDC nativo, y la secuencia
promotora es al menos el 90% homóloga al promotor PDC nativo.
7. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 6, en la que el gen de PDC nativo tiene un terminador
PDC nativo, y la secuencia terminadora es al menos el 90% homóloga
al terminador PDC nativo.
8. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 7, en la que se deleciona el gen de PDC nativo.
9. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 1, en la que la especie de levadura contiene un gen
de PDC nativo, y el gen de PDC nativo se deleciona.
10. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una
proteína de D-lactato deshidrogenada de
Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum y
Lactobacillus pentosus.
11. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 10, en la que el promotor es de una especie de
levadura de los géneros Kluyveromyces o
Saccharomyces.
12. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 11, en la que el promotor es de Kluyveromyces
marxianus.
13. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 11, en la que el promotor es de Saccharomyces
cerevisiae.
14. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 1, que muestra actividad de PDC reducida.
15. La célula de levadura recombinante de la
reivindicación 8, en la que el que el gen de D-LDH
se integra en el locus del gen de PDC delecionado.
16. Un método para fermentar un hidrato de
carbono a ácido láctico, que comprende cultivar la célula de la
reivindicación 1 en condiciones de fermentación en un medio que
contiene un hidrato de carbono que es fermentable por la célula.
17. Un método para fermentar un hidrato de
carbono a ácido láctico, que comprende cultivar la célula de la
reivindicación 8 en condiciones de fermentación en un medio que
contiene un hidrato de carbono que es fermentable por la célula.
18. Un método para fermentar un hidrato de
carbono a ácido láctico, que comprende cultivar la célula de la
reivindicación 9 en condiciones de fermentación en un medio que
contiene un hidrato de carbono que es fermentable por la célula.
19. Un método para fermentar un hidrato de
carbono a ácido láctico, que comprende cultivar la célula de la
reivindicación 14 en condiciones de fermentación en un medio que
contiene un hidrato de carbono que es fermentable por la célula.
20. Un método de acuerdo con el método de las
reivindicaciones 16, 17, 18 ó 19, que comprende además la etapa de
convertir al menos una porción del ácido láctico en lactato.
\newpage
21. El método de la reivindicación 20, que
comprende además la etapa de polimerizar el ácido láctico para
formar un polímero o co-polímero de polilacturo.
22. Un método para producir ácido láctico, que
comprende cultivar las células de la reivindicación 1 en condiciones
de fermentación en un medio que contiene un azúcar que es
fermentable por la célula.
23. Un método para producir ácido láctico, que
comprende cultivar la célula de la reivindicación 8 en condiciones
de fermentación en un medio que contiene un azúcar que es
fermentable por la célula.
24. Un método para producir ácido láctico, que
comprende cultivar la célula de la reivindicación 9 en condiciones
de fermentación en un medio que contiene un azúcar que es
fermentable por la célula.
25. Un método para producir ácido láctico, que
comprende cultivar la célula de la reivindicación 14 en condiciones
de fermentación en un medio que contiene un azúcar que es
fermentable por la célula.
26. Un método de acuerdo con las
reivindicaciones 22, 23, 24 ó 25, que comprende además la etapa de
convertir al menos una porción del ácido láctico en lacturo.
27. El método de la reivindicación 26, que
comprende además la etapa de polimerizar el lacturo para formar un
polímero o co-polímero de polilacturo.
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