ES2290955T3

ES2290955T3 - Adresinas vasculares de mucosas y sus usos.

Info

Publication number: ES2290955T3
Application number: ES96906504T
Authority: ES
Inventors: Michael J. Briskin; Douglas J. Ringler; Dominic Picarella; Walter Newman
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2016-02-12
Also published as: DE69637155T2; WO1996024673A1; DK0808367T3; JP4205162B2; AU4986296A; JPH10513365A; CA2212702A1; EP0808367A1; PT808367E; CA2212702C; MX9706049A; DE69637155D1; EP0808367B1; ATE366809T1; NZ303523A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A ACIDOS NUCLEICOS AISLADOS Y/O RECOMBINANTES QUE CODIFICAN MADCAMS DE PRIMATES Y A LAS PROTEINAS O POLIPEPTIDOS DENOMINADOS AQUI COMO MADCAMS DE PRIMATES AISLADOS Y/O RECOMBINANTES. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A PREPARACIONES DE ACIDOS NUCLEICOS RECOMBINANTES, QUE CONTIENEN UN ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UN MADCAM DE PRIMATE DE LA PRESENTE INVENCION, UNA PORCION DEL MISMO, O UNA VARIANTE RESPECTO A LAS CELULAS HUESPED QUE CONTIENEN TALES PREPARACIONES, UTILES PARA PRODUCIR PROTEINAS RECOMBINANTES; AL EMPLEO DE LOS ACIDOS NUCLEICOS Y/O LAS PROTEINAS EN ENSAYOS DE IDENTIFICACION DE INHIBIDORES (ANTAGONISTAS) DE LA FUNCION DE MADCAMS DE PRIMATES; Y A LOS ANTICUERPOS FRENTE A MADCAM DE PRIMATES, QUE SON UTILES EN METODOS IN VITRO Y EN APLICACIONES DIAGNOSTICAS Y/O TERAPEUTICAS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE AL TRATAMIENTO DE INDIVIDUOS, EN PARTICULAR HUMANOS, QUE PADECEN UNA ENFERMEDAD (ENFERMEDAD INFLAMATORIA DEL INTESTINO) ASOCIADA CON CAPTACION DE LEUCOCITOS POR EL TRACTO GASTROINTESTINAL U OTROS TEJIDOS, POR EJEMPLO, COMO CONSECUENCIA DE LA UNION DE LEUCOCITOS A LAS CELULAS QUE EXPRESAN LA MOLECULA DE MADCAM (ENDOTELIO ASOCIADO AL INTESTINO), QUE CONSISTE EN ADMINISTRAR AL INDIVIDUO UNA CANTIDAD EFICAZ DE UN AGENTE, COMO POR EJEMPLO UN ANTICUERPO QUE INHIBE LA UNION DE LOS LEUCOCITOS A MADCAM.

Description

Adresinas vasculares de mucosas y sus usos.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos que regresan de la circulación a los tejidos linfoides y la emigración a sitios de inflamación están regulados por la interacción con receptores expresados en las vénulas postcapilares, incluidas las vénulas altamente endoteliales (VAE), que se encuentran en los tejidos linfoides secundarios (por ejemplo, nódulos linfáticos mesentéricos), placas de Peyer (PP)) (Bevilacqua, M.P., Annu. Rev. Immunol., 11: 767-804 (1993); Butcher, E.C., Cell, 67: 1033-1036 (1991); Picker, L.J. y col., Annu. Rev. Immunol., 10: 561-591 (1992), y Springer, T.A., Cell, 76: 301-314 (1994)). Estas interacciones son específicas de tejido en cuanto a su naturaleza.

La inflamación (por ejemplo, la inflamación crónica) se caracteriza por infiltración del tejido afectado por leucocitos, tales como linfocitos, linfoblastos y fagocitos mononucleares. La notable selectividad por la que los leucocitos migran preferentemente a diversos tejidos tanto durante la circulación normal como durante la inflamación, resulta de una serie de sucesos adhesivos y activantes que implican múltiples interacciones receptor-ligando, tal como proponen Butcher y otros (Butcher, E.C., Cell, 67: 1033-1036 (1991); vonAdrian, U.H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7538 (1991); Mayadas, T.N. y col., Cell, 74: 541 (1993); Springer, T.A., Cell, 76: 301 (1994)). Como etapa inicial, hay una interacción transitoria y rodante entre los leucocitos y el endotelio, que resulta de la interacción de las selectinas (y por las \alpha4 integrinas en algunos casos) con sus ligandos carbohidratados. Esta interacción, que se caracteriza por rodar en la dirección del flujo, puede ser valorada por métodos conocidos (Lawrence, M.B. y T.A. Springer, Cell, 65: 859 (1991); WO 92/21746, Springer y col. (10 de Diciembre de 1992)). Esto va seguido de sucesos de activación mediados por quimioatrayentes tales como las quimiokinas y sus receptores, que producen activación de la adhesión de las integrinas e influyen en la dirección de migración de los leucocitos a través de las paredes vasculares. Dichas señales secundarias disparan a su vez la firme adhesión de los leucocitos al endotelio a través de las integrinas de los leucocitos y sus ligandos endoteliales (receptores de tipo Ig y los ECM) y posterior migración transendotelial desde la circulación a través del endotelio vascular.

En tejidos linfoides secundarios, tales como las placas de Peyer (PPs) y los nódulos linfoides (por ejemplo, los nódulos linfoides periféricos (NLP)), el tráfico de leucocitos y su regreso están regulados por interacciones de los receptores de regreso sobre la superficie de los leucocitos con las células endoteliales que revisten las vénulas postcapilares, notablemente las vénulas altamente endoteliales (VAE) (Gowans, J.L. y E.J. Knight, Proc. R. Soc. Lond., 159: 257 (1964)). Los receptores denominados adresinas vasculares, que están presentes sobre la superficie de la célula endotelial, regulan la migración y posterior extravasación de los subgrupos de linfocitos. Las adresinas vasculares muestran patrones restringidos de expresión y esta expresión específica de tejido hace una importante contribución a la especificidad del tráfico de leucocitos (Picker, L.J. y E.C. Butcher, Annu. Rev. Immunol., 10: 561-591 (1992); Berg, E.L. y col., Cellular and molecular mechanisms of inflammation, 2: 111 (1991); Butcher, E.C., Cell, 67: 1033-1036 (1991)).

La adresina vascular de mucosas MAdCAM-1 (Molécula de Adhesión Celular Adresina de Mucosas-1) es un receptor de adhesión de la superfamilia de las inmunoglobulinas para los linfocitos, que se distingue de VCAM-1 y de ICAM-1. MAdCAM-1 fue identificada en el ratón como una glicoproteína de \sim60 kd, que es selectivamente expresada en sitios de extravasación de linfocitos. Concretamente, la expresión de MAdCAM-1 fue descrita en las células endoteliales vasculares de los tejidos mucosales, incluidos los tejidos asociados al intestino o los órganos linfoides, tales como las placas de Peyer y las vénulas de la lámina propia del intestino delgado y grueso, y la glándula mamaria lactante, pero no en los nódulos linfáticos periféricos. MAdCAM-1 está implicada en la unión de los linfocitos a las placas de Peyer (Streeter, P.R. y col., Nature, 331: 41-46 (1988); Nakache, M. y col., Nature, 337: 179-181 (1989); Picker, L.J. y col., Annu. Rev. Immunol., 10: 561-591 (1992); Briskin, M.J. y col., Nature, 363: 461 (1993); Berg, E.L. y col., Nature, 366: 695-698 (1993); Berlin, C. y col., Cell, 74: 185-195 (1993)). MAdCAM-1 puede ser inducida in vitro por estímulos proinflamatorios (Sikorski, E.E. y col., J. Immunol., 151: 5239-5250 (1993)).

MAdCAM-1 se une específicamente a la integrina de linfocitos \alpha4\beta7 (a la que también se hace referencia como LPAM-1 (ratón), \alpha4\betap (ratón)), que es un receptor de regreso de los linfocitos implicado en el regreso a las placas de Peyer (Berlin, C. y col., Cell, 80: 413-422 (1994); Berlin, C. y col., Cell, 74: 185-195 (1993), y Erle, D.J. y col., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). Contrariamente a VCAM-1 y a fibronectina, que interaccionan tanto con \alpha4\beta1 como con \alpha4\beta7 (Berlin, C. y col., Cell, 74: 185-195 (1993); Strauch, U.S. y col., Int. Immunol., 6: 263 (1994)), MAdCAM-1 es un receptor selectivo para \alpha4\beta7.

La enfermedad inflamatoria del intestino (EII), tal como la colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn, por ejemplo, puede ser una enfermedad debilitante y progresiva que implique inflamación del tracto gastrointestinal. Estando afectada una población estimada de dos millones de personas solamente en los Estados Unidos, los síntomas incluyen dolor abdominal, calambres, diarrea y hemorragia rectal. Los tratamientos para la EII han incluido fármacos antiinflamatorios, tales como corticosteroides y sulfasalazina), fármacos inmunosupresores (tales como 6-mercaptopurina, ciclosporina y azatioprina) y cirugía (tal como colectomía), Podolsky, New Engl. J. Med., 325: 928-937 (1991) y Podolsky, New Engl. J. Med., 325: 1008-1016 (1991).

\newpage

Algunos estudios han sugerido que la molécula de adhesión celular, ICAM-1, media en el reclutamiento de leucocitos a los sitios inflamatorios a través de la adhesión a los ligandos de la superficie de los leucocitos, es decir, Mac-1 o LFA-1 (Springer, Nature, 346: 425-434 (1990)). Además, la molécula de adhesión a células vasculares-1 (VCAM-1), que reconoce la integrina \alpha4\beta1 (VLA-4), ha sido descrita como poseedora de una función en el reclutamiento de leucocitos in vivo (Silber y col., J. Clin. Invest., 93: 1554-1563 (1994)). Se ha propuesto que la EII puede ser tratada bloqueando la interacción de ICAM-1 con LFA-1 o Mac-1, o de VCAM-1 con \alpha4\beta1 (por ejemplo, WO 93/15764). Sin embargo, es probable que estos objetivos terapéuticos estén implicados en procesos inflamatorios en múltiples órganos y un bloqueo funcional podría causar una disfunción inmune sistémica.

Contrariamente a VCAM-1 e ICAM-1, MAdCAM es preferentemente expresada en el tracto gastrointestinal, se une a la integrina \alpha4\beta7 que se encuentra en los linfocitos y participa en el regreso de estas células a los sitios de mucosas, tales como las placas de Peyer de la pared intestinal (Hamman y col., Journal of Immunology, 152: 3282-3293 (1994)). El uso de inhibidores de la unión de MAdCAM al receptor, \alpha4\beta7, en el tratamiento de enfermedades tales como la EII no ha sido sugerido.

Además, aunque los genes y proteínas \alpha4 y \beta7 humanos han sido identificados (Yuan y col., Int. Immunol., 2: 1097-1108 (1990); Erle y col., J. Biol. Chem., 266: 11009-11016 (1991); Bevilacqua, M.P., Annu. Rev. Immunol., 11: 767-804 (1993); Springer T.A., Cell, 76: 301-314 (1994)); no se ha clonado ni caracterizado la MAdCAM-1 humana o de primates.

La WO94/13312 trata de la provisión de ácidos nucleicos y proteínas purificados de mamíferos que codifican adresinas mucosales. Las proteínas, los ácidos nucleicos y los fragmentos de los mismos sirven para múltiples usos en la modulación de las interacciones de regreso de los leucocitos al tejido mucosal. Además, los fragmentos de proteínas pueden actuar como antígenos para producir anticuerpos específicos para dominios concretos de la adresina mucosal, y los ácidos nucleicos pueden servir como sondas para la elaboración de antisentido para su incorporación en huéspedes que pueden ser alogénicos o xenogénicos a la fuente del ADN, para la expresión de la proteína y similares.

Resumen de la invención

En uno de sus aspectos la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica:

(a): una MAdCAM de primate de producción natural, o

(b): una variante funcional de la misma que se une a la integrina \alpha4\beta7; o

(c): un fragmento funcional de una MAdCAM de primate de producción natural que se une a la integrina \alpha4\beta7 y consta de al menos un dominio de tipo inmunoglobulina, en el que la secuencia de aminoácidos de dicha variante funcional comparte al menos un 75% de semejanza con la secuencia de una proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:2), la Figura 2 (SEC ID NO:4) o la Figura 3 (SEC ID NO:6) y la semejanza de la secuencia del aminoácido se determina mediante el método de Clustal con tabla de pesos de residuos pesados PAM250, empleando una penalización de hueco de 10 y una penalización de longitud de hueco de 10 y parámetros de alineación por parejas de "ktuple" = 1, penalización de hueco = 3, ventana = 4 y diagonales salvadas = 5).

Otro aspecto de la invención se refiere a una proteína aislada que tiene la secuencia del aminoácidos de:

(a): una MAdCAM de primate de producción natural, o

(c): un fragmento funcional de una MAdCAM de primate de producción natural que se une a la integrina \alpha4\beta7 y consta de al menos un dominio de tipo inmunoglobulina, en el que la secuencia de aminoácido de dicha variante funcional comparte al menos un 75% de semejanza con la secuencia de una proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:2), la Figura 2 (SEC ID NO:4) o la Figura 3 (SEC ID NO:6) y la semejanza de la secuencia del aminoácido se determina mediante el método de Clustal con la tabla de pesos de residuos pesados PAM250, empleando una penalización de hueco de 10 y una penalización de longitud de hueco de 10 y parámetros de alineación por parejas de "ktuple" = 1, penalización de hueco = 3, ventana = 4 y diagonales salvadas = 5).

Otro aspecto de la invención se refiere a una MAdCAM de primate de producción natural aislada con una o más funciones seleccionadas del grupo que consta de la unión a una integrina \alpha4\beta7 y la mediación de adhesión celular.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de elaborar una proteína de la invención que consta de mantener una célula huésped que contiene ácido nucleico que codifica dicha proteína bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico, mediante el cual se produce dicha proteína.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento recombinante de antigeno del mismo que une una MAdCAM de primate de producción natural.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno para su uso en la terapia o diagnosis.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno para la elaboración de un medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de detección de una MAdCAM de primate seleccionado en una muestra que consta de:

(a): poner en contacto una muestra con un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo a antígeno que se une a una MAdCAM de primate aislada en condiciones adecuadas para la unión específica de dicho anticuerpo o fragmento al mismo y

(b): detectar los complejos anticuerpo-MAdCAM formados entre dicho anticuerpo o fragmento y la MAdCAM:

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de detección o identificación de un ligando de MAdCAM de primate o un agente que se une a una MAdCAM de primate, compuesto por la combinación de un agente para comprobar con una proteína aislada en condiciones adecuadas para la unión del ligando a la misma y la detección de la formación de un complejo entre dicho agente y dicha proteína.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de detección de un inhibidor de la unión de MAdCAM de primate natural a un ligando de la misma que consta de:

a) combinar un agente que ha de ser estudiado con un ligando de dicha MAdCAM de primate y una composición consistente en MAdCAM de primate aislada y/o recombinante según la invención en condiciones adecuadas para la unión del ligando a la misma y

b) detectar o medir la unión entre la MAdCAM de primate y el ligando, mediante lo cual una reducción de la unión en comparación con un control adecuado indica que el agente es un inhibidor.

La presente invención se refiere a proteínas o polipéptidos, a los que se hace aquí referencia como MAdCAMs de primate aisladas y/o recombinantes (por ejemplo, esencialmente puras). En una realización, la MAdCAM de primate puede unirse selectivamente a células que expresen la integrina \alpha4\beta7, particularmente linfocitos. Las proteínas recombinantes de la presente invención, incluidas las variantes, pueden ser producidas en células huésped tal y como se describe aquí. Además, se pueden producir anticuerpos reactivos con las proteínas de la presente invención usando una MAdCAM de primate o una variante de la misma como inmunógeno, por ejemplo. Dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos son útiles en aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser usados en la purificación y el estudio de MAdCAMs, en la identificación de células que expresan la MAdCAM y en la detección o cuantificación de MAdCAMs en una muestra.

La invención se relaciona asimismo con ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes (por ejemplo, esencialmente puros) que codifican una MAdCAM de primate, tal como las MAdCAMs humanas. En otro aspecto, la invención se relaciona con constructos de ácido nucleico recombinante, tales como plásmidos o vectores retrovíricos, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención o una porción de la misma. Los ácidos nucleicos y constructos pueden ser usados para producir MAdCAMs de primate recombinantes. En otra realización, el ácido nucleico codifica un ácido nucleico antisentido que puede hibridarse con un segundo ácido nucleico codificante de una MAdCAM de primate y que puede inhibir la expresión de la proteína (por ejemplo, cuando se introduce en células).

La presente invención también abarca métodos de identificación de ligandos y/o inhibidores (por ejemplo, antagonistas) de la función de MAdCAM. Por ejemplo, la MAdCAM de primates, incluidas sus variantes, puede ser usada en ensayos (por ejemplo, ensayos de adhesión) diseñados para identificar antagonistas que bloquean la unión de MAdCAM al ligando, la integrina \alpha4\beta7.

La invención se relaciona además con métodos de terapia, incluido un método de tratamiento de un individuo que sufre de una enfermedad asociada al reclutamiento de leucocitos (tales como linfocitos o monocitos) hacia el tracto gastrointestinal u otros tejidos como resultado de la unión de los leucocitos al endotelio asociado al intestino que expresa la molécula MAdCAM, consistente en administrar al individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un primate) una cantidad efectiva de un agente o compuesto, tal como un anticuerpo, que inhibe la unión de los leucocitos a la MAdCAM endotelial. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, quimérico y/o humanizado o un fragmento del mismo de unión a antígeno e inhibe la adhesión de leucocitos que expresan una integrina que contiene la cadena \beta7 (tal como \alpha4\beta7) al endotelio que expresa MAdCAM. En una realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de unión a antígeno tiene la especificidad antigénica de un anticuerpo monoclonal seleccionado entre el grupo consistente en FIB 21, FIB 30, FIB 504 y ACT-1. Las enfermedades inflamatorias intestinales, tales como, aunque sin limitación, la colitis ulcerativa, la enfermedad de Crohn, la Bursitis, la enfermedad celíaca, la colitis microscópica o colagenosa y la gastroenteritis eosinofílica, pueden ser tratadas según el método reivindicado.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 1) determinada a partir de subclones del clon de ADNc 4 codificante de la MAdCAM-1 humana y de la secuencia de la proteína predicha codificada por el marco de lectura abierto (MAdCAM-1, SEC ID Nº: 2). El péptido señal predicho y la región de transmembrana están subrayados en negrilla. Los residuos de cisteína de los dos dominios de tipo Ig están rodeados por un recuadro, al igual que los sitios potenciales de glicosilación ligados a N. El dominio de mucina, que contiene la repetición PPDTTS (Q/P)E consistente en 71 aminoácidos está rodeado por una línea negrilla fina.

La Figura 2 es una ilustración de la secuencia nucleotídica (SEC ID Nº: 3) determinada a partir de los subclones del clon de ADNc 20 codificante de la MAdCAM-1 humana y la secuencia de la proteína predicha codificada por el marco de lectura abierta (MAdCAM-1, SEC ID Nº: 4). El péptido señal predicho y la región de transmembrana están subrayados en negrilla. Los residuos de cisteína de los dos dominios de tipo Ig están en un recuadro, al igual que los sitios potenciales de glicosilación ligada a N. El dominio de mucina, que contiene la repetición PPDTTS(Q/P)E consistente en 47 aminoácidos está rodeado por una línea negrilla fina.

La Figura 3 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 5) determinada a partir de los subclones del clon de ADNc 31D codificante de la MAdCAM-1 de macaco y la secuencia de la proteína predicha codificada por el marco de lectura abierto (MAdCAM-1, SEC ID Nº: 6). El péptido señal predicho y la región de transmembrana están subrayados en negrilla. Los residuos de cisteína de los dos dominios de tipo Ig están en un recuadro. El dominio de mucina, que contiene una sola repetición PPDTTS (Q/P)E, está rodeado de una línea negrilla fina.

Las Figuras 4A-4B son histogramas que ilustran la unión selectiva de las células transfectadas con MAdCAM-1 humana a linfocitos que expresan \alpha4\beta7. La Figura 4A ilustra los resultados de un experimento en el cual se unieron células RPMI 8866 (0,5 X 10^{6}/pocillo), que expresan \alpha4\beta7 (y no \alpha4\beta1), a células CHO/P que expresan MAdCAM-1 murina o humana, pero no se unieron a células CHO/P transfectadas con VCAM-1 humana o a células CHO/P transfectadas con pcDNA-3. La Figura 4B ilustra los resultados de un experimento en el cual se unieron células CHO/P transfectadas con VCAM-1 humana a células Jurkat (que expresan altos niveles de \alpha4\beta1), pero no pudieron unirse a células CHO/P transfectadas con MAdCAM-1 murina o humana o a células CHO/P transfectadas con pcDNA-3 como control. La unión es mostrada como el número de células RPMI 8866 unidas por célula CHO/P (Figura 4A) o células Jurkat unidas por célula CHO/P (Figura 4B) en una media de al menos cuatro campos (objetivo 10X) \pm el error standard. Las reacciones de unión incluían IgG control, anti-\alpha4\beta7 (anticuerpo monoclonal ACT-1) o anti-MAdCAM-1 murina (anticuerpo monoclonal MECA-367) como se indica.

La Figura 5 es un histograma que ilustra que la MAdCAM-1 humana codificada por los clones 4 y 20 se une a células RPMI 8866 y que la unión es inhibida por el anticuerpo ACT-1. Las barras representan una media de cuatro campos a partir de un único experimento con las desviaciones standard tal como se muestra.

La Figura 6 es una ilustración de las estructuras de dominio deducidas de la MAdCAM-1 murina y humana. Los dos dominios de inmunoglobulinas N-terminales unidos por enlaces disulfuro (indicados por lazos) implicados en la adhesión celular, las regiones de transmembrana y una cola citoplásmica están presentes en proteínas murinas, de macaco y humanas. La MAdCAM-1 humana tiene una cola citoplásmica más larga. Una repetición de ocho aminoácidos encontrada en el dominio de mucina está presente en 4 u 8 copias en las isoformas humanas, pero aparece sólo una vez en la murina y en la de macaco.

Las Figuras 7A y 7B son ilustraciones gráficas de puntuaciones histológicas de actividad inflamatoria y lesión epitelial del colon izquierdo (descendente) y derecho (ascendente) de ratones expuestos a 10 días de DSS en el agua de bebida. Se muestran tres grupos de ratones, consistentes en grupos que recibieron un anticuerpo IgG2a de rata irrelevante, anticuerpos FIB 21 o FIB 30.

La Figura 8 es un gráfico de las cuentas \gamma por minuto (cpm) (\pm 1 SEM) como porcentaje del total de cuentas de entrada de ratones a los que se dio DSS en el agua de bebida durante 10 días. Seis grupos consistían en controles negativos a los que se dio sólo agua, controles positivos a los que se dio sólo DSS, grupos de ensayo a los que se dio un anticuerpo IgG2a de rata irrelevante, FIB21, MECA-367 o FIB21 con MECA-367.

La Figura 9 es un gráfico que representa las puntuaciones histológicas (\pm 1 SEM) para la fusión de vellosidades obtenida de muestras de biopsia de yeyuno de titís comunes antes y el día 14º del tratamiento con 2 mg/kg/día de anticuerpo monoclonal ACT-1.

La Figura 10 es un gráfico que representa las puntuaciones histológicas (\pm 1 SEM) para la atrofia de vellosidades obtenida de muestras de biopsia de yeyuno de titís comunes antes y el día 14º del tratamiento con 2 mg/kg/día de anticuerpo monoclonal ACT-1.

La Figura 11 es una ilustración de la consistencia de las heces de animales con colitis (titís de cabeza algodonosa) tratados con anticuerpo ACT-1.

La Figura 12 es una ilustración de la actividad inflamatoria en animales con colitis (titís de cabeza algo-donosa) tratados con anticuerpo ACT-1 valorada histológicamente.

La Figura 13 es un diagrama que ilustra el protocolo experimental para el tratamiento de tití de cabeza algodonosa con colitis crónica con anticuerpo ACT-1.

La Figura 14 es un gráfico que ilustra el efecto terapéutico sobre la consistencia de las heces de la administración de anticuerpo ACT-1 (-\medbullet-) o un anticuerpo emparejado por isotipo e irrelevante (-\medcirc-) a titís de cabeza algodonosa con colitis crónica.

La Figura 15 es un histograma que ilustra el efecto terapéutico de la inmunoterapia con ACT-1 sobre la actividad inflamatoria del colon en titís de cabeza algodonosa con colitis crónica tratados con anticuerpo ACT-1 o un anticuerpo monoclonal control irrelevante. Cada barra representa la media dentro de un grupo de tratamiento del cambio absoluto en la puntuación de la actividad inflamatoria \pm 1 SEM, computado para cada animal comparando la puntuación en un punto temporal particular con la puntuación del mismo animal el Día 0.

La Figura 16 es un histograma que ilustra los números absolutos de linfocitos \alpha4\beta7+ en la circulación periférica en titís de cabeza algodonosa con colitis tratados con anticuerpo ACT-1. Cada barra representa la media (\pm 1 SEM) de la concentración de células \alpha4\beta7+ en sangre detectada por ACT-1.

Las Figuras 17A-17E son gráficos que ilustran los resultados de un análisis FACS que muestra la tinción específica de células Hut 78 con quimeras MAdCAM-Ig. Los sobrenadantes de células COS transitoriamente transfectadas con constructos quiméricos de MAdCAM-Ig humana (de cuatro transfecciones independientes) fueron incubados con células HuT 78 en presencia de Mn^{++} 2 mM y la quimera unida fue detectada usando un anticuerpo conjugado a ficoeritrina específico para IgG1 humana. Figura 17A, control de medio; Figuras 17B-17C, sobrenadantes de células transfectadas con el Clon 21 (consistente en todo el dominio extracelular de la MAdCAM humana); Figuras 17D-17E, sobrenadantes de células Clon 38 (consistente en los dos dominios Ig N-terminales de la MAdCAM humana). Unión después de preincubar las células con medio solamente (a la derecha). La unión fue inhibida por preincubación de las células con MAb FIB 504 anti-\beta7 (a la izquierda).

La Figura 18 es un gráfico que ilustra la diferencia en el peso corporal de ratones scid reconstituidos con 1 X 10^{6} células CD45RB^{hi} T (\blacksquare) en relación a ratones scid control reconstituidos con un número igual de células CD45RB^{lo} T (\Delta) derivadas de bazo de BALB/c. Los ratones receptores fueron pesados a intervalos semanales para evaluar la progresión de la enfermedad.

La Figura 19 es un histograma que ilustra la mayor acumulación en el colon de células de nódulos linfáticos mesentéricos marcadas con ^{111}In inyectadas por vía intravenosa en ratones scid reconstituidos con células CD45RB^{hi} T en comparación con la acumulación en el colon de ratones scid reconstituidos con un número igual de células CD45RB^{lo} T y la inhibición de la acumulación mediante tratamiento durante 2 semanas con una combinación de anticuerpos monoclonales anti-\beta7 (FIB 504) y anti-MAdCAM (MECA-367). Los resultados son expresados como % de cuentas por minuto (CPM) en colon normalizadas con respecto a CPM en bazo y corregidas para el fondo.

La Figura 20 es un histograma que ilustra la completa inhibición de acumulación de células marcadas con ^{111}In (inyectadas intravenosamente) en el colon de ratones scid mediante tratamiento durante 4 meses (partiendo del momento de la reconstitución) con FIB 504, MECA-367 o FIB 504 más MECA-367. De izquierda a derecha: ratones scid reconstituidos con células CD45RB^{lo} T, que recibieron IgG2a de rata control irrelevante emparejada por isotipo; ratones scid reconstituidos con células CD45RB^{hi} T, que recibieron o bien IgG2a de rata control irrelevante emparejada por isotipo, o bien FIB 504, MECA-367 o FIB 504 + MECA-367.

La Figura 21 es un histograma que ilustra la reducción en el número de células CD4^{+} T en el colon ascendente (derecha) o descendente (izquierda) en ratones scid tratados durante 14 días con una combinación de FIB 504 más MECA-367 en comparación con ratones tratados con un anticuerpo IgG2a de rata control emparejado por isotipo según se determina por tinción de secciones congeladas de colon izquierdo y derecho con un anticuerpo de rata específico para CD4 de ratón.

Descripción detallada de la invención Proteínas y péptidos

La presente invención se relaciona con proteínas o polipéptidos aislados y/o recombinantes (incluyendo, por ejemplo, esencialmente puros) denominados MAdCAMs (Moléculas de Adhesión Celular Adresinas de Mucosas) de primates y variantes de las MAdCAMs de primates. En una realización preferida, las proteínas aisladas y/o recombinantes de la presente invención tienen al menos una propiedad, actividad o función característica de una MAdCAM de primate (según se define aquí), tal como función de unión (por ejemplo, la capacidad de unirse a una integrina \alpha4\beta7) y/o función de molécula de adhesión celular (por ejemplo, la capacidad de mediar en la adhesión celular, tal como la adhesión dependiente de \alpha4\beta7 in vitro y/o in vivo) y/o una propiedad inmunológica según se define aquí. Por ejemplo, algunas proteínas de la presente invención pueden unirse selectivamente a una integrina \alpha4\beta7 y así mediar en la adhesión celular dependiente de \alpha4\beta7 a células portadoras de la integrina \alpha4\beta7, tales como leucocitos (especialmente linfocitos tales como células T o B) in vitro y/o in vivo. Em un aspecto, las proteínas de la presente invención pueden mediar en la adhesión celular heterotípica (por ejemplo, de células endoteliales a leucocitos tales como linfocitos).

En otra realización, las proteínas de la presente invención pueden unirse a una integrina \alpha4\beta7 de primate de la misma especie de primate o de otra diferente y/o tener función de moléculas de adhesión celular (por ejemplo, la capacidad de mediar en la adhesión celular tal como la adhesión dependiente de \alpha4\beta7 in vitro y/o in vivo). Por ejemplo, tal como se muestra aquí, las proteínas MAdCAM-1 humanas y de macaco, producidas en células de mamífero por expresión de los clones de ADNc, pueden unirse selectivamente a la integrina \alpha4\beta7 presente en los leucocitos humanos y pueden funcionar como moléculas de adhesión celular capaces de mediar en la adhesión selectiva a células portadoras de la integrina \alpha4\beta7.

Las proteínas o polipéptidos a los que se hace aquí referencia como "aislados" son proteínas o polipéptidos purificados a un estado más allá de aquél en el que existen en células de mamífero. Las proteínas o polipéptidos "aislados" incluyen proteínas o polipéptidos obtenidos por los métodos aquí descritos, por métodos similares u otros métodos adecuados, incluyendo proteínas o polipéptidos esencialmente puros, proteínas o polipéptidos producidos por síntesis química (por ejemplo, péptidos sintéticos) o por combinaciones de métodos biológicos y químicos y proteínas o polipéptidos recombinantes que son aislados. Las proteínas pueden ser obtenidas en un estado aislado de al menos aproximadamente un 50% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente un 75% en peso y, más preferiblemente, en forma esencialmente pura. Las proteínas o polipéptidos a los que se hace aquí referencia como "recombinantes" son proteínas o polipéptidos producidos por la expresión de ácidos nucleicos recombinantes.

Tal como se utiliza aquí, "MAdCAM de primate" se refiere a proteínas MAdCAM de primate naturales o endógenas, a proteínas que tienen una secuencia de amino-ácidos que es la misma que la de una MAdCAM de primate correspondiente natural o endógena (por ejemplo, proteínas recombinantes) y a variantes funcionales de cada una de las anteriores (por ejemplo, fragmentos funcionales y/o mutantes producidos por mutagénesis y/o técnicas recombinantes). En consecuencia, tal como se ha definido aquí, el término incluye MAdCAM de primate madura, proteínas MAdCAM glicosiladas o no glicosiladas, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas de las MAdCAM de primates (por ejemplo, producidas por ayustamiento alternativo u otros procedimientos celulares) y fragmentos funcionales.

Las proteínas MAdCAM de primates naturales o endógenas incluyen proteínas de tipo salvaje tales como la MAdCAM madura, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas que aparecen de forma natural en primates (por ejemplo, humanos u otros primates no humanos, tales como macaco o tití de cabeza algodonosa). Dichas proteínas pueden ser recuperadas a partir de una fuente que produzca de forma natural MAdCAM de primates. Se hace referencia a estas proteínas y proteínas MAdCAM de primates que tienen la misma secuencia de aminoácidos que la correspondiente MAdCAM de primate natural o endógena por el nombre del primate correspondiente. Por ejemplo, cuando el primate correspondiente es un humano, la proteína es denominada proteína MAdCAM humana (por ejemplo, una MAdCAM humana recombinante producida en una célula huésped adecuada).

Como "variantes funcionales" de las MAdCAMs de primates se incluyen fragmentos funcionales, proteínas mutantes funcionales y/o proteínas de fusión funcionales. En general, los fragmentos o porciones de la MAdCAM de primate abarcados por la presente invención incluyen aquéllos que tienen una deleción (es decir, uno o más deleciones) de un aminoácido (es decir, uno o más aminoácidos) en relación con la MAdCAM de primate madura (tal como deleciones N-terminales, C-terminales o internas). También se contemplan los fragmentos o porciones en los que sólo se han eliminado aminoácidos contiguos o en los que se han eliminado aminoácidos no contiguos en relación a la MAdCAM de primate madura.

En general, los mutantes o derivados de MAdCAMs de primates abarcados por la presente invención incluyen variantes naturales o artificiales que difieren por adición, deleción y/o substitución de uno o más residuos de aminoácido contiguos o no contiguos o polipéptidos modificados en los que están modificados uno o más residuos y mutantes consistentes en uno o más residuos modificados. Los mutantes preferidos son variantes naturales o artificiales de la MAdCAM de primate que difieren por adición, deleción y/o substitución de uno o más residuos de amino-ácido contiguos o no contiguos.

Un "fragmento o porción funcional", "mutante funcional" y/o "proteína de fusión funcional" de una MAdCAM de primate se refiere a una proteína u oligopéptido aislado y/o recombinante que tiene al menos una propiedad, actividad y/o función característica de una MAdCAM de primate, tal como función de unión (por ejemplo, la capacidad para unirse a una integrina \alpha4\beta7) y/o función de molécula de adhesión celular (por ejemplo, la capacidad de mediar en la adhesión celular tal como la adhesión dependiente de \alpha4\beta7 in vitro y/o in vivo) y/o que conserva al menos una propiedad inmunológica de una MAdCAM de primate.

Tal como se usa aquí, una proteína, polipéptido u oligopéptido que tiene "al menos una propiedad inmunológica" de una MAdCAM de primate es uno que (a) está unido por al menos un anticuerpo de una especificidad epitópica seleccionada que se une a una MAdCAM de primate natural o endógena o a una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la MAdCAM de primate natural o endógena (por ejemplo, MAdCAM-1 humana) y/o (b) es un inmunógeno capaz de inducir la formación en un animal adecuado de un anticuerpo de una especificidad epitópica seleccionada que se une a una MAdCAM de primate natural o endógena o a una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la MAdCAM de primate natural o endógena. Por ejemplo, un fragmento adecuado puede tener reacción cruzada con un anticuerpo que es producido frente a y/o es reactivo con la MAdCAM de primate
aislada.

Los fragmentos o mutantes adecuados pueden ser identificados por estudio selectivo. Por ejemplo, las regiones N-terminales, C-terminales o internas de la proteína pueden ser eliminadas por etapas y la proteína o polipéptido resultante puede ser estudiado selectivamente utilizando un ensayo adecuado de unión o adhesión, tal como un ensayo aquí descrito. Cuando la proteína resultante exhibe actividad en el ensayo, la proteína resultante ("fragmento") es funcional. La información concerniente a la estructura y función de la MAdCAM y otras moléculas de adhesión murinas y de las MAdCAMs de primate tal como se muestra aquí proporciona una base para dividir la MAdCAM de primates en dominios funcionales (véase más adelante).

El término variante incluye también las proteínas de fusión, consistentes en una MAdCAM de primates (por ejemplo, MAdCAM-1 humana madura) como primer resto, unida a un segundo resto que no aparece en la MAdCAM de primates tal como se encuentra en la naturaleza. De este modo, el segundo resto puede ser un aminoácido, oligopéptido o polipéptido. El primer resto puede estar en una localización N-terminal, en una localización C-terminal o interno con respecto a la proteína de fusión. En una realización, la proteína de fusión consiste en una MAdCAM humana o porción de la misma como primer resto y un segundo resto consistente en una secuencia de unión y un ligando de afinidad (por ejemplo, una enzima, un antígeno, un marcaje epitópico).

En otra realización, la proteína de fusión es una inmunoglobulina híbrida, tal como un híbrido consistente en un resto MAdCAM de primate fusionado en su extremo C al extremo N de un resto de inmunoglobulina (por ejemplo, una o más regiones constantes de inmunoglobulina, preferiblemente de origen primate), tales como los preparados según Capon y col., Patente EE.UU. Nº 5.428.130 y 5.225.538, cuyas enseñanzas son aquí incorporadas como referencia en su totalidad). La inmunoglobulina híbrida consiste en una proteína o polipéptido de fusión que contiene al menos una porción de una cadena de inmunoglobulina y, preferiblemente, al menos un dominio de inmunoglobulina completo (por ejemplo, CH1, bisagra). Se han descrito otros ejemplos de "inmunoadhesinas" (Watson, S.R. y col., Nature, 349: 164-167 (1991); Martin, S. y col., J. Virol., 67: 3561-3568 (1993); Staunton, D.E. y col., J. Exp. Med., 176: 1471-1476 (1992); Capon, D.J. y col., Nature, 337: 525-531 (1989); Jakubowski y col., J. Immunol., 155: 938-946 (1995)). Por ejemplo, se puede preparar una proteína de fusión consistente en toda o en una porción de una MAdCAM de primate (por ejemplo, humana) y una región constante de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina o porción de la misma (por ejemplo, preparando un ácido nucleico que codifique la proteína de fusión). Típicamente, la fusión es construida de tal modo que el extremo C-terminal de la MAdCAM se une al extremo N-terminal de la región constante de inmunoglobulina. Sin embargo, se pueden hacer proteínas de fusión en las cuales el extremo N-terminal de la MAdCAM está unido al extremo C-terminal de la región constante de inmunoglobulina. Preferiblemente, se utiliza una porción de la MAdCAM de primate que es suficiente para unirse a un ligando (por ejemplo, integrina \alpha4\beta7), tal como el dominio extracelular completo o una porción consistente en los dos dominios de inmunoglobulina N-terminales en donde se elimina la región de transmembrana (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3).

Se puede producir una variedad de moléculas híbridas de inmunoglobulinas (por ejemplo, monoméricas, homodiméricas, heterodiméricas, homotetraméricas, heterotetraméricas), dependiendo del tipo de región constante seleccionada y de la porción utilizada (por ejemplo, región constante de cadena ligera, región constante de cadena pesada (tal como las regiones constantes \gamma1, \gamma2, \gamma3, \gamma4, \alpha1, \alpha2, \delta, \varepsilon y \mu obtenidas de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM) y porciones de las mismas) en el polipéptido de fusión y de si están ensambladas en formas multiméricas entre sí y/o con otras inmunoglobulinas híbridas o cadenas de inmunoglobulina (véase Capon y col., Patente EE.UU. Nº 5.428.130 y 5.225.538). En una realización preferida, la proteína de fusión consiste en una región constante de cadena pesada completa o al menos una región de bisagra funcionalmente activa, dominio CH2 y CH3. Una región constante particular (por ejemplo, IgG1), variante o porciones de la misma pueden ser seleccionadas para confeccionar la función efectora. Por ejemplo, se puede incorporar una región constante mutada (variante) a una proteína de fusión para minimizar la unión a receptores Fc (Ejemplo 3, Winter y col., GB 2.209.757 B y Morrison y col., WO 89/07142) y/o para fijar el complemento (WO 94/29351, 22 de Diciembre de 1994), etc.

Como ejemplos de las proteínas "MAdCAM de primate" se incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico MAdCAM-1 humano o de macaco de la presente invención, tales como una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica o substancialmente según se indica en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), Figura 2 (SEC ID Nº: 4) o Figura 3 (SEC ID Nº: 6) y porciones funcionales de la misma. En una realización preferida, una MAdCAM de primate o variante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 55% similar, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75% similar y, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente un 90% similar a una proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), Figura 2 (SEC ID Nº: 4) o Figura 3 (SEC ID Nº: 6).

Estructura MAdCAM

La MAdCAM-1 murina, un miembro de la familia supergénica de las inmunoglobulinas, es una molécula de multidominio, consistente en secuencias tanto relacionadas con inmunoglobulinas como de tipo mucina (Briskin, M.J. y col., Nature, 363: 461 (1993)). Tal como se indica en la Figura 6, la forma murina contiene dos dominios amino-terminales de tipo inmunoglobulina que son homólogos a los dominios de los receptores de adhesión de tipo Ig, ICAM-1 y VCAM-1 y están implicados en la unión a integrinas. El tercer dominio de tipo inmunoglobulina (proximal a membrana), no estando relacionado con los receptores de adhesión de esta clase, comparte homología con otro miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas relacionadas con mucosas, IgA. Además de los tres dominios de tipo inmunoglobulina, la MAdCAM-1 murina tiene un dominio de tipo mucina rico en serina/treonina entre el segundo y el tercer dominio de tipo Ig. Estos elementos estructurales sugieren que MAdCAM-1 facilita más de una función en las cascadas de adhesión celular y estudios recientes de la MAdCAM-1 murina apoyan una función de la MAdCAM-1 en la unión tanto de selectinas como de integrinas (Moore, K.L. y col., J. Cell. Biol., 118: 445 (1992); Bargatze, R.F. y col., Immunity, 3: 99-108 (1995)). También en este sentido, se ha descrito que la MAdCAM-1 murina, cuando es expresada en nódulos linfáticos mesentéricos, puede presentar carbohidratos de unión a L-selectina asociados al epitopo de adresina de los nódulos periféricos, MECA-79 (Berg, E.L. y col., Nature, 366: 695 (1993)).

Tal como se describe aqu í, las proteínas MAdCAM-1 humanas y de macaco tienen dos dominios de tipo inmunoglobulina (de tipo Ig) que son homólogos a los dos dominios amino-terminales de unión a integrinas y de tipo inmunoglobulina de la MAdCAM-1 murina (Figuras 1-3 y 6). Sin embargo, la semejanza de secuencias dentro de la región homóloga al dominio mucina/IgA de la MAdCAM-1 murina es mucho menos aparente. Las regiones proximales a membrana de los receptores humanos y de macaco exhiben una variación considerable (comparándolas entre sí o con la MAdCAM-1 murina) con respecto a la longitud de la secuencia de tipo mucina y a la falta de un dominio Ig (de tipo IgA) proximal a membrana.

Se han identificado dos isoformas de MAdCAM-1 humana que exhibían polimorfismos simples de aminoácidos y variación en el número de copias de una repetición rica en serina/treonina/prolina en la región de mucina. Estas dos isoformas parecen estar codificadas en el ADN genómico, lo que sugiere una variación alélica y/o un procesamiento alternativo de esta secuencia. Estas dos isoformas pueden servir como mecanismos alternativos de regulación de la afinidad de unión a \alpha4\beta7 y/o de presentación de carbohidratos para la unión a selectinas. La presencia de estos dominios de tipo Ig y de mucina en MAdCAMs de primates aquí descritas es también consistente con el papel en la unión a selectinas así como a integrinas.

Recientes experimentos de intercambio de dominios en la MAdCAM-1 murina han mostrado que, aunque el dominio uno de la MAdCAM-1 puede unirse débilmente a \alpha4\beta7, la adhesión es pobre en ausencia de una fuerte activación de integrinas. Los dos dominios de tipo Ig amino-terminales (que son similares a los dominios de ICAM-1 y VCAM-1) son suficientes para la actividad de unión a \alpha4\beta7 de una forma independiente de activación comparable a la de la MAdCAM-1 murina de tipo salvaje.

Se conserva un motivo corto (GLDTSL) presente en el dominio uno de la MAdCAM-1 murino y es necesario para la unión a integrinas en otros receptores de adhesión de tipo Ig, incluyendo el dominio uno de ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3 y los dominios 1 y 4 de VCAM-1 (Staunton, D.E., Cell, 52: 925-33 (1988); Staunton, D.E. y col., Nature, 339: 61 (1989); Osborn, L. y col., Cell, 59: 1203 (1989); Fawcett, J. y col., Nature, 360: 481 (1992)). Esta secuencia, G-(I/ L )-(D/E)-(T/S)-(P/S)-L, está localizada entre las láminas \beta c y d de estos dominios de unión a integrinas. Se encontró el motivo GLDTSL en las MAdCAMs de primates aquí caracterizadas.

La mutagénesis de E34 (Glu^{34}) en este motivo del dominio 1 de ICAM-1 (subrayado anteriormente) y de D40 (Asp^{40}) en VCAM-1 (en negrilla anteriormente) tuvo profundos efectos sobre la unión de LFA-1 y \alpha4\beta1, respectivamente (Osborn, L. y col., J. Cell. Biol., 124: 601-608 (1994); Renz, M.E. y col., J. Cell. Biol., 125: 1395-1406 (1994); Staunton, D.E. y col., Cell, 61: 243-254 (1990); Vonderheide, R.H. y col., J. Cell. Biol., 125: 215-222 (1994)). Más recientemente, se sometió un fragmento de VCAM-1 consistente en los dos dominios N-terminales a determinación de la estructura cristalográfica (Jones, E.Y. y col., Nature, 373: 539-544 (1995); Wang, J-H y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 5714-5718 (1995)). El motivo conservado en VCAM-1 (QIDSPL) parece estar altamente expuesto en la porción N-terminal del bucle CD del primer dominio Ig en una posición que parece ser fácilmente accesible a las integrinas.

Una substitución nucleotídica en este motivo de la MAdCAM-1 murina, que da lugar a un cambio en el aminoácido 61 de leucina a arginina (L61\rightarrowR61), abole las interacciones de MAdCAM-1 con los linfocitos en reposo que expresan \alpha4\beta7. Por lo tanto, la MAdCAM-1 murina requiere también este motivo de aminoácido conservado, GLDTSL, en el bucle CD predicho por ordenador de su dominio N-terminal para unión a su ligando de integrina, \alpha4\beta7.

Las comparaciones de los clones de ADNc MAdCAM humanos 4 y 20 (Figuras 1 y 2) revelaron que los 225 aminoácidos amino-terminales son idénticos en los clones 4 y 20. Esta región consiste en una secuencia predicha líder o de señal hidrofóbica de 18 aminoácidos y dos dominios de tipo inmunoglobulina. Esta región puede ser alineada con la MAdCAM-1 de primate y murina y muestra las siguientes características conservadas: (1) un péptido señal predicho (idéntico en las proteínas humanas y similar a los péptidos señal de macaco y murino); (2) dos pares de residuos de cisteína en el primer dominio de tipo Ig, estando separadas las cisteínas de cada par por 3 aminoácidos; (3) una secuencia de nueve aminoácidos (que contiene el motivo "LDTSL") en el bucle C-D predicho del dominio 1 de tipo Ig y que está implicada como sitio general de reconocimiento de integrinas (idéntico en cada clon de primates), y (4) un segundo dominio de tipo inmunoglobulina no característicamente largo. El tamaño del segundo dominio de tipo Ig, con aproximadamente 70 aminoácidos entre los residuos de cisteína, lo clasificaría como dominio de tipo "V" (variable), contrariamente a los dominios de tipo C2 (constantes), que se encuentran más típicamente en los receptores de adhesión de tipo Ig (Hunkapiller, T. y col., Adv. in Immunol., 44: 1-62 (1989); Williams, A.F. y col., Annu. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988)). Dentro de este dominio hay un bucle C'-E prolongado que contiene una abundancia de residuos cargados negativamente, que es común a cada clon de MAdCAM-1 de primate, murina y humana caracterizado, pero que no se observa en receptores de adhesión relacionados.

La siguiente región encontrada en los clones 4 y 20 es análoga al dominio de mucina de la MAdCAM-1 murina, debido a una prevalencia de residuos de treonina y prolina (69% para el clon 4 y 76% para el clon 20) (encuadrados en la Figura 1 y en la Figura 2). Esta región, aunque es similar en la composición de aminoácidos a la MAdCAM-1 murina, es altamente divergente de la MAdCAM-1 murina. Por lo tanto, la selección para la conservación de los dominios de tipo Ig de unión a integrinas parece mayor que la de las secuencias de mucina. El dominio MAdCAM-1 humano tiene una longitud de 71 aminoácidos en el clon y 4 una longitud de 47 aminoácidos en el clon 20. Esta región contiene también dos polimorfismos: (1) un polimorfismo en el aminoácido 240, que es prolina (P) en el clon 4 y serina (S) en el clon 20, y (2) un polimorfismo en el aminoácido 242, que es asparraguina (N) en el clon 4 y aspartato (D) en el clon 20. Además, los dominios de mucina humanos contienen una repetición de 8 aminoácidos, consistente en la secuencia PPDTTS(Q/P)E, que aparece ocho veces en el clon 4 y cinco veces en el clon 20.

Dado que el dominio de mucina humano es altamente receptivo, el truncamiento de tres repeticiones en el clon 20 en relación al clon 4 podría ser el resultado de procesos tales como ayustamiento alternativo o mutación (por ejemplo, un suceso de recombinación aberrante) que mantienen el marco de lectura, dando un receptor que es funcional con respecto a la unión a integrinas y sugiere que alguna de las secuencias de mucina o todas ellas son prescindibles para la unión a integrinas. De forma consistente, se ha visto que los dominios de tipo Ig 1 y 2 de la MAdCAM-1 murina son suficientes para la adhesión independiente de activación a \alpha4\beta7, lo que indica que las secuencias de mucina murinas son prescindibles para la unión a integrinas. Es también de interés en este sentido que el clon de macaco que fue aislado carece de la mayor parte de la región de repetición.

Los restantes 110 aminoácidos C-terminales son idénticos entre los clones 4 y 20: 47 aminoácidos preceden a un segmento de transmembrana hidrofóbico predicho de 20 aminoácidos, que va seguido de una cola citoplásmica de 43 aminoácidos. Los 47 aminoácidos inmediatamente C-terminales a la región de mucina están en una región correspondiente al dominio Ig de tipo IgA de la MAdCAM-1 murina. Aunque las proteínas humanas y de macaco son similares en esta región, difieren de la MAdCAM-1- murina. En comparación con la MAdCAM-1 murina, las proteínas humanas son 59 aminoácidos más cortas en esta región y carecen de cualquier característica de un dominio de tipo Ig. Los dominios de transmembrana de todos los receptores son similares, pero la cola citoplásmica es considerablemente más larga (43 aminoácidos) en la MAdCAM-1 humana (26 en primate y 20 en el ratón).

Método de producción de proteínas recombinantes

Otro aspecto de la invención se relaciona con un método de producción de una MAdCAM de primate o variante (por ejemplo, porción) de la misma. Se puede obtener proteína recombinante, por ejemplo, mediante la expresión de una molécula de ADN recombinante codificante de una MAdCAM de primate o variante de la misma en una célula huésped adecuada, por ejemplo.

También se facilitan los constructos adecuados para la expresión de una MAdCAM de primate o variante de la misma. Los constructos pueden ser introducidos en una célula huésped adecuada y las células que expresan una MAdCAM de primate recombinante o variante de la misma pueden ser producidas y mantenidas en cultivo. Dichas células son útiles para una variedad de fines y pueden ser usadas en ensayos de adhesión (por ejemplo, en un ensayo para estudiar selectivamente ligandos y/o inhibidores candidatos de la adhesión mediada por MAdCAM), en la producción de proteína para caracterización, aislamiento y/o purificación (por ejemplo, purificación por afinidad) y como inmunógenos, por ejemplo. Las células huésped adecuadas pueden ser procarióticas, incluidas las células bacterianas tales como E. coli, B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas, o eucarióticas, tales como células fúngicas o de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) u otras células eucarióticas inferiores y células de eucariotas superiores tales como las de insectos (por ejemplo, células de insecto Sf9) o mamíferos (por ejemplo, células de ovario de hámster Chino (CHO), células COS, células HuT 78, células 293). (Véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Inc. (1993)). En una realización, se usan células huésped capaces de expresar proteína madura unida a membrana. En otra realización, células huésped capaces de segregar una MAdCAM soluble (por ejemplo, MAdCAM soluble tal como MAdCAM a la que falta la región de transmembrana C-terminal y la cola citoplásmica).

Se pueden producir células huésped que produzcan una MAdCAM de primate recombinante o variantes de la misma como sigue. Por ejemplo, se puede insertar un ácido nucleico codificante de toda o de parte de la secuencia codificante para la proteína deseada en un vector de ácido nucleico, por ejemplo un vector de ADN tal como un plásmido, virus u otro replicón adecuado para expresión. Se dispone de una variedad de vectores, incluidos vectores que se mantienen en copia simple o en copia múltiple, o que resultan integrados en el cromosoma de la célula huésped.

Se pueden usar las señales transcripcionales y/o de traducción de un gen MAdCAM-1 para dirigir la expresión. Alternativamente, se dispone de vectores de expresión adecuados para la expresión de un ácido nucleico codificante de toda o de parte de la secuencia codificante de la proteína deseada. Los vectores adecuados de expresión pueden contener un número de componentes, incluyendo, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: un origen de replicación; un gen marcador seleccionable; uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un finalizador) y/o una o más señales de traducción; una secuencia de señal o secuencia líder para la dirección hacia la membrana o la secreción (de origen primate o de una especie de primate heteróloga o no primate). En un constructo, se puede obtener una secuencia de señal por el vector, la secuencia codificante de MAdCAM de primate u otra fuente.

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Se proporciona un promotor para expresión en una célula huésped adecuada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. En los vectores, el promotor está operablemente unido a un ácido nucleico codificante de la MAdCAM de primate o variante de la misma y puede dirigir la expresión del polipéptido codificado. Se dispone de una variedad de promotores adecuados para huéspedes procarióticos (por ejemplo, promotores lac, tac, T3 y T7 para E. coli) y eucarióticos (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa de levaduras (ADH1), SV40, CMV).

Además, los vectores de expresión consisten típicamente en un marcador seleccionable para la selección de células huésped portadoras del vector, en el caso de un vector de expresión replicable, un origen o replicación. Los genes codificantes de productos que confieren resistencia a antibióticos o a fármacos son marcadores seleccionables comunes y pueden ser usados en células procarióticas (por ejemplo, gen de \beta-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina) y eucarióticas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina o higromicina). Los genes marcadores de la dihidrofolato reductasa permiten la selección con metrotrexato en una variedad de huéspedes. Los genes codificantes del producto génico de marcadores auxotróficos del huésped (por ejemplo, LEU2, URA3, HIS3) son frecuentemente utilizados como marcadores seleccionables en levaduras. El uso de vectores víricos (por ejemplo, baculovirus) o de fagos y los vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la célula huésped, tal como vectores retrovíricos, están también contemplados. La presente invención se relaciona también con células portadoras de estos vectores de expresión.

Por ejemplo, se puede incorporar un ácido nucleico codificante de una MAdCAM de primate o de una variante de la misma en el vector, operablemente unido a uno o más elementos de control de la expresión, y el constructo puede ser introducido en células huésped, que se mantienen en condiciones adecuadas para la expresión, mediante lo cual se produce el polipéptido codificado. El constructo puede ser introducido en células por un método apropiado para la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección). Para la producción de una proteína, las células huésped que contienen el constructo son mantenidas en condiciones apropiadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de inductor, medio adecuado suplementado con sales apropiadas, factores de crecimiento, antibiótico, suplementos nutricionales, etc.). La proteína codificada (por ejemplo, MAdCAM-1 humana) puede ser aislada de las células huésped o del medio.

También se pueden producir de este modo proteínas de fusión. Por ejemplo, algunas realizaciones pueden ser producidas por inserción de un ADNc de MAdCAM de primate o porción del mismo en un vector de expresión adecuado, tal como Bluescript^{(R)}II SK +/- (Stratagene), pGEX-4T-2 (Pharmacia), pcDNA-3 (Invitrogen) y pET-15b (Novagen). El constructo resultante es entonces introducido en una célula huésped adecuada para la expresión. Tras la expresión, la proteína de fusión puede ser aislada o purificada a partir de un lisado celular por medio de una matriz de afinidad adecuada (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. y col., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991)).

Además, los marcajes de afinidad proporcionan un medio de detección de una proteína de fusión. Por ejemplo, la expresión en la superficie celular o la presencia en una fracción celular concreta de una proteína de fusión que contiene un marcaje de afinidad por antígeno o epitopo puede ser detectada por medio de un anticuerpo apropiado.

Ácidos nucleicos, constructos y vectores

La presente invención se relaciona con ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes (incluyendo, por ejemplo, los esencialmente puros) que tienen secuencias que codifican para una MAdCAM de primate o variante de la misma según se describe aquí.

Los ácidos nucleicos a los que se hace aquí referencia como "aislados" son ácidos nucleicos separados de los ácidos nucleicos del ADN genómico o del ADN celular de su fuente de origen (por ejemplo, tal cual existe en células o en una mezcla de ácidos nucleicos tal como una librería) y pueden haber sufrido un mayor procesamiento. Los ácidos nucleicos "aislados" incluyen ácidos nucleicos obtenidos por métodos aquí descritos, métodos similares u otros métodos adecuados, incluyendo ácidos nucleicos esencialmente puros, ácidos nucleicos producidos por síntesis química, por combinaciones de métodos biológicos y químicos y ácidos nucleicos recombinantes que son aislados (véase, por ejemplo, Daugherty, B.L. y col., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Los ácidos nucleicos a los que se hace aquí referencia como "recombinantes" son ácidos nucleicos que han sido producidos por metodología de ADN recombinante, incluidos aquellos ácidos nucleicos que son generados por procedimientos que se basan en un método de recombinación artificial, tal como la reacción en cadena de polimerasa (RCP) y/o el clonaje en un vector usando enzimas de restricción. Los ácidos nucleicos "recombinantes" son también aquéllos que resultan de sucesos de recombinación que se producen a través de los mecanismos naturales de las células, pero que son seleccionados después de la introducción en las células de ácidos nucleicos diseñados para permitir y hacer probable un suceso de recombinación deseado.

En una realización, el ácido nucleico o porción del mismo codifica para una proteína o polipéptido que tiene al menos una propiedad, actividad o función característica de una MAdCAM de primate (según se define aquí), tal como una función de unión (por ejemplo, la capacidad de unirse a una integrina \alpha4\beta7) y/o una función de molécula de adhesión celular (por ejemplo, la capacidad de mediar en la adhesión celular, tal como la adhesión dependiente de \alpha4\beta7 in vitro y/o in vivo y/o una propiedad inmunológica según se define aquí.

La presente invención se relaciona también más específicamente con ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes o una porción de los mismos que tiene secuencias que codifican para la MAdCAM-1 humana o de macaco o variantes de la misma.

La invención se relaciona además con ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que se caracterizan por:

(1) su capacidad para hibridarse a (a) un ácido nucleico codificante de una MAdCAM de primate, tal como un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos según se indica o substancialmente según se indica en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1), en la Figura 2 (SEC ID Nº: 3) o en la Figura 3 (SEC ID Nº: 5); (b) el complemento de cualquiera de (a), o (c) porciones de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, una porción consistente en el marco de lectura abierta), o

(2) su capacidad para codificar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una MAdCAM de primate (por ejemplo, la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6), o

(3) ambas características.

En una realización, el ácido nucleico comparte al menos aproximadamente un 50% de semejanza en la secuencia de nucleótidos con cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas en la Figura 1, Figura 2 o Figura 3 (SEC ID Nº: 1, 3 ó 5, respectivamente) o con una de las regiones codificantes de MAdCAM de las mismas. Más preferiblemente, el ácido nucleico comparte al menos aproximadamente un 75% de semejanza en la secuencia de nucleótidos y, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente un 90% de semejanza en la secuencia de nucleótidos, con cualquiera de las secuencias mostradas en la Figura 1, Figura 2 o Figura 3 (SEC ID Nº: 1, 3 ó 5, respectivamente) o con una de las regiones codificantes de MAdCAM de las mismas.

Los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que cumplen estos criterios consisten en ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas a secuencias de MAdCAMs de primate naturales o variantes de las secuencias naturales. Dichas variantes incluyen mutantes que difieren por adición, deleción o substitución de uno o más residuos, ácidos nucleicos modificados en los que están modificados uno o más residuos (por ejemplo, análogos de ADN o de ARN) y mutantes consistentes en uno o más residuos modificados.

Los ácidos nucleicos de la presente invención, incluyendo los que se hibridan a un ácido nucleico seleccionado como se ha descrito antes, pueden ser detectados o aislados en condiciones altamente estrictas o condiciones moderadamente estrictas, por ejemplo. Las "condiciones altamente estrictas" y las "condiciones moderadamente estrictas" para las hibridaciones de ácidos nucleicos están explicadas en las páginas 2.10.1-2.10.16 (véase, en particular, 2.10.8-11) y las páginas 6.3.1-6 de Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. y col., eds., Vol. 1, Suppl. 26, 1991), cuyas enseñanzas son aquí incorporadas a modo de referencia. Factores tales como la longitud de la sonda, la composición de bases, el porcentaje de desemparejamientos entre las secuencias hibridantes, la temperatura y la fuerza iónica influyen en la estabilidad de los híbridos de ácidos nucleicos. Así, se pueden determinar empíricamente las condiciones alta o moderadamente estrictas y dependen en parte de las características del ácido nucleico conocido (por ejemplo, ADN) y de los otros ácidos nucleicos que han de ser valorados para hibridación al mismo.

Los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que se caracterizan por su capacidad para hibridarse (por ejemplo, en condiciones alta o moderadamente estrictas) a (a) un ácido nucleico codificante de una MAdCAM de primate (por ejemplo, aquellos ácidos nucleicos representados en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1), en la Figura 2 (SEC ID Nº: 3) y en la Figura 3 (SEC ID Nº: 5), (b) el complemento de dichos ácidos nucleicos, (c) o una porción de los mismos, pueden también codificar una proteína o polipéptido que tenga al menos una propiedad, actividad o función característica de una MAdCAM de primate (según se define aquí), tal como una función de unión (por ejemplo, la capacidad de unirse a una integrina \alpha4\beta7) y/o una función de molécula de adhesión celular (por ejemplo, la capacidad de mediar en la adhesión celular tal como la adhesión dependiente de \alpha4\beta7 in vitro y/o in vivo) y/o una propiedad inmunológica tal como se define aquí. Los ácidos nucleicos preferidos tienen longitudes de al menos aproximadamente 40 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 y, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente 75 nucleótidos.

La función de unión de una MAdCAM de primate o variante de la misma codificada por un ácido nucleico de la presente invención puede ser detectada por ensayos standard para unión de ligandos (por ejemplo, ensayos que monitorizan la formación de un complejo entre MAdCAM aislada y/o recombinante y una integrina \alpha4\beta7) o ensayos de adhesión standard (por ejemplo, en los que se monitoriza la adhesión entre una primera célula que expresa una MAdCAM de primate recombinante y una segunda célula portadora de una integrina \alpha4\beta7) u otros métodos adecuados. Los ensayos de unión y/o adhesión u otros métodos adecuados pueden ser también empleados en procedimientos para la identificación y/o aislamiento de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la presente invención (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1). Las propiedades antigénicas de las proteínas o polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser determinadas por métodos inmunológicos empleando anticuerpos que se unen a una MAdCAM de primate, tales como inmunotransferencia, inmunoprecipitación e inmunoensayo (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA).

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser usados en la producción de proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, se puede incorporar un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica una MAdCAM de primate a varios constructos y vectores creados para la posterior manipulación de secuencias o para la producción del polipéptido codificado en células huésped adecuadas según se ha descrito anteriormente.

Otra realización de la invención es ácido nucleico antisentido, que es complementario, total o parcialmente, de una molécula diana consistente en una hebra de sentido y que puede hibridarse con la molécula diana. La diana puede ser ADN o su equivalente de ARN (es decir, donde los residuos de T del ADN son residuos de U en el equivalente de ARN). Cuando se introduce en una célula, el ácido nucleico antisentido puede inhibir la expresión del gen codificado por la hebra de sentido. Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser producidos por técnicas standard.

En una realización concreta, el ácido nucleico antisentido es total o parcialmente complementario y puede hibridarse a un ácido nucleico diana, donde el ácido nucleico diana puede hibridarse a un ácido nucleico que tenga la secuencia de la complementaria de la hebra superior mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1), en la Figura 2 (SEC ID Nº: 3) o en la Figura 3 (SEC ID Nº: 5). Por ejemplo, el ácido nucleico antisentido puede ser complementario a un ácido nucleico diana que tenga la secuencia mostrada como la hebra superior en el marco de lectura abierta de la Figura 1 (SEC ID Nº: 1), de la Figura 2 (SEC ID Nº: 3) o de la Figura 3 (SEC ID Nº: 5), o a una porción del mismo suficiente para permitir la hibridación. En otra realización, el ácido nucleico antisentido es total o parcialmente complementario y puede hibridarse a un ácido nucleico diana que codifica una MAdCAM de primate.

Los ácidos nucleicos pueden ser también usados como sondas (por ejemplo, en hibridación in situ) para valorar las asociaciones entre la enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (u otras condiciones) y la mayor expresión de MAdCAM de primate en los tejidos afectados. Los ácidos nucleicos pueden ser también usados como sondas para detectar y/o aislar (por ejemplo, mediante hibridación con ARN o ADN) variantes polimórficas o alélicas, por ejemplo, en una muestra (por ejemplo, un tejido inflamado) obtenida de un primate. Más aún, la presencia o la frecuencia de una variante particular en una muestra(s) obtenida(s) de uno o más primates afectados, en comparación con una muestra(s) de primate(s) normal(es), puede ser indicativa de una asociación entre la enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (u otras condiciones) y una variante particular, que, a su vez, puede ser usada en el diagnóstico de la condición.

Tal como se describe en los Ejemplos, se aisló un clon de ADNc codificante de la MAdCAM-1 de macaco por clonaje de expresión y se utilizó el ADNc como sonda para estudiar una librería de ADNc humano. Se aislaron y caracterizaron dos ácidos nucleicos distintos codificantes de la MAdCAM-1 humana. Se pueden obtener genes o ADNc adicionales humanos, de macaco o de otros primates. Por ejemplo, los genes aquí descritos, o porciones suficientes de los mismos, ya sea aislados y/o recombinantes o sintéticos, pueden ser usados como sondas o cebadores para detectar y/o recuperar ácidos nucleicos adicionales codificantes de MAdCAMs de primates o variantes de las mismas a partir de una fuente adecuada tal como una librería genómica o de ADNc de primate, según los métodos aquí descritos u otros métodos adecuados (por ejemplo por hibridación, RCP, clonaje de expresión u otras técnicas adecuadas).

En una realización, los ácidos nucleicos codificantes de MAdCAM de primate son producibles por métodos tales como amplificación por RCP. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores apropiados (por ejemplo, un par de cebadores o cebadores encajados) que consistan en una secuencia complementaria o substancialmente complementaria a una porción de un ADNc de MAdCAM de primate aquí descrito. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores complementarios a los extremos 5' ó 3' de la secuencia codificante y/o que flanqueen a la secuencia codificante. Dichos cebadores pueden ser usados en una reacción en cadena de polimerasa con un ácido nucleico plantilla adecuado para obtener ácido nucleico codificante de MAdCAM de primate, por ejemplo. Como plantillas adecuadas se incluyen, por ejemplo, los constructos aquí descritos (tales como pcD3PMAd, pcD3HuMAd-4 o pcD3HuMAd-20), una librería de ADNc u otra fuente adecuada de ADNc o ADN genómico de primate (por ejemplo, humano). Los cebadores pueden contener porciones complementarias a las secuencias flanqueantes del constructo seleccionado como plantilla según sea apropiado.

Se pueden utilizar genes o ADNc adicionales para expresar MAdCAM de primates, correspondiendo las utilidades a las aquí descritas, y pueden ser utilizados en la producción de constructos, células huésped y anticuerpos usando los métodos aquí descritos. Las aproximaciones aquí descritas, incluyendo, aunque sin limitación, las aproximaciones empleadas para aislar y manipular la MAdCAM-1 de macaco y humana, para construir vectores y cepas huésped y para producir y utilizar las proteínas, para producir anticuerpos, etc., pueden ser aplicadas a otros primates.

Métodos y composiciones terapéuticos

La presente invención proporciona también anticuerpos que (1) pueden unirse a una "MAdCAM de primate" in vitro y/o in vivo y/o (2) pueden inhibir una actividad o función característica de una "MAdCAM de primate", tal como una función de unión (por ejemplo, la capacidad de unión a una integrina \alpha4\beta7) y/o una función de molécula de adhesión celular (por ejemplo, la capacidad para mediar en la adhesión celular tal como la adhesión dependiente de \alpha4\beta7 in vitro y/o in vivo). Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos que pueden unirse a una MAdCAM humana o de macaco codificada por un clon de ADNc 4, un clon de ADNc 20 o un clon de ADNc 31D. También se incluyen anticuerpos que se pueden unir a una MAdCAM de primate natural o endógena (por ejemplo, MAdCAM humana). Preferiblemente, los anticuerpos son capaces de unirse selectivamente a la MAdCAM de primate in vitro y/o in vivo (por ejemplo, de unirse selectivamente a la MAdCAM de primate expresada en tejidos mucosales y/o bazo (por ejemplo, según se valora inmunohistológicamente)).

En una realización, los anticuerpos pueden unirse a MAdCAM de primate e inhibir la unión de la "MAdCAM de primate" a una integrina \alpha4\beta7 (por ejemplo, humana), inhibiendo de este modo la adhesión celular mediada por MAdCAM, preferiblemente de forma selectiva. Dicho anticuerpo puede inhibir la adhesión celular dependiente de \alpha4\beta7 a células portadoras de una integrina \alpha4\beta7, tales como leucocitos (especialmente linfocitos tales como las células T o B) in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, se identificaron once hibridomas que producían anticuerpos que inhibían específicamente la adhesión de células RPMI 8866 a MAdCAM-1 (Ejemplo 2, hibridomas denominados 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5, 7G11). Así, los anticuerpos que pueden inhibir la adhesión celular de las células portadoras de una integrina \alpha4\beta7 a las células endoteliales vasculares en tejidos mucosales, incluidos los tejidos asociados al intestino o los órganos linfoides, están incluidos en los anticuerpos de la presente invención.

Preferiblemente, los anticuerpos pueden unirse a una MAdCAM de primate con una alta afinidad (por ejemplo, una Ka en el rango de aproximadamente 1-10 nM, o una Kd en el rango de aproximadamente 1 X 10^{-8} a 1 X 10^{-10} mol^{-1}).

Los anticuerpos de la presente invención son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo procedimientos, investigación y aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Por ejemplo, pueden ser usados para aislar y/o purificar MAdCAM de primates o variantes de la misma (por ejemplo, mediante purificación por afinidad u otros métodos adecuados) y para estudiar la estructura (por ejemplo, la conformación) y función de la MAdCAM.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser también usados para modular la función MAdCAM en aplicaciones diagnósticas (por ejemplo, in vitro) o terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden actuar como inhibidores para inhibir (reducir o evitar) la función de unión y/o la función de molécula de adhesión celular de una MAdCAM de primate según se describe aquí.

Además, los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para detectar y/o medir el nivel de una MAdCAM de primate en una muestra (por ejemplo, tejidos o fluidos corporales, tales como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal o sobre células transfectadas con un ácido nucleico de la presente invención). Por ejemplo, se puede obtener una muestra (por ejemplo, tejido y/o fluido) de un primate y se puede usar un método inmunológico adecuado para detectar y/o medir los niveles de MAdCAM de primate, incluyendo métodos tales como ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), incluyendo ensayos de quimioluminiscencia, radioinmunoensayo e inmunohistología. En una realización, se facilita un método de detección de una MAdCAM de primate seleccionada en una muestra, consistente en poner en contacto una muestra con un anticuerpo que se une a una MAdCAM de primate aislada en condiciones adecuadas para la unión específica de dicho anticuerpo a la MAdCAM de primate seleccionada y detectar los complejos anticuerpo-MAdCAM formados.

En una aplicación del método, se pueden usar anticuerpos reactivos con una MAdCAM-1 de primate para analizar los tejidos normales frente a los inflamados en primates humanos y no humanos en cuanto a la reactividad y/o expresión de MAdCAM de primate (por ejemplo, inmunohistológicamente). De este modo, los anticuerpos de la presente invención permiten métodos inmunológicos de valoración de la expresión de MAdCAM de primate (por ejemplo, MAdCAM-1 humana) en tejidos normales frente a inflamados, a través de lo cual se puede valorar la presencia de enfermedad, el progreso de la enfermedad y/o la eficacia de la terapia anti-MAdCAM-1 de primate en la enfermedad inflamatoria.

La presente invención proporciona también "MAdCAM de primate" tal como se define aquí, incluidas las variantes funcionales, tales como MAdCAM de primate soluble (por ejemplo, que carece de toda o de parte de la región de transmembrana y de la cola citoplásmica, de tal forma que se segrega la proteína) y proteínas de fusión funcionales (por ejemplo, inmunoglobulinas híbridas consistentes en un resto de MAdCAM de primate fusionado en su extremo C al extremo N de un resto de inmunoglobulina). Estas moléculas son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo procedimientos, investigación, diagnóstico y aplicaciones terapéuticas.

Por ejemplo, la MAdCAM de primate, las proteínas de fusión MAdCAM-Ig u otras moléculas MAdCAM de primate solubles recombinantes pueden ser utilizadas en ensayos para identificar ligandos o inhibidores (por ejemplo, un anticuerpo bloqueante) de la interacción MAdCAM de primate:\alpha4\beta7. Tal como se utiliza aquí, un inhibidor es un compuesto que inhibe (reduce o previene) la unión de MAdCAM-1 de primate a un ligando, incluyendo la integrina \alpha4\beta7, y/o que inhibe el disparo de una respuesta celular mediada por el ligando. Una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para conseguir la inhibición de la unión o adhesión a MAdCAM-1 de primate y/o la señalización (por ejemplo, una cantidad suficiente para inhibir la adhesión de una célula portadora de un ligando de MAdCAM-1 de primate (incluidas las integrinas \alpha4\beta7, tales como la integrina \alpha4\beta7 humana, y sus homólogos de primates)) a MAdCAM de primate aislada y/o recombinante.

En un aspecto, se facilita un método de detección o identificación de un ligando de MAdCAM de primate o un agente que se une a una MAdCAM de primate, donde se pone en contacto un agente (es decir, uno o más) que ha de ser estudiado (o un ligando candidato) con una "MAdCAM de primate" aislada y/o recombinante, incluyendo "variantes funcionales" según se define aquí, en condiciones adecuadas para la unión de ligando a la misma y se detecta la formación de un complejo entre dicho agente y la MAdCAM de primate. En una realización, se combina un agente que ha de ser estudiado con una célula huésped que expresa MAdCAM de primate recombinante o una variante funcional en condiciones adecuadas para la unión del ligando a la misma. En una realización, se marca la MAdCAM de primate o variante funcional con un marcaje adecuado (por ejemplo, un marcaje fluorescente, un marcaje isotópico), y se determina la unión por detección del marcaje. La especificad de la unión puede ser valorada por competición o desplazamiento, por ejemplo, usando un agente no marcado, una MAdCAM de primate aislada y/o recombinante no marcada o variante funcional o un segundo ligando de MAdCAM de primate como competidor.

En otro aspecto, se facilita un método de detección de un inhibidor de la adhesión celular mediada por MAdCAM de primate. En una realización, se combina un agente que ha de ser estudiado con un ligando de MAdCAM de primate y una MAdCAM de primate aislada y/o recombinante o variante funcional (por ejemplo, proteína de fusión) en condiciones adecuadas para la unión del ligando a la misma. Se monitoriza la formación de un complejo entre el ligando y la MAdCAM de primate o la variante funcional. Una reducción de la unión de ligando en presencia del agente en relación a un control adecuado (por ejemplo, unión en ausencia de agente) es indicativa de que el agente es un inhibidor. Por ejemplo, las proteínas de fusión y los ensayos descritos en el Ejemplo 3 pueden ser utilizados para detectar inhibidores. Un agente de estudio puede ser también combinado con una primera célula que expresa una MAdCAM de primate recombinante y una segunda célula portadora de una integrina \alpha4\beta7 en condiciones adecuadas para la adhesión de dicha primera célula a dicha segunda célula. La adhesión entre dichas primera y segunda célula puede ser monitorizada y una menor adhesión (reducida o abolida) en comparación con un control adecuado es indicativa de que el agente es un inhibidor. Se pueden usar una célula o células que expresen de forma natural un ligando para MAdCAM-1, tales como un leucocito (por ejemplo, un linfocito B, linfocito T \alpha4\beta7^{+}) u otra célula que exprese un ligando para MAdCAM-1 (por ejemplo, una célula recombinante).

Se pueden usar ensayos tales como los descritos en el Ejemplo 3 para identificar compuestos que inhiben la unión in vitro. Tal como se muestra aquí, las proteínas de fusión consistentes en un resto de MAdCAM de primate (dos fusiones MAdCAM-Ig quiméricas) pueden unirse a linfocitos positivos a \alpha4\beta7 en solución. De este modo, la MAdCAM de primate, incluidas las variantes funcionales, moléculas MAdCAM de primate particularmente solubles y proteínas de fusión tales como las fusiones quiméricas MAdCAM-Ig descritas en el Ejemplo 3, proporcionan inhibidores candidatos de la interacción \alpha4\beta7:MAdCAM y del reclutamiento de linfocitos in vivo a los sitios inflamatorios, lo que puede resultar útil en la terapia según se describe aquí más adelante. La eficacia in vivo de estas moléculas puede ser valorada usando métodos aquí descritos (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 4 y 5) u otros métodos adecuados. Por ejemplo, se pueden usar modelos de primate tales como los descritos en el Ejemplo 5. El modelo CD45RB^{hi}/SCID proporciona un modelo de ratón con semejanza tanto a la enfermedad de Crohn como a la colitis ulcerativa (Ejemplo 4, Powrie, F. y col., Immunity, 1: 553-562 (1994)). La eficacia de este modelo puede ser valorada usando un protocolo experimental similar al usado para anticuerpos monoclonales (Ejemplo 4). Se pueden valorar parámetros tales como la inhibición del reclutamiento de células marcadas con ^{111}In al colon y la reducción del número de linfocitos T CD4^{+} en la lámina propia del intestino grueso después de la administración (por ejemplo, intravenosa (i.v.), intreperitoneal (i.p.) y oral (p.o.)). También se han descrito ratones golpeados, que desarrollan lesiones intestinales similares a las de la enfermedad intestinal inflamatoria humana (Strober, W. y Ehrhardt, R.O., Cell, 75: 203-205 (1993)) y ratones los ratones NOD proporcionan un modelo animal de diabetes mellitus insulino-dependiente.

La invención se relaciona también con el descubrimiento de que las enfermedades asociadas al reclutamiento de leucocitos al tracto gastrointestinal, tales como la EII, u otros tejidos mucosales pueden ser tratadas por inhibición de la unión de MAdCAM a la integrina \alpha4\beta7 y/o del disparo de las respuestas celulares mediadas por \alpha4\beta7. Los compuestos o agentes que inhiben la unión incluyen la "MAdCAM de primates" según se define aquí, incluyendo moléculas de MAdCAM de primate solubles y proteínas de fusión, así como anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión a antígeno que se unen a la MAdCAM y/o a la integrina \alpha4\beta7. Los anticuerpos que pueden ser usados en el método incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados y/o anti-idiotípicos recombinantes o no recombinantes.

Los anticuerpos monoclonales que se unen a MAdCAM o \alpha4\beta7 han sido descritos. Por ejemplo, MECA-367 es un anticuerpo anti-MAdCAM del subtipo IgG2a y está descrito en Gallatin y col., Nature, 304: 30 (1983) y Michie y col., Am. J. Pathol., 143: 1688-1698 (1993). El ACT-1 es un anticuerpo monoclonal que se une a la integrina \alpha4\beta7 (Lazarovits y col., J. Immunol., 133: 1857 (1984); Schweighoffer y col., J. Immunol., 151: 717-729 (1993)). FIB 21 se une a la cadena \beta7, según se describe y caracteriza en Berlin y col., Cell, 74: 184-195 (1993); Andrew, D.P. y col., J. Immunol., 153: 3847-3861 (1994)).

Otros anticuerpos policlonales o monoclonales, tales como los anticuerpos que se unen a los mismos epitopos o a epitopos similares que los anticuerpos aquí descritos, pueden ser preparados según los métodos aquí descritos, métodos conocidos en la técnica u otros métodos adecuados (tales como Kohler y col., Nature, 256: 495-497 (1975); Harlow y col., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY); o Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verano del 94), Ausubel y col., Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY), Capítulo 11 (1991)). También se pueden producir anticuerpos que puedan competir con cualquiera de los anticuerpos producidos por las líneas celulares de hibridoma denominadas 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5 ó 7G11 para unión a una célula portadora de una integrina \alpha4\beta7, preferiblemente integrina \alpha4\beta7 humana.

Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos frente a un inmunógeno apropiado en un mamífero adecuado (por ejemplo, un ratón, rata, conejo u oveja). Los inmunógenos incluyen, por ejemplo, MAdCAM, \alpha4\beta7 o fragmentos inmunogénicos de las mismas. Por ejemplo, se puede producir una MAdCAM de primate o una variante de la misma y utilizarla como un inmunógeno para producir anticuerpos en un protocolo de inmunización adecuado.

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Las células productoras de anticuerpo (por ejemplo, un linfocito) pueden ser aisladas de, por ejemplo, los nódulos linfáticos o el bazo de un animal inmunizado. Las células pueden ser entonces fusionadas a una célula inmortalizada adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma), formando así un hibridoma. Las células fusionadas pueden ser aisladas empleando técnicas de cultivo selectivo. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden ser seleccionadas por medio de un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA) (véase, por ejemplo, Ejemplo 2).

En una realización, el inmunógeno puede ser un anticuerpo que se une, por ejemplo, a MAdCAM, \alpha4\beta7 o fragmentos inmunogénicos de las mismas. El anticuerpo producido puede ser, por lo tanto, un anticuerpo anti-idiotípico, que también puede ser usado en la presente invención (Patente EE.UU Nº 4.699.880).

Los anticuerpos de cadena sencilla y los anticuerpos quiméricos, humanizados o primatizados (injertados CDR o resuperficializados, tales como los de EP 0.592.406, Padlan y col., 13 de Abril de 1994), así como los anticuerpos de cadena sencilla quiméricos o injertados CDR, consistentes en porciones derivadas de diferentes especies, pueden ser también utilizados en la invención. Las diversas porciones de estos anticuerpos pueden ser unidas entre sí químicamente por técnicas convencionales, o pueden ser preparadas como proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, los ácidos nucleicos codificantes de una cadena quimérica o humanizada pueden ser expresados para producir una proteína contigua. Véase, por ejemplo, Cabilly y col., Patente EE.UU. Nº 4.816.567; Cabilly y col., Patente Europea Nº 0.125.023 B1; Boss y col., Patente EE.UU. Nº 4.816.397; Boss y col., Patente Europea Nº 0.120.694 B1; Neuberger, M.S. y col., WO 86/01533; Neuberger, M.S. y col., Patente Europea Nº 0.194.276 B1; Winter, Patente EE.UU. Nº 5.225.539, y Winter, Patente Europea Nº 0.239.400 B1. Véase también Newman, R. y col., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), en relación con anticuerpos primatizados, y Ladner y col., Patente EE.UU. Nº 4.946.778 y Bird, R.E. y col., Science, 242: 423-426 (1988)) en cuanto a anticuerpos de cadena sencilla.

Además, se pueden también producir fragmentos funcionales de anticuerpos, incluidos los fragmentos de anticuerpos quiméricos, humanizados, primatizados o de cadena sencilla. Los fragmentos funcionales de los anticuerpos anteriores retienen al menos una función de unión del anticuerpo de longitud completa del que derivan y, preferiblemente, retienen la capacidad de inhibir la interacción. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos capaces de unirse a la integrina \alpha4\beta7, MAdCAM o porción de las mismas incluyen, aunque sin limitación, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')_{2}. Dichos fragmentos pueden ser producidos por excisión enzimática o por técnicas recombinantes. Por ejemplo, la excisión con papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')_{2}, respectivamente. De forma alternativa, se pueden producir anticuerpos en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en los que han sido introducidos uno o más codones de parada corriente arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, se puede diseñar un gen quimérico que codifique una porción de cadena pesada F(ab')_{2} de manera que incluya secuencias de ADN codificantes del dominio CH_{1} y de la región de bisagra de una cadena pesada.

Los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno que pueden ser utilizados en el método reivindicado incluyen anticuerpos que se unen a MAdCAM y/o \alpha4\beta7, tales como anticuerpos anti-cadena \beta7. Por ejemplo, se pueden administrar anticuerpos del grupo que incluye FIB 21, FIB 30, FIB 504 y ACT-1 y sus mezclas. Alternativamente, o además, se pueden administrar fragmentos antigénicos de estos anticuerpos.

Los compuestos o agentes que inhiben la unión de MAdCAMs y la integrina \alpha4\beta7 pueden ser administrados según el método reivindicado en el tratamiento de enfermedades asociadas a la infiltración leucocitaria (por ejemplo, linfocitaria, monocitaria) de tejidos (incluyendo el reclutamiento y/o la acumulación de leucocitos en los tejidos) que expresan la molécula MAdCAM-1. Se administra una cantidad efectiva de un compuesto o agente (es decir, uno o más) a un individuo (es decir, un mamífero, tal como un humano u otro primate) con objeto de tratar dicha enfermedad. Por ejemplo, de acuerdo con el presente método se pueden tratar enfermedades inflamatorias, incluyendo las enfermedades asociadas con la infiltración leucocitaria del tracto gastrointestinal (incluido el endotelio asociado con el intestino), otros tejidos mucosales o tejidos que expresan la molécula MAdCAM-1 (por ejemplo, tejidos asociados con el intestino, tales como vénulas de la lámina propia del intestino delgado y grueso, y la glándula mamaria (por ejemplo, la glándula mamaria lactante)). De forma similar, puede ser tratado con este método un individuo que tenga una enfermedad asociada con la infiltración leucocitaria de los tejidos como resultado de la unión de leucocitos a células (por ejemplo, células endoteliales) que expresan la molécula MAdCAM-1.

Algunas de las enfermedades que pueden ser tratadas en consecuencia incluyen la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), tal como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, ileítis, enfermedad celíaca, sprue no tropical, enteropatía asociada con artropatías seronegativas, colitis microscópica o colágena, gastroenteritis eosinofílica o bursitis producida después de una proctocolectomía y anastomosis ileoanal.

La pancreatitis y la diabetes mellitus insulino-dependiente son otras enfermedades que pueden ser tratadas usando el presente método. Se ha descrito que la MAdCAM-1 es expresada por algunos vasos del páncreas exocrino en ratones NOD (diabéticos no obesos), así como en ratones BALB/c y SJL. Se describió que la expresión de MAdCAM-1 era inducida sobre el endotelio en islotes inflamados del páncreas del ratón NOD y la MAdCAM era la adresina predominante expresada por el endotelio de los islotes NOD en estadíos tempranos de la insulitis (Hanninen, A. y col., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)).

Además, se observó acumulación de linfocitos que expresan \alpha4\beta7 en los islotes y la MAdCAM-1 estaba implicada en la unión de células de linfoma a través de \alpha4\beta7 a los vasos de los islotes inflamados (Hanninen, A. y col., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)).

Como ejemplos de enfermedades inflamatorias asociadas a los tejidos mucosales que pueden ser tratadas según el presente método se incluyen la mastitis (glándula mamaria), la colecistitis, la colangitis o la pericolangitis (conducto biliar y tejido circundante del hígado), la bronquitis crónica, la sinusitis crónica, el asma y la enfermedad del injerto contra el huésped (por ejemplo, en el tracto gastrointestinal). Tal como se observa en la enfermedad de Crohn, la inflamación se extiende frecuentemente más allá de la superficie mucosal; en consecuencia, las enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón que dan lugar a una fibrosis intersticial, tales como la pneumonitis por hipersensibilidad, las enfermedades del colágeno, la sarcoidosis y otras condiciones idiopáticas, pueden ser llevadas a tratamiento.

El compuesto es administrado en una cantidad efectiva que inhibe la unión de MAdCAM a la integrina \alpha4\beta7. Para la terapia, una cantidad efectiva será suficiente para conseguir el efecto terapéutico y/o profiláctico deseado (tal como una cantidad suficiente para reducir o evitar la unión y/o la señalización mediadas por MAdCAM, inhibiendo así la adhesión y la infiltración de leucocitos y/o las respuestas celulares asociadas). Los compuestos pueden ser administrados en una sola dosis o en dosis múltiples. La dosificación puede ser determinada por métodos conocidos en la técnica y depende, por ejemplo, de la edad del individuo, de la sensibilidad, tolerancia y bienestar global. Las dosificaciones adecuadas para los anticuerpos pueden ser de 0,1-1,0 mg/kg peso corporal por tratamiento.

Según el método, se puede administrar a un individuo (por ejemplo, un humano) un compuesto o agente solo o junto con otro agente. Un compuesto o agente puede ser administrado antes, junto con o después de la administración del agente adicional. En una realización, se administra más de un anticuerpo monoclonal que inhibe la unión de los leucocitos a la MAdCAM endotelial. Alternativamente, se administra un anticuerpo monoclonal que inhibe la unión de los leucocitos a los ligandos endoteliales además de un anticuerpo anti-MAdCAM o anti-\beta7. Por ejemplo, se puede administrar también un anticuerpo que inhiba la unión de los leucocitos a un ligando endotelial distinto de MAdCAM, tal como un anticuerpo anti-ICAM-1 o anti-VCAM-1. En otra realización, se puede administrar un componente adicional farmacológicamente activo (por ejemplo, sulfasalazina, un compuesto antiinflamatorio o un compuesto antiinflamatorio estereoideo u otro no esteroideo) junto con el compuesto o agente (por ejemplo, el anticuerpo de la presente invención).

Son posibles una variedad de vías de administración, incluyendo, pero no limitándose necesariamente a éstas, la parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea), la oral (por ejemplo, dietética), la tópica, la inhalatoria (por ejemplo, inhalación intrabronquial, intranasal u oral, las gotas intranasales) o la rectal, dependiendo de la enfermedad o condición que haya de ser tratada. La administración parenteral es un modo de administración preferido.

La formulación de un compuesto que ha de ser administrado variará según la vía de administración seleccionada (por ejemplo, solución, emulsión, cápsula). Se puede preparar una composición apropiada consistente en compuesto que ha de ser administrado en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. Para soluciones o emulsiones, como portadores adecuados se incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo la solución salina y el medio tamponado. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes o reponedores de fluidos, nutrientes o electrolitos (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Science, 16ª Edición, Mack, Ed. 1980). Para la inhalación, el compuesto puede ser solubilizado y cargado en un dispensador adecuado para administración (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol presurizado).

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Ejemplos

La presente invención será ahora ilustrada por medio de los siguientes Ejemplos, que no pretenden ser limitantes en modo alguno.

Introducción

Los estudios de hibridación usando zoo-transferencias con sondas de ADN de MAdCAM murino en condiciones poco estrictas indicaron que la conservación de nucleótidos entre la MAdCAM-1 murina y especies superiores era pobre. Se utilizó una aproximación de expresión funcional para clonar homólogos de primates y humanos, mediante lo cual se identificaron células transfectadas con ADNc que conferían la capacidad de adherirse a una línea celular linfocítica diana que expresa altos niveles del ligando MAdCAM-1 (\alpha4\beta7) y se recuperaron los ADNc. Dado que las fuentes de tejidos humanos eran escasas, se identificó primeramente un homólogo de primate de MAdCAM-1.

Para el clonaje de expresión, se hizo una librería de expresión de ADNc de primates, derivada de nódulos linfáticos mesentéricos de un macaco, en un vector de expresión eucariótico pRSVsport (de Gibco/BRL). Se utilizó un sistema de transfección de alta eficacia empleando la línea celular CHO/P (Heffernan, M. y J.D. Dennis, Nucleic Acids Res., 19: 85-92 (1991)). Se separó la librería y se transfectaron conjuntos individuales (que representaban aproximadamente 1.500 clones) en los pocillos de placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Se realizaron ensayos de adhesión celular para identificar los ADNc que conferían un fenotipo adhesivo a las líneas de células T y B que expresaban la integrina \alpha4\beta7, un ligando conocido para MAdCAM-1. Se identificó la adhesión microscópicamente por formación de rosetas por parte de las líneas celulares T y B sobre las células transfectadas. Se subfraccionó un conjunto que confería el fenotipo deseado hasta identificar un solo clon de ADNc de longitud completa denominado clon 31D. La secuenciación del ADN de la porción amino-terminal del ADNc reveló homología del clon de macaco con la MAdCAM-1 murina (Briskin, M.J. y col., Nature (Lond.), 363: 461-464 (1993)) tanto a nivel de proteína como de ácido nucleico.

Cuando se introduce en células CHO/P por transfección transitoria, el inserto de ADNc obtenido del clon 31D dirigía la expresión de una proteína que podía mediar en la unión de dos líneas celulares que expresan \alpha4\beta7: (1) TK1, un linfoma de células T murino (Butcher, E.C. y col., Eur. J. of Immunol., 10: 556-561 (1980)), y (2) RPMI 8866, un linfoma de células B humano (Erle, D.J. y col., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). La unión de las células TK1 a células transfectadas con el ADNc de macaco podía ser bloqueada por anticuerpos para las integrinas \alpha4 (MAb PS/2) o \beta7 (MAb FIB 504) y la unión de RPMI 8866 a células CHO/P transitoriamente transfectadas con ADNc de macaco (clon 31D en pSV-SPORT) era bloqueada por el MAb anti-\alpha4\beta7, ACT-1. En experimentos control, un ADNc codificante de VCAM-1 humano no pudo unirse a la línea celular B humana RPMI 8866. Se vio que las células Jurkat, una línea de células T que expresa \alpha4\beta1 y no \alpha4\beta7 se unían a VCAM-1, pero que no podían unirse a transfectantes que expresaban ADNc de macaco.

Se utilizó el ADNc codificante de un homólogo de primate (macaco) de MAdCAM-1 murina como sonda para obtener un clon codificante de un homólogo humano por hibridación. Para obtener un clon de MAdCAM-1 humano, se construyeron dos librerías de ADNc, una derivada de nódulo linfático mesentérico (NLM) humano histológicamente normal y una derivada de un nódulo linfático NLM inflamado de un paciente con enfermedad de Crohn, en el fago vector \lambdaZiplox de Gibco/BRL. El ADNc del clon de macaco fue usado para estudiar estas librerías. Se aislaron dos clones de ADNc humanos diferentes de tamaño similar. Estos clones parecían ser cada uno de longitud completa por análisis preliminar de secuencia. El análisis de los ADNc MAdCAM-1 humanos, así como de macacos, indica que cada una de las proteínas codificadas tiene una secuencia líder hidrofóbica predicha (subrayada en las Figuras 1-3), correspondiendo el resto de las porciones de las proteínas a la MAdCAM-1 humana o de macaco maduras predichas, respectivamente.

Para valorar la función, se subclonaron insertos de ADNc humano en el vector de expresión pCDNA3 (Invitrogen) y se utilizaron ensayos de expresión transitoria para demostrar la función. Los ADNc humanos pueden ser expresados como proteínas funcionales y son capaces de mediar en la unión específica a células que expresan \alpha4\beta7. En consecuencia, estos dos clones de ADNc humano son denominados ADNc MAdCAM-1 humanos.

Se generaron transfectantes estables de ADNc tanto de primates como de humanos en una línea de células pre-B de ratón, L1-2, y células CHO. Se utilizaron transfectantes L1-2 para inmunizar a ratones y generar anticuerpos monoclonales frente a la MAdCAM-1 humana. Se identificaron anticuerpos capaces de inhibir la interacción entre MAdcAM-1 y \alpha4\beta7. la producción de anticuerpos bloqueantes dirigidos frente a la MAdCAM-1 humana es un avance significativo, ya que fallaron los intentos previos por producir dichos anticuerpos bloqueantes con reactividad cruzada con el homólogo humano usando MAdCAM-1 murina.

Ejemplo 1 Clonaje de ADNc MAdCAM-1 de macaco y humano Aislamiento de ARN y selección del mensaje

Se aisló ARN total de (a) nódulos linfáticos mesentéricos (NLM) de primate (macaco), (b) nódulos linfáticos mesentéricos humanos histológicamente normales, (c) nódulos linfáticos mesentéricos humanos (nódulos de íleo inflamado) de un paciente con enfermedad de Crohn y (d) células de cultivo de tejido mediante el uso del reactivo CsTFA^{(R)} (trifluoroacetato de cesio) (Pharmacia, Cat. #17-087-02). Se obtuvo el ARN total de nódulo linfático mesentérico de dos especies de macacos (Macaca fascicularis y Macaca mulatta) y se combinó antes del aislamiento de poli-A ARN. El tejido fue en primer lugar congelado rápidamente en nitrógeno líquido y sometido a homogeneización "dounce" en una solución consistente en isotiocianato de guanidinio 5,5 M, citrato de sodio 25 mM, lauril sarcosina sódica 0,5% y 2-mercaptoetanol 0,2 M, al tiempo que las células del cultivo de tejido (1-5 x 10^{8}) eran lavadas una vez en solución salina tamponada con fosfatos (PBS) y homogeneizadas por pipeteado. Se depositó entonces una capa de lisado aclarado sobre un cojín de CsTFA y se granuló el ARN total por centrifugación durante 20 horas a 30.000 RPM.

Se seleccionó el ARNm por el sistema de aislamiento de ARNm polyATract de Promega. El sistema utiliza un cebador oligo(dT) biotinilado para hibridarse (en solución) a colas poli A de mensajes eucarióticos. Los híbridos fueron capturados y lavados en condiciones altamente estrictas usando estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas y un soporte de separación magnética. El ARNm fue seleccionado por una simple purificación en este sistema y los rendimientos oscilaron entre un 1 y un 2% del rendimiento de ARN total. La integridad tanto del ARN total como del ARNm fue analizada por electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio.

Síntesis de ADNc

Se sintetizó ADNc usando el sistema lambda Superscript^{(R)} (Cat. #18256-016) junto con el vector \lambdaZiplox^{(R)} (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD, Cat. #19643-014) en el caso de las librerías humanas, o el vector pSV-SPORT-1 (Gibco/BRL, Cat. #15388-010) en el caso de la librería de macaco. Se hicieron las siguientes modificaciones del protocolo standard. Se marcó ADNc sólo en la primera o en la segunda hebra (pero no en ambas) con \alpha^{32}P-dCTP y se hicieron estimaciones de la cantidad por inspección de la tinción con bromuro de etidio de alícuotas de fracciones de ADNc.

Secuenciación del ADN

Los ADNc MAdCAM-1 completos de macaco y hombre fueron primeramente aislados en los vectores de librería pSV-SPORT-1 y pZL1 (rescatados de \lambdaZiplox^{(R)}), respectivamente. En base al mapa de restricción, los fragmentos fueron subclonados en vectores Bluescript^{(R)} (Stratagene) para facilitar la secuenciación de regiones internas de los ADNc. Después del análisis de secuencia de estos clones, se hicieron cebadores oligonucleótidicos para completar la secuencia. Se obtuvo una secuencia solapante de ambas hebras. El análisis de secuencia utilizó el kit de secuenciación de ADN sequenase^{(R)} 7-desaza-dGTP con ADN polimerasa T7 versión 2.0 de sequenase (United States Biochemical) y ^{35}S-dCTP (Amersham Life Science and New England Nuclear). También se usaron el kit de secuenciación delta TAQ (USB) y la secuencia rica en G-C gamma ^{32}P-ATP (Amersham) para las secuencias ricas en G-C.

Las secuencias fueron introducidas y analizadas usando el sistema Lasergene (DNASTAR, Inc.). Las alineaciones de secuencias de nucleótidos fueron realizadas por el método de Clustal con tabla de pesos de residuos Pesados, usando una penalización de hueco de 10 y una penalización de longitud de hueco de 10 y parámetros de ausencia (los parámetros alineación por Parejas eran: "ktuple" = 2, penalización de hueco = 5, ventana = 4 y diagonales salvadas = 4).

Las alineaciones de secuencias de aminoácidos fueron realizadas por el método de Clustal con la tabla de pesos de residuos PAM250, usando una penalización de hueco de 10 y una penalización de longitud de hueco de 10 y parámetros de ausencia (los parámetros de alineación por Parejas eran: "ktuple" = 1, penalización de hueco = 3, ventana = 4 y diagonales salvadas = 5).

Preparación de la librería de expresión de macaco

El procedimiento de fraccionación por tamaños fue también modificado ligeramente para la construcción de la librería de expresión de macaco, para asegurar grandes insertos (>1,5 kb). Después de una vuelta de fraccionación, sólo se guardó la primera fracción (la mayor) del ADNc y las fracciones restantes fueron juntadas y sometidas a una posterior vuelta de fraccionación. La fracción superior de la siguiente vuelta fue juntada con la fracción superior de la vuelta previa y también se utilizó la segunda fracción de esta vuelta. Estas dos fracciones fueron precipitadas y sometidas a ligaduras con el vector pSV-SPORT-1 y se transformó una fracción de cada ligadura en bacterias DH10B electrocompetentes (Gibco) para estimar tanto el título de la librería como el tamaño medio de inserto. Las estimaciones de ligadura de sólo la fracción de ADNc mayor superior revelaron el potencial de preparación de 2,4 millones de clones independientes con un tamaño medio de inserto de 1,9 kb y un tamaño mediano de 2 kb.

La librería real estudiada consistía en 150.000 clones independientes, que fueron plaqueados a una densidad de 1.500 clones/placa en 100 placas de agar LB (para generar 100 conjuntos de 1.500 clones/conjunto) con ampicilina a 50 \mug/ml y a los que se hizo crecer durante la noche a 37ºC. Para la purificación de conjuntos individuales, se cubrió cada placa con aproximadamente 2 ml de caldo de Luria (LB) y se rasparon las colonias de cada placa con un raspador standard de células en cultivo de tejidos y se transfirieron las suspensiones bacterianas a tubos de microcentrífuga. Antes de la purificación, se generó un stock de glicerol de cada conjunto. Los ADN plasmídicos fueron purificados usando columnas de espín QIAprep (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante.

Transfecciones

Se sembraron células CHO/P (Heffernan, M. y J.D. Dennis, Nucleic Acids Res., 19: 85-92 (1991)) en placas de 24 pocillos aproximadamente 24 horas antes de la transfección a una densidad de 40.000 células/pocillo. Los ADN fueron transitoriamente transfectados utilizando el reactivo LipofectAMINE^{(R)} (GIBCO, Cat. #18324-012), esencialmente siguiendo el protocolo recomendado con mayor optimización para placas de 24 pocillos como sigue: se diluyeron 200 ng de ADN (que representaba un conjunto de plásmidos o ADN controles purificados) a 20 \mul con medio de suero reducido con Opti-MEM 1 (GIBCO) y se diluyó en 20 \mul de una mezcla que consiste en 18 \mul de Opti-MEM 1 y 2 \mul de reactivo LipofectAMINE^{(R)}. Se incubó entonces esta mezcla de liposomas durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente, tras de lo cual se añadieron 200 \mul de Opti-MEM 1 y se depositó luego toda la mezcla en un pocillo de células CHO/P y se devolvió a la incubadora. Después de una incubación de 2,5 horas a 37ºC, se añadieron 240 \mul de medio MEM-\alpha (Gibco) con un 20% de suero fetal de ternera (FCS) a cada pocillo y se incubaron las células durante otras 18-24 horas más a 37ºC. Se cambió entonces el medio a MEM-\alpha standard con FCS 10% y se llevó a cabo el ensayo de adhesión aproximadamente 20-24 horas más tarde.

Ensayos de adhesión para el clonaje de expresión

Para los ensayos de adhesión en el estudio de clonaje de expresión, se utilizó el linfoma de células T murino TK1, que expresa elevados niveles de \alpha4\beta7 (Butcher, E.C. y col., Eur. J. Immunol., 10: 556-561 (1980)) para detectar células CHO/P transfectadas con ADNc capaces de conferir un fenotipo adhesivo. Las células TK1 fueron resuspendidas a una densidad de 2 X 10^{6}/ml en un tampón de ensayo que consistía en HBSS (solución Salina Equilibrada de Hanks, sin Ca^{2+} o Mg^{2+}), suplementado con un 2% de suero bovino de ternera, HEPES 20 mM, pH 7,3, Mg^{2+} 2 mM y Ca^{2+} 2 mM. Se preincubó cada pocillo transfectado con un conjunto de ADN con 0,25 ml de un sobrenadante combinado que contenía anticuerpos monoclonales para VCAM-1 humana (MAb 2G7, Graber, N.T. y col., J. Immunol., 145: 819-830 (1990)) y MAdCAM-1 murina (MAb MECA-367, American Type Culture Collection (Rockville, MD), Nº de Acceso HB9478, Streeter, P.R. y col., Nature, 331: 41 (1988); véase también la Patente EE.UU. Nº 5.403.919 de Butcher) con objeto de eliminar la adhesión mediada por VCAM-1 (que se expresa a elevados niveles en nódulos linfáticos de primate) o cualquier plásmido de expresión de MAdCAM-1 murina contaminante potencial. Después de incubar a 4ºC durante 15 minutos, se añadieron 0,25 ml de la suspensión de células TK1 (5 x 10^{5} células TK1) a cada pocillo y se continuó con la incubación en una plataforma oscilante durante otros 30 minutos más a 4ºC. Las placas fueron lavadas por inversión suave en un gran vaso de precipitados de solución salina tamponada con fosfatos (PBS), seguido de inversión en un vaso de precipitados de PBS con 1,5% de glutaraldehido para fijación durante un mínimo de 1 hora. Los pocillos fueron entonces examinados microscópicamente (objetivo 10X) en cuanto a formación de rosetas de células TK1.

Purificación de clones de macaco

Los conjuntos que dieron una o más rosetas TK1 fueron además subfraccionados mediante el siguiente protocolo: se retransformó el ADN representativo de un conjunto positivo en DH10B y se plaqueó en noventa y seis placas de Petri de 100 mm a una densidad de aproximadamente 200 colonias/placa. Se utilizaron filtros de nitrocelulosa para generar placas réplica y se sometió entonces un grupo de cada placa a purificación de ADN y posteriores ensayos de adhesión según se ha descrito anteriormente. Se subfraccionó entonces además una placa réplica representativa de un conjunto positivo en conjuntos de 5 colonias, que fueron plaqueadas en réplica y a las que se hizo crecer durante la noche en medio LB que contenía ampicilina. Después de una vuelta más de purificación de ADN y ensayos de adhesión, se pudo hacer crecer entonces a los clones individuales y se identificó a los clones que conferían adhesión de las células TK1.

Se obtuvo un clon de longitud completa, que mostró codificar para MAdCAM-1, y se le denominó 31D. El clon 31D, construido en pSV-SPORT-1 (P25), contiene un inserto de ADNc 5'-SalI a NotI-3'. Se obtuvieron transformantes de la cepa DH10B de E. coli que contenían el clon 31D. Para la expresión en líneas celulares estables, se subclonó este ADNc en el vector de expresión pcDNA-3 (Invitrogen), que lleva un gen de resistencia neo adecuado para la selección G418. Concretamente, se liberó el inserto del clon 31D por digestión con EcoRI (5') y NotI y se insertó en pcDNA-3, que había sido excindido con EcoRI y NotI para obtener pcD3pMAd.

Resultados

Se construyó una librería de expresión de ADNc, dividida en conjuntos de 1.500 clones independientes, a partir de ARNm purificado de nódulos linfáticos mesentéricos (NLM) de macaco. Cada conjunto fue transfectado transitoriamente en la línea celular CHO/P y, a las 48 horas de la transfección, se llevó a cabo un ensayo de adhesión celular usando el linfoma de células T murino TK1. Como VCAM-1 es expresada en los NLM, se hicieron ensayos en presencia de MAb 2G7 anti-VCAM-1 (Graber, N.T. y col., J. Immunol., 145: 819-830 (1990)). Adicionalmente, se realizaron ensayos a 4ºC con objeto de eliminar la adhesión mediada por ADNc ICAM (las células TK1 expresan altos niveles de LFA-1 y LFA-1 no es funcional a 4ºC). El examen microscópico de los ensayos reveló varios pocillos con formación observable de rosetas de células TK1. Se eligieron dos pocillos para posterior análisis repitiendo la transfección y determinando si la unión mediada por los conjuntos podía ser bloqueada por Mab anti-\beta7 o anti-\alpha4. La unión de TK1 a uno de los conjuntos fue completamente inhibida por preincubación de las células TK1 con MAb PS/2 anti-\alpha4 o MAb FIB 504 anti-\beta7. Este conjunto fue sometido a tres vueltas de subfraccionación, hasta aislar un clon único, llamado 31D. El
clon 31D purificado mediaba en la unión de células TK1, que podía ser inhibida por anticuerpos anti-\alpha4 o anti-\beta7.

El tamaño de inserto del clon 31D era aproximadamente de 1,8 kb. La secuenciación del extremo amino reveló varias características consistentes con un homólogo de primate de la MAdCAM-1 murina. Los péptidos de señal tenían ambos 21 aminoácidos de longitud. Aunque la semejanza de aminoácidos resultó ser sólo de un 48%, la identidad era de un 71% si se consideraban las substituciones no conservadoras. Además, la proteína codificada por el clon 31D tenía una característica única para los receptores de adhesión de la familia Ig: dos pares de cisteínas separadas por 3-4 (3 en este caso) aminoácidos en el primer dominio de inmunoglobulina. Finalmente, 8 aminoácidos C-terminales a las primeras cisteínas dobles es una prolongación de 9 aminoácidos que es idéntica a una secuencia en la MAdCAM-1 murina. Dentro de esta región estaba la secuencia LDTSL, que se alinea con un motivo consenso para las interacciones integrinas/miembros de la familia Ig. Aunque este motivo tiene una conservación general con respecto a otros receptores de adhesión Ig tales como ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 y VCAM-1 (Osborn, L. y col., J. Cell. Biol., 124: 601-608 (1994); Renz, M.E. y col., J. Cell. Biol., 125: 1395-1406 (1994)), esta secuencia exacta fue encontrada previamente sólo en la MAdCAM-1 murina. La significación funcional de este motivo es sugerida por el hecho de que una mutación puntual que cambia la primera L (leucina) del motivo en el aminoácido 61 a una R (arginina) en la MAdCAM-1 murina tenía un efecto dramático sobre MAdCAM-1: la unión a \alpha4\beta7 (no mostrada). Los resultados de los estudios funcionales, junto con estas características de secuencia indican que el clon 31D codifica un homólogo de primate de la MAdCAM-1 murina.

Estudio de una librería de fago humana y purificación de clones humanos

Se construyeron librerías de ADNc de fago humanas en el vector \lambdaZiplox^{(R)} (Gibco/BRL). Se preparó ADNc humano a partir de ARN aislado de nódulos linfáticos mesentéricos (NLM) normales o inflamados según se ha descrito anteriormente. El ADNc fue sintetizado como se ha descrito antes, ligado en el vector de fago y titulado en la cepa bacteriana Y1090 (ZL) ("ZL" = Ziplox). Se estudiaron duplicados de filtros de aproximadamente 500.000 clones independientes (50.000 clones/filtro) de las librerías de fago NLM normales y de Crohn con ADNc MAdCAM-1 de macaco de longitud completa marcado con ^{32}P.

Para preparar la sonda, se cortó un fragmento EcoRI-NotI de \sim1,7 kb del clon 31D y se aisló usando GeneClean (BIO 101). El fragmento fue marcado con \alpha^{32}P-dCTP cebando con hexámeros al azar (Maniatis y col., En: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1990)).

Las condiciones de estudio eran las siguientes: se plaquearon 50.000 clones de fago en placas de Petri de 150 mm que contenían agar NZYCM (Gibco/BRL). Después de una incubación que oscilaba entre 7 y 16 horas, las placas fueron cubiertas con filtros de nitrocelulosa de 132 mm (Schleicher y Schuell, Keene, NH) durante 2 minutos y luego cinco minutos para transferir la primera y la segunda extracción (duplicado) de clones de fago, respectivamente. Los filtros fueron entonces mojados durante 5 minutos en solución desnaturalizante (cloruro de sodio 1,5 M, hidróxido de sodio 0,5 N), seguido de neutralización en cloruro de sodio 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5. Los filtros fueron secados al aire durante 15 minutos y luego horneados a vacío durante 2 horas a 80ºC.

Los filtros fueron prehibridados durante 2 horas a 55ºC en Na_{2}HPO_{4} 2 M, SDS 0,5%, 5X Denhardt (1X solución de Denhardt es seroalbúmina bovina 0,02%, ficoll 0,02% y polivinilpirrolidona 0,02%), EDTA 1 mM y 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fueron posteriormente hibridados durante la noche a 55ºC en el mismo tampón. Los filtros fueron lavados una vez a temperatura ambiente en 2X SSC, SDS 0,1% (1X SSC es cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M), seguido de tres a cuatro lavados a 65ºC en 0,1X SSC y SDS 0,1%. Los filtros fueron monitorizados con un contador Geiger para ver que se había reducido el fondo.

Los clones positivos fueron purificados por placa y el plásmido pZL1 que contenía los insertos de ADNc fue rescatado usando el sistema de recombinación CRE LOX (GIBCO) (el plásmido pZL1 está contenido en el cuerpo del vector lambda Ziplox). En particular, se suspendió una placa de fago purificada en 200 \mul de tampón de fago (Tris HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 145 mM, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 8 mM, gelatina 0,01%) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 20 \mul de la suspensión de fago a 100 \mul de un cultivo de una noche de DH10B (ZL) y se incubó durante otros 5 minutos más. Las diluciones de la mezcla fueron entonces plaqueadas en placas LB suplementadas con ampicilina a 50 \mug/ml y MgCl_{2} 10 mM e incubadas durante la noche a 30ºC. Las colonias individuales, que ahora contenían el ADNc insertado en el vector pZL1, crecieron como cultivos standard de una noche y los plásmidos fueron entonces purificados usando reactivos de purificación de plásmidos Quiagen.

Identificación de distintos clones de ADNc MAdCAM-1 humano funcionales

Se estudiaron dos librerías de ADNc humanas de nódulos linfáticos mesentéricos histológicamente normales y de nódulos linfáticos mesentéricos inflamados de un paciente con enfermedad de Crohn utilizando todo el ADNc MAdCAM-1 de macaco como sonda. Se aisló un clon de hibridación cruzada de la librería normal y se aislaron dos clones de hibridación cruzada de la librería de Crohn. Uno de los dos clones aislados de la librería de Crohn tenía aproximadamente 1,3 kb, parecía estar incompleto en el extremo 5' y no fue secuenciado. El clon de la librería normal (clon 4) era ligeramente mayor (1624 pb) que el clon más largo (1558 pb) aislado de la librería de Crohn (clon 20). Aunque estos dos ADNc difieren en tamaño en aproximadamente 100 pb, sus secuencias 5' y 3' no traducidas eran casi idénticas en cuanto a longitud. Cada clon parecía de longitud total, ya que ambos contenían una secuencia señal amino-terminal que era casi idéntica a la secuencia de macaco.

Adicionalmente, la secuenciación preliminar demostró las mismas características distintivas del dominio amino-terminal de tipo Ig que el ADNc de primate. Dado que las diferencias de tamaño de estos clones no podía ser atribuida a la longitud de las secuencias no traducidas, parecía probable que la variación residiera en la región codificante.

Con objeto de determinar si cada clon codificaba MAdCAM-1 humana funcional, los insertos de cada clon fueron subclonados en el vector de expresión pCDNA-3 (Invitrogen, San Diego, CA), que lleva un gen de resistencia neo adecuado para la selección G418. Los ADNc humanos (que fueron hechos utilizando cebadores oligo-dT NotI en el extremo 3' y adaptadores SalI en el extremo 5') fueron ligados en el vector \lambdaZiplox, que contiene el plásmido pZL1. Se rescataron vectores pZL1 con insertos de ADNc como se ha descrito anteriormente. Para el subclonaje, los insertos de los clones 4 y 20 fueron liberados cada uno por digestión del esqueleto pZL1 con EcoRI y NotI. Los fragmentos EcoRI-NotI (5'\rightarrow3') fueron aislados por Geneclean (Bio 101) siguiendo electroforesis en un gel de agarosa 1% y los fragmentos fueron ligados en pcDNA-3 que había sido excindido con EcoRI y NotI. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar una cepa de eficiencia Max DH10B de E. coli (GIBCO) y los transformantes fueron obtenidos siguiendo una selección en agar LB suplementado con 50 \mug/ml de ampicilina (Amp). Los plásmidos denominados pcD3huMAd4 (inserto del clon 4) y pcD3huMAd20 (inserto del clon 20) fueron obtenidos y analizados por digestión de restricción.

El clon pcD3huMAd4 (inserto del clon 4) o pcD3huMAd20 (inserto del clon 20) fue transitoriamente transfectado en células CHO/P. Cada clon dirigía la expresión de una proteína funcional, que podía mediar en la unión y adhesión, según se valora por adhesión de los transfectantes CHO/P al linfoma de células B humano RPMI 8866 (Figura 5) o a células TK1 (no mostrado).

La adhesión de los transfectantes CHO/P a células RPMI 8866 fue bloqueada por preincubación con MAb ACT-1 anti-\alpha4\beta7, pero no por IgG control. La adhesión de transfectantes a células TK1 fue bloqueada por MAb FIB 504 anti-\beta7. Estos resultados indican que el clon 4 (de una librería de nódulos mesentéricos normales) y el clon 20 (de una librería de Crohn) codifican cada uno para proteínas MAdCAM-1 funcionales. Para caracterizar aún más estos distintos ADNc, ambos clones fueron completamente secuenciados.

Resultados

Los ADNc de los clones 4 y 20, codificantes de MAdCAM-1 humana, tienen 1628 pb y 1543 pb, respectivamente, de longitud. El ADNc del Clon 4 (Figura 1, SEC ID Nº: 1) contiene un marco de lectura abierto de 1218 pb codificante de una proteína predicha de 406 aminoácidos (SEC ID Nº: 2) y una región 3' no traducida de 410 pb, pero no contiene región 5' no traducida. El ADNc del Clon 20 (Figura 2, SEC ID Nº: 3) contiene 4 pb de secuencia 5' no traducida, un marco de lectura abierto de 1146 pb codificante de una proteína predicha de 382 aminoácidos (SEC ID Nº: 4) y una región 3' no traducida de 393 pb. Las masas moleculares predichas de las proteínas codificantes, después de la excisión de una secuencia de señal predicha de 18 aminoácidos son 40.910 (clon 4) y 38.375 (clon 20)
daltons.

Se realizaron múltiples alineaciones para analizar el grado de semejanza entre las diferentes especies clonadas de MAdCAM-1. Las alineaciones de nucleótidos revelaron un 81,9% de semejanza de secuencia entre los ADNc MAdCAM-1 de ratón y de rata, un 41,8% de semejanza entre los ADNc de ratón y de macaco, un 42,1% de semejanza entre los ADNc MAdCAM-1 murino y humano (Clon 4) y un 41,8% de semejanza entre los ADNc MAdCAM-1 murino y humano (Clon 20). La alineación de las secuencias nucleotídicas de MAdCAM-1 de macaco con los ADNc del Clon 4 y del Clon 20 humanos reveló semejanzas de secuencia de un 70,7% y de un 75,0%, respectiva-
mente.

Las semejanzas en las secuencias de aminoácidos fueron determinadas en un 78,5% entre la MAdCAM-1 de ratón y de rata, un 44,3% entre ratón y macaco y un 39% entre la murina y MAdCAM-1 codificada por el Clon 4 humano.

Las comparaciones de los clones 4 y 20 de ADNc revelaron una región que es homóloga al dominio de mucina de la MAdCAM-1 murina, debido a una prevalencia residuos de serina, treonina y prolina (69% para el clon 4 y 76% para el clon 20) (encuadrados en la Figura 1 y en la Figura 2). Esta región, aunque es similar en cuanto a la composición de aminoácidos a la MAdCAM-1 murina, es altamente divergente de la MAdCAM-1 murina. El dominio tiene 71 aminoácidos de longitud en el clon 4 y 47 aminoácidos de longitud en el clon 20. Esta región contiene también dos polimorfismos: (1) un polimorfismo en el aminoácido 240, que es prolina (P) en el clon 4 y serina (S) en el clon 20, y (2) un polimorfismo en el aminoácido 242, que es asparraguina (N) en el clon 4 y aspartato (D) en el clon 20. Además, los dominios de mucina humanos contienen una repetición de 8 aminoácidos, consistente en la secuencia PPDTTS(Q/P)E, que aparece ocho veces en el clon 4 y cinco veces en el clon 20.

Para valorar el origen de los clones 4 y 20, se utilizaron cebadores RCP a los lados de la repetición para amplificar el ADN genómico humano. Se utilizaron los siguientes cebadores:

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5'-CTC TAC TGC CAG GCC ACG-3'	(Cebador #1, SEC ID Nº: 7)
5'-AGC CTG GGA GAT CTC AGG G-3'	(Cebador #2, SEC ID Nº: 8)
5'-GCC ACG ATG AGG CTG CCT GG-3'	(Cebador #3, SEC ID Nº: 9)
5'-GTG GAG CCT GGG CTC CTG GG-3'	(Cebador #4, SEC ID Nº:10)

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Los cebadores eran cebadores encajados. En la primera reacción, se utilizaron los cebadores 1 y 2. Para la segunda reacción de amplificación, se preparó una dilución 1:1000 de la primera reacción y se utilizó 1 \mul con los cebadores 3 y 4. Las reacciones de amplificación contenían 0,5 \mug de ADN genómico, o 10 picogramos de plásmidos control (pcD3HuMAd4 o pcD3HuMad20), o aproximadamente 1 ng de ADNc de doble hebra que fue preparado previamente para las librerías ZipLox. El ADN genómico fue obtenido de tres fuentes (Promega, ClonTech y por purificación a partir de células Jurkat). Las condiciones de amplificación eran: un ciclo durante 5 minutos a 94ºC, 25 ciclos a 94ºC durante 45 segundos, 60ºC durante 45 segundos y 72ºC durante un minuto, seguido de un ciclo durante 5 minutos a 72ºC.

Las reacciones de amplificación a partir del ADN genómico dieron dos bandas que coemigraron con los productos individuales de las reacciones de RCP usando el ADNc del clon 4 o del clon 20 como plantilla. Este dato sugiere que los dos clones de ADNc son isoformas codificadas por ADN genómico y son probablemente generadas por ayustamiento alternativo o por transcripción de dos alelos diferentes. El polimorfismo extensivo y la divergencia de secuencias han sido documentados en otras secuencias de mucina (por ejemplo, Hilkens, J. y col., Trends Biochem. Sci., 17: 359-363 (1992)). Por ejemplo, no se conservan bien porciones repetitivas de mucinas intestinales entre roedores y humanos (Gum, J.G. y col., J. Biol. Chem., 266: 22733-22738 (1991)). Una advertencia es que, en base a un análisis de la estructura genómica murina, el ADN genómico humano podría contener un intrón en esta región. De ser así, los cebadores RCP utilizados en este experimento abarcarían el intrón y no se esperaría que la amplificación del ADN genómico humano produjese bandas del mismo tamaño que las producidas por amplificación de los controles de ADNc. El aislamiento y el análisis de clones genómicos de MAdCAM-1 humana podrían excluir de forma concluyente la posibilidad de un artefacto de clonaje. Se puede realizar una mayor valoración del tejido normal y/o inflamado de individuos normales y de pacientes con EII, enfermedad de Crohn u otras condiciones inflamatorias para determinar si existe una correlación entre la isoforma del clon 20 y una enfermedad o actividad inflamatoria.

La comparación de la MAdCAM-1 murina, de macaco y dos isoformas de la humana indica que las porciones amino-terminales de estos receptores exhiben estructuras de dominio que probablemente estén implicadas en el reconocimiento de \alpha4\beta7. Por el contrario, las regiones de estos receptores en una localización correspondiente a la localización del dominio mucina/IgA de la MAdCAM-1 murina exhiben composiciones similares de aminoácidos (regiones de mucina ricas en serina, treonina, prolina), pero divergen más entre sí.

Expresión de ARN MAdCAM-1 humano

Se llevó a cabo un análisis de Northern utilizando Northerns I y II de tejidos múltiples humanos (preparados comercialmente por Clontech, Palo Alto, CA) ó 2 \mug de ARN poli A+ de líneas celulares y tejidos que fueron preparados como se ha descrito antes. Se desnaturalizó el ARN y se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa 1% formaldehido y se transfirió a una membrana PVDF (Immobilon, Millipore) por procedimientos de transferencia capilar standard. Las muestras de ARN fueron teñidas con bromuro de etidio para asegurar inicialmente que la calidad y cantidad de cada ARN celular o tisular eran equivalentes. Después de ser transferido, el ARN fue fijado a membranas por entrecruzamiento UV (Stratalinker, Stratagene) y esta transferencia y las transferencias preparadas comercialmente fueron prehibridadas a 68ºC durante 1 hora en ExpressHyb (Clontech). El inserto de ADNc del clon 4 fue marcado con \alpha^{32}P-dCTP cebando con hexámeros al azar (Maniatis y col., En: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (199)). La hibridación fue llevada a cabo a 68ºC durante 1 hora en ExpressHyb con sonda desnaturalizada a una concentración de 2 X 10^{6} cpm/ml.

Las transferencias fueron entonces lavadas en 0,1 X SSC, SDS 0,1% durante 60 minutos a 65ºC con un cambio de lavado a los 30 minutos. El tiempo de exposición era de 48 horas, con una pantalla de intensificación. Después de esta exposición, se purificó la transferencia por lavado durante 10 minutos en SDS 0,5% y se rehibridó en las mismas condiciones con ADNc de \beta-actina. El tiempo de exposición era de 2 horas.

Resultados

Se sondaron transferencias de Northern para la expresión de MAdCAM-1 usando todo el inserto de ADNc del clon 4 como sonda. Una sola especie de ARN de aproximadamente 1,6 kb fue altamente expresada en el intestino delgado y fue expresada en menor grado en el colon y en el bazo. No se observó expresión significativa en otros tejidos examinados en estas condiciones, incluido el timo, la próstata, los ovarios, los testículos y los leucocitos de sangre periférica (LSP). Este patrón de expresión específico de tejido es consistente con estudios en ratón que muestran la expresión restringida de MAdCAM-1 en las Placas de Peyer, NLM (nódulos linfáticos mesentéricos), lámina propia intestinal y alguna expresión en el seno marginal alrededor de los nódulos de la pulpa blanca esplénica en el bazo (Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 8: 365 (1990); Berg, E.L. y col., Cellular and molecular mechanisms of inflammation, 2: 111 (1991); Briskin, M.J. y col., Nature, 363: 461 (1993)). No se observó expresión significativa en otros tejidos examinados, incluidos el corazón, el cerebro, la placenta, el pulmón, el hígado, el músculo esquelético o el riñón; sin embargo, se detectaron bajos niveles de expresión en el páncreas. Estos datos indican que la expresión de la MAdCAM-1 humana es específica de tejido, con expresión en tejidos mucosales y bazo; se puede realizar un análisis inmunohistoquímico completo de la distribución por tejidos usando anticuerpos monoclonales frente a la MAdCAM-1 humana (véase más adelante).

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Ejemplo 2 Caracterización de clones MAdCAM-1 Ensayos de adhesión funcional Plásmidos

Se utilizaron los plásmidos siguientes en los ensayos de adhesión funcional: (1) se utilizaron pSV-SPORT-1 (Gibco/BRL) o pcDNA-3 (Invitrogen) como controles, (2) MAdCAM-1 murina en pCDM8 (pCDMAD-7, Briskin, M.J. y col., Nature, 363: 461 (1993)), (3) VCAM-1 humana de siete dominios (Polte, T. y col., Nucleic Acids Res., 18: 5901 (1990)) en pcDNA3 (pCD3VCAM) y (4) MAdCAM-1 humana en pcDNA-3 (pCDhuMAd4) (véase lo anterior).

Anticuerpos monoclonales

Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales (MAb) en los ensayos de adhesión funcional: (1) MAb anti-MAdCAM-1 murina MECA-367 (American Type Culture Collection (Rockville, MD), Nº de Acceso HB9478; Streeter, P.R. y col., Nature, 331: 41 (1988), y Patente EE.UU. Nº 5.403.919 de Butcher), (2) MAb anti-VCAM-1 humana 2G7 (American Type Culture Collection (Rockville, MD); Graber, N.T. y col., J. Immunol., 145: 819-830 (1990)), (3) MAb anti-\alpha4\beta7 murina DATK 32 (Andrew, D.P. y col., J. Immunol., 153: 3847-3861 (1994)), (4) MAb anti-\beta7 murina FIB 504 (Andrew, D.P. y col., J. Immunol., 153: 3847 (1994)), (5) MAb anti-\alpha4\beta7 humana ACT-1 (Lazarovits, A.I. y col., J. Immunol., 133: 1857 (1984)), (6) anti-integrina \beta1 humana (CD29) (Becton Dickinson, San José, CA, Cat. #550034) y (7) IgG1 murina e IgG2A de rata como controles irrelevantes.

Líneas celulares

Las siguientes líneas celulares fueron utilizadas en los ensayos de adhesión funcional:

(1) Linfoma de células T murino TK1 (Butcher, E.C. y col., Eur. J. Immunol., 10: 556-561 (1980); E. Butcher (Stanford, CA)), (2) RPMI 8866, una línea de linfoma de células B humano que expresa \alpha4\beta7 (y no \alpha4\beta1) (American Type Culture Collection (Rockville, MD); Erle, D.J. y col., J. Immunol., 153: 517 (1994); una donación de D. Erle), (3) JURKAT, una línea de células T humanas que expresa \alpha4\beta1 (y no \alpha4\beta7) (American Type Culture Collection (Rockville, MD)) y (4) Ramos, una línea de células de linfoma de Burkitt humana (linfocitos B) que expresa \alpha4\beta1 (y no \alpha4\beta7) (American Type Culture Collection (Rockville, MD), Nº de Acceso ATCC CRL 1596).

Ensayos de adhesión funcional

Para los ensayos de adhesión funcional, se introdujeron plásmidos codificantes de diversas especies de MAdCAM-1, VCAM-1 humana y plásmidos control por transfección transitoria en células CHO/P según se ha descrito antes (Ejemplo 1), con las siguientes modificaciones. Como varios pocillos habían de ser transfectados para los estudios de inhibición de anticuerpos, se hizo primeramente para cada plásmido una mezcla maestra de liposomas con múltiplos de los pocillos que habían de ser transfectados. Esto aseguró que la misma mezcla de liposomas fuera transfectada a cada pocillo.

A las 48 horas de la transfección, se retiró el medio. Se añadió un sobrenadante de anticuerpos (0,25 ml) (que contenía MAb anti-VCAM-1 humana 2G7 o MAb anti-MAdCAM-1 murina MECA-367) ó 0,25 ml de tampón de ensayo de adhesión como control y se preincubó la mezcla a 4ºC durante 15 minutos.

Paralelamente, se centrifugaron líneas celulares de linfocitos (RPMI 8866 o Jurkat) y se resuspendieron a una densidad de 2 X 10^{6}/ml en tampón de ensayo consistente en HBSS (sin Ca^{++} o Mg^{++}) suplementado con suero de ternera bovino 2%, HEPES 20 mM, pH 7,3, Mg^{++} 2 mM y Ca^{++} 2 mM. Se preincubaron alícuotas de 0,25 ml (5 X 10^{5} células) de estas suspensiones de células RPMI 8866 o JURKAT con un pequeño volumen de varios anticuerpos purificados o con un volumen igual de sobrenadante DATK 32 a 4ºC durante 15 minutos. Cuando se usó DATK 32 en una preincubación con una línea celular, antes de iniciar el ensayo, el sobrenadante o el tampón presente en los pocillos (que
contenían los transfectantes) fue aspirado para obtener un volumen de 0,5 ml en total para el ensayo de adhesión.

Para la preincubación, se utilizaron anticuerpos purificados (ACT 1, FIB 504 anti-\beta1) y anticuerpos IgG control a concentraciones de 20 \mug/ml. Se utilizaron 0,25 ml de sobrenadante de anticuerpo (usado neto) que contenía anti-VCAM-1 humana (MAb 2G7) o anti-MAdCAM-1 murina (MAb MECA-367) en las preincubaciones. Se usaron 0,25 ml de sobrenadante de anticuerpo de DATK 32 en la preincubación.

Después de las preincubaciones, se combinaron líneas celulares (Jurkat o RPMI 8866) con los transfectantes en los pocillos y se continuó la incubación en una plataforma oscilante durante otros 30 minutos adicionales a 4ºC.

Los ensayos fueron fijados como se ha descrito antes. Las placas fueron lavadas por inversión suave en un gran vaso de precipitados de solución salina tamponada con fosfatos (PBS), seguido de inversión en un vaso de precipitados de PBS con glutaraldehido 1,5% para la fijación durante un mínimo de 1 hora. Se valoró la adhesión contando tanto los linfocitos como las células CHO en un campo a un aumento 20X. Para cada ensayo, se halló la media del número de linfocitos unidos por célula CHO/P como un mínimo de cuatro campos con el error standard. Los resultados en cada caso son de uno de tres experimentos llevados a cabo con resultados similares.

Resultados

La MAdCAM-1 murina se une específicamente a linfocitos que expresan \alpha4\beta7 (y no \alpha4\beta1). Con objeto de determinar la especificidad de las interacciones entre MAdCAM-1 humana y linfocitos, se llevaron a cabo ensayos de adhesión para valorar la capacidad de células CHO/P transfectadas transitoriamente que expresaban MAdCAM-1 humana para unirse a la línea celular RPMI 8866, que sólo expresa \alpha4\beta7 (Erle, D.J. y col., J. Immunol., 153: 517 (1994)) o a la línea de células T Jurkat, que expresa exclusivamente \alpha4\beta1. La unión de estas líneas celulares fue comparada a la de células CHO/P transfectadas transitoriamente que expresan MAdCAM-1 murina y VCAM-1 humana. Los resultados son presentados en las Figuras 4A-4B.

Las células RPMI 8866 no se unieron a transfectantes control, pero se unieron con avidez a transfectantes que expresaban MAdCAM-1 humana o murina. Esta unión resultó completamente inhibida por preincubación con MAb anti-\alpha4\beta7 ACT-1 (Figura 4A). Los transfectantes VCAM-1 no pudieron unirse a RPMI 8866, lo que es consistente con la demostración previa de que las interacciones \alpha4\beta7/VCAM-1 son dependientes de activación (Postigo, A.A. y col., J. Immunol., 151: 2471-2483 (1993); Ruegg, C. y col., J. Cell. Biol., 117: 179-189 (1992)). El fallo de las células RPMI 8866 para unirse a transfectantes VCAM-1 no era debido a una falta de expresión, ya que el análisis FACS utilizando MAb anti-VCAM-1 2G7 indicó una eficacia de transfección de \sim60%. Más aún, los mismos transfectantes VCAM-1 eran capaces de unirse a células Jurkat y la unión fue completamente inhibida por preincubación con los MAb anti-VCAM-1 o anti-\beta1 (Figura 4B). Los transfectantes MAdCAM-1 murinos y humanos no se unían a células Jurkat (una línea positiva a \alpha4\beta1). Estos datos demuestran que la MAdCAM-1 humana puede unirse selectivamente a leucocitos linfocitos humanos que expresan integrinas \alpha4\beta7.

Transfectantes de células L1-2 y CHO

La línea de células L1-2 de ratón deriva de un linfoma pre-B y fue obtenida del Dr. Eugene Butcher (Stanford University, Stanford, CA). Los genes codificantes de los ADNc de macaco o humano para MAdCAM-1 fueron subclonados en el vector pcDNA-3 (Invitrogen) según se ha descrito anteriormente. Los plásmidos resultantes (pcD3HuMAd4, pcD3HuMAd20 o pCD3PMAd (macaco)) fueron introducidos en células L1-2 por transfección como sigue: se hizo crecer a las células L1-2 a una densidad de aproximadamente 10^{6}/ml. Se lavaron 50, 25 ó 12,5 millones de células en HBSS y se resuspendieron después en 0,8 ml de un tampón consistente en solución salina equilibrada de Hanks suplementada con HEPES 20 mM, pH 7,05. se añadió una solución consistente en 20 \mug de plásmido linealizado, 500 \mug de ARNt y HBSS para obtener un volumen final de 200 \mul a la suspensión de células para llevar el volumen total a 1 ml. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, se transfirió la mezcla de células/ADN a una cubeta de electroporación (BioRad, Richmond, CA) y se electroporó a 250 voltios, 960 mF en un pulsador génico BioRad. Después de otros 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células fueron diluidas a 25 ml en medio standard de crecimiento L1-2 (RMPI 1640, suero bovino fetal Hyclone 10%, 50 U/ml de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) y 0,29 mg/ml de L-Glutamina (Gibco) y se devolvieron a la incubadora a 37ºC. A las 48 horas, se granularon las células por centrifugación y se resuspendieron en 50 ml de medio L1-2 suplementado con G418 (Geneticina, Gibco) a 0,8 mg/ml. Las diluciones de la suspensión celular fueron plaqueadas en placas de microtitulación de 96 pocillos y las colonias simples fueron analizadas al crecer en cuanto a la expresión de MAdCAM-1.

Los clones de células L1-2 que expresaban MAdCAM-1 fueron detectados por adherencia a células TK1. Las células L1-2 (células no transfectadas) y TK1 crecen ambas como suspensiones celulares simples. La expresión superficial de MAdCAM-1 puede ser detectada por su capacidad para mediar en la adhesión en virtud de su interacción con \alpha4\beta7 expresada en células TK1. La especificidad de esta interacción fue además demostrada por inhibición mediante pretratamiento de células TK1 con Mab anti-\beta7 FIB 504.

Las células CHO (Células de Ovario de Hámster Chino, American Type Culture Collection (Rockville, MD)) establemente transfectadas con clones de MAdCAM-1 de macaco o humanos fueron preparadas por electroporación según se ha descrito antes para las células L1-2 con las siguientes excepciones. el medio para el crecimiento de las células CHO era \alpha-MEM con desoxirribonucleósidos (Gibco) y suero de ternera fetal 10% (Gibco) y 50 U/ml de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) y 0,29 mg/ml de L-Glutamina (Gibco). El medio de selección consistía en el mismo medio con 0,55 mg/ml de G418 (Gibco). Los clones simples crecieron y fueron analizados en cuanto a su capacidad para exhibir unión \alpha4\beta7-dependiente de células RPMI 8866 utilizando el ensayo de adhesión funcional descrito anteriormente (para los transitorios), excepto por el hecho de que las células fueron plaqueadas a 50.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes del ensayo. Utilizando este criterio, se estableció una línea denominada CHO HuMAd 4.

Anticuerpos monoclonales capaces de inhibir la adhesión

Se generaron anticuerpos monoclonales frente a MAdCAM-1 humana inmunizando a ratones C57BL/6 con transfectantes MAdCAM-1 L1-2. Los ratones fueron inmunizados intraperitonealmente con 10 millones de células resuspendidas en HBSS tres veces a intervalos de dos semanas y se inyectó la cuarta inmunización final (de 10 millones de células resuspendidas en HBSS) intravenosamente. Se realizó la primera inmunización con una mezcla de dos clones (clon 23 y clon 19 de células L1-2) que expresan MAdCAM-1 de macaco. Los restantes refuerzos fueron realizados con un solo clon L1-2 (clon HuMAD4/17 de L1-2) que expresaba MAdCAM-1 humana.

Se realizó con éxito una fusión que generó aproximadamente 5.000 hibridomas. Cuatro días después de la inyección intravenosa final, se separó el bazo y se preparó una suspensión de células simples en medio DMEM libre de suero. Estas células fueron fusionadas con la pareja de fusión SP2/0 según el método de Galfre y col. (Galfre, G. y col., Nature, 299: 550-552 (1977)). Se combinaron 20 ml de células de bazo y 20 ml de células SP2/0, se centrifugaron a 800 g durante 5 minutos y se separó el medio por aspiración. Se añadió una solución de polietilenglicol 1500 (PEG 1500) 50% (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) precalentado a 37ºC al pellet de células a lo largo de 2 minutos, seguido de 10 ml de medio DMEM a lo largo de 3 minutos. Se centrifugó la suspensión celular a 600 g durante 3 minutos y se separó el sobrenadante. Se resuspendió el pellet suavemente en medio DMEM que contenía suero de ternera fetal 20%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina y medio de selección HAT (Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron plaqueadas en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos a 200 \mug/pocillo.

Diez días después de la fusión, los sobrenadantes de los pocillos fueron estudiados en cuanto a reactividad frente a transfectantes MAdCAM-1 humanos CHO (células CHO HuMAd 4) mediante tinción de fluorescencia. La tinción de 500.000 células por muestra fue realizada esencialmente según se ha descrito, utilizando 50 \mul de cada sobrenadante y 50 \mul de células (E. Harlow y D. Lane, 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). El anticuerpo secundario era una IgG anti-murina (H + L) marcada con FITC (Jackson Labs) que estaba diluida 1:200. Se juzgó una fuerte reactividad como un aumento de 2-3 log en la fluorescencia en comparación con células CHO no transfectadas.

Se seleccionaron 48 sobrenadantes de anticuerpo para una fuerte reactividad frente a células CHO HuMAd 4. Estos sobrenadantes de anticuerpo fueron entonces estudiados en cuanto a su capacidad para bloquear la adhesión de células CHO HuMAd 4 a células RPMI 8866. Como control, se examinó la capacidad de los sobrenadantes para inhibir la unión de células Ramos a transfectantes VCAM-1, ya que no debería resultar afectada por un MAb MAdCAM-1 anti-humano específico. Para identificar a los anticuerpos monoclonales bloqueantes anti-MAdCAM-1 humana se realizó el siguiente ensayo. Para obtener transfectantes control, se transfectaron células CHO/P con pCD3VCAM como se ha descrito antes y fueron estudiadas 48 horas después de la transfección. Cuarenta y ocho horas antes del ensayo de inhibición de la adhesión, se plaquearon 40.000 células por pocillo de transfectantes transitorios VCAM-1 en placas de 24 pocillos. Veinticuatro horas antes del ensayo, se plaquearon 50.000 células por pocillo de transfectantes CHOHuMAd 4 en placas de 24 pocillos. El día del ensayo, se añadió cada sobrenadante anti-MAdCAM-1 humana (0,25 ml) a un pocillo que contenía transfectantes CHOHuMAD 4 o transfectantes VCAM-1 y se preincubó la mezcla a 4ºC durante 15 minutos. Se realizaron los ensayos de adhesión utilizando (1) células RPMI 8866 con los transfectantes MAdCAM-1 o (2) células Ramos (una línea humana de células B que expresa \alpha4\beta1) con los transfectantes
VCAM-1.

Paralelamente, se resuspendieron las células (RPMI 8866 o Ramos) a una densidad de 2 X 10^{6}/ml en un tampón de ensayo consistente en HBSS (sin Ca^{++} o Mg^{++}) suplementada con suero de ternera bovina 2%, HEPES 20 mM, pH 7,3, Mg^{++} 2 mM y Ca^{++} 2 mM. Después de la preincubación de los transfectantes con anticuerpo, se añadieron 0,25 ml de las suspensiones de células RPMI 8866 o Ramos (5 X 10^{5} células) a cada pocillo y se continuó con la incubación en una plataforma oscilante durante otros 30 minutos más a 4ºC. Los pocillos fueron lavados, fijados y examinados según se ha descrito antes para valorar la inhibición de la unión.

Once de 48 de los sobrenadantes de hibridomas estudiados mostró una actividad bloqueante substancial, inhibiendo la adhesión de células RPMI 8866 a transfectantes que expresaban MAdCAM-1. La adhesión de células Ramos a transfectantes que expresaban VCAM-1 no resultó afectada, lo que indica una inhibición selectiva de las interacciones mediadas por \alpha4\beta7. Los hibridomas bloqueantes seleccionados fueron subclonados por dilución limitante.

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Resultados

Se prepararon líneas celulares estables que expresaban MAdCAM-1 de macaco o humana en el linfoma L1-2 pre-B murino. Estas células fueron usadas para inmunizar a ratones C57BL/6 y preparar hibridomas. La fusión resultante fue estudiada por tinción de inmunofluorescencia de transfectantes CHO HuMAd 4 que expresaban MAdCAM-1 humana. El estudio de aproximadamente 1.000 pocillos produjo 48 sobrenadantes que exhibían una fuerte reactividad frente a los transfectantes CHO HuMAd 4, mientras que las células CHO no transfectadas eran negativas. Estos sobrenadantes fueron posteriormente estudiados en cuanto a su capacidad para bloquear de manera específica la adhesión de células RPMI 8866 a transfectantes MAdCAM-1 humanos.

Once de los 48 sobrenadantes de hibridoma examinados podían inhibir de manera específica la adhesión de células RPMI 8866 a MAdCAM-1, mientras que la adhesión de células Ramos (que expresan \alpha4\beta1) a transfectantes VCAM-1 no resultó afectada por los mismos sobrenadantes. Estos hibridomas fueron denominados 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5, 7G11.

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Ejemplo 3 Diseño y análisis funcional de una quimera MAdCAM-1-IgG humana Construcción de la quimera MAdCAM-IgG

Se utilizó ADNc del clon 4 de MAdCAM-1 humana en pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), denominado pcD3huMAd4 (Ejemplo 1) como plantilla para la amplificación por RCP de regiones extracelulares de la MAdCAM-1 humana que habían de ser fusionadas con la región constante de la IgG1 humana. Se sintetizó el cebador HUMADIG4/2 (SEC ID Nº: 11), que contiene el extremo 5' de la secuencia codificante de MAdCAM-1 humana (codon ATG, negrilla):

\hskip1cm HindIII

5'-GGAAGCTTCCACCATGGATTTCGGACTGGCCC-3'

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Este cebador 5' fue utilizado junto con un cebador 3' denominado HUMADIG2 (SEC ID Nº: 12) para amplificar las regiones codificantes de los dos dominios de tipo inmunoglobulina (Ig) amino-terminales de la MAdCAM-1 humana. El cebador HUMADIG2 (SEC ID Nº: 12), que contiene una porción complementaria a los nucleótidos de la hebra codificante 667-683 de la SEC ID Nº: 1, tiene la siguiente secuencia:

\hskip1cm SpeI

5'-CCGACTAGTGTCGGGCTGTGCAGGAC-3'

\newpage

Alternativamente, se utilizó el cebador 5' junto con el cebador 3' HUMADIG3 para amplificar una región codificante de todo el dominio extracelular de la MAdCAM-1 humana (clon 4). El cebador 3' HUMADIG2 (SEC ID Nº: 12), que contiene una porción complementaria a los nucleótidos de la hebra codificante 992-1010 de la SEC ID Nº: 1, tiene la siguiente secuencia:

\hskip1cm SpeI

5'-GGACTAGTGGTTTGGACGAGCCTGTTG-3'

Los cebadores fueron diseñados con un sitio 5' HindIII o sitios 3' SpeI según se indica. Estos cebadores fueron utilizados para amplificar por RCP dos diferentes fragmentos de MAdCAM, utilizando un kit optimizador de RCP de Invitrogen (San Diego, CA). Los productos RCP fueron digeridos con las enzimas HindIII y SpeI para generar extremos para clonaje. Los productos fueron posteriormente purificados por electroforesis en gel utilizando el sistema de aislamiento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda, MD).

Se excindió un fragmento de \sim1 kb que incluía las regiones CH1, H (bisagra), CH2 y CH3 por digestión con SpeI y EcoRI a partir de un constructo que codificaba una cadena pesada \gamma1 de inmunoglobulina humana que tenía una región constante humana Fc-mutada. El anticuerpo codificado por este constructo fue utilizado aquí a continuación como control irrelevante emparejado por isotipo. La región constante humana en este constructo fue originalmente obtenida por amplificación RCP de la cadena pesada CAMPATH-1H (Reichmann, L. y col., Nature, 322: 323-327 (1988)) como describen Sims, M.J. y col. (J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993) y Waldmann y col. (WO 93/02191, 4 de Febrero de 1993 (página 23)), cuyas enseñanzas son aquí cada una incorporadas a modo de referencia en su totalidad. Las mutaciones en la región constante de este constructo (Leu^{234} \rightarrow Ala^{234} y Gly^{237} \rightarrow Ala^{237}) fueron diseñadas para reducir la unión a los receptores Fc\gamma humanos y fueron producidas por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. De este modo, las fusiones MAdCAM-Ig producidas contienen el fragmento de región constante SpeI-EcoRI descrito por Sims y col. (J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993)) y Waldmann y col. (WO 93/02191), excepto por la introducción de mutaciones Leu^{234} \rightarrow Ala^{234} y Gly^{237} \rightarrow Ala^{237}).

El fragmento SpeI-EcoRI de 1 kb codificante de la región constante IgG1 mutada en Fc fue aislado por electroforesis en gel utilizando el sistema de aislamiento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda, MD). Este fragmento de región constante, los fragmentos HindIII-SpeI que contenían (a) los dos dominios Ig N-terminales de MAdCAM-1 o (b) todo el dominio extracelular, fueron ligados en una ligadura de tres vías al vector pEE12 (Stephens, P.L. y M.L. Cockett, Nucl. Acids Res., 17: 7110 (1989) y Bebbington, C.R. y C.C.G. Hentschel, 1987, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells (Academic Press, N.Y.), que había sido digerido con HindIII y EcoRI. Se obtuvieron transformantes de la cepa bacteriana DH10B. Se hicieron crecer colonias y se analizaron preps de miniplásmidos por mapeo de restricción. Tres constructos que codifican proteínas de fusión consistentes en todo el dominio extracelular de MAdCAM-1 (constructo HuMAdIg21) o los dos dominios Ig N-terminales (constructo HuMAdIg31 o HuMAdIg38) fusionados a la región constante IgG1 mutada en Fc, fueron secuenciados a través de las porciones MAdCAM-1 enteras, confirmando una fusión apropiada de segmentos y la ausencia de mutaciones inducidas por RCP.

Para el estudio inicial, cada constructo fue transitoriamente transfectado sobre monocapas de 5 X 10^{7} células COS en 1 ml de tampón RPMI (sin suero) y 25 \mug de plásmido utilizando electroporación con un Pulsador Génico Biorad en condiciones standard (960 \muF, 250 V). A las 72-96 horas de la transfección, los sobrenadantes fueron recogidos, pasados a través de filtros de 0,45 \mu y guardados a 4ºC en presencia de azida sódica 0,05%. La producción de quimera fue confirmada por un ELISA en emparedado, utilizando un anticuerpo anti-IgG1 humana como anticuerpo de captura y el mismo anticuerpo, que fue conjugado a fosfatasa alcalina, como segundo anticuerpo para la detección. Se utilizó anticuerpo control irrelevante (que tenía una región constante idéntica) como patrón. También se analizó la quimera por transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-MAdCAM-1 humana y se vio que corría a aproximadamente 200 kd, hecho éste consistente con el tamaño de un homodímero.

Las quimeras MAdCAM humana-Ig solubles se unen específicamente a células positivas a \alpha4\beta7

Los sobrenadantes de cuatro transfecciones diferentes fueron estudiados en cuanto a su capacidad para teñir la línea celular T HuT 78, que mostró previamente unirse a MAdCAM-1 sólo en presencia de Mn^{++}. En consecuencia, cada solución utilizada en este ensayo contenía Mn^{++} 2 mM. Las células HuT 78 (una línea de linfoma humano de células T, American Type Culture Collection, Nº de Acceso ATCC TIB 161) son células portadoras de \alpha4\beta7. Para estudiar la especificidad de unión de las quimeras, las células HuT 78 fueron preincubadas con medio solo (RPMI 1640 con FCS 2%) o medio y 10 \mug/ml del anticuerpo anti-\beta7 FIB 504. Se incubaron aproximadamente 100.000 células sobre hielo durante 15 minutos y se lavaron después con HBSS más FCS 2%/Ca^{++} 2 mM/Mn^{++} 2 mM- Las células fueron entonces incubadas durante 20 minutos sobre hielo con medio una vez más o con sobrenadantes de una de cuatro transfecciones independientes, dos con una quimera que contenía todo el dominio extracelular de MAdCAM-1 (clon 21) y dos con una forma truncada de MAdCAM que contenía los dos dominios Ig N-terminales (clon 38) durante 20 minutos. Después de lavar, las células fueron entonces incubadas con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con ficoeritrina y se valoró la tinción por encima del fondo por citometría de flujo (FACScan). Sólo las células incubadas con los sobrenadantes de quimera se tiñeron por encima del fondo, mientras que la preincubación con el MAb \beta7 redujo esta tinción a niveles de fondo, lo que indica una interacción específica de la quimera con la integrina \alpha4\beta7 (Figuras 17A-17E).

Se seleccionaron líneas celulares NSO permanentes secretoras de quimera MAdCAM humana-Ig después de transfección por electroporación, por el crecimiento en un medio libre de glutamina según se ha descrito previamente (Cockett, M.L. y col., Bio/Technology, 8: 662-667 (1990)). Las líneas clonadas fueron adaptadas a crecimiento en cultivo rotatorio. Los sobrenadantes de tres de estas líneas clonadas (muestras B-D) y una quimera parcialmente purificada (Clon 21, purificado por unión a proteína A, muestra A) fueron estudiados en cuanto a su capacidad para soportar la adhesión de la línea de células B RPMI 8866. Resumiendo, se incubaron placas NEN maxisorb con 100 \mul/pocillo de Proteína A a 20 \mug/ml en tampón carbonato, pH 9,5, durante la noche a 4ºC. Las placas fueron entonces lavadas 2X con medio RPMI 1640 (sin suero). Se unieron 100 \mul de quimera (o diluciones seriadas en RPMI) a los pocillos a 37ºC durante 2 horas y luego se lavaron una vez. Los pocillos fueron entonces bloqueados con FCS durante 1 hora a 37ºC, lavados una vez y luego preincubados con sobrenadantes de cultivo de tejidos que contenían un MAb anti-VCAM-1 humana (2G7) como control o el MAb anti-MAdCAM-1 humana 10G3 (Ejemplo 2). Los MAb 2G7 y 10G3 fueron eliminados antes de la adición de células. Las células RPMI 8866 fueron marcadas fluorescentemente mediante preincubación con tinción BCECF-AM (BCECF-AM, 2',7'-bis(2-carboxi-etil)-5-(y 6)-carboxifluoresceína, éster acetoximetílico, Sondas Moleculares), se añadieron 100 \mul de células a cada pocillo (hasta una concentración final de 10^{5} células/pocillo) y se incubaron en un agitador rotatorio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se valoró la unión de células RPMI 8866 a las quimeras inmovilizadas por lectura de los valores de fluorescencia utilizando un Analizador de la Concentración de Fluorescencia (IDEXX). Se demostró la unión específica, ya que sólo el MAb anti-MAdCAM-1 humana pudo bloquear la unión de las células a la quimera MAdCAM-Ig (Tabla 1).

Éstas y otras proteínas quiméricas de fusión de este tipo pueden ser utilizadas para valorar la capacidad de un agente (por ejemplo, una molécula pequeña) para bloquear la unión de \alpha4\beta7 a la quimera, para identificar los inhibidores de la interacción \alpha4\beta7-MAdCAM. Adicionalmente, como las proteínas quiméricas de fusión pueden unirse a linfocitos positivos a \alpha4\beta7 en solución, proporcionan inhibidores candidatos del reclutamiento de linfocitos in vivo a los sitios inflamatorios.

TABLA 1

1

La línea de células B positiva a \alpha4\beta7 RPMI 8866 se une de manera específica a la quimera MAdCAM humana Ig soluble. El clon 21 de la quimera MAdCAM-1 humana Ig que fue parcialmente purificado sobre Proteína A (muestra A) o sobrenadantes de cultivo de tejidos de diferentes clones NSO (muestras B-D) fueron inmovilizados en placas de 96 pocillos con proteína A y o bien preincubados con un MAb anti-VCAM-1 2G7 (denominado "-" bajo MAb) como control negativo, o bien con el MAb anti-MAdCAM humana 10G3 ("+"). La quimera purificada o los sobrenadantes (utilizados sin diluir ("netos") o en diluciones seriadas 1:2) se unieron a los pocillos a través de la Proteína A y fueron incubados con células RPMI 8866 fluorescentemente marcadas en un agitador rotatorio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con un lavador de placas automatizado (Autolavador de Microplacas EL 404, BIO-TEK Instruments), las células unidas fueron contadas con un lector de placas automatizado (IDEXX). Los números brutos son, por lo tanto, un reflejo de los números de células unidas.

Ejemplo 4 Inhibición del reclutamiento de linfocitos al colon A. Inducción con DSS de colitis en ratones

Se dio acceso a ratones BALB/c a una solución al 5% de dextrano sulfato de sodio (DSS) en el agua de bebida durante un período de 10 días, según se ha descrito previamente (Lab. Invest., 69: 238-249, 1993). Durante este período de tiempo, los ratones desarrollaron síntomas clínicos de colitis, incluyendo reblandecimiento de heces y diarrea con sangre. Era evidente una lesión epitelial multifocal y ulceración, similares a la colitis ulcerativa en humanos, en el examen histológico de mucosa del colon de ratones afectados. Más aún, los ratones afectados pierden un 20-30% de su peso corporal inicial hacia el día 10.

Bloqueo por anticuerpos de las interacciones \beta7 y MAdCAM

Para determinar la eficacia de los anticuerpos específicos para \beta7 en el bloqueo del reclutamiento de linfocitos al colon, se dio a ratones BALB/c diariamente por vía intraperitoneal (i.p.) inyecciones de 100 \mug de anticuerpos monoclonales frente a \beta7, consistentes en FIB21 o en FIB30 en solución salina, según se ha caracterizado y descrito previamente (Berlin, C. y col., Cell, 74: 185-195, 1993; Michie, S.A. y col., Am. J. Pathol., 143: 1688-1698, 1993; Hamann, A. y col., J. Immunol., 152: 3282-3293, 1994) o un anticuerpo monoclonal de rata control emparejado por isotipo a la misma dosis (Andrew y col., antes citado) a lo largo del curso de 10 días de tratamiento con DSS.

Métodos de evaluación

Se utilizaron dos métodos para evaluar la eficacia de la terapia con anticuerpos para inhibir la infiltración leucocitaria y la lesión de la mucosa en el ratón colítico. En el primer método, el tratamiento fue juzgado histológicamente por dos observadores ciegos utilizando un sistema de puntuación para la evaluación de lesión epitelial y el grado de infiltración celular leucocitaria (Tabla 2). Para esta valoración, se fijó primeramente el tejido del colon en formalina tamponada neutra 10%, se deshidrató, se embebió en parafina, se seccionó y se tiñeron las secciones con hematoxilina y eosina antes del examen.

TABLA 2 Evaluación patológica

2

Se realizó una valoración histológica adicional empleando inmunohistoquímica para la detección y semicuantificación de linfocitos que expresan las integrinas \beta7 y vénulas mucosales que expresan MAdCAM. Como se ha descrito previamente (Ringler, D.J. y col., Am. J. Pathol., 134: 373-383 (1989)), el tejido del colon fue en primer lugar congelado rápidamente en compuesto OCT, seccionado mientras estaba congelado y las secciones fueron posteriormente fijadas en acetona durante 10 minutos a 4ºC. Después de lavar en solución salina tamponada con fosfatos (PBS), se bloquearon los sitios de unión no específica a anticuerpos con suero normal de conejo 10% diluido en PBS durante 10 minutos, seguido secuencialmente de lavados por el anticuerpo FIB21 a 20 \mug/ml en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA), anticuerpo policlonal anti-rata de conejo biotinilado, complejos de avidina-peroxidasa y, finalmente, el cromógeno, diaminobenzidina y peróxido de hidrógeno diluido en tampón Tris.

En el segundo método, se valoró cuantitativamente el reclutamiento de linfocitos al colon usando linfocitos de nódulos linfáticos mesentéricos radiomarcados de ratones donantes singénicos. El diseño experimental de los experimentos con animales era similar al descrito anteriormente, excepto por el hecho de que se puso a los ratones BALB/c con DSS 5% durante 9 días (en lugar de 10) y de que el día 8 se dio a los ratones inyecciones i.p. de 100 \mug de FIB21 (anti-\beta7), MECA-367 (anti-MAdCAM), una mezcla de ambos o un anticuerpo monoclonal control emparejado por isotipo en solución salina. El día 9, las células de los nódulos linfáticos mesentéricos fueron aisladas de los ratones BALB/c singénicos donantes, marcas con ^{51}Cr y 5,0 x 10^{6} células/ratón fueron incubadas durante 30 minutos a 37ºC con 500 \mug de anticuerpo control, 250 \mug de MECA-367, 500 \mug de FIB21 o ambos (la cantidad total es de 750 \mug) en solución salina. Las células marcadas y el anticuerpo fueron entonces inyectados por vía intravenosa (i.v.) en los ratones receptores tratados con DSS. Se recogió la longitud total del colon de todos los animales experimentales 1 hora después de la inyección y se midió la irradiación \gamma usando un contador \gamma.

Análisis de datos

Se valoraron las diferencias entre las puntuaciones medias obtenidas para cada grupo de animales en cuanto a la significación estadística usando una prueba t de Student emparejada. Se consideró que las diferencias entre las medias eran significativas cuando P < 0,05.

Resultados

Histológicamente, la inflamación y la lesión epitelial producida en la mucosa eran más graves en el colon descendente, en el recto y en el ciego. El análisis de las secciones congeladas de tejido del colon por inmunohistoquímica reveló que el reclutamiento más significativo de linfocitos \beta7^{+} era hacia el colon derecho. Además, se vio que el nivel de expresión de la adresina vascular de mucosa, MAdCAM-1, era expresado solamente a bajos niveles en los vasos de la mucosa intestinal en un momento temprano en el tratamiento con DSS (3 días), pero que aumentó dramáticamente después de 9 días de tratamiento con DSS, lo que apoya la conclusión de que las interacciones \beta7 y MAdCAM-1 eran relevantes para el proceso inflamatorio en la mucosa del colon durante la colitis inducida por DSS.

La evaluación histológica de ratones expuestos a un curso de 10 días con DSS y terapia diaria usando anticuerpos específicos para \beta7 demostró que se produjeron reducciones substanciales del reclutamiento de leucocitos (P<0,01 para FIB30 y P<0,001 para FIB21) y lesión epitelial (P<0,05) en el colon derecho (ascendente) en comparación con animales que recibieron un anticuerpo control a la misma dosis (Figuras 7A y 7B). Más aún, el análisis utilizando inmunohistoquímica de secciones congeladas de estos animales sugirió que se redujo el número de células \beta7^{+} reclutadas hacia el colon derecho, pero no otras secciones del colon, durante el tratamiento con DSS.

El reclutamiento de linfocitos hacia el colon inflamado fue entonces cuantitativamente valorado usando linfocitos mesentéricos radiomarcados tomados de donantes singénicos. Una hora después de la inyección de estas células en receptores tratados con DSS, hubo una tendencia hacia una reducción en el número de células marcadas con ^{51}Cr reclutadas hacia el colon en ratones que fueron tratados con anticuerpos específicos para \beta7 o con los anticuerpos específicos para MAdCAM, pero no en ratones tratados con anticuerpos control emparejados por isotipo (Figura 8).

B. Inducción de colitis en ratones scid e inhibición del reclutamiento de células de nódulos linfáticos al colon

Los ratones scid reconstituidos con células T CD45RB^{hi} CD4^{+} desarrollan colitis y un síndrome grave de desgaste. La colitis que se desarrolla en ratones scid reconstituidos con células T CD45RB^{hi} CD4^{+} difiere de la mayor parte de los demás modelos murinos de EII en que la colitis inducida en el ratón scid requiere claramente la presencia de células T CD4^{+} para la inducción, si no la patogénesis, de la enfermedad (Powrie, Immunity, 3: 171 (1995), cuyas enseñanzas son aquí incorporadas como referencia en su totalidad).

Se utilizó una modificación del método de Morrissey y col. y Powrie y col. (Morrissey y col., J. Exp. Med., 178: 237 (1993); Powrie y col., Int. Imm., 5: 1461 (1993), cuyas enseñanzas son ambas aquí incorporadas a modo de referencia en su totalidad) para enriquecer en células T CD4^{+}, aisladas del bazo de BALB/c, por depleción de leucocitos granulíticos, células T CD8^{+}, células B220^{+}, células I-A^{+} y macrófagos MAC-1^{+}. Se seleccionaron células CD45RB^{hi} por medio de un clasificador celular, que pasaba el 40-45% más brillante de las células CD4^{+} teñidas con anti-CD45BR. Los ratones receptores scid fueron reconstituidos por inyección intravenosa (i.v.) de 1 x 10^{6} células T CD45RB^{hi} o CD45RB^{lo} en la vena de la cola. Se reconstituyó a cuatro ratones con células T CD45RB^{hi} y a cuatro ratones con células T CD45RB^{lo}.

Los ratones reconstituidos fueron monitorizados semanalmente en cuanto a cambios de peso y al desarrollo de sangre oculta en heces. Típicamente, dentro de las 4-6 semanas post-reconstitución, la diferencia en peso corporal de ratones reconstituidos con células T CD45RB^{hi} en relación a los ratones scid control reconstituidos con un número igual de células T CD45RB^{lo} se hizo estadísticamente significativa (Figura 18).

Se puede inducir la colitis en este modelo con tan sólo 5 x 10^{4} células. En general, se usan de 1 a 5 X 10^{5}. Aunque la cinética de la aparición de la enfermedad no es uniforme entre los ratones en una reconstitución dada, la colitis es de una gravedad similar una vez que el peso corporal ha disminuido a un 75-85% del peso inicial. Las observaciones histológicas eran consistentes con los informes de otros e indican que la colitis en este modelo se caracteriza por una infiltración masiva de células T CD4^{+} en la mucosa y submucosa, inmadurez epitelial, ulceración, hiperplasia de las criptas, pérdida de células caliciformes y abscesos en las criptas. De forma similar a la enfermedad de Crohn, la EII en el modelo scid se caracteriza también por infiltración transmural con fístulas profundas. A diferencia de los otros modelos murinos de colitis, la gravedad de la enfermedad no se limita al colon distal, sino que tiene igual gravedad en el colon transverso y proximal.

Bloqueo con anticuerpos de las interacciones \beta7 y MAdCAM

En estos estudios se utilizó anticuerpo anti-MAdCAM-1 murina (MAb MECA-367; American Type Culture Collection (Rockville, MD), Nº de Acceso HB 9478; Streeter, P.R. y col., Nature, 331: 41 (1988); véase también la Patente EE.UU. Nº 5.403.919 de Butcher) y anticuerpo anti-\beta7 murina (MAb FIB 504; Andrew, D.P. y col., J. Immunol., 153: 3847 (1994)).

Se reconstituyeron ratones scid con 2 X 10^{5} células T CD45RB^{hi} o CD45RB^{lo} CD4^{+}. A los cinco meses post-reconstitución, se inyectó a los ratones durante 14 días con 200 \mug/día de anticuerpo control IgG2a de rata o una mezcla de 100 \mug/día de FIB-504 (específico de \beta7 murina) + 100 \mug/día de MECA-367 (específico de MAdCAM murina). El anticuerpo estaba en PBS. Había cinco ratones en cada grupo de tratamiento. Después de 14 días, los ratones fueron inyectados intravenosamente con 5 X 10^{6} células de nódulos linfáticos mesentéricos (BALB/c) marcadas con ^{111}In-oxina. A las 24 horas de la transferencia adoptiva de células marcadas, los tejidos fueron recogidos y valorados en cuanto a radioactividad. Los niveles de fondo de radioactividad en los tejidos, a los que contribuyó el atrapamiento no específico de células, fueron valorados por inyección de 5 X 10^{6} células marcadas fijadas con formaldehido tamponado con PBS 2%. Los resultados fueron expresados como % de cuentas por minuto (CPM) en el colon normalizadas a las CPM en el bazo y corregidos para el fondo.

Esta valoración cuantitativa de infiltración en el colon en ratones scid reconstituidos con células T CD45RB^{hi} CD4^{+} reveló un aumento en la localización de 10 a 100 veces en comparación con el nivel observado en receptores scid reconstituidos con un número igual de células T CD45RB^{lo} CD4^{+}. Esta mayor acumulación de células marcadas en el colon fue inhibida en un 50-75% por tratamiento durante 2 semanas con una combinación de anticuerpos monoclonales anti-\beta7 y anti-MAdCAM (Figura 19).

En otro experimento, se reconstituyeron ratones scid con 5 X 10^{4} células CD45RB^{hi} o CD45RB^{lo} CD4^{+}. En el momento de la reconstitución, los ratones fueron tratados con (a) 500 \mug de FIB 504 (específico de \beta7) (6 ratones), o (b) 500 \mug de MECA-367 (específico de MAdCAM) (3 ratones), o (c) 1 mg de anticuerpo control emparejado por isotipo (7 ratones), o (d) 1 mg de FIB 504 + MECA-367 (500 \mug de cada uno) (5 ratones). Después de la reconstitución, los anticuerpos fueron administrados a intervalos semanales: (a) 250 \mug de FIB 504, (b) 250 \mug de MECA-367, (c) 500 \mug de control emparejado por isotipo o (d) 500 \mug de FIB 504 + MECA-367 (250 \mug de cada uno).

Después de 4 meses de tratamiento, los ratones fueron inyectados con 5 X 10^{6} células de nódulos linfáticos mesentéricos (BALB/c) marcadas con ^{111}In y se valoró el reclutamiento al colon midiendo los niveles de radioactividad. Los resultados fueron calculados como se ha descrito para la Figura 19. El tratamiento de ratones scid durante 4 meses, partiendo del momento de la reconstitución, con FIB 504 y MECA-367, solos o en combinación, inhibió el mayor reclutamiento de linfocitos al colon en un 100% (Figura 20).

Los ratones scid fueron reconstituidos con 2,0 X 10^{5} a 4,0 X 10^{5} células CD45RB^{hi} o CD45RB^{lo} CD4^{+}. Después de 4 meses, los ratones fueron tratados durante 14 días con una combinación de FIB 504 (específico de \beta7) + MECA-367 (específico de MAdCAM) (100 \mug de cada MAb por día para un total de 200 \mug/día) o un anticuerpo control emparejado por isotipo (200 \mug/día). El anticuerpo estaba en PBS. Cada grupo experimental consistía en 4 ratones. Se tiñeron secciones congeladas del colon izquierdo y derecho con un anticuerpo monoclonal de rata específico para CD4 de ratón y se revelaron con Rojo Rápido o con cromógeno AEC (3-amino-9-etilcarbazol). Se analizó una sección transversal del colon izquierdo y del colon derecho de cada ratón en cuanto a tinción positiva para CD4 utilizando el analizador de Imagen Leica Quantimet 500. Cada sección fue revisada en su totalidad utilizando un objetivo 10X. La significación fue determinada usando una prueba t de Student. Los datos representan el recuento positivo medio/área de tejido \pm 1 desviación standard.

La valoración histológica por inmunohistoquímica con un panel de anticuerpos específicos para marcadores de línea celular y de estado de diferenciación, sugirió que virtualmente todas las células infiltrantes en los cólones de ratones scid reconstituidos con células T CD45RB^{hi} eran células T CD4^{+}. No se pudo identificar ninguna célula T CD8^{+} o B B220^{+} en las condiciones empleadas. Además, el tratamiento de estos ratones con una combinación de anticuerpos monoclonales específicos de \beta7 y de MAdCAM redujo significativamente el número de células T CD4^{+} en el colon ascendente o descendente en relación a los controles (Figura 21). Como las células de los nódulos linfáticos mesentéricos eran \sim95% linfocitos, estos resultados indican que la interacción de \alpha4\beta7 sobre los linfocitos con MAdCAM es importante en el reclutamiento de linfocitos a sitios de inflamación en el colon y que los agentes que bloqueen esta interacción pueden reducir la inflamación.

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Ejemplo 5 Resolución de las alteraciones de las vellosidades en el tití común (Callithrix jacchus) con enteritis con malabsorción Descripción del modelo

Los titís comunes (Callithrix jacchus) son unos primates no humanos del Nuevo Mundo que, en condiciones de cautividad en el New England Regional Primate Research Center (NERPRC), desarrollan un síndrome de malabsorción espontánea que no responde a esteroides caracterizado por pérdida de peso, diarrea y pequeños cambios en la mucosa del intestino, que concuerdan con una pérdida de la capacidad de absorción. Estos cambios histológicos incluyen atrofia y fusión de las vellosidades del intestino delgado y un infiltrado de leucocitos mononucleares en la lámina propia similar a la enfermedad Celíaca (sprue no trópico) en humanos. El análisis retrospectivo de los expedientes del archivo de patología en el NERPRC demostró que hasta un 80% de los titís comunes tienen, en varios grados, enteritis con malabsorción en el momento del examen postmórtem.

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Protocolo de terapia con anticuerpos

Se seleccionaron titís comunes adultos para el estudio de la colonia general del NERPRC. Los estudios de línea basal en todos los animales incluían examen físico, recuento completo de sangre (RCS), perfil químico sanguíneo, B12 sérica, proteína C reactiva y biopsia de yeyuno de todo su espesor por laparotomía. Después de al recuperación de la cirugía abdominal, los animales fueron tratados durante 14 días con 2 mg/kg/día de anticuerpo monoclonal ACT-1, un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a un epitopo conformacional de \alpha4\beta7 (Schweighoffer, T. y col., J. Immunol., 151: 717-729, 1993). Los estudios previos indicaron que este anticuerpo tenía reacción cruzada con la \alpha4\beta7 de Callithrix. Todas las valoraciones que fueron realizadas antes de la terapia con anticuerpos fueron repetidas entre los días 10º y 14º de la terapia con anticuerpos.

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Análisis de las biopsias de yeyuno

Las biopsias de todo el grosor del yeyuno de cada tití fueron evaluadas histológicamente por dos patólogos independientes y la arquitectura de las vellosidades fue puntuada según el siguiente criterio de graduación:

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Atrofia de vellosidades

: 0 - grosor de la mucosa y altura de las vellosidades normales;

: 1 - atrofia suave, ligero acortamiento de las vellosidades, altura aproximadamen te un 75% de la normal;

: 2 - atrofia moderada, vellosidades aproxi madamente un 33-50% de la altura normal;

: 3 - atrofia grave, vellosidades cortas (<33% de lo normal) o no observables.

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Fusión de vellosidades

: 0 - normal, no hay fusión;

: 1 - 1-2 vellosidades en la muestra fusiona das;

: 2 - entre 1-2 y un 50% de las vellosidades en la muestra fusionadas;

: 3 - >50% de las vellosidades en la muestra fusionadas.

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Análisis de datos

Las diferencias entre las puntuaciones medias obtenidas para cada grupo fueron valoradas en cuanto a significación estadística utilizando una prueba t de Student emparejada. Las diferencias entre las medias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.

Resultados

Las puntuaciones medias para la fusión y atrofia de vellosidades antes y después de la terapia de anticuerpos con el anticuerpo monoclonal ACT-1 aparecen en las Figuras 9 y 10, respectivamente. Como queda demostrado, hubo una casi completa resolución de la atrofia de vellosidades (P<0,01) y una tendencia a mejorar la fusión de vellosidades después de un curso de dos semanas de terapia con el anticuerpo ACT-1. El efecto no era secundario a los efectos no específicos de la exposición a una inmunoglobulina extraña, ya que en otros animales tratados con diversos anticuerpos monoclonales dirigidos frente a epitopos distintos del reconocido por ACT-1 no hubo eficacia en la reducción de las puntuaciones de fusión y atrofia de vellosidades.

Ejemplo 6 Resolución de la colitis en el tití de cabeza de algodón Descripción del modelo

El tití de cabeza de algodón (TCA) (Saguinus oedipus) es un primate no humano del Nuevo Mundo que desarrolla una colitis espontánea y frecuentemente crónica que es clínica e histológicamente similar a la colitis ulcerativa del hombre (Madara, J.L. y col., Gastroenterology, 88: 13-19 (1985)).

Inmunoterapia, valoración clínica y biopsia de mucosa

Se instituyó un protocolo experimental que incluía valoración clínica, biopsia de mucosa del colon e inmunoterapia ACT-1 de los TCA con colitis (Figura 13). El ACT-1 es un anticuerpo monoclonal IgG1 murino reactivo con \alpha4\beta7 humana (Schweighoffer, T. y col., J. Immunol., 151: 717-729 (1993); Lazarovits, A.I. y col., J. Immunol., 133: 1857-1862 (1984), y Erle, D.J. y col., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). Se vio que el ACT-1 tenía reacción cruzada en el tití, según se valoró por tinción inmunohistológica, con el anticuerpo ACT-1 de mucosa colítica de animales afectados. Estos estudios piloto iniciales demostraron que de un 40 a un 80% de las células mononucleares dentro de la lámina propia del colon de los animales afectados eran \alpha4\beta7^{+}, de forma similar a la mucosa colítica humana. También se vio que ACT-1 tenía reacción cruzada con \alpha4\beta7 del TCA utilizando citometría de flujo sobre linfocitos de sangre periférica (LSP) de TCA.

Se eligieron TCA con colitis crónica de la colonia general del New England Regional Primate Research Center, Southborough, Massachusetts, en base a la observación clínica de diarrea y pérdida de peso. Para confirmar la presencia de colitis (según se define por una puntuación de actividad inflamatoria histológica de 2 ó 3), los animales de la colonia que se observó tenían emaciación clínica y diarrea fueron evaluados en cuanto a actividad inflamatoria del colon por valoración histológica de rutina de muestras de biopsia de mucosa del colon en múltiples ocasiones antes de la valoración experimental de la inmunoterapia con anticuerpos (Figura 13). Los TCA con colitis crónica fueron estudiados en cuanto a actividad inflamatoria de colitis al menos en dos ocasiones por examen de muestras de mucosa del colon descendente terminal, a 2-3 cm del ano, utilizando un endoscopio de fibra óptica pediátrico. Las puntuaciones de actividad inflamatoria estuvieron basadas en los números relativos de neutrófilos en la lámina propia, lumen de las criptas, epitelio de las criptas y epitelio superficial. Concretamente, se utilizó un sistema de puntuación histopatológica de actividad inflamatoria aguda y crónica (descrito por Madara, J.L. y col., Gastroenterology, 88: 13-19 (1985)). Todas las muestras de biopsia fueron puntuadas y categorizadas en cuatro grupos, representando el 0 la mucosa normal y representando el 3 la mucosa más grave e inflamada. Las puntuaciones de 0 y 1 no representan colitis sintomática, mientras que las puntuaciones de 2 a 3 representan una actividad colítica de suave a grave. Los animales seleccionados para el estudio tenían: (1) alteraciones estructurales moderadas (grado 2) o graves (grado 3) de la superficie y del epitelio de las criptas en la primera muestra de biopsia, lo que sugiere colitis de naturaleza crónica, y (2) actividad inflamatoria moderada (grado 2) o grave (grado 3) en al menos dos muestras de biopsia tomadas con 3-7 días de diferencia antes de la inmunoterapia. Las muestras de biopsia que satisfacían estos criterios fueron caracterizadas por la presencia de ramificación y/o pérdida de las criptas, con infiltración de leucocitos polimorfonucleares (PMN) en la lámina propia y/o el compartimento epitelial.

Así, los animales seleccionados para el estudio tenían evidencia repetida de actividad inflamatoria del colon y colitis clínicamente importante de naturaleza crónica sin evidencia reciente de remisión. Más aún, la persistencia de la diarrea hasta el primer día de administración de anticuerpo monoclonal era un requisito para que el animal fuera incluido en el estudio. A los 5 días de la confirmación de la colitis, los animales comenzaron la inmunoterapia con anticuerpo monoclonal ACT-1.

El anticuerpo ACT-1 fue producido por cultivo en un fermentador de células de fibra hueca utilizando una vía de flujo estéril libre de pirógenos, purificado por cromatografía de afinidad con proteína A y diluido en NaCl 0,9% estéril antes de su uso in vivo. Como los TCA son una especie en peligro, el ACT-1 también demostró tener reacción cruzada con \alpha4\beta7 en LSP de una especie relacionada, el tití común (Callithrix jacchus), con objeto de llevar a cabo un análisis farmacocinético del anticuerpo antes de su administración a TCA con colitis. en este componente del estudio, el ACT-1 fue administrado a dos titís comunes adultos normales, primero como una única infusión intravenosa y luego como una única inyección intramuscular 24 horas después. La administración intravenosa de 2,0 mg/kg de ACT-1 en estos animales dio una vida media estimada en suero de aproximadamente 50 horas, con una absorción continuada de anticuerpo de 2-24 horas después de una simple inyección intramuscular. Utilizando este régimen de dosificación, los picos de concentración en suero del anticuerpo eran aproximadamente de 60 \mug/ml, mientras que los senos de concentración eran de \geq18,0 \mug/ml. No se observó ningún efecto clínico adverso en los titís a los que se dio ACT-1.

En vista de estas observaciones, la mitad de los titís de cabeza de algodón que satisfacían los requerimientos del estudio (n = 4, edad colectiva = 31 años) recibió un único bolo intravenoso (I.V.) de ACT-1 a una dosis de 2,0 mg/kg el primer día y 7 inyecciones intramusculares (I.M.) posteriores de la misma cantidad cada 24 horas, durante un total de 8 días de inmunoterapia. La otra mitad de los animales control con colitis crónica (n = 4, edad colectiva = 26 años) recibió anticuerpo 86D, un anticuerpo monoclonal murino (IgG1) para \gamma\delta TCR de oveja (Mackay, C.R. y col., Eur. J. Immunol., 19: 1477-1483 (1989)), que no tiene reacción cruzada en TCA (datos no mostrados). Este anticuerpo irrelevante, emparejado por isotipo, fue producido, purificado y administrado en idénticas condiciones a ACT-1.

Se obtuvieron de nuevo biopsias de mucosa del colon en el momento de la infusión del primer anticuerpo (Día 0) y los días 5, 10 y 20. Las biopsias fueron evaluadas por un patólogo independiente. Se congelaron biopsias de colon adicionales para inmunohistología. Para los análisis histológicos, las muestras de biopsia de mucosa del colon, tomadas a 2-3 cm del ano, fueron de inmediato congeladas rápidamente en compuesto OCT y se fijaron muestras por duplicado tomadas del área adyacente en formalina tamponada con fosfato 10%, se procesaron por técnicas histológicas de rutina, se embebieron en parafina, se cortaron a un grosor de 6,0 \mum y se tiñeron las secciones con hematoxilina y eosina. Las muestras fijadas con formalina fueron entonces examinadas histopatológicamente. Se utilizaron secciones congeladas fijadas en acetona para detectar la IgG1 murina administrada in vivo eliminando el anticuerpo primario en la secuencia de una técnica inmunohistoquímica de avidina-biotina peroxidasa previamente descrita (Ringler, D.J. y col., Clin. Immunol. Immunopathol., 49: 349-364 (1988)).

Los cuidadores de los animales eran ciegos al régimen terapéutico (ACT-1 frente a anticuerpo monoclonal irrelevante emparejado por isotipo) y evaluaron la consistencia de las heces en cada animal en una base diaria categorizando las heces como diarrea, semisólidas o sólidas. Las puntuaciones fueron asignadas como sigue: 0, heces formadas, sólidas; 1, heces líquidas con algún componente sólido (semisólidas); ó 2, heces líquidas (diarrea). Los animales fueron pesados un día sí y uno no, al tiempo que se recogía sangre con los mismos intervalos para citometría de flujo, hematología y almacenamiento de suero o plasma para posteriores análisis, tales como concentración de anticuerpos, título de IgG anti-ratón, química clínica o proteínas de fase aguda.

Análisis de imagen morfométrico asistido por ordenador

Se realizó un análisis morfométrico, cuantitativo y asistido por ordenador de secciones de biopsia de mucosa utilizando un Analizador de Imagen Leica Quantimet 500. En primer lugar, se realizó el análisis inmunohistoquímico de las secciones de mucosa para delinear los tipos celulares de leucocitos específicos usando una técnica de avidina-biotina peroxidasa, según se ha descrito previamente (Ringler, D.J. y col., Clin. Immunol. Immunopathol., 49: 349-364 (1988)). Se utilizaron secciones congeladas fijadas en paraformaldehido, acetona o formalina para identificar neutrófilos, células \beta7+ y monocitos/macrófagos (M\varphi), respectivamente, utilizando, como reactivos primarios en la secuencia, un anticuerpo policlonal anti-elastasa de oveja (Biodesign, Kennebunk, ME) para identificar neutrófilos, anticuerpo monoclonal FIB21 (IgG2a de rata) para identificar la cadena \beta7 (Andrew, D.P. y col., J. Immunol., 153: 3847-3861 (1994)) y anticuerpo monoclonal HAM-56 (IgM de ratón) para identificar macrófagos (Dako Corp., Carpinteria, CA). El examen de secciones de tejido teñidas utilizando el anticuerpo de elastasa documentó que este reactivo sólo reconocía células polimorfonucleares en mucosa de colon de TCA. Se utilizaron secciones de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina para enumerar las células T y B, usando un anticuerpo policlonal de conejo para CD3 humano (Dako Corpo., Carpinteria, CA) y anticuerpo monoclonal L26 (IgG2a de ratón) (Dako Corp., Carpinteria, CA), respectivamente, como reactivos primarios en la secuencia. Para la detección de anticuerpos primarios, se utilizaron reactivos secundarios específicos de especie y de isotipo con objeto de eliminar el reconocimiento de ACT-1 o anticuerpo IgG1 murino irrelevante en los tejidos. Después de los procedimientos inmunohistoquímicos, cada población de células fue enumerada en 2-4 campos al azar/sección de mucosa. Las células fueron seleccionadas en base a la longitud de onda de color generada por el producto de reacción diaminobenzidina marrón y los criterios de selección de color fueron idénticos en todas las secciones analizadas para cada marcador específico de células. Debido a la morfología de las secciones congeladas y a la alta densidad relativa de los linfocitos \beta7+ y de los macrófagos, la cuantificación de estos tipos celulares fue evaluada como área de mucosa fraccional inmunorreactiva, mientras que todos los demás tipos celulares leucocitarios fueron enumerados como número de células/área de mucosa. Los valores fueron expresados como el porcentaje medio (\pm 1 SEM) del valor de pretratamiento (día 0) en un grupo de tratamiento, obtenido comparando el valor de la muestra de biopsia de cada animal en un punto temporal particular con el valor obtenido del mismo animal el día 0. Así, los valores menores del 100% (mostrados en negrilla en la siguiente Tabla 3) representan una reducción de la densidad de células leucocitarias en comparación con las muestras de pretratamiento, mientras que los valores mayores del 100% representan un aumento de la densidad celular leucocitaria en la mucosa. La significación fue determinada usando una prueba t de Student emparejada y comparando las puntuaciones brutas medias de densidad celular en un punto temporal particular con las de pretratamiento. Se consideró que las diferencias entre medias eran significativas cuando P < 0,05.

Hematología y citometría de flujo

Los linfocitos que expresan la integrina \alpha4\beta7 fueron enumerados por citometría de flujo y el anticuerpo monoclonal ACT-1 utilizando métodos descritos previamente (Mackay, C.R. y col., Eur. J. Immunol., 19: 1477-1483 (1989)). Como se alcanzaron concentraciones saturantes en suero de ACT-1 con el protocolo de infusión, se pudo usar ACT-1 exógenamente administrado en el suero para enumerar el número de linfocitos \alpha4\beta7+ en la sangre. Resumiendo, se analizó la sangre entera de cada animal en cada recogida de sangre por dilución de 100 \mul de sangre anticoagulada con EDTA con PBS/suero de conejo 10%/suero AB humano 5% durante 20 minutos a 4ºC. Después de separar el suero bloqueante, en el caso de los animales tratados con ACT-1, las células de la sangre fueron directamente incubadas con 100 \mul de IgG de conejo anti-ratón conjugada a fluoresceína (Dako Corporation, Carpinteria, CA) o, en el caso de los animales a los que se dio anticuerpo irrelevante o de las muestras de sangre del pretratamiento, se añadió ACT-1 a la sangre a 10 \mug/ml, seguido luego del anticuerpo secundario. Para cada muestra, se analizó un mínimo de 10.000 células. Los recuentos rutinarios de células sanguíneas y los análisis diferenciales fueron realizados usando un analizador de hematología Baker 5000 y una apertura apropiada para células rojas, células blancas y plaquetas del tití de cabeza de algodón. Por los resultados del análisis de hematología y de citometría de flujo, se calcularon los números absolutos de linfocitos \alpha4\beta7+ por \mul de sangre.

Resultados/progreso Concentraciones séricas

Las concentraciones séricas de ACT-1 y un anticuerpo irrelevante emparejado por isotipo eran ambas, en general, \geq 10 \mug/ml para los primeros 10 días del estudio. Los días 2-10 del estudio, el ACT-1 biotinilado, utilizado en sangre entera a una concentración de 10 \mug/ml, no pudo marcar significativamente los linfocitos periféricos, según se valoró por citometría de flujo en animales tratados con ACT-1, mientras que el día 0 y en animales tratados con un anticuerpo irrelevante, el mismo anticuerpo reconoció entre un 70 y un 90% del conjunto de linfocitos periféricos, de forma similar al perfil de tinción de ACT-1 en linfocitos humanos. De forma colectiva, estos resultados sugerían que el protocolo terapéutico para ACT-1 en TCA con colitis dio lugar a saturación de la integrina \alpha4\beta7 en linfocitos en la circulación periférica.

También se valoró la capacidad de ACT-1 para reconocer células \alpha4\beta7+ extravasculares en la lámina propia de la mucosa del colon de TCA con colitis. Se utilizaron técnicas inmunohistoquímicas para detectar IgG1 murina en biopsias de mucosa del colon de los animales de estudio y el ACT-1 fue observado sobre las membranas celulares de células mononucleares en la lámina propia en todos los puntos temporales de biopsia durante los primeros 10 días del estudio en animales tratados con ACT-1, pero no, según se esperaba, del Día 0 antes de la infusión de anticuerpo. No se observó marcaje de las células de la lámina propia en animales a los que se dio anticuerpo irrelevante. Por lo tanto, el régimen de dosificación utilizado en el estudio dio lugar a concentraciones séricas neutralizantes de ACT-1 y reconocimiento extravascular concomitante y marcaje de células inmunes en la mucosa colítica. El anticuerpo ACT-1 fue localizado en el sitio diana, es decir, los linfocitos de la sangre periférica y, específicamente, en el compartimento extravascular en la mucosa colítica.

Efecto clínico

Los cuatro animales de ensayo mantuvieron todos un grado de 2 ó 3 de actividad inflamatoria colítica tanto en las muestras de biopsia de pretratamiento como en las del Día 0, que estuvieron separadas para 3 animales en 5 días. Además, los cambios en la arquitectura de la mucosa de los cuatro animales demostró que estos cuatro animales tenían colitis de una naturaleza de larga duración. Por lo tanto, todos los animales parecían tener un curso crónico de enfermedad.

Se realizó el análisis histopatológico de biopsias de mucosa del colon. Los resultados de TCA representativos (animales Sgo 326-84 y Sgo 17-85) antes y 5 días después de la inmunoterapia con ACT-1 ilustraron el efecto terapéutico de la inmunoterapia ACT-1 sobre los cambios microscópicos en la mucosa del colon en TCA con colitis. Antes de la inmunoterapia, hubo un exudado purulento dentro del compartimento epitelial y del lumen de las criptas, inmadurez epitelial caracterizada por pérdida de células caliciformes totalmente diferenciadas y la lámina propia estaba expandida por un infiltrado inflamatorio mononuclear y purulento (Sgo 326-84, muscularis mucosae). Después de la inmunoterapia con ACT-1, se localizó ACT-1 en las membranas de las células mononucleares de la lámina propia utilizando técnicas inmunohistoquímicas (Sgo 17-85, muscularis mucosae) y el componente neutrofílico del infiltrado inflamatorio se había resuelto, se observaron células caliciformes totalmente diferenciadas y la lámina propia ya no estaba expandida por células mononucleares y/o neutrófilos (Sgo 326-84).

El efecto clínico de ACT-1 sobre la consistencia de las heces en TCA con colitis fue chocante (Figura 14). Se observó una mejoría de la diarrea a una consistencia de las heces al menos semisólida en todos los animales en las 24 horas posteriores a la primera dosis, mientras que se produjo una completa resolución a heces sólidas en todos los animales hacia las 72 horas. Los animales control no mejoraron se observó que tenían diarrea durante todo el período de estudio, mostrando, además, que los criterios de preselección para este grupo de animales eliminó efectivamente a aquéllos que tenían remisiones espontáneas.

Todos los animales mantuvieron heces sólidas durante aproximadamente 1 semana después de finalizar las inyecciones de anticuerpo (Figura 11). Con respecto a los animales individuales, un animal (Sgo 63-93) tenía heces sólidas desde el Día 4 hasta el final del protocolo el Día 20 (Figura 11). Dos animales (Sgo 129-91 y Sgo 17-85) tuvieron ligeras recaídas a heces semisólidas después del Día 14 en el estudio (Figura 11). El cuarto animal (Sgo 326-84) mostró una mejoría persistente/resolución de la diarrea desde el Día 6 hasta el Día 20.

De forma similar, los infiltrados leucocitarios en el colon estaban marcadamente atenuados en TCA a los que se había dado ACT-1. En comparación con las biopsias del pretratamiento, el análisis histológico de la mucosa del colon (especímenes de biopsia fijados con formalina de la mucosa del colon) de animales tratados con ACT-1 mostraron una mejoría en la actividad inflamatoria y alteraciones estructurales asociadas de la mucosa. Utilizando un sistema de puntuación histológica de la actividad inflamatoria del colon (Madara, J.L. y col., Gastroenterology, 88: 13-19 (1985)), los animales tratados con ACT-1 tenían reducciones marcadas en las puntuaciones de actividad inflamatoria en todos los puntos temporales en comparación con las puntuaciones basales del pretratamiento, mientras que no cambiaron las puntuaciones de animales a los que se dio el anticuerpo control (Figura 15). No hubo cambios en las puntuaciones inflamatorias para el grupo de tratamiento irrelevante el Día 20 (Figura 15). Las puntuaciones brutas medias de actividad inflamatoria en todos los puntos temporales en el grupo tratado con ACT-1 fueron estadísticamente menores que las de los mismos animales el Día 0 (Días 5 y 10, P < 0,05; Día 20, P < 0,01).

Con respecto a los animales individuales, los cuatro animales del ensayo mostraron una mejoría en la actividad inflamatoria durante o después de la inmunoterapia con ACT-1. La colitis en dos animales (Sgo 129-91 y Sgo 17-85) se resolvió por completo el Día 10 (Figura 12). Otro animal (Sgo 63-93) no mostró una completa abrogación de la actividad de la colitis hasta el Día 20 (Figura 12), mientras que las puntuaciones de las biopsias de mucosa del cuarto animal (Sgo 326-84) mostró una mejoría durante todo el período de estudio (Figura 12; dos biopsias el día 20 en Sgo 326-84 fueron puntuadas como 0 y 1). Más aún, el animal 326-84 ganó un 20% de su peso corporal original durante el período de estudio.

Con objeto de disponer de una valoración más cuantitativa de la eficacia, se llevó a cabo un análisis de imagen morfométrico asistido por ordenador de subgrupos de leucocitos en la mucosa del colon de todos los animales del estudio. La Tabla 3 ilustra los resultados de un análisis del efecto de la inmunoterapia ACT-1 sobre la actividad inflamatoria del colon en TCA con colitis crónica (expresados como porcentaje de los valores del pretratamiento). La inmunoterapia con ACT-1 dio lugar a reducciones significativas en las densidades de los leucocitos en la mucosa en comparación con los números basales establecidos antes de la administración del anticuerpo, mientras que el grupo control tenía, en general, números similares o aumentados de leucocitos en la mucosa después de la administración de anticuerpo irrelevante. A los diez días de la primera dosis de anticuerpo ACT-1, hubo aproximadamente un 30% menos de leucocitos mononucleares en la mucosa que expresaran integrinas \beta7 en comparación con los valores del pretratamiento. Esta reducción no fue atribuida a reducciones en los números de linfocitos \alpha4\beta7+ en el conjunto circulatorio periférico (Figura 16), no se relacionó con la manipulación ni con efectos inespecíficos, ya que los números de leucocitos \beta7+ en la mucosa del colon de los animales control o bien aumentaron o bien permanecieron en gran medida inalterados. De forma similar, las células T de la mucosa quedaron reducidas en aproximadamente un 50% el día 5 y en aproximadamente un 25% hacia el día 10 en animales tratados con ACT-1, mientras que las células T de la mucosa en el grupo del anticuerpo irrelevante en los mismos puntos temporales no cambiaron. Se observaron reducciones comparables en las células B de la mucosa en el grupo tratado con ACT-1, pero no en el grupo control. Es interesante el hecho de que la inmunoterapia con ACT-1 redujera también la densidad de los leucocitos de la mucosa que tienen poca o que no tienen expresión de \alpha4\beta7. Los neutrófilos se redujeron en un 40-45% los días 10 y 20 en animales tratados con ACT-1; sin embargo, no se observaron reducciones en los PMN en el grupo control. De forma similar, los macrófagos de la mucosa se redujeron en todas las muestras de biopsia de post-tratamiento en un 30-45% en los animales a los que se dio ACT-1, mientras que los macrófagos no cambiaron en el grupo control. Es interesante que, utilizando inmunohistoquímica y un anticuerpo monoclonal de reacción cruzada específico para MAdCAM humana clonada (10G3, Ejemplo 2), no se observó ningún cambio en la expresión en TCA con colitis tratados con anticuerpo ACT-1 o control.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

No se observó ninguna toxicidad evidente en los animales de estudio que pudiera ser atribuida a la administración de ACT-1. Ninguno de los animales de estudio mostró cambios en las valoraciones de la química clínica de las funciones hepática y renal (datos no mostrados). El anticuerpo ACT-1 es un reactivo monoclonal no lítico (Lazarovits, A.I. y col., J. Immunol., 133: 1857-1862 (1984)) y no se observó leucopenia en ningún animal durante el estudio. De hecho, hubo una tendencia a la neutrofilia (números pico en sangre periférica próximos a 40 x 10^{3}/\mul; el rango normal en TCA es de 1,4-12,0 x 10^{3}/\mul) en todos los animales de estudio, incluidos los animales control, durante la primera semana del estudio, cuando se utilizó anestesia/manipulación diarias para administrar los anticuerpos. También hubo una tendencia a linfocitosis en los animales a los que se dio ACT-1, con números absolutos de linfocitos en sangre periférica próximos a 18 x 10^{3}/\mul (el rango normal en TCA es de 0,6-5,7 x 10^{3}/\mul). Por lo tanto, una reducción del reclutamiento de cualquier tipo celular de linfocitos al colon en el grupo tratado con ACT-1 no podía ser atribuido a cambios en el número de leucocitos en el conjunto circulatorio periférico.

Resumen

Cuando se administra a titís de cabeza algodonosa con colitis crónica, un anticuerpo monoclonal para la integrina \alpha4\beta7 resolvió rápidamente la diarrea y la actividad inflamatoria del colon, lo que indica eficacia en mejorar la colitis. Parecía haber una buena correlación entre las puntuaciones de la actividad inflamatoria histológica y la consistencia de las heces. La observación de que la consistencia de las heces mejoró, en general, en 1-2 días en los animales que recibieron anticuerpo ACT-1 es digna de señalar. Más aún, la densidad relativa de subgrupos de leucocitos en la mucosa quedó grandemente atenuada en respuesta a la inmunoterapia con anticuerpos anti-\alpha4\beta7. Estos resultados también manifiestan una terapia eficaz para un proceso inflamatorio que puede ser específico de órgano o de tejido (específico de mucosas).

El efecto terapéutico de ACT-1 en TCA con colitis puede estar mediado por la inhibición del reclutamiento de linfocitos al intestino. Alternativamente, o además, el efecto terapéutico observado puede reflejar alteraciones en otras interacciones celulares o sucesos de señalización mediados por la integrina \alpha4\beta7. Estos resultados indican que el anticuerpo ACT-1 es un antagonista efectivo de la función de la integrina \alpha4\beta7 y que la inhibición de la función de la integrina \alpha4\beta7 puede ser una modalidad de tratamiento específico de órgano o de tejido en el manejo clínico de individuos con enfermedad inflamatoria del intestino. Además, los resultados indican una función para la integrina \alpha4\beta7 en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria del intestino. La integrina \alpha4\beta7 proporciona una diana terapéutica potencial específica de órgano para la enfermedad inflamatoria del intestino.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: LeukoSite, Inc.

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(B): CALLE: 215 First Street

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(C): CIUDAD: Cambridge

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(D): ESTADO/PROVINCIA: Massachusetts

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02142

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(G): TELÉFONO: (617) 621-9350

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(I): TELEFAX: (617) 621-9349

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(i): SOLICITANTE/INVENTOR:

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(A): NOMBRE: Michael J. Briskin

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(B): CALLE: 28 Harbell Street

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(C): CIUDAD: Lexington

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(D): ESTADO/PROVINCIA: Massachusetts

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02173

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(i): SOLICITANTE/INVENTOR:

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(A): NOMBRE: Douglas J. Ringler

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(B): CALLE: 382 Ocean Avenue, #1008

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(C): CIUDAD: Revere

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(D): ESTADO/PROVINCIA: Massachusetts

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02151

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(i): SOLICITANTE/INVENTOR:

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(A): NOMBRE: Dominic Picarella

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(B): CALLE: 2 North Bennet Court, #4

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(C): CIUDAD: Boston

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(D): ESTADO/PROVINCIA: Massachusetts

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02113

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(i): SOLICITANTE/INVENTOR:

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(A): NOMBRE: Walter Newman

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(B): CALLE: 3 Durham Street, #3

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(C): CIUDAD: Boston

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(D): ESTADO/PROVINCIA: Massachusetts

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02115

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Adresinas vasculares de mucosa y sus usos

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

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(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.

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(B): CALLE: Two Militia Drive

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(C): CIUDAD: Lexington

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(D): ESTADO: Massachusetts

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): ZIP: 02173-4799

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(v): FORMA LEÍBLE DEL ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flotante

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30.

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE SOLICITUD:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/523.004

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(B): FECHA DE SOLICITUD: 01-SEP-1995

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/386.857

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(B): FECHA DE SOLICITUD: 10-FEB-1995

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(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Brook, David E.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 22.592

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: LKS94-04A2 PCT

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: 617-861-6240

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(B): TELEFAX: 617-861-9540

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1624 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..1218

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

100

101

102

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 406 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 2:

103

105

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1539 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..1146

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 3:

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106

107

108

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 382 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 4:

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109

110

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1721 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 4..1038

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 5:

111

112

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 345 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 6:

113

114

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 18 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 7:

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\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTACTGCC AGGCCACG

\hfill

18

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 19 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

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\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCTGGGAG ATCTCAGGG

\hfill

19

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 9:

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\hskip-.1em\dddseqskip

GCCACGATGA GGCTGCCTGG

\hfill

20

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 10:

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\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGAGCCTG GGCTCCTGGG

\hfill

20

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 32 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº: 11:

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\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGCTTCC ACCATGGATT TCGGACTGGC CC

\hfill

32

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 26 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº:12:

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\hskip-.1em\dddseqskip

CCGACTAGTG TCGGGCTGTG CAGGAC

\hfill

26

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 27 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID Nº:13:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACTAGTGG TTTGGACGAG CCTGTTG

\hfill

27

Claims

1. Ácido nucleico aislado que codifica

(a): una MAdCAM de primate de producción natural seleccionada del grupo que consta de la proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:2), la proteína mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO:4) o la Figura 3 (SEC ID NO:6) y la forma madura de cualquiera de las anteriores; o

(c): un fragmento funcional de una MAdCAM de primate de producción natural que se une a la integrina \alpha4\beta7 y consta de al menos un dominio de tipo inmunoglobulina,

en el que la secuencia del aminoácido de dicha variante funcional comparte al menos un 75% de semejanza con la secuencia de una proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:2), la Figura 2 (SEC ID NO:4) o la Figura 3 (SEC ID NO:6) y la semejanza de la secuencia del aminoácido se determina mediante el método de Clustal con la tabla de pesos de residuos pesados PAM250, empleando una penalización de hueco de 10 y una penalización de longitud de hueco de 10 y parámetros de alineación por parejas de "ktuple" = 1, penalización de hueco = 3, ventana = 4 y diagonales salvadas = 5).

2. Ácido nucleico aislado de la Reivindicación 1, en el que el ácido nucleico aislado es recombinante y/o esencialmente puro.

3. Ácido nucleico aislado de la Reivindicación 1 o 2, en el que

(a): dicho ácido nucleico se hibrida en condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico, presentando dicho segundo ácido nucleico una secuencia nucleotídica según se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1), en la Figura 2 (SEC ID Nº: 3) o en la Figura 3 (SEC ID Nº: 5) o una secuencia que constituye el complemento del marco de lectura abierta de cualquiera de las anteriores.

(b): dicho ácido nucleico codifica el polipéptido mostrado en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), el polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEC ID Nº: 4), el polipéptido mostrado en la Figura 3 (SEC ID Nº: 6) o las correspondientes proteínas maduras.

4. Ácido nucleico aislado de la Reivindicación 3, que tiene una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo compuesto por una secuencia nucleotídica según se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1), una secuencia nucleotídica según se muestra en la Figura 2 (SEC ID Nº: 3), una secuencia nucleotídica según se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº: 5) y una porción de cualquiera de las anteriores que incluya la secuencia codificante.

5. Constructo de ácido nucleico recombinante que consta de un ácido nucleico de la Reivindicación 1.

6. Constructo de ácido nucleico recombinante de la Reivindicación 5

(a): en que el ácido nucleico recombinante está operablemente unido a una secuencia de control de la expresión; o

(b): consta de un ácido nucleico, en que dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), en la Figura 2 (SEC ID Nº: 4) o en la Figura 3 (SEC ID Nº: 6); o

(c): dicho ácido nucleico se hibrida en condiciones estrictas con un segundo ácido nucleico, presentando dicho segundo ácido nucleico una secuencia de nucleótidos según se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1) en la Figura 2 (SEC ID Nº: 3) o en la Figura 3 (SEC ID Nº: 5) o una secuencia que constituye el complemento del marco de lectura abierta de cualquiera de las anteriores.

7. Proteína aislada que tiene la secuencia de aminoácidos de:

(a): Una MAdCAM de primate natural seleccionada del grupo compuesto por la proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), la proteína mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 4), la proteína mostrada en la Figura 3 (SEC ID Nº: 6) y la forma madura correspondiente de cualquiera de las anteriores.

8. Proteína aislada de la Reivindicación 7, en el que:

(a): la MAdCAM de primate es una MAdCAM humana, codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones estrictas a un segundo ácido nucleico, presentando dicho segundo ácido nucleico una secuencia de nucleótidos según se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1), la Figura 2 (SEC ID Nº: 3), la Figura 3 (SEC ID Nº: 5) o una secuencia que constituye el complemento del marco de lectura abierta de cualquiera de las anteriores.

(b): La MAdCAM de primate es una MAdCAM humana según se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2) la Figura 2 (SEC ID Nº: 4) o la correspondiente proteína madura de cualquiera de las anteriores; o

(c): La MAdCAM de primate es una MAdCAM de macaco, según se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº: 6) o la correspondiente proteína madura.

9. MAdCAM de primate aislada natural que tiene una o más funciones seleccionadas entre el grupo compuesto por la unión a la integrina \alpha4\beta7 y la mediación en la adhesión celular.

10. MAdCAM de primate aislada natural de la Reivindicación 9, en la que la adhesión celular es dependiente de la integrina \alpha4\beta7.

11. MAdCAM de primate aislada de la Reivindicación 9 o 10, en la que dicha unión es selectiva para \alpha4\beta7.

12. Célula huésped compuesta por un ácido nucleico recombinante que codifica:

13. Célula huésped de la Reivindicación 12, en la que el ácido nucleico está operablemente unido a una secuencia de control de la expresión, mediante lo cual se expresa una MAdCAM de primate de producción natural o dicha variante funcional que se une a la integrina \alpha4\beta7 o dicha variante funcional de una MAdCAM de primate natural que se une a la integrina \alpha4\beta7, cuando la célula huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión.

14. Proteína de fusión compuesta por:

(a): Una MAdCAM de primate natural seleccionada del grupo compuesto por la proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), la proteína mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 4), la proteína mostrada en la Figura 3 (SEC ID Nº: 6) y la forma madura correspondiente de cualquiera de las anteriores; o

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15. Proteína de fusión de la Reivindicación 14, compuesta por un primer resto y un segundo resto, en la que dicho primer resto tiene la secuencia de aminoácido de una MAdCAM de primate de producción natural o dicha variante funcional de la misma o dicho fragmento funcional y dicho segundo resto constituye al menos una porción de una cadena de ínmunoglobulina o variante de la misma.

16. Proteína de fusión de la Reivindicación 15, en la que

(a): dicho primer resto está unido en su extremo C-terminal al extremo N-terminal del segundo resto; o

(b): el primer resto se selecciona del grupo compuesto por un fragmento funcional de MAdCAM humana que contiene todo el dominio extracelular y un fragmento funcional de MAdCAM humana que contiene dos dominios de inmunoglobulina N; o

(c): el segundo resto es al menos una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina o variante funcional de la misma.

17. Proteína de fusión de la Reivindicación 16, en la que cadena pesada de inmunoglobulina es de la clase IgG y/o el segundo resto contiene dominios de bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de inmunoglobulina.

18. Inmunoglobulina híbrida compuesta por una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 17.

19. Inmunoglobulina híbrida de acuerdo con la Reivindicación 18, en la que dicha inmunoglobulina híbrida es un homodímero.

20. Constructo de ácido nucleico recombinante compuesto por un ácido nucleico que contiene una secuencia codificante que codifica una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 17, en el que la secuencia codificante está eventualmente unida de manera operativa a una secuencia de control de la expresión.

21. Método de elaboración de una proteína de acuerdo con al Reivindicación 7 que consta de mantener un ácido nucleico recombinante que codifica dicha proteína en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico, mediante el cual se produce dicha proteína.

22. Método tal y como se reivindica en la Reivindicación 21 que consta además de:

(a): introducir en una célula huésped un constructo de ácido nucleico consistente en un ácido nucleico que codifica una MAdCAM de primate, mediante lo cual se produce una célula huésped recombinante que tiene dicha secuencia codificante operablemente unida a por lo menos una secuencia de control de la expresión y

(b): mantener las células huésped producidas en la etapa (a) en un medio adecuado en condiciones en las cuales se expresa el ácido nucleico.

23. Método de la Reivindicación 21 o 22, que además consta de la etapa de aislamiento de dicha proteína.

24. Anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo que se une a una MAdCAM de primate de producción natural, una variante funcional de una MAdCAM de primate de producción natural que se une a la integrina \alpha4\beta7 y/o un fragmento funcional de una MAdCAM de primate de producción natural que se une a la integrina \alpha4\beta7 y consta de al menos un dominio de tipo inmunoglobulina, tal y como se define en la reivindicación 7.

25. Anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo de la Reivindicación 24 para su uso en la terapia o diagnosis.

26. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo de la Reivindicación 24 para elaborar un medicamento para tratar una enfermedad de entre el grupo que consta de la pancreatitis, la diabetes mellitus insulinodependiente, la mastitis, la colecistitis, la colangitis o la pericolangitis, la bronquitis crónica, la sinusitis crónica, el asma y la enfermedad del injerto contra el huésped.

27. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo de la Reivindicación 24 para elaborar un medicamento para tratar los procesos inflamatorios del colon.

28. Anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo de acuerdo con la Reivindicación 24 o 25 o el uso reivindicado en la Reivindicación 27 en el que:

(a): dicho anticuerpo o fragmento del mismo de unión con antígeno puede inhibir una o más funciones de entre la función molecular de adhesión celular de una MAdCAM de primate de producción natural; o

(b): dicho anticuerpo puede inhibir selectivamente la adhesión dependiente de \alpha4\beta7

(c): dicho anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo puede inhibir la unión de una MAdCAM de primate de producción natural a una integrina \alpha4\beta7.

29. Anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo de acuerdo con la Reivindicación 24 o 25 o 28 o el uso reivindicado en la Reivindicación 27 o 28 en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de unión a antígeno.

30. Anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo de acuerdo con la Reivindicación 24 o 25, 28 o 29 o el uso reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 27 a 29 en el que dicha MAdCAM de primate de producción natural es una MAdCAM humana de producción natural.

31. Uso de una MAdCAM de primate, una variante funcional de la misma que se une a la integrina \alpha4\beta7 o una inmunoglobulina híbrida que consta de una MAdCAM de primate o variante de unión a integrina \alpha4\beta7 de la misma, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad de entre el grupo que consta de la pancreatitis, diabetes mellitus insulinodependiente, la mastitis, la colecistitis, la colangitis o la pericolangitis, la bronquitis crónica, la sinusitis crónica, el asma y la enfermedad del injerto contra el huésped,

en el que dicha MAdCAM de primate natural es una proteína con la secuencia de aminoácido de una MadCAm de primate de producción natural seleccionada de entre el grupo compuesto por la proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), la proteína mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 4), la proteína mostrada en la Figura 3 (SEC ID Nº: 6) y la forma madura correspondiente de cualquiera de las anteriores, o un fragmento funcional de la misma que se une a la integrina \alpha4\beta7, compuesto dicho fragmento funcional de al menos un dominio de tipo inmunoglobulina, y

en que la secuencia del aminoácido de dicha variante funcional comparte al menos un 75% de semejanza con la secuencia de una proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:2), la Figura 2 (SEC ID NO:4) o la Figura 3 (SEC ID NO:6) y la semejanza de la secuencia del aminoácido se determina mediante el método de Clustal con la tabla de pesos de residuos pesados PAM250, empleando una penalización de hueco de 10 y una penalización de longitud de hueco de 10 y parámetros de alineación por parejas de "ktuple" = 1, penalización de hueco = 3, ventana = 4 y diagonales salvadas = 5).

32. Uso de una MAdCAM de primate, una variante funcional de la misma que se une a la integrina \alpha4\beta7 o una inmunoglobulina híbrida que consta de una MAdCAM de primate o variante de unión a integrina \alpha4\beta7 de la misma, para la fabricación de un medicamento para tratar procesos inflamatorios del colon,

33. Uso de acuerdo con la Reivindicación 32 en el que:

(a): la MAdCAM de primate, su variante funcional o la inmunoglobulina híbrida puede inhibir la interacción de una MAdCAM de primate con una integrina \alpha4\beta7, o

(b): dicha inmunoglobulina híbrida contiene una proteína de fusión, compuesta por un primer resto y un segundo resto, en la que dicho primer resto es una MAdCAM de primate y dicho segundo resto constituye al menos una porción de una cadena de ínmunoglobulina.

34. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno que une la cadena \beta7 de una integrina \alpha4\beta7 e inhibe la unión de la MAdCAM de primate a una integrina \alpha4\beta7 para elaborar un medicamento para tratar una enfermedad de entre el grupo que consta de la pancreatitis, la diabetes mellitus insulinodependiente, la mastitis, la colecistitis, la colangitis o la pericolangitis, la bronquitis crónica, la sinusitis crónica, el asma y la enfermedad del injerto contra el huésped,

en el que dicha MAdCAM de primate es (a) una MadCAM de primate de producción natural seleccionada del grupo que consta de la proteína mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:2), la proteína mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO:4) o la Figura 3 (SEC ID NO:6) y la forma madura de cualquiera de las anteriores; o

(b) una variante funcional de la misma que se une a la integrina \alpha4\beta7 y

35. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno que une la cadena \beta7 de una integrina \alpha4\beta7 e inhibe la unión de la MAdCAM de primate a una integrina \alpha4\beta7 para elaborar un medicamento para tratar los procesos inflamatorios del colon.

36. Uso de acuerdo con la Reivindicación 35 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno inhibe la adhesión de leucocitos que expresan una integrina que contiene la cadena \beta7 y el endotelio que expresa MAdCAM.

37. Uso de acuerdo con la Reivindicación 35 o 36 en el que:

(a): se utiliza más de un anticuerpo o fragmento del mismo de unión de antígeno que inhibe la unión de leucocitos a la MAdCAM endotelial, o

(b): se utiliza más de un anticuerpo o fragmento del mismo de unión de antígeno que inhibe la unión de leucocitos a ligandos endoteliales y al menos un anticuerpo o fragmento inhibe la unión de leucocitos a un ligando endotelial distinto de la MAdCAM.

38. Uso de acuerdo con la Reivindicación 35 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión de antígeno que inhibe la unión de leucocitos a la MAdCAM endotelial.

39. Uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 27-30 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo de unión de antígeno se selecciona del grupo compuesto por un anticuerpo quimérico, un fragmento quimérico de unión de antígeno, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humanizado de unión de antígeno.

40. Uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 27-30 en el que la enfermedad es colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, enteropatía asociada con artropatías seronegativas, colitis microscópica o colágena, gastroenteritis eosinofílica o bursitis.

41. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo que se une a la integrina \alpha4\beta7 para elaborar un medicamento para tratar una enfermedad seleccionada de entre el grupo que consta de la pancreatitis, la diabetes mellitus insulinodependiente, la mastitis, la colecistitis, la colangitis o la pericolangitis, la bronquitis crónica, la sinusitis crónica, el asma y la enfermedad del injerto contra el huésped, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo tiene la especificidad epitópica del anticuerpo monoclonal ACT-1.

42. Uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 26, 31, 34 y 41, en el que dicha enfermedad es pancreatitis o diabetes mellitus insulinodependiente.

43. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo con antígeno que se une a la integrina \alpha4\beta7 para elaborar un medicamento para tratar los procesos inflamatorios de colon en los humanos, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo tiene la especificidad epitópica del anticuerpo monoclonal ACT-1.

44. Uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 35-38 y 43 en el que dicho proceso inflamatorio de colon se selecciona del grupo compuesto por colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, enteropatía asociada con artropatías seronegativas, colitis microscópica o colágena, gastroenteritis eosinofílica o bursitis.

45. Uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 35-38, 43 y 44 en el que un anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno se selecciona del grupo compuesto por un anticuerpo quimérico, un fragmento quimérico de unión de antígeno, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humanizado de unión a antígeno.

46. Uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 35-38, 43 y 44 en el que un anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de unión a antígeno.

47. Método de detección de una MAdCAM de primate seleccionada en una muestra, que consta de:

a): poner en contacto la muestra con un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno según la Reivindicación 24 en condiciones adecuadas para la unión específica de dicho anticuerpo o fragmento y

b): detectar la formación de un complejo entre dicho anticuerpo o fragmento y la MAdCAM.

48. Método de detección o identificación de un ligando o un agente que se une a una MAdCAM de primate que consta de combinar un agente que ha de ser estudiado con la proteína aislada de la Reivindicación 7 o la célula huésped de la reivindicación 12 en condiciones adecuadas para la unión de ligando a la misma y detectar o medir la formación de un complejo entre dicho agente y dicha proteína.

49. Método de detección de un inhibidor de la unión de MAdCAM de primate de producción natural a un ligando de la misma compuesto por:

a): combinar un agente que ha de ser estudiado con un ligando de MAdCAM de primate y una composición compuesta por una proteína aislada de la Reivindicación 7 o la célula huésped de la reivindicación 12 en condiciones adecuadas para la unión de ligando a la misma y

b): detectar o medir la unión entre dicha proteína aislada o célula huésped mediante lo cual una reducción de la unión en comparación con un control adecuado indica que el agente es un inhibidor.

50. Método de detección de un inhibidor de la unión de MAdCAM de primate de producción natural a un ligando de la misma compuesto por:

a): combinar un agente que ha de ser estudiado con un ligando de MAdCAM de primate y una inmunoglobulina híbrida de la Reivindicación 18 o 19 o una proteína de fusión de cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 17, en condiciones adecuadas para la unión del ligando a una MAdCAM de primate de producción natural

b): detectar o medir la unión entre dicha inmunoglobulina híbrida o proteína de fusión mediante lo cual una reducción de la unión en comparación con un control adecuado indica que el agente es un inhibidor.

51. Método de acuerdo con la Reivindicación 50, en el que dicho ligando es una integrina \alpha4\beta7 y el agente para estudiar es una célula que expresa una integrina \alpha4\beta7 y en el que se combina una inmunoglobulina híbrida de la reivindicación 18 o una proteína de fusión de la reivindicación 14 o 15.

52. Método de detección de un inhibidor de la adhesión celular mediada por MAdCAM, que consta de:

a): combinar un agente que ha de ser estudiado, una célula huésped de la Reivindicación 12 y una segunda célula portadora de una integrina \alpha4\beta7 en condiciones adecuadas para la adhesión de dicha célula huésped a dicha segunda célula y

b): detectar o medir la adhesión entre dicha célula huésped y la segunda célula, mediante lo cual una menor adhesión en comparación con un control adecuado indica que el agente es un inhibidor.

53. Método según cualquiera de las Reivindicaciones 48 a 52, en el que el agente es un anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno.

54. Ácido nucleico aislado de la Reivindicación 4, en el que el ácido nucleico está operablemente unido a una secuencia de control de la expresión.

55. Uso de cualquiera de las Reivindicaciones 26, 31, 34 y 41, en el que la enfermedad es mastitis.

56. Uso de cualquiera de las Reivindicaciones 26, 31, 34 y 41, en el que la enfermedad es la colecistitis, la colangitis o la pericolangitis.

57. Uso de cualquiera de las Reivindicaciones 26, 31, 34 y 41, en el que la enfermedad es la bronquitis crónica, la sinusitis crónica o el asma.

58. Uso de cualquiera de las Reivindicaciones 26, 31, 34 y 41, en el que la enfermedad es la enfermedad del injerto contra el huésped.

59. Uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 26, 34 y 41, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo de unión a antígeno se selecciona del grupo compuesto por un anticuerpo quimérico, un fragmento quimérico de unión de antígeno, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humanizado de unión de antígeno.