PT808367E

PT808367E - Adressinas vasculares da mucosa e suas utilizações

Info

Publication number: PT808367E
Application number: PT96906504T
Authority: PT
Inventors: Douglas J Ringler; Walter Newman; Michael J Briskin; Dominic Picarella
Original assignee: Millennium Pharm Inc
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 2007-10-22
Also published as: DE69637155T2; WO1996024673A1; DK0808367T3; JP4205162B2; AU4986296A; JPH10513365A; ES2290955T3; CA2212702A1; EP0808367A1; CA2212702C; MX9706049A; DE69637155D1; EP0808367B1; ATE366809T1; NZ303523A

Description

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Descrição "ADRESSINAS VASCULARES DA MUCOSA E SUAS UTILIZAÇÕES"

Dados anteriores à invenção A orientação dos linfócitos da circulação para os tecidos linfóides e a migração para locais de inflamação é regulada pela interacção com receptores expressos em vénulas pós-capilares, incluindo vénulas endoteliais elevadas (HEV) encontradas nos tecidos linfóides secundários (por exemplo, nódulos linfáticos mesentéricos, Peyer's Patches (PP)) (Bevilacqua, M.P., Ann. Ver. Immunol., 11: 767-804 (1993); Butcher; E.C., Cell, 67:1033-1036 (1991); Picker, L.J., et al., Annu. Rev. Immunol., 10: 561-591 (1992); and Springer, T.A., Cell, 76:301-314 (1994)). Estas interacções são de natureza especificas em relação aos tecidos. A inflamação (por exemplo, inflamação crónica) é caracterizada pela infiltração no tecido afectado de leucócitos, como os linfócitos, linfoblastos e fagócitos mononucleares. A impressionante selectividade pela qual os leucócitos migram preferencialmente para vários tecidos quer durante a circulação normal quer durante uma inflamação resulta de uma série de ocorrências adesivas e de activação que envolvem múltiplas interacções receptor- ligando tal como foi proposto por Butcher e outros (Butcher, E.C., Cell, 67: 1033-1036 (1991); vonAdrian, U.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 7538 (1991); Mayadas, T.N., et al., Cell, 74: 541 (1993); Springer, T.A., Cell, 76: 301 (1994)). Num passo inicial, há uma interacção transitória e rotativa entre os 2 leucócitos e o endotélio que resulta da interacção de selectinas (e por vezes de integrinas a-4) com os seus ligandos de hidratos de carbono. Esta interacção que é caracterizada pela rotação na direcção do fluxo pode ser determinada por métodos conhecidos (Lawrence, M.B. and T.A. Springer, Cell, 65: 859 (1991); WO 92/21746, Springer et al., (Dezembro 10, 1992)). Isto segue-se de ocorrências de activação mediadas por agentes de quimioatracção como quimioquinas e seus receptores, que causam a activação da adesividade da integrina e influenciam a direcção da migração dos leucócitos através das paredes vasculares. Estes sinais secundários, por sua vez, despoletam a firme adesão dos leucócitos ao endotélio via integrinas dos leucócitos e dos seus ligandos endoteliais (receptores tipo IG e ECM) e a subsequente migração transendotelial da circulação através do endotélio vascular.

Em tecidos linfóides secundários, como Peyer Patch (PP) e nódulos linfáticos (por exemplo, nódulos linfáticos periféricos (PLN)), a orientação e deslocamento dos leucócitos é regulada pelas interacções dos receptores de orientação da superfície dos leucócitos com as células endoteliais ao longo das vénulas pós-capilares, nomeadamente vénulas endoteliais elevadas (HEV) (Gowans, J.L. and E.J. Knight, Proc. R. Soc. Lond., 159: 257 (1964)). Os receptores chamados adressinas vasculares, que estão presentes na superfície celular endotelial regulam a migração e subsequente extravasamento dos subconjuntos de linfócitos. As adressinas vasculares mostram padrões de expressão restritos e esta expressão específica dos tecidos tem uma contribuição importante para a especificidade do movimento dos leucócitos 3 (Picker, L.J. and E.C. Butcher, Ãnnu. Rev. Immunol., 10: 561-591 (1992); Berg, E.L., et al., Cellular and molecular mechanisms of inflammation, 2: 111 (1991); Butcher, E.C., Cell, 67: 1033-1036 (1991)). A adressina vascular da mucosa MAdCAM-1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1) é um receptor de adesão da superfamília das imunoglobulinas para linfócitos, que é diferente de VCAM-1 e ICAM-1. A MAdCAM-1 foi identificada no rato como uma glicoproteina de 60 kd que é expressa de forma selectiva nos locais de extravasamento de linfócitos. Em particular, a expressão de MAdCAM-1 foi registada em células endoteliais vasculares de tecidos de mucosa, incluindo tecidos associados ao intestino ou órgãos linfóides, como Peyer's Patch e vénulas da lamina própria dos intestinos delgado e grosso e da glândula mamária lactante mas não em nódulos linfáticos periféricos. A MAdCAM-1 está envolvida na ligação de linfócitos aos Peyer's Patch (Streeter, P.R., et al., Nature, 331: 41-46 (1988); Nakache, M., et al ., Nature, 337: 179-181 (1989); Picker, L.J., et al., Annu. Rev. Immunol., 10: 561-591 (1992); Briskin, M.J., et al., Nature, 363: 461 (1993); Berg, E.L., et al., Nature, 366: 695-698 (1993); Berlin, C., et al., Cell, 74: 185-195 (1993)). A MAdCAM-1 pode ser induzida in vitro por estímulos pró-inflamatórios (Sikorski, E. E., et al., J. Immunol., 151: 5239-5250 (1993)) . A MAdCAM-1 liga-se especificamente à integrina α4β7 dos linfócitos (também referida como LPAM-1 (rato), α4βρ (rato)) que é um receptor de orientação de linfócitos envolvido na orientação para os Peyer's patch (Berlin, C., et al., Cell, 80: 413-422 (1994); Berlin , C., et al., Cell, 74: 185-195 4 (1993) ; e Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994) . Ao contrário do VACM-1 e da fibronectina, que interagem com α4β1 e α4β7 (Berlin, C., et al., Cell, 74: 185-195 (1993); Strauch, U.S., et al., Int. Immunol., 6: 263 (1994)), a MAdCAM-1 é um receptor selectivo para ο α4β7. A doença inflamatória dos intestinos (IBD), como a colite ulcerosa e a doença de Crohn, por exemplo, pode ser uma doença progressiva e debilitante que envolve a inflamação do trato gastrointestinal. Estima-se que afecta um milhão de pessoas apenas nos Estados Unidos e os sintomas incluem dores abdominais, cãibras, diarreia e hemorragias rectais. Os tratamentos da IBD têm incluído drogas anti-inflamatórias (como os corticosteróides e a sulfasalazina), drogas imunossupressoras (como a 6-mercaptopurina, ciclosporina e azatioprina) e cirurgia (como a colectomia). Podolsky, New Engl. J. Med., 325: 928-937 (1991) e Podolsky, New Engl. J. Med., 325: 1008-1016 (1991) .

Alguns estudos sugeriram que a molécula de adesão celular, ICAM-1, medeia o recrutamento de leucócitos para locais inflamatórios através de ligandos da superfície dos leucócitos, isto é, Mac-lou LFA-1 (Springer, Nature, 346: 425- 434 (1990)). Para além disso, tem-se referido que a molécula-1 de adesão celular vascular (VCAM-1), que reconhece a integrina α4β1 (VLA-4) desempenha um papel no recrutamento de leucócitos in vivo (Silber et al., J. Clin. Invest. 93: 1554-1563 (1994) ) . Foi proposto que a IBD pode ser tratada bloqueando a interacção de ICAM-1 com LFA-1 ou Mac-1 ou de VCAM-1 com α4β1 (por exemplo, WO 93/15764). No entanto, estes alvos terapêuticos estão provavelmente envolvidos nos 5 processos inflamatórios em múltiplos órgãos, e um bloqueio funcional pode causar uma disfunção imune sistémica.

Contrariamente ao VCAM-1 e ICAM-1, a MAdCAM é preferencialmente expressa no tracto gastrointestinal, liga-se à integrina α4β7 encontrada nos linfócitos e participa na orientação destas células para locais em mucosas, como os Peyer's patch nas paredes intestinais (Hamann et al., Journal of Immunology, 152: 3282-3293 (1994)). A utilização de inibidores da ligação de MAdCAM ao receptor α4β7, no tratamento de doenças como a IBD não foi sugerida. Mais ainda, apesar de se terem identificado dos genes e proteínas a4 e β7 humanos (Yuan et al., Int. Irmunol., 2: 1097-1108 (1990) ; Erle et al., J . Biol. Chem., 266: 11009-11016 (1991) ; Bevilacqua, M.P., Annu. Rev. Immunol., 11: 767-804 (1993); Springer, T.A., Cell, 76: 301-314 (1994)), não se clonou nem caracterizou a MAdCAM-1 de seres humanos ou primatas. A WO 94/13312 direcciona-se para o fornecimento de ácidos nucleicos e proteínas purificados de mamíferos que codifiquem adressinas da mucosa. As proteínas, ácidos nucleicos e seus fragmentos servem uma variedade de fins na modulação de interacções de orientação nos tecidos da mucosa com leucócitos. Para além disso, os fragmentos de proteínas podem servir de antigénios para produzir anticorpos específicos para determinados domínios da adressina da mucosa, enquanto que os ácidos nucleicos podem ser usados como sondas, para preparação antisense para introdução nos hospedeiros que podem ser alogénicos ou xenogenéicos em relação à fonte de ADN, para a expressão da proteína e outras que tais. 6

Sumário da Invenção

Num aspecto da invenção diz respeito a um ácido nucleico isolado que codifica a) uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente, ou b) uma sua variante funcional que se liga à integrina α4β7; ou c) um fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 e compreende pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

Noutro aspecto, a invenção diz respeito a uma proteína isolada que tem a sequência de aminoácidos de a) uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente, ou b) uma sua variante funcional que se liga à integrina α4β7; ou c) um fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 e compreende pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, em que a sequência de aminoácidos da referida variante 7 funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

Num outro aspecto, a invenção diz respeito a uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente isolado com uma ou mais funções seleccionado do grupo que consiste na ligação à integrina α4β7 e mediação da adesão celular.

Num outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para produzir uma proteína da invenção que compreende a manutenção de uma célula hospedeira que contém ácido nucleico recombinante que codifica a referida proteína em condições apropriadas para a expressão do ácido nucleico em que a referida proteína é produzida.

Num outro aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo ou fragmento de ligação a um antigénio seu que se liga a uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente.

Num outro aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo ou fragmento de ligação a um antigénio da invenção para ser usado em terapia ou diagnóstico. 8

Num outro aspecto, a invenção diz respeito à utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação a um antigénio da invenção para a produção de um medicamento.

Num outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para detectar uma MAdCAM de primata seleccionada numa amostra que compreende: a) fazer contactar uma amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação a um antigénio seu que se liga a uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente em condições para a ligação especifica ao referido anticorpo ou fragmento; e b) detectar a formação de um complexo entre o referido anticorpo ou fragmento e o MAdCAM.

Num outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para detectar ou identificar um ligando ou um agente que se ligue a uma MAdCAM de primata que compreende a combinação de um agente a ser testado com uma proteína isolada da invenção em condições apropriadas para a ligação ao ligando, e a detecção ou medição da formação de um complexo entre o referido agente e a referida proteína.

Num outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para detectar um inibidor de ligação de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente a um seu ligando que compreende a: a) combinação de um agente a ser testado com um ligando da referida MAdCAM de primata e uma composição que contém MAdCAM de primata isolado e/ou recombinante 9 da invenção em condições apropriadas para a ligação do seu ligando; e b) detecção ou medição da ligação entre a MAdCAM de primata e o ligando, em que a diminuição da ligação em comparação com um controlo adequado indica que o agente é um inibidor. A presente invenção diz respeito a proteínas ou polipeptídeos, aqui referidos como MAdCAMs de primata isolados e/ou recombinantes (por exemplo, essencialmente puros). Numa forma de realização, a MAdCAM de primata pode-se ligar selectivamente a células que expressem a integrina α4β7, em particular linfócitos. As proteínas recombinantes da presente invenção, incluindo variantes, podem ser produzidas em células hospedeiras, tal como é aqui descrito. Para além disso, os anticorpos reactivos com as proteínas da presente invenção podem ser produzidas usando uma MAdCAM de primata ou uma sua variante como imunogéneo, por exemplo. Estes anticorpos ou seus fragmentos são úteis em aplicações terapêuticas, de diagnóstico ou de pesquisa. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados na purificação e estudo de MAdCAMs, na identificação de células que expressam MAdCAM e da detecção ou quantificação de MAdCAM em amostras. A invenção também diz respeito a ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes (por exemplo, essencialmente puros) que codificam uma MAdCAM de primata, como MAdCAMs humanos. Noutro aspecto, a invenção diz respeito a construções de ácido nucleico recombinante, como plasmídeos ou vectores retrovirais, que contenham um ácido nucleico que 10 codifique uma proteína da presente invenção ou uma sua porção. Os ácidos nucleicos e as construções podem ser usados para produzir MAdCAM de primata recombinante. Noutra forma de realização, o ácido nucleico codifica um ácido nucleico antisense que pode hibridizar com um segundo ácido nucleico que codifica uma MAdCAM de primata e que pode inibir a expressão da proteína (por exemplo, quando introduzido nas células) .

Também englobados pela presente invenção estão métodos de identificação de ligandos e/ou inibidores (por exemplo, antagonistas) da função MAdCAM. Por exemplo, a MAdCAM de primata, incluindo variantes, pode ser usando em ensaios (por exemplo, ensaios de adesão) concebidos para identificar antagonistas que bloqueiam a ligação de MAdCAM ao ligando, a integrina α4β7. A invenção também diz respeito a métodos de terapia, incluindo um método de tratamento de um indivíduo que sofra de uma doença associada ao recrutamento de leucócitos (como linfócitos ou monócitos) para o aparelho gastrointestinal ou para outros tecidos em resultado da ligação de leucócitos ao endotélio associado ao intestino que expressam a molécula MAdCAM, que compreende a administração ao indivíduo (por exemplo, um mamífero como um primata) de uma quantidade eficaz de um agente ou compostos, como um anticorpo, que inibe a ligação do leucócito à MAdCAM endotelial. O anticorpo é, de preferência, monoclonal, quimérico e/ou anticorpo humanizado ou um seu fragmento que se ligue a um antigénio e iniba a adesão de leucócitos que expressem uma integrina contendo a cadeia β7 (como a α4β7) ao endotélio que expressa o MAdCAM. Numa forma de realização, o anticorpo monoclonal ou 11 o fragmento que se liga ao antigénio tem a especificidade antigénica de um anticorpo monoclonal seleccionado do grupo que consiste em FIB 21, FIB 30, FIB 504 e ACT-1. As doenças inflamatórias do intestino, como, mas não estando limitadas a, colite ulcerosa, doença de Crohn, Pouchite, doença celíaca, colite microscópica ou colagenosa, e gastroenterite eosinofilica podem ser tratadas de acordo com o método reivindicado.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é uma ilustração da sequência nucleotidica (SEQ ID N:l) determinada a partir de subclones do clone de cADN 4 que codifica o MAdCAM-1 humano, e a sequência da proteína prevista codificada pela estrutura ('trame') de leitura aberta (MAdCAM-1; SEQ ID N:2). O peptídeo sinal previsto e a região transmembranar estão sublinhados a negrito. Os resíduos de cisteína dos dois tipo-Ig estão dentro de uma caixa, bem como os locais de glicosilação N-ligados potenciais. 0 domínio de mucina, contendo a repetição PPDTTS (Q/P)E consistindo em 71 aminoácidos está contornado por uma fina linha a negrito. A Figura 2 é uma ilustração da sequência nucleotidica (SEQ ID N:3) determinada a partir de subclones do clone de cADN 20 que codifica o MAdCAM-1 humano, e a sequência da proteína prevista codificada pela estrutura de leitura aberta (MAdCAM-1; SEQ ID N:4). O peptídeo sinal previsto e a região transmembranar estão sublinhados a negrito. Os resíduos de cisteína dos dois tipo-Ig estão dentro de uma caixa, bem como os locais de glicosilação N-ligados potenciais. O domínio de 12 mucina, contendo a repetição PPDTTS (Q/P)E consistindo em 47 aminoácidos está contornada por uma fina linha a negrito. A Figura 3 é uma ilustração da sequência nucleotidica (SEQ ID N:5) determinada a partir de subclones do clone de cADN 31D que codifica o MAdCAM-1 de macacos ('macaque'), e a sequência da proteína prevista codificada pela estrutura de leitura aberta (MAdCAM-1; SEQ ID N:6). 0 peptídeo sinal previsto e a região transmembranar estão sublinhados a negrito. Os resíduos de cisteína dos dois tipo-lg estão dentro de uma caixa. 0 domínio de mucina, contendo a repetição PPDTTS (Q/P)E está contornada por uma fina linha a negrito.

As Figuras 4A e 4B são histogramas que ilustram a ligação selectiva de células transfectadas com MAdCAM humano para linfócitos que expressam α4β7. A Figura 4A ilustra os resultados de uma experiência em que células RPMI 8866 (0,5xl06/poço), que expressam α4β7 (e não α4β1) ligadas a CHO/P que expressam MAdCAM humano ou de murídeo, mas não se ligam a células CHO/P transfectadas comVCAM-1 humano ou a células CHO/P transfectadas com pcADN-3. A Figura 4B ilustra os resultados de uma experiência em que células CHO/P transfectadas com VCAM-1 humano se ligam a células Jurkat (que expressam elevados níveis de α4β1) mas não se ligam a células CHO/P transfectadas com MAdCAM de murídeo ou humano ou a células CHO/P transfectadas com pcADN-3 como controlo. A ligação está representada pelo número de células RPMI 8866 ligadas por célula CHO/P (Figura 4B) numa média de pelo menos quatro campos (objectiva lOx) + /- desvio padrão. As reacções de ligação incluíram IgG controlo, anti- α4β7 (anticorpo 13 monoclonal ACT-1), ou anti- MAdCAM -1 de murídeo (anticorpo monoclonal MECA-367) tal como indicado. A Figura 5 é um é um histograma que ilustra que o MAdCAM-1 humano codificado pelos clones 4 e 20 se ligam a células RPMI 8866 e que a ligação é inibida pelo anticorpo ACT-1.As barras representam uma média de quatro campos a partir de uma única experiência com os desvios padrão representados. A Figura 6 é uma ilustração das estruturas de domínio deduzidas de MAdCAM-1 humano e de murídeo. Os dois domínios de imunoglobulina N-terminais ligados por pontes dissulfureto (indicadas por laços) implicados na adesão celular regiões transmembranares e uma cauda citoplasmática estão presentes nas proteínas humanas, de macacos e de murídeos. O MAdCAM-1 humano tem uma cauda citoplasmática mais comprida. Uma repetição de oito aminoácidos encontrada no domínio mucina está presente em 4 ou 8 cópias nas isoformas humanas mas aparece apenas uma vez nos macacos e nos murídeos.

As Figuras 7A e 7B são ilustrações gráficas de resultados histológicos de actividade inflamatória e danos epiteliais do cólon esquerdo (descendente) e direito (ascendente) de ratos expostos a 10 dias de DSS na sua água para beber. Mostram-se três grupos de ratos, consistindo em grupos que recebem um anticorpo IgG2a irrelevante, anticorpo FIB 21 ou FIB 30. A Figura 8 é um gráfico de contagens γ por minuto (cpm) (± 1 SEM) como percentagem das contagens de entrada totais de ratos a que foi dada água com DSS durante 10 dias. Seis grupos consistiam em controlos negativos a que foi dada apenas água, aos controlos positivos foi dado apenas DSS, aos grupos teste foi dado anticorpo IgG2a irrelevante, FIB 21, MECA-367 ou FIB 21 com MECA-367. 14 A Figura 9 é um gráfico que representa os resultados histológicos (± 1 SEM) para fusão de vilosidades obtidos a partir de amostras de biopsias de jejuno de saguins vulgares antes e no 14°dia de tratamento com 2mg/kg/dia de anticorpo monoclonal ACT-1. A Figura 10 é um gráfico que representa os resultados histológicos (± 1 SEM) para atrofia de vilosidades obtidos a partir de amostras de biopsias de jejuno de saguins vulgares antes e no 14°dia de tratamento com 2mg/kg/dia de anticorpo monoclonal ACT-1. A Figura 11 é uma ilustração da consistência das fezes de animais coliticos (tamaris cotton-top 'topo de algodão') tratados com anticorpo ACT-1. A Figura 12 é uma ilustração da actividade inflamatória em animais coliticos (tamaris cotton-top) tratados com anticorpo ACT-1 tal como determinado histologicamente. A Figura 13 é um diagrama que ilustra o protocolo experimental para o tratamento de tamaris cotton-top coliticos crónicos com anticorpo ACT-1. A Figura 14 é uma ilustração gráfica do efeito terapêutico, na consistência das fezes, da administração de anticorpo ACT-1 (-·-) ou de um anticorpo irrelevante isotipo-emparelhado (-o-) a tamaris cotton-top coliticos crónicos. A Figura 15 é um histograma que ilustra o efeito terapêutico de imunoterapia ACT-1 na actividade inflamatória colónica em tamaris cotton-top coliticos crónicos tratados com anticorpoACT-1 ou com um anticorpo monoclonal controlo irrelevante. Cada barra representa a média dentro do grupo de tratamento da alteração absoluta nos resultados da actividade inflamatória ± 1 SEM, registada para cada animal comparando 15 os resultados num determinado momento no tempo com o resultado do mesmo animal no Dia 0. A Figura 16 é um histograma que ilustra os números absolutos de linfócitos α4β7+ no conjunto circulatório periférico em tamaris cotton-top coliticos tratados com anticorpo ACT-1. Cada barra representa a média (± 1 SEM) da concentração de células α4β7 + no sangue detectadas pelo ACT-1.

As Figuras 17A e 17B são representações que ilustram os resultados da análise FACS que mostra a coloração especifica das células Hut 78 com quimeras MAdCAM-Ig. Os sobrenadantes das células COS transitoriamente transfectadas com uma construção MAdCAM-Ig humano quimérica (a partir de quatro transfecções independentes) foram incubadas com células Hut 78 na presença de 2 mM Mn++, e detectou-se a ligação da quimera usando um anticorpo conjugado ficoeritrina específico para IgGl humana. A Figura 17A , meio controlo; Figuras 17B-17C, sobrenadantes de células transfectadas com Clone 21 (compreendendo o domínio extracelular inteiro da MAdCAM humano); Figuras 17D-17E, sobrenadantes de células Clone 38 (compreendendo os dois domínios Ig N-terminais da MAdCAM humano). Ligação após pré-incubação das células apenas com meio (à direita) . A ligação foi inibida pela pré-incubação de células com anti-p7 MAb FIB 504 (à esquerda). A Figura 18 é um gráfico que ilustra a diferença de peso corporal de ratos scid reconstituídos com células lxlO6 CD45RBhl T () em relação aos ratos scid reconstituídos com igual número de células CD45RB10 T (A) derivadas do baço BALB/c. Os ratos receptores foram pesados com intervalos semanais para avaliar a progressão da doença. 16 A Figura 19 é um histograma que ilustra o aumento da acumulação do cólon de células de nódulo linfático mesentérico marcadas com in-In injectadas por via intravenosa em de ratos scid reconstituídos com células CD45RBhl T em comparação com a acumulação no cólon de ratos scid reconstituídos com igual número de células CD45RB10 T e a inibição da acumulação pelo tratamento durante 2 semanas com uma combinação de anticorpos anti- β7 (FIB 504) e anti-MAdCAM (MECA-367). Os resultados são expressos como % de contagens por minuto (CPM) em cólon normalizado para CPM no baço e corrigido para o fundo. A Figura 20 é um histograma que ilustra a completa inibição da acumulação de células marcadas com ni-ln (injectadas por via intravenosa) no cólon de ratos scid pelo tratamento durante 4 meses (começando no momento da reconstituição) com FIB 504, MECA-367, ou FIB 504 com MECA-367. Da direita para a esquerda: ratos scid reconstituídos com células CD45RB10 T, recebendo IgG2a de rato controlo isotipo-emparelhado irrelevante; de ratos scid reconstituídos com células CD45RBhl T, recebendo quer IgG2a de rato controlo isotipo-emparelhado irrelevante, FIB 504, MECA-367, ou FIB 504 + MECA-367. A figura 21 é um histograma que ilustra a redução do número de células T CD4+ no cólon ascendente (direito) ou descendente (esquerdo) em ratos scid tratados durante 14 dias com uma combinação de FIB 504 com MECA-367 quando em comparação com ratos tratados com um anticorpo IgG2a de rato controlo isotipo-emparelhado determinada pela coloração de secções congeladas do cólon esquerdo ou direito com um anticorpo específico de rato para rato CD4. 17

Descrição Detalhada da Invenção

Proteínas e Peptídeos A presente invenção diz respeito a proteínas ou polipeptídeos isolados e/ou recombinantes (incluindo, por exemplo, essencialmente puros) designados MAdCAMs de primatas (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecules) e variantes de MAdCAMs de primatas. Numa forma de realização preferida, as proteínas isoladas e/ou recombinantes da presente invenção têm pelo menos uma propriedade, actividade ou função caracterí stica de uma MAdCAM de primata (tal como aqui definida), tal como a função de ligação 8por exemplo, a capacidade de se ligar a uma integrina α4β7) e/ou função de molécula de adesão celular (por exemplo, a capacidade de mediar a adesão celular como a adesão dependente de α4β7 in vitro e/ou in vivo), e/ou propriedade imunológica tal como aqui definida. Por exemplo, algumas proteínas da presente invenção podem-se ligar selectivamente a uma integrina α4β7 e mediar assim a adesão celular dependente de α4β7 a células que tenham a integrina α4β7, como os leucócitos (especialmente linfócitos como as células B ou T) in vitro e/ou in vivo. Num aspecto, as proteínas da presente invenção podem mediar a adesão celular heterotípica (por exemplo, células endoteliais a leucócitos como os linfócitos).

Noutra forma de realização, as proteínas da presente invenção podem ligar-se à integrina α4β7 de primatas da mesma ou de diferentes espécies de primatas, e/ou têm função de molécula de adesão celular (por exemplo, a capacidade de mediar a adesão celular como a adesão dependente de α4β7 in 18 vitro e/ou in vivo). Por exemplo, tal como aqui mostrado, as proteínas MAdCAM-l humanas e de macaco, produzidas em células de mamíferos pela expressão de clones de cADN, podem selectivamente ligar-se à integrina α4β7 presente nos linfócitos humanos, e podem funcionar como moléculas de adesão celular capazes de mediar a adesão selectiva a células com integrina α4β7.

As proteínas ou polipeptídeos aqui referidos como "isolados" são proteínas ou polipeptídeos purificados a um estado para além daquele em que é encontrado nas células de mamíferos. Proteínas ou polipeptídeos "isolados" incluem proteínas ou polipeptídeos obtidos pelos métodos aqui descritos, métodos similares ou por outros métodos adequados, incluindo proteínas ou polipeptídeos essencialmente puros, proteínas ou polipeptídeos produzidos por síntese química (por exemplo, peptídeos sintéticos) ou por combinações de métodos biológicos e químicos e proteínas ou polipeptídeos recombinantes que são isolados. As proteínas podem ser obtidas num estado isolado de pelo menos cerca de 50% por peso, de preferência pelo menos cerca de 75% por peso, e mais preferivelmente, na sua forma essencialmente pura. As proteínas ou polipeptídeos aqui referidos como "recombinantes" são proteínas ou polipeptídeos produzidos pela expressão de ácidos nucleicos recombinantes.

Tal como é aqui usado, "MAdCAM de primata" refere-se a proteínas MAdCAM que ocorrem naturalmente ou endógenas, a proteínas com uma sequência de aminoácidos que é a mesma da MAdCAM de primata que ocorre naturalmente ou endógena correspondente (por exemplo, proteínas recombinantes) e a variantes funcionais de cada uma das anteriores (por exemplo, 19 fragmentos funcionais e/ou mutantes produzidas via mutagénese e/ou técnicas recombinantes) . Assim sendo, tal como aqui definido, o termo inclui MAdCAM de primatas maduros, proteínas MAdCAM glicosiladas ou não glicosiladas, variantes polimórficas ou alélicas, e outras isoformas da MAdCAM de primatas (por exemplo, produzidas por união 'splicing' alternativa ou outros processos celulares) e fragmentos funcionais.

Proteínas MAdCAM de primata que ocorrem naturalmente ou endógenas incluem proteínas do tipo selvagem como a MAdCAM madura, variantes polimórficas ou alélicas, e outras isoformas que ocorrem naturalmente em primatas (por exemplo, humanos ou outros primatas não humanos, como os macacos 'macaque', tamaris tipo algodão). Estas proteínas podem ser recuperadas a partir de uma fonte que naturalmente produza MAdCAM de primatas. Estas proteínas e as proteínas MAdCAM de primatas com a mesma sequência de aminoácidos que a MAdCAM de primata que ocorre naturalmente ou endógenas ou endógena, são referidas pelo nome do primata correspondente. Por exemplo, quando o primata correspondente é um ser humano, a proteína é designada como proteína MAdCAM humana (por exemplo, uma MAdCAM humana recombinante produzida numa célula hospedeira apropriada). "Variantes funcionais" de MAdCAMs de primatas incluem fragmentos funcionais, proteínas mutantes funcionais, e/ou proteínas de fusão funcionais. Geralmente, os fragmentos ou porções de MAdCAM de primatas englobados pela presente invenção incluem os que têm uma delecção (isto é, uma ou mais delecções) de um aminoácido (isto é, um ou mais aminoácidos) relativamente à MAdCAM de primata madura (como delecções N- 20 terminais, C-terminais ou internas). Fragmentos ou porções em que apenas aminoácidos contiguos foram eliminados ou em que aminoácidos não contiguos foram eliminados em relação à MAdCAM de primata madura também estão visionadas.

Em geral, os mutantes ou derivados de MAdCAMs de primatas, englobados pela presente invenção incluem variantes naturais ou artificiais que diferem pela adição, delecção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos contíguos ou não contíguos, ou polipeptídeos modificados em que se modifica um ou mais resíduos, e mutantes que contêm um ou mais resíduos modificados. Os mutantes preferidos são variantes naturais ou artificiais de MAdCAM de primatas que diferem pela adição, delecção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos contíguos ou não contíguos.

Uma "porção ou fragmento funcional", "mutante funcional" e/ou "proteína de fusão funcional" de uma MAdCAM de primata refere-se a uma proteína ou oligopeptídeo isolado e/ou recombinante que tem pelo menos uma propriedade, actividade e/ou função característica de uma MAdCAM de primata, como a função de ligação (por exemplo, a capacidade de se ligar a uma integrina α4β7), e/ou função de molécula de adesão celular (por exemplo, a capacidade de mediar a adesão celular como a adesão dependente de α4β7 in vitro e/ou in vivo) e/ou retenha pelo menos uma propriedade imunológica de uma MAdCAM de primata.

Tal como é aqui usado, uma proteína, polipeptídeo ou oligopeptídeo com "pelo menos uma propriedade imunológica" de uma MAdCAM de primata é uma em que (a) está ligada por pelo menos um anticorpo de uma especificidade epitópica seleccionada que se liga a uma MAdCAM de primata que ocorre 21 naturalmente ou endógena ou a uma proteína com a mesma sequência de aminoácidos que a MAdCAM de primata que ocorre naturalmente ou endógena (por exemplo, MAdCAM-1 humana), e/ou (b) é um imunogéneo capaz de induzir a formação num animal apropriado de um anticorpo de uma especificidade epitópica seleccionada que se liga a uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente ou endógena ou a uma proteína com a mesma sequência de aminoácidos que a MAdCAM de primata que ocorre naturalmente ou endógena. Por exemplo, um fragmento apropriado pode reagir com um anticorpo que se direcciona contra e/ou é reactivo com MAdCAM de primata isolado.

Fragmentos ou mutantes apropriados podem ser identificados por rastreio. Por exemplo, pode-se retirar o terminal-N, terminal-C ou regiões internas da proteína em vários passos e a proteína ou polipeptídeo resultante pode ser rastreada usando um ensaio de adesão ou ligação adequado, como um ensaio aqui descrito. Quando a proteína resultante apresentar actividade no ensaio, a proteína ("fragmento") resultante é funcional. A informação respeitante à estrutura e função da MAdCAM de rato e de outras moléculas de adesão, e de MAdCAMs de primatas aqui mostradas, fornece uma base para dividir a MAdCAM de primata em domínios funcionais (ver em baixo). 0 termo variante também engloba proteínas de fusão, compreendendo uma MAdCAM de primata (por exemplo, MAdCAM-1 humana madura) como primeira metade, ligada a uma segunda metade que não ocorre na MAdCAM de primata tal como é encontrada na natureza. Assim, a segunda metade pode ser um aminoácido, oligopeptídeo ou polipeptídeo. A primeira metade pode estar numa localização de terminal-N, localização de 22 terminal-C ou interna da proteína de fusão. Numa forma de realização, a proteína de fusão compreende uma MAdCAM humana ou uma sua porção como primeira parte, e uma segunda metade que compreende uma sequência de ligação e ligando de afinidade (por exemplo, uma enzima, um antigénio, etiqueta epítopo).

Noutra forma de realização, a proteína de fusão é uma imunoglobulina híbrida, como um híbrido que contém uma parte de MAdCAM de primata fundida no seu terminal-C ao terminal-N de uma parte de imunoglobulina 8por exemplo, uma ou mais regiões constantes de imunoglobulina, de preferência de origem primata) , como as preparadas de acordo com Capon et al., Patentes Estadunidenses No. 5,428,130 e 5,225,538, cujos ensinamentos estão aqui incorporados por referência na sua totalidade. A imunoglobulina híbrida compreende uma proteína ou polipeptídeo de fusão contendo pelo menos uma porção de uma cadeia de imunoglobulina, e de preferência pelo menos um domínio completo (por exemplo, CHI, hinge 'charneira'). Têm sido divulgados outros exemplos de "imunoadesinas" (Watson, S.R., et al., Nature, 349: 164-167 (1991); Martin, S., et al., J. Vlrol., 67: 3561-3568 (1993); Staunton, D.E., et al., J. Exp. Med., 176: 1471-1476 (1992); Capon, D.J., et al. , Nature, 337: 525-531 (1989); Jakubowski et al., J. Immunol., 155: 938-946 (1995)). Por exemplo, pode-se preparar uma proteína de fusão compreendendo toda ou uma porção de uma MAdCAM de primata (por exemplo, humana e uma região constante de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina ou uma sua porção (por exemplo, preparando um ácido nucleico que codifique a proteína de fusão). Normalmente, a fusão é construída de modo que o terminal-C da MAdCAM se junte ao terminal-N da região 23 constante da imunoglobulina. No entanto, podem-se fazer proteínas de fusão que o fim do terminal-N da MAdCAM se junta com o fim do terminal-C da região constante da imunoglobulina. De preferência usa-se uma porção da MAdCAM de primata que é suficiente para se ligar a um ligando (por exemplo, integrina α4β7) como o domínio extracelular completo ou uma porção contendo os dois domínios de imunoglobulina terminal-N em que se retira a região transmembranar (ver, por exemplo, Exemplo 3).

Pode-se produzir uma variedade de moléculas de imunoglobulina híbridas (por exemplo, monomérica, homodimérica, heterodimérica, homotetramérica, heterotetramérica) dependendo do tipo de região constante seleccionada e da porção usada (por exemplo, região constante de cadeia leve, região constante de cadeia pesada (como as regiões constantes γΐ, γ2, γ3, γ4, αΐ, α2, δ, ε, e μ obtidas a partir de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM) , e suas porções) no polipeptídeo de fusão, e se são juntas em formas multiméricas uma com a outra e/ou com outras imunoglobulinas híbridas ou cadeias de imunoglobulinas (ver Capon et al., Patentes Estadunidenses N°. 5,428,130 e 5,225, 538). Numa forma de realização preferida, a proteína de fusão contém uma região constante de cadeia pesada completa ou pelo menos uma região charneira funcionalmente activa, domínio CH2 e CH3. Pode-se seleccionar uma determinada região constante (por exemplo, IgGl), uma variante ou suas porções para ajustar a função efectora. Por exemplo, uma região constante com mutação (variante) pode ser incorporada numa proteína de fusão para minimizar a ligação a receptores Fc (Exemplo 3, Winter et al., GB 2,209, 757 B; e Morrison et al., WO 89/07142), e/ou 24 para fixar complementos (WO 94/29351, Dezembro 22, 1994) , etc.

Exemplos de proteínas "MAdCAM de primata" incluem proteínas codificadas por um ácido nucleico MAdCAM-1 humano ou de macaco da presente invenção, como uma proteína com uma sequência de aminoácidos estabelecida ou substancialmente como a estabelecida na Figura 1 (SEQ ID N0:2), Figur2 2 (SEQ 10 NO:4) ou Figura 3 (SEQ ID NO:6), e suas porções funcionais. Numa forma de realização preferida, uma MAdCAM de primata ou uma variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 55% similar, mais preferivelmente cerca de 75% similar, e ainda mais preferivelmente cerca de 90% similar à proteína representada na Figura 1 (SEQ ID NO:2), Figur2 2 (SEQ 10 NO:4) ou Figura 3 (SEQ ID ΝΟ:β).

Estrutura de MAdCAM A MAdCAM-1 de murídeo, um membro da família supergene de imunoglobulina, é uma molécula multi-domínio, que compreende sequências relacionadas com imunoglobulina e tipo mucina (Briskin, M.J., et al., Nature, 363:461 (1993)).Tal como indicado na Figura 6, a forma de murídeo contém dois domínios tipo-imunoglobulina amino-terminais que são homólogos dos domínios dos receptores de adesão tipo-Ig, ICAM-1 e VCAM-1 e estão implicados na ligação à integrina. O terceiro domínio tipo-imunoglobulina (membrana proximal), apesar de não relacionado com os receptores de adesão desta classe, partilha homologia com outro membro da superfamília das imunoglobulinas relacionadas com mucosa, IgA. Para além dos três domínios tipo imunoglobulina, a MAdCAM-1 de murídeo tem um domínio tipo-mucina rico em serina/treonina entre o 25 segundo e o terceiro domínio tipo-Ig. Estes elementos estruturais sugerem que a MAdCAM-l facilita mais do que uma função nas cascatas de adesão celular, e recentes estudos da MAdCAM-l de murídeo apoiam os papéis da MAdCAM-l de selectina e de ligação à integrina (Moore, K.L., et al., J. Cell. Biol., 118:445 (1992); Bargatze, R.F., et al., Immuníty, 3:99-108 (1995)). Também a este respeito, foi divulgado que a MAdCAM-l de murídeo, quando expressa em nódulos linfáticos mesentéricos pode apresentar carbohidratos de ligação à L-selectina associados com o epítopo de adressina de nódulo periférico, MECA-79 (Berg, E.L., et al., Nature, 366:695 (1993)) .

Tal como aqui descrito, as proteínas MAdCAM-l humanas e de macaco têm dois domínios tipo-imunoglobulina (tipo-Ig) que são homólogos dos dois domínios tipo-imunoglobulina amino-terminais de ligação á integrina da MAdCAM-l de murídeo (Figuras 1-3, e 6). No entanto, a similaridade das sequências dentro da região homóloga do domínio mucina/IgA da MAdCAM-l de murídeo é muito menos aparente. As regiões proximais da membrana dos receptores humanos e de macaco apresentam uma variação considerável (quando comparadas uma com a outra ou com MAdCAM-l de murídeo) no que diz respeito ao comprimento da sequência tipo mucina e à falta de um domínio Ig (tipo-IgA) proximal de membrana.

Foram identificadas duas isoformas de MAdCAM-l humana que apresentam polimorfismos de aminoácidos simples e variação do número de cópias de uma repetição rica em serina/treonina/prolina na região mucina. Estas duas isoformas parecem ser codificadas no ADN genómico, sugerindo variação alélica e/ou processamento alternativo desta 26 sequência. Estas duas isoformas podem servir como mecanismos alternativos de regulação da afinidade de ligação ao α4β7 e/ou a apresentação de carbohidratos para ligação à selectina. A presença destes domínios tipo-Ig e mucina em MAdCAMs de primata aqui descritos também é consistente com o papel de ligação à selectina bem como à integrina.

Experiências recentes de permuta de domínios em MAdCAM-1 de murídeo mostraram que, apesar do domínio um da MAdCAM-1 se ligar de forma fraca a α4β7, a adesão é fraca na ausência de uma forte activação da integrina. Os dois domínios tipo-Ig amino-terminais (que são similares aos domínios de ICAM-1 e VCAM-1) são suficientes para actividade de ligação a α4β7 num modo de activação independente comparável à da MAdCAM-1 de murídeo tipo selvagem.

Um pequeno motivo (GLDTSL) presente no domínio um da MAdCAM-1 é conservado e exigido para a ligação à integrina noutros receptores de adesão tipo-Ig, incluindo o domínio um de ICAM-1, ICAM-2, e ICAM-3, e domínios 1 e 4 de VCAM-1 (Staunton, D.E., Cell, 52: 925-33 (1988); Staunton, D.E., et al., Nature, 339:61 (1989); Osborn, L., et al.f Cell, 59:1203 (1989); Fawcett, J., et al., Nature, 360:481 (1992). Esta sequência, G-(I/L)-(D/E)-(T/S)-(P/S)-L está localizada entre as folhas β c e d destes domínios de ligação á integrina. O motivo GLDTSL nas MAdCAMs de primata aqui caracterizadas. A mutagénese de E34 (Glu34) neste motivo do domínio 1 do ICAM-1 (sublinhado em cima) e do D40 (Asp40) em VCAM-1 (a negrito em cima) tem efeitos profundos na ligação de LFA-1 e α4β1, respectivamente (Osborn, L., et al., J. Cell . Biol, 124:601-608 (1994); .Renz , M.E. et al., J. Cell. Biol., 125:1395-1406 (1994); Staunton, D.E., et al., Cell, 61:243- 27 254 (1990); Vonderheide, R.H., et al., J. Cell. Biol., 125:215-222 (1994). Mais recentemente, um fragmento de VCAM-1 contendo os dois domínios terminais-N foi sujeito a determinação cristalográfica da estrutura (Jones, E.Y., et al., Nature, 373:539-544 (1995); Wang, J-H, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 92:5714-5718 (1995)). O motivo conservado em VCAM-1 (QIDSPL) parece estar altamente exposto na porção de terminal-N da ansa CD do primeiro domínio Ig numa posição que parece ser facilmente acessível às integrinas.

Uma substituição de nucleótidos neste motivo da MAdCAM-1 de murídeo, resultando na alteração do aminoácido 61 de leucina para arginina (L61-*R61) elimina as interaeções de MAdCAM-1com linfócitos em descanso que expressem α4β7. Assim sendo, a MAdCAM-1 de murídeo também precisa deste motivo de aminoácidos conservado, GLDTSL, dentro da ansa CD prevista pelo computador no seu domínio terminal-N para se ligar ao ligando da integrina, α4β7.

As comparações dos clones de cADN de MAdCAM humana 4 e 20 (Figuras 1 e 2) revelaram que os aminoácidos 225 amino-terminais são idênticos nos clones 4 e 20. Esta região contém uma região prevista líder ou sequência sinal hidrofóbica de 18 aminoácidos e dois domínios tipo-imunoglobulina esta região pode ser alinhada com MAdCAM-1 de primata e de murídeo e apresenta as seguintes características conservadas: (1) um peptídeo sinal previsto (idêntico nas proteínas humanas e similar nos peptídeos sinal de macacos e murídeos); (2) dois pares de resíduos de cisteína no primeiro domínio tipo-Ig, sendo que as cisteínas de cada par estão separadas por 3 aminoácidos; (3) uma sequência de nove aminoácidos (que 28 contém o motivo "LDTSL") na ansa C-D prevista do domínio 1 tipo-Ig e está implicado como local geral de reconhecimento da integrina (idêntica em cada clone de primatas); e (4) um segundo domínio tipo-imunoglobulina grande e incaracterístico. 0 tamanho do segundo domínio tipo-Ig, com aproximadamente 70 aminoácidos entre resíduos de cisteína classificá-lo-ia como domínio tipo "V" (variável), em contraste com domínios tipo C2 (constante) que são mais frequentemente nos receptores de adesão tipo-Ig (Hunkapiller, T., et al., Adv. in Immunol., 44:1-62 (1989); Williams, A.F., et al., Annu. Rev. Immunol., 6:381-405 (1988)). Dentro deste domínio está uma ansa C'-E prolongada contendo uma abundância de resíduos com carga negativa, comum a todos os clones de MAdCAM de primatas, murídeo e humanos caracterizados, mas que não é vista nos receptores de adesão relacionados. A região seguinte encontrada nos clones 4 e 20 é análoga ao domínio mucina da MAdCAM-1 de murídeo, devido à prevalência de resíduos de serina, treonina e prolina (69% para o clone 4 e 76% para o clone 20) (em caixa nas Figuras 1 e 2). Esta região, apesar de similar na composição de aminoácidos à MAdCAM de murídeo, é altamente divergente da MAdCAM de murídeo. Assim sendo, a selecção para a conservação dos domínios tipo-Ig de ligação à integrina parece maior do que a das sequências mucina. O domínio MAdCAM-1 humano tem o comprimento de 71 aminoácidos no clone 4, e 47 aminoácidos no clone 20. Esta região também contém dois polimorfismos: (1) um polimorfismo no aminoácido 240, que é a prolina (P) no clone 4 e a serina (S) no clone 20; e (2) um polimorfismo no aminoácido 242 que é a asparagina (N) no clone 4 e o aspartato (D) no clone 20. Para além disso, os domínios de 29 mucina humanos contêm uma repetição de 8 aminoácidos que consiste na sequência PPDTTS(Q/P)E, que aparece oito vezes no clone 4 e cinco vezes no clone 20.

Como o dominio de mucina humano é altamente repetitivo, o truncamento de três repetições no clone 20 em relação ao clone 4 pode ser o resultado de processos como uma união ('splicing') ou mutação alternativa (por exemplo, um evento de recombinação aberrante) que mantém a estrutura ('frame') de leitura obtendo-se um receptor que é funcional em relação à ligação á integrina, e sugerindo que uma ou todas as sequências mucina são dispensáveis para ligação á integrina. Consistentemente, foi demonstrado que os dominios tipo-Ig 1 e 2 da MAdCAM-1 de murídeo são suficientes para a adesão independente da activação à α4β7, indicando que de mucina de murideo são dispensáveis para ligação a integrina. Também interessante a este respeito, o clone de macaco que foi isolado tem falta da maioria da região de repetição.

Os restantes 110 aminoácidos do terminal-C são idênticos nos clones 4 e 20: 47 aminoácidos precedem um segmento transmembranar hidrofóbico previsto de 20 aminoácidos, que é seguido por uma cauda citoplasmática de 43 aminoácidos. Os 47 aminoácidos imediatamente terminal-C da região mucina estão numa região que corresponde ao dominio Ig tipo-IgA da MAdCAM-1 de murídeo. Apesar das proteínas humanas e de macaco serem similares nesta região, são divergentes da MAdCAM-1 de murídeo. Em comparação com a MAdCAM-1 de murídeo, as proteínas humanas são mais curtas em 59 aminoácidos nesta região e não têm as características de um domínio tipo-Ig. Os domínios transmembranares de todos os receptores são similares, mas a cauda citoplasmática é consideravelmente 30 mais longa (43 aminoácidos) na MAdCAM-l humana (26 nos primatas e 20 nos ratos). Método para Produzir Proteínas Recombinantes

Outro aspecto da invenção diz respeito a um método de produção de uma MAdCAM de primata ou de uma sua variante (por exemplo, uma porção). A proteína recombinante pode ser obtida, por exemplo, pela expressão de uma molécula de ADN recombinante que codifica uma MAdCAM de primata ou uma sua variante numa célula hospedeira apropriada, por exemplo.

Também se providenciam construções apropriadas para a expressão de uma MAdCAM de primata ou sua variante. As construções podem ser introduzidas numa célula hospedeira apropriada, e podem-se produzir e manter em cultura células que expressam uma MAdCAM de primata recombinante ou uma sua variante. Estas células são úteis para uma variedade de fins e podem ser usadas em ensaios de adesão (por exemplo, num ensaio para testar ligandos e/ou candidatos a inibidores para a adesão mediada por MAdCAM), na produção de proteínas para caracterização, isolamento e/ou purificação (por exemplo, purificação por afinidade) e como imunogéneos, por exemplo. As células hospedeiras apropriadas podem ser procarióticas, incluindo células bacterianas como a E. coli, B. subtilis e ou outras bactérias apropriadas ou eucarióticas, como células de fungos e leveduras (por exemplo., Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae,

Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), ou outras células eucarióticas inferiores, e células de eucariotas superiores como as de insectos (por exemplo, células de insecto Sf9) ou de mamífero (por exemplo células de ovário de 31 hamster chinês (CHO), células COS, células HuT 78, células 293). (Ver, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993) ) . Numa forma de realização, usam-se células hospedeiras capazes de expressar proteínas maduras de ligação à membrana. Noutra forma de realização, células hospedeiras capazes de segregar MAdCAM (por exemplo, MAdCAM solúvel, como a MAdCAM a que falta a região transmembranar terminal-C e a cauda citoplasmática).

As células hospedeiras que produzem uma MAdCAM de primata recombinante ou suas variantes podem ser produzidas da seguinte forma. Por exemplo, pode-se inserir um ácido nucleico que codifica toda ou parte da sequência de codificação para a proteína desejada pode ser inserida num vector de ácido nucleico, por exemplo, um vector de ADN, como um plasmídeo, vírus ou outro réplicon apropriado para expressão. Encontra-se disponível uma variedade de vectores, incluindo vectores que são mantidos em cópias únicas ou cópias múltiplas, ou que se integram nos cromossomas da célula hospedeira.

Os sinais de transcrição e/ou translação de um gene de MAdCAM-1 podem ser usados para dirigir a expressão. Em alternativa, estão disponíveis vectores de expressão apropriados para a expressão de um ácido nucleico que codifica toda ou parte de uma sequência codificadora da proteína desejada. Os vectores de expressão apropriados podem conter uma variedade de componentes, incluindo, mas não estando limitados a um ou mais dos seguintes: uma origem de replicação; um gene marcador seleccionável; um ou mais elementos de controlo de expressão, como um elemento de 32 controlo transcripcional (por exemplo, um promotor, um potenciador, um finalizador) , e/ou um ou mais sinais de translação; uma sequência sinal ou sequência líder para marcar a membrana ou secreção (de origem primata ou de um primata heterólogo ou de espécies não-primatas). Numa construção, a sequência sinal pode ser fornecida pelo vector, pela sequência de codificação da MAdCAM de primata ou por outra fonte.

Fornece-se um promotor para expressão numa célula hospedeira apropriada. Os promotores podem ser constitutivos ou induzíveis. Nos vectores, o promotor é ligado de forma operacional a um ácido nucleico que codifica a MAdCAM de primata ou uma sua variante, e é capaz de dirigir a expressão do polipeptídeo codificado Está disponível uma variedade de promotores apropriados para hospedeiros procarióticos (por exemplo, promotores lac, tac, T3, T7 para E.coli) e eucarióticos (por exemplo, álcool desidrogenase de levedura (ADH1), SV40, CMV).

Para além disso, os vectores de expressão contêm normalmente um marcador seleccionável para selecção de células hospedeiras que contêm o vector, no caso de vector de expressão replicável, uma origem ou replicação. Os genes que codificam produtos que conferem resistência a antibióticos ou drogas são marcadores seleccionáveis comuns e podem ser usados em células procarióticas (por exemplo, o gene da β-lactamase (resistência à ampicilina), gene Tet para resistência à tetraciclina) e eucarióticas (por exemplo, genes de resistência à neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina ou higromicina). Os genes marcadores da dihidrofolato redutase permitem a selecção com 33 metotrexato numa variedade de hospedeiros. Os genes que codificam o produto genético de marcadores auxotróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, HIS3) são frequentemente usados como marcadores seleccionáveis em leveduras. Também está contemplada a utilização de vectores virais (por exemplo, baculovirus) ou fágicos, e vectores que são capazes de se integrar no genoma da célula hospedeira, como virus retrovirais. A presente invenção também diz respeito a células que contêm estes vectores de expressão.

Por exemplo, um ácido nucleico que codifica uma MAdCAM de primata ou uma sua variante pode ser incorporado no vector, operacionalmente ligado a um ou mais elementos de controlo da expressão, e a construção pode ser inserida nas células hospedeiras que são mantidas em condições apropriadas para expressão, pelo que o polipeptídeo é produzido. A construção pode ser introduzida em células por um método apropriado para a célula hospedeira seleccionada (por exemplo, transformação, transfecção, electroporação, infecção). Para a produção de uma proteína, as células hospedeiras que contêm a construção são mantidas em condições apropriadas à expressão, (por exemplo, na presença de um indutor, meio adequado suplementado com sais apropriados, factores de crescimento, antibióticos, suplementos nutricionais, etc.). A proteína codificada (por exemplo, MAdCAM-1 humana) pode ser isolada a partir das células hospedeiras ou do meio.

As proteínas de fusão também podem ser produzidas deste modo. Por exemplo, algumas formas de realização podem ser produzidas pela inserção de cADN de MAdCAM-1 de primata ou de uma porção num vector de expressão apropriado, como o Bluescript®! I SK+/- (Stratagene),pGEX-4T-2 (Pharmacia), 34 pcDNA-3 (Invitrogen) e pET-15b (Novagen). A construção resultante é depois inserida numa célula hospedeira apropriada para expressão. Após a expressão, a proteína de fusão pode ser isolada ou purificada a partir de um lisado celular através de uma matriz de afinidade apropriada (ver por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16,4,1-16.7.8 (1991)). Para além disso, os marcadores de afinidade fornecem um meio para detector uma proteína de fusão. Por exemplo, a expressão na superfície celular ou a presença numa fracção particular da célula de uma proteína de fusão contendo um antigénio ou um marcador epítopo de afinidade pode ser detectado através de um anticorpo apropriado. Ácidos Nucleicos, Construções e Vectores A presente invenção diz respeito a ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes (incluindo, por exemplo, essencialmente puros) com sequências que codificam uma MAdCAM de primata ou uma sua variante tal como aqui descrito.

Os ácidos nucleicos referidos como "isolados" são ácidos nucleicos separados dos ácidos nucleicos do ADN genómico ou do ARN celular da sua fonte de origem (por exemplo, tal como existe nas células ou numa mistura de ácidos nucleicos como numa biblioteca) e pode ser sujeito a um maior processamento. Ácidos nucleicos "isolados"incluem ácidos nucleicos obtidos por métodos aqui descritos, métodos similares ou outros métodos apropriados, incluindo ácidos nucleicos essencialmente puros, ácidos nucleicos produzidos por síntese química, por combinações de métodos biológicos e químicos e ácidos nucleicos recombinantes que são isolados (ver por 35 exemplo, Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9):2471-2476 (1991); Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Os ácidos nucleicos aqui referidos como "recombinantes" são ácidos nucleicos que foram produzidos por metodologia de ADN recombinante, incluindo os ácidos nucleicos que são obtidos por procedimentos com base num método de recombinação artificial, como a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e/ou clonagem usando enzimas de restrição. Ácidos nucleicos "recombinantes" são também os que resultam de eventos de recombinação que ocorrem através dos mecanismos naturais das células, mas são seleccionados para depois da introdução nas células de ácidos nucleicos concebidos para permitir e tornar provável o desejado evento de recombinação.

Numa forma de realização, o ácido nucleico ou a sua porção codifica uma proteína ou polipeptídeo com pelo menos uma propriedade, actividade ou função característica de uma MAdCAM de primata (tal como aqui definida) , tal como função de ligação (por exemplo, a capacidade de se ligar à integrina α4β7), e/ou função de molécula de adesão celular (por exemplo, a capacidade de mediar a adesão celular como a adesão dependente de α4β7 in vitro e/ou in vivo), e/ou propriedades imunológicas aqui definidas. A presente invenção também diz respeito, mais especificamente, a ácidos nucleicos isolados ou recombinantes ou a suas porções com sequências que codificam a MAdCAM-1 humana ou de macaco ou suas variantes. A invenção também diz respeito a ácidos nucleicos isolados ou recombinantes que são caracterizados pela: 36 (1) sua capacidade de hibridizar com (a) um ácido nucleico que codifica uma MAdCAM de primata, como um ácido nucleico com uma sequência de nucleótidos tal como a estabelecida ou substancialmente como a estabelecida na Figura 1 (SEQ ID N0:1), Figura 2 (SEQ ID NO:3), ou Figura 3 (SEQ ID N0:5); (b)o complemento de cada um de (a); ou (c) porções de cada um dos anteriores (por exemplo, uma porção que compreende a estrutura de leitura aberta ( 'reading frame'); ou (2) sua capacidade de codificar um polipeptideo com a sequência de aminoácidos de uma MAdCAM de primata (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:6); ou (3) por ambas as características.

Numa forma de realização, o ácido nucleico partilha pelo menos 50% de similaridade da sequência nucleotídica com qualquer uma das sequências das Figura 1, Figura 2 ou Figura 3 (SEQ ID NO:l, 3 ou 5, respectivamente) ou com uma das regiões de codificação de MAdCAM. Mais preferivelmente, o ácido nucleico partilha pelo menos 75% de similaridade da sequência nucleotídica, e mais preferivelmente, pelo menos 90% de similaridade da sequência nucleotídica das Figura 1, Figura 2 ou Figura3 (SEQ ID NO:l, 3 ou 5, respectivamente) ou com uma das regiões de codificação de MAdCAM.

Os ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes que cumprem estes critérios compreendem ácidos nucleicos com sequências idênticas ás das MAdCAMs de primatas que ocorrem naturalmente ou variantes das sequências que ocorrem naturalmente. Estas variantes incluem mutantes que diferem pela adição, delecção ou substituição de um ou mais resíduos, ácidos nucleicos em que um ou mais resíduos são modificados 37 (por exemplo, análogos de ADN ou ARN) e mutantes que compreendem um ou mais resíduos modificados.

Os ácidos nucleicos da presente invenção, incluindo os que hibridizam com um ácido nucleico seleccionado tal como acima descrito, podem ser detectados ou isolados em condições muito rigorosas ('stringency') ou condições moderadamente rigorosas, por exemplo. " Condições muito rigorosas" e "condições moderadamente rigorosas" para hibridizações de ácidos nucleicos estão explicadas nas 2.10.1-2.10.16 (ver particularmente 2.10.811) e as páginas 6.3.1-6 em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 1, Suppl. 26, 1991), cujos ensinamentos estão aqui incorporados por referência. Factores como o comprimento da sonda, composição em bases, percentagem de emparelhamento entre as sequências de hibridização, temperatura e força iónica influenciam a estabilidade dos híbridos de ácidos nucleicos. Assim, as condições muito ou moderadamente rigorosas podem ser determinadas empiricamente e dependem, em parte, das características dos ácido nucleico conhecido (por exemplo, ADN) e do outro ácido nucleico a ser avaliado para hibridização.

Os ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes que são caracterizados pela sua capacidade para hibridizar (por exemplo, em condições muito ou moderadamente rigorosas) com (a) um ácido nucleico que codifica uma MAdCAM de primata (por exemplo, os ácidos nucleicos representados na Figura 1 (SEQ ID NO:1), Figura 2 (SEQ ID NO:3), ou Figura 3 (SEQ ID NO:5); (b) o complemento destes ácidos nucleicos, (c) uma porção deles, também podem codificar uma proteína ou polipeptídeo com pelo menos uma propriedade, actividade ou função 38 característica de uma MAdCAM de primata (tal como aqui definida), tal como função de ligação (por exemplo, a capacidade de se ligar à integrina α4β7), e/ou função de molécula de adesão celular (por exemplo, a capacidade de mediar a adesão celular como a adesão dependente de α4β7 in vitro e/ou in vivo), e/ou propriedades imunológicas aqui definidas. Os ácidos nucleicos preferidos têm comprimentos de pelo menos 40 nucleótidos, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 50 e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 75 nucleótidos. A função de ligação de uma MAdCAM de primata ou sua variante que é codificada por um ácido nucleico da presente invenção pode ser detectada por métodos padrão para ligação de ligandos (por exemplo, ensaios que monitorizam a formação de um complexo entre a MAdCAM recombinante e/ou isolada e a integrina α4β7) ou ensaios de adesão padrão (por exemplo, em que se monitoriza a adesão entre uma primeira célula que expressa uma MAdCAM de primata recombinante e uma segunda célula que tem uma integrina α4β7) ou outros métodos apropriados. Os ensaios de adesão e/ou de ligação ou outros ensaios adequados também podem ser usados em procedimentos para a identificação e/ou isolamento de ácidos nucleicos que codifiquem um polipeptideo da presente invenção (ver, por exemplo, Exemplo 1) . As propriedades antigénicas das proteínas ou polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos da presente invenção podem ser determinados por métodos imunológicos usando anticorpos que se ligam à MAdCAM de primata, como o immunoblotting, a imunoprecipitação e ensaios imunológicos (por exemplo, ensaio radioimunológico, ELISA). 39

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser usados na produção de proteínas ou polipeptídeos. Por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, ADN) que codifica uma MAdCAM de primata pode ser incorporado em várias construções e vectores criados para posterior manipulação de sequências ou para a produção do polipeptídeo codificado em células hospedeiras apropriadas tal como foi descrito.

Outra forma de realização da invenção é um ácido nucleico antisense que é complementar, na sua totalidade ou em parte, de uma molécula alvo contendo uma cadeia ('strand') sense e pode hibridizar com a molécula alvo. 0 alvo pode ser ADN ou o seu ARN (isto é, onde o ADN tem resíduos T o seu ARN te resíduos U). Quando introduzido numa célula, o ácido nucleico antisense pode inibir a expressão do gene codificado pela cadeia sense. Os ácidos nucleicos antisense podem ser produzidos por técnicas padrão.

Numa forma de realização particular, o ácido nucleico antisense é total ou parcialmente complementar do ácido nucleico alvo, em que o ácido nucleico alvo pode hibridizar com um ácido nucleico com a sequência do complemento da cadeia top representada na Figura 1 (SEQ ID N0:1), Figura 2 (SEQ ID N0:3), ou Figura 3 (SEQ ID N0:5) ou com uma porção suficiente para permitir a hibridização. Noutra forma de realização, o ácido nucleico antisense é total ou parcialmente complementar e pode hibridizar com um ácido nucleico alvo que codifique uma MAdCAM de primata.

Os ácidos nucleicos também podem ser usados como sondas (por exemplo, numa hibridização in situ) para avaliar associações entre uma doença inflamatória do intestino (IBD) (ou outras condições) e o aumento da expressão da MAdCAM de 40 primata em tecidos afectados. Os ácidos nucleicos também podem ser usados como sondas para detectar e/ou isolar (por exemplo, por hibridização com ADN ou ARN) variante polimórficas ou alélicas, por exemplo, numa amostra obtida a partir de um primata (por exemplo, tecido inflamado). Além disso, a presença ou frequência de uma determinada variante num ou numa amostras obtidas a partir de um ou mais primatas afectados, em comparação com um ou mais de primatas normais, pode ser indicativo de uma associação entre uma doença inflamatória do intestino (IBD) (ou outras condições) e uma determinada variante, que por sua vez pode ser usada no diagnóstico da condição.

Tal como descrito nos Exemplos, isolou-se um clone de cADN que codifica uma MAdCAM de macaco pela clonagem da expressão, e usou-se o cADN como sonda para testar uma biblioteca de cADN humano. Isolaram-se caracterizaram-se dois ácidos nucleicos distintos que codificam MAdCAM-1 humana. Podem-se obter mais genes ou cADN de humanos, macacos ou de outros primatas. Por exemplo, os genes aqui descritos, ou porções deles suficientes, quer isolados, quer recombinantes ou sintéticos, podem ser usados como sondas ou primers para detectar e/ou recuperar ácidos nucleicos adicionais que codificam MAdCAMs de primatas ou suas variantes a partir de uma fonte apropriada como bibliotecas de cADN ou genómicas de primatas, de acordo com os métodos aqui descritos ou por outros métodos adequados (por exemplo, por hibridização, PCR, clonagem de expressão ou outras técnicas adequadas).

Numa forma de realização, os ácidos nucleicos que codificam MAdCAM de primatas podem ser produzidos por métodos como amplificação por PCR. Por exemplo, primers apropriados 41 (por exemplo, um par de primers ou primers juntos 'nested') podem ser concebidos de modo a conter uma sequência que seja complementar ou substancialmente complementar a uma porção de um cADN de MAdCAM de primata aqui descrito. Por exemplo, podem-se conceber primers complementares ás terminações 5' ou 3' da sequência de codificação e/ou que estão no flanqueamento da sequência de codificação. Estes primers podem ser usados numa reacção em cadeia da polimerase com um ácido nucleico padrão apropriado de modo a obter um ácido nucleico que codifique uma MAdCAM de primata, por exemplo. Padrões ( 'templates') apropriados incluem, por exemplo, construções aqui descritas (como a pcD3PMAd, pcD3HuMAd-4 ou pcD3HuMAd-20), uma biblioteca de cADN ou outra fonte apropriada de cADN ou ADN genómico de primata (por exemplo humano). Os primers podem porções complementares de sequências de flanqueamento da construção seleccionada como padrão ou apropriada.

Podem-se usar genes ou cADN adicionais para expressar MAdCAM de primata, com finalidades correspondentes às aqui descritas, e podem ser usadas na produção de construções, células hospedeiras e anticorpos usando métodos aqui descritos. As abordagens aqui descritas, incluindo, mas não estando limitadas às abordagens usadas para isolar e manipular MAdCAM-1 humana e de macaco, para construir vectores e estirpes hospedeiras, e para produzir e utilizar as proteínas, para produzir anticorpos, etc., podem ser aplicadas a outros primatas. 42 Métodos e Composições Terapêuticos A presente invenção também providencia anticorpos que (1) se podem ligar a "MAdCAM de primata" in vitro ou in vivo; e/ou (2) podem inibir uma actividade ou função caracteristica de uma "MAdCAM de primata", como a função de ligação (por exemplo, a capacidade de se ligar à integrina α4β7), e/ou função de molécula de adesão celular (por exemplo, a capacidade de mediar a adesão celular como a adesão dependente de α4β7 in vitro e/ou in vivo) . Estes anticorpos incluem anticorpos que se podem ligar a uma MAdCAM humana ou de macaco codificada pelo cADN clone 4, cADN clone 20 ou cADN clone 31D. Também englobados estão anticorpos que se podem ligar a uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente ou endógena (por exemplo, MAdCAM humana). De preferência, os anticorpos são capazes de se ligar selectivamente a uma MAdCAM de primata in vitro e/ou in vivo (por exemplo, pela ligação selectiva a uma MAdCAM de primata expressa em tecidos da mucosa e/ou baço (por exemplo, tal como verificado imunohistologicamente) .

Numa forma de realização, os anticorpos podem-se ligar a MAdCAM de primata e inibir a ligação da "MAdCAM de primata" a uma integrina α4β7 (por exemplo, humana), inibindo assim a adesão celular mediada pela MAdCAM, de preferência selectivamente. Tais anticorpos podem inibir a adesão celular dependente de α4β7 a células com integrina α4β7, como os leucócitos (especialmente linfócitos como as células T ou B) in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, identificaram-se onze hibridomas que produzem anticorpos que inibem especificamente a adesão de células RPMI 8866 a MAdCAM-1 (Exemplo 2, hibridomas designados por 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 43 10F2, 10Δ6, 1Ε5, 2F5, 7G11). Assim, os anticorpos que podem inibir a adesão celular de células com integrina α4β7 a células endoteliais vasculares em tecidos de mucosa, incluindo tecidos associados ao intestino ou órgãos linfóides também estão englobados pelos anticorpos da presente invenção.

De preferência, os anticorpos podem-se ligar a uma MAdCAM de primata com elevada afinidade (por exemplo, um Ka no intervalo de cerca de 1 - 10 nM, ou um Kd no intervalo de cerca de 1 x 10"8 a 1 x IO'10 mol _1) .

Os anticorpos da presente invenção são úteis numa variedade de aplicações, incluindo aplicações em processos, pesquisa, diagnóstico e terapias. Por exemplo, podem ser usados para isolar e/ou purificar MAdCAM de primata ou suas variantes (por exemplo, por purificação de afinidade ou outros métodos adequados), e para estudar a estrutura (por exemplo, conformação) e função da MAdCAM.

Os anticorpos da presente invenção também podem ser usados para modular a função MAdCAM em aplicações de diagnóstico (por exemplo, in vitro) ou terapêuticas. Por exemplo, os anticorpos podem actuar como inibidores para inibir (reduzir ou prevenir) a função de ligação e/ou a função de molécula de adesão celular de uma MAdCAM de primata tal como aqui descrito.

Para além disso, os anticorpos da presente invenção também podem ser usados para detectar e/ou medir o nivel de uma MAdCAM de primata numa amostra (tecidos ou fluidos corporais, como um exsudado inflamatório, sangue, soro, fluidos do intestino, ou em células transfectadas com um ácido nucleico da presente invenção). Por exemplo, pode-se 44 obter uma amostra (por exemplo, tecido e/ou fluido) a partir de um primata e pode-se usar um método imunológico adequado para detectar e/ou medir os níveis de MAdCAM de primata, incluindo métodos como o Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), incluindo ensaios de quimioluminescência, ensaios radioimunológicos e imunohistológicos. Numa forma de realização, fornece-se um método para detectar uma MAdCAM de primata seleccionada numa amostra, que compreende fazer contactar uma amostra com um anticorpo que se liga com uma MAdCAM de primata isolada em condições apropriadas à ligação específica do referido anticorpo à MAdCAM de primata seleccionada e na detecção dos complexos anticorpo- MAdCAM formados.

Numa aplicação do método, podem-se usar os anticorpos reactivos com uma MAdCAM-1 de primata para analisar os tecidos normais versus inflamados em humanos e primatas não humanos quanto à reactividade e/ou expressão de MAdCAM de primata (por exemplo, imunohistologicamente). Assim, os anticorpos da presente invenção permitem métodos imunológicos de avaliação da expressão de MAdCAM de primata (por exemplo, MAdCAM-1 humana) em tecidos normais versus inflamados, através dos quais se pode avaliar a presença da doença, o progresso da doença e/ou a eficácia da terapia anti- MAdCAM-1 de primata na doença inflamatória. A presente invenção também providencia "MAdCAM de primata" tal como aqui definido, incluindo variantes funcionais, como MAdCAM de primata solúvel (por exemplo, sem toda ou parte da região transmembranar e cauda citoplasmática, como a da proteína segregada) e proteínas de fusão funcionais (por exemplo, imunoglobulinas híbridas que 45 contêm uma parte de MAdCAM de primata fundida no terminal-C, ao terminal-N de uma parte de imunoglobulina) . Estas moléculas são úteis numa variedade de aplicações incluindo, incluindo aplicações em processos, pesquisa, diagnóstico e terapias.

Por exemplo, podem-se usar, MAdCAM de primata, proteínas de fusão MAdCAM-Ig ou outras moléculas MAdCAM de primata solúveis recombinantes em ensaios para identificar ligandos ou inibidores (por exemplo, um anticorpo bloqueante) da interacção MAdCAM: α4β7 tal como é aqui usado, um inibidor é um composto que inibe (reduz ou evita) a ligação de MAdCAM-1 de primata a um ligando, incluindo integrina α4β7, e/ou que inibe o desencadear de uma resposta celular mediada pelo ligando. Uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para conseguir a inibição da ligação ou adesão de MAdCAM-1 de primata e/ou sinalização (por exemplo, uma quantidade suficiente para inibir a adesão de uma célula com um ligando de MAdCAM-1 de primata (incluindo integrinas α4β7, como a integrina α4β7 humana e os seus homólogos primatas)) para MAdCAM de primata isolada/ ou recombinante.

Num aspecto, fornece-se um método para detectar ou identificar um ligando de MAdCAM de primata ou um agente que se ligue a MAdCAM de primata, em que um (isto é, um ou mais) agente a ser testado (ou ligando candidato) é posto em contacto com "MAdCAM de primata" isolado e/ou recombinante, incluindo "variantes funcionais", tal como aqui definido, em condições apropriadas para ligação com o ligando e detecta-se a formação de um complexo entre o referido agente e a MAdCAM de primata. Numa forma de realização, um agente a ser testado é combinado com uma célula hospedeira que expressa MAdCAM de 46 primata recombinante ou uma variante funcional em condições apropriadas para ligação com o ligando. Numa forma de realização, a MAdCAM de primata ou uma variante funcional é marcada com um marcador apropriado (por exemplo, marcação fluorescente, marcação com isótopos) e determina-se a ligação pela detecção do marcador. A especificidade da ligação pode ser determinada por competição ou substituição, por exemplo, usando agente não marcado, uma MAdCAM de primata isolada e/ou recombinante ou uma variante funcional não marcada, ou um segundo ligando de MAdCAM de primata como competidor.

Noutro aspecto, fornece-se um método para detectar um inibidor de adesão celular mediada pela MAdCAM de primata. Numa forma de realização, um agente a ser testado é combinado com um ligando de MAdCAM de primata e uma MAdCAM de primata isolada e/ou recombinante ou uma variante funcional (por exemplo, proteína de fusão) em condições apropriadas para ligação ao ligando. A formação de um complexo entre o ligando e a MAdCAM de primata ou a variante funcional é monitorizada. Uma diminuição da ligação do ligando na presença de um agente em relação a um controlo adequado (por exemplo, ligação na ausência do agente) é indicativo que o agente é um inibidor. Por exemplo, as proteínas de fusão e os ensaios descritos no Exemplo 3 podem ser usados para detectar inibidores. Um agente a ser testado também pode ser combinado com uma primeira célula que expressa uma MAdCAM de primata recombinante e uma segunda célula com uma integrina α4β7 em condições apropriadas para a adesão da referida primeira célula à referida segunda célula. A adesão entre a referida primeira célula e a referida segunda célula pode ser monitorizada e a diminuição da adesão (redução ou extinção) 47 em comparação com um controlo adequado) é indicativo que o agente é um inibidor. Pode-se usar uma célula ou células que expressem naturalmente um ligando para MAdCAM-1, como um leucócito (por exemplo, um linfócito B α4β7+, linfócito T) ou outra célula que expresse ligando para MAdCAM-l (por exemplo, uma célula recombinante).

Ensaios como os descritos no Exemplo 3 podem ser usados para identificar compostos que inibem a ligação in vitro. Tal como aqui se mostra, as proteínas de fusão que contêm uma parte de MAdCAM de primata (duas fusões MAdCAM-Ig quiméricas) podem-se ligar a linfócitos positivos para α4β7 em solução. Assim, as MAdCAM de primata, incluindo variantes funcionais, em particular moléculas de MAdCAM de primata solúveis e proteínas de fusão como as fusões MAdCAM-Ig quiméricas descritas no Exemplo 3, fornecem inibidores candidatos da interacção α4β7: MAdCAM e do recrutamento de linfócitos in vivo para locais de inflamação, que podem ser úteis em terapia tal como descrito em baixo. A eficácia in vivo destas moléculas pode ser avaliada usando métodos aqui descritos (ver por exemplo, Exemplos 4 e 5) ou por outros métodos adequados. Por exemplo, podem-se usar modelos primatas como os descritos no Exemplo 5. 0 modelo CD45RBHl/SCID fornece um modelo de rato com semelhanças com a doença de Crohn e a colite ulcerosa (Exemplo 4, Powrie, F. et al., Immunity, 1: 553-562 (1994)). A eficácia deste modelo pode ser avaliada usando um protocolo experimental similar ao usado para os anticorpos monoclonais (Exemplo 4) . Podem-se avaliar os parâmetros como a inibição do recrutamento de células marcadas com mIn para o cólon e a redução do número de linfócitos T CD4+ na lamina própria do intestino grosso após 48 administração (por exemplo, intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.) e per oral (p.o.)). Também foram descritos ratos "knockout" que desenvolvem lesões intestinais similares às da doença inflamatória dos intestinos humana (Strober, W. and Ehrhardt, R.O., Cell, 75: 203-205 (1993)), e os ratos NOD providenciam um modelo animal para a diabetes mellitus insulino-dependente. A invenção também diz respeito à descoberta de que as doenças associadas com o recrutamento de leucócitos para o trato gastrointestinal, como o IBD, ou outros tecidos de mucosa podem ser tratados pela inibição da ligação de MAdCAM à integrina α4β7 e/ou do desencadeamento das respostas celulares mediadas pela α4β7. Os compostos ou agentes que inibem a ligação incluem "MAdCAM de primata" tal como aqui definida, incluindo particular moléculas de MAdCAM de primata solúveis e proteínas de fusão, bem como anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénios que se podem ligar à MAdCAM e/ou à integrina α4β7. Os anticorpos que se podem usar no método incluem anticorpos policlonais recombinantes ou não recombinantes, monoclonais, quiméricos, humanizados e/ou anti-idiotipicos.

Os anticorpos monoclonais que se ligam a MAdCAM ou a α4β7 já foram descritos. Por exemplo, MECA-367 é um anticorpo anti- MAdCAM do subtipo IgG2a e está descrito em Gallatin et al., Nature, 304: 30 (1983) e Michie et al., Am. J. Pathol., 143: 1688-1698 (1993). ACT-1 é um anticorpo monoclonal que se liga à integrina α4β7 (Lazarovits et al., J. Immunol., 133: 1857 (1984); Schweighoffer et al., J. Immunol., 151: 717-729 (1993) . O FIB 21 liga-se à cadeia β7 e está descrito e 49 caracterizado em Berlin et al., Cell, 74: 184-195 (1993); Andrew, D.P. et al., J. Immunol.,153: 3847-3861 (1994)).

Podem-se fazer outros anticorpos monoclonais ou policlonais, como os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo ou a um similar que os anticorpos acima descritos, de acordo com os métodos aqui descritos, métodos conhecidos no meio ou por outros métodos apropriados (tal como Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975), Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, NY) ou Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel et al., Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11 (1991)). Também se podem produzir anticorpos que possam competir com qualquer um dos anticorpos produzidos pelas linhas de células hibridomas 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5, ou 7G11 para se ligarem a uma célula com integrina α4β7, de preferência integrina α4β7 humana.

Por exemplo, os anticorpos podem ser dirigidos contra um imunogéneo apropriado num mamífero adequado (por exemplo, um rato, uma ratazana, coelho ou ovelha). Imunogéneos incluem, por exemplo, MAdCAM, α4β7 ou seus fragmentos imunogénicos. Por exemplo, pode-se produzir uma MAdCAM de primata ou uma variante e usá-la como imunogéneo para dirigir anticorpos num protocolo de imunização adequado.

As células produtoras de anticorpos (por exemplo, um linfócito) podem ser isoladas a partir, por exemplo, dos nódulos linfáticos ou do baço de um animal imunizado. As células podem então ser fundidas numa célula imortalizada apropriada (por exemplo, uma linha de células de mieloma) formando assim um hibridoma. As células fundidas podem ser 50 isoladas usando técnicas de cultura selectivas. As células que produzem anticorpos com a especificidade desejada podem ser seleccionadas com um ensaio adequado (por exemplo ELISA) (ver, por exemplo, Exemplo 2).

Numa forma de realização, o imunogéneo pode ser um anticorpo que se ligue, por exemplo, a uma MAdCAM, α4β7, ou seus fragmentos imunogénicos. O anticorpo criado pode ser um anticorpo anti-iodópico, que podem ser usados na presente invenção (Patente Estadunidense No. 4,699,880).

Patente

Também se podem usar nesta invenção, anticorpos de cadeia simples e quiméricos, humanizados ou primatizados (enxertados-CDR ou "resurfaced", como de acordo com a EP 0,592,406; Padlan et al., April 13, 1994) bem como anticorpos de cadeia simples enxertados-CDR bem como quiméricos, que contenham porções derivadas de espécies diferentes. As várias porções destes anticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam uma cadeia quimérica ou humanizada podem ser expressos de modo a produzir uma proteína contígua. Ver, por exemplo, Cabilly e tal., Patente Estadunidense No. 4,816,567; Cabilly et al., Patente Europeia No. 0,125,023 Bl; Boss et al., Patente Estadunidense No. 4,816,397; Boss et al., Patente Europeia No. 0,120,694 Bl; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger , M.S. et al., Patente Europeia No. 0,194,276 Bl; Winter, Patente Estadunidense No.,5,225,539; e Winter, Patente Europeia No. 0,239,400 Bl. Ver também, Newman, R. et al., BioTechnology, 10:1455-1460 (1992), que diz respeito a anticorpos primatizados e Ladner et al., 51

Estadunidense No. 4,946,778 e Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426 (1988)) que dizem respeito a anticorpos de cadeia simples.

Para além disso, também se podem produzir fragmentos funcionais de anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos de cadeia simples, quiméricos, humanizados ou primatizados. Fragmentos funcionais dos seguintes anticorpos retêm pelo menos uma função de ligação do todo o anticorpo do qual deriva e, de preferência, retêm a capacidade de inibir a interacção. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo capazes de se ligar à integrina α4β7, à MAdCAM, ou a porções suas incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2· Estes fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática ou por técnicas recombinantes. Por exemplo, a clivagem por papaína ou pepsina pode gerar fragmentos Fab ou F(ab')2? respectivamente. Em alternativa, os anticorpos podem ser produzidos numa variedade de formas truncadas usando genes de anticorpo em que foram introduzidos um ou mais codões stop a montante do seu local stop natural. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção de cadeia pesada F(ab')2 pode ser concebida para incluir sequências de ADN que codificam o domínio CHi e a região hinge da cadeia pesada.

Os anticorpos e os seus fragmentos de ligação aos antigénios que podem ser usados no método reivindicado incluem anticorpos que se ligam a MAdCAM e/ou α4β7, como anticorpos de cadeia anti- α4β7. Por exemplo, podem-se administrar anticorpos do grupo que inclui FIB 21, FIB 30, FIB 504 e ACT-1 e misturas deles. Em alternativa ou 52 adicionalmente, podem-se administrar fragmentos antigénio destes anticorpos.

Os compostos ou agentes que inibem a ligação de MAdCAM à integrina α4β7 podem ser administrados de acordo com o método reivindicado no tratamento de doenças associadas à infiltração nos tecidos de leucócitos (por exemplo, linfócitos, monócitos) (incluindo recrutamento e/ou acumulação de leucócitos nos tecidos) que expressam as moléculas MAdCAM-1. Uma quantidade eficaz de um composto ou agente (isto é, um ou mais) é administrada a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, como um humano ou outro primata) de modo a tratar essa doença. Por exemplo, doenças inflamatórias, incluindo doenças que estão associadas com a infiltração de leucócitos no trato gastrointestinal (incluindo endotélio associado ao intestino), outros tecidos de mucosa, ou tecidos que expressam a molécula MAdCAM-1 (por exemplo tecidos associados ao intestino, como as vénulas da lamina própria do intestino grosso e delgado; e glândulas mamárias (por exemplo, glândula mamária lactante), podem ser tratadas de acordo com o presente método. De igual modo pode-se tratar um indivíduo com uma doença associada à infiltração de leucócitos em tecidos em resultado da ligação de leucócitos às células (por exemplo, células endoteliais) que expressam a molécula de MAdCAM-1.

As doenças que podem ser tratadas de acordo com isto incluem a doença inflamatória do intestino (IBD), como a colite ulcerosa, doença de Crohn, ileíte, doença celíaca, Sprue não tropical, enteropatia associada com artropatias seronegativas, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite eosinofílica, ou 'pouchite' ('infecção da 53 bolsa') resultando de uma proctocolectomia e anastomose ileoanal. A pancreatite e a diabetes mellitus insulino-dependente são outras doenças que podem ser tratadas usando o presente método. Foi divulgado que a MAdCAM-1 é expressa por alguns vasos do pâncreas exócrino em ratos NOD (diabéticos não gordos) , bem como em ratos BALB/c e SJL. A expressão de MAdCAM-1 foi induzida no endotélio de ilhotas inflamadas do pâncreas de ratos NOD e a MAdCAM-1 foi a adressina predominantemente expressa no endotélio das ilhotas NOD nos estádios primários de insulite (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)). Para além disso, foi observada a acumulação de leucócitos que a α4β7 dentro das ilhotas, e a MAdCAM-1 foi implicada na ligação de células de linfoma via α4β7 em vasos das ilhotas inflamadas (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)).

Exemplos de doenças inflamatórias associadas com tecidos da mucosa que podem ser tratados de acordo com o presente métodos incluem mastite (glândula mamária), colecistite, colangite ou pericolangite (dueto biliar ou tecido circundante do tecido), bronquite crónica, sinusite crónica, asma e doença de enxerto versus hospedeiro (por exemplo no trato gastrointestinal) . Tal como se vê na doença de Crohn, a inflamação estende-se frequentemente para lá da superfície da mucosa, e assim sendo as doenças inflamatórias crónicas do pulmão que resultam da fibrose intersticial, como a pneumonite hipersensível, doença de colagéneo, sarcoidose, e outras condições idiopáticas, podem ser receptivas ao tratamento. 54 0 composto é administrado numa quantidade eficaz que inibe a ligação da MAdCAM à integrina α4β7. Para terapia, uma quantidade eficaz será suficiente para conseguir o desejado efeito terapêutico e/ou profiláctico (como uma quantidade suficiente para reduzir ou evitar a ligação e/ou sinalização mediada por MAdCAM, inibindo assim a adesão e infiltração de leucócitos e/ou as respostas celulares associadas). Os compostos podem ser administrados em doses únicas ou individuais. A dosagem pode ser determinada por métodos conhecidos no meio e é dependente, por exemplo, da idade, da sensibilidade, tolerância e bem-estar global do indivíduo. Doses adequadas para anticorpos podem ser de 0,1-1,0 mg/kg de peso corporal por tratamento.

De acordo com o método, um composto ou agente pode ser administrado a um indivíduo (por exemplo, um humano) sozinho ou em conjunto com outro agente. Um composto ou agente pode ser administrado antes, em conjunto ou depois da administração do agente adicional. Numa forma de realização, administra-se mais de um anticorpo monoclonal que inibe a ligação de leucócitos à MAdCAM endotelial. Em alternativa, administra-se um anticorpo monoclonal que inibe a ligação de leucócitos a ligandos endoteliais, para além do anticorpo anti- MAdCAM ou anti- β7. Por exemplo, também se pode administrar um anticorpo que inibe a ligação dos leucócitos a um ligando endotelial para além da MAdCAM, como um anticorpo anti-ICAM-1 ou anti-VCAM-1. Noutra forma de realização pode-se administrar um ingrediente farmacologicamente activo adicional (por exemplo, sulfasalazina, um composto anti-inflamatório, ou um composto anti-inflamatório esteróide ou 55 não esteróide) em conjunto com o composto ou agente (por exemplo, o anticorpo da presente invenção). São possíveis várias vias de administração incluindo, mas não estando necessariamente limitadas a, parenteral (por exemplo, injecção intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutânea), oral (por exemplo, alimentar), tópica, inalação (por exemplo, intrabronquial, inalação intranasal ou oral, gotas intranasais) ou rectal, dependendo da doença ou condição a ser tratada. A administração parenteral é o modo preferido de administração. A formulação de um composto a ser administrado irá variar de acordo com a via de administração seleccionada (por exemplo, solução, emulsão, cápsula) uma composição apropriada que contém o composto a ser administrado pode ser preparado num veículo fisiologicamente aceitável. Para soluções ou emulsões, veículos adequados incluem, por exemplo, soluções, emulsões ou suspensões aquosas ou alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de sódio e dextrose, Ringer com lactato ('lactated') ou óleos fixados. Veículos intravenosos podem incluir vários aditivos, conservantes, ou fluidos, nutrientes ou electrólito de enchimento (Ver, na generalidade, Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980). Para inalação, o composto pode ser solubilizado e carregado num dispensador adequado para administração (por exemplo, um atomizador, nebulizador ou dispensador aerosol pressurizado). 56

EXEMPLIFICAÇÃO A presente invenção será agora ilustrada por meios dos seguintes exemplo, que não pretendem de modo algum ser limitativos.

Introdução

Estudos de hibridização usando zoo blots com sondas de ADN de MAdCAM de murideo em condições pouco rigorosas ('low stringency') indicaram que a conservação de nucleótidos entre a MAdCAM-1 de murideo e de espécies mais evoluídas era fraca. Usou-se uma aproximação de expressão funcional para clonar homólogos de humanos e primatas, em que foram identificadas células transfectadas com cADNs que conferem a capacidade para aderir a uma linha celular de linfócitos alvo que expressam elevados níveis de ligando MAdCAM-1 (α4β7) e os cADNs foram recuperados. Como as fontes de tecido humano eram escassas, identificou-se primeiro um homólogo primata de MAdCAM-1.

Para clonagem de expressão, fez-se uma biblioteca de expressão de cADN de primata, derivada de nódulos linfáticos mesentéricos de um macaco num vector de expressão eucariótico pRSVsport (de Gibco/BRL). Usou-se um sistema de transfecção de elevada eficiência usando a linha celular CHO/P (Heffernan, M. e J.D. Dennis, Nucleic Acids Res., 19: 85-92 (1991)) . A biblioteca foi separada e conjuntos individuais (representando aproximadamente 1500 clones) foram transfectados em poços de placas de cultura de tecidos de 24 poços. Fizeram-se ensaios de adesão celular para identificar cADNs que conferem um fenótipo adesivo nas linhas celulares T e B que expressam a integrina α4β7, um conhecido ligando de 57 MAdCAM-l. Identificou-se a adesão microscopicamente pela rosetagem das linhas celulares T e B nas células tranfectadas. Um conjunto conferindo o desejado fenótipo foi sub fraccionado até se identificar um único clone de cADN com todo o comprimento designado clone 31D. A seguenciação do ADN da porção amino-terminal do cADN revelou homologia entre o clone de macaco e a MAdCAM-l de murideo (Briskin, M.J., et al, Nature (Lond.), 363:461-464 (1993)) guer ao nível proteico quer de ácido nucleico.

Quando introduzido em células CHO/P por transfecção transitória, o enxerto de ADN obtido do clone 31D dirigiu a expressão de uma proteína que podia mediar a ligação de duas linhas celulares que expressam α4β7: (1) TK1 uma célula T de linfoma de murideo (Butcher, E.C., et al., Eur. J. of Immunol., 10: 556-561 (1980)); e (2) RPMI 8866, uma célula B de linfoma humano (Erle, D.J., et al., J. Iimunol., 153: 517528 (1994) . A ligação de células TK1 a células transfectadas com o cADN de macaco pode ser bloqueada por anticorpos quer para as intergrinas a4 (MAb PS/2) quer para β7 (MAb FIB 504) e a ligação das células RPMI 8866 a células CHO/P transfectadas de forma transitória com cADN de macaco (clone 31D em pSV-SPORT) foi bloqueada pelo anti- α4β7 MAb, ACT-1. Nas experiências controlo, um cADN que codifica o VCAM-1 não conseguiu ligar-se à linha celular B humana RPMI 8866. Observou-se que células Jurkat, uma linha de células T que expressam α4β1 mas não α4β7 se ligam a VCAM-1, mas não se ligam a transfectantes que expressam cADN de macaco.

Usou-se o cADN que codifica um homólogo de primata (macaco) de MAdCAM-l de murideo como sonda para obter um clone que codifica um homólogo humano por hibridização. Para 58 obter um clone MAdCAM-l humano construíram-se duas bibliotecas de ADN, uma derivada de gânglio linfático mesentérico humano histologicamente normal (MLN) e outra derivada de um gânglio linfático MLN inflamado de um paciente com doença de Crohn, no vector fágico ÀZiplox da Gibco/BRL. 0 cADN do clone de macaco foi usado para testar estas bibliotecas. Foram isolados dois diferentes clones de cADN humano de tamanho semelhante. Estes clones pareciam ambos de tamanho completo pela análise de sequência preliminar. A análise dos cADNs de MAdCAM-l humano e de macaco indicou que cada uma das proteínas codificadas tem uma sequência líder hidrofóbica prevista (sublinhada nas Figuras 1-3) com as restantes porções das proteínas correspondendo à MAdCAM-l humana ou de macaco madura prevista, respectivamente.

Para determinar a função, os enxertos de cADN humano foram subclonados em vectores de expressão pCDNA3 (Invitrogen) e usaram-se ensaios de expressão transitória para demonstrar a função. Os cADNs humanos podem ser expressos como proteínas funcionais e são capazes de mediar a ligação específica a células que expressam α4β7. Assim sendo, estes dois clones de cADN humanos são designados com cADNs de MAdCAM-l humanos

Geraram-se transfectantes estáveis de cADNs de primata e humano numa linha de células pré-B de rato, em células Ll-2 e CHO. Usaram-se transfectantes Ll-2 para imunizar ratos e gerar anticorpos monoclonais contra a MAdCAM-l humana. Identificaram-se anticorpos capazes de inibir a interacção entre MAdCAM-l e α4β7 A produção de anticorpos de bloqueamento dirigidos contra a MAdCAM-l humana é um avanço significativo, pois tentativas anteriores para produzir estes 59 anticorpos de bloqueamento com reacção cruzada com o homólogo humano usando MAdCAM-l de murídeo falharam.

Exemplo 1. Clonaqem de cADNS de MAdCAM-1 de Macaco e Humano

Isolamento e Selecção de ARN de mensagem

Isolou-se ARN total de (a) gânglios linfáticos mesentéricos de primata (macaco) (MLN); (b) gânglios linfáticos mesentéricos humanos histologicamente normais; (c) gânglios linfáticos mesentéricos humanos (gânglio ileal inflamado) de um paciente com doença de Crohn; e (d) células de cultura de tecidos usando o reagente CsTFA™ (trifluoroacetato de césio) (Pharmacia; Cat.#17-087-02) . Obteve-se ARN total de gânglios linfáticos mesentéricos a partir de duas espécies de macacos (Macaca fascicularis e Macaca mulatta) e foi combinado antes do isolamento de ARN poli-A. 0 tecido foi primeiro rapidamente congelado em azoto liquido e sujeito a homogeneização numa solução que consiste em 5,5 M isotiocianato de guanidinio, 25 mM de citrato de sódio, 0,5% de sarcosina laurel de sódio e 0,2M de 2-mercaptoetanol, enquanto se lavaram as células da cultura de tecidos (l-5xl08) uma vez em solução salina de fosfato tamponada (PBS) e homogeneizada por pipetagem. Um lisado clarificado foi depois posto em camada numa almofada de CsTFA e o ARN total foi recolhido por centrifugação durante 20 horas a 30000 rpm.

Seleccionou-se o mARN pelo sistema de isolamento de mARN polyATract da Promega. O sistema utiliza um primer oligo (dT) biotinilado para hibridizar (em solução) com caudas poli A de mensagens eucarióticas. Capturaram-se os híbridos e foram 60 lavados em condições muito rigorosas (elevada 'stringency') usando estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas e um aparelho de separação magnética. Seleccionou-se o mARN por uma purificação simples neste sistema e os rendimentos foram de 1-2% do rendimento total de ARN total. A integridade quer do ARN total quer do ARN foi analisada por electroforese de gel e coloração com brometo de etídio.

Síntese de cADN O cADN foi sintetizado usando o sistema Superscript™ lambda (Cat. #18256-016) em conjunto com o vector ÀZiplox da (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD, Cat#19643-014) no caso de bibliotecas humanas ou com o vector pSV-SPORT-1 da (Gibco/BRL, Cat#15388-010) no caso de bibliotecas de bibliotecas de macaco. Fizeram-se as seguintes modificações em relação ao protocolo padrão. O cADN foi marcado apenas na primeira ou segunda cadeia (mas não em ambas) com a p-dCTP e fizeram-se estimativas da quantidade por inspecção com coloração com brometo de etídio de alíquotas de fracções de cADN.

Sequenciação de ADN

Os cADNs de MAdCAM-1 humano e de macaco completos foram primeiro isolados nos vectores da biblioteca pSV-SPORT-1 e pZLl (resgatado de ÀZiplox™), respectivamente. Com base no mapa de restrição, subclonaram-se fragmentos em vectores Bluescript™ (Stratagene) para facilitar a sequenciação das regiões internas dos cADNs. Depois da análise de sequência destes clones, fizeram-se primers de oligonucleótidos para completar a sequência. Obtiveram-se sobreposições de 61 sequências de ambas as cadeias. A análise de sequência utilizou o kit de sequenciação de ADN sequenase™ 7-deaza-dGTP com a versão de sequenase 2.0 T7 DNA polymerase (United States Biochemical) e 35S-dCTP (Amersham Life Science and New England Nuclear). Também se usaram o kit delta TAQ sequencing (USB) e gamma 35P-ATP (Amersham) de sequências ricas em G-C, para sequências ricas em G-C.

As sequências foram analisadas usando o sistema Lasergene (DNASTAR, Inc.). Fizeram-se os alinhamentos de sequência de nucleótidos pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos Weighted, usando um intervalo de área ( 'gap penalty') de 10 e um intervalo de área de comprimento ('gap length penalty') de 10, e parâmetros por defeito (parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=2, área de intervalo=5, janela=4 e diagonais salvas=4).

Fizeram-se os alinhamentos de sequência de aminoácidos pelo método de Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando um intervalo de área ('gap penalty') de 10 e um intervalo de área de comprimento ('gap length penalty') de 10, e parâmetros por defeito (parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5).

Preparação da biblioteca de expressão de macaco O procedimento de fraccionamento de tamanho também foi ligeiramente modificado para a construção da biblioteca de expressão de macaco de modo a assegurar enxertos de grande tamanho (>1,5 kb).Após uma volta de fraccionamento, guardou-se apenas a primeira fracção (a maior) de ADN e as restantes porções foram reunidos e sujeitos a uma nova volta de 62 fraccionamento. A fracção de topo da volta seguinte foi reunida com a fracção de topo da volta anterior e segunda fracção desta volta também foi usada. Estas duas fracções foram precipitadas e postas em ligações com o vector pSV-SPORT-1 e uma fracção de cada ligação foi transformada para bactérias DH10B electrocompetentes (Gibco) para fazer uma estimativa quer do titulo da biblioteca quer do tamanho médio do enxerto. As estimativas da ligação apenas da fracção de cADN topo maior revelaram o potencial de fazer até 2,4 milhões de clones independentes com um tamanho médio de enxerto de 1,9 kb e um tamanho mediano de 2 kb. A biblioteca real testada consistia em 150 000 clones independentes que são plaqueados com uma densidade de 1 500 clones/placa em placas de agar 100 LB (para gerar 100 conjuntos de 1 500 clones/conjunto) com ampicilina a 50 pg/ml e cresceram durante a noite a 37°C. Para purificação de conjuntos individuais, em cada placa foi posta uma camada com aproximadamente 2 ml de caldo Luria (LB) e as colónias foram raspadas de cada placa com um raspador de células de cultura de tecidos padrão e as suspensões bacterianas foram transferidas para tubos de microfuge. Antes da purificação, gerou-se um stock de glicerol a partir de cada conjunto. Purificaram-se os ADNs de plasmideos usando colunas QIAprep spin (QIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante.

Transfecções

Semearam-se células CHO/P (Heffernan, M. e J.D. Dennis, Nucleic Acids Res., 19:85-92 (1991)) em placas de 24 poços aproximadamente 24 horas antes da transfecção com uma densidade de 40 000 células/poço. Os ADNs foram 63 transitoriamente transfectados usando o reagente LipofectAMINE™ (GIBCO; Cat #18324-012), seguindo essencialmente o protocolo recomendado com posterior optimização para placas de 24 poços como se segue: diluíram-se 200 ng de ADN (representando quer um conjunto de plasmídeos quer ADNs controlo purificados) para 20 μΐ com meio de soro reduzido Opti-MEM-1 (GIBCO) e para 20 μΐ de uma mistura que consiste em 18 μΐ de Opti-MEM-1 e 2 μΐ reagente LipofectAMINE™. Esta mistura de lipossomas foi então incubada durante aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente após o que se adicionou 200 μΐ de Opti-MEM-1 e a mistura foi depois sobreposta num poço de células CHO/P e voltaram para a incubadora. Depois de uma incubação de 2,5 horas a 37°C, adicionou-se 240 μΐ de meio MEM-α (Gibco) com 20% de soro fetal de vitelo (FCS) a cada poço e as células foram incubadas durante mais 18-24 horas a 37°C. Os meios foram depois mudados para meio MEM-α padrão com 10% de FCS, e fez-se o ensaio de adesão aproximadamente 20-24 horas depois.

Ensaios de adesão para clonaqem de expressão

Para os ensaios de adesão nos testes clonagem de expressão, usou-se a TK1 célula T de linfoma de murídeo que expressam elevados níveis de α4β7 (Butcher, E.C., et al., Eur. J. Inmunol., 10: 556-561 (1980)) para detectar células CHO/P transfectadas com cADNs capazes de conferir um fenótipo adesivo. As células TK1 foram resuspensas até uma densidade de 2xl06/ml num tampão de ensaio que consistia em HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, sem Ca2+ou Mg2+) , suplementada com 2% de soro de vitelo, 20 mM de HEPES, pH 7,3, 2 mM Mg2+, e 2 mM Ca2+. Cada poço transfectado com um conjunto de ADN foi pré- 64 incubado com 0,25 ml de um sobrenadante combinado contendo anticorpos monoclonais para a VCAM-1 humana (MAb 2G7; Graber, N. T., et al., J. Immunol., 145:819-830 (1990)) e MAdCAM-l de murideo (MAb MECA-367; American Type Culture Collection (Rockville, MD), No. de Acesso HB9478; Streeter, P.R., et al., Nature, 331:41 (1988)); ver também Patente Estadunidense No. 5,403,919 para Butcher) de modo a eliminar a adesão mediada por VCAM-1(que é expressa em elevados níveis nos gânglios linfáticos dos primatas) ou qualquer potencial plasmídeo de expressão de MAdCAM-l de murideo contaminante. Depois de incubação a 4°C durante 15 minutos, adicionou-se O, 25 ml da suspensão de células TKl (5xl05 células TKl) a cada poço e continuou-se a incubação numa plataforma oscilante durante mais 30 minutos a 4°C. As placas foram lavadas invertendo-as suavemente num grande recipiente com solução salina fosfatado tamponada (PBS) seguida da inversão num recipiente de PBS com 1,5% de glutaraldeído para fixação num mínimo de 1 hora. Os poços foram então examinados microscopicamente (objectiva lOx) para de células TKl.

Purificação de clones de macaco

Conjuntos com uma ou mais rosetas de TKl foram subfraccionados usando o seguinte protocolo: O ADN representativo de um conjunto positivo foi re-transformados em DH10B e plaquearam-se noventa e seis placas de 100 mm com uma densidade de aproximadamente 200 colónias/placa. Usaram-se filtros de nitrocelulose para gerar réplicas das placas, e um conjunto de cada placa foi depois sujeito a purificação de ADN e subsequentes ensaios de adesão tal como descrito em cima. Uma placa réplica representativa de um conjunto 65 positivo foi depois subfraccionada em conjuntos de 5 colónias, em que cada plaqueadas com réplicas e cresceram durante a noite em meio LB com ampicilina Depois de mais uma volta de purificação de ADN e de ensaios de adesão, os clones individuais puderam então crescer e identificaram-se os clones que conferiam adesão às células TK1.

Obteve-se um clone de comprimento total que se verificou codificar a MAdCAM-1 e foi designada como clone 31D. 0 clone 31D, construído em pSV-SPORT-1 (P25) , contém um enxerto de cADN 5'-SalI para Noti-3'. Obtiveram-se transformantes de E. coli estirpe DH10B contendo o clone 31D. Para expressão em linhas de células estáveis, este cADN foi subclonado para o vector de expressão pcADN-3 (Invitrogen), que contém um gene de neo resistência adequado para selecção G418. Em particular, o enxerto de clone 31D foi libertado por digestão com EcoRI (5') e Notl e inserido em pcADN-3 que foi clivado com EcoRI e Notl para obter pcD3pMAd.

Resultados

Construiu-se uma biblioteca de expressão de cADN, dividida em conjuntos de 1500 clones independentes, a partir de mARN purificado de gânglios linfáticos mesentéricos de macacos (MLNs). Cada conjunto foi transitoriamente transfectado para a linha de células CHO/P e 48 horas após a transfecção, fez-se um ensaio de adesão a células usando as TK1 de células T de linfoma de murídeo. Como a VCAM-1 é expressa em MLNs, os ensaios foram feitos na presença de anti-VCAM-1 MAb 2G7 (Graber, N.T., et al., J. Immunol., 145:819-830 (1990)). Adicionalmente, fizeram-se ensaios a 4°C de modo a eliminar a adesão mediada por cADNs ICAM (as células TK1 expressam elevados níveis de LFA-l e a LFA-l não é funcional a 4°C). 0 exame microscópico dos ensaios revelou vários poços com rosetagem visível de células TK1. Escolheram-se dois poços para posterior análise repetindo a transfecção e determinando se a ligação mediada pelos conjuntos pode ser bloqueada por MAbs anti~87ou anti-a4. A ligação de TK1 a um dos conjuntos foi completamente inibida pela pré-incubação das células TK1 quer com anti-a4 MAb PS/2 ou anti-βν MAb FIB 504. Este conjunto foi sujeito a três voltas de subfraccionamento até se isolar um único clone, chamado 31D. O clone 31D purificado mediou a ligação de células TKl que podia ser inibida por anticorpos anti-a4 ou anti-p7. O tamanho de enxerto do clone 31D era aproximadamente 1,8 kb. A sequenciação do terminal amino revelou várias características consistentes com um homólogo de primata de MAdCAM-1 de murídeo. Os peptídeos sinal tinham ambos 21 aminoácidos de comprimento. Apesar da similaridade de aminoácidos encontrada ser de 48%, a identidade era de 71% se se considerassem as substituições não conservativas. Para além disso, a proteína codificada pelo clone 31D tinha uma característica única dos receptores de adesão da família Ig: dois pares de cisteínas separadas por 3-4 (3 neste caso) aminoácidos no primeiro domínio imunoglobulina. Por fim, 8 aminoácidos terminal-C para as primeiras duas cisteínas é uma extensão de 9 aminoácidos que são idênticos a uma sequência na MAdCAM-1 de murídeo. Dentro desta região estava a sequência LDTSL, que se alinha com um motivo consensus para as interacções integrina/ membros da família Ig. Apesar deste motivo ter conservação geral em relação a outros receptores 67 de adesão Ig como ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 e VCAM-1 (Osborn, L., et al., J. Cell. Biol, 124:601-608 (1994); Renz, M.E., et al., J. Cell. Biol., 125:1395-1406 (1994)), esta exacta sequência foi encontrada apenas em MAdCAM-1 de murídeo. O significado funcional deste motivo é sugerido pelo facto de um ponto de mutação que altera a primeira L (leucina) do motivo no aminoácido 61 por uma R (arginina) na MAdCAM-1 de murideo tem um efeito dramático na MAdCAM-1: ligação à α4β7 (não representada). Os resultados dos estudos funcionais em conjunto com estas caracteristicas de sequências indicam que o clone 31D codifica um homólogo de MAdCAM-1 de murideo.

Testes da biblioteca de fagos humanos e purificação de clones humanos

Construiram-se bibliotecas de cADN fágico humano no vector ÀZiplox™ (GIBCO/BRL). O cADN foi feito a partir de ARN isolado de gânglios linfáticos mesentéricos (MLN) quer normais quer inflamados tal como descrito em cima. O cADN foi sintetizado como se refere em cima, ligado no vector fágico, e titulado na estirpe bacteriana Y1090 (ZL) ("ZL"= Ziplox). Testaram-se filtros duplicados com aproximadamente 500 000 clones independentes (50 000 clones/filtro) quer das bibliotecas de fagos MLN normais quer das de Crohn com cADN de MAdCAM-1 de macaco com comprimento total.

Para preparar a sonda, retirou-se um fragmento de -1,7 kb EcoRI-Notl do clone 31D e isolou-se usando GeneClean (BIO 101) . O fragmento foi marcado com a32P-dCTP por priming com hexâmeros aleatórios (Maniatis et al., In: Moleculer Cloning (Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1990)) .

As condições de teste foram as seguintes: 50 000 clones fágicos foram plaqueados em placas de petri de 150 mm contendo agar NZYCM (Gibco/BRL). Após incubação entre 7-16 horas, as placas foram sobrepostas com 132 mm de filtros de nitrocelulose (Schleicher e Schuell, Keene, NH) durante 2 minutos e depois cinco minutos para transferir o primeiro e segundo levantamento (duplicado) de clones fágicos, respectivamente. Os filtros foram depois ensopados durante 5 minutos numa solução desnaturante (1,5 M de cloreto de sódio, 0,5 N de hidróxido de sódio) seguido de neutralização em 1,5 M de cloreto de sódio, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5. Os filtros foram secos ao ar durante 15 minutos e depois seco sob vácuo durante 2 horas a 80°C.

Os filtros foram pré-hibridizados durante 2 horas a 55°C em 2M Na2HP04, 0,5% SDS, 5% de Denhardt (lx solução de Denhardt em 0,02%de albumina de soro de bovino, 0,02% ficoll e 0,02% polivinil-pirrolidona) , 1 mM EDTA e 50 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e subsequentemente hibridizados durante a noite a 55°C no mesmo tampão. Os filtros foram lavados à temperatura ambiente e 2x SSC, 0,1% SDS (lx SSC é 0,15 M cloreto de sódio, 0,015 M citrato de sódio), seguido por três a quatro lavagens a 65°C em 0,lx SSC e 0,1% SDS. Os filtros foram monitorizados com um contador Geiger para ver que o fundo foi reduzido.

Os clones positivos foram purificados em placa, e o plasmideo contendo pZLl contendo o enxerto de cADN foi resgatado usando o sistema de recombinação CRE LOX (GIBCO) (plasmideo pZLl está contido dentro do corpo do vector lambda Ziplox). Em particular, uma placa de fago purificada foi suspensa em 200 μΐ de tampão de fagos (20 mM Tris HC1, pH 69 7,5, 145 mM NaCl, 8 mM MgS04*7H20, 0,01% gelatina) durante 5 minutos à temperatura ambiente. Depois adicionou-se 20 μΐ de suspensão fágica a 100 μΐ de uma cultura com uma noite de DH10B (ZL) e incubou-se mais 5 minutos. As diluições da mistura foram depois plaqueadas em placas LB, suplementadas com ampicilina a 50 pg/ml e 10mMMgCl2, e incubadas durante a noite a 30°C. Fizeram-se crescer colónias únicas, que agora contêm o enxerto de cADN no vector pZLl, como culturas padrão crescidas durante a noite e os plasmideos foram purificados usando reagentes de purificação de plasmideos Qiagen.

Identificação de distintos clones de cADN de MAdCAM-1 humano funcionais

Testaram-se duas bibliotecas de cADN humano de gânglios linfáticos mesentéricos humanos histologicamente normais e gânglios linfáticos mesentéricos inflamados de um doente com a doença de Crohn usando o cADN de MAdCAM-1 de macaco completo como sonda. Um clone de hibridização cruzada foi isolado a partir da biblioteca normal, e dois clones de hibridização cruzada foram isolados a partir da biblioteca de Crohn. Um dos dois isolados da biblioteca de Crohn tinha cerca de 1,3 kb, parecia ser incompleto no terminal 5' e não foi sequenciado. O clone da biblioteca normal (clone 4) era ligeiramente maior (1624 pb) que o clone mais comprido (1558 pb) isolado da biblioteca de Crohn (clone 20). Apesar destes dois cADNs diferirem no tamanho em aproximadamente 100 pb, as suas sequências não traduzidas 3' e 5' eram praticamente idênticas no comprimento. Cada clone parecia ter o comprimento completo, pois ambos continham uma sequência 70 sinal amino-terminal que era quase idêntica à sequência de macaco.

Para além disso, a sequenciação preliminar demonstrou que as mesmas caracteristicas distintivas do domínio tipo-Ig amino-terminal do cADN de primata. Como as diferenças no tamanho destes clones não podem ser atribuídas ao comprimento das sequências não traduzidas, parece provável que a variação resida na sequência de codificação.

De modo a determinar se cada clone codificava uma MAdCAM-lhumana funcional, os enxertos de cada clone foram subclonados em vectores de expressão pCADN-3 (Invitrogen, San Diego, CA) , que tem um gene de neo resistência apropriado para selecção G418. Os cADNs humanos (que foram feitos usando primers Notl oligo-dT na terminação 3', e adaptadores Sall na terminação 5') foram ligados no vector λζίρίοχ, que contém o plasmídeo pZLl Os vectores pZLl com enxertos de cADN foram resgatados tal como em cima. Para a subclonagem, os enxertos dos clones 4 e 20 foram libertados por digestão a partir da estrutura de pZLl com EcoRI e Notl. Os fragmentos EcoRI-Notl (5'->3') foram isolados por Geneclean (Bio 101) seguido por electroforese num gel de agarose a 1% e os fragmentos foram ligados em pcADN-3 que foi clivado com EcoRI e Notl. A mistura de ligação foi usada para transformar uma estirpe DH10B E. coli Max eficiência (GIBCO) e os transf ormantes foram obtidos a seguir à selecção em agar LB suplementado com 50pg/ml de ampicilina (Amp). Obtiveram-se plasmídeos designados pcD3huMAd4 (enxerto do clone 4) e pcD3huMAd20 (enxerto de clone 20) e foram analisados com enzimas de restrição. 71 0 clone pcD3huMAd4 (enxerto do clone 4) ou o pcD3huMAd20 (enxerto do clone 20) foi transfectado transitoriamente em células CHO/P. Cada clone dirigiu a expressão de uma proteína funcional que pode mediar a ligação e adesão, tal como foi verificado pela adesão de transfectantes CHO/P a células RPMI 8866 células B de linfomas humanas (Figura 5) ou a células TK1 (não mostrado). A adesão de transfectantes CHO/P a células RPMI 8866 foi bloqueada pela pré-incubação com 3η^-α4β7 MAb ACT-1, mas não por IgG controlo. A adesão de transfectantes a células TK1 foi bloqueada por anti-p7 MAb FIB 504. Estes resultados indicam que o clone 4 (de uma biblioteca de gânglios linfáticos mesentéricos normais) e o clone 20 (de uma biblioteca de Crohn) codificam cada um proteínas MAdCAM-1 funcionais. Para caracterizar estes cADNs distintos, ambos os clones foram completamente sequenciados.

Resultados

Os cADNs dos Clones 4 e 20, que codificam a MAdCAM-1 humana, têm o comprimento del628 pb e 1543 pb, respectivamente. O cADN do Clone 4 (Figura 1; SEQ ID NO:l) contém uma estrutura de leitura (' reading trame') aberta de 1218 pb que codifica uma proteína prevista de 406 aminoácidos (SEQ ID NO:2), e uma região 3' não traduzida de 410 pb, mas não contém região 5' não traduzida. O cADN do Clone 20 (Figure 2; SEQ ID NO:3) contém 4 pb de sequência não traduzida 5', uma estrutura de leitura aberta de 1146 pb que codifica uma proteína prevista de 382 aminoácidos (SEQ ID NO:4), e uma região 3' não traduzida de 393 pb. As massas moleculares previstas das proteínas codificadas, após a 72 clivagem de uma sequência sinal prevista de 18 aminoácidos são 40 910 (clone 4) e 38 375 (clone 20) daltons.

Fizeram-se alinhamentos múltiplos para analisar o grau de similaridade entre as diferentes espécies clonadas de MAdCAM-1. Os alinhamentos de nucleótidos revelaram uma similaridade de sequência de 81.9% entre os cADNs de MAdCAM-1 de rato e ratazana, 41.8% de similaridade entre os cADNs de rato e de macaco, 42.1% de similaridade entre os cADNs de MAdCAM-1 de murideo e humano (Clone 4), e 41.8% de similaridade entre os cADNs de MAdCAM-1 de murideo e humano (Clone 20) . O alinhamento das sequências de nucleótidos de MAdCAM-1 com os cADNs dos Clone 4 e Clone 20 revelaram similaridades de sequências de 70.7% e 75.0%, respectivamente.

Determinou-se que as similaridades da sequência de aminoácidos eram de 7 8.5% entre a MAdCAM-1 o rato e a ratazana, 44.3% entre o rato e o macaco, e 39% entre o murideo e a MAdCAM-1 codificada pelo Clone 4 humano.

As comparações do cADNs dos clones 4 e 20 revelaram uma região que é homóloga do domínio mucina da MAdCAM-1 de murideo, devido à prevalência de resíduos de serina, treonina e prolina (69% para o clone 4 e 76% para o clone 20) (englobados em caixa nas Figuras 1 e 2) . Esta região, apesar de similar na composição em aminoácidos em relação à MAdCAM-1 de murideo, é altamente divergente da MAdCAM-1 de murideo. O domínio tem 71 aminoácidos de comprimento no clone 4, e 47 aminoácidos de comprimento no clone 20. Esta região também tem dois polimorfismos: (1) um polimorfismo no aminoácido 240, que é a prolina (P) no clone 4 e a serina (S) no clone 20; e (2) um polimorfismo no aminoácido 242, que é a asparagina (N) no clone 4 e aspartato (D) no clone 20. Para 73 além disso, os domínios de mucina humanos contêm uma repetição de 8 aminoácidos que consiste na sequência PPDTTS(Q/P)E, que aparecem oito vezes no clone 4 e cinco vezes no clone 20.

Para determinar a origem dos clones 4 e 20, usaram-se primers PCR que estão nos flancos da repetição para amplificar o ADN genómico humano. Usaram-se os seguintes primers: 5'-CTC TAC TGC CAG GCC ACG-3' (Primer #1, SEQ ID NO:7) 5'-AGC CTG GGA GAT CTC AGG G-3' (Primer #2, SEQ 1D NO:8) 5'-GCC ACG ATG AGG CTG CCT GG-3' (Primer #3, SEQ ID NO:9)

5'-GTG GAG CCT GGG CTC CTG GG-3' (Primer #4, SEQ ID NO:10)

Os primers eram primers juntos 'nested'. Na primeira reacção usaram-se os primers 1 e 2. Para a segunda reacção de amplificação preparou-se uma diluição 1:1000 da primeira reacção e usou-se 1 μΐ com os primers 3 e 4. As reacções de amplificação continham 0.5 pg de ADN genómico, 10 picograma de plasmídeos controlo (pcD3HuMAd4 ou pcD3HuMAd20), ou aproximadamente 1 ng de cADN de cadeia dupla que foi preparado anteriormente para as bibliotecas ZipLox. O ADN genómico foi obtido de três fontes (Promega; ClonTech, e por purificação de células Jurkat). As condições de amplificação foram: um ciclo durante 5 minutos a 94°C; 25 ciclos a 94°C durante 45 segundos; 60°C durante 45 segundos e 72°C durante um minuto seguido de um ciclo durante 5 minutos a 72°C.

As reacções de amplificação do ADN genómico originaram duas bandas que co-migraram com os produtos individuais das reacções PCR que usaram quer cADN do clone 4 quer clone 20 74 como padrão. Estes dados sugerem que os dois clones de cADN são isoformas codificadas pelo ADN genómico e provavelmente são gerados por união ('splicing') alternativa ou pela transcrição de dois alelos diferentes. Há documentação de extenso polimorfismo e divergência de sequências noutras sequências de mucina (por exemplo, Hilkens, J. et al., Trends, Biochem. Sei, 17: 359-363 (1992)). Por exemplo, porções repetitivas de mucinas intestinais não são bem conservadas entre roedores e humanos (Gum, J.G. et al., J. Biol. Chem., 266: 22733-22738 (1991)). Um sinal que, com base na análise da estrutura genómica de murideo, o ADN genómico humano pode conter um intrão nesta região. Se assim for, os primers PCR usados nesta experiência iriam transpor o intrão e não se espera que a amplificação de ADN genómico humano produza bandas com o mesmo tamanho das produzidas pelos cADN controlos. 0 isolamento e a análise de clones MAdCAM-1 genómico humanos pode, definitivamente, excluir um artefacto de clonagem. Podem-se fazer outras avaliações de tecidos normais e/ou inflamados de indivíduos normais e de pacientes com IBO, doença de Crohn ou outras condições inflamatórias para determinar se há uma correlação entre a isoforma do clone 20 e uma doença ou actividade inflamatória. A comparação de MAdCAM-1 de murideo, macaco e as duas isoformas humanas indicam que as porções amino-terminais destes receptores apresentam estruturas de domínio que provavelmente estão envolvidas no reconhecimento da α4β7. Pelo contrário, as regiões destes receptores numa localização correspondendo a uma localização do domínio mucina/IgA da MAdCAM-1 de murideo apresentam composições em aminoácidos 75 similares (regiões de mucina ricas em serina, treonina, prolina), mas são mais divergentes uma da outra.

Expressão de ARN de MAdCAM-1 humano

Fez-se uma análise Northern usando Northerns I and II com tecidos múltiplo humano (comercialmente preparados por Clontech, Paio Alto, CA), ou 2 pg of poli A+ ARN de linhas de células e tecidos que foram preparados da forma acima descrita. 0 ARN foi desnaturado e sujeito a electroforese através de um gel de 1% agarose formaldeido e transferido para uma membrana PVDF (Immobilon, Millipore) por procedimentos de blot capilar padrão. As amostras de ARN foram coradas com brometo de etidio para, de inicio, assegurar que a qualidade e quantidade de ARN de cada célula ou tecido era equivalente. Após a transferência, o ARN foi fixado para membranas por ligação cruzada por UV (Stratalinker, Stratagene) e este blot e os blots preparados comercialmente foram pré-hibridizados a 68°C durante 1 horas em ExpressHyb (Clontech) . 0 enxerto de cADN do clone 4 foi marcado com a32P-dCTP por preparação com hexâmeros aleatórios (Maniatis et al., In Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, N.Y., (199) ) . A hibridização foi feita a 68°C durante 1 hora em ExpressHyb com sonda desnaturada numa concentração de 2 X 106 com/ml. Os blots foram depois lavados em 0,1X SSC, 0,1% SDS durante 60 minutos a 65°C com uma mudança de lavagem aos 30 minutos. O tempo de exposição foi de 48 horas com um rastreio intensificado. Depois da exposição, o blot foi desmontado lavando durante 10 minutos em 0,5% SDS e rehibridizado nas 76 mesmas condições com um cADN de β-actina. 0 tempo de exposição foi de 2 horas.

Resultados

Os Northern blots foram sondados para a expressão de MAdCAM-1 usando o enxerto de cADN total do clone 4 como sonda. Uma espécie de ARN simples com aproximadamente 1,6 kb foi altamente expressa no intestino delgado e foi expresso em menor graus no cólon e baço. Não se observou expressão significativa noutros tecidos examinados nestas condições, incluindo timo, próstata, ovários, testículos e leucócitos de sangue periférico (PBL). Este padrão de expressão específico para tecidos é consistente com estudos no rato que mostram expressão restrita de MAdCAM-1 Peyer's Patches, MLN (gânglios linfáticos mesentéricos), lamina própria intestinal e alguma expressão no seio marginal à volta dos gânglios da polpa branca esplénica no baço (Hemler, M.E., Annu. Rev. Irmunol., 8:365 (1990); Berg, E.L., et al., Cellular and molecular mechanisms of inflammation, 2:111 (1991); Briskin, M.J., et al., Nature, 363:461 (1993)). Não se observou expressão significativa noutros tecidos examinados incluindo coração, cérebro, placenta, pulmão, fígado, músculo-esquelético ou rim, no entanto, detectaram-se baixos níveis de expressão no pâncreas. Estes dados indicam que a expressão de MAdCAM-1 é específica para tecidos com expressão em tecidos de mucosa e no baço; pode-se fazer uma análise imunohistoquímica minuciosa da distribuição de tecidos usando anticorpos monoclonais contra a MAdCAM-1 humana (ver em baixo). 77

Exemplo 2: Caracterização de Clones de MAdCAM-1

Ensaios de adesão funcional Plasmídeos:

Usaram-se os seguintes plasmídeos nos ensaios de adesão funcional: (1) pSV-SPORT-1 (Gibco/BRL) ou pcDNA-3 (Invitrogen) foram usados como controlos; (2) MAdCAM-1 de murídeo em pCDM8 (pCDMAD-7; Briskin, M.J., et al., Nature, 363:461 (1993)); (3) sete domínios humanos VCAM-1 (Polte, T., et al. , Nucleic Acids Res., 18:5901 (1990)) em pcDNA3 (pCD3VCAM); e (4) MAdCAM-1 humana em pcDNA-3 (pCDhuMAd4) (ver em cima).

Anticorpos monoclonais:

Usaram-se os seguintes anticorpos monoclonais (MAb) nos ensaios de adesão funcional: (1) MAdCAM-1 MAb MECA-367 anti-murídeo (American Type Culture Collection (Rockville, MD) , n° Acesso HB9478; Streeter, P.R., et al., Nature, 331:41 (1988); e Patente Estadunidense No. 5,403,919 de Butcher); (2) VCAM-1 MAb 2G7 anti- humano (American Type Culture Collection

(Rockville, MD); Graber, N.T., et al., J. Immunol., 145:819-830 (1990)); (3) α4β7 MAb DATK 32 anti-murídeo (Andrew, D.P., et al., J. Immunol., 153:3847-3861 (1994)); (4) β7 MAb FIB 504 anti-murídeo (Andrew, D.P., et al., J. Immunol., 153: 3847 (1994)); (5) α4β7 MAb ACT-1 anti-murídeo (Lazarovits, A.I., et al., J. Immunol., 133:1857 (1984)); (6) integrina βΐ (CD29) (Beco Diazinho; San José, CA, Cat. #550034); e (7) IgGl de murídeo e IgG2A de ratazana como controlos irrelevantes. 78

Linhas Celulares

Usaram-se as seguintes linhas de células nos ensaios de adesão funcional: (1) Células T de linfoma TK1 de murideo (Butcher, E.C., et al., Eur. J. Immunol., 10:556-561 (1980); E. Butcher (Stanford, CA) ; (2) linha de células B de linfoma humanas RPMI 8866, que expressam α4β7 (e não α4β1) (American Type Culture Collection (Rockville, MD); Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153:517 (1994); uma oferta de D. Erle); (3) JURKAT, uma linha de células T humanas que expressam α4β1 (e não α4β7) (American Type Culture Collection (Rockville, MD)); e (4) Ramos, uma linha de células de linfoma Burkitt (B linfociticas) humanas que expressam α4β1 (e não α4β7) (American Type Culture Collection (Rockville, MA) , n° Acesso ATCC CRL 1596).

Ensaios de adesão funcional:

Para os ensaios de adesão funcional, os plasmideos que codificam várias espécies de MAdCAM-1, VCAM-1 humana, e plasmideos controlo foram introduzidos por transfecção transitória em células CHO/P tal como descrito em cima (Exemplo 1) com as seguintes modificações. Como vários poços iam ser transfectados para estudos de inibição com anticorpos, fez-se primeiro, para cada plasmideo, uma mistura principal de lipossomas com múltiplos dos poços a serem transfectados. Isto assegurou que a mesma mistura de lipossomas foi transfectada em cada poço. 48 horas após a transfecção removeu-se o meio. Adicionou-se um sobrenadante de anticorpo (0.25 ml) (contendo quer anti-VCAM-1 MAb 2G7 humana quer anti-MAdCAM-1 MAb MECA-367 de murideo), ou 0.25 ml tampão de ensaio de adesão como 79 controlo, e a mistura foi pré-incubada a 4°C durante 15 minutos.

Ao mesmo tempo, as linhas de células de células de linfócitos (RPMI 8866 ou Jurkat) foram decantadas e resuspensas com uma densidade de 2xl06/ml em tampão de ensaio que consiste em HBSS (sem Ca++ nem Mg++) suplementado com 2% de soro de vitelo, 20 mM HEPES, pH 7.3, 2 mM Mg++ e 2 mM Ca++. Pré-incubaram-se aliquotas de 0.25 ml (5xl05 células) destas suspensões de células RPMI 88 66 ou JURKAT com um pequeno volume de vários anticorpos purificados ou com um volume igual de sobrenadante DATK 32 a 4°C durantel5 minutes. Quando se usou-se DATK 32 numa pré-incubação com uma linha de células antes do inicio do ensaio, ou sobrenadante ou tampão presente nos poços (contendo os transfectantes foi aspirado de modo a obter um volume total de 0,5 ml para o ensaio de adesão.

Para as pré-incubações, usaram-se anticorpos purificados (ACT 1, FIB 504 anti-βΐ) e anticorpos IgG controlo em concentrações de 20 pg/ml. Usou-se 0.25 ml de sobrenadante de anticorpo (usado puro) contendo o anti-VCAM-1 humano (MAb2G7) ou anti-MAdCAM-1 de murídeo (MAb MECA-367) em pré-incubações. Usou-se 0.25 ml de sobrenadante de anticorpo de DATK 32 na pré-incubação.

Depois das pré-incubações, as linhas de células (Jurkat ou RPMI 8866) foram combinadas com os transfectantes nos poços, e continuou-se a incubação numa plataforma com agitação durante mais 30 minutos a 4°C.

Os ensaios foram fixos tal como descrito em cima. As placas foram lavadas invertendo-as suavemente num grande recipiente com solução salina fosfatada tamponada (PBS), 80 seguida da inversão num recipiente com PBS com 1.5% de glutaraldeido para fixação durante um mínimo de 1 hora. A adesão foi avaliada contando quer os linfócitos quer as células CHO num campo com uma ampliação de 20X. Para cada ensaio, o número de linfócitos ligados por célula CHO/P foi determinado como a média de no mínimo quatro campos com desvio padrão. Os resultados em cada caso são de uma de três experiências realizadas com resultados similares.

Resultados A MAdCAM-1 de murídeo liga-se especificamente a linfócitos que expressam α4β7 (e não α4β1). De modo a determinar a especificidade das interacções MAdCAM-1 humana -linfócitos fizeram-se ensaios de adesão para determinar a capacidade de células CHO/P transfectadas transitoriamente que expressam MAdCAM-1 humana de se ligarem à linha de células RPMI 8866 que expressam apenas α4β7 (Erle, O.J., et al., J. Immunol., 153:517 (1994)), ou à linha de células T Jurkat, que expressam exclusivamente α4β1. A ligação a estas células foi comparada com a de células CHO/P transfectadas transitoriamente que expressam MAdCAM-1 de murídeo e VCAM-1 humana. Os resultados estão representados nas Figuras 4A-4B.

As células RPMI 8866 não se ligaram a transfectantes controlo mas ligaram-se avidamente a transfectantes que expressam a MAdCAM-1 humana ou de murídeo. Esta ligação foi completamente inibida pela pré-incubação com anti-a4p7 MAb ACT-1 (Figura 4A) . Os transfectantes VCAM-1 não se ligaram a RPMI 8866, o que é consistente com a demonstração anterior de as interacções ο<4β 7/VCAM-1 são dependentes de activação (Postigo, A.A., et al., J. Immunol., 151:2471-2483 (1993); 81

Ruegg, C., et al., J. Cell. Biol., 117:179-189 (1992)). A não ligação das células RPMI 8866 aos transfectantes VCAM-l não foi devida à falta de expressão, pois uma análise FACS usando anti-VcAM-1 MAb 2G7 indicou uma eficiência de transfecção de - 60%. Para além disso, os mesmos transfectantes VCAM-l foram capazes de se ligar a células Jurkat e a ligação foi completamente inibida pela pré-incubação quer com anti-VCAM-1 quer com anti-βΐ MAbs (Figura 4B). Os transfectantes MAdCAM-1 humanos e de murideo não se ligaram às células Jurkat (uma linha α4β1 positiva). Estes dados demonstram que a MAdCAM-1 humana pode-se ligar de forma selectivamente a leucócitos linfócitos que expressam integrinas α4β7.

Transfectantes de células Ll-2 e CHO A linha de células Ll-2 deriva de um pré- linfoma B e foi obtida do Dr. Eugene Butcher (Stanford University, Stanfold, CA). Os genes que codificam os cADNs para a MAdCAM-1 quer de macaco quer humana foram subclonados num vector pcDNA-3 (Invitrogen) tal como descrito em cima. Os plasmideos resultantes (pcD3HuMAd4, pcD3HuMAd20, ou pCD3PMad (macaco) foram introduzidos em células LI-2 por transfecção do modo que se segue: as células Ll-2 cresceram até uma densidade de aproximadamente 106/ml. Lavaram-se quer 50, 25 ou 12,5 milhões de células em HBSS e depois foram resuspensas em 0.8 ml de um tampão que consiste na solução de sal balançada de Hanks suplementada com 20 mM HEPES, pH 7.05. Adicionou-se uma solução que consiste em 20 pg de plasmideo linearizado, 500 pg de tARN e HBSS até ao volume final de 200 pl à suspensão celular de modo a obter-se um volume total de 1 ml. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, a mistura 82 células/ADN foi transferida para uma cuvete de electroporação (BioRad, Richmond, CA) e foi electroporada a 250 volts, 960 mF num pulsador de genes BioRad. Depois de mais 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, as células foram diluidas para 25 ml em meio de crescimento Ll-2 padrão (RMPI 1640, 10% soro fetal de bovino Hyclone, 50 U/ml Penicilina/ Estreptomicina (Gibco) e 0.29 mg/ml L Glutamina (Gibco) e voltaram para a estufa a 37°C. 48 horas depois, as células foram recolhidas por centrifugação e resuspensas em 50 ml de meio Ll-2 suplementado com G418 (Geneticin; Gibco) a 0.8 mg/ml. As diluições da suspensão de células foram plaqueadas em placas de microtitulo de 96 poços e fizeram-se crescer colónias individuais e foram analisadas quanto à expressão de MAdCAM-1.

Os clones de células Ll-2 que expressam MAdCAM-1 podem ser detectadas pela aderência a células TKI. As células Ll-2 (células não transfectadas) e TKI cresceram ambas como suspensões de células individuais. A expressão de MAdCAM-1 na superfície pode ser detectada pela sua capacidade de mediar a adesão devido à sua interacção com α4β7 expressa nas células TKI. A especificidade desta interacção foi demonstrada pela inibição no pré-tratamento de células TKI com anti-p7 MAb FIB 504.

Prepararam-se células CHO (Chinese Hamster Ovary Cells; American Type Culture Collection (Rockville, MD) ) transfectadas de forma estável com clones de MAdCAM-1 quer humanos quer de macaco por electroporação tal como descrito em cima para as células Ll-2 com as seguintes excepções. O meio para o crescimento de células CHO foi a-MEM com deoxiribonucleótidos (Gibco) e 10% de soro fetal de vitelo 83 (Gibco) e 50 U/ml Penicilina/Estreptomicina (Gibco) e 0.29 mg/ml de L Glutamina (Gibco). O meio de selecção consistia no mesmo meio com 0.55 mg/ml G418 (Gibco). Os clones individuais cresceram e foram analisados quanto à sua capacidade para apresentar uma ligação dependente de α4β7 das células RPMI 8866 usando os ensaios de adesão funcional acima descritos (para transitórios), excepto pelo facto de as células serem plaqueadas a 50 000 células por placa numa placa de 24 poços no dia antes do ensaio. Usando estes critérios, estabeleceu-se uma linha chamada CHO HuMAd 4.

Anticorpos monoclonais capazes de inibir a adesão

Produziram-se anticorpos monoclonais contra a MAdCAM-1 humana pela imunização de ratos C57BL/6 com transfectantes MAdCAM-1 Ll-2. Os ratos foram imunizados intraperitonealmente com 10 milhões de células resuspensas em HBSS três vezes com intervalos de duas semanas e uma quarta imunização (de 10 milhões de células resuspensas em HBSS) foi injectada por via intravenosa. A primeira imunização foi feita com uma mistura de dois clones (células Ll-2 clone 23 e clone 19) que expressam MAdCAM-1 de macaco. As restantes foram feitas com um único clone Ll-2 (Ll-2 clone HuMAD4/17) que expressa MAdCAM-1 humana.

Fez-se uma fusão bem sucedida que gerou aproximadamente 5 000 hibridomas. Quatro dias depois da injecção intravenosa final, removeu-se o baço e preparou-se uma suspensão de células única em meio DMEM livre de soro Estas células foram fundidas com o parceiro de fusão SP2/0, de acordo com o método de Galfre et al. (Galfre, G., et al., Nature, 299:550-552 (1977)). Combinaram-se 20 ml de células de baço com 20 ml 84 de células SP2/0, centrifugadas a 800 g durante 5 minutos e o meio foi removido por aspiração. Adicionou-se uma solução de 50% polietilenoglicol 1500 (PEG 1500) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) pré-aquecida a 37°C à pílula de células durante 2 minutos, seguido por lOml de meio DMEM durante 3 minutos. A suspensão de células foi centrifugada a 600g durante 3 minutos e o sobrenadante foi removido. A pílula foi resuspensa suavemente em meio DMEM contendo 20% de soro fetal de vitelo, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina, e meio de selecção de HAT (Sigma, st. Louis, MO). As células foram plaqueadas em dez placas de microtítulo de fundo chato de 96 poços a 200 μΐ/poço.

Dez dias depois da fusão, os sobrenadantes dos poços foram testados quanto a sua reactividade contra transfectantes CHO MAdCAM-1 humano (células CHO HuMAd 4), por coloração por fluorescência. A coloração de 500 000 células por amostra foi feita essencialmente como descrito, usando 50 μΐ de cada sobrenadante e 50 μΐ de células (E. Harlow and D. Lane, 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . O anticorpo secundário era um IgG (H + L) anti-murídeo marcado com FITC (Jackson Labs) que foi diluído 1:200. Considerou-se forte reactividade como um aumento de 2-3 log na fluorescência em comparação com células CHO não transfectadas.

Seleccionaram-se 48 sobrenadantes de anticorpos por forte reactividade contra células CHO HuMAd 4. Estes sobrenadantes de anticorpos foram depois testados quanto à sua capacidade para bloquear a adesão de células CHO HuMAd 4 a células RPMI 8866. Como controlo, examinou-se capacidade dos sobrenadantes 85 para inibir a ligação de células Ramos a transfectantes VCAM- 1 que não deve ser afectada por um anti-MAdCAM-l MAb humano especifico. Para identificar anticorpos monoclonais anti-MAdCAM-1 humano de bloqueio fez-se o seguinte ensaio. Para obter transfectantes controlo, transfectaram-se células CHO/P com pCD3VCAM tal como descrito, e foram testadas 48 horas após transfecção. 48 horas antes do ensaio de adesão, plaquearam-se 40 000 células por poço de transfectantes transitórios de VCAM-1 em placas de 24 poços. 24 horas antes do ensaio, plaquearam-se 50 000 células por poço de transfectantes CHOHuMAd 4 em placas de 24 poços. No dia do ensaio, cada sobrenadante anti-MAdCAM-l humano (0.25 ml) foi adicionado a um poço contendo transfectantes CHOHuMAD 4 ou transfectantes VCAM-1 e a mistura foi pré-incubada 4°C durante 15 minutos. Fizeram-se ensaios de adesão usando (1) células RPMI 8866 com os transfectantes MAdCAM-1 ou (2) células Ramos (uma linha de células B humanas que expressam α4β1) com os transfectantes VCAM-1.

Paralelamente, resuspenderam-se células (RPMI 8866 ou Ramos) com uma densidade de 2 x 106/ ml num tampão de ensaio que consistia em HBSS (sem Ca h' ou Mg++) suplementado com 2% de soro de vitelo de bovino, 20 mM HEPES pH 7.3, 2 mM Mg e 2 mM Ca++. Após a pré-incubação dos transfectantes com o anticorpo, adicionaram-se 0.25 ml das suspensões de células RPMI 8866 ou Ramos (5 x 105 células) a cada poço e continuou-se a agitação numa plataforma de agitação durante mais 30 minutos a 4°C. Os poços foram lavados, fixados e examinados tal como se descreveu em cima para avaliar a inibição da ligação. 86

Onze dos 48 sobrenadantes de hibridomas examinados apresentaram um bloqueio da actividade substancial, inibindo a adesão de células RPMI 8866 a transfectantes que expressam MAdCAM-l. A adesão de células Ramos a transfectantes que expressam VCAM-1 não foi afectada, o que indica que uma inibição selectiva para interacções mediadas por α4β7. Os hibridomas de bloqueio seleccionados foram subclonados por diluição limitante.

Resultados

Fizeram-se linhas celulares estáveis que expressam MAdCAM-l humana ou de macaco nas pré-B linfoma Ll-2 de murídeo. Estas células foram usadas para imunizar ratos C57BL/6 e preparar hibridomas. A fusão resultante foi testada por coloração de imunofluorescência de transfectantes CHO HuMAd 4 que expressam a MAdCAM-l humana. Os testes da aproximadamente 1 000 poços produziram 48 sobrenadantes que apresentaram uma forte reactividade contra os transfectantes CHO HuMAd 4, enquanto que as células CHO não transfectadas eram negativas. Estes sobrenadantes foram posteriormente testados quanto à sua capacidade para bloquear a adesão de células RPMI 8866 a transfectantes MAdCAM-l humanos. 11 dos 48 sobrenadantes hibridoma examinados puderam inibir especificamente a adesão de células RPMI 8866 a MAdCAM-l, enquanto que a adesão de células Ramos (que expressam α4β1) a transfectantes VCAM-1 não foi afectada pelos mesmos sobrenadantes. Estes hibridomas foram designados 10G4, 8C1, 10G3, 9G12, 9E4, 7H12, 10F2, 10A6, 1E5, 2F5, 7G11. 87

Exemplo 3: Concepção e análise funcional de uma quimera MAdCAM-l-Iq humana

Construção da quimera MAdCAM-l-Iq

Usou-se o clone 4 de cADN de MAdCAM-l humana em pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA.), chamado pcD3huMAd4 (Exemplo 1) como padrão para amplificação por PCR de regiões extracelulares de MAdCAM-l humana a serem fundidas com a região constante da IgGl humana. Sintetizou-se o primer HUMADIG4/2 (SEQ ID NO:11), que contém a terminação 5' da sequência de codificação da MAdCAM-l humana (codão ATG, negrito):

HindIII 5'-GGAAGCTTCCACCATGGATTTCGGACTGGCCC-3'

Este primer 5' foi usado em conjunto com um primer 3' designado HUMA0IG2 (SEQ ID NO:12) para amplificar regiões que codificam os dois dominios tipo imunoglobulina amino-terminais da MAdCAM-l humana. 0 primer HUMADIG2 (SEQ ID NO:12), que contém uma porção complementar dos nucleótidos da cadeia de codificação 667-683 da SEQ ID N0:1, tem a seguinte sequência:

Spel 5'-CCGACTAGTGTCGGGCTGTGCAGGAC-3'

Alternativamente, o primer 5' foi usado em conjunto com um primer 3' designado HUMA0IG3 para amplificar regiões que codificam todo o domínio extracelular da MAdCAM-l humana (clone 4). 0 primer 3' HUMADIG2 (SEQ ID N0:12), que contém uma porção complementar dos nucleótidos da cadeia de codificação 992-1010 da SEQ ID NO:l, tem a seguinte sequência:

Spel 5'-GGACTAGTGGTTTGGACGAGCCTGTTG-3'

Os primers foram concebidos com um sítio 5' HindIII ou sítios 3' Spel tal como indicado. Estes primers foram usados para amplificar por PCR dois diferentes fragmentos MAdCAM, usando um kit de optimização de PCR da Invitrogen (San Diego, CA) . Os produtos PCR foram digeridos com as enzimas HindIII e Spel para se obterem terminações para clonagem. Os produtos foram posteriormente purificados por electroforese em gel usando o sistema de isolamento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda MO).

A - Excisou-se um fragmento com 1 kb que englobava as regiões CHI, H (hinge) , CH2 e CH3 por digestão com Spel e EcoRI a partir de uma construção que codificava a cadeia pesada da imunoglobulina γΐ humana com uma região constante humana com mutação Fc. 0 anticorpo codificado por esta construção foi usada como um isotipo marcado como controlo irrelevante daqui em diante. A região constante humana nesta construção foi originalmente obtida por amplificação por PCR da cadeia pesada CAMPATH-1H (Reichmann, L. et al., Nature, 322: 323-327 (1988}) tal como descrito por Sims, M.J. et al. (J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993}) e Waldmann et al (WO 93/02191, 4 de Fevereiro, 1993 (página 23)), cujos ensinamentos estão aqui incorporados por referência na sua totalidade. As mutações na região constante desta construção (Leu234 -> Ala234 e Gli237 -> Ala237 ) foram concebidas para reduzir a ligação a receptores humanos Fcy, e foram produzidos por mutagénese dirigida por oligonucleótidos. Assim, as fusões MAdCAM-Ig produzidas continham o fragmento da região constante Spel-EcoRI descrita por Sims et al, (J. Immunol., 89 151: 2296-2308 (1993)) e Waldmann et al (WO 93/02191), excepto pela introdução de mutações Leu -> Ala e Gli ->

Ala237 . O fragmento 1 kb Spel-EcoRI que codifica a região constante IgGl com mutação Fc foi isolada por electroforese em gel usando o sistema de isolamento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda MO) . Este fragmento de região constante, os fragmentos HindIII-spel contendo (a) os dois domínios Ig N-terminal de MAdCAM-1 ou (b) todo o domínio extracelular, foram ligados numa ligação de três vias ao vector pEE12 (Stephens, P.L. and M.L. Cockett, Nucl. Acids. Res., 17:7110 (1989) e Bebbington, C.R. and C.C.G. Hentschel, 1987, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells, (Academic Press, N.Y.), que foi digerido com HindIII e EcoRI. Obtiveram-se transformantes da estirpe bacteriana DH10B. As colónias cresceram e analisaram-se mini preps de plasmídeos por mapeamento de restrição. Sequenciaram-se três construções que codificam proteínas de fusão contendo quer todo o domínio extracelular de MAdCAM-1 (construção HuMAdIg21) ou os dois domínios Ig N-terminal (construção HuMAdIg31 ou HuMAdIg38) fundidos com a região constante IgGl com mutação Fc, ao longo de todas as porções MAdCAM-1, confirmando a fusão adequada dos segmentos e a ausência de mutações induzidas por PCR.

Para os testes iniciais, cada construção foi transitoriamente transfectada em monocamadas de 5 x 107 células COS em 1 ml de tampão RPMI (sem soro) e 25 pg de plasmídeo usando electroporação com um Biorad Gene Pulser em condições padrão (960 pF, 250 V). 72-96 horas depois da transfecção recolheram-se os sobrenadantes, foram passados 90 por filtros 0.45 μ e foram armazenados a 4°C na presença de 0.05% de azida de sódio. Confirmou-se a produção da quimera por uma sanduíche ELISA, usando um anticorpo anti-IgGl humano como anticorpo de captura e o mesmo anticorpo, conjugado com fosfatase alcalina como segundo anticorpo para detecção. Usou-se um anticorpo controlo irrelevante (com uma região constante idêntica) como padrão. A quimera também foi analisada por "western blotting" usando um anticorpo monoclonal anti-MAdCAM-1 humana, e verificou-se que corria a aproximadamente 200 kd, o que é consistente com o tamanho de um homodímero.

Quimeras MAdCAM-lg humanas solúveis que se ligam especificamente a células α4β7 positivas

Testaram-se sobrenadantes de quatro transfecções diferentes quanto à sua capacidade de corar a linha de células T HuT 78, que se verificou previamente que se ligam a MAdCAM-1 apenas na presença de Mn++. Assim sendo, cada solução usada neste ensaio continha 2 mM Mn++. As células HuT 78 (uma linha de células T de linfoma humano; American Type Culture Collection, N° de Acesso ATCC TIB 161) são células que se ligam a α4β7. Para testar a especificidade de ligação das quimeras, as células Hut 78 foram pré-incubadas quer com meio apenas (RPMI 1640 com 2% FCS) ou meio comlO pg/ml do anticorpo anti-p7 FIB 504. Aproximadamente 100 000 células foram incubadas em gelo durante 15 minutos e depois foram lavadas com HBSS com 2% FCS / 2 mM Ca++/ 2 mM Mn++. As células foram depois mais uma vez incubadas durante 20 minutos gelo apenas com meio ou com sobrenadantes de uma de quatro transfecções independentes, duas com uma quimera contendo 91 todos o domínio extracelular de MAdCAM-l (clone 21) e duas com uma forma truncada de MAdCAM contendo os dois domínios Ig N-terminal (clone 38) durante 20 minutos. Após a lavagem, as células foram depois incubadas com um anticorpo anti-IgG humano conjugado com ficoeritrina e a coloração acima do fundo foi avaliada por citometria de fluxo (FACScan). Apenas as células incubadas com os sobrenadantes das quimeras coraram acima do fundo, enquanto que a pré-incubação com β7 MAb reduziu esta coloração para níveis de fundo, o que indica uma interacção específica da quimera com a integrina α4β7 (Figuras 17A-17E).

Seleccionaram-se linhas de células NSO permanentes que segregam a quimera de MAdCAM-lg humana, após transfecção por electroporação, por crescimento num meio sem glutamina tal como descrito anteriormente por (Cockett, M.L., et al., Bio/Technology, 8: 662-667 (1990)). As linhas clonadas foram adaptadas a crescer em culturas 'giratórias' ("spinner"). Testaram-se os sobrenadantes de três destas linhas clonadas (amostras B-D), e uma quimera parcialmente purificada (Clone 21, purificada pela ligação à proteína A, amostra A) quanto à sua capacidade para manter a adesão da linha de células B RPMI 8866. Resumidamente, incubaram-se placas maxisorb com 100 μΐ/poço de Proteína A a 20 pg/ml em tampão de carbonato, pH 9.5 durante a noite a 4°C. As placas foram depois lavadas 2x com meio RPMI 1640 (sem soro) . 100 μΐ de quimera (ou diluições em série em RPMI) ligaram-se aos poços a 37° durante 2 horas e depois foram lavadas uma vez. Os poços foram então bloqueados com FCS durante 1 hora a 37°C, lavados uma vez e depois foram pré-incubados com sobrenadantes de cultura de tecidos contendo um anti- VCAM-1 MAb humano (2G7) 92 como controlo ou o anti- MAdCAM-l MAb 10G3 humano (Exemplo 2) . Os 2G7 e 10G3 MAbs foram removidos antes da adição de células. As células RPMI 8866 foram marcadas com fluorescência pré-incubando-as com corante BCECF-AM (BCECF-AM; éster 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(e-6)-carboxifluoresceina, acetoximetil; Molecular Probes), adicionaram-se 100 μΐ de células a cada poço (até uma concentração final de 105 células/poço) e incubaram-se num agitador rotativo durante 30 minuto à temperatura ambiente. A ligação das células RPMI 8866 a quimeras imobilizadas foi avaliada pela leitura dos valores de fluorescência usando um Fluorescence Concentration Analyzer (IDEXX). A especificidade da ligação foi demonstrada pois apenas o anti-MAdCAM-1 MAb humano pôde bloquear a ligação das células à quimera MAdCAM-Ig (Tabela 1) .

Estas e outras proteinas de fusão quiméricas podem ser usadas para avaliar a capacidade de um agente (por exemplo, moléculas pequenas) para bloquear a ligação de α4β7 a quimeras, para identificar inibidores de interacção α4β7-MAdCAM. Para além disso, como as proteinas de fusão quiméricas se podem ligar a linfócitos positivos para α4β7 em solução, são inibidores candidatos para a inibição in vivo do recrutamento de linfócitos para locais de inflamação. 93

TABELA A

Amostra An ti HumMAd MAbs Puro 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 A - 195527 195527 195527 18560 4254 3558 + 3860 3092 1746 2200 482 564 B - 195527 195527 195527 195528 52056 2932 + 6526 3626 3274 2978 1648 1518 Ç - 195527 195527 35548 9570 21782 1926 + 4566 4094 3922 3492 2436 2566 D - 195527 30840 46852 16270 5474 2656 + 7350 6794 6020 4510 6548 5122 A linha de células B RPM1 8866 α4β7 positivas liga-se especificamente à Quimera MAdCAM Ig humana solúvel. A quimera MAdCAM-1 Ig humana Clone 21 que foi parcialmente purificada com proteína A (Amostra A) ou os sobrenadantes s«de cultura de tecidos de diferentes clones NSO (Amostras B-D) foram imobilizados em placas de 96 poços com proteína A e foram pré-incubados com um anti-VCAM-1 MAb 2G7 (designado nos Mabs) como controlo negativo ou com o anti-MAdCAM MAb 10 G3. ("+") . A quimera purificada ou os sobrenadantes (usados não diluídos ("puro") ou com diluições em série de 1:2) foi ligada aos poços via Proteína A, e incubados com células RPMI 8866 marcadas com fluorescência num agitador rotativo durante 94 30 minutos à temperatura ambiente. Depois da lavagem comum lavador de placas automático (EL 404 Microplate Autowasher, BIO-TEK Instruments), as ligações das células foram contadas com um leitor de placas automatizado (IDEXX). Os números brutos são um reflexo dos números de células ligadas.

Exemplo 4: Inibição do Recrutamento de Linfócitos para o Cólon A. Indução-DSS de Colite em ratos A ratos BALB/c foi dado acesso a uma solução a 5% de dextrano sulfato de sódio (DSS) na sua água para beber durante um periodo de 10 dias, tal como foi previamente descrito (Lab. Invest. 69:238-249, 1993). Durante este periodo, os ratos desenvolveram sintomas clínicos de colite, incluindo amolecimento das fezes e diarreia com sangue. Danos epiteliais multifocais e ulceração, similares à colite ulcerosa nos humanos, eram evidentes nos exames histológicos da mucosa colónica dos ratos afectados. Para além disso, no dia 10, os ratos afectados tinham perdido 20-30% do seu peso corporal inicial.

Blogueio por anticorpos das interacções β7 e MAdCAM

Para determinar a eficácia dos anticorpos específicos para β7 no bloqueio do recrutamento de linfócitos para o cólon, deu-se intraperitonealmente (i.p.) a ratos BALB/c injecções delOO pg de anticorpos monoclonais contra β7, consistindo em FIB21 ou FIB30 em solução salina, tal como foi anteriormente caracterizado e descrito (Berlin, C., et al., Cell 74:185-195, 1993; Michie, S.A., et al., Am. J 95

Pathol.143:1688-1698, 1993; Hamann, A., et al., J. Immunol. 152:3282-3293, 1994) ou um anticorpo monoclonal de ratazana controlo correspondente a um isotipo na mesma dose (Andrew et al., supra) durante os 10 dias do tratamento com DSS. Métodos de avaliação

Usaram-se dois métodos para avaliar a eficácia da terapia com anticorpos para inibir a infiltração de leucócitos e os danos na mucosa nos ratos com colite. No primeiro método, o tratamento foi julgado histologicamente por dois observadores às cegas usando um sistema de pontos para a avaliação dos danos epiteliais e grau de infiltração celular de leucócitos (Tabela 2). Para esta avaliação, o tecido do cólon foi fixado em 10% de formalina tamponada neutra, desidratado, embebido em parafina, seccionado, e as secções foram coradas com hematoxilina e eosina antes de ser examinado. TABELA 2: AVALIAÇÃO PATOLÓGICA Grau Definição

INFLAMAÇÃO

Normal (0) Ausência de aglomerações de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) ou células mononucleares na lamina própria; ausência de PMNs intraepiteliais.

Suave (1) Agregados focais de PMNs e/ou células mononucleares na lamina própria (suspeitas ou ligeiras) ou presença de PMNs intraepiteliais isolados em 3 ou menos criptas por secção cruzada. 96

Moderado (2) Agregados focais de PMNs e/ou células mononucleares na lamina própria (multi-focais ou difusas 2-5x) ou presença de PMNs intraepiteliais em mais de 3 criptas por secção cruzada. Grave (3) Infiltração difusa de PMNs ou células mononucleares na lamina própria (difusas >5x) ou abcessos nas criptas. Normal (0) ALTERAÇÕES ESTRUTURAIS OU EPITELIAIS Criptas apertadas, sem erosão, células epiteliais colunares. Suave (D Imaturidade epitelial; irregularidade suspeita da superfície epitelial. Moderado (2) Pelo menos dois focos de ramificação das criptas ou perda das criptas (<50%); perda de superfície epitelial Grave (3) Ramificação difusa ou multifocal ou perda de criptas (>50%); fibrose; perda completa do epitélio (focal).

Fizeram-se mais avaliações histológicas usando a imunohistoquimica para a detecção e semi-quantificação de linfócitos que expressam integrinas β7 e vénulas da mucosa que expressam MAdCAM. Tal como já foi anteriormente descrito (Ringler, D.J., et al., Am. J. Pathol., 134: 373383 (1989)), o tecido do cólon foi primeiro rapidamente congelado em 97 composto OCT, seccionado enquanto congelado e as secções foram posteriormente fixadas em acetona durante 10 min a 4°C. Depois de ser lavado em solução salina fosfatada tamponada (PBS), os sítios de ligação de anticorpos não específicos foram bloqueados com soro normal de coelho a 10% diluído em PBS durante 10 min, seguido em sequência por lavagem com anticorpo FIB21 a 20 pg/ml em PBS durante 30 min à temperatura ambiente (TA) , anticorpos policlonais anti-ratazana de coelho biotinilados, complexos avidina-peroxidase e, por fim, o cromogéneo, diaminobenzidina e peróxido de hidrogénio diluído sem tampão Tris.

No segundo método, o recrutamento de linfócitos para o cólon foi avaliado quantitativamente usando linfócitos de gânglios linfáticos mesentéricos marcados radioactivamente de ratos dadores singénicos. A concepção experimental das experiências com animais foi similar à descrita em cima excepto que os ratos BALB/c estiveram com 5% DSS durante 9 dias (em vez de 10) e no dia 8, foram dadas aos ratos injecções i.p. de 100 pg of FIB21 (anti- β7), MECA-367 (anti-MAdCAM), uma mistura de ambos ou um anticorpo monoclonal controlo isotipo-emparelhado em solução salina. No dia 9, as células dos gânglios linfáticos mesentéricos foram isoladas dos ratos BALB/c dadores singénicos, marcados com 51Cr, e incubaram-se 5.0 x 106 células/rato durante 30 minutos a 37°C com 500 pg de anticorpo controlo, 250 pg de MECA 367, 500 pg de FIB21 ou com ambos (quantidade total de 750 pg) em solução salina. As células marcadas e o anticorpo foram injectadas intravenosamente (i.v.) nos ratos receptores tratados com DSS. Recolheram-se os cólon de todos os animais da 98 experiência 1 hora após as injecções e mediu-se a radiação-γ usando um contador-γ.

Análise de dados

Avaliaram-se as diferenças entre os valores médios obtidos para cada grupo de animais quanto à significância estatística usando um teste t de Student. Consideraram-se as diferenças significantes quando P < 0.05.

Resultados

Histologicamente, a inflamação e os danos epiteliais na mucosa eram mais graves no cólon descendente, recto e cego. A análise de secções de tecido congelado do cólon por imunohistoquímica revelou que o recrutamento mais significativo de linfócitos β7+ era no cólon direito. Para além disso, verificou-se que o nível de expressão da adressina vascular da mucosa, MAdCAM-1, era baixo nos vasos da mucosa intestinal no início do tratamento com DSS (3 dias), mas aumentava dramaticamente após 9 dias de tratamento com DSS, apoiando a conclusão de que as interacções entre β7 e MAdCAM-1 são importantes para o processo inflamatório da mucosa do cólon durante a colite induzida por DSS. A avaliação histológica de ratos expostos a 10 dias de DSS e terapia diária usando anticorpos específicos para β7 demonstrou que ocorreu uma substancial redução do recrutamento de leucócitos (P<0,01 para FIB30 e P<0,001 para FIB21) e dos danos epiteliais (P<0,05) no cólon direito (ascendente) quando comparados com animais que receberam o anticorpo controlo na mesma dose (Figuras 7A e 7B). Para além disso, a análise usando imunohistoquímica das secções 99 congeladas destes animais sugere que o número de células β7+ recrutadas no cólon direito, mas não noutras secções do cólon, durante o tratamento com DSS foi reduzido. 0 recrutamento de linfócitos para o cólon inflamado foi depois avaliado quantitativamente usando linfócitos mesentéricos marcados radioactivamente retirados de dadores singénicos. Uma hora depois da injecção destas células nos receptores tratados com DSS, houve a tendência da redução no número de células marcadas com 51Cr recrutadas para o cólon em ratos que foram tratados quer com anticorpos β7-θ3ρθοίficos quer com os anticorpos específicos para MAdCAM, mas não em ratos tratados com os anticorpos controlo isotipo-emparelhados (Figura 8). B. Indução de colite em ratos scid e inibição do recrutamento de células dos gânglios linfáticos para o cólon

Os ratos scid reconstituídos com células T CD45RBhl CD4+ desenvolveram colite e um grave síndroma de desnutrição. A colite que se desenvolve em ratos com células T CD45RBhl CD4+ difere da maioria dos outros modelos de murídeos de IBD em que a colite induzida nos ratos scid necessita claramente da presença de células T CD4+ para a indução, senão para a patogénese, da doença (Powrie, Immunity, 3:171 (1995), cujos ensinamentos estão aqui incorporados por referência na sua totalidade).

Usou-se uma modificação do método de Morrissey et al. e Powrie et al. (Morrissey et al., J. Exp, Med., 178:237 (1993); Powrie et al., Int. Imm., 5:1461 (1993), cujos 100 ensinamentos de ambos estão aqui incorporados por referência na sua totalidade) para enriquecer células T CD4+, isoladas do baço de BALB/c, pela depleção de leucócitos granulíticos, células T CD8+, células B220+, células I-A+ e macrófagos MAC-1+. Seleccionaram-se células CD45RBhl por um separador de células, escolhendo 40-45% das células CD4+ mais brilhantes coradas com anti-CD45RB. Os ratos scid receptores foram reconstituídos pela injecção intravenosa (i.v.) de 1 x 106 células T CD45RBhl ou CD45RB10 na veia da cauda. Quatro ratos foram reconstituídos com células T CD45RBhl e quatro ratos com células T CD45RB10.

Os ratos reconstituídos foram monitorizados semanalmente quanto a alterações de peso e ao desenvolvimento de sangue fecal oculto. Normalmente, nas 4-6 semanas após a reconstituição, a diferença no peso corporal de ratos reconstituídos com células T CD45RBhl em relação a ratos scid controlo reconstituídos com igual número de células T CD45RB10 é estatisticamente significativo (Figura 18).

Neste modelo, a colite pode ser induzida com apenas 5 x 104 células. Normalmente, usa-se de 1 a 5 x 105. Apesar da cinética do início da doença não ser uniforme entre ratos numa dada reconstituição, a colite tem uma gravidade similar quando o peso corporal diminuiu para 75-85% do peso corporal inicial. As observações histológicas eram consistentes com as divulgações de outros e indicaram que a colite, neste modelo, é caracterizada pela infiltração massiva de células T CD4+ na mucosa e sub-mucosa, imaturidade epitelial, ulceração, hiperplasia das criptas, perda de células em taça e abcessos da cripta. Como na doença de Crohn, a IBD no modelo scid também é caracterizado por infiltração transmural com 101 fístulas profundas. Ao contrário de outros modelos de colite em murídeos, a gravidade da doença não está limitada ao cólon distai mas é igualmente grave no cólon transversal e proximal.

Bloqueio por anticorpos das interacções β7-ΜΑάΟΑΜ

Usaram-se, nestes estudos, anticorpos anti-MAdCAM-1 de murídeo (MAb MECA-367; American Type Culture Collection (Rockville, MD), N° de Acesso HB 9478; Streeter, P.R., et al., Nature, 331:41 (1988); ver também Patente Estadunidense No. 5,403,919 de Butcher) e anticorpos anti-p7 de murídeo (MAb FIB 504; Andrew, D.P., et al., J.Immunol., 153: 3847 (1994)) .

Reconstituíram-se ratos scid com 2 χ 105 células T CD45RBhl ou CD45RB10 CD4+. Cinco meses após a reconstituição, os ratos foram injectados durante 14 dias com 200 pg/dia de anticorpo controlo de ratazana IgG2a ou com uma mistura de 100 pg/dia de FIB-504 (β7 especifico de murídeo) + 100 pg/dia de MECA-367 (MAdCAM específico de murídeo). O anticorpo estava em PBS, Havia cinco ratos em cada grupo de tratamento. 14 dias depois, os ratos foram injectados por via intravenosa com 5 χ 106 células de gânglios linfáticos mesentéricos (BALB/c) marcadas com mIn-oxina. 24 horas depois da transferência adoptiva de células marcadas, recolheram-se os tecidos e avaliou-se a radioactividade. Os níveis de fundo de radioactividade nos tecidos, originados pelo aprisionamento não específico de células, foram avaliados pela injecção de 5 χ 106 células marcadas fixadas com 2% PBS-formaldeído tamponado. Os resultados foram expressos como % 102 de contagens por minuto (CPM) no cólon normalizado em relação a CPM no baço e corrigidos quanto aos níveis de fundo.

Esta avaliação quantitativa da infiltração no cólon em ratos scid reconstituídos com células T CD45RBhl CD4+ revelou um aumento na localização de 10- a 100- vezes em comparação com o nível observado em receptores scid reconstituídos com igual número de células T CD45RB10 CD4+. Este aumento de acumulação de células marcadas no cólon foi inibido em 50-75% pelo tratamento durante 2 semanas com uma combinação de anticorpos monoclonais anti-07 e anti-MAdCAM (Figura 19).

Noutras experiências, os ratos scid foram reconstituídos com 5 x 104 células T CD45RBhl ou CD45RB10 CD4T. No momento da reconstituição, os ratos foram tratados quer com (a) 500 pg de FIB 504 (07-específico) (6 ratos); (b) 500 pg MECA-367 (MAdCAM-específico) (3 ratos); (c) 1 mg de anticorpo controlo isotipo-emparelhado (7 ratos); ou (d) 1 mg FIB 504 + MECA-367 (500 pg cada) (5 ratos) . A seguir à reconstituição, administraram-se anticorpos em intervalos semanais (a) 250 pg FIB 504; (b) 250 pg MECA-367; (c) 500 pg de controlo isotipo-emparelhado; ou (d) 500 pg FIB 504 + MECA-367 (250 pg cada).

Quatro meses depois do tratamento, os ratos foram injectados com 5 x 106 células de gânglios linfáticos mesentéricos marcadas com mIn (BALB/c), e o recrutamento para o cólon foi avaliado medindo níveis de radioactividade. Os resultados foram calculados coo se descreveu para a Figura 19. O tratamento dos ratos scid durante 4 meses, começando no momento da reconstituição, com FIB 504 e MECA-367, sozinhos ou em combinação, inibiu o recrutamento de linfócitos para o cólon em 100% (Figura 20) . 103

Reconstituíram-se ratos scid com 2,0 x 105 a 4,0 x 105 de células T CD45RBhl ou CD45RB10. 4 meses depois, os ratos foram tratados durante 14 dias com uma combinação de FIB 504 (β7 — específicos) + MECA-367 (MAdCAM-específicos) (100 pg de cada Mab por dia num total de 200 pg/dia) ou um anticorpo controlo isotipo-emparelhado (200 pg/dia). Os anticorpos estavam em PBS. Cada grupo experimental consistia em 4 ratos. As secções congeladas do cólon direito e esquerdo foram coradas com um anticorpo monoclonal de ratazana específico para CD4 de rato e foram reveladas com Fast Red ou cromogéneo AEC (3-amino-9-etilcarbazole). Analisou-se uma secção do cólon direito e do cólon esquerdo de cada rato para coloração positiva quanto à presença de usando um analisador Leica Quantimet 500 Image. Cada secção foi observada na sua totalidade usando uma objectiva 10x. Determinou-se a significância usando um teste t de Student. Os dados representam a área positiva contagem/tecido média ± 1 desvio padrão. A avaliação histológica por imunohistoquímica com um painel de anticorpos específicos para marcadores de linhagem de células e estados de diferenciação, sugeriu que virtualmente todas as células infiltrantes no cólon de ratos scid reconstituídos com células T CD45RBhl eram células T CD4+ T. Não se identificaram células T CD8+ nem células B B220+ nas condições usadas. Para além disso, o tratamento destes ratos com uma combinação de anticorpos monoclonais específicos para β-7 e MAdCAM reduziu significativamente o número de células T CD4+ no cólon ascendente ou descendente relativamente aos controlos (Figura 21). Como as células dos gânglios linfáticos mesentéricos são 95% linfócitos, estes resultados indicam que a interacção de α4β7 nos linfócitos com MAdCAM é 104 importante no recrutamento de linfócitos para locais de inflamação no cólon e que os agentes que bloqueiam esta interacção podem reduzir a inflamação.

Exemplo 5: Desaparecimento das alterações das vilosidades no Saguim Comum (Callithrix jacchus) com Enterite Malabsortiva

Descrição do modelo

Os saguins comuns (Callithrix jacchus) são primatas não humanos do novo mundo, que em condições de cativeiro no New England Regional Primate Research Center (NERPRC), desenvolveram um síndroma de malabsorção espontâneo, não responsivo a esteróides caracterizado por perda de peso, diarreia e pequenas alterações na mucosa intestinal consistentes com perda de capacidade de absorção. Estas alterações histológicas incluem a atrofia e fusão de pequenas vilosidades intestinais e uma infiltração de leucócitos mononucleares dentro da lamina própria similar à da doença Celíaca (psilose não tropical) em humanos A análise retrospectiva dos ficheiros do arquivo patológico no NERPRC demonstrou que até 80% dos saguins comuns têm, em vários graus, enterite malabsortiva no momento do exame post-mortem

Protocolo de terapia com anticorpos

Seleccionaram-se saguins comuns adultos para o estudo da colónia do NERPRC. Os exames básicos a todos os animais incluíram exame físico, contagem total do sangue (CTS), perfil químico do sangue, B12 do soro, proteína c-reactiva, e biopsia jejunal de espessura completa por laparotomia. A seguir à recuperação da cirurgia abdominal, os animais foram 105 tratados durante 14 dias com 2 mg/kg/dia de anticorpo monoclonal ACT-1, um anticorpo monoclonal de bloqueio contra o epitopo conformacional de α4β7 (Schweighoffer, T., et al.,J. Immunol. 151:717-729, 1993). Estudos anteriores indicaram que este anticorpo tinha reacção cruzada com Callithrix aAfil. Todas as avaliações que foram feitas antes da terapia com anticorpos foram repetidas entre o 10° e o 14° dia de terapia com anticorpos.

Análise das biopsias jejunais

As avaliações histológicas das biopsias jejunais de espessura completa de cada saguim foram feitas por dois patologistas independentes e atribuíram-se pontos à arquitectura das vilosidades de acordo com os seguintes critérios de graduação:

Atrofia das vilosidades 0 1 2 - espessura da mucosa e altura das vilosidades normal atrofia suave; ligeiro encurtamento das vilosidades; altura aproximadamente 75% do normal atrofia moderada; vilosidades com aproximadamente 33-50% da altura - atrofia grave; vilosidades curtas ou não observáveis 3 106

Fusão das vilosidades 0 - normal; sem fusão 1 - 1-2 vilosidades em espécimes fundidos 2 - entre 1-2 e 50% das vilosidades em espécimes fundidos 3 - > 50% das vilosidades em espécimes fundidos

Análise de dados

Resultados

Os valores médios para a fusão e atrofia das vilosidades antes e depois da terapia com o anticorpo monoclonal ACT-1 estão representados nas Figuras 9 e 10, respectivamente. Tal como se demonstrou, houve uma quase completa resolução da atrofia das vilosidades (P<0,01) e uma tendência da melhoria da fusão das vilosidades após duas semanas de terapia com o anticorpo ACT-1. O efeito não foi secundário em relação aos efeitos não específicos da exposição a imunoglobulinas estranhas pois outros animais tratados com vários anticorpos monoclonais dirigidos contra epítopos que não os reconhecidos por ACT-1 não mostraram qualquer eficácia na redução da pontuação da atrofia e fusão das vilosidades. 107

Exemplo 6: Resolução da Colite nos Tamaris Cotton-Top

Descrição do modelo

Os tamaris cotton-top (TCT) (Saguinus oedipus) é um primata não humano do Novo Mundo que desenvolve colite espontânea, e por vezes crónica que é clínica e histologicamente similar à colite ulcerosa no homem (Madara, J.L., et al., Gastroenterology, BB: 13-19 (1985)).

Imunoterapia, Avaliação Clinica e Biopsia da Mucosa

Instituiu-se um protocolo experimental que envolveu avaliação clínica, biopsia da mucosa do cólon e imunoterapia com ACT-1 de TCT colíticos (Figura 13). O ACT-1 é um anticorpo monoclonal igGl de murídeo reactivo com a α4β7 humana (Schweighoffer, T., et al., J. Immunol., 151: 717-729 (1993) ; Lazarovits, A.I., et al., J. Iimunol., 133:1857-1862 (1984); e Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153:517-528 (1994) ) . Verificou-se que o ACT-1 tem reacção no tamari tal como se avaliou por coloração imunohistológica com anticorpo ACT-lda mucosa colítica de animais afectados. Estes estudos piloto iniciais demonstraram que 40-80% das células mononucleares na lamina própria do cólon de animais afectados eram α4β7+, como na mucosa colitica humana. Também se verificou que o ACT-1 também reage com α4β7 de TCT usando citometria de fluxo nos linfócitos de sangue periférico (LSPs).

Escolheram-se TCTs com colite crónica da colónia do New England Regional Primate Research Center, Southborough,

Massachusetts tendo como base a observação de diarreia e perda de peso. Para confirmar a presença de colite (definida 108 por uma actividade inflamatória histológica com 2 ou 3 pontos), avaliaram-se os animais da colónia com emagrecimento e diarreia clinica quanto à actividade inflamatória do cólon por avaliações histológicas de rotina de amostras de biopsias da mucosa do cólon em múltiplas ocasiões antes da avaliação experimental da imunoterapia com anticorpos (Figura 13) . Os TCTs coliticos crónicos foram testados quanto à actividade inflamatória em pelo menos duas ocasiões examinando espécimens da mucosa do cólon descendente terminal, a 2-3 cm do ânus usando um endoscópio de fibra óptica pediátrico. A pontuação da actividade inflamatória teve como base o número relativo de neutrófilos na lamina própria, no lúmen da cripta, no epitélio da cripta e na superfície do epitélio. Mais propriamente, usou-se um sistema de pontuação histológico de actividade inflamatória aguda e crónica (descrito por Madara, J.L., et al., Gastroenterology, 88: 13-19' (1985)). Todas as amostras de biopsia foram pontuadas e categorizadas em quatro grupos, em que 0 representa a mucosa normal e 3 representa a mucosa mais inflamada e grave. As pontuações de 0 e 1 não representam colite sintomática, enquanto que as pontuações de 2 a 3 representam uma actividade colítica suave a grave. Os animais seleccionados para o estudo tinham: (1) alterações estruturais moderadas (grau 2) ou graves (grau 3) da superfície e das criptas do epitélio na primeira biopsia, sugerindo uma colite de natureza crónica, e (2) actividade inflamatória moderada (grau 2) ou grave (grau 3) em pelo menos duas amostras de biopsia feitas 3-7 dias antes da imunoterapia. As amostras de biopsia que satisfaziam estes critérios eram caracterizadas pela presença de ramificação e/ou perda das criptas com 109 infiltração de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) na lamina própria e/ou compartimento epitelial.

Assim, os animais para este estudo apresentavam várias evidências de actividade inflamatória no cólon e colite clinicamente relevante de natureza crónica sem evidências recentes de remissão. Para além disso, a persistência de diarreia no primeiro dia de administração de anticorpos monoclonais era um requisito para o animal ser incluido no estudo. Nos 5 dias seguintes à confirmação da colite, os animais começaram a imunoterapia com o anticorpo monoclonal ACT-1. O anticorpo ACT-1 foi produzido por cultura num fermentados de células de fibra oca usando um patamar de fluxo ( 'flowpath') livre de pirogénio estéril, purificado por cromatografia de afinidade com proteina A e diluído em 0.9% NaCl antes de ser usado use in vivo. Como os TCTs são uma espécie em vias de extinção, também se demonstrou que o ACT-1 reage com α4β7 de LSPs de espécies relacionadas, o saguim comum (Callithrix jacchus) de modo a fazer a análise farmacocinética do anticorpo antes da sua administração a TCTs coliticos. Nesta componente do estudo, administrou-se ACT-1 a dois saguins adultos normais, primeiro através de uma única infusão intravenosa e depois com uma única injecção intramuscular 24 horas depois. A administração intravenosa de 2.0 mg/kg de ACT-1 nestes animais providenciou um tempo de vida no soro estimado de aproximadamente 50 horas, com absorção contínua de anticorpo das 2-24 horas após a única injecção intramuscular. Usando este regime de dose, as concentrações pico no soro de anticorpo foram de aproximadamente 60 pg./ml, enquanto que as concentrações mais 110 baixas foram £18.0 gg/ml. Não se observaram efeitos clinicos adversos nos saguins a quem foi administrado ACT-1.

Tendo em conta estas observações, a metade dos tamaris cotton top que satisfaziam os requisitos do estudo (n = 4; idade colectiva = 31 anos) foi dada uma única pilula ('bolus') intravenosa (I.V.) de ACT-1 numa dose de 2.0 mg/kg no primeiro dia, e depois 7 injecções intramusculares (I.M.) com a mesma quantidade cada 24 horas, num total de 8 dias de imunoterapia. A outra metade dos animais controlo coliticos crónicos (n = 4; idade colectiva = 26 anos) recebera o anticorpo 86D, um anticorpo monoclonal de murideo (IgGl) para o TCR γδ de ovelha (Mackay, C.R., et al., Eur. J. Immunol., 19: 1477-1483 (1989)), que não reage em TCTs (dados não apresentados). Estes anticorpos irrelevantes isotipo-emparelhado foram produzidos, purificados, e administrados em condições idênticas ao ACT-1.

Obtiveram-se novamente biopsias da mucosa do cólon no momento da primeira infusão de anticorpo (Dia 0) e nos dias 5, 10 e 20. As biopsias foram avaliadas por um patologista independente. Biopsias adicionais do cólon foram congeladas para imunohistologia. Para as analises histológicas, os espécimens de biopsia da mucosa do cólon, retiradas a 2-3 com do ânus, foram imediatamente congeladas e duplicados das amostras da área adjacente foram fixadas em 10% de formalina fosfatada tamponada, processadas por técnicas histológicas de rotina, embebidas em parafina, cortadas com uma espessura de 6,0 prn, e as secções foram coradas com hematoxilina e eosina. Estas amostras fixadas com formalina foram depois histopatologicamente examinadas. As amostras congeladas fixadas com acetona foram usadas para detectar a IgGl de 111 murídeo administradas in vivo eliminando o anticorpo primário na sequência de uma técnica imunohistoquimica de avidina-biotina peroxidase anteriormente descrita (Ringler, D.J., et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 49: 349-364 (1988)).

Os tratadores dos animais não conheciam o regime terapêutico (ACT-1 vs. anticorpo irrelevante isotipo-emparelhado), e avaliaram a consistência das fezes de cada animal diariamente categorizando as fezes como diarreia, semi-sólidas, ou sólidas. A pontuação foi atribuída da seguinte forma: 0, fezes sólidas com forma; 1, fezes líquidas com alguns componentes (semi-sólidas); ou 2, fezes líquidas (diarreia). Os animais foram pesados dia sim, dia não, retirando-se sangue com o mesmo intervalo para citometria de fluxo, hematologia, e armazenamento de soro ou plasma para análises posteriores, como concentração de anticorpo, título do anti-IgG de rato, química clínica ou proteínas de fase aguda.

Análise de imagem morfométrica assistida por computador

Fez-se uma análise de imagem morfométrica assistida por computador das secções da biopsia à mucosa usando um Leica Quantimet 500 Image Analyzer. Primeiro fez-se a analise imunohistoquimica das secções da mucosa para delinear os tipos específicos de células de leucócitos usando uma técnica de avidina-biotina peroxidase anteriormente descrita (Ringler, D.J., et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 49: 349-364 (1988)). As secções congeladas fixadas com paraformaldeído, acetona, ou formalina, foram usadas para identificar neutrófilos, células β7+ e monócitos/ macrófagos (Mí), respectivamente, usando como reagentes primários na 112 sequência, um anticorpo policlonal anti-elastase de ovelha (Biodesign, Kennebunk, ME), para identificar neutrófilos, um anticorpo monoclonal FIB21 (IgG2a) de ratazana para identificar a cadeia β7 (Andrew, D.P., et al., J. Immunol., 153: 3847-3861 (1994)), e anticorpo monoclonal HAM-56 (IgM de rato) para identificar macrófagos (Dako Corp., Carpinteria, CA). 0 exame das secções coradas de tecido usando o anticorpo elastase documentou que este reagente reconheceu apenas células polimorfonucleares na mucosa de TCT colónicos. As secções de tecido fixadas com formalina e embebidas em parafina foram usadas para enumerar células T e B, usando um anticorpo policlonal de coelho para o CD3 humano (Dako Corp., Carpinteria, CA) e o anticorpo monoclonal L26 (IgG2a de rato) (Dako Corp., Carpinteria, CA), respectivamente, como agentes primários na sequência. Para a detecção de anticorpos primários, usaram-se reagentes secundários específicos para a espécie e isotipo de modo a eliminar o reconhecimento de ACT-1 ou do anticorpo IgGl irrelevante de murídeo nos tecidos. Depois dos procedimentos imunohistoquimicos, cada população de células foi enumerada em 2-4 campos/secções aleatórias da mucosa. As células foram seleccionadas com base no comprimento de onda da cor gerado pelo produto da reacção diaminobenzidina castanho e os critérios de selecção da cor foram idênticos em todas as secções analisadas para cada marcador específico para as células. Devido à morfologia das secções congeladas e à densidade relativamente alta de linfócitos β7+ e de macrófagos, a quantificação destes tipos de células foi avaliada como a área fraccional imunoreactiva da mucosa, enquanto que todos os outros tipos de células de leucócitos foram enumerados como o número de células/área da 113 mucosa. Os valores foram expressos como a percentagem média (± 1 SEM) do valor de pré-tratamento (dia 0) dentro do grupo de tratamento, obtido comparando o valor de cada amostra da biopsia de um animal num determinado momento com o obtido no mesmo animal no dia 0. Assim, valores inferiores a 100% (representados a negrito na Tabela 3 em baixo) representam uma diminuição da densidade de leucócitos em comparação com as amostras pré-tratamento, enquanto que valores superiores a 100% representam um aumento da densidade de células de leucócitos na mucosa. A significância foi determinada usando um teste T de Student e comparando os valores médios da densidade celular num determinado momento com os valores do pré-tratamento. As diferenças entre os valores médios foram considerados significativos quando p<0,05.

Hematologia e citometria de fluxo

Enumeraram-se os leucócitos que expressam integrina α4β7 por citometria de fluxo e a anticorpo monoclonal ACT-1 usando métodos anteriormente descritos (Mackay, C.R., et al., Eur. J. Immunol., 19: 1477-1483 (1989}). Como se atingiram concentrações de saturação de ACT-1 no soro com o protocolo de infusão, pode-se usar ACT-1 administrado exogenamente no soro para enumerar o número de linfócitos α4β7+ no sangue. Resumidamente, analisou-se o sangue completo de cada animal de cada recolha de sangue diluindo 100 μΐ de sangue anticoagulado com EDTA com soro PBS/10% soro de coelho/5% AB humano durante 20 min a 4°C. Depois da remoção do soro de bloqueio, as células do sangue foram directamente incubadas, no caso de animais tratados com ACT-1, com 100 μΐ de anti-IgG-de-rato conjugado com fluoresceina de coelho (Dako 114

Corporation, Carpinteria, CA), ou nos casos de animais a quem dado o anticorpo irrelevante e de amostras de sangue de pré-tratamento, adicionou-se 10 pg/ml de ACT-1 ao sangue, seguido pelo anticorpo secundário. Para cada amostra analisaram-se no minimo 10 000 células. Fizeram-se contagens de células sanguíneas de rotina e análise diferencial usando um analisador hematológico Baker 5000 e uma barreira apropriada para glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas de tamaris cotton-top. A partir dos resultados da análise hematológica e de citometria de fluxo, calcularam-se os números absolutos de linfócitos α4β7+ por μΐ de sangue.

Resultados/Progresso

Concentrações no soro

As concentrações no soro de ACT-1 e de um anticorpo irrelevante isotipo-emparelhado eram geralmente ambos ^10 pg/ml durante os primeiros 10 dias de estudo. Nos dias 2-10 do estudo, o ACT-1 biotinilado, usado no sangue complete numa concentração de 10 pg/ml, não conseguiu marcar significativamente os linfócitos periféricos, como foi determinado por citometria de fluxo em animais tratados com ACT-1, enquanto que no dia 0 e em animais tratados com um anticorpo irrelevante, o mesmo anticorpo reconheceu entre 70-90% dos linfócitos periféricos, similarmente ao perfil de coloração do ACT-1 nos linfócitos humanos. No seu conjunto, estes resultados sugerem que o protocolo terapêutico para o ACT-1 em TCTs coliticos provocou uma saturação da integrina α4β7 nos linfócitos da circulação periférica. A capacidade do ACT-1 reconhecer as células α4β7+ extravasculares dentro da lamina própria da mucosa do cólon 115 de TCTs colíticos também foi avaliada. Usaram-se técnicas imunohistoquimicas para detector IgGl de murideo nas biopsias da mucosa colónica dos animais do estudo e observou-se ACT-1 nas membranas celulares de células mononucleares dentro da lamina própria em todos os momentos de biopsia nos primeiros 10 dias do estudo em animais tratados com ACT-I, mas não, como esperado, no Dia Oantes da infusão de anticorpo. Não se observou marcação das células da lamina própria em animais a quem foi dado anticorpo irrelevante. Assim sendo, o regime de dose utilizado no estudo teve como resultado a neutralização das concentrações no soro de ACT-I, e o reconhecimento extravascular concomitante e marcação de células imunitárias dentro da mucosa colitica. O anticorpo ACT-1 localizou o sitio alvo, nomeadamente os linfócitos no sangue periférico e especificamente no compartimento extravascular na mucosa colitica.

Efeito clinico .Todos os quatro animais teste tinham um grau 2 ou 3 de actividade inflamatória colitica nas amostras da biopsia quer no pré-tratamento quer no Dia 0, que no caso de 3 dos animais tinham um intervalo de 5 dias. Para além disso, as alterações na arquitectura da mucosa dos quatro animais demonstraram que estes quatro animais tinham colite com uma natureza de longa duração. Assim, todos os animais pareciam ter o desenvolvimento de uma doença crónica.

Fez-se a análise histopatológica das biopsias da mucosa do cólon. Os resultados de TCTs representativos (animais Sgo 326-84 e Sgo 17-85) antes e 5 dias depois da imunoterapia com ACT-1 ilustraram o efeito terapêutico da imunoterapia com 116 ACT-1 nas alterações microscópicas da mucosa colónica em TCTs coliticos. Antes da imunoterapia, havia um exsudado purulento no compartimento epitelial e no lúmen da cripta, imaturidade epitelial caracterizada pela perda de células em taça completamente diferenciadas, e a lamina própria foi expandida devido a um infiltrado inflamatório purulento e mononuclear (Sgo 326-84, muscularis mucosae). Depois da imunoterapia com ACT-1, localizou-se o ACT-1 nas membranas de células mononucleares dentro da lamina própria usando técnicas imunohistoquimicas (Sgo 17-85, muscularis mucosae), e o componente neutrofilico do infiltrado inflamatório tinha-se resolvido, observaram-se células em taça completamente diferenciadas e lamina própria já não estava expandida por células mononucleares e/ou neutrófilos (Sgo 326-84). 0 efeito clinico de ACT-1 na consistência das fezes em TCTs coliticos foi surpreendente (Figura 14). Observou-se uma melhoria da diarreia para pelo menos uma consistência de fezes semi-sólidas em todos os animais nas 24 horas seguintes à primeira dose tendo a completa alteração para fezes sólidas ocorrido em todos os animais às 72 horas. Os animais controlo não melhoraram e tiveram diarreia durante todo o período de estudo, mostrando, adicionalmente, que os critérios de pré-selecção para este grupo de animais efectivamente eliminaram os que podiam ter remissões espontâneas.

Todos os animais mantiveram fezes sólidas durante aproximadamente 1 semana após o fim das injecções de anticorpo (Figura 11) . Em relação a animais individuais, um animal (Sgo 63-93) teve fezes sólidas desde o Dia 4 até ao fim do protocolo no Dia 20 (Figura 11) . Dois animais (Sgo 129-91 e Sgo 17-85) tiveram ligeiras recaídas para fezes 117 semi-sólidas após o Dia 14 do estudo (Figura 11). 0 quarto animal (Sgo 326-84) mostrou uma melhoria/ resolução persistente da diarreia do Dia 6 ao Dia 20. De igual modo, os infiltrados de leucócitos no cólon foram marcadamente atenuados nos TCTs a quem foi dado ACT-l. Comparadas com as biopsias pré-tratamento, as análises histológicas da mucosa do cólon (espécimens de biopsia de mucosa do cólon fixadas com formalina) de animais tratados com ACT-l mostraram uma melhoria da actividade inflamatória e das alterações estruturais associadas na mucosa. Usando um sistema de pontuação histológico da actividade inflamatória colónica (Madara, J.L., et al., Gastroenterology, 88: 13-19 (1985)), os animais tratados com ACT-l tinham uma diminuição evidente das pontuações de actividade inflamatória em todos os momentos comparados com a pontuação base do pré-tratamento, enquanto que a pontuação dos animais a quem foi dado o anticorpo controlo não se alterou (Figura 15) . Não houve alterações nas pontuações inflamatórias do grupo com tratamento irrelevante no Dia 20 (Figura 15) . As pontuações médias da actividade inflamatória em todos os momentos do grupo tratado com ACT-l eram estatisticamente inferiores aos dos mesmos animais no Dia 0 (Dias 5 e 10, P < 0,05; Dia 20, P < 0,01) .

Em relação a animais individuais, todos os quatro animais teste apresentaram uma melhoria da actividade inflamatória durante ou depois da imunoterapia com ACT-l. A colite em dois animais (Sgo 129-91 e Sgo 17-85) estava completamente resolvida pelo Dia 10 (Figura 12). Outro animal (Sgo 63-93) não completou a revogação da actividade colitica até ao Dia 20 (Figura 12), enquanto que as pontuações da biopsia à 118 mucosa do quarto animal (Sgo 326-84) mostraram uma melhoria durante todo o periodo de estudo (Figura 12; duas biopsias no dia 20 no Sgo 326-84 tiveram como pontuação 0 e 1). Para além disso, o animal 326-84 ganhou 20% do seu peso corporal original durante o periodo de estudo.

De modo a se obter uma avaliação mais quantitativa da eficácia fez-se uma análise de imagem morfométrica assistida por computador dos subconjuntos de leucócitos dentro da mucosa do cólon para todos os animais do estudo. A Tabela 3 ilustra os resultados de uma análise do efeito da imunoterapia com ACT-1 na actividade inflamatória no cólon em TCTs com colite crónica (expressa como percentagem dos valores do pré-tratamento). A imunoterapia com ACT-1 teve como resultado reduções significativas na densidade de leucócitos na mucosa em comparação com os números base estabelecidos antes da administração do anticorpo, enquanto que o grupo controlo teve números similares ou mais elevados de leucócitos na mucosa após a administração do anticorpo irrelevante. Dez dias após a primeira dose de anticorpo ACT-1, havia aproximadamente 30% menos leucócitos mononucleares na mucosa que expressavam integrinas α4β7 em comparação com os valores pré-tratamento. Esta diminuição não foi atribuída à diminuição do número de linfócitos α4β7+ na circulação periférica (Figura 16), nem estava relacionada com efeitos de manipulação ou não-específicos pois o número de leucócitos β7+η3 mucosa do cólon dos animais controlo ou aumentou ou se manteve inalterado. De igual modo, as células T da mucosa foram reduzidas em aproximadamente 50% pelo dia 5 e, em cerca de 25% pelo dia 10 nos animais tratados com ACT-1, enquanto que as células T da mucosa no grupo com anticorpo irrelevante 119 não se alterou, nos mesmos momentos. Observaram-se reduções comparáveis nas células B da mucosa no grupo tratado com o ACT-1 mas não no grupo controlo. Curiosamente, a imunoterapia com ACT-1 também reduziu a densidade de leucócitos na mucosa gue tinham pouca ou nenhuma expressão de α4β7. Os neutrófilos foram reduzidos em 40-45% nos dias 10 e 20 em animais tratados com ACT-1, no entanto não se observaram reduções de PMNs no grupo controlo. De igual modo, os macrófagos da mucosa foram reduzidos em todas as amostras de biopsia pré-tratamento em 30-45% em animais tratados com ACT-1, enquanto que não houve alterações nos macrófagos do grupo controlo. Curiosamente, usando imunohistoquimica e um anticorpo monoclonal de reacção cruzada para a MAdCAM clonada humana (10G3, Exemplo 2), não se observaram alterações na expressão de TCTs coliticos tratados com ACT-1 ou com anticorpo controlo. 120 TABELA 3

Análise quantitativa da densidade de leucócitos na mucosa do cólon em TCTs tratados com ACT-1 ou anticorpos monoclonais controlo ACT-1 IgGl Irrelevante Pffls Células β7+ Células T Células B Μφ Pffls Células β7+ Células T Células B Μφ Dia 5 (¾) 83,0111,3 69,9112,0 50,4+5,9 [ 53,1+11,8t 70,316,4* 75,7117,8 73,8110,0 104,018,0 256,1167,7 141,8121,6 Dia 57,5+13,7t 68,4+7,lt 75, 9+44, 4§ 82,1117,6 58,514,3 [ 148,3149,3 118,8127,6 105,619,6 357,01108,4 80,719,8 10 (¾) Dia 61,1+11,4§ 59,8+12,6§ 96,4110,4 61,3113,4§ 58,515,0§ 339,6194,1 113,7128,1 72,4111,3t 209,0151,0 174,5148,0 20 (¾) t P < 0,05 ; *P < 0,02; §P<0,01; [P<0,001 121 Não se observou uma toxicidade clara nos animais do estudo que pudesse ser atribuída à administração de ACT-1. Nenhum dos animais do estudo apresentou alterações das avaliações de química clínica da função renal ou hepática (dados não representados). 0 anticorpo ACT-1 é um reagente monoclonal não lítico (Lazarovits, A.I., et al., J. Immunol., 133: 1857-1862 (1984)), e não se observou leucopenia em qualquer animal durante o estudo. De facto, houve uma tendência para neutrofilia (os números máximos no sangue periférico aproximaram-se de 40 x 103/μ1; o intervalo normal nos TCT é de 1,4-12,0 x 103/μ1) em todos os animais do estudo, incluindo os animais controlo, durante a primeira semana de estudo, em que diariamente se usou anestesia/manipulação para administrar os anticorpos. Também houve a tendência para a linfocitose nos animais a quem foi dado ACT-1, com números absolutos de linfócitos no sangue periférico a atingirem 18 x 103/μ1 (intervalo normal nos TCT é de 0,6-5,7 x 103/μ1). Assim, a diminuição do recrutamento de qualquer tipo de células de leucócito para o cólon no grupo tratado com ACT-1 não pode ser atribuída a alterações no número de leucócitos na circulação periférica.

Sumário

Quando administrado a tamaris cotton-top com colite crónica, o anticorpo monoclonal contra a integrina α4β7 resolve rapidamente a diarreia e a actividade inflamatória, o que indica eficácia no melhoramento da colite. Parece haver uma boa correlação entre as pontuações histológicas da actividade inflamatória e a consistência das fezes. A observação de que a consistência das fezes melhorou, em 122 geral, em 1-2 dias nos animais que receberam o anticorpo ACT-1 é digna de nota. Para além disso, a densidade relativa dos subconjuntos de leucócitos na mucosa foi grandemente atenuada em resposta à imunoterapia com anticorpos anti- α4β7. Estes resultados também demonstram uma terapia eficaz para um processo inflamatório que pode ser especifico para um órgão ou tecido (especifico para mucosa). 0 efeito terapêutico de ACT-1 em TCTs colíticos pode ser mediado pela inibição do recrutamento de linfócitos para o intestino. Em alternativa, ou adicionalmente, o efeito terapêutico observado pode reflectir alterações noutras interacções celulares ou na sinalização de acontecimentos mediados pela integrina α4β7. Estes resultados indicam que o anticorpo ACT-1 é um antagonista eficaz da função integrina α4β7 e que a inibição da função integrina α4β7 pode ser uma modalidade de tratamento especifico para um órgão ou tecido na gestão clinica de indivíduos com doença inflamatória do intestino. Para além disso, os resultados indicam um papel para a integrina α4β7 na patogénese da doença inflamatória do intestino. A integrina α4β7 providencia um potencial alvo terapêutico específico para o órgão para a doença inflamatória do intestino. 123 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: LeukoSite, Inc. (B) RUA: 215 First Street (C) CIDADE: Cambridge (D) ESTADO/PROVÍNCIA: Massachusetts (E) PAÍS: U.S.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 02142 (G) TELEFONE: (617) 621-9350 (I) FAX: (617) 621-9349 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: Michael J. Briskin (B) RUA: 28 Harbell Rua (C) CIDADE: Lexington (D) ESTADO/PROVÍNCIA: Massachusetts (E) PAÍS: U.S.A. (F) CÓDIGO POSTAL : 02173 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: Douglas J. Ringler (B) RUA: 382 Ocean Avenue, #1008 (C) CIDADE: Revere (D) ESTADO/PROVÍNCIA: Massachusetts (E) PAÍS: U.S.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 02151 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: Dominic Picarella (B) RUA: 2 North Bennet Court, #4 (C) CIDADE: Boston (D) ESTADO/PROVÍNCIA: Massachusetts (E) PAÍS: U.S.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 02113 124 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: Walter Newman (B) RUA: 3 Durham Street, #3 (C) CIDADE: Boston (D) ESTADO/PROVÍNCIA: Massachusetts (E) PAÍS: U.S.A. (F) CÓDIGO POSTAL : 02115 (ii) Título da Invenção: Adressinas Vasculares da Mucosa e suas Utilizações (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 13 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) MORADA : Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C. (B) RUA: Two Militia Drive (C) CIDADE: Lexington (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: U.S.A. (F) ZIP: 02173-4799 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) DADOS DA REQUISIÇÃO ACTUAL: (A) N° DE REQUERENTE: (B) DATA DE PREENCHIMENTO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE REQUISIÇÕES ANTERIORES: (A) N° DE REQUERENTE: US 08/523,004 (B) DATA DE PREENCHIMENTO: 01-SET-1995 (vii) DADOS DE REQUISIÇÕES ANTERIORES: (A) N° DE REQUERENTE: US 08/386,857 (B) DATA DE PREENCHIMENTO: 10-FEV-1995 (viii) INFORMAÇÃO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Brook, Dav id E. (B) N° DE REGISTO: 22,592

(C) REFERÊNCIA/N° DE REGISTO: LKS94-04A2 PCT 125 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-861-6240 (B) FAX: 617-861-9540 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1624 Pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERISTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1 ·· 1218 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 ATG GAT TTC GGA CTG GCC CTC CTG CTG GCG GGG CTT CTG GGG CTC CTC 48 Met Asp Fen Gli Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gli Leu Leu Gli Leu Leu 1 5 10 15 CTC GGC CAG TCC CTC CAG GTG AAG CCC CTG CAG GTG GAG CCC CCG GAG 96 Leu Gli Gin Ser Leu Gin Vai Lis Pro Leu Gin Vai Glu Pro Pro Glu 20 25 30 CCG GTG GTG GCC GTG GCC TTG GGC GCC TCG CGC CAG CTC ACC TGC CGC 144 Pro Vai Vai Ala Vai Ala Leu Gli Ala Ser Arg Gin Leu Tre Cis Arg 40 45 35 126 CTG GCC TGC GCG GAC CGC GGG GCC TCG GTG CAG TGG CGG GGC CTG GAC 192 Leu Ala Cis Ala Asp Arg Gli Ala Ser Vai Gin Trp Arg Gli Leu Asp 50 55 60 ACC AGC CTG GGC GCG GTG CAG TCG GAC ACG GGC CGC AGC GTC CTC ACC 240 Tre Ser Leu Gli Ala Vai Gin Ser Asp Tre Gli Arg Ser Vai Leu Tre 65 70 75 80 GTG CGC AAC GCC TCG CTG TCG GCG GCC GGG ACC CGC GTG TGC GTG GGC 288 Vai Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gli Tre Arg Vai Cis Vai Gli 85 90 95 TCC TGC GGG GGC CGC ACC TTC CAG CAC ACC GTG CAG CTC CTT GTG TAC 336 Ser Cis Gli Gli Arg Tre Fen Gin His Tre Vai Gin Leu Leu Vai Tir 100 105 110 GCC TTC CCG GAC CAG CTG ACC GTC TCC CCA GCA GCC CTG GTG CCT GGT 384 Ala Fen Pro Asp Gin Leu Tre Vai í Ser Pro Ala Ala Leu Vai Pro Gli 115 120 125 GAC CCG GAG GTG GCC TGT ACG GCC CAC AAA GTC ACG CCC GTG GAC CCC 432 Asp Pro Glu Vai Ala Cis Tre Ala His Lis Vai Tre Pro Vai Asp Pro 130 135 140 AAC GCG CTC TCC TTC TCC CTG CTC GTC GGG GGC CAG GAA CTG GAG GGG 480 127

Asn Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Vai Gli Gli Gin Glu Leu Glu Gli 145 150 155 160 GCG CAA GCC CTG GGC CCG GAG GTG CAG GAG GAG GAG GAG GAG CCC CAG 528 Ala Gin Ala Leu Gli Pro Glu Vai Gin Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gin 165 170 175 GGG GAC GAG GAC GTG CTG TTC AGG GTG ACA GAG CGC TGG CGG CTG CCG 576 Gli Asp Glu Asp Vai Leu Fen Arg Vai Tre Glu Arg Trp Arg Leu Pro 180 185 190 CCC CTG GGG ACC CCT GTC CCG CCC GCC CTC TAC TGC CAG GCC ACG ATG 624 Pro Leu Gli Tre Pro Vai Pro Pro Ala Leu Tir Cis Gin Ala Tre Met 195 200 205 AGG CTG CCT GGC TTG GAG CTC AGC CAC CGC CAG GCC ATC CCC GTC CTG 672 Arg Leu Pro Gli Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala Ile Pro Vai Leu 210 215 220 CAC AGC CCG ACC TCC CCG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG CCT 720 His Ser Pro Tre Ser Pro Glu Pro Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Pro 225 230 235 240 CCC AAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT 768 Pro Asn Tre Tre Ser Pro Glu Ser Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Ser 245 250 255 CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT 816 128

Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro 260 265 270

CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG CCT 864

Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro Pro

Asp Tre Tre Ser Pro Glu Pro 275 280 285 CCC GAC AAG ACC TCC CCG GAG CCC GCC CCC CAG CAG GGe TCC ACA CAC 912 Pro Asp Lis Tre Ser Pro Glu ] Pro Ala Pro Gin Gin ( Gli Ser Tre His 290 295 300 ACC CCC AGG AGC CCA GGC TCC ACC AGG ACT CGC CGC CCT GAG ATC TCC 960 Tre Pro Arg Ser Pro Gli Ser Tre Arg Tre Arg Arg Pro Glu Ile Ser 305 310 315 320 CAG GCT GGG CCC ACG CAG GGA GAA GTG ATC CCA ACA GGC TCG TCC AAA 1008 Gin Ala Gli Pro Tre Gin Gli Glu Vai Ile Pro Tre Gli Ser Ser Lis 325 330 335 CCT GCG GGT GAC CAG CTG CCC GCG GCT CTG TGG ACC AGC AGT GCG GTG 1056 Pro Ala Gli Asp Gin Leu Pro Ala Ala Leu Trp Tre Ser Ser Ala Vai 340 345 350 CTG GGA CTG CTG CTC CTG GCC TTG CCC ACG TAT CAC CTC TGG AAA CGC 1104 Leu Gli Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Tre Tir His Leu Trp Lis Arg 360 365 355 129 TGC CGG CAC CTG GCT GAG GAC GAC ACC CAC CCA CCA GCT TCT CTG AGG 1152 Cis Arg His Leu Ala Glu Asp Asp Tre His Pro Pro Ala Ser Leu Arg 370 375 380 CTT CTG CCC CAG GTG TCG GCC TGG GCT GGG TTA AGG GGG ACC GGC CAG 1200 Leu Leu Pro Gin Vai Ser Ala Trp Ala Gli Leu Arg Gli Tre Gli Gin 385 390 395 400 GTC GGG ATC AGC CCC TCC TGAGTGGCCA GCCTTTCCCC CTGTGAAAGC 1248 Vai Gli Ile Ser Pro Ser 405 AAAATAGCTT GGACCCCTTC AAGTTGAGAA CTGGTCAGGG CAAACCTGCC TCCCATTCTA 1308 CTCAAAGTCA TCCCTCTGCT CACAGAGATG GATGCATGTT CTGATTGCCT CTTTGGAGAA 1368 GCTCATCAGA AACTCAAAAG AAGGCCACTG TTTGTCTCAC CTACCCATGA CCTGAAGCCC 1428 CTCCCTGAGT GGTCCCCACC TTTCTGGACG GAACCACGTA CTTTTTACAT ACATTGATTC 1488 ATGTCTCACG TCTCCCTAAA AATGCGTAAG ACCAAGCTGT GCCCTGACCA CCCTGGGCCC 1548 CTGTCGTCAG GACCTCCTGA GGCTTTGGCA AATAAACCTC CTAAAATGAT AAAAAAAAAA 1608

AAAAAAAAAA AAAAAA 1624 (2 ) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 406 aminoácidos (B ) TIPO: aminoácido 130 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2

Met Asp Fen Gli Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gli Leu Leu Gli Leu Leu 1 5 10 15

Leu Gli Gin Ser Leu Gin Vai Lye Pro Leu Gin Vai Glu Pro Pro Glu 20 25 30

Pro Vai Vai Ala Vai Ala Leu Gli Ala Ser Arg Gin Leu Tre Cis Arg 35 40 45

Leu Ala Cis Ala Asp Arg Gli Ala Ser Vai Gin Trp Arg Gli Leu Asp 50 55 60

Tre Ser Leu Gli Ala Vai Gin Ser Asp Tre Gli Arg Ser Vai Leu Tre 65 70 75 80

Vai Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gli Tre Arg Vai Cis Vai Gli 85 90 95

Ser Cis Gli Gli Arg Tre Fen Gin His Tre Vai Gin Leu Leu Vai Tir 100 105 110

Ala Fen Pro Asp Gin Leu Tre Vai Ser Pro Ala Ala Leu Vai Pro Gli 115 120 125

Asp Pro Glu Vai Ala Cis Tre Ala His Lis Vai Tre Pro Vai Asp Pro 130 135 140

Asn Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Vai Gli Gli Gin Glu Leu Glu Gli 131 145 150 155 160

Ala Gin Ala Leu Gli Pro Glu Vai Gin Glu Glu Glu Glu Glu Pro

Gin 165 170 175

Gli Asp Glu Asp Vai Leu Fen Arg Vai Tre Glu Arg Trp Arg Leu

Pro 180 185 190

Pro Leu Gli Tre Pro Vai Pro Pro Ala Leu Tir Cis Gin Ala Tre

Met 195 200 205

Arg Leu Pro Gli Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala Ile Pro Vai Leu 210 215 220

His Ser Pro Tre Ser Pro Glu Pro Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Pro 225 230 235 240

Pro Asn Tre Tre Ser Pro Glu Ser Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu

Ser 245 250 255

Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro 260 265 270

Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Pro 275 280 285

Pro Asp Lis Tre Ser Pro Glu Pro Ala Pro Gin Gin Gli Ser Tre His 290 295 300

Tre Pro Arg Ser Pro Gli Ser Tre Arg Tre Arg Arg Pro Glu Ile Ser 305 310 315 320

Gin Ala Gli Pro Tre Gin Gli Glu Vai Ile Pro Tre Gli Ser Ser Lis 335 132 335 132 325 330

Pro Ala Vai 350 Leu Gli Arg 365

Gli Asp Gin Leu Pro Ala Ala Leu Trp Tre Ser Ser Ala 340 345

Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Tre Tir His Leu Trp Lis 355 360

Cis Arg His Leu Ala Glu Asp Asp Tre His Pro Pro Ala Ser Leu Arg 370 375 380

Leu Leu Pro Gin Vai Ser Ala Trp Ala Gli Leu Arg Gli .Tre Gli Gin 385 390 395 400

Vai Gli Ile Ser Pro Ser 405 (2 ) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1539 Pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERISTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1. .1146 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3 ATG GAT TTC GGA CTG GCC CTC CTG CTG GCG GGG CTT CTG GGG CTC CTC 48

Met Asp Fen Gli Leu Ala Leu Leu Leu Ala

Gli Leu Leu Gli Leu Leu 1 5 10 15 133

CTC GGC CAG TCC CTC CAG GTG AAG CCC CTG CAG GTG GAG CCC CAG GAG 96 Leu Gli Gin Ser Leu Gin Vai Lis Pro Leu Gin Vai Glu Pro Pro Glu 20 25 30 CCG GTG GTG GCC GTG GCC TTG GGC GCC TCG CGC CAG CTC ACC TGC CGC 144 Pro Vai Vai Ala Vai Ala Leu Gli Ala Ser Arg Gin Leu Tre Cis Arg 35 40 45 CTG GCC TGC GCG GAC CGC GGG GCC TCG GTG CAG TGG CGG GGC CTG GAC 192 Leu Ala Cis Ala Asp Arg Gli Ala Ser Vai Gin Trp Arg Gli Leu ASp 50 55 60 ACC AGC CTG GGC GCG GTG CAG TCG GAC ACG GGC CGC AGC GTC CTC ACC 240 Tre Ser Leu Gli Ala Vai Gin Ser Asp Tre Gli Arg Ser Vai Leu Tre 65 70 75 80 GTG CGC MC GCC TCG CTG TCG GCG GCC GGG ACC CGC GTG ' TGC GTG GGC 288 Vai Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gli Tre Arg Vai Cis Vai Gli 85 90 95 TCC TGC GGG GGC CGC ACC TTC CAG CAC ACC GTG CAG CTC CTT GTG TAC 336 Ser Cye Gli Gli Arg Tre Fen Gin His Tre Vai Gin Leu Leu Vai Tir 100 105 110 GCC TTC CCG GAC CAG CTG ACC GTC Tce CCA GCA GCC CTG GTG CCT GGT 384 Ala Fen Pro Asp Gin Leu Tre Vai : Ser Pro Ala Ala Leu Vai Pro Gli 115 120 125 GAC CCG GAG GTG GCC TGT ACG GCC CAC AAA GTC ACG CCC GTG GAC CCC 432 134 134 Ala Cis Tre Ala His Vai Asp Pro 135

Asp Pro Glu Vai

Lis Vai Tre Pro 130 140 AAC GCG CTC TCC TTC TCC CTG CTC GTC GGG GGC CAG GAA CTG GAG GGG 480

Asn Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Vai Gli Gli Gin Glu Leu Glu Gli 145 150 155 160 GCG CAA GCC CTG GGC CCG GAG GTG CAG GAG GAG GAG GAG GAG CCC CAG 528

Ala Gin Ala Leu Gli Pro Glu Vai Gin Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gin 165 170 175

GGG GAC GAG GAC GTG CTG TTC AGG GTG ACA GAG CGC TGG CGG CTG CCG 576

Gli Asp Glu Asp Vai Leu Fen Arg Vai Tre Glu Arg Trp Arg Leu Pro 180 185 190

CCC CTG GGG ACC CCT GTC CCG CCC GCC CTC TAC TGC CAG GCC ACG ATG 624

Pro Leu Gli Tre Pro Vai Pro Pro Ala Leu Tir Cis Gin Ala Tre Met 195 200 205 AGG CTG CCT GGC TTG GAG CTC AGC CAC CGC CAG GCC ATC CCC GTC CTG 672

Arg Leu Pro Gli Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala Ile Pro Vai Leu 210 215 220 CAC AGC CCG ACC TCC CCG GAG CCT CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT 720

His Ser Pro Tre Ser Pro Glu Pro Pro

Asp Tre Tre Ser Pro Glu Ser 225 230 235 240 CCC GAC ACC ACC TCC CCG GAG TCT CCC GAC ACC ACC TCC CAG GAG CCT 768

Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Ser Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro 245 135 250 255 ccc GAC ACC ACC TCC CCG GAG CCT CCC GAC AAG ACC TCC CCG GAG ccc 816 Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Pro Pro Asp Lis Tre Ser Pro Glu Pro 260 265 270 GCC CCC CAG CAG GGC TCC ACA CAC ACC CCC AGG AGC CCA GGC TCC ACC 864 Ala Pro Gin Gin Gli Ser Tre His Tre Pro Arg Ser Pro Gli Ser Tre 275 280 285 AGG ACT CGC CGC CCT GAG ATC TCC CAG GCT GGG CCC ACG CAG GGA GAA 912 Arg Tre Arg Arg Pro Glu Ile Ser Gin Ala Gli Pro Tre Gin Gli Glu 290 295 300 GTG ATC CCA ACA GGC TCG TCC AAA CCT GCG GGT GAC CAG CTG CCC GCG 960 Vai lie Pro Tre Gli Ser Ser Lye Pro Ala Gli Asp Gin Leu Pro Ala 305 310 315 320 GCT CTG TGG ACC AGC AGT GCG GTG CTG GGA CTG CTG CTC CTG GCC TTG 1008 Ala Leu Trp Tre Ser Ser Ala Vai Leu Gli Leu Leu Leu Leu Ala Leu 325 330 335 CCC ACC TAT CAC CTC TGG AAA CGC TGC CGG CAC CTG GCT GAG GAC GAC 1056 Pro Tre Tir His Leu Trp Lis Arg Cis Arg His Leu Ala Glu Asp Asp 340 345 350 ACC TGG CAC CCA 1104 CCA GCT TCT CTG AGG CT-T CTG CCC CAG GTG TCG GCC Tre His Pro Pro Ala Ser Leu Arg Leu Leu Pro Gin Vai Ser Ala Trp 6 355 136 360 365 GCT GGG TTA AGG GGG ACC GGC CAG GTC GGG ATC AGC CCC TCC 114 Ala Gli Leu Arg Gli Tre Gli Gin Vai Gli Ile Ser Pro Ser 370 375 380 TGAGTGGCCA GCCTTTCCCC CTGTGAAAGC AAMTAGCTT GGACCCCTTC AAGTTGAGAA 1206 CTGGTCAGGG CAAACCTGCC TCCCATTCTA CTCAAAGTCA TCCCTCTGTT CACAGAGATG 1266 GATGCATGTT CTGATTGCCT CTTTGGAGAA GCTCATCAGA AACTCAAAAG AAGGCCACTG 1326 TTTGTCTCAC CTACCCATGA CCTGAAGCCC CTCCCTGAGT GGTCCCCACC TTTCTGGACG 1386 GAACCACGTA CttttTACAT ACATTGATTC ATGTCTCACG TCTCCCTAAA AATGCGTAAG 1446 ACCAAGCTGT GCCCTGACCA CCCTGGGCCC CTGTCGTCAG GACCTCCTGA GGCTTTGGCA 1506 AATAAACCTC CTAAAATGAA AAAAAAAAAA AAA 1539 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 382 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

( ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4

Met Asp Fen Gli Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gli Leu Leu Gli Leu Leu 1 5 10 15

Leu Gli Gin Ser Leu Gin Vai Lis Pro Leu Gin Vai Glu Pro Pro Glu 30 137 30 137 20 25

Pro Vai Vai Ala Vai Ala Leu Gli Ala Ser Arg Gin Leu Tre Cis

Arg 35 40 45

Leu Ala Cis Ala Asp Arg Gli Ala Ser Vai Gin Trp Arg Gli Leu Asp 50 55 60

Tre Ser Leu Gli Ala Vai Gin Ser Asp Tre Gli Arg Ser Vai Leu

Tre 65 70 75 80

Vai Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gli Tre Arg Vai Cis Vai

Gli 85 90 95

Ser Cis Gli Gli Arg Tre Fen Gin His Tre Vai Gin Leu Leu Vai

Tir 100 105 110

Ala Fen Pro Asp Gin Leu Tre Vai Ser Pro Ala Ala Leu Vai Pro Gli 115 120 125

Asp Pro Giu Vai Ala Cis Tre Ala His Lis Vai Tre Pro Vai Asp Pro 130 135 140

Asn Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Vai Gli Gli Gin Glu Leu Glu Gli 145 150 155 160

Ala Gin Ala Leu Gli Pro Glu Vai Gin Glu Glu Glu Glu Glu Pro

Gin 165 170 175

Gli Asp Glu Asp Vai Leu Fen Arg Vai Tre Glu Arg Trp Arg Leu Pro 180 185 190

Pro Leu Gli Tre Pro Vai Pro Pro Ala Leu Tir Cis Gin Ala Tre Met 138 195 200 205

Arg Leu Pro Gli Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala Ile Pro Vai Leu 210 215 220

His Ser Pro Tre Ser Pro Glu Pro Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Ser 225 230 235 240

Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Ser Pro Asp Tre Tre Ser Gin Glu Pro 245 250 255

Pro Asp Tre Tre Ser Pro Glu Pro Pro Asp Lis Tre Ser Pro Glu Pro 260 265 270

Ala Pro Gin Gin Gli Ser Tre His Tre Pro Arg Ser Pro Gli Ser

Tre 275 280 285

Arg Tre Arg Arg Pro Glu Ile Ser Gin Ala Gli Pro Tre Gin Gli Glu 290 295 300

Vai He Pro Tre Gli Ser Ser Lis Pro Ala Gli Asp Gin Leu Pro

Ala 305 310 315 320

Ala Leu Trp Tre Ser Ser Ala Vai Leu Gli Leu Leu Leu Leu Ala Leu 325 330 335

Pro Tre Tir His Leu Trp Lis Arg Cis Arg His Leu Ala Glu Asp Asp 340 345 350

Tre His Pro Pro Ala Ser Leu Arg Leu Leu Pro Gin Vai Ser Ala Trp 355 360 365

Ala Gli Leu Arg Gli Tre Gli Gin Vai Gli He Ser Pro Ser 370 375 380 139 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1721 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERISTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 4 .· 1038 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5 AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC CTC CTG CTG GCG GGG CTT CTG GGG CTC 48

Met Asp Arg Gli Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gli Leu Leu Gli Leu 1 5 10 15 CTC CAG CCG GGC TGC GGC CAG TCC CTC CAG GTG AAG CCC CTG CAG GTG 96

Leu Gin Pro Gli Cis Gli Gin Ser Leu Gin Vai Lis Pro Leu Gin Vai 20 25 30

GAG CCC CCG GAG CCG GTG GTG GCC GTG GCC CTG GGC GCC TCT CGC CAG 144

Glu Pro Pro Glu Pro Vai Vai Ala Vai

Ala Leu Gli Ala Ser Arg Gin 35 40 45

CTC ACC TGC CGC CTG GAC TGC GCG GAC CGC GGG GCC ACG GTG CAG TGG 192

Leu Tre Cis Arg Leu Asp Cis Ala Asp Arg

Gli Ala Tre Vai Gin Trp 50 55 60

CGG GGC CTG GAC ACC AGC CTG GGC GCG GTG CAG TCG GAC GCG GGC CGC 240 70 140 70 140 Arg Vai 75 AGC CGT Ser Ser 80 90 GTG CGG Vai Tre 105 CTC GCC Leu Tre 120 CTG ACG Leu Tre 135 CCT CAG Pro Leu 155 GAA GAG Glu Glu 160 170 GAG CGC Glu Leu

Ser Leu Gli Ala Gli Arg GAG CCC CAG GAG GAG 576

Gli Leu Asp Tre

Gin Ser Asp Ala 65 GTC CTC ACC GTG CGC AAC GCC TCG CTG TCG GCG GCC GGG ACC 288

Vai Leu Tre Vai Arg Asn Ala Ser Leu Ala Ala Gli Tre Arg 85 95

TGC GTG GGC TCC TGC GGG GGC CGC ACC TTC CAG CAC ACC GTG 336

Cis Vai Gli Ser Cis Gli Gli Arg Fen Gin His Tre Vai Arg 100 110

CTT GTG TAC GCC TTC CCG GAC CAG CTG ACC ATC TCC CCG GCA 384

Leu Vai Tir Ala Fen Pro Asp Gin Leu Ile Ser Pro Ala Ala 115 125 GTG CCT GGT GAC CCG GAG GTG GCC TGT ACG GCC CAC AM GTC 432

Vai Pro Gly Asp Pro Glu Vai Ala Cye Ala His Lis Vai Tre 130 140 GTG GAC CCC AAT GCG CTC TCC TTC TCC CTG CTC CTG GGG GAC 480

Vai Asp Pro Asn Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Gli Asp Gin 145 150 CTG GAG GGG GCC CAG GCT CTG GGC CCG GAG GTG GAG GAG GAG 528

Leu Glu Gli Ala Gin Ala Leu Gly Pro Vai Glu Glu Glu Glu 165 175

GAG GAC GTG CTG TTC AGG GTG ACA GAG

Glu Pro Gin Glu Glu Glu Asp Vai Fen Arg Vai Tre Glu Arg 180 141 185 TGG CGG CTG CCG ACC CTG 190 GCA ACC CCT GTC CTG CCC GCG CTC TAC TGC Trp 624 Arg Leu Pro Tre Leu Ala Tre Pro Vai Leu 200 Pro Ala Leu Tir Cis 195 205 CAG GCC ACG ATG AGG CTG CCT GGC TTG GAG CTC AGC CAC CGC CAG GCC 672 Gin Ala Tre Met krg Leu Pro Gli Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala 210 215 220 ATC CCG GTC CTG CAC GGC CCG ACC TCC CGG GAG CCC CCC GAC ACG ACC 720 Ile Pro Vai Leu His Gli Pro Tre Ser Arg Glu Pro Pro ?\sp Tre Tre 225 230 235 TCC CCG GAA CCC CGG GCC GCG ACC TCC CCG GAG ACC ACC CCC CAG CAG 768 Ser Pro Glu Pro ?\rg Ala Ala Tre Ser Pro Glu Tre Ire Pro Gin ( Gin 240 245 250 255 GGC TCC ACA CAC AGC CCC AGG AGC CCG GGC TCT ACC AGG ACT TGC CGC 816 Gli Ser Tre His Ser Pro Arg Ser Pro Gli Ser Tre Arg Tre Cis Arg 260 265 270 CCT GAG ATC TCC CAG GCT GGG CCC ACG CAG GGA GAA GTG ATC CCA ACA 864 Pro Glu lie Ser Gin Ala Gli Pro Tre Gin Gli Glu Vai Ile Pro Tre 275 280 285 GGC TCG TCC AAA CCT ACG GGT GAC CAG CTG CCC GCG GCT CTG TGG ACC 912 Gli Ser Ser Lis Pro Tre Gli Asp Gin Leu Pro Ala Ala Leu Trp Tre 290 142 295 300

AGC AGT GCG GTG CTG GGA CTG CTG CTC CTG GCT TTG CCC ACC TAC CAC 960

Ser Ser Ala Vai Leu Gli Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Tre Tir His 305 310 315 CTC TGG AM CGT TGC CGG CAC CTG GCT GAG GAC GGC GCC CAC CCA CCA 1008

Leu Trp Lis Arg Cis Arg His Leu Ala Glu

Asp Gli Ala His Pro Pro 320 325 330 335

GCT TCT CTG AGT AGC CAG CCC TTC CCC CTG TGAAGGGAAA ATAGGTTGGA 1058

Ala Ser Leu Ser Ser Gin Pro Fen Pro Leu 340 345 341 CCCCTTCAAG CTGAGAACTG GTCGGGGCAA ACCTGCCTCC CATTCTATTC AAAGTCATCG 1118 CTCTGGTCAC AGAGAGGGAC GCACATTCTG ATTGCCTCCT TTGGAAAGGC TCATCAGAM 1178 CTCAAAAGAA GGTGATCGTT TGTCCCGCCT ACCCGTGACC TGGAAGCCCC CGCCCCGCTC 1238 GAGTGACCCC TGACTTTCTG GACGGAACCA ACGTACTTCT TACATATATT GATTCATGTG 1298 TCATATCTCC CTAAAATGCG TAAAACCAGC TGTGCCCCGA CCACCTTGGG CCCCTGCCAT 1358 CAGGACCTCC TGAGGCTTTG GCAAATAAAC CTCCTAAAAG GATAGAAACT GAAACTTGTG 1418 GCCGGGCGCG GTGGCTCAAG CCTGTAATCC CAGCACTTTG GGAGGCCGAG GTGGGTGGAT 1478 CACGAGGTCA GGAGATCGAG ACCATCCTGG CTAACCCGTG AAACCCCGTC TCTACTAAAA 1538 AAATACAAAA ATTAGCCGGG AGCGGTGGCG GGCGCCTGTA GTCCCAGCTA CTCGGGAGGC 1598 143 TGAGGCAGGA GAATGGCGTG AACCCGGGAG GCGGAGCTTG CAGTGAGCTG AGATCCGGCC 1658 ACTGCACTCC AGCCTGGGGG ACAGAGCGAG ACTCCGTCTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1718

AAA 1721 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 345 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6

Met Asp Arg Gli Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gli Leu Leu Gli Leu Leu 1 5 10 15

Gin Pro Gli Cis Gli Gin Ser Leu Gin Vai Lis Pro Leu Gin Vai Glu 20 25 30

Pro Pro Glu Pro Vai Vai Ala Vai Ala Leu Gli Ala Ser Arg Gin Leu 35 40 45

Tre Cis Arg Leu Asp Cis Ala Asp Arg Gli Ala Tre Vai Gin Trp Arg 50 55 60

Gli Leu Asp Tre Ser Leu Gli Ala Vai Gin Ser Asp Ala Gli Arg Ser 65 70 75 80 144

Vai Leu Tre Vai Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gli Tre Arg Vai 85 90 95

Cis Vai Gli Ser Cis Gli Gli Arg Tre Fen Gin His Tre Vai Arg Leu 100 105 110

Leu Vai Tir Ala Fen Pro Asp Gin Leu Tre Ile Ser Pro Ala Ala Leu 115 120 125

Vai Pro Gli Asp Pro Glu Vai Ala Cis Tre Ala His Lis Vai Tre Pro 130 135 140

Vai Asp Pro Asn Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Leu Gli Asp Gin

Glu 145 150 155 160

Leu Glu Gli Ala Gin Ala Leu Gli Pro Glu Vai Glu Glu Glu Glu

Glu 165 170 175

Glu Pro Gin Glu Glu Glu Asp Vai Leu Fen Arg Vai Tre Glu Arg

Trp 180 185 190

Arg Leu Pro Tre Leu Ala Tre Pro Vai Leu Pro Ala Leu Tir Cis Gin 195 200 205

Ala Tre Met Arg Leu Pro Gli Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala

Ile 210 215 220

Pro Vai Leu His Gli Pro Tre Ser Arg Glu Pro Pro Asp Tre Tre

Ser 225 230 235 240

Pro Glu Pro Arg Ala Ala Tre Ser Pro Glu Tre Tre Pro Gin Gin Gli 245 250 255 145

Ser Tre His Ser Pro Arg Ser Pro Gli Ser Tre Arg Tre Cis Arg Pro 260 265 270

Glu Ile Ser Gin Ala Gli Pro Tre Gin Gli Glu Vai Ile Pro Tre Gli 275 280 285

Ser Ser Lis Pro Tre Gli Asp Gin Leu Pro Ala Ala Leu Trp Tre Ser 290 295 300

Ser Ala Vai Leu Gli Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Tre Tir His Leu 305 310 315 320

Trp Lis Arg Cis Arg His Leu Ala Glu Asp Gli Ala His Pro Pro Ala 325 330 335

Ser Leu Ser Ser Gin Pro Fen Pro Leu 340 345 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7 (1) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7 CTCTACTGCC AGGCCACG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8 146 AGCCTGGGAG ATCTCAGGG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO 9 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO 9 GCCACGATGA GGCTGCCTGG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (1) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10 GTGGAGCCTG GGCTCCTGGG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11 (1) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11 GGAAGCTTCC ACCATGGATT TCGGACTGGC CC 32 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 147 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12 CCGACTAGTG TCGGGCTGTG CAGGAC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13 GGACTAGTGG TTTGGACGAG CCTGTTG 27

Lisboa 09/10/2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um ácido nucleico isolado que codifica a) uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente seleccionada do grupo que consiste na proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), a proteína representada na Figura 2 (SEQ ID N°4), ou a proteína representada na Figura 3 (SEQ ID N°6), e a forma madura de qualquer uma das anteriores; ou b) uma sua variante funcional que se liga à integrina 0(4 β7 ; ou c) um fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 e compreende pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

2. 0 ácido nucleico isolado da Reivindicação 1, em que o ácido nucleico isolado é recombinante e/ou essencialmente puro.

3. Um ácido nucleico isolado da Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que 2 a) o referido ácido nucleico hibridiza em condições muito rigorosas ('high stringency') com um segundo ácido nucleico, sendo que o segundo ácido nucleico tem uma sequência de nucleótidos que está representada nas Figura 1 (SEQ ID N°l), Figura 2 (SEQ ID N°3), ou Figura 3 (SEQ ID N°5) , ou uma sequência que é o complemento da estrutura ('trame') de leitura aberta de qualquer um dos anteriores; ou b) o referido ácido nucleico codifica o polipeptideo representado na Figura 1 (SEQ ID N°2), o polipeptideo representado na Figura 2 (SEQ ID N°4), o polipeptideo representado na Figura 3 (SEQ ID N°6) , ou as correspondentes proteínas maduras.

4. 0 ácido nucleico isolado da Reivindicação 3, em que o ácido nucleico isolado tem uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste na sequência de nucleótidos representada na Figura 1 (SEQ ID N°l), a sequência de nucleótidos representada na Figura 2 (SEQ ID N°3), a sequência de nucleótidos representada na Figura 3 (SEQ ID N°5) , e uma porção de qualquer dos anteriores que contenha a sequência de codificação.

5. Uma construção de ácido nucleico recombinante isolado que contém um ácido nucleico da Reivindicação 1.

6. A construção de ácido nucleico recombinante isolado da Reivindicação 5, a) em que o ácido nucleico recombinante está operativamente ligado a uma sequência de controlo de expressão; ou 3 b) que compreende um ácido nucleico, em que o referido ácido nucleico codifica um polipeptideo com uma sequência de nucleótidos que está representada nas Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), ou c) em que o referido ácido nucleico hibridiza em condições muito rigorosas com um segundo ácido nucleico, sendo que o segundo ácido nucleico tem uma sequência de nucleótidos representada na Figura 1 (SEQ ID N°l), na Figura 2 (SEQ ID N°3), na Figura 3 (SEQ ID N°5), ou uma sequência que é o complemento da estrutura ('frame') de leitura aberta de qualquer um dos anteriores.

7. Uma proteína isolada que em a sequência de aminoácidos de: a) uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente seleccionada do grupo que consiste na proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2) , a proteína representada na Figura 2 (SEQ ID N°4) , ou a proteína representada na Figura 3 (SEQ ID N°6), e a forma madura de qualquer uma das anteriores; ou b) uma sua variante funcional que se liga à integrina α4β7; ou c) um fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 e compreende pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a 4 similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

8. A proteína isolada da Reivindicação 7, em que a) a MAdCAM de primata é uma MAdCAM humana, codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições muito rigorosas com um segundo ácido nucleico, sendo que o segundo ácido nucleico tem uma sequência de nucleótidos representada na Figura 1 (SEQ ID N°l), na Figura 2 (SEQ ID N°3), na Figura 3 (SEQ ID N°5), ou uma sequência que é o complemento da estrutura ('trame') de leitura aberta de qualquer um dos anteriores; b) a MAdCAM de primata é uma MAdCAM humana tal como se vê na Figura 1 (SEQ ID N°2) , na Figura 2 (SEQ ID N°4), ou proteína madura correspondente de qualquer um dos anteriores; ou c) a MAdCAM de primata é uma MAdCAM de macaco tal como se vê na Figura 3 (SEQ ID N°6) , ou a correspondente proteína madura.

9. Uma MAdCAM de primata isolada que ocorra naturalmente com uma ou mais funções seleccionadas do grupo que consiste na ligação à integrina α4β7 e na mediação da adesão celular. 5

10. A MAdCAM de primata isolada da Reivindicação 9, em que a adesão celular é dependente da integrina α4β7.

11. A MAdCAM de primata isolada da Reivindicação 9 ou da reivindicação 10,em que a referida ligação é selectiva para α4β7.

12. Uma célula hospedeira que contém um ácido nucleico recombinante que codifica: a) uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente seleccionada do grupo que consiste na proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), a proteína representada na Figura 2 (SEQ ID N°4), ou a proteína representada na Figura 3 (SEQ ID N°6), e a forma madura de qualquer uma das anteriores; ou b) uma sua variante funcional que se liga à integrina α4β7; ou c) um fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 e compreende pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N° 4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5. 6

13. A célula hospedeira da Reivindicação 12 em que o referido ácido nucleico recombinante está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão, em que a referida MAdCAM de primata que ocorre naturalmente ou a sua referida variante funcional que se liga à integrina α4β7 ou o seu referido fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 é expressa quando a célula hospedeira é mantida em condições apropriadas à expressão

14. Uma proteina de fusão que compreende: a) uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente seleccionada do grupo que consiste na proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), a proteína representada na Figura 2 (SEQ ID N°4), ou a proteína representada na Figura 3 (SEQ ID N°6), e a forma madura de qualquer uma das anteriores; ou b) uma sua variante funcional que se liga à integrina α4β7; ou c) um fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 e compreende pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos 7 ΡΑΜ250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

15. A proteína de fusão da Reivindicação 14 que compreende uma primeira parte e uma segunda parte, em que a referida primeira parte tem a sequência de aminoácidos uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente ou de uma sua variante funcional ou de um seu fragmento funcional e a referida segunda parte é pelo menos uma porção de uma cadeia de imunoglobulina ou uma sua variante.

16. A proteína de fusão da Reivindicação 15, em que a) a referida primeira parte é junta no seu terminal-C ao terminal-N da segunda parte; ou b) a primeira parte é seleccionada do grupo que consiste num fragmento funcional da MAdCAM humana que contém todo o domínio extracelular e um fragmento funcional MAdCAM humana que contém dois domínios de imunoglobulina terminal-N; ou c) a segunda parte é pelo menos uma porção de região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou uma sua variante funcional.

17. A proteína de fusão da Reivindicação 16, em que a cadeia pesada de imunoglobulina é do tipo IgG; e/ou a segunda parte compreende domínios hinge, CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina.

18. Uma imunoglobulina híbrida que compreende uma proteína de fusão tal como reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 14 a 17.

19. Uma imunoglobulina híbrida da Reivindicação 18, em que a referida imunoglobulina híbrida é um homodímero.

20. Uma construção de ácido nucleico recombinante que compreende um ácido nucleico que contém uma sequência de codificação que codifica uma proteína de fusão tal como reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 14 a 17, em que, opcionalmente, a sequência de codificação está operativamente ligada a uma sequência de controlo de expressão.

21. Um método para produzir uma proteína tal como reivindicado na Reivindicação 7, que compreende a manutenção de uma célula hospedeira que contém um ácido nucleico recombinante que codifica a referida proteína, em condições apropriadas à expressão do um ácido nucleico e em que a referida proteína é produzida.

22. Um método tal como reivindicado na Reivindicação 21 que compreende a) a introdução na célula hospedeira de uma construção que contém um ácido nucleico que codifica a referida proteína, em que se produz uma célula hospedeira recombinante com a referida sequência de codificação operativamente ligada a uma sequência de controlo de expressão; e 9 b) a manutenção das células hospedeiras produzidas no passo (a) num meio adequado em condições em que o ácido nucleico é expresso.

23. 0 método da Reivindicação 21 ou reivindicação 22 que também inclui o passo de isolar a referida proteína.

24. Um anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio que se liga a uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente, ou a uma variante funcional de uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente que se liga à integrina α4β7 e/ou a um fragmento funcional de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente que se liga à integrina α4β7 e que contém pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, tal como definido na Reivindicação 7.

25. Um anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tal como reivindicado na Reivindicação 24 para ser usado em terapia ou diagnóstico.

26. Utilização de um anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tal como reivindicado na Reivindicação 24 para a produção de um medicamento para tratar uma doença seleccionada do grupo que consiste em pancreatite, diabetes mellitus insulino-dependente, mastite, colecistite, colangite, pericolangite, bronquite crónica, sinusite crónica, asma e enxertos versus doença do hospedeiro. 10

27. Utilização de um anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tal como reivindicado na Reivindicação 24 para a produção de um medicamento para tratar a doença inflamatória do intestino.

28. 0 anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tal como reivindicado na Reivindicação 24 ou Reivindicação 25 ou a utilização reivindicada na Reivindicação 27, em que: a) o referido anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio pode inibir uma ou ambas as funções de ligação ou de molécula de adesão celular de uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente; ou b) o referido anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio pode inibir selectivamente a adesão dependente de α4β7, ou c) o referido anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio pode inibir a ligação de uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente à integrina α4β7.

29. 0 anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tal como reivindicado na Reivindicação 24, Reivindicação 25 ou Reivindicação 28 ou a utilização reivindicada na Reivindicação 27 ou na Reivindicação 28, em que o referido anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio é um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação a um antigénio.

30. O anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tal como reivindicado na Reivindicação 24, 25, 11 28 ou 29 ou a utilização reivindicada na Reivindicação 27 à 29, em que MAdCAM de primata que ocorre naturalmente é uma MAdCAM humana que ocorre naturalmente.

31. Utilização de uma MAdCAM de primata, uma variante funcional que se ligue à integrina α4β7, ou uma imunoglobulina híbrida que contenha uma MAdCAM de primata ou uma sua variante que se ligue à integrina α4β7, para a produção de um medicamento para tratar uma doença seleccionada do grupo que consiste em pancreatite, diabetes mellitus insulino-dependente, mastite, colecistite, colangite, pericolangite, bronquite crónica, sinusite crónica, asma e enxertos versus doença do hospedeiro, em que a referida MAdCAM de primata é uma proteína com a sequência de aminoácidos de uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente seleccionada do grupo que consiste na proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), a proteína representada na Figura 2 (SEQ ID N°4), ou a proteína representada na Figura 3 (SEQ ID N°6), e a forma madura de qualquer uma das anteriores; ou uma sua porção funcional que se liga à integrina α4β7, sendo que a referida porção funcional contém pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, e em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4) , ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é 12 determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

32. Utilização de uma MAdCAM de primata, uma variante funcional que se ligue à integrina α4β7, ou uma imunoglobulina híbrida que contenha uma MAdCAM de primata ou uma sua variante que se ligue à integrina α4β7, para a produção de um medicamento para tratar a doença inflamatória do intestino, em que a referida MAdCAM de primata é uma proteína com a sequência de aminoácidos de uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente seleccionada do grupo que consiste na proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), a proteína representada na Figura 2 (SEQ ID N°4), ou a proteína representada na Figura 3 (SEQ ID N°6) , e a forma madura de qualquer uma das anteriores; ou uma sua porção funcional que se liga à integrina α4β7, sendo que a referida porção funcional contém pelo menos um domínio tipo imunoglobulina, e em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4) , ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e 13 parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

33. Utilização de acordo com a Reivindicação 32 em que a) a MAdCAM de primata, variante funcional ou imunoglobulina híbrida pode inibir a interacção de uma MAdCAM de primata com uma integrina α4β7; ou b) a referida imunoglobulina híbrida contém uma proteína de fusão, que contém uma primeira e uma segunda partes, em que a primeira parte é uma MAdCAM de primata e a referida segunda parte é pelo menos uma porção de uma cadeia de imunoglobulina

34. Utilização de anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio que se liga à cadeia β7 de uma integrina α4β7 e inibe a ligação de uma MAdCAM de primata à integrina α4β7 na produção de um medicamento para tratar uma doença seleccionada do grupo que consiste em pancreatite, diabetes mellitus insulino-dependente, mastite, colecistite, colangite, pericolangite, bronquite crónica, sinusite crónica, asma e enxertos versus doença do hospedeiro, em que a referida MAdCAM de primata é (a) uma MAdCAM de primata que ocorre naturalmente seleccionada do grupo que consiste na proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), a proteína representada na Figura 2 (SEQ ID N°4), ou a proteína representada na Figura 3 (SEQ ID N°6), e a forma madura de qualquer uma das anteriores; ou 14 (b) uma sua porção funcional que se liga à integrina α4β7, e em que a sequência de aminoácidos da referida variante funcional é pelo menos 75% similar à sequência da proteína representada na Figura 1 (SEQ ID N°2), Figura 2 (SEQ ID N°4), ou Figura 3 (SEQ ID N°6), e a similaridade da sequência de aminoácidos é determinada pelo método Clustal com a tabela de pesos de resíduos PAM250, usando uma área de intervalo de 10, uma área de intervalo de comprimento de 10 e parâmetros de alinhamento de pares de 'ktuple'=l, área de intervalo=3, janela=4 e diagonais salvas=5.

35. Utilização de anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio que se liga à cadeia β7 de uma integrina α4β7 e inibe a ligação de uma MAdCAM de primata à integrina α4β7 na produção de um medicamento para tratar a doença inflamatória do intestino.

36. Utilização de acordo com a Reivindicação 35 em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a um antigénio inibe a adesão de leucócitos que expressam uma integrina que contém uma cadeia β7 com o endotélio que expressa MAdCAM

37. Utilização de acordo com a Reivindicação 35 ou 36 em que a) se usa mais de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio inibe a ligação de leucócitos à MAdCAM endotelial; ou 15 b) se usa mais de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio inibe a ligação de leucócitos a ligandos endoteliais e pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio inibe a ligação de leucócitos a um ligando endotelial para além da MAdCAM.

38. Utilização de acordo com a Reivindicação 35 em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio inibe a ligação de leucócitos à MAdCAM endotelial.

39. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 27-30 em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio é seleccionado do grupo que consiste num anticorpo quimérico, fragmento de ligação a um antigénio quimérico, num anticorpo humanizado e fragmento de ligação a um antigénio humanizado.

40. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 27-30 em que a doença é colite ulcerosa, doença de Crohn, doença Celíaca, enteropatia associada a artropatias seronegativas, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite eosinofílica ou pouchite.

41. Utilização de anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio que se liga à integrina α4β7 para a produção de um medicamento para tratar uma doença seleccionada do grupo que consiste em pancreatite, diabetes mellitus insulino-dependente, mastite, colecistite, colangite, pericolangite, bronquite crónica, sinusite crónica, asma e enxertos versus doença 16 do hospedeiro, em que o referido anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tem a especificidade epitópica do anticorpo monoclonal ACT-l.

42. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 26, 31, 34 e 41 em que a doença é pancreatite ou diabetes mellitus insulino-dependente.

43. Utilização de anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio que se liga à integrina α4β7 para a produção de um medicamento para tratar a doença inflamatória do intestino num humano, em que o referido anticorpo ou um fragmento de ligação a um antigénio tem a especificidade epitópica do anticorpo monoclonal ACT-1.

44. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 35-38 e 43 em que a doença inflamatória do intestino é seleccionada do grupo que consiste em colite ulcerosa, doença de Crohn, doença Celíaca, enteropatia associada a artropatias seronegativas, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite eosinofílica ou pouchite.

45. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 35-38, 43 e 44 em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio é seleccionado do grupo que consiste num anticorpo quimérico, fragmento de ligação a um antigénio quimérico, num anticorpo humanizado e fragmento de ligação a um antigénio humanizado. 17

46. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 35-38, 43 e 44 em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio é um anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio monoclonal.

47. Um método para detectar uma MAdCAM de primata numa amostra que consiste: a) fazer contactar uma amostra com um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio da reivindicação 24 em condições adequadas para a ligação especifica ao referido anticorpo ou seu fragmento; e b) detectar a formação de um complexo entre o referido anticorpo ou fragmento e a MAdCAM.

48. Um método para detectar ou identificar um ligando ou um agente que se ligue a uma MAdCAM de primata que compreende a combinação de um agente a ser testado com uma proteína isolada da Reivindicação 7 ou célula hospedeira da Reivindicação 12 em condições apropriadas para a ligação ao ligando, e a detecção ou medição da formação de um complexo entre o referido agente e a referida proteína.

49. Um método para detectar um inibidor de ligação de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente a um seu ligando que compreende a: a) combinação de um agente a ser testado com um ligando da referida MAdCAM de primata e uma composição que contém uma proteína isolada tal como reivindicado na Reivindicação 7 ou células hospedeiras tal como 18 reivindicado na Reivindicação 12 em condições apropriadas para a ligação do seu ligando; e b) detecção ou medição da ligação entre a referida proteína ou célula hospedeira e o ligando, em que a diminuição da ligação em comparação com um controlo adequado indica que o agente é um inibidor.

50. Um método para detectar um inibidor de ligação de uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente a um seu ligando que compreende a: a) combinação de um agente a ser testado com um ligando da referida MAdCAM de primata e uma imunoglobulina híbrida da Reivindicação 18 ou 19 ou uma proteína de fusão de qualquer uma das Reivindicações 14 a 17 em condições apropriadas para a ligação do ligando a uma MAdCAM de primata que ocorra naturalmente; e b) detecção ou medição da ligação entre a referida imunoglobulina híbrida ou proteína de fusão e o referido ligando, em que a diminuição da ligação em comparação com um controlo adequado indica que o agente é um inibidor.

51. 0 método da Reivindicação 50, em que o referido ligando é integrina α4β7, e um agente a ser testado, uma célula que expressa integrina α4β7, e uma imunoglobulina híbrida da Reivindicação 18 ou uma proteína de fusão da Reivindicação 14 ou Reivindicação 15 são combinados.

52. Um método para detectar um inibidor da adesão celular mediada pela MadCAM que consiste em: 19 a) combinar um agente a ser testado, uma célula hospedeira da Reivindicação 12 e uma segunda célula com integrina α4β7 em condições adequadas à adesão da referida célula hospedeira à referida segunda célula; e b) detecção ou medição da ligação entre as referidas célula hospedeira e segunda célula, em que a diminuição da ligação em comparação com um controlo adequado indica que o agente é um inibidor.

53. 0 método de qualquer uma das Reivindicações 48 a 52, em que o agente é um anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio.

54. 0 ácido nucleico da Reivindicação 4,em que o ácido nucleico está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão.

55. A utilização de qualquer uma das Reivindicações 26, 31, 34 e 41 em que a referida doença é mastite.

56. A utilização de qualquer uma das Reivindicações 26, 31, 34 e 41 em que a referida doença é colecistite, colangite ou pericolangite.

57. A utilização de qualquer uma das Reivindicações 26, 31, 34 e 41 em que a referida doença é bronquite crónica, sinusite crónica ou asma. 20

58. A utilização de qualquer uma das Reivindicações 26, 31, 34 e 41 em que a referida doença é um enxerto versus doença do hospedeiro

59. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 26, 34 e 41 em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio é seleccionado do grupo que consiste num anticorpo quimérico, fragmento de ligação a um antigénio quimérico, num anticorpo humanizado e fragmento de ligação a um antigénio humanizado. Lisboa, 09/10/2007