ES2291177T3 - Polipeptido de tipo receptor acoplado a proteina g. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un compuesto que modula la quimiotaxis de eosinófilos, que comprende poner en contacto un polipéptido que comprende: (i) un polipéptido traducido a partir de la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº: 1; (ii) un polipéptido de la SEC ID Nº: 2; o (iii) un polipéptido codificado por el ADNc de NCIMB 41073; con un compuesto candidato y determinar si se produce la modulación de dicho polipéptido.
Description
Polipéptido de tipo receptor acoplado a proteína
G.
La presente invención describe una secuencia
polinucleotídica que codifica un polipéptido que pertenece a la
clase de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteína G
(GPCR). La presente invención también describe, entre otras cosas,
procesos para producir el polipéptido y sus usos.
Las células y los tejidos responden a una amplia
diversidad de moléculas de señalización extracelular por medio de
la interacción de estas moléculas con receptores específicos de la
superficie celular. Una de estas clases de receptores se conoce
como la clase de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y éstos se
caracterizan porque contienen una serie de 7 segmentos
transmembrana hidrófobos. Tras la unión de un ligando extracelular
a su receptor, se inician señales intracelulares por interacciones
con proteínas G heterotriméricas que, a su vez, pueden conducir a
varios acontecimientos intracelulares diferentes dependiendo del
receptor que se haya activado. Por ejemplo, algunos GPCR afectan a
la actividad adenil ciclasa, mientras que otros actúan a través de
la fosfolipasa C.
Los miembros de la superfamilia GPCR responden a
una amplia diversidad de ligandos incluyendo aminas de molécula
pequeña (tales como serotonina, dopamina, acetilcolina), mediadores
derivados de lípidos (tales como LpA), derivados de aminoácido
(tales como glutamato) y hormonas y péptidos neurotransmisores
(tales como neuroquinina, galanina, glucagón, gastrina). Aunque los
GPCR se activan por una amplia serie de ligandos, debe tenerse en
cuenta que los GPCR individuales tienen un repertorio de ligandos
pequeño y muy específico. Basándose en un análisis de la estructura
primaria de un nuevo GPCR, ahora es posible clasificarlos en
subfamilias específicas, estrechando de esta manera la serie de
posibles ligandos.
En muchos casos, los ligandos endógenos de GPCR
son relativamente pequeños, lo que permite que se mimeticen o
bloqueen por análogos sintéticos. Por ejemplo, fármacos tales como
prazosin, doxazosin, cimetidina y ranitidina son antagonistas
eficaces de sus GPCR diana respectivos.
De esta manera, como la modulación de los GPCR
puede tener consecuencias terapéuticas, sigue existiendo la
necesidad de proporcionar nuevos GPCR y sus agonistas y antagonistas
asociados.
En un aspecto amplio, la presente invención se
refiere a un método para identificar un compuesto que modula la
quimiotaxis de eosinófilos, que comprende poner en contacto un
polipéptido que comprende:
- (i)
- un polipéptido traducido a partir de la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº: 1;
- (ii)
- un polipéptido de la SEC ID Nº: 2; o
- (iii)
- un polipéptido codificado por el ADNc de NCIMB 41073;
con un compuesto candidato y
determinar si se produce la modulación de dicho
polipéptido.
Para facilitar la referencia, a continuación se
discuten aspectos de la presente invención con los encabezamientos
de sección apropiados. Sin embargo, las enseñanzas presentadas en
cada sección no necesariamente están limitadas a cada sección
particular.
En los siguientes comentarios, las referencias a
la "secuencia de nucleótidos" y a la "secuencia de
aminoácidos" se refieren respectivamente a una cualquiera o más
de las secuencias de nucleótidos presentadas o descritas en este
documento y a una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos
presentadas o descritas en este documento. Además, y como se usa en
este documento, la "secuencia de aminoácidos" se refiere a
secuencias peptídicas o proteicas y pueden hacer referencia a
partes de éstas. Además, la expresión "secuencia de
aminoácidos" es sinónimo de la frase "secuencia
polipeptídica". Además, la expresión "secuencia de
nucleótidos" es sinónimo de la frase "secuencia
polinucleotídica".
En este documento, se describe un polinucleótido
aislado y/o purificado que comprende uno o más de:
- (a)
- un polinucleótido que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2;
- (b)
- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1;
- (c)
- un polinucleótido que codifica el polipéptido expresado por el ADN contenido en NCIMB 41073;
- (d)
- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con el polinucleótido de uno cualquiera de los puntos (a) a (c);
- (e)
- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el polinucleótido de uno cualquiera de los puntos (a) a (d);
- (f)
- un complemento para el polinucleótido de una cualquiera de (a) a (e); o
- (g)
- un fragmento polinucleotídico del polinucleótido de una cualquiera de (a) a (f).
Preferiblemente, el polinucleótido comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 75%
con el polinucleótido de una cualquiera de (a) a (c). Más
preferiblemente, el polinucleótido comprende una secuencia de
nucleótidos que tiene una identidad de al menos 80% con el
polinucleótido de una cualquiera de (a) a (c). Incluso más
preferiblemente, el polinucleótido comprende una secuencia de
nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85% con el
polinucleótido de una cualquiera de (a) a (c). Aún más
preferiblemente, el polinucleótido comprende una secuencia de
nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% con el
polinucleótido de una cualquiera de (a) a (c). Más preferiblemente,
el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que tiene
una identidad de al menos 95% con el polinucleótido de una
cualquiera de (a) a (c). Aún más preferiblemente, el polinucleótido
comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al
menos 98% con el polinucleótido de una cualquiera de (a) a (c).
El polinucleótido descrito anteriormente
codifica un receptor acoplado a proteína G (GPCR).
La presente invención también describe una sonda
o cebador polinucleotídico que comprende al menos 15 nucleótidos
contiguos del polinucleótido descrito anteriormente.
La presente invención describe además un vector
que comprende el polinucleótido descrito anteriormente.
La presente invención también describe una
célula hospedadora transformada o transfectada con el vector
descrito anteriormente. Preferiblemente, la célula hospedadora es
una célula de mamífero, insecto, hongo, bacteria o
levadura.
levadura.
También se proporciona el producto de ARN
transcrito del polinucleótido descrito anteriormente y una molécula
de ARN o un fragmento de la misma que es antisentido en relación con
el producto de ARN y es capaz de hibridar con el mismo.
También se describe una ribozima o proteína con
dedos de cinc capaz de unirse al polinucleótido descrito
anteriormente.
Se describe un proceso para producir un
polipéptido o fragmento del mismo, que comprende cultivar dicha
célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de
dicho polipéptido o fragmento. Preferiblemente, dicho polipéptido o
fragmento se expresa en la superficie de dicha célula. El proceso
preferiblemente incluye además la recuperación del polipéptido o
fragmento del cultivo.
La presente invención también describe un
proceso para producir células capaces de expresar un polipéptido o
fragmento del mismo que comprende transformar o transfectar células
con el vector descrito anteriormente.
La presente invención también describe células
producidas por el proceso descrito anteriormente. También se
describe una preparación de membrana de dichas células.
La presente invención describe un polipéptido
que comprende:
- (a)
- un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida traducida a partir de la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº: 1 y variantes, fragmentos, homólogos, análogos y derivados del mismo;
- (b)
- un polipéptido de la SEC ID Nº: 2 y variantes, fragmentos, homólogos, análogos y derivados del mismo; o
- (c)
- un polipéptido codificado por el ADNc de NCIMB 41073 y variantes, fragmentos, homólogos, análogos y derivados del mismo.
La presente invención también describe un
anticuerpo contra el polipéptido descrito anteriormente.
La presente invención también describe un
compuesto que modula el polipéptido descrito anteriormente.
Preferiblemente, el compuesto antagoniza o antagoniza
selectivamente el polipéptido. Como alternativa, el compuesto
agoniza el polipéptido.
La presente invención también describe una
composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o compuesto
descrito anteriormente y uno o más vehículos, diluyentes, adyuvantes
o excipientes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención proporciona un método para
identificar un compuesto que se une y modula el polipéptido
descrito anteriormente, que comprende poner en contacto dicho
polipéptido con un compuesto candidato y determinar si se produce
modulación.
Preferiblemente, dicho método comprende:
- (a)
- poner en contacto un compuesto con células que expresan el polipéptido descrito anteriormente en su superficie celular, asociándose dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; realizándose dicho contacto en condiciones suficientes para permitir la unión de los compuestos al polipéptido; y
- (b)
- identificar un compuesto capaz de unirse a un polipéptido por medio de la detección de la señal producida por dicho segundo componente.
Como alternativa, dicho método comprende:
- (a)
- poner en contacto (i) un primer componente detectable que se sabe que se une al polipéptido descrito anteriormente y (ii) un compuesto, con células que expresan el polipéptido anterior en su superficie celular, asociándose dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; realizándose dicho contacto en condiciones suficientes para permitir la unión de los compuestos al polipéptido; y
- (b)
- determinar si el primer componente se une al polipéptido detectando la ausencia u otra cosa de una señal generada por la interacción del primer componente con el polipéptido.
El compuesto identificado por cualquiera de los
métodos anteriores preferiblemente se une y (i) antagoniza o
antagoniza selectivamente el polipéptido descrito anteriormente, o
(ii) agoniza el polipéptido descrito anteriormente.
Como los GPCR están implicados en la
transducción de señales, los moduladores (por ejemplo, agonistas o
antagonistas) del polipéptido de la presente invención pueden
encontrar utilidad en la interferencia del proceso de transducción
de señales.
El anticuerpo, compuesto o composición descrita
anteriormente puede usarse como agente farmacéutico.
Por lo tanto, estos anticuerpos, compuestos y
composiciones que pueden modular el polipéptido descrito en este
documento, pueden encontrar utilidad en las áreas terapéuticas
relacionadas con aspectos de la transducción de señales. Las áreas
terapéuticamente útiles incluyen, pero sin limitación, obesidad,
diabetes y enfermedades metabólicas, enfermedades neurológicas,
psicoterapias, enfermedad urogenital, reproducción y medicina
sexual, inflamación, cáncer, reparación de tejidos, dermatología,
pigmentación de la piel, fotoenvejecimiento, debilidad,
osteoporosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad
gastrointestinal, antiinfección, alergia y enfermedad respiratoria,
trastornos de órganos sensoriales, trastornos del sueño y pérdida de
cabello.
Son afecciones preferidas para el tratamiento
con dichos anticuerpos, compuestos y composiciones trastornos
alérgicos tales como asma extrínseca, rinitis (alérgica y crónica),
dermatitis por Onchocerca, dermatitis atópica, reacciones a
fármacos y NERDS (nódulos, eosinofilia, reumatismo, dermatitis e
hinchazón); enfermedades de vasculitis granulomatosa tales como
vasculitis temporal, síndrome de Churg-Strauss,
poliarteritis, granulomatosis de Wegner y prostatitis granulomatosa
eosinofílica; trastornos inmunológicos tales como reacciones
autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple), rechazo de injertos
y asma intrínseca; enfermedades intersticiales y otras enfermedades
pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica
(COPD), efusiones pleurales eosinofílicas, infiltrados
eosinofílicos pulmonares transitorios (Loffler), histiocitosis,
neumonía eosinofílica crónica, neumonitis de hipersensibilidad,
aspergilosis broncopulmonar alérgica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar
idiopática y eosinofilia tópica; enfermedades parasitarias
infecciosas tales como toxocariasis, filariasis, esquistosomiasis,
triquinosis, estrongiloides, ascariasis y
equinococosis/cisticercosis; otras enfermedades infecciosas tales
como coccidioidomicosis aguda, enfermedad por arañazo de gato,
tuberculosis afebril y neumonía clamidial en la infancia;
enfermedades neoplásicas y mieloproliferativas tales como carcinoma
broncogénico, síndrome hipereosinofílico, linfomas de células T y
enfermedad de Hodgkin; estados inflamatorios tales como enfermedades
inflamatorias del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa,
enfermedad de Crohn) y sinusitis; así como enfermedad celiaca,
enfermedad hepática obstructiva y dermatitis herpetiforme.
Son trastornos especialmente preferidos para el
tratamiento con estos anticuerpos, compuestos y composiciones asma
(tanto intrínseca como extrínseca), COPD y enfermedades
inflamatorias del intestino.
Por consiguiente, también se describe el uso del
compuesto descrito anteriormente en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad
de modular el polipéptido descrito anteriormente. Preferiblemente,
el tratamiento es para un paciente que tiene necesidad de
antagonizar o antagonizar selectivamente el polipéptido. Como
alternativa, el tratamiento es para un paciente que tiene necesidad
de agonizar el polipéptido.
Además, la invención describe un método para el
tratamiento de un paciente que tiene necesidad de modular el
polipéptido descrito anteriormente, que comprende administrar al
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto
descrito anteriormente. Preferiblemente, dicho método es para el
tratamiento de un paciente que tiene necesidad de antagonizar o
antagonizar selectivamente el polipéptido. Como alternativa, dicho
método es para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de
agonizar el polipéptido.
Preferiblemente, dicho compuesto es un
polipéptido y se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del
compuesto proporcionando al paciente un ADN que codifica dicho
compuesto y expresando dicho compuesto in vivo.
La presente invención también describe el uso
del anticuerpo descrito anteriormente en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad
de modular el polipéptido descrito anteriormente. Preferiblemente,
dicho método es para el tratamiento de un paciente que tiene
necesidad de antagonizar o antagonizar selectivamente el
polipéptido. Como alternativa, dicho método es para el tratamiento
de un paciente que tiene necesidad de agonizar el polipéptido.
La presente invención también describe un método
para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de modular
el polipéptido descrito anteriormente, que comprende administrar al
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo
descrito anteriormente. Preferiblemente, dicho método es para el
tratamiento de un paciente que tiene necesidad de antagonizar o
antagonizar selectivamente el polipéptido. Como alternativa, dicho
método es para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de
agonizar el polipéptido.
La presente invención describe el uso del
compuesto descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de trastornos alérgicos, enfermedades de
vasculitis granulomatosa, trastornos inmunológicos, enfermedades
intersticiales y otras enfermedades pulmonares, enfermedades
infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades neoplásicas
y mieloproliferativas. Preferiblemente, dicho trastorno alérgico es
asma extrínseca, dicho trastorno inmunológico es asma intrínseca,
dicha enfermedad pulmonar es COPD y dichas enfermedades
inflamatorias son enfermedades inflamatorias del intestino.
La presente invención también describe el uso
del anticuerpo anterior en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de trastornos alérgicos, enfermedades de vasculitis
granulomatosa, trastornos inmunológicos, enfermedades
intersticiales y otras enfermedades pulmonares, enfermedades
infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades neoplásicas
y mieloproliferativas. Preferiblemente, dicho trastorno alérgico es
asma extrínseca, dicho trastorno inmunológico es asma intrínseca,
dicha enfermedad pulmonar es COPD y dichas enfermedades
inflamatorias son enfermedades inflamatorias del intestino.
En el presente documento se describe un método
para el tratamiento de trastornos alérgicos, enfermedades de
vasculitis granulomatosa, trastornos inmunológicos, enfermedades
intersticiales y otras enfermedades pulmonares, enfermedades
infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades neoplásicas y
mieloproliferativas en un paciente, que comprende administrar al
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto descrito
anteriormente. Preferiblemente, dicho trastorno alérgico es asma
extrínseca, dicho trastorno inmunológico es asma intrínseca, dicha
enfermedad pulmonar es COPD y dichas enfermedades inflamatorias son
enfermedades inflamatorias del intestino.
Además, la presente invención describe un método
para el tratamiento de trastornos alérgicos, enfermedades de
vasculitis granulomatosa, trastornos inmunológicos, enfermedades
intersticiales y otras enfermedades pulmonares, enfermedades
infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades neoplásicas y
mieloproliferativas en un paciente, que comprende administrar al
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo
descrito anteriormente. Preferiblemente, dicho trastorno alérgico
es asma extrínseca, dicho trastorno inmunológico es asma
intrínseca, dicha enfermedad pulmonar es COPD y dichas enfermedades
inflamatorias son enfermedades inflamatorias del intestino.
El anticuerpo mencionado anteriormente también
puede usarse para el enriquecimiento o aislamiento de eosinófilos a
partir de sangre mamíferos, preferiblemente de sangre humana.
También se describen células modificadas por
ingeniería genética ex vivo o in vivo para expresar,
sobreexpresar, infraexpresar o presentar una inserción o deleción
dirigida del polipéptido descrito anteriormente.
Como se ha explicado anteriormente, la presente
invención describe un GPCR - que se ha denominado internamente
PFI-013 - y una secuencia de nucleótidos que lo
codifica. La presente invención también describe el uso de las
nuevas secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos en el
diagnóstico y tratamiento de enfermedades. La presente invención se
refiere al uso de secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de
PFI-013 para evaluar y/o seleccionar agentes que
puedan modular el GPCR. La presente invención también describe
células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que
comprenden o expresan las nuevas secuencias de ácido nucleico o de
aminoácidos para evaluar y/o seleccionar agentes que puedan modular
el GPCR.
El polipéptido PFI-013 puede ser
igual que la forma natural - para este aspecto, preferiblemente el
polipéptido PFI-013 es la secuencia de aminoácidos
no nativa (es decir, no está presente en su medio natural) - o es
una variante, homólogo, fragmento o derivado de dicha forma.
Además, o como alternativa, el polipéptido PFI-013
es un polipéptido PFI-013 aislado y/o un polipéptido
PFI-013 purificado. El polipéptido
PFI-013 puede obtenerse a partir de cualquier
fuente apropiada o producirse por dicha fuente, ya sea natural o no,
o puede ser sintética, semisintética o recombinante.
La secuencia codificante de
PFI-013 puede ser igual que la forma natural - para
este aspecto, preferiblemente la secuencia codificante de
PFI-013 es la secuencia de nucleótidos no nativa (es
decir, no está presente en su medio natural) - o es una variante,
homólogo, fragmento o derivado de la misma. Además, o como
alternativa, la secuencia codificante de PFI-013 es
una secuencia codificante de PFI-013 aislada y/o una
secuencia codificante de PFI-013 purificada. La
secuencia codificante de PFI-013 puede obtenerse a
partir de cualquier fuente apropiada o producirse por dicha fuente,
ya sea natural o no, o puede ser sintético, semisintético o
recombinante.
El polipéptido PFI-013 y/o su
secuencia codificante y/o una secuencia capaz de hibridar con la
misma es/son útiles para ensayar la selectividad de candidatos de
fármacos entre diferentes GPCR.
Se ha demostrado (en este documento) que
PFI-013 es muy similar a los receptores de histamina
y que PFI-013 codifica un nuevo GPCR cuyo ligando
probablemente será una amina pequeña.
Por lo tanto, probablemente, los fármacos que
modulan el nuevo receptor PFI-013 modularán procesos
de transducción de señales. Por lo tanto, es probable que los
moduladores del receptor PFI-013 sean útiles para el
tratamiento de muchos trastornos diferentes asociados con la
transducción de señales que probablemente incluirán, pero sin
limitación, obesidad, diabetes y enfermedad metabólica, enfermedad
neurológica, psicoterapias, enfermedad urogenital, medicina de la
reproducción y sexual, inflamación, cáncer, reparación de tejidos,
dermatología, pigmentación de la piel, fotoenvejecimiento,
debilidad, osteoporosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad
gastrointestinal, antiinfección, alergia y enfermedad respiratoria,
trastornos de órganos sensoriales, trastornos del sueño y pérdida
de cabello.
Son afecciones preferidas para el tratamiento
con estos fármacos trastornos alérgicos tales como asma extrínseca,
rinitis (alérgica y crónica), dermatitis por Onchocerca, dermatitis
atópica, reacciones de fármacos y NERDS (nódulos, eosinofilia,
reumatismo, dermatitis e hinchazón); enfermedades de vasculitis
granulomatosa tales como vasculitis temporal, síndrome de
Churg-Strauss, poliarteritis, granulomatosis de
Wegner y prostatitis granulomatosa eosinofílica; trastornos
inmunológicos tales como reacciones autoinmunes (por ejemplo,
esclerosis múltiple), rechazo de injertos y asma intrínseca;
enfermedades intersticiales y otras enfermedades pulmonares tales
como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), efusiones
pleurales eosinofílicas, infiltrados eosinofílicos pulmonares
transitorios (Loffler), histiocitosis, neumonía eosinofílica
crónica, neumonitis de hipersensibilidad, aspergilosis
broncopulmonar alérgica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática y
eosinofilia tópica; enfermedades parasitarias infecciosas tales
como toxocariasis, filariasis, esquistosomiasis, triquinosis,
estrongiloides, ascariasis y equinococosis/cisticercosis; otras
enfermedades infecciosas tales como coccidioidomicosis aguda,
enfermedad por arañazo de gato, tuberculosis afebril y neumonía
clamidial en la infancia; enfermedades neoplásicas y
mieloproliferativas tales como carcinoma broncogénico, síndrome
hipereosinofílico, linfomas de células T y enfermedad de Hodgkin;
estados inflamatorios tales como enfermedades inflamatorias del
intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn) y
sinusitis; así como enfermedad celiaca, enfermedad hepática
obstructiva y dermatitis herpetiforme.
Son afecciones especialmente preferidas para el
tratamiento con dichos fármacos el asma (tanto extrínseca como
intrínseca), COPD y enfermedades inflamatorias del intestino.
De esta manera, el polipéptido
PFI-013 y/o su secuencia codificante y/o una
secuencia capaz de hibridar con el mismo puede ser útil para
seleccionar candidatos de fármaco para el tratamiento de
enfermedades asociadas con la transducción de señales. Además, se
cree que el polipéptido PFI-013 y/o su secuencia
codificante y/o una secuencia capaz de hibridar con el mismo puede
ser útil para seleccionar candidatos de fármaco para el tratamiento
de enfermedades tales como las descritas anteriormente.
Pueden usarse tanto las secuencias de
nucleótidos que codifican el polipéptido PFI-013
como el propio polipéptido PFI-013 para seleccionar
agentes que puedan afectar a la actividad de GPCR. En particular, la
secuencia de nucleótidos que codifica el propio receptor
PFI-013 puede usarse para seleccionar agentes que
puedan antagonizar la actividad de GPCR. Además, la secuencia de
nucleótidos que codifica el polipéptido PFI-013 o el
propio polipéptido PFI-013 puede usarse para
seleccionar agentes que afecten selectivamente a la actividad de
GPCR, tales como antagonistas selectivos del receptor
PFI-013.
El término "polipéptido" - que es
intercambiable con el término "proteína" - incluye moléculas de
polipéptido monocatenarias así como complejos de múltiples
polipéptidos donde los polipéptidos constituyentes individuales
están unidos por medios covalentes o no covalentes.
Preferiblemente, el polipéptido de la presente
invención es un polipéptido monocatenario.
Los polipéptidos descritos en este documento
pueden estar en una forma aislada sustancialmente. Se entenderá que
el polipéptido puede mezclarse con vehículos o diluyentes que no
interfieran con el fin para el que está destinado el polipéptido y
se considerará aislado sustancialmente. Un polipéptido descrito en
este documento también puede estar en una forma sustancialmente
purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá el polipéptido en
una preparación en la que más de 90%, por ejemplo 95%, 98% o 99% del
polipéptido en la preparación es un polipéptido de la presente
invención. Los polipéptidos pueden modificarse, por ejemplo, por la
adición de restos de histidina para ayudar a su purificación.
Los polipéptidos pueden producirse por medios
sintéticos (por ejemplo, como se describe por Geysen et al.,
1996) o de manera recombinante, como se describe más adelante.
La secuencia de aminoácidos per se no
incluye el receptor PFI-013 nativo cuando está en su
medio natural y cuando se ha expresado por su secuencia de
nucleótidos codificante nativa que también está en su medio natural
y cuando esa secuencia de nucleótidos está bajo el control de su
promotor nativo que también está en su medio natural. Para
facilitar la referencia, se ha denominado a esta secuencia
"secuencia de aminoácidos no nativa".
Los términos "variante", "homólogo",
"fragmento", "análogo" o "derivado" en relación con
la secuencia de aminoácidos para el polipéptido incluyen cualquier
sustitución, variación, modificación, reemplazo, deleción o adición
de un (o más) aminoácido en la secuencia, siempre que el polipéptido
resultante tenga actividad de GPCR, teniendo preferiblemente al
menos la misma actividad biológica que los polipéptidos mostrados en
la SEC ID Nº: 2 que se adjunta. En particular, el término
"homólogo" incluye la homología con respecto a la estructura
y/o función. Con respecto a la homología de secuencia, hay una
homología de secuencia de al menos 70%, preferiblemente al menos
75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos
85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos
95% con la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 2. Más
preferiblemente, hay una homología de al menos 98% con la secuencia
mostrada en la SEC ID Nº: 2.
Típicamente, para la variante, homólogo o
fragmento, los tipos de sustituciones de aminoácidos que pueden
hacerse deben mantener la hidrofobia/hidrofilia de la secuencia de
aminoácidos. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos, por
ejemplo, de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones, siempre que la
secuencia modificada retenga la capacidad de actuar como GPCR. Las
sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos no
naturales.
La secuencia de aminoácidos descrita en este
documento puede producirse por expresión de una secuencia de
nucleótidos que la codifica en un sistema de expresión adecuado.
Además, o como alternativa, la propia proteína
podría producirse usando métodos químicos para sintetizar un
polipéptido PFI-013, en su totalidad o en parte. Por
ejemplo, pueden sintetizarse péptidos por técnicas en fase sólida,
escindirse de la resina y purificarse por cromatografía líquida de
alta resolución preparativa (por ejemplo Creighton (1983) Proteins
Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York,
NY, USA). La composición de los péptidos sintéticos puede
confirmarse por análisis o secuenciación de aminoácidos (por
ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman).
La síntesis directa de péptidos puede realizarse
usando diversas técnicas en fase sólida (Roberge JY et al
Science Vol 269 1995 202-204) y la síntesis
automática puede realizarse, por ejemplo, usando el sintetizador de
péptidos ABI 431 A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones
proporcionadas por el fabricante. Además, la secuencia de
aminoácidos de PFI-013, o cualquier parte de la
misma, puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse
usando métodos químicos con una secuencia de otras subunidades, o
cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptido
variante.
Se puede ligar una secuencia aminoacídica de
PFI-013 natural, modificada o recombinante a una
secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por
ejemplo, para la exploración de bibliotecas para obtener compuestos
y agonistas y antagonistas peptídicos de actividad la del GPCR
PFI-013, puede ser útil codificar una proteína
PFI-013 quimérica que exprese un epítopo heterólogo
que se reconozca por un anticuerpo disponible en el mercado.
También se puede modificar por ingeniería genética una proteína de
fusión para que contenga un sitio de escisión localizado entre una
secuencia de PFI-013 y la secuencia de proteína
heteróloga, de forma que el PFI-013 se pueda
escindir y purificar del resto heterólogo.
El PFI-013 también se puede
expresar como una proteína recombinante con uno o más dominios
polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación
de la proteína. Tales dominios para facilitar la purificación
incluyen, pero sin limitación, péptidos quelantes de metal tales
como módulos de histidina-triptófano que permiten
la purificación en metales inmovilizados (Porath J, Protein Expr
Purif Vol 3 1992 pág 263-281), dominios de proteína
A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el
dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación por
afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle, WA, Estados Unidos). La
inclusión de una secuencia de unión escindible tal como Factor XA o
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA, Estados Unidos) entre el
dominio de purificación y el PFI-013 es útil para
facilitar la purificación.
En la SEC ID Nº: 2 se muestra una secuencia de
aminoácidos específica de PFI-013. Sin embargo,
también se describen secuencias de aminoácidos que codifican otros
GPCR que incluirían secuencias de aminoácidos que tienen una
identidad de al menos 70% (preferiblemente una identidad de al menos
75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos
85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos
95%, mucho más preferiblemente al menos 98%) con esa secuencia de
aminoácidos específica.
Los polipéptidos también incluyen fragmentos de
la secuencia de aminoácidos y variantes de la misma. Los fragmentos
adecuados tendrán un tamaño de al menos 5, por ejemplo, al menos 10,
12, 15 ó 20 aminoácidos.
Los polipéptidos también se pueden modificar
para contener una o más (por ejemplo, al menos 2, 3, 5 ó 10)
sustituciones, deleciones o inserciones, incluyendo sustituciones
conservadas. Estos aspectos se discuten en una sección
posterior.
La expresión "secuencia de nucleótidos",
como se usa en este documento, se refiere a una secuencia
oligonucleotídica o secuencia polinucleotídica, y a variantes,
homólogos, fragmentos, análogos y derivados de la misma (tales como
partes de la misma). La secuencia de nucleótidos puede ser ADN o ARN
que puede ser de origen genómico, sintético o recombinante, y que
puede ser bicatenario o monocatenario, representando la cadena con
sentido o antisentido.
Preferiblemente, la expresión "secuencia de
nucleótidos" quiere decir ADN.
Más preferiblemente, la expresión "secuencia
de nucleótidos" quiere decir ADN preparado mediante el uso de
técnicas de ADN recombinante (es decir, ADN recombinante).
La secuencia de nucleótidos per se no
incluye la secuencia de nucleótidos codificante nativa de acuerdo
con la presente invención en su medio natural cuando está bajo el
control de su promotor nativo que también está en su medio natural.
Para facilitar la referencia, a esta secuencia se le ha denominado
la "secuencia de nucleótidos no nativa".
Las secuencias de nucleótidos pueden incluir en
su interior nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se
conocen varios tipos diferentes de modificaciones de
oligonucleótidos. Éstas incluyen estructuras de metilfosfonato y
fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los
extremos 3' y/o 5' de la molécula. Debe entenderse que las
secuencias de nucleótidos descritas en este documento se pueden
modificar por cualquier método disponible en la técnica. Tales
modificaciones se pueden realizar para mejorar la actividad o vida
útil in vivo de las secuencias de nucleótidos.
También se describen secuencias de nucleótidos
que son complementarias a las secuencias presentadas en este
documento, o cualquier variante, homólogo, análogo, fragmento o
derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un
fragmento de las mismas, entonces esa secuencia se puede usar como
una sonda para identificar secuencias codificantes similares en
otros organismos, etc.
En este documento se describen secuencias de
nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias
presentadas en este documento, o cualquier variante, homólogo,
análogo, fragmento o derivado de las mismas.
Se describen secuencias de nucleótidos que son
capaces de hibridar con las secuencias que son complementarias a
las secuencias presentadas en este documento, o cualquier variante,
homólogo, análogo, fragmento o derivado de las mismas.
El término "variante" también incluye las
secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces
de hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en este
documento.
Preferiblemente, el término "variante"
incluye secuencias que son complementarias a secuencias que son
capaces de hibridar en condiciones rigurosas (por ejemplo, 65ºC y
0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015 pH 7,0})
con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento.
También se describen secuencias de nucleótidos
que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos que se han
descrito anteriormente (incluyendo secuencias complementarias a las
que se presentan en este documento).
También se describen secuencias de nucleótidos
que son complementarias a secuencias que pueden hibridar con las
secuencias de nucleótidos que se han descrito anteriormente
(incluyendo secuencias complementarias a las que se presentan en
este documento).
En la presente invención también se describen
secuencias polinucleotídicas que son capaces de hibridar con las
secuencias de nucleótidos presentadas en este documento en
condiciones de rigurosidad intermedia a máxima.
La presente invención describe secuencias de
nucleótidos que pueden hibridar con la secuencia de nucleótidos que
se ha descrito anteriormente, o el complemento de la misma, en
condiciones rigurosas (por ejemplo, 65ºC y 0,1xSSC).
Alternativamente se pueden caracterizar ácidos
nucleicos ejemplares como las secuencias de nucleótidos que
codifican una proteína PFI-013 e hibridan con la
secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1. Se prefieren las
secuencias que codifican PFI-013 que hibrida en
condiciones de alta rigurosidad con la secuencia mostrada en la SEC
ID Nº: 1 o el complemento de la misma.
La invención describe secuencias de ácido
nucleico que son capaces de hibridar, en condiciones rigurosas, con
un fragmento de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1 o el
complemento de la misma. Preferiblemente, el fragmento tiene una
longitud comprendida entre 15 y 50 bases. De forma ventajosa, tiene
aproximadamente 25 bases de
longitud.
longitud.
Los términos "variante", "homólogo",
"análogo", "derivado" o "fragmento" en relación con
la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido descrito en
este documento incluyen cualquier sustitución de, variación de,
modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de un (o más)
ácido nucleico de o a la secuencia, haciendo posible que la
secuencia de nucleótidos resultante codifique o sea capaz de
codificar un polipéptido que tenga actividad de receptor
PFI-013, siendo preferiblemente al menos tan
biológicamente activo como el polipéptido codificado por la
secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1. En particular, el término
"homólogo" incluye la homología con respecto a la estructura
y/o función, haciendo posible que la secuencia de nucleótidos
resultante codifique o sea capaz de codificar un polipéptido que
tenga actividad como un GPCR PFI-013. Con respecto a
la homología de secuencia, preferiblemente hay al menos 70%,
preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%,
más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%,
más preferiblemente al menos 95% de homología con una secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID Nº: 2. Mucho más preferiblemente, hay al menos 98% de
homología con una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2. Con respecto
a la homología de secuencia, hay una homología de al menos 70%,
preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más
preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más
preferiblemente al menos 95% con la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEC ID Nº: 1. Mucho más preferiblemente, hay una
homología de al menos 98% con la secuencia de nucleótidos mostrada
en la SEC ID Nº: 1.
Como se indica, la presente invención describe
una secuencia de ADN (preferiblemente una secuencia de ADNc) que
codifica PFI-013. En particular, la presente
invención describe secuencias de ADNc que codifican
PFI-013.
La presente invención también describe segmentos
de ADN que comprenden la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº:
1 o variaciones alélicas de la misma.
La presente invención también describe
polipéptidos producidos por la expresión en una célula hospedadora
en la que se han incorporado las anteriores secuencias de ADN o
variaciones alélicas de las mismas.
La presente invención también describe ADN que
comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1 o
variaciones alélicas de la misma.
La presente invención también describe ADN no
nativo que comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº:
1 o variaciones alélicas de la misma.
La presente invención describe ADN recombinante
que comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1 o
variaciones alélicas de la misma.
Los polinucleótidos descritos en este documento
incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos usados en la presente invención. Se entenderá que una
variedad de polinucleótidos diferentes codifican una secuencia de
aminoácidos dada como consecuencia de la degeneración del código
genético.
Conociendo las secuencias de aminoácidos
expuestas en este documento, es posible idear secuencias de ácidos
nucleicos parciales y de longitud completa tales como ADNc y/o
clones genómicos que codifiquen los polipéptidos usados en la
presente invención. Por ejemplo, los polinucleótidos usados en la
presente invención se pueden obtener usando la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) degenerada que usará cebadores diseñados para
dirigirse a secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos
presentadas en este documento. Los cebadores contendrán típicamente
múltiples posiciones degeneradas. Sin embargo, para minimizar la
degeneración, se seleccionarán secuencias que codifiquen regiones
de las secuencias de aminoácidos presentadas en este documento que
contengan aminoácidos tales como metionina que están codificados
por solamente un triplete. Además, se seleccionarán secuencias para
tener en cuenta el uso de codones en el organismo cuyo ácido
nucleico se use como ADN de plantilla para el procedimiento de PCR.
La PCR se usará en condiciones de menor rigurosidad que las usadas
para clonar secuencias con cebadores de secuencia única (no
degenerada) contra secuencias conocidas.
Las secuencias de ácido nucleico obtenidas por
PCR que codifican fragmentos polipeptídicos se pueden usar después
para obtener secuencias mayores usando técnicas de exploración de
bibliotecas de hibridación. Por ejemplo, se puede marcar un clon de
PCR con átomos radiactivos y usarse para explorar una biblioteca de
ADNc o genómica de otras especies, preferiblemente otras especies
de mamífero. Las condiciones de hibridación serán típicamente
condiciones de rigurosidad media a alta (por ejemplo, cloruro sódico
0,03 M y citrato sódico 0,03 M a una temperatura de aproximadamente
50ºC a aproximadamente 60ºC).
También se pueden usar sondas de ácido nucleico
degenerado que codifiquen toda o parte de la secuencia de
aminoácidos para sondar bibliotecas de ADNc y/o genómicas de otras
especies, preferiblemente otras especies de mamífero. Sin embargo,
se prefiere realizar inicialmente técnicas de PCR para obtener una
única secuencia para uso en procedimientos de exploración
posteriores.
Las secuencias polinucleotídicas que codifican
PFI-013, fragmentos del polipéptido, proteínas de
fusión o equivalentes funcionales de las mismas, se pueden usar
para generar moléculas de ADN recombinante que dirijan la expresión
de PFI-013 en células hospedadoras apropiadas.
Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden
usar otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma
secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente para
clonar y expresar PFI-013. Como entenderán los
especialistas en la técnica, puede ser ventajoso producir
secuencias de nucleótidos que codifiquen PFI-013 que
posean codones que no son de origen natural. Se pueden seleccionar
codones preferidos por un hospedador procariota o eucariota
particular (Murray E et al (1989) Nuc Acids Res
17:477-508), por ejemplo, para aumentar la velocidad
de expresión de PFI-013 o para producir transcritos
de ARN recombinante que tengan propiedades deseables, tales como una
vida media más larga, que los transcritos producidos a partir de
una secuencia de origen natural.
Las secuencias polinucleotídicas obtenidas
usando las técnicas que se han descrito anteriormente se pueden
usar para obtener secuencias homólogas y variantes adicionales
usando las técnicas que se han descrito anteriormente. También se
pueden modificar para usarse para expresar los polipéptidos de la
presente invención en una diversidad de sistemas de células
hospedadoras, por ejemplo, para optimizar las preferencias de
codones de una célula hospedadora particular en la que se expresan
las secuencias polinucleotídicas. Se pueden desear otros cambios de
secuencia para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción, o para alterar la propiedad o función de los
polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
Las secuencias polinucleotídicas de
PFI-013 alteradas que se pueden usar de acuerdo con
la invención incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de
diferentes restos nucleotídicos, dando como resultado un
polinucleótido que codifica el mismo PFI-013 o uno
funcionalmente equivalente. La proteína también puede tener
deleciones, inserciones o sustituciones de restos aminoacídicos que
producen un cambio silencioso y dan como resultado un
PFI-013 funcionalmente equivalente. Se pueden hacer
sustituciones aminoacídicas deliberadas basándose en la similitud
de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la
naturaleza anfipática de los restos, siempre que se conserve la
actividad biológica del PFI-013. Por ejemplo, los
aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido
glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y
arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados
que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina,
isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina,
treonina, fenilalanina y tirosina.
Como se usa en este documento, un "alelo" o
"secuencia alélica" es una forma alternativa de
PFI-013. Los alelos se dan como resultado de una
mutación, es decir, un cambio en la secuencia de ácido nucleico, y
generalmente producen ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura
o función puede estar o no alterada. Cualquier gen dado puede tener
ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales
comunes que dan origen a alelos se atribuyen generalmente a
deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos. Cada uno de
estos tipos de cambios pueden suceder solos o en combinación con
los demás, una o más veces en una secuencia dada.
Las secuencias de nucleótidos se pueden
modificar por ingeniería genética para alterar una secuencia
codificante de PFI-013 por una diversidad de
razones, incluyendo, pero sin limitación, alteraciones que modifican
la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto
génico. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones usando
técnicas que se conocen bien en la técnica, por ejemplo, mutagénesis
dirigida para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar
los patrones de glicosilación o para cambiar la preferencia de
codones.
Se pueden usar los polinucleótidos para producir
un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una
reacción de amplificación alternativa, una sonda, por ejemplo,
marcada con un marcador de revelado por medios convencionales
usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los
polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Tales cebadores,
sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15,
preferiblemente al menos 20, por ejemplo, al menos 25, 30 ó 40
nucleótidos.
Los polinucleótidos o cebadores pueden llevar un
marcador de revelado. Los marcadores adecuados incluyen
radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S, marcadores
enzimáticos u otros marcadores proteicos tales como biotina. Tales
marcadores se pueden añadir a polinucleótidos o cebadores y se
pueden detectar usando métodos conocidos en la técnica.
Los polinucleótidos, tales como un
polinucleótido de ADN, y los cebadores se pueden producir de forma
recombinante, de forma sintética, o por cualquier medio disponible
para los especialistas en la técnica. También se pueden clonar por
técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por
medios sintéticos, que implican una fabricación por etapas de la
secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido cada vez. En este
campo se pueden adquirir fácilmente técnicas para conseguir esto
usando técnicas automatizadas.
Los polinucleótidos de mayor tamaño generalmente
se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando
técnicas de clonación por PCR. Esto implicará hacer un par de
cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15-30
nucleótidos) para una región de la secuencia de nucleótidos que se
desea clonar, poner los cebadores en contacto con el ARNm o el ADNc
obtenido de una célula eucariota o procariota, realizar una reacción
en cadena de la polimerasa en condiciones que provoquen la
amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado
(por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de
agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores se pueden
diseñar para contener sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción adecuados de forma que el ADN amplificado se pueda
clonar en un vector de clonación adecuado.
Las moléculas de ADN se pueden modificar para
aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles
modificaciones incluyen, pero sin limitación, la adición de
secuencias flanqueantes de los extremos 5' y/o 3' de la molécula o
el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de
los enlaces de fosfodiesterasa en la cadena principal de la
molécula.
Las secuencias de nucleótidos que son capaces de
hibridar con toda o parte de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº:
1 o una variación alélica de las mismas se pueden usar en técnicas
antisentido para modificar la expresión de PFI-013.
Como alternativa, estas secuencias (o partes de las mismas) se
pueden usar como una sonda, o para amplificar toda o parte de tal
secuencia cuando se usa como un cebador de PCR.
Además de las secuencias de ADN recombinante,
las secuencias genómicas también son de utilidad en el contexto del
descubrimiento de fármacos. Puede ser útil inhibir la transcripción
de ARNm de una isoforma particular en vez de inhibir su proteína
traducida. Esto puede ocurrir con PFI-013, si hay
variantes de corte y empalme y donde esas diferentes variantes de
corte y empalme pueden transcribirse a partir de diferentes
promotores.
Las secuencias de ADN, una vez conocidas,
proporcionan la información necesaria para diseñar ensayos para
detectar específicamente isoformas o variantes de corte y empalme.
Sin embargo, los pares de cebadores de PCR con especificidad de
isoforma son sólo un ejemplo de un ensayo que depende completamente
del conocimiento de la secuencia de ADN específica de la isoforma o
variante de corte o empalme. Este ensayo permite la detección del
ARNm para la isoforma para acceder a la distribución tisular y
relevancia biológica de cada isoforma en un estado patológico
particular. También permite la identificación de líneas celulares
que pueden expresar de manera natural sólo una isoforma - un
descubrimiento que podría evitar la necesidad de expresar genes
recombinantes. Si se demuestra que ciertas isoformas específicas de
PFI-013 están asociadas con un estado patológico
particular, pueden ser valiosas en el diseño de ensayos de
diagnóstico para detectar la presencia de ARNm de isoformas.
Un nivel anormal de secuencias de nucleótidos
que codifican un receptor PFI-013 en una muestra
biológica puede reflejar una aberración cromosómica, tal como una
deleción o mutación de un ácido nucleico. Por consiguiente, las
secuencias de nucleótidos que codifican un receptor de
PFI-013 proporcionan la base para sondas que pueden
usarse en métodos de diagnóstico para detectar aberraciones
cromosómicas tales como deleciones, mutaciones o translocaciones
cromosómicas en el gen que codifica PFI-013. En
estos estados patológicos, puede estar alterada la expresión del
gen de PFI-013 o puede haber una aberración
cromosómica presente en la región del gen que codifica
PFI-013.
PFI-013.
La secuencia codificante de
PFI-013 podría sintetizarse, en su totalidad o en
parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase
Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser
215-23, Horn T et al (1980) Nuc Acids Res
Symp Ser 225-232).
Como se usa en este documento "natural" se
refiere a un PFI-013 con una secuencia de
aminoácidos encontrada en la naturaleza.
Como se usa en este documento, los términos
"aislado" y "purificado" se refieren a moléculas,
secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, que se retiran de su
medio natural y se aíslan o separan de al menos otro componente con
el que están asociadas de manera natural.
Como se usa en este documento, "biológicamente
activo" se refiere a un PFI-013 como se describe
en la presente invención - tal como un PFI-013
recombinante - que tiene una función estructural similar (pero no
necesariamente en el mismo grado), y/o una función reguladora
similar (pero no necesariamente en el mismo grado), y/o una función
bioquímica similar (pero no necesariamente en el mismo grado) y/o
una actividad inmunológica (pero no necesariamente en el mismo
grado) del PFI-013 natural. Específicamente, un
PFI-013 tiene la capacidad de actuar como un
GPCR.
GPCR.
Como se usa en este documento, "actividad
inmunológica" se define como la capacidad del
PFI-013 natural, recombinante o sintético, o de
cualquier oligopéptido del mismo, para inducir una respuesta inmune
específica en animales o células apropiadas y para unirse a
anticuerpos específicos.
\newpage
El término "derivado", como se usa en este
documento en relación con la secuencia de aminoácidos, incluye la
modificación química de un PFI-013. Serían ejemplos
ilustrativos de estas modificaciones un reemplazo de hidrógeno por
un grupo alquilo, acilo o amino.
El término "análogo", como se usa en este
documento en relación con la secuencia de aminoácidos (o la
secuencia codificante de la misma) incluye la modificación química
de un PFI-013 o la secuencia codificante del mismo.
Serían ejemplos ilustrativos de estas modificaciones el reemplazo de
restos aminoacídicos naturales o nucleótidos naturales por restos
aminoacídicos no naturales (por ejemplo,
D-aminoácidos, beta-alanina,
hidroxiprolina) o nucleótidos no naturales (por ejemplo, inosina,
desmetil-citidina).
Como se usa en este documento, una
"deleción" se define como un cambio en la secuencia de
nucleótidos o de aminoácidos en la que están ausentes uno o más
restos nucleotídicos o aminoacídicos, respectivamente.
Como se usa en este documento, una "inserción
" o "adición" es un cambio en una secuencia de nucleótidos o
de aminoácidos que tiene como resultado la adición de uno o más
restos nucleotídicos o aminoacídicos, respectivamente, en
comparación con el PFI-013 natural.
Como se usa en este documento, una
"sustitución" se produce por el reemplazo de uno o más
nucleótidos o aminoácidos por nucleótidos o aminoácidos diferentes,
respectivamente.
El término "homólogo", con respecto a las
secuencias de nucleótidos, puede ser sinónimo de variaciones
alélicas de las secuencias.
En particular, el término "homología", como
se usa en este documento, puede equivaler al término
"identidad". En este documento, la homología de secuencia con
respecto a la secuencia de nucleótidos descrita en la presente
invención y la secuencia de aminoácidos descrita en la presente
invención puede determinarse por medio de una simple comparación
"visual" (es decir, una comparación estricta) de una cualquiera
o más de las secuencias con otra secuencia para ver si esa otra
secuencia tiene una identidad de al menos 70% con las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos. Una homología de secuencia relativa
(es decir, la identidad de secuencia) también puede determinarse
por medio de programas informáticos disponibles en el mercado que
pueden calcular el porcentaje (%) de homología entre dos o más
secuencias. Son ejemplos típicos de estos programas informáticos
FASTA o BLAST.
Un método alternativo para producir
alineamientos de secuencias es usar el programa informático ClustalW
(Thompson J.D., Higgins D.G. y Gibson T.J., Nucleic Acid Research,
Vol. 22 (22); 4673-4680 (1994)).
El porcentaje (%) de homología puede calcularse
sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con
la otra secuencia y se compara directamente cada aminoácido de una
secuencia con el aminoácido correspondiente de la otra secuencia,
un resto cada vez. Esto se denomina alineamiento "sin huecos".
Típicamente, estos alineamientos sin huecos se realizan sólo sobre
un número relativamente pequeño de restos (por ejemplo, menos de 50
aminoácidos contiguos).
Aunque éste es un método muy sencillo y
consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de
secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción hará
que los siguientes restos aminoacídicos se salgan del alineamiento,
pudiendo dar como resultado una gran reducción en el % de homología
cuando se realiza un alineamiento global. Por consiguiente, la
mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para
que produzcan alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles
inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación
de homología total. Esto se consigue insertando "huecos" en el
alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología
local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan
"penalizaciones de huecos" a cada hueco que aparece en el
alineamiento, de manera que, para el mismo número de aminoácidos
idénticos, un alineamiento de secuencias con tan pocos huecos como
sea posible - que refleja una mayor relación entre las dos
secuencias comparadas - conseguirá una mayor puntuación que una con
muchos huecos. Típicamente se usan "costes de huecos de
afinado" ("affine gap costs") que cargan un coste
relativamente alto para la existencia de un hueco y una menor
penalización para cada resto posterior en el hueco. Éste es el
sistema de puntuación de huecos usado con más frecuencia. Por
supuesto, las altas penalizaciones de huecos producirán
alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los
programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones de
los huecos. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto
cuando se usa este software para comparaciones de secuencias. Por
ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit (véase más
adelante), la penalización de huecos por defecto para las
secuencias de aminoácidos es -12 para la creación de un hueco y -4
para cada extensión. Las penalizaciones de huecos por defecto
alternativas para las secuencias de aminoácidos son -8 para la
creación de un hueco y -2 para cada extensión.
Por lo tanto, el cálculo del % máximo de
homología requiere en primer lugar la producción de un alineamiento
óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones de los huecos. Un
programa informático adecuado para realizar este alineamiento es el
paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.;
Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los
ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de
secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete BLAST (véase
Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA
(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.,
403-410) y el juego GENEWORKS de herramientas de
comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para las
búsquedas fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al.,
1999 ibid, páginas 7-58 a
7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se
prefiere usar el programa GCG Bestfit.
Aunque el % de homología final puede medirse en
términos de identidad, en algunos casos, el propio proceso de
alineamiento típicamente no se basa en una comparación de parejas de
todo o nada. En lugar de esto, generalmente se usa una matriz de
puntuaciones de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada
comparación por parejas basándose en la similitud química o
distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz usada comúnmente es
la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para la serie BLAST de
programas. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan los
valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos
habitual si ésta se suministra (véanse en el manual del usuario los
detalles adicionales). Se prefieren usar los valores por defecto
públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la
matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez que el software ha producido un
alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología,
preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software
típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencias y
genera un resultado numérico.
Cuando se indica, para algunas aplicaciones, la
homología (o identidad) de secuencia puede determinarse usando
cualquier algoritmo de homología adecuado, usando por ejemplo
parámetros por defecto. Como discusión de los asuntos básicos en la
búsqueda de similitudes de bases de datos de secuencias, véase
Altschul et al. (1994) Nature Genetics
6:119-129. Para algunas aplicaciones se emplea el
algoritmo BLAST, con parámetros establecidos a valores por defecto.
El algoritmo BLAST se describe con detalle en
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. Ventajosamente,
"homología sustancial", cuando se evalúa por BLAST, equivale a
secuencias que coinciden con un valor EXPECT de al menos
aproximadamente e-7, preferiblemente de al menos
aproximadamente e-9 y aún más preferiblemente de al
menos e-10 o inferior. El umbral por defecto para
EXPECT en la búsqueda BLAST normalmente es 10.
Si se usan penalizaciones de huecos cuando se
determina la identidad de la secuencia, preferiblemente se usan los
siguientes parámetros:
Otros métodos de programas informáticos para
determinar la identidad y similitud entre las dos secuencias
incluyen, pero sin limitación, el paquete del programa GCG (Devereux
et al., 1984 Nucleic Acids Research 12: 387) y FASTA
(Altschul et al. 1990 J Molec Biol
403-410).
El perfil de una familia de secuencias puede
modelarse de una manera probabilística usando modelos ocultos de
Markov (HMM) (Durbin, R., Eddy, S., Krogh, A. and Mitchison, G.
(1998), Biological Sequence Analysis: Probabilistic models of
proteins and nucleic acids; Cambridge University Press, Cambridge,
UK.; Eddy, S.R. (1998), Profile hidden Markov models;
Bioinformatics, 14: 755-763). Los HMM se
desarrollaron originalmente para uso en el reconocimiento del habla
y desde entonces se han usado para una serie de aplicaciones de
procesamiento de señales. Una señal se modela como una secuencia de
elementos procedente de una serie definida. En el reconocimiento
del habla, esta serie consiste en los sonidos que constituyen el
lenguaje y el objetivo es deducir las palabras que representan los
sonidos. Una secuencia proteica de una familia particular puede
considerarse de la misma manera. La secuencia es una serie de
elementos de la serie de 20 aminoácidos y el requisito es determinar
la familia de proteínas que podría representar la secuencia.
El perfil basado en HMM puede construirse a
partir de un alineamiento de secuencias múltiple de miembros de una
familia conocida. Cara posición en el alineamiento corresponde a un
estado, siendo los estados "correspondencia", "inserción"
o "deleción". Por lo tanto, el alineamiento completo puede
considerarse como una cadena lineal, o trayectoria, de estados de
interconexión conectados por probabilidades de transición. Estos
estados "emiten" restos aminoacídicos con diferentes
probabilidades (basándose en la serie de restos vistos en el
alineamiento junto con los datos de sustitución y métodos de
"pseudorrecuento" - para tener en cuenta las correcciones de
los datos limitados en el alineamiento inicial). La probabilidad de
una secuencia particular que corresponde con el modelo puede
calcularse como una combinación de las probabilidades de transición
entre los estados y las probabilidades de emisión para esa
secuencia de aminoácidos.
Una vez que se ha obtenido un buen alineamiento
de miembros de una familia conocida, pueden construirse HMM con una
pequeña intervención manual (en comparación con los perfiles) y son
un método más sensible para detectar homólogos remotos. La base de
datos Pfam es una biblioteca de perfiles basados en HMM para muchas
familias de proteínas (Bateman, A., Birney, E., Durbin, R., Eddy,
S.R., Finn, R.D. y Sonhammer, E.L.L. (1999), Pfam 3.1: 1313
multiple alignments and profile HMMs match the majority of proteins,
Nucleic Acids Research, 27: 260-262). Contiene
modelos construidos a partir de segmentos seminales editados
cuidadosamente y modelos generados automáticamente por un
procedimiento iterativo. Esta automatización completa de proceso
tiene el inconveniente de que cualquier error que se produzca se
propagará rápidamente.
Los términos "variante" o "derivado",
en relación con las secuencias de aminoácidos descritas en este
documento, incluyen cualquier sustitución, variación, modificación,
reemplazo, deleción o adición de un (o más) aminoácido en la
secuencia que haga que la secuencia de aminoácidos resultante tenga
actividad de PFI-013, preferiblemente teniendo al
menos la misma actividad que el polipéptido presentado en la SEC ID
Nº: 2.
Las secuencias descritas en la presente
invención pueden modificarse. Típicamente, se realizan
modificaciones que mantienen la actividad de
PFI-013 de la secuencia. Pueden realizarse
sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó
30 sustituciones, siempre que la secuencia modificada retenga la
actividad de PFI-013. Las sustituciones de
aminoácidos pueden incluir el uso de análogos no naturales, por
ejemplo, para aumentar la vida media en plasma sanguíneo de un
polipéptido administrado terapéuticamente.
Pueden realizarse sustituciones conservativas,
por ejemplo, de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en
el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma
línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:
Como se ha indicado anteriormente, las proteínas
usadas en la invención típicamente se obtienen por medios
recombinantes, por ejemplo como se describe en este documento, y/o
usando medios sintéticos usando técnicas bien conocidas para el
especialista en la técnica tales como síntesis en fase sólida. Las
variantes y derivados de estas secuencias incluyen proteínas de
fusión, donde las proteínas de fusión comprenden al menos la
secuencia de aminoácidos de la presente invención que está unida
(directa o indirectamente) a otra secuencia de aminoácidos. Estas
otras secuencias de aminoácidos - que algunas veces se denominan
compañeros de proteínas de fusión - típicamente impartirán una
funcionalidad favorable - tal como ayudar a la extracción y
purificación de la secuencia de aminoácidos de la presente
invención. Los ejemplos de compañeros de proteínas de fusión
incluyen glutatión-S-transferasa
(GST), 6xHis, GAL4 (dominios de unión al ADN y/o activación de la
transcripción) y \beta-galactosidasa. También
puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica
entre el compañero de proteína de fusión y la secuencia proteica
para permitir la eliminación de esta última. Preferiblemente, el
compañero de proteína de fusión no perjudicará a la función de la
proteína.
Los términos "variante" o "derivado"
en relación con la secuencia de nucleótidos usada en la presente
invención incluyen cualquier sustitución, variación, modificación,
reemplazo, deleción o adición de un (o más) ácido nucleico en la
secuencia, que haga que la secuencia de nucleótidos resultante
codifique un polipéptido con actividad de PFI-013,
preferiblemente que tenga al menos la misma actividad que la
secuencia presentada en la SEC ID Nº: 2.
Como se ha indicado anteriormente con respecto a
la homología de secuencias, hay una homología de secuencias de al
menos 70%, preferiblemente de al menos 75%, más preferiblemente de
al menos 80%, más preferiblemente de al menos 85%, más
preferiblemente de al menos 90%, más preferiblemente de al menos 95%
con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1. Mucho
más preferiblemente, hay una homología de al menos 98% con la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1. Las
comparaciones de homología de nucleótidos pueden realizarse como se
ha indicado anteriormente. Para algunas aplicaciones, un programa de
comparación de secuencias preferido es el programa GCG Wisconsin
Bestfit descrito anteriormente. La matriz de puntuación por defecto
tiene un valor de correspondencia de 10 para cada nucleótido
idéntico y de -9 para cada desacoplamiento. La penalización de
creación de hueco por defecto es de -50 y la extensión de hueco por
defecto es de -3 para cada nucleótido.
Como se usa en este documento, los términos
"variante", "homólogo", "fragmento" y "derivado"
incluyen variaciones alélicas de las secuencias.
El término "variante" también incluye las
secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de
hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en este
documento.
El término "hibridación", como se usa en
este documento, incluirá "el proceso por medio del cual una cadena
de ácido nucleico se une con una cadena complementaria por medio de
emparejamiento de bases" (Coombs J (1994) Dictionary of
Biotechnology, Stockton Press, New York, NY, USA) así como el
proceso de amplificación como se realiza en las tecnologías de PCR
descritas en Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY,
USA).
Las condiciones de hibridación se basan en la
temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de ácido nucleico,
como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning
Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San
Diego, CA, USA), y confieren una "rigurosidad" definida como se
explica más adelante.
La rigurosidad de la hibridación se refiere a
las condiciones en las que son estables los híbridos de ácidos
polinucleicos. Estas condiciones son evidentes para los
especialistas en este campo. Como es conocido para los
especialistas en la técnica, la estabilidad de los híbridos se
refleja en la temperatura de fusión (Tm) del híbrido que se
reducirá de aproximadamente 1 a 1,5ºC con cada reducción de 1% en la
homología de las secuencias. En general, la estabilidad de un
híbrido es una función de la concentración de iones de sodio y de la
temperatura. Típicamente, la reacción de hibridación se realiza en
condiciones de mayor rigurosidad, seguido de lavados de rigurosidad
variable.
Como se usa en este documento, alta rigurosidad
se refiere a condiciones que permiten la hibridación únicamente de
las secuencias de ácido nucleico que forman híbridos estables en
Na^{+} 1 M a 65-68ºC.
Típicamente se produce una máxima rigurosidad a
aproximadamente Tm-5ºC (5ºC por debajo de la Tm de
la sonda).
Se produce una rigurosidad elevada a
aproximadamente 5ºC a 10ºC por debajo de la Tm de la sonda. Las
condiciones de alta rigurosidad pueden proporcionarse, por ejemplo,
por hibridación en solución acuosa que contiene 6x SSC, 5x
Denhardt's, SDS (dodecil sulfato sódico) al 1%, pirofosfato Na^{+}
0,1 y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado como
competidor no específico. Después de la hibridación, puede
realizarse un lavado de alta rigurosidad en varias etapas, con un
lavado final (de aproximadamente 30 minutos) a la temperatura de
hibridación en 0,2-0,1x SSC, SDS al 0,1%.
La rigurosidad moderada, o intermedia, sucede
típicamente a aproximadamente 10ºC-20ºC por debajo
de la Tm de la sonda.
La baja rigurosidad sucede típicamente a
aproximadamente 20ºC-25ºC por debajo de la Tm de la
sonda.
Como se entenderá por los especialistas en la
técnica, se puede usar una hibridación de máxima rigurosidad para
identificar o detectar secuencias polinucleotídicas idénticas
mientras que se puede usar una hibridación de rigurosidad
intermedia (o baja) para identificar o detectar secuencias
polinucleotídicas similares o relacionadas.
La rigurosidad moderada se refiere a condiciones
equivalentes a hibridación en la solución que se ha descrito
anteriormente pero a aproximadamente 60-62ºC. En ese
caso, el lavado final se realiza a la temperatura de hibridación en
1x SSC, SDS al 0,1%.
La baja rigurosidad se refiere a condiciones
equivalentes a hibridación en la solución que se ha descrito
anteriormente a aproximadamente 50-52ºC. En ese
caso, el lavado final se realiza a la temperatura de hibridación en
2x SSC, SDS al 0,1%.
Se entiende que estas condiciones se pueden
adaptar y duplicar usando una diversidad de tampones, por ejemplo,
tampones basados en formamida, y temperaturas. La solución de
Denhardt y SSC se conocen bien por los especialistas en la técnica
como otros tampones de hibridación adecuados (véase, por ejemplo,
Sambrook, et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,
NY, USA o Ausubel, et al., eds. (1990) Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Las condiciones de
hibridación óptimas se tienen que determinar empíricamente, ya que
la longitud y el contenido de GC de la sonda también juegan un
papel.
Los polinucleótidos capaces de hibridar
selectivamente con las secuencias de nucleótidos presentadas en este
documento, o con su complemento, tendrán una homología de al menos
70%, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos
80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos
90%, más preferiblemente al menos 95%, mucho más preferiblemente al
menos 98% con las secuencias de nucleótidos correspondientes
presentadas en este documento en una región de al menos 20,
preferiblemente al menos 25 ó 30, por ejemplo, al menos 40, 60 ó
100 o más nucleótidos contiguos.
La expresión "selectivamente hibridable"
significa que el polinucleótido usado como una sonda se usa en
condiciones en las que se observa que un polinucleótido diana de la
invención hibrida con la sonda a un nivel significativamente por
encima del nivel de fondo. La hibridación de fondo puede producirse
debido a otros polinucleótidos presentes, por ejemplo, en la
biblioteca de ADNc o de ADN genómico que se está explorando. En este
caso, el nivel de fondo implica un nivel de señal generado por la
interacción entre la sonda y un miembro de ADN no específico de la
biblioteca que es menos de 10 veces, preferiblemente menos de 100
veces tan intenso como la interacción específica observada con el
ADN diana. Se puede medir la intensidad de la interacción, por
ejemplo, radiomarcando la sonda, por ejemplo, con ^{32}P.
La presente invención describe secuencias de
nucleótidos que pueden hibridar con una cualquiera o más de las
secuencias de nucleótidos de la presente invención en condiciones
rigurosas (por ejemplo, 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M,
Citrato de Na_{3} 0,015 M pH 7,0}).
Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a
las secuencias descritas en este documento se pueden obtener de
varias maneras. Otras variantes de las secuencias descritas en este
documento se pueden obtener, por ejemplo, sondando bibliotecas de
ADN obtenidas a partir de una variedad de individuos, por ejemplo,
individuos de diferentes poblaciones. Además, se pueden obtener
otros homólogos virales/bacterianos, o celulares, particularmente
homólogos celulares encontrados en células de mamífero (por
ejemplo, células de bovino, ovino, porcino, equino, roedores y
primates), y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general
serán capaces de hibridar selectivamente con la secuencia mostrada
en la SEC ID Nº: 1. Tales secuencias se pueden obtener sondando
bibliotecas de ADNc hechas de, o bibliotecas de ADN genómico
derivadas de otras especies animales, y sondando tales bibliotecas
con sondas que comprenden toda o parte de la secuencia mostrada en
la SEC ID Nº: 1 en condiciones de rigurosidad media a alta. Se
aplican consideraciones similares para obtener especies homólogas y
variantes alélicas de las secuencias polipeptídicas o de
nucleótidos presentadas en este documento.
También se pueden obtener variantes y homólogos
de cepa/especie usando PCR degenerada que usará cebadores diseñados
para dirigirse a secuencias dentro de las variantes y homólogos que
codifican secuencias de aminoácidos conservadas en las secuencias
presentadas en este documento. Se pueden predecir las secuencias
conservadas, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos
de varias/os variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencias
se pueden realizar usando software informático conocido en la
técnica. Por ejemplo, se usa de forma generalizada el programa GCG
Wisconsin PileUp o ClustalW.
Los cebadores usados en la PCR degenerada
contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en
condiciones de rigurosidad menores que las usadas para clonar
secuencias con cebadores de secuencia única contra secuencias
conocidas.
Como alternativa, se pueden obtener tales
polinucleótidos por mutagénesis dirigida de secuencias
caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se
requieran cambios de codón silenciosos en las secuencias para
optimizar las preferencias de codón para una célula hospedadora
particular en la que se expresan las secuencias polinucleotídicas.
Se pueden desear otros cambios de secuencia para introducir sitios
de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la
propiedad o función de los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
Se pueden usar los polinucleótidos para producir
un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una
reacción de amplificación alternativa, una sonda, por ejemplo,
marcada con un marcador de revelado por medios convencionales
usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los
polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Tales cebadores,
sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15,
preferiblemente al menos 20, por ejemplo, al menos 25, 30 ó 40
nucleótidos.
Los polinucleótidos, tales como polinucleótidos
de ADN y sondas se pueden producir de forma recombinante, de forma
sintética, o por cualquier medio disponible para los especialistas
en la técnica. También se pueden clonar por técnicas
convencionales.
En general, los cebadores se producirán por
medios sintéticos, que implican una fabricación por etapas de la
secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido cada vez. Las
técnicas para conseguir esto usando técnicas automatizadas se
pueden adquirir fácilmente en la técnica.
Los polinucleótidos más largos generalmente se
producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando
técnicas de clonación por PCR. Esto implicará obtener un par de
cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que
flanquean una región de la secuencia que se desea clonar, poner los
cebadores en contacto con el ARNm o el ADNc obtenido de una célula
animal o de ser humano, realizar una reacción en cadena de la
polimerasa en condiciones que provoquen la amplificación de la
región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo,
purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar
el ADN amplificado. Los cebadores se pueden diseñar para contener
sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de
forma que el ADN amplificado se pueda clonar en un vector de
clonación adecuado.
Preferiblemente, el polinucleótido usado en la
presente invención está unido operativamente a una secuencia
reguladora que puede proporcionar la expresión de la secuencia
codificante, tal como por la célula hospedadora elegida. A modo de
ejemplo, la presente invención describe un vector que comprende el
polinucleótido de la presente invención unido operativamente a
dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de
expresión.
La expresión "unido operativamente" se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos
están en una relación que les permite funcionar de la manera
deseada. Una secuencia reguladora "unida operativamente" a una
secuencia codificante se une de tal manera que la expresión de la
secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con
las secuencias de control.
La expresión "secuencias reguladoras"
incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de
la expresión.
El término "promotor" se usa en el sentido
normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión de la ARN
polimerasa.
La expresión potenciada del polinucleótido que
codifica el polipéptido usado en la presente invención también
puede conseguirse por medio de la selección de regiones reguladoras
heterólogas, por ejemplo, regiones de promotor, de líder de
secreción y de terminación, que sirven para aumentar la expresión y,
si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del
hospedador de expresión elegido y/o para permitir el control
inducible de la expresión del polipéptido descrito en este
documento.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos
usada en la presente invención puede unirse operativamente a al
menos un promotor.
Aparte del promotor nativo para el gen que
codifica el polipéptido usado en la presente invención, pueden
usarse otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido.
El promotor puede seleccionarse por su eficacia para dirigir la
expresión del polipéptido en el hospedador de expresión deseado.
En otra realización, puede seleccionarse un
promotor constitutivo para dirigir la expresión del polipéptido
deseado. Esta construcción de expresión puede proporcionar ventajas
adicionales ya que evita la necesidad de cultivar el hospedador de
expresión en un medio que contiene un sustrato de inducción.
Serían ejemplos de promotores adecuados LTR,
SV40 y CMV en sistemas de mamífero; lac o trp de E.
coli en sistemas bacterianos; el promotor del poliedro de
baculovirus (polh) en sistemas de insecto y otros promotores
que se sabe que controlan la expresión en células eucariotas o
procariotas u otros virus.
Son ejemplos de promotores fuertes constitutivos
y/o inducibles que se prefieren para uso en hospedadores de
expresión fúngica los que se pueden obtener a partir de genes
fúngicos para promotores de xilanasa (xlnA), fitasa,
ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC), triosa
fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa
(AdhA), \alpha-amilasa (amy),
amiloglucosidasa (AG - del gen glaA), acetamidasa
(amdS) y
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa
(gpd).
(gpd).
Son ejemplos de promotores fuertes de levadura
los que se pueden obtener a partir de genes de alcohol
deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato quinasa y
triosafosfato isomerasa.
Son ejemplos de promotores bacterianos fuertes
los promotores de \alpha-amilasa y de SP02,
así como promotores de genes de proteasas extracelulares.
También pueden usarse promotores híbridos para
mejorar la regulación inducible de la construcción de expresión.
El promotor también puede incluir
características para asegurar o aumentar la expresión en un
hospedador adecuado. Por ejemplo, las características pueden ser
regiones conservadas tales como la caja Pribnow o una caja TATA. El
promotor puede contener incluso otras secuencias para afectar (tal
como mantener, mejorar o reducir) los niveles de expresión de la
secuencia de nucleótidos de la presente invención. Por ejemplo,
otras secuencias adecuadas incluyen el intrón Sh1 o un intrón de
ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles - tales como
elementos inducibles por la temperatura, agentes químicos, luz o
estrés. También pueden estar presentes elementos adecuados para
aumentar la transcripción o traducción. Un ejemplo de este último
elemento es la secuencia señal 5' de TMV (véase Sleat, Gene 217
[1987] 217-225; y Dawson, Plant Mol. Biol. 23 [1993]
97).
El vector de expresión también puede contener
secuencias que actúan sobre el promotor para amplificar la
expresión. Por ejemplo, los elementos de acción en cis de SV40, CMV
y polioma (potenciador) y un marcador selectivo pueden proporcionar
un rasgo fenotípico para la selección (por ejemplo, dihidrofolato
reductasa o resistencia a neomicina para células de mamífero o
resistencia a ampicilina/tetraciclina para E. coli). La
selección del vector apropiado que contiene el promotor y el
marcador de selección apropiado está bien dentro del nivel de los
especialistas en la técnica.
La expresión "construcción" - que es un
sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e
"híbrido" - incluye la secuencia de nucleótidos descrita en
este documento unida directa o indirectamente a un promotor. Un
ejemplo de unión indirecta es la disposición de un grupo espaciador
adecuado tal como una secuencia intrónica, tal como el intrón de
Sh1 o el intrón de ADH, entre el promotor y la secuencia de
nucleótidos descrita en este documento. Esto mismo ocurre para el
término "fusionado", que incluye la unión directa o indirecta.
En cualquier caso, los términos no incluyen la combinación natural
de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína asociada
normalmente con el promotor del gen de tipo silvestre y cuando están
en su medio natural.
La construcción puede contener o expresar
incluso un marcador que permita la selección de la construcción
genética, por ejemplo, en células de mamífero, levadura, insecto,
fúngicas o bacterianas. Existen varios marcadores que pueden usarse
tales como, por ejemplo, los que proporcionan resistencia a
antibióticos a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina y
gentamicina.
El término "vector" incluye vectores de
expresión, vectores de transformación y vectores lanzadera.
La expresión "vector de expresión"
significa una construcción que puede expresarse in vivo o
in vitro.
La expresión "vector de transformación"
significa una construcción que puede transferirse desde una entidad
a otra entidad - que puede ser de la misma especie o puede ser de
una especie diferente. Si la construcción puede transferirse desde
una especie a otra - tal como desde un vector viral tal como MMLV o
FIV a una línea celular o célula primaria humana o de mamífero,
entonces el vector de transformación algunas veces se denomina
"vector lanzadera".
Puede usarse una gran diversidad de sistemas de
expresión en diferentes hospedadores. Por ejemplo, sistemas
episomales, cromosómicos y derivados de virus (por ejemplo, vectores
derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, papovavirus
tales como SV40, vaccinia virus, adenovirus y retrovirus).
La secuencia de ADN puede insertarse en el
vector por una diversidad de técnicas. En general, la secuencia de
ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado
por procedimientos conocidos en la técnica y que se consideran
dentro del alcance de los especialistas en la técnica. La secuencia
de ADN en el vector de expresión está unida operativamente a
secuencias de control apropiadas que dirigen la síntesis de ARNm
(es decir, el promotor).
Los vectores pueden usarse para transformar una
célula hospedadora adecuada como se describe más adelante para
proporcionar la expresión de un polipéptido. De esta manera, en un
aspecto adicional, la invención describe un proceso para preparar
polipéptidos que comprende cultivar una célula hospedadora
transformada o transfectada con un vector de expresión como se ha
descrito anteriormente, en condiciones que proporcionen la expresión
por el vector de una secuencia codificante que codifica los
polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores
de plásmidos, virus o bacteriófagos (fago) que disponen de un
origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión
del polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.
Los vectores pueden contener uno o más genes
marcadores selectivos. Los sistemas de selección más adecuados para
microorganismos industriales son los formados por el grupo de
marcadores de selección que no requieren una mutación en el
organismo hospedador. Son ejemplos de marcadores de selección
fúngicos los genes de acetamidasa (amdS), ATP sintetasa,
subunidad 9 (oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), resistencia a fleomicina y a benomilo (benA). Son
ejemplos de marcadores de selección no fúngicos el gen de
resistencia a G418 bacteriano (éste también puede usarse en células
de mamífero y levaduras, pero no en hongos filamentosos), el gen de
resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a
neomicina (células de mamífero) y el gen uidA de E.
coli, que codifica la \beta-glucuronidasa
(GUS).
Los vectores pueden usarse in vitro, por
ejemplo para la producción de ARN o usarse para transfectar o
transformar una célula hospedadora.
De esta manera, pueden incorporarse
polinucleótidos en un vector recombinante (típicamente un vector
replicable), por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El
vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula
hospedadora compatible. De esta manera, la invención describe un
método para obtener polinucleótidos por medio de la introducción de
un polinucleótido en un vector replicable, la introducción del
vector en una célula hospedadora compatible y el desarrollo de la
célula hospedadora en condiciones que produzcan la replicación del
vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedadora. Más
adelante se describen células hospedadoras en relación con los
vectores de expresión.
La presente invención se refiere al uso de
células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que
expresan un polipéptido PFI-013 en métodos de
selección para la identificación de moduladores (por ejemplo,
antagonistas o agonistas) de PFI-013. Estas células
hospedadoras modificadas por ingeniería genética podrían usarse para
explorar bibliotecas de péptidos o moléculas orgánicas capaces de
modular la actividad de PFI-013. Los moduladores
(por ejemplo, antagonistas) del polipéptido PFI-013,
tales como anticuerpos, péptidos o pequeñas moléculas orgánicas
proporcionarán la base para composiciones farmacéuticas para el
tratamiento de enfermedades asociadas, por ejemplo, con
PFI-013. Estos moduladores (por ejemplo,
antagonistas) pueden administrarse solos o en combinación con otros
agentes terapéuticos para el tratamiento de estas enfermedades.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión y células hospedadoras que comprenden
secuencias polinucleotídicas que codifican PFI-013
para seleccionar agentes que puedan afectar a la expresión o
actividad de PFI-013.
El término "tejido", como se usa en este
documento, incluye el tejido per se y el órgano.
La expresión "célula hospedadora" - en
relación con la presente invención - incluye cualquier célula que
pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína recombinante descrita en la presente invención y/o
productos obtenidos a partir de la misma, donde un promotor puede
permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos cuando está
presente en la célula hospedadora.
La presente invención describe además células
hospedadoras transformadas o transfectadas con un polinucleótido.
Preferiblemente, dicho polinucleótido se lleva en un vector para la
replicación y expresión de dicho polinucleótido. Las células se
elegirán de manera que sean compatibles con dicho vector y pueden
ser, por ejemplo, procariotas (por ejemplo, células bacterianas), o
eucariotas (es decir, células de mamífero, fúngicas, de insecto y de
levadura).
La introducción de polinucleótidos en células
hospedadoras puede realizarse por métodos como los descritos en
Sambrook, et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA.
Estos métodos incluyen, pero sin limitación, transfección con
fosfato cálcico, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos
catiónicos, electroporación, transvección, microinyección,
transducción, microinyección de Amarillo de Lucifer (scrape loading)
e introducción balística.
Los ejemplos de hospedadores representativos
incluyen células bacterianas (por ejemplo, E. coli,
Streptomyces); células fúngicas tales como células de
levadura y Aspergillus; células de insecto tales como células
de Drosophila S2 y Spodoptera SF9; células de
animales tales como células CHO, COS, HEK, HeLa y 3T3. La selección
del hospedador apropiado se considera dentro del alcance de los
especialistas en la técnica.
Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido
que codifica el polipéptido descrito en este documento, y/o el
deseo de un procesamiento adicional de la proteína expresada, pueden
preferirse hospedadores eucariotas tales como levaduras u otros
hongos. En general, se prefieren las células de levadura a las
células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo,
algunas proteínas se expresan o se secretan poco en células de
levadura, o en algunos casos no se procesan de la manera apropiada
(por ejemplo, hiperglicosilación en levadura). En estos casos, debe
seleccionarse un organismo hospedador fúngico diferente.
Los ejemplos de hospedadores de expresión
apropiados para uso en la presente invención son hongos tales como
especies de Aspergillus (tales como las descritas en los
documentos EP-A-0184438 y
EP-A-0284603) y especies de
Trichoderma; bacterias tales como especies de
Escherichia, especies de Streptomyces y especies de
Pseudomonas; y levaduras tales como especies de
Kluyveromyces (tales como las descritas en los documentos
EP-A-0096430 y
EP-A-0301670) y especies de
Saccharomyces. A modo de ejemplo, los hospedadores de
expresión típicos pueden seleccionarse entre Aspergillus
niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus
niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus
nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei,
Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe,
Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae.
El uso de células hospedadoras adecuadas - tales
como células de mamífero, levadura, insecto y fúngicas - puede
permitir la realización de modificaciones postraduccionales (por
ejemplo, miristoilación, glicosilación, truncamiento, lipidación y
fosforilación de tirosina, serina o treonina) que pueden ser
necesarias para conferir una actividad biológica óptima tras la
expresión recombinante de productos descritos en este documento.
El término "organismo" incluye cualquier
organismo, excepto el ser humano, que pueda comprender la secuencia
de nucleótidos que codifica la proteína recombinante descrita en
este documento y/o productos obtenidos a partir de la misma, donde
un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de
nucleótidos descrita en este documento cuando está presente en el
organismo. Los ejemplos de organismos pueden incluir un hongo,
levadura o protozoo.
La expresión "organismo transgénico"
incluye cualquier organismo, excepto el ser humano, que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica la proteína descrita en este
documento y/o productos obtenidos a partir de la misma, donde el
promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos
descrita en este documento dentro del organismo. Preferiblemente,
la secuencia de nucleótidos se incorpora en el genoma del
organismo.
La expresión "organismo transgénico" no
incluye la secuencia de nucleótidos codificante nativa en su medio
natural cuando está bajo el control de su promotor nativo que
también está en su medio natural. Además, la presente invención no
incluye la proteína nativa cuando está en su medio natural y cuando
se ha expresado por su secuencia de nucleótidos codificante nativa
que también está en su medio natural y cuando esa secuencia de
nucleótidos está bajo el control de su promotor nativo que también
está en su medio natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico descrito
en este documento incluye un organismo que comprende uno cualquiera
de, o combinaciones de, la secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos, construcciones, vectores, plásmidos,
células y tejidos o sus productos que se describen en este
documento. La célula u organismo transformado podría preparar
cantidades aceptables del compuesto deseado que podrían recuperarse
fácilmente de la célula u organismo.
Como se ha indicado anteriormente, el organismo
hospedador puede ser un organismo procariota o eucariota. Un
ejemplo de un hospedador procariota adecuado es E. coli. Las
enseñanzas sobre la transformación de hospedadores procariotas
están bien documentadas en la técnica, por ejemplo véase Sambrook
et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA) y
Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology
(1995), John Wiley & Sons, Inc.).
En un ejemplo preferido, el hospedador
transformado es una célula de mamífero o, por ejemplo, una célula de
insecto, donde la introducción de polinucleótidos en dicha célula
hospedadora puede realizarse por métodos como los descritos, por
ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, NY, USA). Estos métodos incluyen, pero sin limitación,
transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos
catiónicos, electroporación, transvección, microinyección,
transducción, microinyección de Amarillo Lucifer (scrape loading) e
introducción balística.
En otro ejemplo, el organismo transgénico puede
ser una levadura. A este respecto, también se han usado levaduras
ampliamente como vehículo para la expresión de genes heterólogos. La
especie Saccharomyces cerevisiae tiene una larga historia de
uso industrial, incluyendo su uso para la expresión de genes
heterólogos. La expresión de genes heterólogos en Saccharomyces
cerevisiae se ha revisado por Goodey et al. (1987, Yeast
Biotechnology, D R Berry et al, eds, páginas
401-429, Allen y Unwin, London) y por King et
al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton y G
T Yarronton, eds, páginas 107-133, Blackie,
Glasgow).
Por varias razones Saccharomyces
cerevisiae es adecuado para la expresión de genes heterólogos.
En primer lugar, no es patógeno para los seres humanos y no puede
producir ciertas endotoxinas. En segundo lugar, tiene una larga
historia de seguridad en el uso después de siglos de explotación
comercial para diversos fines. Esto ha llevado a una amplia
aceptación por el público. En tercer lugar, el amplio uso comercial
y la investigación asociada con el organismo han dado como
resultado una riqueza de conocimiento sobre la genética y
fisiología, así como las características de fermentación a gran
escala de Saccharomyces cerevisiae.
Se proporciona una revisión de los principios de
la expresión génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y
la secreción de productos génicos en E Hinchcliffe y E Kenny
("Yeast as a vehicle for the expression of heterologous
genes", 1993, Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison,
eds, 2ª edición, Academic Press Ltd.).
Están disponibles varios tipos de vectores de
levadura, incluyendo vectores de integración, que requieren
recombinación con el genoma del hospedador para su mantenimiento, y
vectores plasmídicos que se replican de forma autónoma.
Para preparar el Saccharomyces
transgénico, se preparan construcciones de expresión insertando
secuencias de nucleótidos en una construcción diseñada para la
expresión en levadura. Se han desarrollado varios tipos de
construcción usados para expresión heteróloga. Las construcciones
contienen un promotor activo en levadura fusionado con la secuencia
de nucleótidos de la presente invención, habitualmente se usa un
promotor con origen de levadura, tal como el promotor GAL1.
Habitualmente se usa una secuencia de señal con origen de levadura,
tal como la secuencia que codifica el péptido señal SUC2. Un
terminador activo en levadura detiene el sistema de expresión.
Se han desarrollado varios protocolos de
transformación para la transformación de levaduras. Por ejemplo, se
puede preparar un Saccharomyces transgénico siguiendo las
enseñanzas de Hinnen et al. (1978, Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA, 75: 1929); Beggs, J D
(1978, Nature, Londres, 275:104); e Ito, H et al. (1983, J.
Bacteriology 153:163-168).
Las células de levadura transformadas se
seleccionan usando diversos marcadores selectivos. Entre los
marcadores usados para la transformación hay varios marcadores
auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores de
resistencia a antibióticos dominantes tales como los marcadores de
antibióticos aminoglicósidos, por ejemplo, G418.
Por lo tanto, la presente invención también
describe un método para transformar una célula hospedadora con una
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o un derivado,
homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma.
Las células hospedadoras transformadas con una
secuencia de nucleótidos codificante de PFI-013 se
pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y
recuperación de la proteína codificada (en membranas celulares) del
cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante
se puede expresar en la superficie celular, puede secretarse o
puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia
y/o el vector usado. Como entenderán los especialistas en la
técnica, los vectores de expresión que contengan secuencias
codificantes de PFI-013 generalmente permitirán la
expresión en la membrana celular. Otras construcciones
recombinantes pueden unir la secuencia codificante de
PFI-013 a la secuencia de nucleótidos que codifica
un dominio polipeptídico que facilitará la
purificación/identificación de proteínas (Kroll DJ et al.
(1993) DNA Cell Biol Vol 12 pág. 441-53, véase
también la anterior discusión de vectores que contienen proteínas
de fusión).
Una célula, preferiblemente una célula animal,
que está "genéticamente modificada" es heterocigota u
homocigota para una modificación que se introduce en la célula, o
en una célula progenitora, por ingeniería genética. Los métodos
convencionales de ingeniería genética que están disponibles para
introducir la modificación incluyen recombinación homóloga,
inmovilización de genes en vector viral, irradiación, mutagénesis
química y la expresión transgénica de una secuencia de nucleótidos
que codifica ARN antisentido solo o en combinación con ribozimas
catalíticas. Los métodos preferidos para la modificación genética
son recombinación homóloga e inmovilización de genes en vector
viral, modificando ambos un gen endógeno insertando una secuencia de
ácido nucleico extraña en el locus del gen. Una secuencia de ácido
nucleico que es extraña al gen es una secuencia exógena que aparece
de forma natural en el gen. Esta inserción de ADN extraño puede
suceder en cualquier región del gen de PFI-013, por
ejemplo, en un potenciador, un promotor, una región reguladora, una
región no codificante, una región codificante, un intrón o un exón.
El método más preferido de modificación por ingeniería genética es
la recombinación homóloga, en la que la secuencia de ácido nucleico
extraña se inserta de manera dirigida sola o en combinación con una
deleción de una parte de la secuencia génica endógena.
Por un gen de PFI-013 que está
"alterado funcionalmente" se entiende un gen de
PFI-013 que está modificado genéticamente de forma
que la actividad celular del polipéptido PFI-013
codificado por el gen alterado está disminuida en células que
normalmente expresan la versión de tipo silvestre del gen de
PFI-013. Cuando la modificación genética elimina
eficazmente todas las copias de tipo silvestre del gen de
PFI-013 en una célula (por ejemplo, la célula
modificada genéticamente, preferiblemente una célula animal, es
homocigota para la alteración del gen de PFI-013 o
solamente la copia de tipo silvestre del gen de
PFI-013 presente originariamente está ahora
alterada), entonces la modificación genética tiene como resultado
una disminución de la actividad del polipéptido
PFI-013 (es decir, se reduce la expresión del
receptor) en comparación con una célula de control apropiada que
expresa el gen de tipo silvestre de PFI-013. Esta
disminución de la actividad del polipéptido PFI-013
(es decir, reducción de la expresión del receptor) se debe a la
reducción de la expresión del gen de PFI-013 (es
decir, los niveles de ARNm de PFI-013 disminuyen de
forma eficaz y producen niveles disminuidos del polipéptido
PFI-013) y/o se debe a que el gen de
PFI-013 alterado codifica un polipéptido mutado con
función o estabilidad disminuida en comparación con un polipéptido
PFI-013 de tipo silvestre. Preferiblemente, la
actividad (es decir, expresión disminuida del receptor) del
polipéptido PFI-013 en la célula modificada
genéticamente disminuye hasta 50% o menos de los niveles de tipo
silvestre, más preferiblemente, hasta 25% o menos, e, incluso más
preferiblemente, hasta 10% o menos de los niveles de tipo silvestre.
Mucho más preferiblemente, la alteración del gen de
PFI-013 da como resultado una mutación null.
Por una "célula animal modificada
genéticamente" que contiene un gen alterado funcionalmente de
PFI-013 se entiende una célula animal, incluyendo
una célula humana, creada por ingeniería genética para contener un
gen alterado funcionalmente de PFI-013, así como
células hijas que heredan el gen alterado de
PFI-013. Estas células se pueden modificar
genéticamente en un cultivo de acuerdo con métodos convencionales
conocidos en la técnica. Como alternativa a modificar genéticamente
las células en cultivo, también pueden aislarse células de mamífero
no humanas a partir de un mamífero no humano modificado
genéticamente que contiene una rotura en el gen de
PFI-013. Las células animales pueden obtenerse a
partir de preparaciones de células o tejidos primarios así como de
líneas celulares adaptadas a cultivo, tumorigénicas o transformadas.
Estas células y líneas celulares proceden, por ejemplo, de células
endoteliales, células epiteliales, islotes, neuronas y otras
células derivadas de tejido neural, células mesoteliales,
osteocitos, linfocitos, condrocitos, células hematopoyéticas,
células inmunes, células de las glándulas u órganos principales (por
ejemplo, hígado, pulmón, corazón, estómago, páncreas, riñón y
piel), células de músculo liso (incluyendo células del músculo
esquelético, músculo liso y músculo cardíaco), células endocrinas o
exocrinas, fibroblastos y células madre embrionarias y otras
células totipotentes o pluripotentes (por ejemplo, células madre
embrionarias (ES), células de tipo ES y células de la línea
germinal embrionaria (EG), y otras células madre, tales como células
progenitoras y células madre derivadas de tejidos). Las células
modificadas genéticamente preferidas son células ES, más
preferiblemente células ES de ratón o de rata, y aún más
preferiblemente células ES humanas.
Una "región de homología" usada en un
vector de dirección para recombinación homóloga con un gen de
PFI-013 está relacionada (es decir, es
complementaria) con una parte del gen de PFI-013 o
con una secuencia que flanquea el gen de PFI-013 en
un grado suficiente para permitir que se produzca la hibridación
entre la región de homología y la secuencia del gen de
PFI-013 en condiciones de baja rigurosidad
convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, como se
describe en Current Protocols in Human Genetics, unidad 4.1, John
Wiley & Sons, New York, NY, 2000).
Por una "célula ES" o una "célula de tipo
ES" se entiende una célula madre pluripotente derivada de un
embrión, de una célula germinal primordial o de un teratocarcinoma,
que puede auto-renovarse de manera indefinida así
como diferenciarse en tipos celulares que son representantes de las
tres capas germinales embrionarias.
Por "reducido" se entiende una reducción
estadísticamente significativa (es decir, p<0,1).
Las células animales modificadas genéticamente,
incluyendo las células humanas, son heterocigotas u homocigotas
para una modificación que altere funcionalmente el gen de
PFI-013. Las células animales pueden obtenerse por
ingeniería genética en células en cultivo o, en el caso de células
de mamífero no humano, las células pueden aislarse a partir de
mamíferos no humanos modificados genéticamente.
El locus del gen de PFI-013 se
rompe funcionalmente por uno de los diversos métodos para
modificación genética conocidos en la técnica, incluyendo
mutagénesis química (Rinchik, Trends in Genetics 7:
15-21, 1991, Russell, Environmental & Molecular
Mutagenesis 23 (Suppl. 24) 23-29, 1994), irradiación
(Russell, supra), expresión transgénica de ARN antisentido
del gen de PFI-013, solo o en combinación con una
secuencia de ribozima de ARN catalítica (Luyckx et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 12174-79, 1999; Sokol
et al., Transgenic Research 5: 363-71, 1996;
Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
2051-55, 1994; Larsson et al., Nucleic Acids
Research 22: 2242-48, 1994) y, como se describe con
más detalle más adelante, la rotura del gen de
PFI-013 por la inserción de una secuencia de ácido
nucleico extraña en el locus del gen de PFI-013.
Preferiblemente, la secuencia extraña se inserta por recombinación
homóloga o por la inserción de un vector viral. Más
preferiblemente, el método de alteración génica de
PFI-013 es recombinación homóloga e incluye una
deleción de una parte de la secuencia del gen endógeno de
PFI-013.
La integración de la secuencia extraña altera
funcionalmente el gen de PFI-013 por medio de uno o
más de los siguientes mecanismos: por interferencia con el proceso
de transcripción o traducción del gen de PFI-013
(por ejemplo, por interferencia con el reconocimiento del promotor,
o por introducción de un sitio de terminación de la transcripción o
un codón de parada de la traducción en el gen de
PFI-013); o por distorsión de la secuencia
codificante del gen de PFI-013 de tal manera que ya
no codifique un polipéptido PFI-013 con función
receptora normal (por ejemplo, por inserción de una secuencia
codificante extraña en la secuencia codificante del gen de
PFI-013, por introducción de una mutación de cambio
de fase o sustitución de uno o más aminoácidos, o, en el caso de un
suceso cruzado doble, por deleción de una parte de la secuencia
codificante del gen de PFI-013 que se requiere para
la expresión de una proteína receptora funcional).
Para insertar una secuencia extraña en el locus
de un gen de PFI-013 en el genoma de una célula, la
secuencia de ADN extraña se introduce en la célula de acuerdo con
un método convencional conocido en la técnica tal como
electroporación, precipitación con fosfato cálcico, infección
retroviral, microinyección, balística, transfección de liposomas,
transfección con DEAE-dextrano o infección con
transferrina (véase, por ejemplo, Neumann et al., EMBO J. 1:
841-845, 1982; Potter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA 81: 7161-65, 1984; Chu et al.,
Nucleic Acids Res. 15: 1311-26, 1987; Thomas y
Capecchi, Cell 51: 503-12, 1987; Baum et
al., Biotechniques 17: 1058-62, 1994; Biewenga
et al., J. Neuroscience Methods 71: 67-75,
1997; Zhang et al., Biotechniques 15:
868-72, 1993; Ray y Gage, Biotechniques 13:
598-603, 1992; Lo, Mol. Cell. Biol. 3:
1803-14, 1983; Nickoloff et al., Mol.
Biotech. 10: 93-101, 1998; Linney et al.,
Dev. Biol. (Orlando) 213: 207-16, 1999; Zimmer y
Gruss, Nature 338: 150-153, 1989; y Robertson et
al., Nature 323: 445-48, 1986). El método
preferido para introducir ADN extraño en una célula es
electroporación.
El método de recombinación homóloga se dirige al
gen de PFI-013 para que se altere por medio de la
introducción de un vector de dirección al gen de
PFI-013 en una célula que contiene un gen de
PFI-013. La capacidad del vector de dirección al
gen de PFI-013 para su alteración se debe al uso de
una secuencia de nucleótidos en el vector que es homóloga al gen de
PFI-013. Esta región de homología facilita la
hibridación entre el vector y la secuencia endógena del gen de
PFI-013. Tras la hibridación, aumenta en gran medida
la probabilidad de un suceso cruzado entre el vector de dirección y
secuencias genómicas. Este suceso cruzado tiene como resultado la
integración de la secuencia del vector en el locus del gen de
PFI-013 y la alteración funcional del gen de
PFI-013.
Se revisan principios generales con respecto a
la construcción de vectores usados para la dirección en Bradley
et al. (Biotechnol. 10: 534, 1992). Pueden usarse dos tipos
ejemplares diferentes de vector para insertar ADN por recombinación
homóloga: un vector de inserción o un vector de reemplazo. Un vector
de inserción es ADN circular que contiene una región de homología
del gen de PFI-013 con un rotura bicatenaria.
Después de la hibridación entre la región de homología y el gen de
PFI-013 endógeno, un solo suceso cruzado en la
rotura bicatenaria tiene como resultado la inserción de la
secuencia del vector entera en el gen endógeno en el sitio de
cruce.
El vector más preferido para usar para la
recombinación homóloga es un vector de reemplazo, que es colineal
en lugar de circular. La integración del vector de reemplazo en el
gen de PFI-013 requiere un suceso cruzado doble, es
decir, el cruce en dos sitios de hibridación entre el vector de
dirección y el gen de PFI-013. Este suceso cruzado
doble tiene como resultado la integración de una secuencia del
vector que está intercalada entre los dos sitios de cruce en el gen
de PFI-013 y la deleción de la secuencia del gen de
PFI-013 endógeno correspondiente que originalmente
estaba entre los dos sitios de cruce (véase, por ejemplo, Thomas y
Capecchi et al., Cell 51: 503-12, 1987;
Mansour et al., Nature 336: 348-52, 1988;
Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
7688-7692, 1990; y Mansour, GATA 7:
219-227, 1990).
Una región de homología en un vector de
dirección generalmente tiene una longitud de al menos 100
nucleótidos. Más preferiblemente, la región de homología tiene una
longitud de al menos 1-5 kilobases (Kb). Aunque no
hay ninguna longitud mínima demostrada o grado mínimo de relación
necesario para una región de homología, la eficacia de dirección
para recombinación homóloga generalmente corresponde con la longitud
y grado de relación entre el vector de dirección y el locus del gen
de PFI-013. En caso de que se use un vector de
reemplazo, y una parte del gen de PFI-013 endógeno
se delecione tras recombinación homóloga, una consideración
adicional es el tamaño de la parte delecionada del gen de
PFI-013 endógeno. Si esta parte del gen de
PFI-013 endógeno tiene una longitud mayor de 1 kb,
entonces se recomienda un casete de dirección con regiones de
homología mayores de 1 kb para mejorar la eficacia de la
recombinación. En la bibliografía se describe una guía adicional con
respecto a la selección y uso de secuencias eficaces para
recombinación homóloga (véase, por ejemplo, Deng y Capecchi, Mol.
Cell. Biol. 12: 3365-3371, 1992; Bollag et
al., Annu. Rev. Genet. 23: 199-225, 1989; y
Waldman y Liskay, Mol. Cell. Biol. 8:
5350-5357,
1988).
1988).
Puede usarse una amplia diversidad de vectores
de clonación como esqueletos de vector en la construcción de
vectores de dirección al gen de PFI-013, incluyendo
plásmidos relacionados con pBluescript (por ejemplo, Bluescript
KS+11), pQE70, pQE60, pQE-9, pBS, pD10, phagescript,
phiX174, fagémido pBK, pNH8A, pNH16a, pNH18Z, pNH46A, ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, and
pRIT5 PWLNEO, pSV2CAT, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, PBPV, PMSG, y
pSVL, vectores basados en pBR322 y pBR322, pBM9, pBR325, pKH47,
pBR328, pHC79, fago Charon 28, pKB11, pKSV-10,
plásmidos relacionados con pK19, plásmidos pUC, y la serie de
plásmidos pGEM. Estos vectores pueden adquirirse en una diversidad
de fuentes comerciales (por ejemplo, Boehringer Mannheim
Biochemicals, Indianapolis, IN; Qiagen, Valencia, CA; Stratagene,
La Jolla, CA; Promega, Madison, WI; y New England Biolabs, Beverly,
MA). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector, por
ejemplo, plásmidos, virus o sus partes, siempre que sean
replicables y viables en el hospedador deseado. El vector también
puede comprender secuencias que le permiten replicarse en el
hospedador cuyo genoma se va a modificar. El uso de este vector
puede expandir el periodo de interacción durante el cual puede
producirse la recombinación, aumentando la eficacia de la dirección
(véase Molecular Biology, ed. Ausubel et al, Unit 9.16, Fig.
9.16.1).
El hospedador específico empleado para propagar
los vectores de dirección descritos anteriormente no es crítico.
Los ejemplos incluyen K12 RR1 de E. coli (Bolivar et
al., Gene 2: 95, 1977), K12 HB101 de E. coli (ATCC Nº
33694), MM21 de E. coli (ATCC Nº 336780), DH1 de E.
coli (ATCC Nº 33849), la cepa DH5\alpha de E. coli y
STBL2 de E. coli. Como alternativa, pueden usarse
hospedadores tales como Saccharomyces cerevisiae. Los
hospedadores mencionados anteriormente están disponibles en el
mercado (por ejemplo, Stratagene, La Jolla, CA; y Life
Technologies, Rockville, MD).
Para crear el vector de dirección, se añade una
construcción de dirección al gen de PFI-013 a un
esqueleto de vector descrito anteriormente. Las construcciones de
dirección al gen de PFI-013 descritas anteriormente
tienen al menos una región de homología al gen de
PFI-013. Para obtener las regiones de homología al
gen de PFI-013, se usa una secuencia relacionada
con el gen de PFI-013 como base para producir
cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos
cebadores se usan para amplificar la región deseada de la secuencia
de PFI-013 por amplificación por PCR de alta
fidelidad (Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967, 1991;
Eckert y Kunkel 1: 17, 1991; y Patente de Estados Unidos Nº
4.683.202). La secuencia genómica se obtiene a partir de una
biblioteca de clones genómicos o por preparación de ADN genómico,
preferiblemente de la especie animal diana para la alteración del
gen de PFI-013.
Preferiblemente, las construcciones de dirección
descritas anteriormente también incluyen una secuencia de
nucleótidos exógena que codifica una proteína marcadora positiva. La
expresión estable de un marcador positivo después de la integración
del vector confiere una característica identificable a la célula sin
comprometer la viabilidad de la célula. Por lo tanto, en el caso de
un vector de reemplazo, el gen marcador se coloca entre dos
regiones de homología flanqueantes de manera que se integra en el
gen de PFI-013 después del suceso cruzado
doble.
Se prefiere que la proteína marcadora positiva
sea una proteína selectiva; la expresión estable de esta proteína
en una célula confiere una característica fenotípica selectiva, es
decir, la característica aumenta la supervivencia de la célula en
condiciones letales de otra manera. De esta manera, por medio de la
imposición de la condición selectiva, se pueden aislar células que
expresen de manera estable el marcador selectivo positivo de otras
células que no tengan integrada satisfactoriamente la secuencia del
vector basándose en la viabilidad. Los ejemplos de proteínas
marcadoras selectivas (y sus agentes de selección) incluyen Neo
(G418 o kanamicina), Hyg (higromicina), HisD (histidinol), Gpt
(xantina), Ble (bleomicina) y Hprt (hipoxantina) (véase, por
ejemplo, Capecchi y Thomas, Patente de Estados Unidos Nº 5.464.764
y Capecchi, Science 244: 1288-92, 1989). Otros
marcadores positivos que también pueden usarse como alternativa a
un marcador selectivo incluyen proteínas indicadoras tales como
\beta-galactosidasa, luciferasa de luciérnaga, o
proteína fluorescente verde (véase, por ejemplo, Current Protocols
in Cytometry, Unidad 9.5, y Current Protocols in Molecular Biology,
Unidad 9.6, John Wiley & Sons; New York, NY, 2000).
El esquema de selección positiva descrito
anteriormente no distingue entre células que han integrado el vector
por recombinación homóloga dirigida en el locus del gen de
PFI-013 frente a la integración no homóloga
aleatoria de la secuencia del vector en cualquier posición
cromosómica. Por lo tanto, cuando se usa un vector de reemplazo
para recombinación homóloga, también se prefiere incluir una
secuencia de nucleótidos que codifique una proteína marcadora de
selección positiva. La expresión de un marcador selectivo negativo
hace que una célula que expresa el marcador pierda viabilidad
cuando se expone a cierto agente (es decir, la proteína marcadora se
vuelve letal para la célula en ciertas condiciones selectivas). Los
ejemplos de marcadores de selección negativa (y sus agentes de
letalidad) incluyen timidina quinasa del virus herpes simplex
(ganciclovir o
1,2-desoxi-2-fluoro-\alpha-d-arabinofuranosil-5-yodouracilo),
Hprt (6-tioguanina o 6-tioxantina),
toxina diftérica, toxina de ricino y citosina desaminasa
(5-fluorocitosina).
La secuencia de nucleótidos que codifica el
marcador de selección negativa está situada fuera de las dos
regiones de homología del vector de sustitución. Con esta posición,
las células sólo integran y expresan de forma estable el marcador
de selección negativa si la integración se produce mediante
recombinación no homóloga aleatoria; la recombinación homóloga
entre el gen de PFI-013 y las dos regiones de
homología en la construcción de dirección excluye la integración de
la secuencia que codifica el marcador de selección negativa. Por lo
tanto, mediante la imposición de la condición negativa, las células
que han integrado el vector de dirección mediante recombinación no
homóloga aleatoria pierden la viabilidad.
Se prefiere la combinación descrita
anteriormente de marcadores de selección positiva y negativa porque
puede diseñarse una serie de etapas de selección positivas y
negativas para seleccionar más eficazmente sólo las células que han
experimentado la integración del vector por recombinación homóloga
y, por lo tanto, tienen un gen de PFI-013
potencialmente interrumpido. Se describen ejemplos adicionales de
esquemas de selección positiva-negativa, marcadores
selectivos y construcciones de dirección, por ejemplo, en la Patente
de Estados Unidos Nº 5.464.764, el documento WO 94/06908 y
Valancius y Smithies, Mol. Cell. Biol. 11: 1402, 1991.
Para que una proteína marcadora se exprese de
manera estable tras la integración del vector, el vector de
dirección puede diseñarse de manera que la secuencia codificante
marcadora esté unida operativamente al promotor endógeno del gen de
PFI-013 tras la integración del vector. Entonces, la
expresión del marcador se dirige por el promotor del gen de
PFI-013 en células que expresan normalmente el gen
de PFI-013. Como alternativa, cada marcador en la
construcción de dirección del vector puede contener su propio
promotor que dirige la expresión independiente del promotor del gen
de PFI-013. Este último esquema tiene la ventaja de
permitir la expresión de marcadores en células que típicamente no
expresan el gen de PFI-013 (Smith and Berg, Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 49: 171, 1984; Sedivy and Sharp,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 227: 1989; Thomas y Capecchi, Cell
51: 503, 1987.
Los promotores exógenos que pueden usarse para
dirigir la expresión de genes marcadores incluyen promotores
específicos de célula o específicos de fase, promotores
constitutivos y promotores inducibles o regulables. Los ejemplos,
sin limitación, de estos promotores incluyen el promotor de timidina
quinasa de herpes simplex, promotor/potenciador de citomegalovirus
(CMV), promotores de SV40, promotor de PGK,
PMC1-neo, promotor de metalotioneína, promotor
tardío de adenovirus, promotor 7.5K de virus vaccinia, promotor de
beta globina aviar, promotores de histona (por ejemplo, de la
histona de ratón H3-614), promotor de beta actina,
enolasa específica de neuronas, promotor de actina muscular y
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (véase en general,
Sambrook et al., Molecular Cloning, Vols.
I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1989 y Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 2000; Stratagene, La Jolla,
CA).
Para confirmar si las células han integrado la
secuencia del vector en el locus diana del gen de
PFI-013, pueden usarse cebadores o sondas genómicas
que son específicas para el suceso deseado de integración del vector
junto con análisis por PCR o por transferencia de Southern para
identificar la presencia del vector de integración deseado en el
locus del gen de PFI-013 (Erlich et al.,
Science 252: 1643-51, 1991; Zimmer y Gruss, Nature
338: 150, 1989; Mouellic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
87: 4712, 1990; y Shesely et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 88: 4294, 1991).
Otro método disponible para insertar una
secuencia de ácido nucleico extraña en el locus del gen de
PFI-013 para alterar funcionalmente el gen de
PFI-013 es la inmobilización de genes. Este método
aprovecha la maquinaria celular presente en todas las células de
mamíferos que empalma los exones en el ARNm para insertar una
secuencia codificante de un vector de captura de genes en un gen de
manera aleatoria. Una vez insertado, el vector de captura de genes
produce una mutación que puede alterar funcionalmente el gen de
PFI-013 capturado. A diferencia de la recombinación
homóloga, este sistema para mutagénesis genera mutaciones en su
mayoría aleatorias. Por lo tanto, para obtener una célula
modificada genéticamente que contiene un gen de
PFI-013 funcionalmente interrumpido, deben
identificarse y seleccionarse las células que contengan esta
mutación particular a partir de una combinación de células que
contienen mutaciones aleatorias en una diversidad de genes.
Se han descrito sistemas y vectores de captura
de genes para usar en células murinas genéticamente modificadas y
otros tipos celulares (véanse, por ejemplo, Allen et al.,
Nature 333: 852-55, 1988; Bellen et al.,
Genes Dev. 3: 1288-1300, 1989; Bier et al.,
Genes Dev. 3: 1273-1287, 1989; Bonnerot et
al., J. Virol. 66: 4982-91, 1992; Brenner et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 5517-21,
1989; Chang et al., Virology 193: 737-47,
1993; Friedrich y Soriano, Methods Enzymol. 225:
681-701, 1993; Friedrich y Soriano, Genes Dev. 5:
1513-23, 1991; Goff, Methods Enzymol. 152:
469-81, 1987; Gossler et al., Science 244:
463-65, 1989; Hope, Develop. 113:
399-408, 1991; Kerr et al., Cold Spring Harb.
Symp. Quant. Biol. 2: 767-776, 1989; Reddy et
al., J. Virol. 65: 1507-1515, 1991; Reddy et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6721-25,
1992; Skarnes et al., Genes Dev. 6: 903-918,
1992; von Melchner y Ruley, J. Virol. 63: 3227-3233,
1989; y Yoshida et al., Transgen. Res. 4:
277-87, 1995).
Los vectores de captura de promotores (5' trap)
contienen, en sentido 5' a 3', una secuencia aceptora de corte y
empalme seguida de un exón, que típicamente se caracteriza por un
codón de inicio de la traducción y una fase de lectura abierta
(ORF) y/o un sitio interno de entrada al ribosoma. En general, estos
vectores de captura de promotores no contienen promotores ni
secuencias donantes de corte y empalme operativamente unidas. Por
consiguiente, después de la integración en el genoma celular de la
célula hospedadora, la secuencia del vector de captura de
promotores intercepta el corte y empalme normal del gen que se
encuentra cadena arriba y actúa como exón terminal. La expresión
de la secuencia codificante del vector depende de la integración
del vector en un intrón del gen interrumpido en la fase de lectura
apropiada. En tal caso, la maquinaria celular de corte y empalme
empalma exones del gen capturado cadena arriba de la secuencia
codificante del vector (Zambrowicz et al., documento WO
99/50426).
Un método alternativo para producir un efecto
similar al del vector de captura de promotores descrito
anteriormente es un vector que incorpora un conjunto anidado de
codones de terminación presentes en, o si no introducidos por
ingeniería genética en, la región entre el aceptor de corte y
empalme del vector de captura de promotor y el codón de inicio de
la traducción o secuencia de poliadenilación. La secuencia
codificante puede también generarse por ingeniería genética para
contener un sitio de entrada al ribosoma independiente (IRES), de
manera que la secuencia codificante se exprese en gran medida de
manera independiente del sitio de integración dentro del genoma de
la célula hospedadora. Típicamente, pero no necesariamente, se usa
un IRES junto con un conjunto anidado de codones de
terminación.
Otro tipo de esquema de captura de genes usa un
vector de captura de genes 3'. Este tipo de vector contiene, en
combinación operativa, una región promotora que media la expresión
de una secuencia codificante contigua, la secuencia codificante, y
una secuencia donante de corte y empalme que determina el extremo 3'
del exón de la secuencia codificante. Después de la integración en
el genoma de una célula hospedadora, el transcrito expresado por el
promotor del vector se corta y empalma con una secuencia aceptora de
corte y empalme del gen capturado que se localiza cadena abajo de
la secuencia del vector de captura de genes integrado. Por lo
tanto, la integración del vector produce la expresión de un
transcrito de fusión que comprende la secuencia codificante del
casete de captura de genes 3' y cualquier exón celular cadena abajo,
incluyendo el exón terminal y su señal de poliadenilación. Cuando
tales vectores se integran en un gen, la maquinaria de corte y
empalme celular corta y empalma la secuencia codificante del vector
cadena arriba de los exones 3' del gen capturado. Una ventaja de
tales vectores es que la expresión de los vectores de captura de
genes 3' se dirige por un promotor del casete de captura de genes y
no requiere la integración en un gen que se exprese normalmente en
la célula hospedadora (Zambrowicz et al., documento WO
99/50426). Los ejemplos de promotores y potenciadores de la
transcripción que pueden incorporarse en el vector de captura de
genes 3' incluyen los analizados anteriormente con respecto a los
vectores de dirección.
La cadena principal del vector viral usado como
componente estructural del promotor o vector de captura de genes 3'
puede seleccionarse de entre una amplia variedad de vectores que
pueden insertarse en el genoma de la célula diana. Los vectores de
cadena principal adecuados incluyen, pero sin limitación, vectores
de virus herpes simplex, vectores de adenovirus, vectores de virus
adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, virus
de la pseudorrabia, vectores de virus alfa-herpes y
similares. Puede encontrarse una revisión minuciosa de vectores
virales, en particular, de vectores virales adecuados para modificar
células no replicantes y de cómo usar tales vectores junto con la
expresión de una secuencia polinucleotídica exógena en Viral
Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications, Eds.
Caplitt y Loewy, Academic Press, San Diego, 1995.
Preferiblemente, se usan vectores retrovirales
para captura de genes. Estos vectores pueden usarse junto con
líneas celulares que empaquetan retrovirus, tales como las descritas
en la Patente de Estados Unidos Nº 5.449.614. Cuando se usan
células de mamífero no murinas como células diana para la
modificación genética, pueden usarse líneas celulares
empaquetadoras anfótropicas o pantrópicas para empaquetar vectores
adecuados (Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:
11400-11406, 1996). Se describen vectores
retrovirales representativos que pueden adaptarse para generar los
vectores de captura de genes 3' descritos en la presente invención,
por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.521.076.
Los vectores de captura de genes pueden contener
uno o más de los genes marcadores positivos analizados anteriormente
con respecto a vectores de dirección usados para recombinación
homóloga. De manera similar a su uso en vectores de dirección,
estos marcadores positivos se usan en vectores de captura de genes
para identificar y seleccionar las células que hayan integrado el
vector en el genoma celular. El gen marcador puede generarse por
ingeniería genética para contener un sitio de entrada al ribosoma
independiente (IRES) de modo que el marcador se expresará en su
mayor parte de manera independiente de la localización en la que el
vector se ha integrado dentro del genoma de la célula diana.
Dado que los vectores de captura de genes se
integrarán en el genoma de las células hospedadoras infectadas de
manera bastante aleatoria, debe identificarse una célula modificada
genéticamente que tenga un gen de PFI-013 alterado
entre una población de células que se han sometido a integración
aleatoria del vector. Preferiblemente, las modificaciones genéticas
en la población de células son de suficiente aleatoriedad y
frecuencia como para que la población presente mutaciones en casi
todos los genes que se encuentran en el genoma de las células,
haciendo que sea probable identificar entre la población a una
célula con el gen de PFI-013 alterado (véase
Zambrowicz et al., documento WO 99/50426; Sands et
al., documento WO 98/14614).
Se identifican líneas celulares mutantes
individuales que contienen un gen de PFI-013
alterado en una población de células mutadas usando, por ejemplo,
transcripción inversa y PCR (RT-PCR) para
identificar una mutación en una secuencia del gen de
PFI-013. Puede aumentarse la eficacia de este
proceso haciendo combinaciones de clones. Por ejemplo, para
encontrar un clon individual que contiene un gen de
PFI-013 alterado, se realiza una
RT-PCR usando un cebador que se ancla en el vector
de captura de genes y el otro cebador que se localiza en la
secuencia del gen de PFI-013. Un resultado de
RT-PCR positivo indica que la secuencia del vector
está codificada en el transcrito del gen de
PFI-013, indicando que el gen de
PFI-013 se ha alterado mediante un proceso de
integración de captura de genes (véase, por ejemplo, Sands et
al., documento WO 98/14614).
Puede producirse una interrupción funcional del
gen endógeno PFI-013 en fases específicas del
desarrollo o del ciclo celular (interrupción temporal) o en tipos
celulares específicos (interrupción espacial). La interrupción del
gen de PFI-013 puede ser también inducible cuando
están presentes ciertas condiciones. Puede usarse un sistema de
escisión de recombinasa, tal como un sistema
Cre-Lox, para activar o inactivar el gen de
PFI-013 en una fase específica del desarrollo, en
un tejido o tipo celular particular, o en condiciones ambientales
particulares. Generalmente, los métodos que utilizan tecnología
Cre-Lox se realizan como se describe en Torres y
Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford
University Press, 1997. También puede emplearse una metodología
similar a la descrita para el sistema Cre-Lox
utilizando el sistema FLP-FRT. Se proporcionan
consejos adicionales con respecto al uso de sistemas de escisión de
recombinasa para alterar genes de manera condicional mediante
recombinación homóloga o inserción viral, por ejemplo, en la Patente
de Estados Unidos Nº 5.626.159, la Patente de Estados Unidos Nº
5.527.695, la Patente de Estados Unidos Nº 5.434.066, el documento
WO 98/29533, Orban et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:
6861-65, 1992; O'Gorman et al., Science 251:
1351-55, 1991; Sauer et al., Nucleic Acids
Research 17: 147-61, 1989; Barinaga, Science 265:
26-28, 1994; y Akagi et al, Nucleic Acids
Res. 25: 1766-73, 1997. Puede usarse más de un
sistema recombinasa para modificar genéticamente una célula
animal.
Cuando se usa la recombinación homóloga para
alterar el gen de PFI-013 de manera temporal,
espacial o inducible, usando un sistema de recombinasa tal como el
sistema Cre-Lox, se sustituye una porción de la
región codificante del gen de PFI-013 por una
construcción de dirección que comprende la región codificante del
gen de PFI-013 flanqueada por sitios loxP. Las
células animales que llevan esta modificación genética contienen un
gen de PFI-013 funcional flanqueado por loxP. El
aspecto temporal, espacial o inducible de la interrupción del gen
de PFI-013 está causado por el patrón de expresión
de un transgén adicional, un transgén de recombinasa Cre, que se
expresa en la célula animal bajo el control del promotor regulado
espacialmente, regulado temporalmente o inducible deseado,
respectivamente. Una recombinasa Cre se dirige a sitios loxP para la
recombinación. Por lo tanto, cuando se activa la expresión de Cre,
los sitios LoxP experimentan recombinación para escindir la
secuencia codificante del gen de PFI-013
interpuesto, dando como resultado una alteración funcional del gen
de PFI-013 (Rajewski et al., J. Clin. Invest.
98: 600-03, 1996; St.-Onge et al., Nucleic
Acids Res. 24: 3875-77, 1996; Agah et al.,
J. Clin. Invest. 100: 169-79, 1997; Brocard et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14559-63,
1997; Feil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:
10887-90, 1996; y Kühn et al., Science 269:
1427-29, 1995).
Puede generarse una célula que contenga tanto un
transgen de recombinasa Cre como un gen de PFI-013
flanqueado por loxP por medio de técnicas transgénicas
convencionales. Pueden encontrarse más pautas en relación con el
uso de promotores específicos de sistemas de recombinasa para
alterar temporalmente, espacialmente o condicionalmente el gen de
PFI-013, por ejemplo, en Sauer, Meth. Enz. 225:
890-900, 1993, Gu et al., Science 265:
103-06, 1994, Araki et al., J. Biochem. 122:
977-82, 1997, Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:
6191-96, 1996, y Meyers et al., Nature
Genetics 18: 136-41, 1998.
También puede conseguirse una alteración
inducible del gen de PFI-013 por medio del uso de un
sistema binario de respuesta a tetraciclina (Gossen y Bujard, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51, 1992). Este
sistema implica modificar genéticamente una célula para introducir
un promotor de Tet en el elemento regulador del gen de
PFI-013 endógeno y un transgen que expresa un
represor controlable por tetraciclina (TetR). En esta célula, la
administración de tetraciclina activa el TetR que, a su vez, inhibe
la expresión del gen de PFI-013 y, por lo tanto,
altera funcionalmente el gen de PFI-013 (St.-Onge
et al., Nucleic Acids Res. 24: 3875-77,
1996, Patente de Estados Unidos Nº 5.922.927).
También pueden adoptarse los sistemas descritos
anteriormente para la alteración temporal, espacial e inducible del
gen de PFI-013 cuando se usa captura de genes como
método de modificación genética, por ejemplo, como se describe en
el documento WO 98/29533.
Los métodos descritos anteriormente para
modificación genética pueden usarse para alterar funcionalmente un
gen de PFI-013 en prácticamente cualquier tipo de
célula somática o célula madre derivada de un animal. Las células
animales modificadas genéticamente de la invención incluyen, pero
sin limitación, células de mamífero, incluyendo células humanas, y
células aviares. Estas células pueden proceder de cualquier línea
celular animal modificada por ingeniería genética, tal como líneas
celulares adaptadas a cultivo, tumorigénicas o transformadas, o
pueden aislarse a partir de un mamífero no humano, modificado
genéticamente, que lleva la modificación genética de
PFI-013 deseada.
Las células pueden ser heterocigotas u
homocigotas para el gen de PFI-013 alterado. Para
obtener células que sean homocigotas para la alteración del gen de
PFI-013 (PFI-013-/-), puede
realizarse una dirección directa y secuencial a los dos alelos.
Este proceso puede facilitarse reciclando un marcador selectivo
positivo. De acuerdo con este esquema, la secuencia de nucleótidos
que codifica el marcador selectivo positivo se retira después de la
alteración de un alelo usando el sistema Cre-Lox P.
De esta manera, el mismo vector puede usarse en una vuelta
posterior de dirección para alterar el segundo alelo del gen de
PFI-013 (Abuin y Bradley, Mol. Cell. Biol. 16:
1851-56, 1996; Sedivy et al., T.I.G. 15:
88-90, 1999; Cruz et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 88: 7170-74, 1991; Mortensen et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7036-40,
1991; te Riele et al., Nature (London) 348:
649-651, 1990).
Una estrategia alternativa para obtener células
ES que son PFI-013-/- es la homogenotización de
células procedentes de una población de células que son
heterocigotas para la alteración del gen de PFI-013
(PFI-013+/-). El método usa un esquema en el que se
seleccionan clones dirigidos a PFI-013+/- que
expresan un marcador de resistencia a fármaco frente a una
concentración muy alta de fármaco; favoreciendo esta selección a las
células que expresan dos copias de la secuencia que codifica el
marcador de resistencia a fármaco y, por lo tanto, son homocigotas
para la alteración del gen de PFI-013 (Mortensen
et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2391-95,
1992).
Después de la modificación genética de la célula
o línea celular deseada, el locus del gen de PFI-013
puede confirmarse como sitio de modificación por análisis de PCR de
acuerdo con métodos convencionales de PCR o transferencia de
Southern conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de
Estados Unidos Nº 4.683.202; y Erlich et al., Science 252:
1643, 1991). También puede realizarse otra verificación de la
alteración funcional del gen de PFI-013 si los
niveles de ARN mensajero del gen de PFI-013 (ARNm)
y/o los niveles del polipéptido PFI-013 se reducen
en células que normalmente expresan el gen de
PFI-013. Pueden obtenerse medidas de los niveles de
ARNm del gen de PFI-013 usando reacción en cadena de
la polimerasa mediada por transcriptasa inversa
(RT-PCR), análisis de transferencia de Northern o
hibridación in situ. La cuantificación de los niveles de
polipéptido PFI-013 producido por las células puede
realizarse, por ejemplo, por métodos de inmunoensayo convencionales
conocidos en la técnica. Estos inmunoensayos incluyen, pero sin
limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que
usan técnicas tales como radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de
inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoensayos de tipo
"sandwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de
precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión,
inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcadores
enzimáticos o de radioisótopos, por ejemplo), transferencias de
Western, análisis de gel bidimensional, reacciones de
precipitación, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A
y ensayos de inmunoelectroforesis.
Son células animales modificadas genéticamente
preferidas células madre embrionarias (ES) y células de tipo ES.
Estas células proceden de los blastocistos y embriones previos a la
implantación de diversas especies, tales como ratones (Evans et
al., Nature 129:154-156, 1981; Martin, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 78: 7634-7638, 1981), cerdos
y ovejas (Notanianni et al., J. Reprod. Fert. Suppl., 43:
255-260, 1991; Campbell et al., Nature 380:
64-68,1996) y primates, incluyendo seres humanos
(Thomson et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.843.780,
Thomson et al., Science 282: 1145-1147, 1995;
y Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
7844-7848, 1995).
Estos tipos de células son pluripotentes. Es
decir, en las condiciones apropiadas, se diferencian en una amplia
diversidad de tipos celulares derivados de las tres capas germinales
embrionarias: ectodermo, mesodermo y endodermo. Dependiendo de las
condiciones de cultivo, una muestra de células ES puede cultivarse
indefinidamente como células madre, dejarse diferenciar en una
amplia diversidad de tipos celulares diferentes dentro de una sola
muestra, o dirigirse a la diferenciación en un tipo celular
específico, tal como células de tipo macrófago, células neuronales,
cardiomiocitos, adipocitos, células de músculo liso, células
endoteliales, células de músculo esquelético, queratinocitos y
células hematopoyéticas tales como eosinófilos, mastocitos, células
progenitoras eritroides o megacariocitos. La diferenciación dirigida
se consigue incluyendo factores de crecimiento o componentes de la
matriz específicos en las condiciones de cultivo, como se describe
adicionalmente, por ejemplo, en Keller et al., Curr. Opin.
Cell Biol. 7: 862-69, 1995, Li et al., Curr.
Biol. 8: 971, 1998, Klug et al., J. Clin. Invest. 98:
216-24, 1996, Lieschke et al., Exp. Hematol.
23: 328-34, 1995, Yamane et al., Blood 90:
3516-23, 1997, y Hirashima et al., Blood 93:
1253-63, 1999.
La línea de células madre embrionaria particular
que se usa para la modificación genética no es crítica; las líneas
de células ES murinas ilustrativas incluyen AB-1
(McMahon y Bradley, Cell 62:1073-85, 1990), E14
(Hooper et al., Nature 326: 292-95, 1987),
D3 (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87:
27-45, 1985), CCE (Robertson et al., Nature
323: 445-48, 1986), RW4 (Genome Systems, St. Louis,
MO), y DBA/1lacJ (Roach et al., Exp. Cell Res. 221:
520-25, 1995).
La producción del polipéptido usado en la
presente invención puede realizarse cultivando hospedadores de
expresión eucariotas o procariotas, que se han transformado con uno
o más polinucleótidos que codifican dicho polipéptido, en un medio
de fermentación nutriente convencional. La selección del medio
apropiado puede basarse en la elección de hospedadores de expresión
y/o basarse en los requisitos reguladores de la construcción de
expresión. Estos medios son bien conocidos para los especialistas
en la técnica. Si se desea, el medio puede contener otros
componentes que favorezcan a los hospedadores de expresión
transformados son respecto a otros microorganismos potencialmente
contaminantes.
De esta manera, la presente invención también
describe un método para producir un polipéptido que tenga actividad
de PFI-013, comprendiendo el método las etapas de
(a) transformar una célula hospedadora con una secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o un derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento del mismo; y (b) cultivar la célula
hospedadora transformada en condiciones adecuadas pasa la expresión
de dicho polipéptido.
La presente invención también describe un método
para producir un polipéptido que tiene actividad de
PFI-013, comprendiendo el método las etapas de (a)
cultivar una célula hospedadora que se haya transformado con una
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o un derivado,
homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo en condiciones
adecuadas para la expresión de dicho polipéptido; y (b) recuperar
dicho polipéptido a partir del cultivo de la célula
hospedadora.
La presente invención también describe un método
para producir un polipéptido que tiene actividad de
PFI-013, comprendiendo el método las etapas de (a)
transformar una célula hospedadora con una secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEC ID Nº: 1 o un derivado, homólogo, variante,
análogo o fragmento del mismo; (b) cultivar la célula hospedadora
transformada en condiciones adecuadas para la expresión de dicho
polipéptido; y (c) recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo
de células hospedadoras.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo
de acción de la ribozima implica una hibridación con especificidad
de secuencia de la molécula de ribozima con un ARN diana
complementario, seguido de escisión endonucleolítica. En la
invención se describen moléculas de ribozima de motivo de cabeza de
martillo obtenidas por ingeniería genética que catalizan de manera
específica y eficaz la escisión endonucleolítica de secuencias de
ARN de PFI-013.
Los sitios de escisión de ribozimas específicos
dentro de cualquier diana de ARN posible se identifican inicialmente
por exploración de la molécula diana para buscar sitios de escisión
de ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC.
Una vez identificadas, pueden evaluarse secuencias de ARN cortas de
entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen
diana que contiene el sitio de escisión con respecto a las
características estructurales secundarias que pueden hacer que la
secuencia de nucleótidos sea inoperativa. La idoneidad de dianas
candidatas también puede evaluarse ensayando la accesibilidad a la
hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de
protección frente a ribonucleasa.
Tanto las moléculas de ADN y ARN antisentido
como las ribozimas pueden prepararse por cualquier método conocido
en la técnica para la síntesis de moléculas de ARN. Éstas incluyen
técnicas para sintetizar químicamente oligonucleótidos tales como
síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Como alternativa,
pueden generarse moléculas de ARN por transcripción in vitro
o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de
ARN antisentido. Estas secuencias de ADN pueden incorporarse en una
amplia diversidad de vectores con promotores de ARN polimerasa
adecuados tales como T7 o SP6. Como alternativa, pueden introducirse
construcciones de ADNc antisentido que sintetizan ARN antisentido
de manera constitutiva o inducible en líneas celulares, células o
tejidos.
La presencia de la secuencia codificante del
polinucleótido PFI-013 puede detectarse por
hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN o
amplificación usando sondas, partes o fragmentos de la secuencia
presentada en la SEC ID Nº: 1. Los ensayos basados en la
amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de
oligonucleótidos u oligómeros basados en la secuencia codificante
de PFI-013 para detectar transformantes que
contienen ADN o ARN de PFI-013. Como se usa en este
documento, "oligonucleótidos" u "oligómeros" puede hacer
referencia a una secuencia de ácido nucleico de al menos
aproximadamente 10 nucleótidos y de hasta aproximadamente 60
nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 15 a 30
nucleótidos, y más preferiblemente de aproximadamente 20 a 25
nucleótidos que pueden usarse como sonda o amplímero.
Preferiblemente, los oligonucleótidos proceden de la región 3' de la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1.
En la técnica se conoce una diversidad de
protocolos para detectar y medir la expresión del polipéptido
PFI-013, tal como por medio del uso de anticuerpos
policlonales o monoclonales específicos para la proteína. Los
ejemplos incluyen ensayo en inmunoabsorbente ligado a enzima
(ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células
activada por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo
basado en anticuerpos monoclonales, de dos sitios, que utiliza
anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos que no
interfieren en un polipéptido PFI-013, pero también
puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Éstos y otros
ensayos se describen, entre otros sitios, en Hampton R et
al., (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press,
St Paul, MN, USA) y Maddox DE et al., (1983, J Exp Med 15
8:1211).
Los especialistas en la técnica conocen una
amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden
usarse en diversos ensayos de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Los
medios para producir sondas de hibridación o de PCR marcadas para
detectar secuencias polinucleotídicas de PFI-013
incluyen oligomarcaje, desplazamiento de mella (nick traslation),
marcaje terminal o amplificación por PCR usando un nucleótido
marcado. Como alternativa, la secuencia codificante de
PFI-013, o cualquier parte de la misma, puede
clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm.
Estos vectores se conocen en la técnica, están disponibles en el
mercado y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in
vitro por la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como
T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados.
Varias compañías tales como Amersham Pharmacia
Biotech (Piscataway, NJ, USA), Promega (Madison, WI, USA), y US
Biochemical Corporation (Cleveland, OH, USA) suministran kits
comerciales y protocolos para estos procedimientos. Las moléculas
indicadoras o marcadores adecuados incluyen los radionúclidos,
enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos,
así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y
similares. Las patentes que enseñan el uso de estos marcadores
incluyen los documentos
US-A-3817837;
US-A-3850752;
US-A-3939350;
US-A-3996345;
US-A-4277437;
US-A-4275149 y
US-A-4366241. Además, pueden
producirse inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el
documento US-A-4816567.
Otros métodos para cuantificar la expresión de
una molécula adicional incluyen radiomarcaje (Melby PC et
al., 1993, J. Immunol Methods Vol 159 p235-44) o
biotinilación (Duplaa C et al., 1993, Anal Biochem Vol 229
p36) de nucleótidos, co-amplificación de un ácido
nucleico de control, y curvas patrón en las que se interpolan los
resultados experimentales. La cuantificación de múltiples muestras
puede acelerarse realizando el ensayo en un formato ELISA donde el
oligómero de interés se presenta en diversas diluciones y una
respuesta espectrofotométrica o calorimétrica proporciona una
rápida cuantificación.
Aunque la presencia/ausencia de expresión de un
gen marcador sugiere que el gen de interés también está presente,
su presencia y expresión deben confirmarse. Por ejemplo, si se
inserta la secuencia codificante de PFI-013 dentro
de una secuencia de un gen marcador, las células recombinantes que
contienen las regiones codificantes de PFI-013
pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador.
Como alternativa, un gen marcador puede ponerse en tándem con una
secuencia codificante de PFI-013 bajo el control de
un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a
inducción o selección normalmente también indica expresión de
PFI-013.
Como alternativa, las células hospedadoras que
contienen la secuencia codificante de PFI-013 y
expresan regiones codificantes de PFI-013 pueden
identificarse por medio de una diversidad de procedimientos
conocidos para los especialistas en la técnica. Estos
procedimientos incluyen, pero sin limitación, técnicas de
hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN y
técnicas de bioensayo de proteínas o inmunoensayo que incluyen
tecnologías basadas en la membrana, basadas en solución o basadas
en chip para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o
proteína.
La secuencia de aminoácidos descrita en este
documento también puede usarse para generar anticuerpos - tal como
por medio del uso de técnicas convencionales - contra la secuencia
de aminoácidos.
Pueden usarse procedimientos bien conocidos en
la técnica para la producción de anticuerpos contra polipéptidos
PFI-013. Estos anticuerpos incluyen, pero sin
limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios,
fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de
expresión de Fab. Se prefieren especialmente para realizar
diagnósticos y con fines terapéuticos anticuerpos neutralizadores,
es decir, los que antagonizan la actividad biológica de
polipéptidos PFI-013.
Para la producción de anticuerpos, pueden
inmunizarse diversos hospedadores que incluyen cabras, conejos,
ratas, ratones, etc. por inyección con el polipéptido
PFI-013 o cualquier parte, variante, homólogo,
fragmento, análogo o derivado del mismo u oligopéptido que conserve
propiedades inmunogénicas. Dependiendo de la especie de hospedador,
pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta
inmunológica. Estos adyuvantes incluyen, pero sin limitación,
adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de
aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina,
polioles pluronic, polianions, péptidos, emulsiones de aceite,
hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. BCG (Bacilli
Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum
son adyuvantes humanos potencialmente útiles que pueden
emplearse.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales
contra la secuencia de aminoácidos usando cualquier técnica que
permita la producción de moléculas de anticuerpo por líneas
celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero sin
limitación, la técnica de hibridoma descrita originalmente por
Koehler y Milstein (1975, Nature Vol 256 p495-497),
la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al.,
(1983) Immunol Today Vol 4 p72; Cote et al. (1983)
Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) Vol 80
p2026-2030) y la técnica de hibridoma EBV (Cole
et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan
R Liss Inc, pp. 77-96). Además, pueden usarse
técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos
quiméricos", el empalme de genes de anticuerpo de ratón a genes
de anticuerpo humano para obtener una molécula con una especificidad
de antígeno y actividad biológica apropiadas (Morrison et
al. (1984) Proceedings of the National Academy of Sciences
(USA) Vol 81 p6851-6855; Neuberger et al.
(1984) Nature Vol 312 p604-608; Takeda et
al., (1985) Nature Vol 314 p452-454). Como
alternativa, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción
de anticuerpos monocatenarios (documento
US-A-4946779) para producir
anticuerpos monocatenarios con especificidad de polipéptido.
También pueden producirse anticuerpos por
inducción de la producción in vivo en la población de
linfocitos o sometiendo a selección bibliotecas de inmunoglobulinas
recombinantes o paneles de reactivos de unión muy específicos como
se describe en Orlandi et al. (1989, Proceedings of the
National Academy of Sciences (USA) Vol 86 p
3833-3837), and Winter G and Milstein C (1991;
Nature Vol 349 p293-299).
También pueden generarse fragmentos de
anticuerpo que contienen sitios de unión específicos para
PFI-013. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen,
pero sin limitación, los fragmentos F(ab')_{2} que pueden
producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y
los fragmentos Fab que pueden generarse por reducción de los
enlaces disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. Como
alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab
para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab
monoclonales con la especificidad deseada (Huse WD et al.
(1989) Science Vol 256 p1275-1281).
Una técnica alternativa implica la selección de
bibliotecas de presentación en fagos donde, por ejemplo, el fago
expresa fragmentos scFv en la superficie de su cubierta con una gran
diversidad de regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Esta técnica es bien conocida en este campo.
Los anticuerpos con especificidad por
PFI-013 son útiles para el diagnóstico de afecciones
y enfermedades asociadas con la expresión del receptor
PFI-013. En la técnica se conocen bien diversos
protocolos para la unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos
usando anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades
establecidas. Estos inmunoensayos típicamente implican la formación
de complejos entre el polipéptido PFI-013 y su
anticuerpo específico (o molécula de unión a PFI-013
similar) y la medición de la formación del complejo. Se prefiere un
inmunoensayo basado en anticuerpos monoclonales, de dos sitios, que
utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos no
interferentes en una proteína PFI-013 específica,
pero también puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos
ensayos se describen en Maddox DE et al., (1983, Journal of
Experimental Medicine Vol 158 p1211).
Los anticuerpos
anti-PFI-013 son útiles para el
diagnóstico de trastornos que implican una transducción de señales
anormal u otros trastornos o enfermedades caracterizadas por la
expresión anormal de un receptor PFI-013. Los
ensayos de diagnóstico para PFI-013 incluyen métodos
que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar un
polipéptido PFI-013 en fluidos corporales, células o
tejidos humanos, o secciones o extractos de estos tejidos. Los
polipéptidos y anticuerpos pueden usarse con o sin modificación. A
menudo, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán por medio de su
unión, covalente o no covalente, con una molécula indicadora. Los
especialistas en la técnica conocen una amplia diversidad de
moléculas indicadoras.
Los anticuerpos pueden usarse en un método para
detectar polipéptidos presentes en muestras biológicas por medio de
un método que comprende: (a) proporcionar un anticuerpo de la
invención; (b) incubar una muestra biológica con dicho anticuerpo
en condiciones que permitan la formación de un complejo de
anticuerpo-antígeno; y (c) determinar si se forma
el complejo de anticuerpo-antígeno que comprende
dicho anticuerpo.
También pueden usarse anticuerpos para el
enriquecimiento o aislamiento de eosinófilos a partir de mamíferos,
preferiblemente a partir de sangre humana. En un ejemplo preferido,
los anticuerpos se unen a un soporte sólido, por ejemplo, perlas
magnéticas, se incuban con los leucocitos de sangre periférica, y
después las perlas con eosinófilos unidos se separan de las células
no unidas usando un imán. El especialista en la técnica conocerá
otros métodos similares para usar anticuerpos para el aislamiento de
células específicas a partir de una mezcla de tipos celulares.
Los anticuerpos pueden unirse a un soporte
sólido y/o envasarse en kits en un recipiente adecuado junto con
reactivos adecuados, controles, instrucciones y similares.
La presente invención también describe un método
de ensayo para detectar la presencia de PFI-013 en
células (tales como células humanas) que comprende: (a) realizar
una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
(RT-PCR) sobre ARN (tal como ARN total) procedente
de dichas células usando un par de cebadores de PCR que sean
específicos para PFI-013, como se determina a partir
de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1 o una variación
alélica del mismo; y (b) ensayar la aparición de un fragmento de PCR
del tamaño apropiado - tal como por electroforesis en gel de
agarosa.
Hay numerosos ensayos en los que el polipéptido
descrito en este documento puede usarse para seleccionar moduladores
(por ejemplo, antagonistas o agonistas) del polipéptido. Los
ejemplos de estos ensayos incluyen:
Ensayo Funcional - Un ejemplo de un
método para seleccionar receptores para identificar moduladores de
los mismos es controlar el efecto inhibidor o estimulador sobre la
acumulación de AMPc o adenilato ciclasa. Este ensayo implica la
transfección de una célula de mamífero con el receptor de la
presente invención para la expresión en la superficie celular. La
célula después se expone a un supuesto modulador y se mide la
cantidad de acumulación de AMPc. Si el supuesto modulador se une al
receptor y tiene un efecto funcional, aumentarán o se reducirán los
niveles de actividad adenilato ciclasa o AMPc mediada por
receptor.
Ensayo Funcional usando un lector de Placas
de Imágenes Fluorescentes (FLIPR®) - Una técnica usada para la
selección que incluye el uso de células que expresan un receptor
(por ejemplo, células HEK293 transfectadas) en un sistema que mide
los cambios en el calcio intracelular o los cambios en el pH
extracelular producidos por activación del receptor. En esta
técnica, pueden ponerse en contacto células que expresan el receptor
con compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos, lípidos,
nucleótidos o glicoproteínas) que provocan una respuesta de segundo
mensajero, por ejemplo, transducción de señales, cambio en los
niveles de calcio o cambios en el pH. Estos cambios se usan para
determinar si el compuesto potencial activa o inhibe el
receptor.
Ensayo de Unión de Ligandos - Este tipo
de ensayo puede ensayar la unión de un compuesto candidato, donde
la adherencia a las células que contienen el receptor descrito en
este documento se detecta por medio de un marcador asociado directa
o indirectamente con el compuesto candidato o en un ensayo que
implica competición con un competidor marcado. Los ensayos
convencionales para realizar selecciones que determinan si el
compuesto activa o inhibe el receptor se comprenden bien por los
especialistas en la técnica.
La presente invención se refiere a un método
para identificar agentes (tales como compuestos, otras sustancias o
composiciones que las contienen) que afectan (tales como que
antagonizan, agonizan o modifican de otra manera) la actividad de
PFI-013 y/o su expresión, comprendiendo el método
poner en contacto PFI-013 o la secuencia de
nucleótidos que lo codifica con el agente y después medir la
actividad de PFI-013 y/o su expresión.
La presente invención también se refiere a un
método para identificar agentes (tales como compuestos, otras
sustancias o composiciones que los comprenden) que afectan (tal como
que antagonizan, agonizan o modifican de otra manera) a la
actividad de PFI-013 y/o su expresión, comprendiendo
el método medir la actividad de PFI-013 y/o su
expresión en presencia del agente o después de la adición del agente
en: (a) una línea celular en la que se ha incorporado ADN
recombinante que comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID
Nº: 1 o (b) una población de células o línea celular que expresa de
una forma naturalmente selectiva PFI-013.
Preferiblemente, la actividad de PFI-013 se
determina por los métodos de ensayo descritos anteriormente.
La presente invención también se refiere a un
método para seleccionar un agente para la modulación
(preferiblemente para la modulación específica) de la actividad de
PFI-013 o la expresión de la secuencia de
nucleótidos que lo codifica, comprendiendo el método las etapas de:
(a) proporcionar un agente candidato; (b) combinar
PFI-013 o la secuencia de nucleótidos que lo
codifica con el agente candidato durante un periodo de tiempo
suficiente para permitir la modulación en condiciones adecuadas; y
(c) detectar la modulación del agente candidato con respecto a
PFI-013 o la secuencia de nucleótidos que lo
codifica para averiguar si el agente candidato modula la actividad
de PFI-013 o la expresión de la secuencia de
nucleótidos que lo codifica.
La presente invención también se refiere a un
método para seleccionar un agente con respecto a la actividad de
unión específica con PFI-013 o la secuencia de
nucleótidos que lo codifica, comprendiendo el método las etapas de:
(a) proporcionar un agente candidato; (b) combinar
PFI-013 o la secuencia de nucleótidos que lo
codifica con el agente candidato durante un periodo de tiempo
suficiente para permitir la unión en condiciones adecuadas; y (c)
detectar la unión del agente candidato a PFI-013 o
la secuencia de nucleótidos que lo codifica para averiguar si el
agente candidato se une a PFI-013 o a la secuencia
de nucleótidos que lo codifica.
De esta manera, en ciertas realizaciones de la
presente invención, PFI-013 y/o una línea celular
que expresa PFI-013 puede usarse para seleccionar
anticuerpos, péptidos u otros agentes, tales como moléculas
orgánicas o inorgánicas, que actúan como moduladores (por ejemplo,
antagonistas o agonistas) de la actividad de PFI-013
o para su expresión, identificando de esta manera un agente
terapéutico capaz de modular el receptor. Como alternativa, la
selección de bibliotecas de péptidos o bibliotecas orgánicas
obtenidas por química combinatoria con PFI-013
expresado de manera recombinante o líneas celulares que expresan
PFI-013 puede ser útil para la identificación de
agentes terapéuticos que funcionan por medio de la modulación del
receptor. Pueden seleccionarse compuestos sintéticos, productos
naturales y otras fuentes de materiales con posible actividad
biológica de varias formas que se consideran rutinarias para los
especialistas en la técnica. Por ejemplo, pueden expresarse
secuencias de nucleótidos que codifican la región
N-terminal de PFI-013 en una línea
celular, que puede usarse para la selección de moduladores
alostéricos, agonistas o antagonistas, de la actividad de
PFI-013.
Un polipéptido PFI-013, sus
fragmentos inmunogénicos u oligopéptidos del mismo, pueden usarse
para seleccionar compuestos terapéuticos en cualquiera de una
diversidad de técnicas de selección de fármacos. El polipéptido
empleado en este ensayo puede estar libre en solución, fijado a un
soporte sólido, llevado en la superficie de una célula o localizado
intracelularmente. Puede medirse la formación de complejos de unión
entre un polipéptido PFI-013 y el agente a
ensayar.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un método para seleccionar uno o una pluralidad de
compuestos con respecto a la modulación (preferiblemente la
modulación específica, tal como la afinidad de unión específica) de
PFI-013 o su expresión, que comprende proporcionar
uno o una pluralidad de compuestos; combinar un
PFI-013 o una secuencia de nucleótidos que lo
codifica con el o cada compuesto de la pluralidad de compuestos
durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la modulación
en condiciones adecuadas; y detectar la unión de un
PFI-013, a cada uno de la pluralidad de compuestos,
identificando de esta manera el compuesto o compuestos que modulan
un PFI-013 o una secuencia de nucleótidos que lo
codifica. En este ensayo, la pluralidad de compuestos puede
producirse por técnicas de química combinatoria conocidas para los
especialistas en la técnica.
Otra técnica para la selección de fármacos
proporciona una selección de alto rendimiento (HTS) de compuestos
que tienen una afinidad de unión adecuada por los polipéptidos
PFI-013 y se basa en el método descrito con detalle
en Geysen, documento WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de
1984. En resumen, se sintetizan grandes números de compuestos de
ensayo peptídicos pequeños diferentes en un sustrato sólido, tal
como pasadores de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos
de ensayo peptídicos se hacen reaccionar con fragmentos de
PFI-013 y se lavan. Después se detecta
PFI-013 unido - tal como por medio de métodos
adaptados de manera apropiada bien conocidos en la técnica. Un
PFI-013 purificado también puede aplicarse
directamente sobre placas como un recubrimiento para uso en las
técnicas de selección de fármacos mencionadas anteriormente. Como
alternativa, pueden usarse anticuerpos no neutralizadores para
capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.
Esta invención describe el uso de ensayos
competitivos de selección de fármacos en los que anticuerpos
neutralizadores capaces de unirse a un polipéptido
PFI-013 compiten específicamente con un compuesto de
ensayo por la unión a un PFI-013. De esta manera,
los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de
cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos
con un PFI-013.
El método de ensayo descrito en la presente
invención puede ser una selección de alto rendimiento (HTS). A este
respecto, las enseñanzas del documento WO 84/03564 pueden adaptarse
al PFI-013 de la presente invención.
Las enseñanzas del documento
US-A-5738985 también pueden
adaptarse al método de ensayo.
La presente invención se refiere al uso de un
agente para que afecte a la actividad de PFI-013
(tal como para que antagonice, module o agonice su actividad de
GPCR).
La presente invención también describe una
composición de diagnóstico para la detección de secuencias
polinucleotídicas de PFI-013. La composición de
diagnóstico puede comprender la secuencia mostrada en la SEC ID Nº:
1 o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del
mismo, o una secuencia capaz de hibridar con todo o parte de la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o una variación
alélica del mismo.
Para proporcionar una base para el diagnóstico
de una enfermedad, deben establecerse valores normales o estándar a
partir de la expresión de un polipéptido PFI-013.
Esto se consigue combinando fluidos corporales o extractos
celulares obtenidos a partir de sujetos normales, animales o seres
humanos, con un anticuerpo contra el polipéptido
PFI-013 en condiciones adecuadas para la formación
de complejos que son bien conocidas en la técnica. La cantidad de
formación de complejo convencional puede cuantificarse por medio de
su comparación con una serie de dilución de controles positivos
donde una cantidad conocida de anticuerpo se combina con
concentraciones conocidas de un polipéptido PFI-013
purificado. Entonces, los valores convencionales obtenidos a partir
de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos a
partir de muestras de sujetos que podrían estar afectados por un
trastorno o enfermedad relacionada con la expresión del polipéptido
PFI-013. La desviación entre los valores patrón y
del sujeto establece la presencia del estado patológico.
Un polinucleótido PFI-013, o
cualquier parte del mismo, puede proporcionar la base para un
compuesto de diagnóstico y/o terapéutico. Para fines de
diagnóstico, pueden usarse secuencias polinucleotídicas de
PFI-013 para detectar y cuantificar la expresión de
genes en afecciones, trastornos o enfermedades en las que puede
estar implicada la actividad de PFI-013.
La secuencia polinucleotídica que codifica
PFI-013 puede usarse para el diagnóstico de
enfermedades producidas por la expresión de
PFI-013. Por ejemplo, pueden usarse secuencias
polinucleotídicas que codifican PFI-013 en ensayos
de hibridación o de PCR de tejidos de biopsias o autopsias o fluidos
biológicos, tales como suero, líquido sinovial o biopsias de
tumores, para detectar anomalías en la expresión de
PFI-013. La forma de estos métodos cualitativos o
cuantitativos puede incluir análisis de Southern o de Northern, dot
blot u otras tecnologías basadas en membranas; tecnologías de PCR;
tecnología de tiras reactivas, pasadores o chips; y tecnologías
ELISA u otras tecnologías en formato de múltiples muestras. Todos
estos métodos son bien conocidos en la técnica y, de hecho, son la
base de muchos kits de diagnóstico disponibles en el mercado.
Estos ensayos pueden adaptarse para evaluar la
eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular y
pueden usarse en estudios animales, en ensayos clínicos o para
monitorizar el tratamiento de un paciente individual. Para
proporcionar una base para el diagnóstico de una enfermedad, debe
establecerse un perfil normal o estándar para la expresión de
PFI-013. Esto se consigue combinando fluidos
corporales o extractos celulares obtenidos a partir de sujetos
normales, animales o humanos, con PFI-013 o una
parte del mismo, en condiciones adecuadas para la hibridación o
amplificación. La hibridación convencional puede cuantificarse
comparando los valores obtenidos para los sujetos normales con una
serie de dilución de controles positivos realizados en el mismo
experimento donde se usa una cantidad conocida de
PFI-013 purificado. Los valores patrón obtenidos a
partir de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos
a partir de muestras de sujetos potencialmente afectados por un
trastorno o enfermedad relacionado con la expresión de la secuencia
codificante de PFI-013. La desviación entre los
valores patrón y del sujeto establece la presencia del estado
patológico. Si la enfermedad se establece, se administra un agente
terapéutico existente y pueden generarse valores o un perfil de
tratamiento. Finalmente, el ensayo puede repetirse en una base
regular para evaluar si los valores progresan o vuelven al patrón
normal o estándar. Pueden usarse perfiles de tratamiento sucesivos
para demostrar la eficacia del tratamiento durante un periodo de
varios días o varios
meses.
meses.
De esta manera, la presente invención describe
el uso de un polipéptido PFI-013, o variante,
homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, para producir
anticuerpos anti-PFI-013 que puedan
usarse, por ejemplo, como diagnóstico para detectar y cuantificar
los niveles de PFI-013 en estados patológicos.
La presente invención describe además ensayos de
diagnóstico y kits para la detección de PFI-013 en
células y tejidos que comprenden un PFI-013
purificado que puede usarse como control positivo, y anticuerpos
anti-PFI-013. Estos anticuerpos
pueden usarse en tecnologías basadas en solución, basadas en
membrana o basadas en tejidos para detectar cualquier estado
patológico o afección relacionada con la expresión de la proteína
PFI-013 o la expresión de deleciones o una
variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo.
Como alternativa, la presente invención describe
un proceso para diagnosticar en un paciente una enfermedad o una
susceptibilidad a una enfermedad relacionada con una
infra-expresión de PFI-013 que
comprende: determinar una mutación en la secuencia de ácido
nucleico que codifica PFI-013, o la cantidad del
PFI-013 en una muestra procedente de un paciente.
También se proporciona un proceso de diagnóstico que comprende
analizar en una muestra derivada de un hospedador la presencia de
PFI-013.
Otro aspecto descrito en este documento es la
disposición de sondas de hibridación de ácido nucleico o de PCR que
sean capaces de detectar secuencias polinucleotídicas, incluyendo
secuencias genómicas, que codifican la región codificante de
PFI-013 o moléculas relacionadas estrechamente,
tales como alelos. La especificidad de la sonda, es decir, si
procede de un dominio o región muy conservada, conservada o no
conservada, y la rigurosidad de la hibridación o amplificación
(alta, intermedia o baja) determinarán si la sonda identifica sólo
la secuencia codificante de PFI-013 natural, o
secuencias relacionadas. Las sondas para la detección de secuencias
de ácido nucleico relacionadas se seleccionan entre regiones de
nucleótidos conservadas o muy conservadas de polinucleótidos de
PFI-013, tales como la región 3', y estas sondas
pueden usarse en un grupo de sondas degeneradas. Para la detección
de secuencias de ácido nucleico idénticas, o cuando se desea una
especificidad máxima, las sondas de ácido nucleico se seleccionan
entre regiones de nucleótidos no conservadas o regiones únicas de
polinucleótidos de PFI-013. Como se usa en este
documento, la expresión "región de nucleótidos no conservada"
se refiere a una región de nucleótidos que es única para la
secuencia codificante de PFI-013 descrita en este
documento y no existe en secuencias relacionadas.
La PCR, como se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188 proporciona usos
adicionales para oligonucleótidos basados en la secuencia de
PFI-013. Estos oligómeros generalmente se obtienen
por síntesis química, pero también pueden generarse enzimáticamente
o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros
generalmente comprenden dos secuencias de nucleótidos, una con
orientación con sentido (5'\rightarrow3') y la otra con
orientación antisentido (3'\leftarrow5') empleadas en condiciones
optimizadas para la identificación de un gen o estado específico.
Los mismos dos oligómeros, series anidadas de oligómeros, o incluso
un grupo degenerado de oligómeros pueden emplearse en condiciones
menos rigurosas para la detección y/o cuantificación de secuencias
de ADN o ARN muy relacionadas.
La secuencia de ácido nucleico para
PFI-013 también puede usarse para generar sondas de
hibridación como se ha descrito previamente, para localizar en el
mapa genómico la secuencia genómica endógena. La secuencia puede
localizarse en un cromosoma particular o en una región específica
del cromosoma usando técnicas bien conocidas. Éstas incluyen
hibridación in situ en extensiones de cromosomas (Verma et
al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques,
Pergamon Press, New York City, USA), preparaciones cromosómicas de
citometría de flujo, o construcciones cromosómicas artificiales
tales como cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas
artificiales de bacterias (BAC), construcciones de PI de bacterias o
bibliotecas de ADN de un solo cromosoma.
En la extensión de mapas genéticos es
inestimable la hibridación in situ de preparaciones
cromosómicas y técnicas de mapeo físicas tales como análisis de
asociaciones usando marcadores cromosómicos establecidos. Pueden
encontrarse ejemplos de mapas genéticos en Science (1995; 270:410f y
1994; 265:1981f). A menudo, la colocación de un gen en el cromosoma
de otra especie de mamífero puede revelar marcadores asociados
incluso si no se conoce el número o brazo de un cromosoma humano
particular. Pueden asignarse nuevas secuencias a brazos
cromosómicos, o partes de los mismos, por mapeo físico. Esto
proporciona una información valiosa a los investigadores que buscan
genes de enfermedades usando clonación posicional u otras técnicas
de descubrimiento de genes. Una vez que se ha localizado
aproximadamente una enfermedad o síndrome, tal como ataxia
telangiectasia (AT), por medio de asociación genética con una
región genómica particular, por ejemplo, AT con
1lq22-23 (Gatti et al (1988) Nature
336:577-580), cualquier secuencia que se localice en
ese área por medio de mapeo puede representar genes reguladores o
asociados para una investigación adicional. La secuencia de
nucleótidos de la presente invención también puede usarse para
detectar diferencias en la localización cromosómica debido a
translocación, inversión, etc. entre individuos normales, portadores
o afectados.
En este documento se describe una composición
farmacéutica para tratar a un individuo que lo necesita debido a la
actividad de PFI-013, comprendiendo la composición
una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que modula (tal
como que antagoniza o agoniza) dicha actividad y un vehículo,
diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
De esta manera, la presente invención también
describe composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes de
la presente invención (un agente capaz de modular el patrón de
expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención o
la actividad de su producto de expresión y/o un agente identificado
por un ensayo de acuerdo con la presente invención). A este
respecto, y en particular para terapia humana, aunque los agentes
puedan administrarse solos, generalmente se administrarán mezclados
con un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéutico
seleccionado con respecto a la vía de administración deseada y la
práctica farmacéutica convencional.
A modo de ejemplo, en las composiciones
farmacéuticas, los agentes pueden administrarse con cualquier
aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de
recubrimiento o agente solubilizante adecuado.
En general, es probable que una dosis
intravenosa u oral terapéuticamente eficaz de los agentes varíe de
0,01 a 50 mg/kg de peso corporal del sujeto a tratar,
preferiblemente de 0,1 a 20 mg/kg. El agente también puede
administrarse por infusión intravenosa, a una dosis que
probablemente variará de 0,001 a 10 mg/kg/h.
De esta manera, la presente invención también
describe un método para el tratamiento de un individuo que lo
necesita debido a la actividad de PFI-013, que
comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de una
composición farmacéutica.
Típicamente, el médico determinará la dosis real
más adecuada para un paciente individual, y ésta variará con la
edad, peso, sexo y respuesta del paciente particular. Las dosis
anteriores son ejemplos del caso típico. Por supuesto, puede haber
casos individuales en los que se requieran intervalos de
dosificación mayores o menores.
Cuando sea apropiado, las composiciones
farmacéuticas pueden administrarse por inhalación, en forma de un
supositorio o pesario, tópicamente en forma de una loción, solución,
crema, pomada o polvo fino, por medio del uso de un parche cutáneo,
por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales
como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos solos o en mezcla
con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones
que contienen agentes aromatizantes o colorantes, o pueden
inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intracavernosa,
intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración
parenteral, las composiciones pueden usarse de la mejor manera en
forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras
sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para hacer
que la solución sea isotónica con la sangre. Para la administración
bucal o sublingual, loas composiciones pueden administrarse en forma
de comprimidos o grageas que pueden formularse de una manera
convencional.
Para administración oral, parenteral, bucal y
sublingual a los sujetos (tales como pacientes), el nivel de
dosificación diario de los agentes de la presente invención
típicamente puede ser de 10 a 500 mg (en una sola dosis o en dosis
divididas). De esta manera, y a modo de ejemplo, los comprimidos o
cápsulas pueden contener de 5 a 100 mg de agente activo para la
administración individual, o pueden administrarse dos o más
comprimidos de una vez, cuando sea apropiado. También es posible
administrar los agentes en formulaciones de liberación
sostenida.
En algunas aplicaciones, generalmente en seres
humanos, la vía preferida es la administración oral de los agentes,
siendo la más conveniente y en algunos casos pudiendo evitar
inconvenientes asociados con otras vías de administración - tales
como los asociados con la administración intracavernosa (i.c.). En
circunstancias en las que el destinatario padece un trastorno de
deglución o tiene alterada la absorción del fármaco después de la
administración oral, el fármaco puede administrarse por vía
parenteral, sublingual o bucal.
Para uso veterinario, un agente típicamente se
administra como una formulación convenientemente aceptable de
acuerdo con la práctica veterinaria normal y el cirujano veterinario
determinará el régimen de dosificación y la vía de administración
que serán más apropiados para un animal particular. Sin embargo,
como ocurre con los tratamientos humanos, es posible administrar el
agente solo para tratamientos veterinarios.
Típicamente, las composiciones farmacéuticas -
que pueden ser para uso humano o animal - comprenderán uno
cualquiera o más de un diluyente, vehículo, excipiente o adyuvante
farmacéuticamente aceptable. El vehículo, excipiente, adyuvante o
diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de
administración deseada y la práctica farmacéutica convencional.
Como se ha indicado anteriormente, las composiciones farmacéuticas
pueden comprender como - o además de - el vehículo, excipiente,
adyuvante o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de
suspensión, agente de recubrimiento o agente de solubilización
adecuado.
En algunos ejemplos descritos en este documento,
las composiciones farmacéuticas comprenderán uno o más de: un
agente que se ha seleccionado por medio de un ensayo de la presente
invención; y un agente que es capaz de interaccionar con la SEC ID
Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2.
En la invención también se describen secuencias
oligonucleotídicas, moléculas de ARN y ADN antisentido y ribozimas,
que funcionan para desestabilizar el ARNm de PFI-013
o inhibir la traducción de PFI-013.
Una molécula antisentido de
PFI-013 puede proporcionar la base para el
tratamiento de diversas situaciones anómalas relacionadas con, por
ejemplo, un aumento de la actividad de PFI-013.
Pueden usarse vectores de expresión derivados de
retrovirus, adenovirus, virus herpes o vaccinia o de diversos
plásmidos bacterianos, para la administración de moléculas
recombinantes con sentido o antisentido de PFI-013
en la población celular diana. Pueden usarse métodos bien conocidos
por los especialistas en la técnica para generar vectores
recombinantes que contienen PFI-013. Como
alternativa, puede administrarse PFI-013
recombinante a las células diana en liposomas.
La secuencia de ADNc de longitud completa y/o
sus elementos reguladores permiten a los investigadores usar
PFI-013 como herramienta en las investigaciones de
la función génica con sentido (Youssoufian H y HF Lodish (1993) Mol
Cell Biol 13: 98-104) o antisentido (Eguchi et
al (1991) Annu Rev Biochem 60: 631-652). Pueden
usarse oligonucleótidos, diseñados a partir del ADNc o de secuencias
de control obtenidas a partir de ADN genómico, in vitro o
in vivo para inhibir la expresión. Esta tecnología se conoce
bien en la técnica, y pueden diseñarse oligonucleótidos con sentido
o antisentido o fragmentos más largos a partir de diversas
localizaciones a lo largo de las regiones codificantes o de control.
Pueden usarse oligonucleótidos apropiados, que pueden tener una
longitud de 20 nucleótidos, para aislar secuencias de
PFI-013 o moléculas estrechamente relacionadas a
partir de bibliotecas humanas.
Además, puede modularse la expresión de
PFI-013 transfectando una célula o tejido con
vectores que expresen altos niveles de un fragmento de
PFI-013 en condiciones en las que sería preferible
bloquear la actividad de PFI-013. Tales
construcciones pueden inundar las células con secuencias con sentido
o antisentido no traducibles. Incluso en ausencia de integración en
el ADN, tales vectores pueden continuar transcribiendo moléculas de
ARN hasta que las endonucleasas endógenas inutilicen todas las
copias del vector. Esta expresión transitoria puede durar un mes o
más con un vector no replicante e incluso más tiempo si los
elementos de replicación apropiados forman parte del sistema del
vector.
Pueden obtenerse modificaciones de la expresión
génica diseñando secuencias antisentido para las regiones de
control del gen de PFI-013, tales como los
promotores, potenciadores e intrones.
Se prefieren oligonucleótidos procedentes del
sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, entre las
regiones -10 y +10 de la secuencia líder. Pueden también diseñarse
moléculas de ARN y ADN antisentido para cloquear la traducción de
ARNm, evitando que el transcrito se una a ribosomas. De manera
similar, puede conseguirse la inhibición usando metodología de
emparejamiento de bases de Hogeboom, también conocida como
emparejamiento de bases en "triple hélice". El emparejamiento
en triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice para
abrirse lo suficiente para permitir la unión de polimerasas,
factores de transcripción o moléculas reguladoras.
Por lo tanto, la invención describe una
composición farmacéutica que comprende un agente identificado
mediante el método de la presente invención (o incluso una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo) junto con un diluyente,
adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente
aceptable.
aceptable.
La composición farmacéutica puede ser para uso
veterinario (es decir, en animales) o para uso en seres humanos.
Por lo tanto, la presente invención también
describe composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades
eficaces de moduladores (por ejemplo, antagonistas o agonistas) de
la proteína PFI-013 (incluyendo secuencias de ácido
nucleico antisentido) mezcladas con un diluyente, vehículo,
excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable (incluyendo
combinaciones de los mismos).
La presente invención describe composiciones
farmacéuticas que pueden comprender la totalidad o porciones de las
secuencias polinucleotídicas de PFI-013, moléculas
antisentido de PFI-013, polipéptidos
PFI-013, moduladores proteicos, peptídicos u
orgánicos de la bioactividad de PFI-013, tales como
antagonistas (incluyendo anticuerpos) o agonistas, solos o en
combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto
estabilizante, y pueden administrarse en un vehículo biocompatible
estéril farmacéuticamente aceptable incluyendo, pero sin limitación,
solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua.
Aunque, en general, las técnicas mencionadas en
este documento son bien conocidas en la técnica, puede hacerse
referencia en particular a Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Short
Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed, John Wiley & Sons,
Inc. La técnica de PCR se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188.
La siguiente muestra se depositó de acuerdo con
el Tratado de Budapest en el depositario reconocido de la
Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas (NCIMB) en 23
St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY, Reino Unido, el 23
de agosto de 2000:
NCIMB número NCIMB 41073 es Escherichia
coli Pfi-013.
El depositante fue Pfizer Central Research,
Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Reino
Unido.
Un especialista en la técnica podría desarrollar
fácilmente el clon de E. coli mencionado anteriormente
(NCIMB 41073) en caldo de Luria que contenga ampicilina, y aislar el
ADN plasmídico del clon usando el método de lisis alcalina como se
describe en Sambrook, et al., eds. (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva
York, NY, Estados Unidos. Después, puede utilizarse el método de
terminación di-desoxi como se describe en Sanger
et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
(Estados Unidos) (Dic. 1977), 74 (12): 5463-5467) y
modificado por Applied Biosystems (véase la bibliografía del
fabricante de Applied Biosystems) para detección fluorescente para
secuenciar el ADN e identificar PFI-013.
La presente invención emplea secuencias
expresables de ese depósito y realizaciones que las comprenden. La
presente invención también emplea proteínas que comprenden
secuencias expresables de ese depósito y realizaciones que las
comprenden.
La presente invención se describirá ahora, sólo
a modo de ejemplo, con referencia a las Figuras y Listado de
Secuencias que la acompañan, en las que:
La Figura 1 muestra un esquema del análisis
bioinformático de PFI-013 (db = base de datos).
La Figura 2 muestra un alineamiento de ClustalW
de PFI-013 con el receptor de histamina humana H3
(una línea vertical (|) entre restos aminoacídicos denota
identidad; una marca de dos puntos (:) entre restos aminoacídicos
denota una sustitución conservativa).
La Figura 3 muestra, en forma de diagrama, las
estructuras genómicas del gen de PFI-013 y del gen
del receptor de histamina humana H3 ("bloques regtangulares" =
exones; \lambda = intrones; los números inmediatamente debajo de
los "bloques rectangulares" indican(1) restos
aminoacídicos, para el diagrama de H3 humano y (2) pares de bases
dentro del cóntigo, para el diagrama de
PFI-013).
La Figura 4 muestra una transferencia de
Northern, que indica la distribución tisular del ARNm de
PFI-013.
La Figura 5 muestra los resultados de análisis
de PCR cuantitativo de ARNm de diversos tejidos mediante Taqman®
(Leucocitos P.B. = leucocitos de sangre periférica; Intestino Delg.
= intestino delgado; Músculo Esquel. = músculo esquelético).
La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo
de unión de ligando de filtro - expresados como la diferencia en la
radiactividad de ^{3}H-histamina unida a las
membranas de células transfectadas con PFI-013 y de
transfección simulada (CPM = recuentos por minuto de radiactividad;
[Ligando] = concentración de ^{3}H-histaminaen
nM).
La Figura 7 muestra la activación de células HEK
que expresan PFI-013 por histamina en un ensayo
funcional basado en fluorescencia (FLIPR®). La Figura 7A muestra un
ensayo basado en células, que indica el efecto de histamina sobre
células HEK293 (que expresan G\alpha15) transfectadas con una
construcción de expresión de PFI-013. La Figura 7B
muestra el mismo ensayo basado en células, pero indicando el efecto
de histamina sobre células HEK293 (que expresan G\alpha15)
transfectadas sólo con vector. Un pico en un cuadrado indica un
incremento transitorio en la concentración de calcio intracelular en
el pocillo correspondiente y, por lo tanto, indica una respuesta
funcional por las células resultante del tratamiento respectivo.
La Figura 8 muestra la activación de células
HEK293 que expresan PFI-013 mediante diversos
agonistas de histamina (ligandos histaminérgicos) en un ensayo
funcional basado en fluorescencia (FLIPR®). La Figura 8A muestra un
ensayo basado en células, que indica el efecto de agonistas de
histamina sobre células HEK293 (que expresan G\alpha15)
transfectadas con una construcción de expresión de
PFI-013. La Figura 8B muestra el mismo ensayo
basado en células, pero que indica el efecto de agonistas de
histamina sobre células HEK293 (que expresan G\alpha15)
transfectadas sólo con vector. Un pico en un cuadrado indica un
incremento transitorio en la concentración de calcio intracelular
en el pocillo correspondiente y, por lo tanto, indica una respuesta
funcional por las células resultante del tratamiento
respectivo.
La Figura 9 muestra los resultados de ensayos de
quimiotaxis de eosinófilos humanos con diversos agonistas
selectivos de subtipo de receptor de histamina.
La Figura 10 muestra los efectos de diversos
antagonistas selectivos de subtipo de receptor de histamina sobre
la quimiotaxis de eosinófilos humanos inducida por histamina. La
Figura 10A muestra la quimiotaxis de eosinófilos inducida por
histamina y el efecto potenciador del pretratamiento de los
eosinófilos con interleucina-5
(IL-5). La Figura 10B muestra la inhibición de la
quimiotaxis inducida por histamina por diversos antagonistas de
histamina (CPD = compuesto). La Figura 10C muestra una curva de
respuesta a la dosis de dos antagonistas de histamina sobre la
quimiotaxis de eosinófilos inducida por histamina.
La SEC ID Nº: 1 muestra la secuencia de
nucleótidos que codifica PFI-013. Se indica el codón
de inicio de la traducción ATG mediante las tres primeras letras.
Se indica el codón de terminación mediante las tres últimas
letras.
La SEC ID Nº: 2 muestra la secuencia de
aminoácidos correspondiente que codifica
PFI-013.
Las SEC ID Nº: 3-10 muestran los
cebadores de PCR usados en los Ejemplos.
Se clonó el polinucleótido que codifica el GPCR
descrito en este documento y se analizaron las secuencias de ADN y
de aminoácidos usando diversas herramientas bioinformáticas. El GPCR
codificado por las secuencias descritas en este documento se ha
denominado PFI-013.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
PFI-013 se identificó por
primera vez en una base de datos de etiquetas de secuencias
expresadas (EST) con secuencias obtenidas de una biblioteca de ADNc
de eosinófilos estimulados con IL-5, pero sólo como
una secuencia parcial. La búsqueda en las bases de datos genómicas
públicas condujo a la identificación de la secuencia de longitud
completa de PFI-013 y a la determinación de su
homología con los receptores de histamina H3 usando, entre otros,
el algoritmo BLAST.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
A fin de confirmar que PFI-013
era un miembro de la familia de GPCR, se realizaron varias
estrategias bioinformáticas (véase la Figura 1).
Se hizo una búsqueda de PFI-013
contra Swissprot usando el algoritmo de BLAST (Herramienta de
Búsqueda de Alineamiento Local Básico (Altschul SF (1993) J.Mol.
Evol. 36: 290-300; Altschul, SF et al. (1990)
J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul, SF et
al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402))
para identificar la coincidencia proteica más cercana. En este
caso, la mayor coincidencia fue con:
AF140538-01 PRI AAD38151.1 ARNm
del receptor de histamina H3 de Homo sapiens, secuencia
codificante completa (CDS).
Estos resultados indican que
PFI-013 es un miembro de la familia de GPCR.
Estos resultados se muestran en la Figura 2.
Los genes para los receptores de
PFI-013 y de histamina H3 humana tienen una
estructura muy similar, como se demuestra en la Figura 3. La Figura
3 también muestra la parte de secuencia originalmente identificada
como la EST en la biblioteca de ADNc de eosinófilos.
Se hizo una búsqueda de PFI-013
contra una base de datos de GPCR humano no redundante que comprendía
principalmente secuencias de las bases de datos de Patentes Genbank
y Geneseq a fin de identificar la clase de agonista para este
receptor. Las diez mejores coincidencias se muestran a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran que
PFI-013 es más similar a los receptores de
histamina, y sugieren que PFI-013 codifica un nuevo
GPCR cuyo ligando parece ser una amina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se extrajo el ARN total de 1 x 10^{8} células
AML14.3D10, obtenidas del Dr. C.C. Paul, VA Medical Center, Dayton,
Ohio, Estados Unidos (Baumann, M.A. & Paul, C. C. (1998) Stem
Cells 16: 16-24), usando el kit Qiagen RNeasy Maxi
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Posteriormente,
el ARNm se aisló del ARN total mencionado anteriormente usando un
kit de purificación de ARNm oligotex de Qiagen, de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. Se transcribió de manera inversa 1
\mug de ARNm de AML14.3D10 a ADNc usando Display
Thermo-RT® (Display Systems Biotech) de acuerdo con
el protocolo suministrado y utilizando un cebador específico del
gen de PFI-013,
PFI-013-rt (SEC ID Nº: 5). Se
emplearon cebadores específicos de PFI-013
(PFI-013 directo y PFI-013 inverso;
SEC ID Nº: 3 y 4, respectivamente) en una PCR para amplificar la
región codificante del ADNc de AML14.3D10, en la que las
condiciones eran las siguientes:
Cebador Directo (= PFI-013
directo):
| 5'- ACCA5TGCCAGATACTAATAGCACAATC-3' | (SEC ID Nº: 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador Inverso (= PFI-013
inverso):
| 5'- TTAAGAAGATACTGACCGACTGTG-3' | (SEC ID Nº: 4) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador de Transcripción Inversa:
| 5'-GGGCAAGATAAAGGGCAGACCAGAT-3' | (SEC ID Nº: 5) |
\vskip1.000000\baselineskip
- (1)
- 94ºC 1 min
- (2)
- 60ºC 1,5 mins
- (3)
- 68ºC 3 mins
Las etapas (1) a (3) se repitieron durante 34
ciclos más.
- (4)
- 68ºC 10 mins
- (5)
- 4ºC en remojo.
El producto de la PCR PFI-013 se
extrajo en gel usando el kit de extracción de gel QIAgen, de acuerdo
con las instrucciones de los fabricantes. El producto resultante se
sometió a clonación TA (metodología de clonación Invitrogen TA) en
el vector pcDNA3.1/V5-His-TOPO
(Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Posteriormente se verificó la secuencia del inserto resultante en
las dos cadenas usando la metodología de secuenciación de ADN ABI
de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ejemplo
4
Se amplificó por PCR un fragmento de 261 pb
hacia el extremo 3' del gen de PFI-013 usando los
siguientes cebadores:
\newpage
| PFI-013F: | 5'-TCCTTCTCCCAATCAGATTCTGTAGC-3' | (SEC ID Nº: 6) | |
| PFI-013B: | 5' -GTATCCATTGTGTCACAAGCGC-3' | (SEC ID Nº: 7) |
- (1)
- 94ºC 1 min
- (2)
- 68ºC 1,5 mins
Las etapas (1) y (2) se repitieron durante 29
ciclos más.
- (3)
- 68ºC 10 mins
- (4)
- 4ºC en remojo.
La reacción de PCR se sometió a electroforesis a
través de un gel de agarosa al 0,8% procesado en tampón TAE x1
(tampón Tris-Acetato-EDTA, pH 8,3;
Sigma). La banda resultante se escindió del gel usando un kit de
extracción de gel Qiaquick® (Qiagen) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante, en un volumen de 50 \mul de
Tris-Cl 10 mM pH 8,0. 5 \mul del producto de PCR
purificado se marcaron con ^{32}P-dCTP usando el
kit de cebado aleatorio de Amersham (Amersham Pharmacia Biotech),
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y posteriormente
se purificó usando una columna Chromaspin Spin +
TE-30 (Clontech).
Se prehibridaron transferencias de Northern de
múltiples tejidos humano & humano II (MTN - Clontech) a 68ºC
durante 1 h con 25 ml de solución Express Hyb (Clontech). La sonda
de PFI-013 se añadió a 25 ml más de solución
Express Hyb precalentada (68ºC). La solución de prehibridación se
decantó de las membranas y la solución de hibridación se añadió a
las membranas. Las membranas se incubaron a 68ºC durante 16 horas.
Las membranas se lavaron dos veces con SSPE x0,5/SDS al 0,1% a 68ºC
y después se expusieron a una película de autorradiografía BioMAX
(Kodak) durante 1 semana a -80ºC.
Los resultados se muestran en la Figura 4. Se
observó el mayor nivel de expresión de ARNm de
PFI-013 en leucocitos de sangre periférica (PBL),
siendo detectable la expresión en bazo, testículos y colon.
Se usó una reacción de curva patrón para
cuantificar la expresión de PFI-013, usando una
solución de plásmido de 0,55 g/\mul de pcDNA3.1 que contenía la
secuencia codificante de PFI-013. La solución de
plásmido se diluyó en serie en etapas logarítmicas hasta
10^{-12}. La curva patrón se preparó usando esta dilución para
2-200.000 copias/pocillo. Se usaron concentraciones
de 300 nM de cada cebador
(PFI-013F-taq (SEC ID Nº: 8) y
PFI-013R-taq (SEC ID Nº: 9)) y de
150 nM de PFI-013CP (SEC ID Nº: 10) con 2X Mezcla
Maestra Universal de PCR TaqMan® (Applied Biosystems). Como
plantilla se usó 1 ng de ADNc de Paneles de ADNc de Múltiples
Tejidos (MTC^{TM}), Humano I y Humano II (Clontech). La reacción
se procesó en el Sistema de Detección de Secuencia TaqMan® 7700,
con cuantificación a tiempo real con un solo indicador, con un
volumen de reacción de 25 \mul y cada punto por triplicado. Las
condiciones de PCR fueron: 50ºC durante 2 min, 95ºC durante 10 min,
después 95ºC durante 15 seg, 60ºC durante 1 min durante 40 ciclos.
Los resultados se analizaron por el software de detección de
secuencia. El nivel basal, es decir el efecto de fondo para las
lecturas de fluorescencia, se fijó a 3-12 ciclos.
El fichero de resultados se exportó a Excel (Microsoft), y la curva
patrón se regeneró con los parámetros de detección del fichero de
resultados. Los resultados se expresan como número de copias de
transcritos de PFI-013 por 1 ng de ADNc de tejido,
representando las barras de error la desviación típica (véase la
Figura 5).
| PFI-013F-taq: | 5'-AATATTTTATTGGAGCCTGTGGAA-3' | (SEC ID Nº: 8) | |
| PFI-013R-taq: | 5'-GGAAGAGACAGCAGTCAGTCCA-3' | (SEC ID Nº: 9) | |
| PFI-013CP: | 5'-FAM-ACACAAAGGATATCAGCGAAAGGCAAGCCTAMRA-3' | (SEC ID Nº: 10) |
Los resultados se muestran en la Figura 5. Los
resultados de PCR cuantitativos confirman los datos de la
transferencia de Northern, ya que el mayor nivel de expresión se
observó en leucocitos de sangre periférica (Leucocitos P.B),
seguido de bazo y testículos; detectándose bajos niveles de
expresión en las demás muestras.
Ejemplo
5
Se transfectaron 2 x 10^{8} células
CHO-K1 con
pcDNA3.1/V5-His-TOPO-PFI-013
o se transfectaron de forma simulada, usando Lipofectamine Plus
(Gibco-BRL) de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. Después de la incubación durante las 48 horas
posteriores a la transfección, se realizaron preparaciones de
membrana brutas como se indica a continuación: Las células se
recogieron por raspado, se resuspendieron en 20 ml de tampón de
ensayo enfriado con hielo (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4)),
se homogeneizaron y la suspensión resultante se centrifugó a 20.000
g, a 4ºC durante 30 minutos. El sobrenadante se decantó, el
sedimento se resuspendió en 3 ml de tampón de ensayo y se volvió a
homogeneizar (Tris-HCl 50 mM pH 7,4). La
concentración de proteína se determinó a través de un ensayo de
Bradford (Biorad), de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante.
Después se incubaron alícuotas de esta
preparación de membrana que contenían 200 \mug de proteína con
diversas concentraciones de ^{3}H-histamina (por
ejemplo, 0,72-1500 nM; obteniéndose la
^{3}H-histamina en Amersham Pharmacia Biotech)
durante 2 horas a 30ºC. Para terminar las incubaciones, se filtraron
rápidamente las muestras usando el recolector de células Brandell
en Filtermats Wallac (Perkin Elmer) (que previamente se habían
humedecido (durante 1 h) en una solución al 0,3% (v/v) de PEI
(polietilenimina; Sigma) en tampón de ensayo para reducir la unión
al Filtermat). Inmediatamente, los Filtermat/pocillos se lavaron
cuatro veces en rápida sucesión con 2 ml de tampón de ensayo por
pocillo. Los Filtermats se secaron usando un microondas, y se fundió
un material de centelleo Meltilex (Perkin Elmer) sobre los
Filtermats usando el sellante térmico Wallac Meltilex. La
radiactividad unida en los Filtermats se determinó usando el
contado de centelleo de betaplate de Wallac.
Los datos se expresaron como la diferencia entre
la radiactividad unida a las membranas de células transfectadas con
PFI-013 y transfectadas de forma simulada.
Los datos preliminares, mostrados en la Figura
6, sugieren que la histamina se une a PFI-013,
aunque con una afinidad relativamente baja.
Ejemplo
6
Se empleó la tecnología del Lector en Placas de
Imágenes Fluorescentes (FLIPR®) como medio para detectar la
activación de PFI-013 por histamina o por agonistas
de histamina en un ensayo basado en células.
Se transfectaron de forma transitoria 5 x
10^{6} células de Riñón Embrionario Humano (HEK) 293 que
expresaban el gen G\alpha15 de ratón (denominadas de aquí en
adelante "células 293") con 7,5 \mug de vector de
PFI-013 (contenido dentro del plásmido
pcDNA4HISmaxB (Invitrogen)), o el vector solo, usando reactivo
Lipofectamine Plus® (Gibco BRL) según el protocolo del fabricante.
El ADNc de PFI-013 se había clonado en pcDNA4HISmaxB
usando sitios de restricción KpnI y NotI para
escindir el ADNc de PFI-013 a partir de
pcDNA3.1/V5-His-TOPO y para
insertar el ADNc en pcDNA4HISmaxB usando técnicas de biología
molecular convencionales (por ejemplo, de acuerdo con Sambrook,
et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA) y usando la
ADN ligasa de T4 para unir los fragmentos; se usó pcDNA4HISmaxB ya
que contiene elementos que regulan positivamente el nivel de
transcripción de genes con respecto a los vectores de pcDNA3.1
convencionales). 24 horas después de la transfección, las células se
separaron del matraz usando solución de Tripsina/EDTA (LTI) y se
sembraron en una placa de 96 pocillos de paredes negras tratada con
poli-D-lisina (Becton Dickinson) a
una densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo. Las placas se dejaron
durante una noche para dejar que las células se adhirieran al fondo
de los pocillos. El medio se retiró de las células y se reemplazó
con 100 \mul de solución de carga de colorante caliente (a 37ºC)
(50 \mug de Fluo3 (Molecular probes) en 20 \mul de DMSO + ácido
plurónico al 20% en DMSO, añadido a 11 ml de Medio de Eagle
Modificado por Dulbecco que contenía 1x Probenecid (100x Probenecid
- 0.71 g). El Probenecid se disolvió en 5 ml de NaOH 1 M y 5 ml de
Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS) de Dulbecco, por placa;
el Probenecid (Molecular Devices) inhibe la actividad de la
proteína de transporte de aniones, mejorando de esta manera la
carga de colorante). Las placas después se incubaron durante 1 hora
a 37ºC. Posteriormente, las placas se lavaron con 250 \mul de
tampón de lavado por pocillo (5 ml de solución madre de Probenecid
100x + 495 ml de PBS, pH 7,4) 4 veces. Las placas se devolvieron al
incubador a 37ºC/5%de CO_{2} durante 30 minutos antes del
procesamiento dentro del instrumento FLIPR®. El procesamiento de
FLIPR® implicaba la lectura de la fluorescencia de todas las
muestras durante 2 minutos; durante este periodo de tiempo se
determinó el nivel basal de fluorescencia durante 10 segundos.
Después se transfirió la cantidad deseada de compuesto (es decir,
histamina o agonistas de histamina) automáticamente a los pocillos y
la fluorescencia de controló continuamente durante el resto del
tiempo. Todos los compuestos se diluyeron en tampón de lavado.
Usando la metodología descrita con detalle
anteriormente, se investigó el efecto de la histamina sobre la
activación funcional de PFI-013.
La figura 7 representa la acción de
dihidrocloruro de histamina 10 \muM diluido en serie en
concentraciones logarítmicas hasta 10 pM (columnas 2 a 8) por
duplicado (filas B y C), sobre células 293 transfectadas con
PFI-013 (figura 7A) o células 293 transfectadas sólo
con el vector (figura 7B). Las demás células contenían sólo tampón,
sin compuesto. Se encontró una activación específica de
PFI-013 por histamina a la concentración 10
\muM.
Usando la metodología descrita con detalle
anteriormente, se investigó el efecto de compuestos histaminérgicos
sobre la activación funcional de PFI-013.
La figura 8 representa la acción de diversos
compuestos histaminérgicos (columnas 2 a 10) diluidos en serie
desde 10 \muM (filas A y B) hasta 0,5 \muM por duplicado (filas
G y H), sobre células 293 transfectadas con PFI-013
(figura 8A) o células 293 transfectadas sólo con vector (figura 8B).
Las demás células contenían sólo tampón sin compuesto.
Los resultados indican que
PFI-013 se activa, en un orden jerárquico de
potencia, por N-\alpha-metil
histamina (columna 6) > histamina (columna 4) >
R-\alpha-metil histamina (columna
5) = histamina-1-metilo (columna
8). Para los demás compuestos ensayados (Dimaprit,
L-histidina, Imetit, noscapina y clobenpropit,
respectivamente en las columnas 2, 3, 7, 9 y 10), no pudo
detectarse activación de PFI-013 en este ensayo.
Ejemplo
7
Se aislaron eosinófilos a partir de sangre
periférica como se ha descrito previamente (Hansel, TT., De Vries
IJ., Iff T., Rihs S., Wandzilak M., Betz S., Blaser K. y Walker C.
(1991). An improved immunomagnetic procedure for the isolation of
highly purified human blood eosinophils. J. Imm. Meth.
145:105-10). La quimiotaxis se midió usando una
cámara Boyden de 48 pocillos (Neuro Probe Inc., Cabin John, MD,
USA). Los agonistas se diluyeron en medio RPMI (BioWhittaker,
Walkersville, MD, USA) que contenía albúmina de suero bovino (BSA)
al 0,1% (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) y se añadieron a los
pocillos inferiores de la cámara de quimiotaxis. Se usó un filtro
de policarbonato sin PVP de 5 \mum para separar los pocillos de la
cámara (Neuro Probe Inc., Cabin John, MD, USA). Los eosinófilos se
resuspendieron en medio RPMI/BSA a una concentración de 2,5 x
10^{6} células por ml. Después se añadieron 50 \mul de esta
suspensión celular a la cámara superior. Las cámaras se incubaron
durante 45 minutos en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2}
a 37ºC. Después del periodo de incubación, los filtros se
retiraron, el lado superior se raspó para retirar las células que no
habían migrado y los filtros se tiñeron con colorante
Diff-Quick stain (Dade Behring AG, Dudingen, Suiza).
Los números de células que migraban (fondo del filtro) se contaron
por microscopía óptica. Después se determinó la media de tres
campos de alta potencia. El número de células que migraban se
calculó restando este número del número de células por campo de
alta potencia en los pocillos que no contenían ningún agonista.
Todos los compuestos se adquirieron en
Sigma-RBI.
Se realizaron experimentos para caracterizar el
subtipo de receptor de histamina implicado en la respuesta
quimiotáctica de eosinófilos a la histamina. La metodología fue como
se ha detallado anteriormente. Los compuestos ensayados fueron:
dihidrocloruro de histamina (agonista no selectivo del receptor de
histamina), base libre de histamina, dimaleato de HTMT (agonista
del receptor de histamina H1), Dimaprit (agonista del receptor de
histamina H2) e Imetit (agonista del receptor de histamina H3). Se
incluyó eotaxina como control positivo para la quimiotaxis de
eosinófilos. En el estudio se incluyó burimamida, ya que previamente
Raible et al. habían descrito un efecto agonista parcial de
este compuesto sobre la producción de Ca^{2+} intracelular en
eosinófilos humanos aislados (Raible D.G. et al (1994)
Pharmacological characterisation of a novel histamine receptor on
human eosinophils, Am J Respir Crit Care Med. 149, páginas
1506-1511).
Los resultados se muestran en la figura 9. Sólo
el agonista no selectivo del receptor de histamina, dihidrocloruro
de histamina, indujo una respuesta quimiotáctica significativa en
eosinófilos humanos aislados en un ensayo in vitro. El
agonista de H2, dimaprit, y los agonistas de H3, imetit y
burimamida, no presentaron ninguna actividad quimiotáctica,
mientras que el agonista de H1, HTMT, presentó una respuesta
quimiotáctica muy débil sólo a la mayor concentración ensayada (1
\muM).
Se realizaron experimentos de antagonistas para
caracterizar adicionalmente el subtipo de receptor de histamina
implicado en la respuesta quimiotáctica de eosinófilos a la
histamina. La metodología fue como se ha detallado anteriormente,
con la excepción de que se utilizó IL-5 para cebar
los eosinófilos para los estudios de quimiotaxis, ya que se
demostró que aumentaba la respuesta quimiotáctica a histamina (véase
la figura 10A). Los antagonistas se usaron como una sola
concentración de 10 \muM. Los antagonistas ensayados fueron:
maleato de mepiramina (antagonista del receptor de histamina H1),
cimetidina (antagonista del receptor de histamina H2), tioperamida
(antagonista del receptor de histamina H3) y clobenpropit
(antagonista del receptor de histamina H3).
Los resultados, mostrados en la figura 10B,
indican que los dos antagonistas de H3, tioperamida y clobenpropit,
tenían el mayor efecto sobre la reducción de la respuesta
quimiotáctica de eosinófilos humanos aislados a dihidrocloruro de
histamina.
Se realizó otro experimento para determinar la
CI_{50} tanto de tioperamida como de clobenpropit (antagonistas
de histamina H3) para inhibir la quimiotaxis de eosinófilos humanos
aislados in vitro. La metodología fue como se ha indicado
anteriormente, usando tioperamida y clobenpropit a concentraciones
de 10 \muM, 1 \muM y 0,1 \muM (la histamina, como agonista,
se usó a 30 nM).
Los resultados preliminares, mostrados en la
figura 10C, indican que clobenpropit y tioperamida antagonizan la
quimiotaxis inducida por histamina de eosinófilos humanos con una
CI_{50} de 1,5 \muM y 0,83 \muM respectivamente.
Se apreciará que lo anterior se proporciona sólo
a modo de ejemplo y que pueden modificarse detalles sin apartarse
del alcance de la invención.
<110> Pfizer Limited (sólo EP (GB)),
Pfizer Inc. (EP excepto GB /US /JP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo Polipéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCS10373APME
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 9925641.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-10-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 0009973.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-04-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 390
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatgccag atactaatag cacaatc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaagaagat actgaccgac tgtg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcaagata aagggcagac cagat
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccttctccc aatcagattc tgtagc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatccattg tgtcacaagc gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatattttat tggagcctgt ggaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagagaca gcagtcagtc ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacaaagga tatcagcgaa aggcaagcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Un método para identificar un compuesto que
modula la quimiotaxis de eosinófilos, que comprende poner en
contacto un polipéptido que comprende:
- (i)
- un polipéptido traducido a partir de la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº: 1;
- (ii)
- un polipéptido de la SEC ID Nº: 2; o
- (iii)
- un polipéptido codificado por el ADNc de NCIMB 41073;
con un compuesto candidato y
determinar si se produce la modulación de dicho
polipéptido.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende:
- (a)
- poner en contacto un compuesto con células que expresan el polipéptido definido en la reivindicación 1 en su superficie celular, asociándose dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; realizándose dicho contacto en condiciones suficientes para permitir la unión de los compuestos al polipéptido; y
- (b)
- identificar un compuesto capaz de unirse a dicho polipéptido por medio de la detección de la señal producida por dicho segundo componente.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
o la reivindicación 2, donde el compuesto es útil en el tratamiento
de trastornos alérgicos, enfermedades de vasculitis granulomatosa,
trastornos inmunológicos, enfermedades intersticiales y otras
enfermedades pulmonares, enfermedades infecciosas, afecciones
inflamatorias, y enfermedades neoplásicas y
mieloproliferativas.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho trastorno alérgico es asma extrínseca, dicho
trastorno inmunológico es asma intrínseca, dicha enfermedad pulmonar
es enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y dichas
enfermedades inflamatorias son enfermedades inflamatorias del
intestino.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende:
- (a)
- poner en contacto (i) un primer componente detectable que se sabe que se une al polipéptido definido en la reivindicación 1 y (ii) un compuesto, con células que expresan dicho polipéptido en su superficie celular, asociándose dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; realizándose dicho contacto en condiciones suficientes para permitir la unión de los compuestos al polipéptido; y
- (b)
- determinar si el primer componente se une al polipéptido detectando la ausencia u otra cosa de una señal generada por la interacción del primer componente con el polipéptido.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho compuesto se une y
antagoniza o antagoniza selectivamente el polipéptido como se define
en la reivindicación 1.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho compuesto se une y
agoniza el polipéptido como se define en la reivindicación 1.
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