ES2247017T3

ES2247017T3 - Receptor humano de cistenil leucotrieno 2(cyslt2).

Info

Publication number: ES2247017T3
Application number: ES01303090T
Authority: ES
Inventors: Lee Harland
Original assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Corp SRL
Current assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Corp SRL
Priority date: 2000-04-05
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2021-03-30
Also published as: GB0008504D0; EP1158050B1; DK1158050T3; EP1158050A1; DE60112994D1; DE60112994T2; JP2002017378A; JP3694246B2; ATE303438T1

Abstract

Un polinucleótido aislado y/o purificado que consiste en uno o más de: (a) un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1; o (b) el complemento del polinucleótido de (a).

Description

Receptor humano de cisteinil leucotrieno 2 (CysLT_{2})

Campo técnico

La presente invención se refiere a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que pertenece a la clase de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteínas G (GPCRs: G-Protein Coupled Receptors). La presente invención se refiere también, entre otras cosas, a procedimientos para producir el polipéptido y a sus usos.

Fundamento de la invención

Las células y los tejidos responden a una amplia variedad de moléculas de señalización extracelulares mediante la interacción de estas moléculas con receptores específicos de la superficie de la célula. Una de estas clases de receptores se conoce como receptores acoplados a proteína G (GPCRs: G-Protein Coupled Receptors), y se caracteriza porque contiene una serie de 7 segmentos transmembrana hidrófobos. Al unir un ligando extracelular a su receptor, se inician señales extracelulares por medio de interacciones con proteínas G heterotriméricas que, a su vez, pueden conducir a cierto número de eventos intracelulares distintos que dependen de cual es el receptor que ha sido activado. Por ejemplo, algunos GPCRs influyen sobre la actividad de la adenil ciclasa mientras que otros actúan a través de la fosfolipasa C.

Los miembros de la superfamilia de GPCR responden a una amplia variedad de ligandos, incluyendo aminas de molécula pequeña (tales como serotonina, dopamina, acetilcolina), mediadores derivados de lípidos (tales como LpA), derivados de aminoácidos (tales como glutamato) y péptidos neurotransmisores y hormonas (tales como neuroquinina, galanina, glucagón, gastrina). Aunque los GPCRs son activados por una amplia gama de ligandos, hay que tener en cuenta que los GPCRs individuales tienen un repertorio de ligandos pequeño y muy específico. Basándose en un análisis de la estructura primaria de un nuevo GPCR, ahora es posible clasificarlos en subfamilias específicas, estrechando así la gama de ligandos potenciales.

En muchos casos, los ligandos endógenos de los GPRCs son relativamente pequeños, permitiéndoles mimetizarse o bloquearse por análogos sintéticos. Por ejemplo, fármacos tales como la prazosina, la doxazosina, la cimetidina o la ranitidina, son todos ellos antagonistas eficaces de sus respectivos GPCRs diana. Así, como la modulación de los GPCRs puede tener consecuencias terapéuticas, hay una necesidad continuada de proporcionar nuevos GPCRs y sus agonistas y antagonistas asociados.

El número de entrada AL137118, EMBL Sequence Database, versión 5 (GI: 7406543), fecha disponible el
04/1/2000, contenía cromosoma 13 humano, secuencia map q14.12-21.1 del clon RP11-108P5 en 5 piezas desordenadas. No se proporcionó ningún comentario de ninguna secuencia de codificación contenida en ella, pero en la versión 20 de esta entrada, que se puso a disposición pública el 13 de marzo de 2001, se añadió la anotación al efecto de que en este segmento está comprendida una secuencia del receptor CysLT_{2}.

Aspectos resumidos de la invención

En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos. En relación con esto, se ha aislado una secuencia específica de aminoácidos, y se ha de entender que la invención cubre esa secuencia y las variantes, fragmentos, derivados y homólogos de la misma.

En otro aspecto amplio, la presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos. En relación con esto, se ha aislado una secuencia específica de ácidos nucleicos, y se ha de entender que la invención cubre esa secuencia así como las variantes, fragmentos, derivados y homólogos de la misma.

Así pues, de forma resumida, algunos aspectos de la presente invención se refieren a:

1. Secuencias de aminoácidos.

2. Secuencias de nucleótidos.

3. Ensayos que utilizan dichas secuencias.

4. Sistemas de expresión que comprenden o expresan dichas secuencias.

Otros aspectos concernientes a la secuencia de aminoácidos de la presente invención y/o a la secuencia de nucleótidos de la presente invención, incluyen: una construcción que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un vector que un plásmido que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; una célula transfectada o transducida viralmente con una construcción/vector/plásmido que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un tejido que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un órgano que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un hospedador transformado que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; y un organismo transformado que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención. La presente invención comprende también métodos para expresarla, tal como la expresión en un microorganismo, incluyendo métodos para transferirla. La presente invención comprende también purificar y cristalizar el polipéptido, opcionalmente seguido por la aclaración de la estructura tridimensional, preferentemente mediante cristalografía de rayos X. La presente invención comprende también derivar un modelo de homología de la estructura tridimensional del polipéptido de la presente invención.

Para facilitar la consulta, se discuten ahora aspectos de la presente invención bajo los encabezamientos apropiados de cada sección. Sin embargo, las enseñanzas bajo cada sección no están necesariamente limitadas a cada sección en particular.

Aspectos detallados de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado y/o purificado que consiste en uno o más de:

(a) un polinucleótido que codifica el polipéptido que se expone en la SEC ID No: 2;

(b) un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID No: 1;

(c) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con el polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) o (b);

(d) un complemento del polinucleótido según uno cualquiera de los apartados (a) a (c); o

(e) un fragmento polinucleotídico del polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d).

Preferentemente, el polinucleótido consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 75% de identidad con el polinucleótido según uno cualquiera de los apartados (a) o (b). Más preferentemente, el polinucleótido consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad, incluso más preferentemente al menos un 85% de identidad, incluso más preferentemente al menos un 90% de identidad, incluso más preferentemente al menos un 95% de identidad, lo más preferentemente al menos un 98% de identidad, con el polinucleótido de los apartados (a) o (b).

El polinucleótido descrito anteriormente codifica preferentemente un receptor acoplado a proteína G (GPCR). Incluso más preferentemente, el polinucleótido codifica un receptor cisteinil leucotrieno, incluso más preferentemente un receptor CysLT_{2}.

La presente invención proporciona también una sonda o cebador de polinucleótido que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del polinucleótido descrito anteriormente.

La presente invención proporciona además un vector que contiene el polinucleótido descrito anteriormente.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada con el vector descrito anteriormente. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula de mamífero, de insecto, fúngica, bacteriana o de levadura.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el producto de RNA transcrito del polinucleótido descrito anteriormente. También se proporciona una molécula de RNA o un fragmento del mismo que es antisentido en relación con el producto de RNA y es capaz de hibridarse con el mismo.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido, que comprende cultivar dicha célula hospedadora bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido. Preferentemente, dicho polipéptido se expresa en la superficie de dicha célula. Preferentemente el procedimiento incluye además recuperar el polipéptido del cultivo.

También se proporciona mediante la presente invención un procedimiento para producir células capaces de expresar un polipéptido, que comprende transformar o transfectar células con el vector descrito anteriormente. De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporcionan células producidas por el procedimiento descrito anteriormente. También se proporciona un preparado de membranas de dichas células.

También se describe en la memoria descriptiva el microorganismo depositado bajo el número de entrada NCIMB 41074 en las National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido que consiste en:

(a): la secuencia de aminoácidos deducida, traducida a partir de la secuencia de polinucleótido de la SEC ID No: 1; o

(b): un polipéptido de SEC ID No: 2.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para identificar un compuesto, que se une y modula el polipéptido descrito anteriormente, que comprende poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto candidato, y determinar si tiene lugar la modulación.

Preferentemente, dicho método comprende:

(a): poner en contacto un compuesto (o una mezcla de compuestos) con células que expresan el polipéptido descrito anteriormente sobre su superficie celular, estando asociado dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; siendo dicho contacto bajo condiciones adecuadas para permitir la unión de compuestos al polipéptido; y

(b): identificar un compuesto capaz de unión con el polipéptido detectando la señal producida por dicho segundo componente.

Alternativamente, dicho método comprende:

(a): poner en contacto (i) un primer componente detectable, que se sabe que se une al polipéptido descrito anteriormente y (ii) un compuesto, con células que expresan el polipéptido anterior en su superficie celular, estando asociado dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; siendo dicho contacto bajo condiciones suficientes para permitir la unión de compuestos al polipéptido; y

(b): determinar si el primer componente se une al polipéptido detectando la ausencia o no de una señal generada a partir de la interacción del primer componente con el polipéptido.

Alternativamente, dicho método comprende:

(a): poner en contacto células que expresan el polipéptido descrito en su superficie celular (o membranas preparadas a partir de dichas células) con un compuesto de ensayo o una mezcla de compuestos de ensayo, junto con, o seguido por, un compuesto con un marcador detectable, que se sabe que se une al polipéptido, y

(b): determinar si el compuesto de ensayo o uno o más componentes de la mezcla de compuestos de ensayo se une al polipéptido detectando una disminución (o no) del marcador detectable unido al polipéptido.

El compuesto identificado por cualquiera de los métodos anteriores preferentemente se une y (i) antagoniza o antagoniza selectivamente al polipéptido descrito anteriormente, o (ii) agoniza o agoniza selectivamente al polipéptido descrito anteriormente.

Como los GPCRs están implicados en la transducción de la señal, los moduladores (p. ej. agonistas o antagonistas) del polipéptido de la presente invención pueden encontrar uso para interferir en el proceso de transducción de la señal.

Los anticuerpos, compuestos y composiciones que pueden modular el polipéptido de la presente invención, pueden encontrar aplicación en muchas áreas terapéuticas que incluyen, pero sin limitarse a ellas, obesidad, diabetes y enfermedad metabólica, enfermedad neurológica, psicoterapia, enfermedad urogenital, medicina sexual y de la reproducción, inflamación, cáncer, reparación de tejidos, dermatología, pigmentación de la piel, foto envejecimiento, debilidad, osteoporosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad gastrointestinal, infecciones, alergia y enfermedades respiratorias, trastornos de órganos sensoriales, trastornos del sueño y pérdida del cabello. Preferentemente tales anticuerpos, compuestos y composiciones se usan para tratar a pacientes con trastornos alérgicos, trastornos inflamatorios tales como enfermedades intestinales inflamatorias, trastornos inmunológicos, enfermedades pulmonares tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), enfermedades infecciosas, enfermedades neoplásicas y mieloproliferativas, enfermedades granulomatosas vasculíticas, así como enfermedades cardíacas. Más preferentemente, tales anticuerpos, compuestos y composiciones se usan para tratar pacientes con rinitis alérgica o asma; incluso más preferentemente, tales anticuerpos, compuestos y composiciones se usan para tratar la congestión nasal, bien sean solos o en combinación con terapias anti-histamínicas.

En consecuencia, también se describe el uso del compuesto descrito anteriormente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de modular el polipéptido descrito anteriormente. Preferentemente, el tratamiento es para un paciente que necesita antagonizar o antagonizar selectivamente el polipéptido. Alternativamente, el tratamiento es para un paciente que necesita agonizar el polipéptido.

También se describe el uso del anticuerpo descrito anteriormente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de modular el polipéptido descrito anteriormente. Preferentemente, dicho método es para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de antagonizar o antagonizar selectivamente el polipéptido. Alternativamente, dicho método es para el tratamiento de un paciente que necesita agonizar el polipéptido.

También se describe un método para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de modular el polipéptido descrito anteriormente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo descrito anteriormente. Preferentemente, dicho método es para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de antagonizar o antagonizar selectivamente el polipéptido. Alternativamente, dicho método es para el tratamiento de un paciente que necesita agonizar el polipéptido.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan células modificadas por ingeniería genética ex vivo o in vivo para que expresen, sobre expresen, subexpresen o muestren inserción o deleción direccionadas (dirigidas a la diana) del polipéptido de la presente invención.

La presente invención se refiere también al uso de las nuevas secuencias de ácido nucleicos y aminoácidos en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad.

Polipéptido PFI-017

El término "polipéptido", que es intercambiable con el término "proteína" y que a veces se menciona también como "secuencia de aminoácidos", incluye moléculas de polipéptido de cadena simple, así como complejos de múltiples polipéptidos en los que los polipéptidos constituyentes individuales están unidos por medios covalentes o no covalentes. Preferentemente, el polipéptido de la presente invención es un polipéptido de cadena simple.

Los polipéptidos de la presente invención pueden estar en forma sustancialmente aislada. Se entenderá que el polipéptido puede ser mezclado con vehículos o diluyentes que no interfieran con el propósito que se pretende para el polipéptido, y ser considerado aún como sustancialmente aislado. Un polipéptido de la presente invención puede también estar en forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprenderá generalmente el polipéptido en un preparado en el que más del 90%, p. ej. el 95%, el 98% o el 99% del polipéptido del preparado, es un polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser modificados, por ejemplo mediante la adición de restos de histidina, para facilitar su purificación.

El polipéptido PFI-017 puede ser el mismo que la forma de origen natural (para este aspecto, preferentemente el polipéptido PFI-017 no está en su entorno natural) o es una variante, un homólogo, un fragmento o un derivado del mismo. El polipéptido PFI-017 no está cubierto por la invención cuando ha sido expresado por su secuencia de nucleótidos codificadora nativa que está también en su entorno natural y cuando esa secuencia de nucleótidos está bajo el control de su promotor nativo, que está también en su entorno natural. Además, o en la alternativa, el polipéptido PFI-017 es polipéptido PFI-017 aislado y/o polipéptido PFI-017 purificado. El polipéptido PFI-017 puede ser obtenido a partir de, o producido por cualquier fuente adecuada, sea natural o no, o puede ser sintético, semisintético o recombinante.

La secuencia codificadora de PFI-017 puede ser la misma que la forma de origen natural (para este aspecto, preferentemente la secuencia codificadora de PFI-017 no está en su entorno natural) o es una variante, un homólogo, un fragmento o un derivado del mismo. Además, o en la alternativa, la secuencia codificadora de PFI-017 es una secuencia codificadora de PFI-017 aislada y/o secuencia codificadora de PFI-017 purificada. La secuencia codificadora de PFI-017 puede ser obtenida a partir de, o producida por, cualquier fuente adecuada, sea natural o no, o puede ser sintética, semisintética o recombinante. La secuencia de aminoácidos de la presente invención puede ser producida mediante expresión de una secuencia de nucleótidos que la codifica en un sistema de expresión
adecuado.

Además, o en la alternativa, la propia proteína podría producirse usando métodos químicos para sintetizar un polipéptido PFI-017, en conjunto o en parte. Por ejemplo, pueden sintetizarse los péptidos mediante técnicas en fase sólida, separarse de la resina y purificarse mediante cromatografía de líquidos de alta eficacia preparativa (p. ej. Creighton (1983) Protein Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., Nueva York, NY, EE.UU.). La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (p. ej. el procedimiento de degradación de Edman).

La síntesis directa de péptidos puede realizarse usando varias técnicas en fase sólida (Roberge JY et al., Science, Vol. 269, 1995, 202-204) y puede conseguirse la síntesis automática usando, por ejemplo, el sintetizador de péptidos ABI 431 A (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de PFI-017, o cualquier parte de la misma, puede ser alterada durante la síntesis directa y/o combinada usando métodos químicos con una secuencia procedente de otras subunidades, o cualquier parte de la misma, para producir un polipéptido variante.

En otra realización de la invención, una secuencia de aminoácidos PFI-017 natural, modificada o recombinante, puede ser ligada a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el cribado de bibliotecas en relación con compuestos y agonistas y antagonistas peptídicos de actividad GPCR de PFI-017, puede ser útil codificar una proteína PFI-017 quimérica que expresa un epítopo heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente. También puede construirse por ingeniería genética una proteína de fusión que contenga un sitio de segmentación localizado entre una secuencia de PFI-017 y la secuencia de la proteína heteróloga, de forma que la PFI-017 pueda ser segmentada y separada pura del resto heterólogo.

La PPI-017 puede expresarse también como proteína recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a ellos, péptidos quelantes de metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados (Porath, J., Protein Expr. Purif. Vol. 3, 1992 p. 263-281), dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, WA, USA). La inclusión de una secuencia enlazadora segmentable tal como Factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA, USA) entre el dominio de purificación y PFI-017 es útil para facilitar la purificación.

Una vez purificada la proteína, pueden obtenerse cristales con métodos similares a los descritos por Palczewski et al. en Science, 289, 739-745 (2000), y la estructura puede ser resuelta mediante cristalografía de rayos X como se describe en esta publicación, u otras técnicas biofísicas. Alternativamente, o adicionalmente, la estructura tridimensional del polipéptido de la invención puede ser modelada también mediante modelación por homología, que comprende las etapas de alinear la secuencia del polipéptido de la invención con la secuencia de un polipéptido similar de estructura conocida, preferentemente rodopsina, cartografiar las diferencias de secuencia en la estructura conocida, derivando así un modelo para la estructura tridimensional del polipéptido de la invención. La estructura tridimensional, derivada bien sea mediante la determinación de la estructura o mediante modelación por homología, puede usarse después para diseñar compuestos que pueden unirse al polipéptido de la invención, o para la predicción de si los compuestos se unirán a él.

Los términos "variante", "homólogo", "fragmento", "análogo" o "derivado" en relación con la secuencia de aminoácidos para el polipéptido de la presente invención, incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o adición de un aminoácido (o más), de la secuencia o a la secuencia, con la condición de que el polipéptido resultante tenga actividad de GPCR, preferentemente siendo al menos tan activo biológicamente como el polipéptido que se muestra en la SEC ID No: 2 anexa. En particular, el término "homólogo" cubre la homología con respecto a la estructura y/o a la función. Con respecto a la homología de secuencia, hay al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 95% de homología con la secuencia mostrada en SEC ID No:2. Lo más preferentemente hay al menos un 98% de homología con la secuencia mostrada en SEC ID No: 2.

Típicamente, para la variante, homólogo o fragmento de la presente invención, los tipos de sustituciones de aminoácidos que podrían hacerse deben mantener la hidrofobicidad/hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos. Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones, siempre y cuando la secuencia modificada conserve la capacidad para actuar como GPCR de acuerdo con la presente invención. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos que no sean de origen natural.

El polipéptido PFI-017 y/o su secuencia codificadora, y/o una secuencia capaz de hibridarse con la misma, es o son útiles para ensayar la selectividad de los fármacos candidatos entre distintos GPCRs.

Se ha demostrado (en el presente texto) que el PFI-017 es lo más parecido a los receptores de leucotrieno y que el PFI-017 codifica un nuevo GPCR cuyos ligandos son cisteinil leucotrienos, p. ej. LTC_{4} y LTD_{4}. Por tanto el PFI-017 se denomina también receptor cysLT_{2}. PFI-017 se refiere a una secuencia que comprende la SEC ID No 2, o una variante, fragmento, homólogo o derivado de la misma; PFI-017^{\text{*}} se refiere específicamente a la secuencia codificadora y/o al producto de traducción como se publica en Heise, C.E. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 30531-30539, y Takasaki, J. et al., (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 316-322; ambos trabajos publicados después de la fecha de prioridad de esta solicitud. Esta secuencia se muestra en SEC ID No: 5.

Secuencia de nucleótidos de la presente invención

La expresión "secuencia de nucleótidos" como se usa en el presente texto se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o una secuencia de polinucleótidos, y variantes, homólogos, fragmentos, análogos y derivados de las mismas. La secuencia de nucleótidos puede ser DNA o RNA, que pueden ser de origen genómico o sintético o recombinante, que pueden ser de doble cadena o de cadena simple, tanto si representan la cadena con sentido como antisentido.

Preferentemente, la expresión "secuencia de nucleótidos" significa DNA. Más preferentemente, la expresión "secuencia de nucleótidos" significa DNA preparado mediante el uso de técnicas de DNA recombinante (es decir, DNA recombinante).

En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos de la presente invención por sí misma no cubre la secuencia de nucleótidos codificadora nativa en su entorno natural, cuando está bajo el control de su promotor nativo que está también en su entorno natural. Para facilitar la referencia, los autores de la presente invención han denominado esta realización preferida "la secuencia de nucleótidos no nativa".

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden incluir dentro de ellas nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica diversos tipos de modificación a nucleótidos. Estos incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la presente invención, se ha de entender que las secuencias de nucleótidos descritas en el presente texto pueden ser modificadas por cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones pueden ser llevadas a cabo para favorecer la actividad in vivo o lapso de vida de las secuencias de nucleótidos de la presente invención.

La presente invención comprende también secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias presentadas en el presente texto, o cualquier variante, homólogo, análogo, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de la misma, entonces esa secuencia puede ser usada como sonda para identificar secuencias codificadoras similares en otros organismos, etc.

También se describen secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con las secuencias presentadas en el presente texto y sus complementos, o cualquier variante, homólogo, análogo, fragmento o derivado de las mismas. Preferentemente dichas secuencias de nucleótidos son capaces de hibridarse bajo condiciones entre intermedias y rigurosas, más preferentemente bajo condiciones rigurosas (p. ej. 65ºC y 0,1xSSC {0,1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato Na_{3} 0,015M pH 7,0}) con las secuencias de nucleótidos presentadas en el presente texto.

Los ejemplos de ácidos nucleicos pueden caracterizarse alternativamente como aquellas secuencias de nucleótidos que codifican una proteína PFI-017 y se hibridan con la secuencia de DNA mostrada en la SEC ID No: 1. Se prefieren las secuencias que codifican PFI-017 tales que se hibridan bajo condiciones muy rigurosas con la secuencia mostrada en la SEC ID No: 1, o el complemento de las mismas.

Ventajosamente se describen también secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de hibridarse, bajo condiciones rigurosas, con un fragmento de la secuencia mostrada en la SEC ID No: 1 o su complemento. Preferentemente, el fragmento tiene una longitud entre 15 y 50 bases. Ventajosamente, es de una longitud de aproximadamente 25
bases.

Los términos "variante", "homólogo", "análogo", "derivado" o "fragmento", en relación con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido preferido de la presente invención incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o adición de uno o más nucleótidos desde o a la secuencia, con la condición de que la secuencia de nucleótidos resultante codifique o sea capaz de codificar un polipéptido que tiene actividad de receptor de PFI-017, preferentemente siendo al menos tan activo biológicamente como el polipéptido codificado por la secuencia mostrada en SEC ID No: 1. En particular, el término "homólogo" cubre la homología con respecto a la estructura y/o a la función, con la condición de que la secuencia de nucleótidos resultante codifica o es capaz de codificar un polipéptido que tiene actividad como GPCR de PFI-017. Con respecto a la homología de secuencia, preferentemente hay al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 95% de homología con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID No:2. Lo más preferentemente hay al menos un 98% de homología con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID No: 2. Con respecto a la homología de secuencia, preferentemente hay al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 95% de homología con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID No: 1. Lo más preferentemente hay al menos un 98% de homología con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID No: 1.

Como se ha indicado, la presente invención se refiere a una secuencia de DNA (preferentemente una secuencia de cDNA) que codifica PFI-017. En particular, la presente invención se refiere a secuencias de cDNA que codifican PFI-017. Se apreciará que una gama de polinucleótidos diferentes codifican una secuencia de aminoácidos dada como consecuencia de la degeneración del código genético.

La presente invención se refiere también a segmentos de DNA que comprenden la secuencia de DNA mostrada en SEC ID No: 1 o variaciones alélicas de la misma.

La presente invención se refiere también a polipéptidos producidos por expresión en una célula hospedadora en la que han sido incorporadas las anteriores secuencias de DNA o variaciones alélicas de las mismas.

La presente invención proporciona también DNA, preferentemente DNA no nativo, más preferentemente DNA recombinante, que comprende la secuencia de DNA mostrada en la SEC ID No: 1 o variaciones alélicas de la misma.

Conociendo las secuencias de aminoácidos expuestas en el presente texto es posible imaginar secuencias parciales y de longitud completa de ácidos nucleicos tales como cDNA y/o clones genómicos que codifican los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, pueden obtenerse polinucleótidos de la presente invención usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) degenerada que use cebadores diseñados para dirigirse a secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos presentadas en el presente texto. Los cebadores contendrán típicamente múltiples posiciones degeneradas. Sin embargo, para reducir al mínimo la degeneración, se elegirán las secuencias que codifican regiones de las secuencias de aminoácidos presentadas en el presente texto que contienen aminoácidos, tales como metionina, que son codificados por tan sólo un triplete. Además, se elegirán las secuencias teniendo en cuenta el uso de codón en el organismo cuyo ácido nucleico es usado como DNA molde para el procedimiento de PCR. La PCR se usará en condiciones de rigor más bajas que las usadas para clonar secuencias con cebadores de secuencia única (no degenerada) frente a secuencias conocidas.

Las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas por PCR, que codifican fragmentos de polipéptido de la presente invención, pueden ser usadas entonces para obtener secuencias mayores usando técnicas de cribado de genotecas por hibridación. Por ejemplo, puede marcarse un clon de PCR con átomos radiactivos y ser usado para cribar una genoteca de cDNA o genómica de otra especie, preferentemente otra especie de mamífero. Las condiciones de hibridación serán típicamente condiciones de rigor medio a alto (por ejemplo cloruro sódico 0,03M y citrato sódico 0,03M, a una temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC).

Las sondas de ácido nucleico degeneradas que codifican toda o parte de la secuencia de aminoácidos pueden ser usadas también para sondar cDNA y/o bibliotecas genómicas de otras especies, preferentemente de otras especies de mamífero. Sin embargo, se prefiere llevar a cabo técnicas de PCR inicialmente para obtener una secuencia simple para ser usada en posteriores procedimientos de cribado.

De acuerdo con la presente invención, las secuencias de polinucleótidos que codifican PFI-017, fragmentos del polipéptido, proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, pueden ser usadas para generar moléculas de DNA recombinante que dirigen la expresión de PFI-017 en células hospedadoras apropiadas. Debido a la inherente degeneración del código genético, pueden usarse otras secuencias de DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia funcionalmente equivalente, para clonar y expresar PFI-017. Como entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican PFI-017 que poseen codones que no son de origen natural. Los codones preferidos por un hospedador procariótico o eucariótico particular (Murray E. et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508) pueden elegirse, por ejemplo, para aumentar la tasa de expresión de PFI-017 o para producir transcritos de RNA recombinante que tengan las propiedades deseables, tales como una vida mitad más larga, que los transcritos producidos a partir de secuencias de origen natural.

Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención obtenidas usando las técnicas descritas anteriormente puede ser usadas para obtener otras secuencias homólogas y variantes usando las técnicas descritas antes. También pueden ser modificadas para ser usadas para expresar los polipéptidos de la presente invención en una diversidad de sistemas de células hospedadoras, por ejemplo para optimizar las preferencias de codón para una célula hospedadora particular en la que están siendo expresadas las secuencias de polinucleótidos. Pueden desearse otros cambios en las secuencias con el fin de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o de alterar la propiedad o la función de los péptidos codificados por los polinucleótidos.

Las secuencias de polinucleótidos PFI-017 alteradas que pueden ser usadas de acuerdo con la invención incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de diferentes restos de nucleótidos que tienen por resultado un polinucleótido que codifica el mismo PFI-017 o uno funcionalmente equivalente. La proteína puede tener también deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que tienen por resultado un PFI-017 funcionalmente equivalente. Pueden hacerse sustituciones deliberadas de aminoácidos sobre la base de la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los restos, siempre y cuando se conserve la actividad biológica de PFI-017. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina, y los aminoácidos con grupos polares de cabeza no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Incluidos en el alcance de la presente invención están los alelos de PFI-017. Como se usa en el presente texto, un "alelo" o una "secuencia alélica" es una forma alternativa de PFI-017. Los alelos resultan de una mutación, es decir, un cambio en la secuencia de ácidos nucleicos, y generalmente producen mRNAs alterados o polipéptidos cuya estructura y función pueden estar alteradas o no. Cualquier gen dado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a alelos se adscriben generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos. Cada uno de estos tipos de cambio puede ocurrir solo o en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia dada.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden ser modificadas mediante ingeniería genética con el fin de alterar una secuencia codificadora de PFI-017 por diversas razones, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, alteraciones que modifican la clonación, el procesado y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones usando técnicas que son bien conocidas en este campo, p. ej. mutagénesis sitio-dirigida para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glicosilación o para cambiar la preferencia codónica.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para producir un cebador, p. ej. un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda p. ej. marcada con un marcador de revelado por medios convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los polinucleótidos pueden ser clonados en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15, preferentemente al menos 20, por ejemplo al menos 25, 30 o 40 nucleótidos, y están también comprendidos en la expresión "polinucleótidos de la presente invención" como se usa en el presente texto.

Los polinucleótidos o cebadores de la presente invención pueden llevar un marcador de revelado. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P ó ^{35}S, marcadores enzimáticos, u otros marcadores de proteína tales como biotina. Tales marcadores pueden ser añadidos a los polinucleótidos o cebadores de la presente invención y pueden detectarse usando técnicas conocidas en este campo.

Los polinucleótidos tales como un polinucleótido de DNA y cebadores de acuerdo con la presente invención pueden ser producidos por vía recombinante, por síntesis o por cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También pueden ser clonados por técnicas estándar.

En general, los cebadores serán producidos por métodos de síntesis, que implican una elaboración en etapas de la secuencia de ácidos nucleicos deseada, un nucleótido cada vez. Los métodos para realizar esto usando técnicas automáticas son ya disponibles en la técnica.

Generalmente se producirán polinucleótidos más largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por PCR. Esto implicará hacer un par de cebadores (p. ej. de aproximadamente 15-30 nucleótidos) para una región de la secuencia de nucleótidos que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con mRNA o cDNA obtenidos a partir de una célula eucariótica o procariótica, llevando a cabo una reacción en cadena de polimerasa bajo condiciones que ocasionan la amplificación o multiplicación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (p. ej. purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperando el DNA amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios adecuados de reconocimiento de enzimas de restricción, para facilitar la clonación del DNA amplificado en un vector adecuado.

Las moléculas de DNA pueden ser modificadas para aumentar la estabilidad intracelular y la vida mitad. Las modificaciones posibles incluyen, pero sin limitarse a ellas, la adición de secuencias flanqueantes de los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en vez de uniones fosfodiesterasa dentro del esqueleto de la molécula.

Como se mencionó con anterioridad, también se describen secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con toda o parte de la secuencia mostrada en SEC ID No: 1 o una variación alélica de la misma. Estas secuencias de nucleótidos pueden usarse en técnicas antisentido para modificar la expresión de PFI-017. Alternativamente, estas secuencias (o porciones de las mismas) pueden ser usadas como sonda, o para amplificar la totalidad o parte de tal secuencia cuando se usa como cebador para PCR.

Además de las secuencias de DNA recombinante, las secuencias genómicas son también de utilidad en el contexto del descubrimiento de fármacos. Puede ser valioso inhibir la transcripción del mRNA de una isoforma en particular en vez de inhibir su proteína traducida. Esto puede ser cierto con el PFI-017, si hay variantes de ayuste y en donde esas diferentes variantes de ayuste pueden ser transcritas a partir de diferentes promotores.

Otra utilidad de la invención es que las secuencias de DNA, una vez conocidas, dan la información necesaria para diseñar ensayos para detectar específicamente isoformas o variantes de ayuste. Los pares de cebadores de PCR específicos de la isoforma no son más que un ejemplo de ensayo que depende completamente del conocimiento de la secuencia de DNA específica de la isoforma o variante de ayuste. Tal ensayo permite la detección del mRNA para la isoforma para evaluar la distribución en el tejido y la relevancia biológica de cada isoforma para un estado patológico en particular. También permite la identificación de líneas de células que pueden expresar naturalmente solamente una isoforma, un descubrimiento que podría obviar la necesidad de expresar genes recombinantes. Si se demuestra que isoformas específicas de PFI-017 están asociadas con un estado patológico en particular, la invención sería valiosa en el diseño de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de la isoforma del
mRNA.

Un nivel anormal de secuencias de nucleótidos que codifican un receptor PFI-017 en una muestra biológica puede reflejar una anomalía cromosómica tal como una deleción o mutación de ácidos nucleicos. En consecuencia, las secuencias de nucleótidos que codifican un receptor PFI-017 proporcionan la base para sondas que pueden ser usadas con fines de diagnóstico para detectar anomalías cromosómicas tales como deleciones, mutaciones o translocaciones cromosómicas en el gen que codifica PFI-017. La expresión del gen PFI-017 puede ser alterada en tales estados patológicos o puede haber una anomalía cromosómica presente en la región del gen que codifica PFI-017.

En una realización alternativa de la invención, la secuencia codificadora de PFI-017 podría ser sintetizada, en su totalidad o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véanse Caruthers MH et al. (1980), Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 215-23, Horn T et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225-232).

Origen natural

Como se usa en el presente texto, "origen natural" se refiere a un PFI-017 con una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza

Aislado/purificado

Como se usa en el presente texto, los términos "aislado" y "purificado" se refieren a moléculas, bien sean de ácido nucleico o de aminoácidos, que son retiradas de su entorno natural y aisladas o separadas de al menos otro componente con el que están asociadas de forma natural.

Biológicamente activo

Como se usa en el presente texto, "biológicamente activo" se refiere a un PFI-017 según la presente invención, tal como un PFI-017 recombinante, que tiene una función estructural similar (pero no necesariamente en el mismo grado), y/o una función reguladora similar (pero no necesariamente en el mismo grado), y/o una función bioquímica similar (pero no necesariamente en el mismo grado), y/o una función inmunológica similar (pero no necesariamente en el mismo grado) al PFI-017 de origen natural. Específicamente, un PFI-017 de la presente invención tiene la capacidad de actuar como GPCR, que es una de las actividades características del polipéptido PFI-017 de la presente invención.

Actividad inmunológica

Como se usa en el presente texto, se define "actividad inmunológica" como la capacidad del PFI-017 natural, recombinante o sintético, o cualquier oligopéptido del mismo, para inducir una respuesta inmunitaria específica en animales o células apropiados y para unirse con anticuerpos específicos.

Derivado

El término "derivado", como se usa en el presente texto en relación con la secuencia de aminoácidos, incluye la modificación química de un PFI-017. Ilustrativa de tales modificaciones sería el reemplazamiento de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino.

Análogo

El término "análogo", como se usa en el presente texto en relación con la secuencia de aminoácidos (o la secuencia codificadora de la misma) incluye la modificación química de un PFI-017 o la secuencia codificadora del mismo. Ilustrativo de tales modificaciones sería el reemplazamiento de restos de aminoácidos naturales o nucleótidos naturales con restos de aminoácidos no naturales (p. ej. D-aminoácidos, beta-alanina, hidroxiprolina) o nucleótidos no naturales (p. ej. inosina, dimetil-citidina).

Deleción

Como se usa en el presente texto, se define una "deleción" o "borrado" como un cambio en la secuencia de nucleótidos o bien de aminoácidos, en la que uno o más restos de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, están ausentes.

Inserción/adición

Como se usa en el presente texto, una "inserción" o "adición" es un cambio en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que ha tenido por resultado la adición de uno o más nucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente, en comparación con el PFI-017 de origen natural.

Sustitución

Como se usa en el presente texto, la "sustitución" es el resultado del reemplazamiento de uno o más nucleótidos o aminoácidos por nucleótidos o aminoácidos diferentes, respectivamente.

Homólogo

El término "homólogo" con respecto a la secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de aminoácidos de la presente invención, incluirá variaciones alélicas de las secuencias.

Aquí, la homología de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de aminoácidos de la presente invención puede ser determinada usando programas informáticos a disposición del público que pueden calcular el porcentaje (%) de homología entre dos o más secuencias. Ejemplos típicos de tales programas informáticos son los programas FASTA o BLAST.

El cálculo del % de homología entre dos secuencias requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, introduciendo huecos (gaps) donde fuesen necesarios para conseguir un alineamiento óptimo. Programas de ordenador adecuados para llevar a cabo tal alineamiento están incluidos en el paquete GCG (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387), p. ej. Gap o Bestfit. Los ejemplos de otros programas que pueden llevar a cabo comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitarse a ellos, el paquete BLAST, preferentemente BLAST2 (véase Ausubel et al., 199 ibid - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410), ClustalW (Thompson, J. D. et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22 4673-80), y la serie GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA son disponibles para investigación off-line y on-line (Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones se prefiere usar el programa GCG Bestfit.

Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, en algunos casos el propio proceso de alineamiento típicamente no se basa en una comparación de pares todo o nada. En vez de ello, se usa generalmente una matriz de puntuación de similitud escalada que asigna puntuaciones a cada comparación de pares acertada basándose en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz usada comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto de la serie de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin usan generalmente o bien los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se suministra (véase el manual del usuario para obtener más detalles). Se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG o, en el caso de otro programa, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el programa de ordenador ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. Típicamente el programa informático hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Como se ha indicado, para algunas aplicaciones puede determinarse la homología (o identidad) de secuencias usando cualquier algoritmo de homología adecuado, que emplee por ejemplo parámetros por defecto. Para una discusión de los temas básicos en la búsqueda de similitud de bases de datos de secuencias, véase Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6:119-129. Para algunas aplicaciones se emplea el algoritmo BLAST, con los parámetros ajustados en los valores por defecto. El algoritmo BLAST se describe con detalle en http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. Ventajosamente, "homología sustancial", cuando es establecida por BLAST, equivale a secuencias que coinciden con un valor EXPECT de al menos aproximadamente e-7, preferentemente al menos aproximadamente e-9, y lo más preferentemente e-10 o inferior. El umbral por defecto para EXPECT en la busca de BLAST es normalmente
10.

Si cuando se determina la identidad de secuencias se deben usar penalizaciones por huecos (GAP Penalties), que permiten al usuario controlar el número o longitud de los huecos que el programa introduce para optimizar el alineamiento, entonces preferentemente se usan los parámetros por defecto del programa informático.

Hibridación

El término "hibridación", como se usa en el presente texto, incluye "el proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se junta con una cadena complementaria mediante el apareamiento de bases" (Coombs J (1964) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York, NY, EE.UU.) así como el proceso de amplificación llevado a cabo en tecnologías de PCR, como se describe en Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, EE.UU.).

Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de ácido nucleico, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego, CA, EE.UU.) y confieren un "rigor" definido como se explica más adelante.

El rigor de la hibridación se refiere a las condiciones bajo las cuales los híbridos de ácidos polinucleicos son estables. Tales condiciones son evidentes para un profesional con una experiencia normal en este campo. Como saben los expertos en la técnica, la estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, que disminuye aproximadamente 1 a 1,5ºC con cada 1% de disminución en la homología de la secuencia. En general, la estabilidad de un híbrido es función de la concentración de ion sodio y de la temperatura. Típicamente, la reacción de hibridación se lleva a cabo bajo condiciones de rigor más alto, seguida por lavados de rigor variable.

Como se usa en el presente texto, un rigor elevado se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de solamente aquellas secuencias de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en Na^{+} 1 M a 65-68ºC. El máximo rigor tiene lugar típicamente a aproximadamente Tm - 5ºC (5ºC por debajo de la Tm de la sonda).

El rigor elevado tiene lugar a aproximadamente 5ºC a 10ºC por debajo de la Tm de la sonda. Por ejemplo, pueden proporcionarse condiciones de rigor elevado mediante la hibridación en una solución acuosa que contiene 6x SSC, 5x Denhardt, 1% de SDS (dodecil sulfato sódico), 0,1 pirofosfato Na^{+} y 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmón desnaturalizado como competidor no específico. Después de la hibridación, puede hacerse un lavado de rigor elevado en varias etapas, con un lavado final (aproximadamente 30 minutos) a la temperatura de hibridación en 0,2-0,1x SSC, 0,1% de SDS.

El rigor moderado, o intermedio, tiene lugar a aproximadamente 10ºC a 20ºC por debajo de la Tm de la sonda. El rigor moderado se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la solución anteriormente descrita, pero a aproximadamente 60-62ºC. En ese caso el lavado final se realiza la temperatura de hibridación en 1x SSC, 0,1% de SDS.

El rigor bajo tiene lugar típicamente a aproximadamente 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm de la sonda. El rigor bajo se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la solución antes descrita a aproximadamente 50-52ºC. En ese caso, el lavado final se lleva a cabo a la temperatura de hibridación en 2x SSC, 0,1% de SDS.

Como entenderán los expertos en la técnica, puede usarse una hibridación de rigor elevado para identificar o detectar secuencias idénticas de polinucleótidos, mientras que una hibridación de rigor intermedio (o moderado) puede usarse para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos similares o relacionadas.

Se entiende que estas condiciones pueden ser adaptadas y duplicadas usando una diversidad de tampones, p. ej. tampones basados en formamida, y temperaturas. La solución de Denhardt y SSC son bien conocidos por los expertos en la técnica, al igual que otros tampones de hibridación adecuados (véanse, p. ej., Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, EE.UU., o Ausubel et al., ed. (1990) Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.). Las condiciones de hibridación óptimas se han de determinar empíricamente, ya que la longitud y el contenido de GC de la sonda desempeña también un papel.

Los polinucleótidos de la invención capaces de hibridarse selectivamente con las secuencias de nucleótidos presentadas en el presente texto, o con su complemento, serán generalmente al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 95%, lo más preferentemente al menos un 98%, homólogos respecto a las correspondientes secuencias de nucleótidos presentadas en el presente texto, sobre una región de al menos 20, preferentemente al menos 25 ó 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100, o más, nucleótidos contiguos.

La expresión "hibridable selectivamente" significa que el polinucleótido usado como sonda se usa bajo condiciones en las que se observa que un polinucleótido diana de la presente invención se hibrida con la sonda a un nivel significativamente por encima del de fondo. La hibridación de fondo puede ocurrir a causa de otros polinucleótidos presentes, por ejemplo, en la genoteca de cDNA o DNA genómico que se está usando. En tal caso, el fondo supone un nivel de señal generada por interacción entre la sonda y un miembro de DNA no específico de la genoteca, que es menos de 10 veces, preferentemente menos de 100 veces tan intensa como la interacción específica observada con el DNA diana. La intensidad de la interacción puede medirse, por ejemplo, marcando la sonda radiactivamente, por ejemplo con ^{32}P.

En un aspecto preferido, la presente invención cubre secuencias de nucleótido que pueden hibridarse con una cualquiera, o más, de las secuencias de nucleótidos de la presente invención bajo condiciones rigurosas (p. ej. 65ºC y 0,1x SSC).

Secuencias reguladoras

Preferentemente, el polinucleótido de la presente invención está unido operativamente a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificadora, tal como por la célula hospedadora elegida. A título de ejemplo, la presente invención cubre un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención unido operativamente a tal secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.

La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite actuar en la manera pretendida. Una secuencia reguladora "unida operativamente" a una secuencia codificadora está ligada de manera tal que la expresión de la secuencia codificadora se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

La expresión "secuencias reguladoras" incluye promotores e intensificadores, y otras señales de regulación de la expresión. El término "promotor" se usa en el sentido normal en la técnica, p. ej. un sitio de unión de RNA polimerasa.

La intensificación de la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención puede también conseguirse mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, p. ej. región del promotor, guía de secreción y del terminador, que sirven para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés desde el hospedador de expresión elegido, y/o para proporcionar el control inducible de la expresión del polipéptido de la presente invención. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar unida operativamente al menos a un promotor.

Aparte del promotor original respecto al gen que codifica el polipéptido de la presente invención, pueden usarse otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención. El promotor puede seleccionarse por su eficacia para dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención en el hospedador de expresión deseado.

En otra realización, puede elegirse un promotor constituyente para dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención deseado. Tal construcción de expresión puede proporcionar ventajas adicionales ya que soslaya la necesidad de cultivar los hospedadores de expresión en un medio que contiene un sustrato inductor.

Ejemplos de promotores adecuados serían LTR, SV40 y CMV en sistemas de mamíferos; lac o trp de E. coli en sistemas bacterianos; promotor poliedro de baculovirus (polh) en sistemas de insectos, y otros promotores que se sabe que controlan la expresión en células eucarióticas y procarióticas o sus virus.

Los ejemplos de promotores constitutivos y/o inducibles fuertes que son preferidos para ser usados en hospedadores de expresión fúngicos son aquellos que pueden obtenerse a partir de los genes fúngicos para los promotores xilanasa (xlnA), fitasa, ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), \alpha-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG, procedente del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd). Los ejemplos de promotores fuertes de levadura son aquellos que pueden obtenerse a partir de los genes para alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato cinasa y triosafosfato isomerasa.

Ejemplos de promotores bacterianos fuertes son los promotores \alpha-amilasa y SP02, así como promotores procedentes de genes de proteasa extracelular.

También pueden usarse promotores híbridos para mejorar la regulación inducible de la construcción de expresión.

El promotor puede incluir adicionalmente características que aseguren o que aumenten la expresión en un hospedador adecuado. Por ejemplo, las características pueden ser regiones conservadas tales como una caja Pribnow o una caja TATA. El promotor puede incluso contener otras secuencias que afecten (por ejemplo que mantengan, potencien o reduzcan) a los niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, entre otras secuencias adecuadas se incluye el intrón ShI o un intrón ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles, tales como elementos inducibles por la temperatura, la composición química, la luz o el estrés. También pueden estar presentes elementos adecuados para intensificar la transcripción o la traducción. Un ejemplo de estos últimos elementos es la secuencia señal TMV 5' (Sleat, Gene 217 [1987] 217-225; y Dawson, Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).

El vector de expresión puede contener también secuencias que actúan sobre el promotor amplificando la expresión, por ejemplo los elementos de acción cis (intensificadores) SV40, CMV y polioma, y un marcador seleccionable puede proporcionar un rasgo fenotípico para selección (p. ej. dihidrofolato reductasa o resistencia a la neomicina para células de mamíferos o resistencia a la ampicilina/tetraciclina para E. coli). La selección del vector apropiado que contiene el promotor y el marcador de selección apropiados cae dentro del nivel de conocimientos de los expertos en la técnica.

Construcciones

El término "construcción", que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido", incluye la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención unida directa o indirectamente a un promotor. Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo espaciador adecuado tal como una secuencia intrón, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Otro tanto es cierto para el término "fusionado" en relación con la presente invención, que incluye unión directa o indirecta. En cada caso, los términos no cubren la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína asociada normalmente con el promotor del gen de tipo silvestre y cuando están ambos en su entorno natural.

La construcción puede incluso contener o expresar un marcador que permite la selección de la construcción genética en, por ejemplo, células de mamífero, de levadura, de insecto, fúngicas o bacterianas.

Existen varios marcadores que pueden usarse, tales como, por ejemplo, los que proporcionan resistencia a los antiobióticos contra G418, higromicina, bleomicina, kanamicina y gentamicina.

Preferentemente la construcción de la presente invención comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la presente invención unida operativamente a un promotor.

Vectores

El término "vector" incluye vectores de expresión, vectores de transformación, vectores de clonación y vectores lanzadera. El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de expresión "in vivo" o "in vitro".

La expresión "vector de transformación" significa una construcción capaz de ser transferida de una entidad a otra, que puede ser de la misma especie o puede ser de una especie diferente. Si la construcción es capaz de ser transferida desde una especie a otra, por ejemplo desde un vector viral tal como MMLV o FIV a una célula o línea celular primaria humana o de mamífero, entonces el vector de transformación se denomina a veces "vector lanzadera".

Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión en hospedadores diferentes. Por ejemplo, sistemas episomal, cromosómico y derivados de virus (p. ej. vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, virus papova tal como SV40, virus vaccinia, adenovirus y retrovirus).

La secuencia de DNA puede ser insertada en el vector por una diversidad de técnicas. En general la secuencia de DNA se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado por procedimientos conocidos en la técnica y que se consideran al alcance de los expertos en este campo. La secuencia de DNA en el vector de expresión se une operativamente a secuencias de control apropiadas que dirigen la síntesis de mRNA (es decir, el promotor).

Los vectores de la presente invención pueden ser transformados en una célula hospedadora adecuada como se describe más adelante para proporcionar la expresión de un polipéptido de la presente invención. Así, en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar polipéptidos de acuerdo con la presente invención, que comprende cultivar una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió antes, bajo condiciones que proporcionan la expresión por el vector de una secuencia codificadora que codifica los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmido, virus o bacteriófago (fago), provistos de un origen de la replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.

Los vectores de la presente invención pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables. Los sistemas de selección mas adecuados para microorganismos industriales son los formados por el grupo de marcadores de selección que no requieren una mutación en el organismo hospedador. Ejemplos de marcadores fúngicos de selección son los genes para acetamidasa (amdS), ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC), orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa (pvrA), fleomicina y resistencia al benomil (benA). Los ejemplos de marcadores de selección no fúngicos son el gen bacteriano de resistencia a la neomicina (este puede usarse también en células de mamíferos y de levadura, pero no en hongos filamentosos, el gen de la resistencia a la ampicilina (E. coli), y el gen uidA de E. coli, que codifica la glucuronidasa (GUS).

Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producción de RNA o proteína (en sistemas de transcripción/traducción in vitro), o usarse para transfectar o transformar una célula hospedadora.

Así pues, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser incorporados en un vector recombinante (típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Así, en otra realización, la invención proporciona un método para preparar polinucleótidos de la presente invención introduciendo un polinucleótido de la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y desarrollando la célula hospedadora bajo condiciones que producen la replicación del vector. El vector pude ser recuperado de la célula hospedadora. Células hospedadoras adecuadas se describen más adelante en relación con los vectores de expresión.

La presente invención se refiere también al uso de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que expresan un polipéptido PFI-017 o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, en métodos de cribado para la identificación de moduladores (p. ej. antagonistas o agonistas) de PFI-017. Tales células hospedadoras modificadas por ingeniería podrían usarse para cribar librerías de péptidos o moléculas orgánicas capaces de modular la actividad de PFI-017. Los moduladores (p. ej. antagonistas) del polipétido PFI-017, tales como anticuerpos, péptidos o pequeñas moléculas orgánicas, proporcionarán la base para composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades asociadas, por ejemplo, con PFI-017. Tales moduladores (p. ej. antagonistas) pueden ser administrados solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de tales enfermedades.

La presente invención se refiere también a vectores de expresión y células hospedadoras que comprende secuencias de polinucleótido que codifican PFI-017 o una variante, un homólogo, un fragmento, un análogo o un derivado del mismo para la producción in vivo o in vitro de proteína PFI-017 o para cribar agentes que pueden afectar a la expresión o la actividad de PFI-017.

Tejido

El término "tejido", como se usa en el presente texto, incluye tejido tal cual u órgano.

Células hospedadoras

La expresión "célula hospedadora", en relación con la presente invención, incluye cualquier célula que pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante de acuerdo con la presente invención y/o productos obtenidos de la misma, en donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención, cuando está presente en la célula hospedadora.

Así pues, otra realización de la presente invención proporciona células hospedadoras transformadas o transfectadas con un polinucleótido de la presente invención. Preferentemente, dicho polinucleótido es portado en un vector para la replicación y expresión de dicho polinucleótido. Las células se escogerán para que sean compatibles con dicho vector y, por ejemplo, pueden ser procarióticas (por ejemplo células bacterianas), o eucarióticas (es decir, células de mamífero, fúngicas, de insecto y de levadura).

La introducción de polinucleótidos en células hospedadoras puede efectuarse por métodos como los que se describen en Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, EE.UU. Estos métodos incluyen, pero sin limitarse a ellos, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada con DEAE-dextrano, tranfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, microinyección, transducción, carga por raspado e introducción balística.

Los ejemplos de hospedadores representativos incluyen células bacterianas (p. ej. E. coli, Streptomyces), células fúngicas tales como células de levaduras y Aspergillus, células de insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera SF9, células de animales tales como las células CHO, COS, HEK293, HeLa y 3T3. La selección del hospedador apropiado se considera al alcance de los expertos en la técnica.

Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención, y/o si es de desear posterior procesamiento de la proteína expresada, pueden preferirse los hospedadores eucarióticos tales como levaduras u otros hongos. En general, las células de levadura se prefieren sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas o son escasamente expresadas o segregadas de la células de levadura, o bien en algunos casos no son procesadas apropiadamente (p. ej. hiperglicosilación en levadura). En estos casos, debe elegirse un organismo hospedador fúngico diferente.

Ejemplos de hospedadores de expresión adecuados dentro del alcance de la presente invención son hongos tales como las especies de Aspergillus (tal como se describen en los documentos EP-A-0184438 y EP-A-0284603) y las especies de Trichoderma; bacterias tales como las especies de Escherichia, las especies de Streptomyces y las especies de Pseudomonas; y levaduras tales como las especies de Kluyveromyces (tales como las descritas en los documentos EP-A-0096430 y EP-A-0301670) y las especies de Saccharomyces. A título de ejemplo, los hospedadores de expresión típicos pueden elegirse entre Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae.

El uso de células hospedadoras adecuadas, tales como las células hospedadoras de mamífero, levadura, insectos y fúngicas, puede proporcionar modificaciones post-traduccionales (p. ej. miristoilación, glicosilación, truncamiento y fosforilación de tirosina, serina o treonina) como puede ser necesario para conferir actividad biológica óptima en productos de expresión recombinantes de la presente invención.

Organismo

El término "organismo" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo, excepto humano, que pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante de acuerdo con la presente invención, y/o productos obtenidos de la misma, en el que un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención cuando está presente en el organismo. Los ejemplos de organismos incluyen hongos, levaduras o protozoos.

La expresión "organismo transgénico" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo, excepto humano, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de acuerdo con la presente invención, y/o productos obtenidos de la misma, en el que el promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención dentro del organismo. Preferentemente la secuencia de nucleótidos está incorporada en el genoma del organismo.

El organismo transgénico de la presente invención incluye un organismo que comprende una cualquiera, o combinaciones, de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, construcciones de acuerdo con la presente invención (incluyendo combinaciones de las mismas), vectores de acuerdo con la presente invención, plásmido de acuerdo con la presente invención, células de acuerdo con la presente invención, y tejidos de acuerdo con la presente invención, o los productos de los mismos. La célula u organismo transformados podrían preparar cantidades aceptables del compuesto deseado que sería fácilmente recuperable de la célula o del organismo.

Transformación de células hospedadoras/organismos hospedadores

Como se indicó anteriormente, el organismo hospedador puede ser un organismo procariótico o uno eucariótico. Un ejemplo de hospedador procariótico adecuado es E. coli. Las enseñanzas sobre la transformación de hospedadores procarióticos están bien documentadas en la técnica, por ejemplo véanse Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, EE.UU.) y Ausubel et al., (Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons, Inc.).

En una realización preferida, el hospedador transformado es una célula de mamífero o, por ejemplo, una célula de insecto, en la que la introducción de polinucleótidos en dichas células hospedadoras puede ser realizada por métodos como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, EE.UU.). Estos métodos incluyen, pero sin limitarse a ellos, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, microinyección, transducción, carga por raspado e introducción balística.

En otra realización el organismo transgénico puede ser una levadura. En relación con esto, las levaduras han sido también muy utilizadas como vehículo para la expresión génica heteróloga. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene un largo historial de uso industrial, incluyendo su uso para la expresión génica heteróloga. La expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido revisada por Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D. R. Berry et al., ed., pp 401-429, Allen and Unwin, Londres) y por King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton y G. T. Yarronton, ed., pp, 107-133, Blackie, Glasgow). Una revisión de los principios de la expresión génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de los productos génicos viene dada en E. Hinchcliffe y E. Kenny ("Yeast as a vehicle for the expresión of heterologous genes", 1993, Yeasts, Vol. 5, Anthony H. Rose y J. Stuart Harrison, ed., 2ª edición, Academic Press Ltd.). Se dispone de varios tipos de vectores de levadura, incluyendo vectores integradores, que requieren la recombinación con el genoma hospedador para su mantenimiento, y vectores de plásmido que replican de forma autónoma.

Para preparar el Saccharomyces transgénico, se preparan construcciones de expresión insertando la secuencia de nucleótidos de la presente invención en una construcción diseñada para la expresión en levadura. Se han desarrollado varios tipos de construcciones usadas para la expresión heteróloga. Las construcciones contienen un promotor activo en levadura fusionado con la secuencia de nucleótidos de la presente invención, normalmente se usa un promotor originario de levadura, tal como el promotor GAL1. Normalmente se usa una secuencia señal originaria de levadura, tal como la secuencia que codifica el péptido señal SUC2. Un terminador activo en levadura finaliza el sistema de expresión.

Para la transformación de levadura se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, puede prepararse un Saccharomyces transgénico de acuerdo con la presente invención siguiendo las enseñanzas de Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 75: 1929); Beggs, J. D, (1978, Nature, Londres, 275: 104) y Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153: 163-168).

Las células de levadura transformadas se eligen usando varios marcadores selectivos. Entre los marcadores usados para la transformación hay cierto número de marcadores auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores dominantes de resistencia a antibióticos, tales como marcadores del antibiótico aminoglicósido, p. ej. el G418.

Así pues, la presente invención proporciona también un método para transformar una célula hospedadora con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEC ID No: 1 o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma.

Las células hospedadoras transformadas con una secuencia de nucleótidos codificadora de PFI-017 pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada (en membranas de células) del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede ser expresada en la superficie de la célula, segregada, o puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen secuencias codificadoras de PFI-017 permitirán generalmente la expresión en la membrana de la célula. Otras construcciones recombinantes pueden reunir la secuencia codificadora de PFI-017 con una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptido que facilite la purificación e identificación de la proteína (Kroll D. J. et al. (1993) DNA Cell Biol. Vol. 12 p 441-53; véase también la anterior discusión de vectores que contienen proteínas de fusión).

Modificado por ingeniería genética o modificado genéticamente

Una célula, preferentemente una célula animal, que está "modificada genéticamente" es heterocigótica u homocigótica para una modificación que se introduce en la célula, o en una célula progenitora, mediante ingeniería genética. Los métodos estándar de ingeniería genética de los que se dispone para introducir la modificación incluyen recombinación homóloga, trampa génica de vector viral, irradiación, mutagénesis química y la expresión transgénica de una secuencia de nucleótidos que codifica RNA antisentido solo o en combinación con ribozimas catalíticos. Los métodos preferidos para la modificación genética son la recombinación homóloga y la trampa génica de vector viral, que modifican ambos un gen endógeno insertanto una secuencia extraña de ácidos nucleicos en el locus del gen. Una secuencia de ácidos nucleicos que es extraña al gen es una secuencia exógena que no se presenta en el gen de forma natural. Esta inserción de DNA extraño puede ocurrir dentro de cualquier región del gen de PFI-017, p. ej. en un intensificador, un promotor, una región reguladora, una región no codificadora, una región codificadora, un intrón o un exón. El método más preferido de ingeniería genética es la recombinación homóloga, en la que la secuencia extraña de ácidos nucleicos es insertada de manera dirigida a la diana, bien sea sola o en combinación con una deleción de una parte de la secuencia génica endógena.

Interrumpido funcionalmente

Por un gen de PFI-017 que está "interrumpido funcionalmente" se entiende un gen de PFI-017 que está modificado genéticamente de forma que la actividad celular del polipéptido PFI-017 codificado por el gen interrumpido está disminuida en células que normalmente expresan la versión de tipo silvestre del gen de PFI-017. Cuando la modificación genética elimina efectivamente todas las copias de tipo silvestre del gen de PFI-017 en una célula (p. ej. la célula modificada genéticamente, preferentemente una célula animal, es homocigótica para la interrupción del gen de PFI-017 o todas las copias de tipo silvestre del gen de PFI-017 originalmente presentes están ahora interrumpidas), entonces la modificación genética tiene por resultado una reducción de la actividad del polipéptido PFI-017 (es decir, expresión del receptor reducida) en comparación con una célula testigo apropiada que expresa el gen PFI-017 de tipo silvestre. Esta reducción de la actividad del polipéptido PFI-017 (es decir, expresión del receptor reducida) resulta de la expresión reducida del gen PFI-017 (es decir, los niveles de mRNA de PFI-017 están efectivamente reducidos y producen niveles reducidos de polipéptido PFI-017) y/o porque el gen PFI-017 interrumpido codifica un polipéptido mutado con función o estabilidad reducida en comparación con un polipéptido PFI-017 de tipo silvestre. Preferentemente, la actividad (es decir, expresión del receptor reducida) del polipéptido PFI-017 en la célula modificada genéticamente está reducida al 50% o menos de los niveles de la del tipo silvestre, más preferentemente al 25% o menos, e incluso más preferentemente al 10% o menos de los niveles del tipo silvestre. Lo más preferentemente, la interrupción del gen PFI-017 tiene por resultado una mutación nula.

Célula animal modificada genéticamente

Por una "célula animal modificada genéticamente" que contiene un gen PFI-017 funcionalmente interrumpido se entiende una célula animal, incluyendo una célula humana aislada, creada tratándola por ingeniería genética para que contenga un gen PFI-017 funcionalmente interrumpido, así como células hijas que heredan el gen PFI-017 interrumpido. Estas células pueden ser modificadas genéticamente en cultivo de acuerdo con cualquier método estándar conocido en la técnica. Como alternativa a la modificación genética de las células en cultivo, también pueden aislarse células de mamífero no humanas a partir de un mamífero no humano modificado genéticamente que contiene una interrupción del gen PFI-017. Las células animales de la presente invención pueden obtenerse a partir de células primarias o preparados de tejidos, así como de líneas de células adaptadas en cultivo, tumorigénicas o transformadas. Esta células y líneas de células se derivan, por ejemplo, de células endoteliales, células epiteliales, islotes, neuronas y otras células derivadas de tejido nervioso, células mesoteliales, osteocitos, linfocitos, condrocitos, células hematopoyéticas, células inmunitarias, células de las glándulas u órganos principales (p. ej. hígado, pulmón, corazón, estómago, páncreas, riñón y piel), células musculares (incluyendo células del músculo esquelético, músculo liso y músculo cardíaco), células exocrinas o endocrinas, fibroblastos y células madre no humanas embrionarias y otras totipotenciales o pluripotenciales (p. ej. células madre embrionarias (ES: Embryonic Stem cells), células similares a ES y células germinales embrionarias (EG), y otras células madre tales como células progenitoras y células madre derivadas de tejidos). Las células modificadas genéticamente preferidas son las células ES, más preferentemente células ES de ratón o de rata.

Una "región de homología" usada en un vector de direccionamiento para recombinación homóloga con un gen PFI-017 está relacionada (es decir, es complementaria) con una porción del gen PFI-017 o una secuencia que flanquea el gen PFI-017 en un grado suficiente para permitir que tenga lugar la hibridación entre la región de homología y la secuencia génica de PFI-017 en condiciones estándar de rigor bajo conocidas en la técnica (p. ej. como se describe en Current Protocols in Human Genetics, unit 4.1, John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 2000).

Por "célula ES" o "célula similar a, o del tipo ES" se entiende una célula madre pluripotencial derivada de un embrión no humano, de una célula germinativa primordial no humana o de un teratocarcinoma, que es capaz de autorrenovación indefinida así como de diferenciación en tipos de células que son representativas de las tres capas germinativas embrionarias.

Por "reducido" se entiende una disminución estadísticamente significativa (es decir, p<0,1).

Las células animales modificadas genéticamente, incluyendo células humanas aisladas, de la invención son heterocigóticas u homocigóticas para una modificación que interrumpe funcionalmente el gen PFI-017. Las células animales pueden derivarse tratando por ingeniería genética células en cultivo, o, en el caso de células de mamífero no humano, las células pueden ser aisladas de mamíferos no humanos modificados genéticamente.

El locus del gen PFI-017 está interrumpido funcionalmente por una de las diversas técnicas para modificación genética conocidas en este campo, incluyendo mutagénesis química (Rinchik, Trends in Genetics 7: 15-21, 1991, Russell, Environmental and Molecular Mutagenesis 23 (Supl. 24) 23-29, 1994), irradiación (Russell, supra), expresión transgénica de RNA antisentido del gen PFI-017, bien solo o en combinación con una secuencia de ribozima de RNA catalítica (Luyckx et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 12174-79, 1999; Sokol et al., Transgenic Research 5: 363-71, 1996; Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2051-55, 1994; Larsson et al., Nucleic Acids Research 22: 2242-48, 1994) y, como se discute más adelante con mayor detalle, la interrupción del gen PFI-017 por la inserción de una secuencia de ácidos nucleicos extraña en el locus del gen PFI-017. Preferentemente, la secuencia extraña es insertada por recombinación homóloga o por inserción de un vector viral. Lo más preferentemente, el método de interrupción del gen PFI-017 es recombinación homóloga, e incluye una deleción de una porción de la secuencia del gen endógeno de PFI-017.

La integración de la secuencia extraña interrumpe funcionalmente el gen PFI-017 a través de uno o más de los siguientes mecanismos: interfiriendo con el proceso de transcripción o de traducción del gen PFI-017 (p. ej. interfiriendo con el reconocimiento del promotor, o introduciendo un sitio de terminación de la transcripción o un codón de parada de la traducción en el gen PFI-017; o distorsionando la secuencia codificadora del gen PFI-017 de forma que deje de codificar un polipéptido PFI-017 con función normal de receptor (p. ej. insertando una secuencia codificadora extraña en la secuencia codificadora del gen PFI-017, introduciendo una mutación del marco de lectura o sustitución de uno o varios aminoácidos, o, en el caso de un evento de entrecruzamiento doble, borrando una porción de la secuencia codificadora del gen PFI-017 que se requiere para la expresión de una proteína receptora funcional).

Para insertar una secuencia extraña en un locus del gen PFI-017 en el genoma de una célula, se introduce en la célula la secuencia extraña de DNA de acuerdo con un método estándar conocido en la técnica, tal como electroporación, precipitación con fosfato cálcico, infección retroviral, microinyección, biobalística, transfección con liposomas, transfección con DEAE-dextrano, o transferinfección (véanse, p. ej., Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161-65, 1984; Chu et al., Nucleic Acids Res. 15: 1311-26, 1987; Thomas y Capecchi, Cell 51: 503-12, 1987; Baum et al., Biotechniques 17: 1058-62; Biewenga et al., J. Neuroscience Methods 71: 67-75, 1997; Zhang et al., Biotechniques 15: 868-72, 1993; Ray y Gage, Biotechniques 13: 598-603, 1992; Lo, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-14, 1983; Nickoloff et al., Mol. Biotech. 10: 93-101, 1998; Linney et al., Dev. Biol.. (Orlando) 213: 207-16, 1999; Zimmer y Gruss, Nature 338: 150-153, 1989; y Robertson et al., Nature 323: 445-48, 1986). El método preferido para introducir DNA extraño en una célula es la electroporación.

Recombinación homóloga

El método de recombinación homóloga direcciona el gen PFI-017 para la interrupción introduciendo un vector de direccionamiento de PFI-017 en una célula que contiene un gen PFI-017. La capacidad del vector para direccionar el gen PFI-017 para la interrupción procede de usar una secuencia de nucleótidos en el vector que es homóloga respecto de la del gen PFI-017. Esta región de homología facilita la hibridación entre el vector y la secuencia endógena del gen PFI-017. Al hibridarse, la probabilidad de un evento de entrecruzamiento entre el vector de direccionamiento y las secuencias genómicas aumenta en gran medida. Este evento de entrecruzamiento tiene por resultado la integración de la secuencia del vector en el locus del gen de PFI-017 y la interrupción funcional del gen PFI-017.

Los principios generales relativos a la construcción de vectores usados para direccionamiento se revisan en Bradley et al. (Biotechnol. 10: 534, 1992). Pueden usarse dos tipos de ejemplos de vector distintos para insertar DNA por recombinación homóloga; un vector de inserción o un vector de reemplazamiento. Un vector de inserción es DNA circular que contiene una región de homología con el gen PFI-017 con una rotura de la doble hebra. Después de la hibridación entre la región de homología y el gen PFI-017 endógeno, un evento simple de entrecruzamiento en la rotura de la doble hebra tiene por resultado la inserción de la secuencia del vector entera en el gen endógeno en el sitio de entrecruzamiento.

El vector más preferido para ser usado para recombinación homóloga es un vector de reemplazamiento que es colineal en vez de circular. La integración del vector de reemplazamiento en el gen PFI-017 requiere un evento de doble entrecruzamiento, es decir entrecruzamiento en dos sitios de hibridación entre el vector de direccionamiento y el gen PFI-017. Este doble evento de entrecruzamiento tiene por resultado la integración de la secuencia del vector que está emparedada entre los dos sitios de entrecruzamiento en el gen PFI-017 y la deleción de la correspondiente secuencia génica PFI-017 endógena que originalmente se extendía entre los dos sitios de entrecruzamiento (véanse, p. ej. Thomas y Capecchi et al., Cell 51: 503-12, 1987; Mansour et al., Nature 336: 348-52, 1988; Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7688-7692, 1990; y Mansour, GATA 7: 219-227, 1990).

Una región de homología en un vector de direccionamiento es generalmente de al menos 100 nucleótidos de longitud. Lo más preferentemente, la región de homología es al menos de 1 a 5 kilobases (Kb) de longitud. Aunque no se ha demostrado una longitud mínima o un grado mínimo de relación requerido para una región de homología, la eficiencia de direccionamiento para la recombinación homóloga se corresponde generalmente con la longitud y el grado de relación entre el vector de direccionamiento y el locus del gen PFI-017. En el caso en que se use un vector de reemplazamiento, y una parte del gen PFI-017 endógeno se borre al tener lugar la recombinación homóloga, una consideración adicional es el tamaño de la parte borrada del gen PFI-017 endógeno. Si esta parte del gen PFI-017 endógeno tiene una longitud mayor que 1 Kb, se recomienda entonces una casete de direccionamiento con regiones de homología que son más largas que 1 Kb para mejorar la eficiencia de recombinación. Otras recomendaciones relativas a la selección y el uso de secuencias efectivas para recombinación homóloga se describen en la bibliografía (véanse, p. ej., Deng y Capecchi, Mol. Cell. Biol.. 12: 3365-3371, 1992; Bollag et al., Annu. Rev. Genet. 23: 199-225, 1989; y Waldman y Liskay, Mol. Cell. Biol. 8: 5350-5357, 1988).

Puede usarse una gran variedad de vectores de clonación como esqueletos de vectores en la construcción de vectores de direccionamiento del gen PFI-017, incluyendo plásmidos relacionados con pBluescript (p. ej. pBluescript KS+11), pQE70, pQE60, pQE-9, pBS, pD10, phagescript, phi-X-174, pBK Phagemid, pNH8A, pNH16a, pNH18Z, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 PWLNEO, pSV2CAT, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, PBPV, PMSG y pSVL, PBR322 y vectores basados en PBR322, pBM9, PBR325, pKH47, pBR328, pHC79, fago Charon 28, pKB11, pKSV-10, plásmidos relacionados con pK19, plásmidos pUC, y la serie pGEM de plásmidos. Estos vectores están disponibles en una gran variedad de fuentes comerciales (p. ej. Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN; Qiagen, Valencia, CA; Stratagene, La Jolla, CA; Promega, Madison, WI; y New England Biolabs, Beverly, MA). Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector, p. ej. plásmidos, virus o partes de los mismos, siempre y cuando sea replicable y viable en el hospedador deseado. El vector puede comprender también secuencias que le permitan replicarse en el hospedador cuyo genoma se va a modificar. El uso de tal vector puede agrandar el periodo de interacción durante el cual puede tener lugar la recombinación, aumentando la eficacia del direccionamiento (véase Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Unit 9.16, Fig. 9.16.1).

El hospedador específico empleado para propagar los vectores de direccionamiento descritos antes no es crítico. Los ejemplos incluyen E. coli K12 RR1 (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977), E. coli K12 HB101 (ATCC nº 33694), E. coli MM21 (ATCC nº 336780), E. coli DH1 (ATCC nº 33849), E. coli cepa DH5\alpha, y E. coli STBL2. Alternativamente, pueden usarse hospedadores tales como S. cerevisiae. Los hospedadores anteriormente mencionados son disponibles comercialmente (p. ej. Stratagene, La Jolla, CA; y Life Technologies, Rockville, MD).

Para crear el vector de direccionamiento, se añade una construcción de direccionamiento del gen PFI-017 al esqueleto del vector antes mencionado. Los construcciones de direccionamiento del gen PFI-017 descritas antes tienen al menos una región de homología del gen PFI-017. Para hacer las regiones de homología del gen PFI-017 se usa una secuencia relacionada con el gen PFI-017 como base para producir cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos cebadores se usan para amplificar o multiplicar la región deseada de la secuencia de PFI-017 mediante amplificación por PCR de alta fidelidad (Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967, 1991; Eckert y Kunkel 1: 17, 1991; y patente de EE.UU. nº 4.683.202). La secuencia genómica se obtiene a partir de una genoteca de clones genómicos o de una preparación de DNA genómico, preferentemente procedente de la especie animal que se va a direccionar para la interrupción del gen PFI-017.

Preferentemente, las construcciones de direccionamiento descritas antes incluyen también una secuencia de nucleótidos exógena que codifica una proteína marcador positivo. La expresión estable de un marcador positivo después de la integración del vector confiere una característica identificable en la célula sin comprometer la viabilidad de la misma. Por consiguiente, en el caso de un vector de reemplazamiento, el gen marcador se sitúa entre dos regiones de homología flanqueantes de forma que se integra en el gen PFI-017 después del evento de doble entrecruzamiento.

Se prefiere que la proteína marcador positivo sea una proteína seleccionable; la expresión estable de tal proteína en una célula confiere una característica fenotípica seleccionable, es decir, la característica intensifica la supervivencia de la célula bajo condiciones que, de otra forma, serían letales. Así, imponiendo la condición seleccionable se pueden aislar células que expresan establemente el marcador seleccionable positivo sobre la base de la viabilidad. Los ejemplos de proteínas marcador seleccionable positivo (y sus agentes de selección) incluyen Neo (G148 o kanamicina), Hyg (higromicina), HisD (histidinol), Gpt (xantina), Ble (bleomicina) y Hprt (hipoxantina) (véanse, p. ej., Capecchi y Thomas, patente de EE.UU. nº 5.464.764, y Capecchi, Science 244: 1288-92, 1989). Otros marcadores positivos que también pueden usarse como alternativa para un marcador seleccionable incluyen proteínas informadoras ("reporter") tales como \beta-galactosidasa, luciferasa de la luciérnaga o proteína fluorescente verde (véanse, p. ej., Current Protocols in Cytometry, Unit 9.5, y Current Protocols in Molecular Biology, Unit 9.6, John Wiley ans Sons, Nueva York, NY, 2000).

El esquema de selección positiva anteriormente descrito no distingue entre células que han integrado el vector por recombinación homóloga direccionada en el locus del gen PFI-017, frente a la integración aleatoria no homóloga de la secuencia vectora en cualquier posición cromo somática. Por tanto, cuando se usa un vector de reemplazamiento para la recombinación homóloga, se prefiere también incluir una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína marcador seleccionable negativo. La expresión de un marcador seleccionable negativo hace que una célula que exprese el marcador pierda viabilidad cuando se expone a un determinado agente (esto es, la proteína marcadora se hace letal para la célula bajo ciertas condiciones seleccionables). Los ejemplos de marcadores seleccionables negativos (y sus agentes de letalidad) incluyen timidina cinasa del virus herpes simplex (gancyclovir o 1,2-desoxi-2-fluoro-\alpha-d-arabinofuranosil-5-yodouracilo), Hprt (6-tioguanina o 6-tioxantina) y toxina de difteria, toxina ricina y citosina desaminasa (5-fluorocitosina).

La secuencia de nucleótidos que codifica el marcador seleccionable negativo se sitúa fuera de las dos regiones de homología del vector de reemplazamiento. Dada esta posición, las células solamente integrarán y expresarán establemente el marcador seleccionable negativo si la integración ocurre por recombinación aleatoria no homóloga; la recombinación homóloga entre el gen PFI-017 y las dos regiones de homología en la construcción de direccionamiento excluye de la integración la secuencia que codifica el marcador seleccionable negativo. Así, imponiendo la condición negativa, las células que han integrado el vector de direccionamiento por recombinación aleatoria no homóloga pierden viabilidad.

La combinación antes descrita de marcadores seleccionables positivos y negativos se prefiere porque puede diseñarse una serie de pasos de selección positiva y negativa para seleccionar más eficientemente solamente aquellas células que han experimentado la integración del vector por recombinación homóloga y, por tanto, tienen un gen PFI-017 potencialmente interrumpido. Otros ejemplos de esquemas de selección positiva-negativa, marcadores seleccionables y construcciones de direccionamiento se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.464.764, el documento WO 94/06908, y en Valancius y Smithies, Mol. Cell. Biol.. 11: 1402, 1991.

Para que una proteína marcadora se exprese establemente al integrarse el vector, el vector de direccionamiento puede ser diseñado de forma que la secuencia codificadora del marcador esté unida operativamente al promotor del gen PFI-017 endógeno al tener lugar la integración del vector. La expresión del marcador es después impulsada por el promotor del gen PFI-017 en células que expresan normalmente el gen PFI-017. Alternativamente, cada marcador en la construcción de direccionamiento del vector puede contener su propio promotor que impulsa la expresión independientemente del promotor del gen PFI-017. Este último esquema tiene la ventaja de permitir la expresión de marcadores en células que típicamente no expresan el gen PFI-017 (Smith y Berg, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 49: 171, 1984; Sedivy y Sharp, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 227: 1989; Thomas y Capecchi, Cel 51: 503, 1987).

Los promotores exógenos que pueden ser usados para impulsar la expresión génica del marcador incluyen promotores específicos de la célula o específicos de la etapa, promotores constitutivos, y promotores inducibles o regulables. Los ejemplos no limitantes de estos promotores incluyen el promotor de timidina cinasa del herpes simplex, promotor/intensificador del citomegalovirus (CMV), promotores SV40, promotor PGK, PMC1-neo, promotor de metalotioneína, promotor tardío del adenovirus, promotor 7,5K del virus vaccinia, promotor de beta globina aviar, promotores de histona (p. ej. histona H3-614 de ratón), promotor de beta actina, enolasa específica de las neuronas, promotor de actina del músculo, y el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (véase de un modo general, Sambrook et al., Molecular Cloning, vol. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 2000; Stratagene, La Jolla, CA).

Para confirmar si las células han integrado la secuencia vectora en el locus del gen PFI-017 direccionado, pueden usarse cebadores o sondas genómicas que son específicas para el evento de integración del vector deseada, en combinación con PCR o análisis de transferencia Southern para identificar la presencia de la integración del vector deseada en el locus del gen PFI-017 (Erlich et al., Science 252: 1643-51, 1991; Zimmer y Gruss, Nature 338: 150, 1989; Mouellic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 4712, 1990; y Shesely et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 4294, 1991).

Trampa de genes

Otro método disponible para insertar una secuencia extraña de ácido nucleico en el locus del gen PFI-017 para interrumpir funcionalmente el gen PFI-017, es la trampa de genes. Este método se aprovecha de la maquinaria celular presente en todas las células de mamífero, que corta y empalma exones en mRNA para insertar en un gen una secuencia codificadora de un vector de trampa de genes, de una forma aleatoria. Una vez insertado, el vector trampa de genes crea una mutación que puede interrumpir funcionalmente el gen PFI-017 atrapado. Al contrario que la recombinación homóloga, este sistema de mutagénesis crea mutaciones muy aleatorias. Así, para obtener una célula modificada genéticamente que contiene un gen PFI-017 interrumpido funcionalmente, han de identificarse células que contienen esta mutación en particular y seleccionarlas entre un conjunto de células que contienen mutaciones aleatorias en una diversidad de genes.

Se han descrito sistemas de trampa de genes y vectores para ser usados para modificar genéticamente células murinas y otros tipos de células (véanse, p. ej., Allen et al., Nature 333: 852-55, 1988; Bellen et al., Genes Dev. 3: 1288-1300, 1989; Bier et al., Genes Dev. 3: 1273-1287, 1989; Bonnerot et al., J. Virol. 66: 4982-91; Brenner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 5517-21, 1989; Chang et al., Virology 193: 737-47, 1993; Friedrich y Soriano, Methods Enzymol. 225: 681-701, 1993; Friedrich y Soriano, Genes Dev. 5: 1513-23, 1991; Goff, Methods Enzymol. 152: 469-81, 1987; Gossler et al., Science 244: 463-65, 1989; Hope, Develop. 113: 399-408, 1991; Kerr et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2: 767-776, 1989; Reddy et al., J. Virol. 65: 1507-1515, 1991; Reddy et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 6721-25, 1992; Skarnes et al., Genes Dev. 6: 903-918, 1992; von Melchner y Ruley, J. Virol. 63: 3227-3233, 1989; y Yoshida et al., Transgen. Res. 4: 277-87, 1995).

Los vectores trampa del promotor (trampa 5') contienen, en orden 5' a 3', una secuencia aceptora de ayuste seguida por un exón, que está caracterizada típicamente por un codón de iniciación de la traducción y marco de lectura abierto (ORF) y/o un sitio interno de entrada al ribosoma. En general, estos vectores trampa de promotor no contienen promotores ni secuencias donadoras de ayuste enlazadas operativamente. En consecuencia, después de la integración en el genoma celular de la célula hospedadora, la secuencia del vector trampa del promotor intercepta el ayuste normal del gen secuencia arriba y actúa como un exón terminal. La expresión de la secuencia codificadora del vector es dependiente del vector que se integra en un intrón del gen interrumpido en el marco de lectura apropiado. En tal caso, la maquinaria celular de ayuste corta y empalma exones del gen atrapado secuencia arriba de la secuencia codificadora del vector (Zambrowicz et al., WO 99/50426).

Un método alternativo para producir un efecto similar al vector trampa de promotor anteriormente descrito es un vector que incorpora un juego anidado de codones de parada presente, o si no construido por ingeniería genética, en la región entre el aceptor de ayuste del vector trampa del promotor y el codón de iniciación de la traducción o secuencia de poliadenilación. La secuencia de codificación puede ser también construida por ingeniería genética para que contenga un sitio independiente de entrada al ribosoma (IRES: Independent Ribosome Entry Site) de forma que la secuencia de codificación se expresará de una manera en gran medida independiente del sitio de integración dentro del genoma de la célula hospedadora. Típicamente, pero no necesariamente, se usa un IRES junto con un conjunto anidado de codones de parada.

Otro tipo de esquema de atrapamiento de genes utiliza un vector trampa de genes 3'. Este tipo de vector contiene, en combinación operativa, una región promotora, que media en la expresión de una secuencia de codificación contigua, la secuencia de codificación, y una secuencia donadora de ayuste que define el extremo 3' del exón de la secuencia codificadora. Después de la integración en el genoma de una célula hospedadora, el transcrito expresado por el promotor del vector es empalmado a una secuencia aceptora de ayuste a partir del gen atrapado que está situado secuencia abajo de la secuencia del vector trampa de genes integrado. Así, la integración del vector tiene por resultado la expresión de un transcrito de fusión que comprende la secuencia de codificación de la casete trampa de genes 3' y cualquier exón celular secuencia abajo, incluyendo el exón terminal y su señal de poliadenilación. Cuando tales vectores se integran en un gen, la maquinaria celular de ayuste empalma la secuencia codificadora del vector secuencia arriba de los exones 3' del gen atrapado. Una ventaja de tales vectores es que la expresión de los vectores trampa de genes 3' está impulsada por un promotor en el interior de la casete de trampa de genes y no requiere integración en un gen que sea expresado normalmente en la célula hospedadora (Zambrowicz et al., WO 99/50426). Los ejemplos de promotores transcripcionales e intensificadores que pueden incorporarse al vector trampa de genes 3' incluyen los que se han discutido anteriormente con respecto a vectores de direccionamiento.

El esqueleto del vector viral usado como componente estructural para el promotor o vector trampa de genes 3' puede elegirse entre una variedad de vectores que pueden ser insertados en el genoma de una célula diana. Los vectores esqueleto adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, vectores de virus del herpes simples, vectores de adenovirus, vectores de virus adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, virus de la pseudorrabia, vectores de virus de alfa-herpes, y similares. Puede encontrarse una revisión minuciosa de los vectores virales, en particular vectores virales adecuados para modificar células no replicantes, y de cómo usar estos vectores junto con la expresión de una secuencia de polinucleótidos exógena, en Viral Vectors; Gene Therapy and Neuroscience Applications, Ed. Caplitt y Loewy, Academic Press, San Diego, 1995.

Preferentemente se usan vectores retrovirales para el atrapamiento de genes. Estos vectores pueden ser usados junto con líneas de células de empaquetamiento retrovirales tales como las descritas en la patente de EE.UU. nº 5.449.614. Cuando se usan células de mamífero no murino como célula diana para la modificación genética, pueden usarse líneas de células de empaquetamiento anfotrópicas o pantrópicas para empaquetar los vectores adecuados (Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93; 11400-11406, 1996). Vectores retrovirales representativos que pueden ser adaptados para crear los vectores trampa de genes 3' descritos actualmente, se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.521.076.

Los vectores trampa de genes pueden contener uno o más de los genes marcadores positivos discutidos anteriormente en relación con los vectores de direccionamiento usados para la recombinación homóloga. Al igual que su uso en vectores de direccionamiento, estos marcadores positivos se usan en vectores trampa de genes para identificar y seleccionar células que han integrado el vector en el genoma celular. El gen marcador puede ser construido para que contenga un sitio independiente de entrada al ribosoma (IRES) de forma que el marcador se exprese de manera independiente en gran medida de la posición en la que el vector se ha integrado en el genoma de la célula
diana.

Dado que los vectores trampa del gen se integrarán en el genoma de células hospedadoras infectadas, de una manera completamente aleatoria, una célula modificada genéticamente que tiene un gen PFI-017 interrumpido ha de ser identificada entre una población de células que han experimentado la integración aleatoria del vector. Preferentemente, las modificaciones genéticas en la población de células son de aleatoriedad y frecuencia suficientes como para que la población represente mutaciones en esencialmente cada gen que se encuentra en el genoma de la célula, haciendo probable que se identifique entre la población una célula con un gen PFI-017 interrumpido (véanse Zambrowicz et al., WO 99/50426; Sands et al., WO 98/14614).

Las líneas de células mutantes que contienen un gen PFI-017 interrumpido se identifican en una población de células mutadas usando, por ejemplo, transcripción inversa y PCR (RT-PCR) para identificar una mutación en una secuencia del gen PFI-017. Este proceso puede hacerse más eficiente agrupando clones. Por ejemplo, para encontrar un clon individual que contiene un gen PFI-017 interrumpido, se realiza la RT-PCR usando un cebador anclado en el vector trampa del gen y el otro cebador situado en la secuencia del gen PFI-017. Un resultado positivo de la RT-PCR indica que la secuencia del vector está codificada en el transcrito del gen PFI-017, indicando que el gen PFI-017 ha sido interrumpido por un evento de integración de la trampa de genes (véase, por ejemplo, Sands et al., WO 98/14614).

Interrupciones de genes temporales, espaciales e inducibles

Una interrupción funcional del gen PFI-017 endógeno puede ocurrir en etapas de desarrollo o ciclos celulares específicos (interrupción temporal) o en tipos de células concretos (interrupción espacial). La interrupción del gen PFI-017 puede ser también inducible cuando están presentes determinadas condiciones. Puede usarse un sistema de escisión de recombinasa, tal como un sistema Cre-Lox, para activar o inactivar el gen PFI-017 en una etapa del desarrollo específica, en un tipo particular de tejido o de célula, o bajo condiciones particulares del entorno. Generalmente, se llevan a cabo métodos que utilizan la tecnología de Cre-Lox, como se describe en Torres y Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997. También puede utilizarse una metodología similar a la descrita para el sistema Cre-Lox utilizando el sistema FLP-FRT. Se proporcionan más indicaciones relativas al uso de sistemas de escisión con recombinasa para interrumpir genes condicionalmente por recombinación homóloga o inserción viral, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.626.159, patente de EE.UU. nº 5.527.695, patente de EE.UU. nº 5.434.066, documento WO 98/29533, Orban et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 6861-65, 1992; O'Gorman et al., Science 251: 1321-55, 1991; Sauer et al., Nucleic Acids Research 17: 147-61, 1989; Barinaga, Science 265: 26-28, 1994; y Akagi et al., Nucleic Acids Res. 25: 1766-73, 1997. Puede usarse más de un sistema de recombinasa para modificar genéticamente una célula animal.

Cuando se usa recombinación homóloga para interrumpir el gen PFI-017 de un modo temporal, espacial o inducible, usando un sistema de recombinasa tal como el sistema Cre-Lox, una parte de la región de codificación del gen PFI-017 es reemplazada por una construcción de direccionamiento que comprende la región de codificación del gen PFI-017 flanqueada por sitios loxP. Las células animales que llevan esta modificación genética contienen un gen funcional PFI-017 flanqueado por loxP. El aspecto temporal, espacial o inducible de la interrupción del gen PFI-017 es causado por el patrón de expresión de un transgén adicional, un transgén de recombinasa Cre, que se expresa en la célula animal bajo el control del promotor deseado regulado espacialmente, regulado temporalmente o inducible, repectivamente. Una recombinasa Cre direcciona los sitios loxP para la recombinación. Por consiguiente, cuando se activa la expresión de Cre, los sitios loxP experimentan recombinación para escindir la secuencia de codificación del gen PFI-017 emparedada, dando por resultado una interrupción funcional del gen PFI-017 (Rajewski et al., J. Clin. Invest. 98: 600-03, 1996; St.-Onge et al., Nucleic Acids Res. 24: 3875-77, 1996; Agah et al., J. Cli. Invest. 100; 169-79, 1997; Brocard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14559-73, 1997; Feil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10887-90, 1996; y Kühn et al., Science 269: 1427-29, 1995).

Puede generarse una célula que contiene tanto un trasgén de recombinasa Cre como un gen PFI-017 flanqueado por loxP, mediante técnicas trasgénicas estándar. Otras indicaciones relativas al uso de promotores específicos para los sistemas de recombinasa para interrumpir el gen PFI-017 temporalmente, espacialmente o condicionalmente se encuentran, por ejemplo, en Sauer, Meth. Enz. 225: 890-900, 1993, Gu et al., Science 265:103-06, 1994, Araki et al., J. Biochem. 122: 977-82, 1997, Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6191-96, 1996, y Meyers et al., Nature Genetics 18: 136-41, 1998.

Una interrupción inducible del gen PFI-017 puede conseguirse también usando un sistema binario con respuesta a la tetraciclina (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51, 1992). Este sistema implica modificar genéticamente una célula para introducir un promotor Tet en el elemento regulador del gen PFI-017 endógeno y un trasgén que expresa un represor controlable por tetraciclina (TetR). En tal célula, la administración de tetraciclina activa el TetR que, a su vez, inhibe la expresión del gen PFI-017 y, por consiguiente, interrumpe funcionalmente el gen PFI-017 (St-Onge et al., Nucleic Acids Res. 24: 3875-77, 1996, patente de EE.UU. nº 5.922.927).

Los sistemas anteriormente descritos para interrupciones temporal, espacial e inducible del gen PFI-017 pueden adoptarse también cuando se usa la trampa de genes como método de modificación genética, por ejemplo, como se describe en el documento WO 98/29533.

Creación de células animales modificadas genéticamente

Los métodos de modificación genética antes descritos pueden ser usados para interrumpir funcionalmente un gen PFI-017 en prácticamente cualquier tipo de célula somática o célula madre derivada de un animal. Las células animales modificadas genéticamente de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellas, células de mamífero, incluyendo células humanas, y células de ave. Estas células pueden derivarse de la ingeniería genética de cualquier línea de células animales, tales como líneas de células adaptadas en cultivo, tumorigénicas o transformadas, o pueden ser aisladas de un mamífero no humano modificado genéticamente, que lleve la modificación genética de PFI-017 deseada.

Las células pueden ser heterocigóticas u homocigóticas para el gen PFI-017 interrumpido. Para obtener células que son homocigóticas para la interrupción del gen PFI-017 (PFI-017-/-), puede realizarse el direccionamiento directo secuencial de ambos alelos. Este proceso puede facilitarse reciclando un marcador seleccionable positivo. De acuerdo con este esquema, la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador seleccionable positivo es elimina después de la interrupción de un alelo usando el sistema Cre-Lox P. Así, el mismo vector puede ser usado en una posterior ronda de direccionamiento para interrumpir el segundo alelo del gen PFI-017 (Abuin y Bradley, Mol. Cell. Biol. 16: 1851-56, 1996; Sedivy et al., T.I.G. 15: 88-90, 1999; Cruz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7170-74, 1991; Mortensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7036-40, 1991; te Riele et al., Nature 348: 649-651, 1990).

Una estrategia alternativa para obtener células ES no humanas que son PFI-017-/- es la homogenotización de células a partir de una población de células que es heterocigótica para la interrupción del gen PFI-017 (PFI-017+/-). El método utiliza un esquema en el que se seleccionan clones direccionados de PFI-017+/- que expresan un marcador seleccionable de resistencia a un fármaco frente a una concentración de fármaco muy elevada; esta selección favorece a las células que expresan dos copias de la secuencia que codifica el marcador de la resistencia al fármaco y son, por tanto, homocigóticos para la interrupción del gen PFI-017 (Mortensen et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2391-95, 1992).

Después de la modificación genética de la célula o línea celular deseada, el locus del gen PFI-017 puede ser confirmado como sitio de modificación por análisis de PCR de acuerdo con métodos estándar de PCR o de transferencia Southern conocidos en la técnica (véanse, p. ej., la patente de EE.UU. nº 4.683.292; y Erlich et al., Science 252: 1643, 1991). También puede hacerse una posterior verificación de la interrupción funcional del gen PFI-017 si los niveles de RNA mensajero (mRNA) del gen PFI-017 y/o los niveles de polipéptido PFI-017 están reducidos en las células que normalmente expresan el gen PFI-017. Pueden obtenerse medidas de los niveles de mRNA del gen PFI-017 usando la reacción en cadena de la polimerasa mediada por transcriptasa inversa (RT-PCR), análisis de transferencia Northern o hibridación in situ. La cuantificación de los niveles de polipéptido PFI-017 producido por las células puede hacerse, por ejemplo, por métodos estándar de inmunoensayo conocidos en la técnica. Tales inmunoensayos incluyen, pero sin limitarse a ellos, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorbente ligado a una enzima), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcadores enzimáticos o de radioisótopos, por ejemplo), transferencias Western, análisis en gel bidimensional, reacciones de precipitación, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis.

Las células animales modificadas genéticamente preferidas son las células madre embrionarias (ES) no humanas y células del tipo ES. Estas células se derivan de la preimplantación de embriones y blastocitos de varias especies, tales como ratones (Evans et al., Nature 129: 154-156, 1981); Martin, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78: 7635-7638, 1981), cerdos y ovejas (Notanianni et al., J. Reprod. Fert. Suppl., 43: 255-260, 1991; Campbell et al., Nature 380: 64-68, 1996) y primates (Thomson et al., patente de EE.UU. nº 5.843.780, Thomson et al., Science 282: 1145-1147, 1995; y Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848, 1995).

Estos tipos de células son pluripotenciales. Es decir, bajo las condiciones apropiadas, se diferencian en una amplia variedad de tipos de células derivados de las tres capas germinales embrionarias: ectodermo, mesodermo y endodermo. Dependiendo de las condiciones de cultivo, puede cultivarse indefinidamente una muestra de células ES como células madre, permitiendo que se diferencien en una amplia variedad de tipos distintos de células dentro de una célula individual, o dirigiéndolas a diferenciarse en un tipo de célula específico, tal como células similares a los macrófagos, células neuronales, cardiomiocitos, adipocitos, células del músculo liso, células endoteliales, células del músculo esquelético, queratinocitos, y células hematopoyéticas, tales como eosinófilos, mastocitos, células progenitoras eritroides, o megacariocitos. La diferenciación dirigida se realiza incluyendo factores de crecimiento específicos o componentes matriz en las condiciones de cultivo, como se describe con más detalle, por ejemplo, en Keller et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7: 862-69, 1995, Li et al., Curr. Biol. 8: 971, 1998, Klug et al., J. Clin. Invest. 98: 216-24, 1996, Lieschke et al., Exp. Hematol. 23: 328-34, 1995, Yamane et al., Blood 90: 3516-23, 1997, y Hirashima et al., Blood 93: 1253-63, 1999.

La línea particular de células madre embrionarias que se usa para modificación genética no es crítica; los ejemplos de líneas de células ES murinas incluyen AB-1 (McMahon y Bradley, Cell 62: 1073-85, 1990), E14 (Hooper et al., Nature 326: 292-95, 1987), D3 (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-45, 1985), CCE (Robertson et al., Nature 323: 445-48, 1986), RW4 (Genome Systems, St. Louis, MO) y DBA/1lacJ (Roach et al., Exp. Cell Res. 221: 520-25, 1995).

Producción del polipeptido

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la presente invención puede llevarse a cabo mediante el cultivo de hospedadores de expresión eucarióticos o procarióticos, que han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio nutriente de fermentación convencional. La selección del medio apropiado puede basarse en la elección de los hospedadores de expresión y/o basarse en los requerimientos reguladores de la construcción de expresión. Tales medios son bien conocidos por los expertos en la técnica. Si se desea, el medio puede contener componentes adicionales que favorezcan a los hospedadores de expresión transformados, sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

Así pues, la presente invención proporciona también un método para producir un polipéptido que tiene actividad de PFI-017, comprendiendo el método las etapas de (a) transformar una célula hospedadora con una secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID No: 1 o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo; y (b) cultivar la célula hospedadora transformada, bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido.

La presente invención se refiere también a un método para producir un polipéptido que tiene actividad de PFI-017, comprendiendo el método las etapas de (a) cultivar una célula hospedadora que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEC ID No: 1 o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido; y (b) recuperar dicho polipéptido del cultivo de células hospedadoras.

La presente invención se refiere también a un método para producir un polipéptido que tiene actividad de PFI-017, comprendiendo el método las etapas de (a) transformar una célula hospedadora con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEC ID No: 1 o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo; (b) cultivar la célula hospedadora transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido; y (c) recuperar dicho polipéptido del cultivo de células hospedadoras.

Ribozimas

Las ribozimas son moléculas de RNA enzimáticas capaces de catalizar la segmentación específica de RNA. El mecanismo de la acción de las ribozimas implica la hibridación, específica para la secuencia, de la molécula de ribozima con RNA diana complementario, seguida por segmentación endonucleolítica. Dentro del alcance de la presente invención están moléculas construidas por ingeniería genética de ribozima de motivo "cabeza de martillo" que catalizan de forma específica y eficiente la segmentación endonucleolítica de secuencias de RNA de PFI-017.

Los sitios específicos de segmentación de la ribozima dentro de cualquier diana potencial de RNA se identifican inicialmente explorando la molécula diana en relación con sitios de segmentación de la ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, pueden evaluarse secuencias cortas de DNA de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del gen diana que contiene el sitio de segmentación en relación con características estructurales secundarias que pueden hacer inoperante a la secuencia oligonucleotídica. La adecuación de las dianas candidatas puede ser también evaluada probando la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasa.

Tanto las moléculas antisentido de RNA y DNA como las ribozimas de la presente invención pueden ser preparadas por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de ácidos nucleicos. Estos métodos incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligonucleótidos, tales como síntesis química en fase sólida con fosforamidita. Alternativamente, pueden generarse moléculas de RNA por transcripción in vitro o in vivo de secuencias de DNA que codifican la molécula de RNA antisentido. Tales secuencias de DNA pueden ser incorporadas en una amplia variedad de vectores con promotores de RNA polimerasa adecuados tales como T7 o SP6. Alternativamente, pueden introducirse construcciones de cDNA antisentido que sintetizan RNA antisentido constitutivamente o induciblemente, en las líneas de células, las células o los tejidos.

Detección

La presencia de la secuencia de codificación del polinucleótido PFI-017 puede ser detectada mediante hibridación de DNA-DNA o DNA-RNA o amplificación usando sondas, porciones o fragmentos de la secuencia presentada en SEQ ID Nº: 1. Los ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de oligonucleótidos u oligómeros basados en la secuencia de codificación de PFI-017 para detectar transformantes que contienen DNA o RNA de PFI-017. Como se usa en el presente texto, "oligonucleótidos" u "oligómeros" pueden referirse a una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y como mucho aproximadamente 60 nucleótidos, preferentemente aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos, y más preferentemente aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, que puede usarse como sonda o amplímero. Preferentemente, los oligonucleótidos se derivan de la región 3' de la secuencia de nu cleótidos mostrada en SEQ ID Nº: 1.

Se conocen en la técnica una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión del polipéptido PFI-017, como por ejemplo usando anticuerpos bien sea policlonales o bien monoclonales, específicos para la proteína. Los ejemplos incluyen el ensayo en inmunosorbente ligado a una enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo de base monoclonal, de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos para dos epítopos no interferentes en un polipéptido PFI-017, pero también puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen, entre otras publicaciones, en Hampton R et al. (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Pres, St. Paul, MN, EE.UU.) y Maddox DE et al. (1983, J. Exp. Med. 15, 8: 1211).

Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden usarse en varios ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir la hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias de polinucleótidos de PFI-017 incluyen oligomarcaje, traslación de mella, marcaje final o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, la secuencia de codificación de PFI-017, o cualquier parte de ella, puede ser clonada en un vector para la producción de una sonda de mRNA. Tales vectores son conocidos en la técnica, son disponibles comercialmente, y pueden usarse para sintetizar sondas de RNA in vitro mediante la adición de una RNA polimerasa apropiada, tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados.

Hay varias firmas, como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA), Promega (Madison, WI, USA) y US Biochemical Corporation (Cleveland, OH, USA) que suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos. Las moléculas informadoras (repórter) o marcadores adecuados incluyen los radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Entre las patentes que enseñan el uso de tales marcadores se incluyen los documentos US-A-3817837, US-A-3850752, US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 y US-A-4366241. También pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes como se indica en el documento US-A-4816567.

Otros métodos para cuantificar la expresión de una molécula en particular incluyen el radiomarcaje (Melby PC et al., 1993, J. Immunol. Methods Vol. 159 p 235-44) o nucleótidos de biotinilación (Duplaa C et al., 1993, Anal Biochem Vol 229 p36), co-amplificación de un ácido nucleico de control, y curvas patrón en las que se interpolan los resultados experimentales. La cuantificación de muestras múltiples puede ser acelerada realizando el ensayo en un formato ELISA en el que el oligómero de interés se presenta en varias diluciones y una respuesta espectrofotométrica o colorimétrica da una cuantificación rápida.

Aunque la presencia/ausencia de expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés está también presente, su presencia y su expresión han de ser confirmadas. Por ejemplo, si la secuencia de codificación de PFI-017 se inserta dentro de una secuencia del gen marcador, las células recombinantes que contienen regiones de codificación de PFI-017 pueden ser identificadas por la ausencia de función del gen marcador. Alternativamente, puede ponerse en tándem un gen marcador con una secuencia codificadora de PFI-017 bajo el control de un único promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección indica normalmente también la expresión de PFI-017.

Alternativamente, las células hospedadoras que contienen la secuencia de codificación de PFI-017 y expresan regiones de codificación de PFI-017 pueden ser identificadas por una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a ellos, hibridación DNA-DNA o DNA-RNA, y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas que incluyen tecnologías basadas en membranas, basadas en solución, o basadas en chips para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o la proteína.

Anticuerpos

La secuencia de aminoácidos de la presente invención puede ser usada también para generar anticuerpos, tal como mediante el uso de técnicas estándar, contra la secuencia de aminoácidos.

Pueden usarse procedimientos bien conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos contra polipéptidos PFI-017. Tales anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena simple, fragmentos Fab, y fragmentos elegidos entre bibliotecas de expresión de Fab o Fv de cadena simple (sc: Single Chain). Los anticuerpos neutralizantes, es decir, aquellos que antagonizan la actividad biológica de polipéptidos PFI-017, son especialmente preferidos para diagnóstico y terapia.

Para la producción de anticuerpos, varios hospedadores entre los que se incluyen cabras, conejos, ratas, ratones, etc. pueden ser inmunizados mediante la inyección del polipéptido PFI-017 o cualquier parte, variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, u oligopéptido que conserve las propiedades inmunogénicas. Tales fragmentos u oligopéptidos pueden ser acoplados a proteínas portadoras, usando métodos bien conocidos en la técnica. Dependiendo de la especie hospedadora, pueden usarse varios coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales coadyuvantes incluyen, pero sin limitarse a ellos, coadyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, y hemocianina de la lapa de California. Los BCG (Bacilli Calmette-Guerin) y el Corynebacterium parvum son útiles coadyuvantes humanos que pueden ser empleados.

Los anticuerpos monoclonales contra la secuencia de aminoácidos pueden prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero sin limitarse a ellas, la técnica de hibridomas originalmente descrita por Koehler y Milstein (1975, Nature Vol. 256 p. 495-497), la técnica del hibridoma con células B humanas (Kosbor et al. (1983) Immunol. Today Vol. 4 p. 72; Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) Vol. 80 p. 2026-2030) y la técnica del EBV-hibridoma (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, p. 77-96). Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el ayuste de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con una especificidad de antígeno y una actividad biológica apropiadas (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) Vol 81 p 6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature Vol 312 p 604-608; Takeda et al. (1985) Nature Vol 314 p 452-454). Alternativamente, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (documento US-A-4946779), para producir anticuerpos de cadena simple específicos del polipéptido.

También pueden producirse anticuerpos induciendo in vivo la producción en la población de linfocitos o cribando bibliotecas de inmunoglobulina recombinante o paneles de reactivos de unión altamente específicos, como se describe en Orlandi et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) Vol 86, p 3833-3837), y Winter G y Milstein C (1991, Nature 349 p 293-299).

También pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contienen sitios específicos para PFI-017. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los fragmentos F(ab')_{2} que pueden ser producidos por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden ser generados por digestión con papaína de la molécula de anticuerpo. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse WD et al. (1989) Science Vol. 256 p 1275-1281).

Una técnica alternativa implica el cribado de bibliotecas de exposición de fago en las que, por ejemplo, el fago expresa fragmentos scFv en la superficie de su revestimiento con una gran variedad de regiones que determinan la complementariedad (CDRs: Complementarity Determinig Regions). Esta técnica es bien conocida en este campo.

Los anticuerpos específicos para PFI-017 son útiles para el diagnóstico de condiciones y enfermedades asociadas con la expresión del receptor PFI-017. Son bien conocidos en la técnica una diversidad de protocolos para unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos que usan anticuerpos policlonales o bien monoclonales con especificidades establecidas. Tales inmunoensayos implican típicamente la formación de complejos entre el polipéptido PFI-017 y su anticuerpo específico (o molécula de unión de PFI-017 similar), y la medida de la formación del complejo. Se prefiere un inmunoensayo de dos sitios de base monoclonal, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos no interferentes en una proteína PFI-017 específica, pero también puede emplearse un ensayo de unión no competitiva. Estos ensayos de describen en Maddox DE et al. (1983, Journal of Experimental Medicine, Vol. 158,
p. 1211).

Los anticuerpos anti-PFI-017 son útiles para el diagnóstico de trastornos que implican trastornos o enfermedades caracterizadas por una expresión anormal de un receptor PFI-017. Los ensayos de diagnóstico para PFI-017 incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar un polipéptido PFI-017 en fluidos corporales humanos, células, tejidos o secciones o extractos de tales tejidos. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden ser usados con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados uniendo a ellos, bien sea de forma covalente o bien no covalente, una molécula informadora. Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de moléculas informadoras.

Pueden usarse anticuerpos en un método para detectar polipéptidos de la invención presentes en muestras biológicas, que comprende: (a) proporcionar un anticuerpo de la presente invención; (b) incubar una muestra biológica con dicho anticuerpo bajo condiciones que permiten la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (c) determinar si se forma el complejo anticuerpo-antígeno que comprende dicho anticuerpo.

Pueden unirse anticuerpos a un soporte sólido y/o empaquetado en kits, en un envase adecuado, junto con los adecuados reactivos, controles, instrucciones, y demás.

Ensayos/métodos de identificación

La presente invención se refiere también a un método de ensayo para detectar la presencia de PFI-017 en células (tales como células humanas) que comprende: (a) realizar una reacción en cadena de la polimerasa asistida con transcriptasa inversa (RT-PCR) en RNA (como el RNA total) de tales células, usando un par de cebadores de PCR que son específicos para PFI-017, según se determina a partir de la secuencia de DNA indicada en SEC ID No: 1 o una variación alélica de la misma; y (b) ensayar la aparición de un fragmento de PCR del tamaño apropiado, por ejemplo mediante electroforesis en gel de agarosa.

Hay numerosos ensayos en los que el polipéptido de la presente invención puede ser usado para cribar moduladores (p. ej. antagonistas o agonistas) del polipéptido. Los ejemplos de tales ensayos incluyen:

Ensayo funcional: Un ejemplo de un método para cribar receptores para identificar agonistas de los mismos es vigilar el efecto inhibidor o estimulador sobre la acumulación de cAMP o de adenilato ciclasa. Tal ensayo implica transfectar una célula de mamífero con el receptor de la presente invención para la expresión en la superficie de la célula. La célula se expone después a agonistas putativos y se mide la cantidad de acumulación de cAMP. Si el agonista putativo se
une al receptor los niveles de actividad de adenilato ciclasa o cAMP mediada por receptor aumentarán o disminuirán.

Ensayo funcional usando un lector de placas de formación de imagen fluorométrica (FlipR: Fluorometric Imaging Plate Reader): Una técnica usada para cribar e incluye el uso de células que expresan el receptor de la presente invención (por ejemplo, células HEK293 transfectadas) en un sistema que mide p. ej. cambios del calcio intracelular causados por la activación del receptor. En esta técnica, las células que expresan el receptor de la presente invención pueden ponerse en contacto con compuestos (p. ej. pequeñas moléculas, péptidos, lípidos, nucleótidos o glicoproteínas) que pueden provocar una respuesta del segundo mensajero, p. ej. un cambio en los niveles de calcio. Estos cambios se utilizan para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe al receptor.

Ensayo de unión de ligando: Este tipo de ensayo puede probar la unión de un compuesto candidato, en el que la unión a las células que contienen el receptor de la presente invención se detecta por medio de un marcador asociado directa o indirectamente con el compuesto candidato o en un ensayo que implica competición con un competidor marcado. Los ensayos estándar para llevar a cabo cribados que determinan si el compuesto activa o inhibe al receptor son bien conocidos por los expertos en la técnica.

La presente invención, por tanto, se refiere también a un método para identificar agentes (tales como compuestos, otras sustancias o composiciones que los contienen) que afectan (por ejemplo antagonizan, agonizan o modifican de alguna otra forma) la actividad de PFI-017 y/o la expresión del mismo, comprendiendo el método poner en contacto el PFI-017, o la secuencia de nucleótidos que lo codifica, con el agente, y después medir la actividad de PFI-017 y/o la expresión de la misma.

La presente invención se refiere también a un método para modificar agentes (tales como compuestos, otras sustancias o composiciones que las comprenden) que afectan selectivamente (por ejemplo antagonizan, agonizan o modifican de alguna otra forma) a la actividad de PFI-017 y/o a la expresión de la misma, comprendiendo el método poner en contacto PFI-017, o la secuencia de nucleótidos que lo codifica, con el agente, y después medir la actividad de PFI-017 y/o la expresión de la misma.

La presente invención se refiere también a un método para identificar agentes (tales como compuestos, otras sustancias o composiciones que las comprenden) que afectan (por ejemplo antagonizan, agonizan o modifican de alguna otra forma) o afectan selectivamente a la actividad de PFI-017 y/o la expresión de la misma, comprendiendo el método medir la actividad de PFI-017 y/o la expresión de la misma en presencia del agente o después de la adición del agente en: (a) una línea de células en la que se ha incorporado DNA recombinante que comprende la secuencia de DNA mostrada en SEC ID Nº: 1 o una variación alélica de la misma, o (b) una población de células o una línea de células que expresa selectivamente de modo natural PFI-017. Preferentemente, la actividad de PFI-017 se determina mediante los métodos de ensayo descritos anteriormente.

La presente invención se refiere también a un método para cribar un agente para modulación (preferentemente para modulación específica) de la actividad de PFI-017 (o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (incluyendo un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo), comprendiendo el método las etapas de (a) proporcionar un agente candidato; (b) combinar PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) con el agente candidato durante un tiempo suficiente para permitir la modulación bajo condiciones adecuadas; y (c) detectar la modulación del agente candidato para PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de nucleótidos codificadora del mismo (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma), con el fin de determinar si el agente candidato modula la actividad de PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo), o la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma).

La presente invención se refiere también a un método para cribar un agente en cuanto a la afinidad de unión específica con PFI-017 (o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (incluyendo un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma), comprendiendo el método las etapas de (a) proporcionar un agente candidato; (b) combinar PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma) con el agente candidato durante un tiempo suficiente para permitir la unión bajo condiciones adecuadas; y (c) detectar la unión del agente candidato a PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de nucleótidos codificadora del mismo (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma), con el fin de determinar si el agente candidato se une a PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo), o la secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma).

Así, en ciertas realizaciones de la presente invención, el PFI-017 o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo y/o una célula que expresa el PFI-017 o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, pueden usarse para cribar anticuerpos, péptidos u otros agentes, tales como moléculas orgánicas o inorgánicas, que actúan como moduladores (p. ej. antagonistas o agonistas) de la actividad de PFI-017 o para la expresión del mismo, identificando con ello un agente terapéutico capaz de modular el receptor. Alternativamente, el cribado de bibliotecas de péptidos o librerías orgánicas hecho mediante química combinatoria con PFI-017 expresado de forma recombinante, o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, o líneas de células que expresan PFI-017 o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, puede ser útil para la identificación de agentes terapéuticos que actúan modulando el receptor. Compuestos sintéticos, productos naturales y otras fuentes de materiales potencialmente activos biológicamente pueden ser cribados de varias formas consideradas rutinarias por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican la región N-terminal de PFI-017 pueden expresarse en una línea de células, que puede ser usada para cribar moduladores alostéricos, bien sean agonistas o bien antagonistas, de la actividad de PFI-017.

Un polipéptido PFI-017, sus fragmentos inmunogénicos o los oligopéptidos de los mismos, pueden ser usados para cribar compuestos terapéuticos en una cualquiera entre diversas técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido empleado en tal ensayo puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, dispuesto sobre la superficie de una célula o situado intracelularmente. Puede medirse la formación de complejos de unión entre un polipéptido PFI-017 y el agente que se está ensayando.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para cribar uno o diversos compuestos para la modulación (preferentemente modulación específica, tal como una afinidad de unión específica) de PFI-017, o la expresión del mismo, o una parte del mismo, o variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, que comprende proporcionar uno o varios compuestos; combinar un PFI-017 o una secuencia de nucleótidos que codifica al mismo, o una parte del mismo, o variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, con el compuesto o con cada uno de una diversidad de compuestos, durante un tiempo suficiente para permitir la modulación bajo condiciones adecuadas; y detectar la unión de un PFI-017, o parte del mismo, o variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, a cada uno de una diversidad de compuestos, identificando así el compuesto o compuestos que modulan un PFI-017 o una secuencia de nucleótidos que codifica al mismo. En tal ensayo, la diversidad de compuestos puede ser producida por técnicas de química combinatoria conocidas por los expertos en la técnica.

Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona cribados de alta productividad (HTS: High Throughput Screenings) de compuestos que tiene una adecuada afinidad de unión a los polipéptidos PFI-017, y se basa en el método descrito con detalle en Geysen, WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. De una forma resumida, un gran número de pequeños compuestos peptídicos de ensayo diferentes se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como varillas de material plástico o alguna otra superficie. Los compuestos peptídicos de ensayo se hacen reaccionar con fragmentos de PFI-017 y se lavan. Entonces se detecta un PFI-017 unido, por ejemplo mediante la apropiada adaptación de métodos bien conocidos en la técnica. También puede aplicarse como recubrimiento directamente un PFI-107 purificado, sobre placas de las usadas en las técnicas de cribado de fármacos antes mencionadas. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.

Esta invención considera también el uso de ensayos competitivos de cribado de fármacos en los que anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido PFI-017 compiten específicamente con un compuesto de ensayo por la unión con un PFI-017. De esta manera, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con un PFI-017.

El método de ensayo de la presente invención puede ser un cribado de alta productividad (HTS). En relación con esto, las enseñanzas del documento WO 84/03564 pueden ser adaptadas para el PFI-017 de la presente invención. Las enseñanzas del documento US-A-5738985 pueden también adaptarse para el método de ensayo de la presente invención.

Agentes

El agente identificado por los métodos de la presente invención puede ser, por ejemplo, un compuesto orgánico o un compuesto inorgánico. El agente puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que es antisentido para toda o parte de la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 1.

El agente descrito anteriormente (o incluso una sal del mismo aceptable farmacéuticamente, o un solvato del mismo aceptable farmacéuticamente), o una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los expuestos antes, puede ser usado como medicamento.

Diagnóstico

La presente invención proporciona también una composición para diagnóstico para la detección de secuencias de polinucleótidos de PFI-017. La composición para diagnóstico puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 1 o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado de la misma, o una secuencia capaz de hibridarse con toda o parte de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1 o una variación alélica de la misma.

Para proporcionar una base para el diagnóstico de la enfermedad, deben establecerse valores normales o estándar a partir de una expresión del polipéptido PFI-017. Esto se consigue combinando fluidos corporales o extractos de células o tejidos tomados de sujetos normales, sean animales o humanos, con anticuerpos contra un polipéptido PFI-017, bajo condiciones adecuadas para la formación de complejo que son bien conocidas en la técnica. La cuantía de la formación de complejo estándar puede ser determinada comparándola con una serie de diluciones de controles positivos en la que una cantidad conocida de anticuerpo se combina con concentraciones conocidas de un polipéptido PFI-017 purificado. Después, los valores estándar obtenidos de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos de muestras procedentes de sujetos potencialmente afectados por un trastorno o una enfermedad relacionada con la expresión de un polipéptido PFI-017. La desviación entre los valores estándar y los del sujeto determina la existencia de este estado patológico.

Un polinucleótido PFI-017, o cualquier parte del mismo, puede proporcionar la base para un compuesto para diagnóstico y/o terapéutico. Con fines diagnósticos, las secuencias de polinucleótido PFI-017 pueden ser usadas para detectar y cuantificar la expresión génica en condiciones, trastornos o enfermedades en las que puede estar implicada la actividad de PFI-017.

La secuencia de polinucleótidos que codifica PFI-017 puede ser usada para el diagnóstico de enfermedades resultantes de la expresión de PFI-017. Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos que codifica PFI-017 puede ser usada en ensayos de hibridación o de PCR de tejidos procedentes de biopsias o autopsias o fluidos biológicos tales como suero, líquido sinovial o biopsia tumoral, para detectar anomalías en la expresión de PFI-017. La forma de tales métodos cualitativos o cuantitativos puede incluir análisis Southern o northern, transferencia de mancha (dot blot) o cualquier otra tecnología basada en membranas; tecnologías PCR; tecnologías dip stick, pin o chip; y ELISA y otras tecnologías de formato de muestra múltiple. Todas estas técnicas son bien conocidas en este campo y son, de hecho, la base de muchos kits de diagnóstico disponibles comercialmente.

Tales ensayos pueden ser hechos a la medida para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico en particular y pueden usarse en estudios con animales, en experimentos clínicos o en la vigilancia del tratamiento de un paciente concreto. Con el fin de proporcionar una base para el diagnóstico de una enfermedad, debe establecerse un perfil normal o estándar para la expresión de PFI-017. Esto se realiza combinando fluidos corporales o extractos de células tomados de sujetos normales, sean animales o humanos, con PFI-017 o una porción del mismo, bajo condiciones adecuadas para la hibridación o la amplificación. La hibridación estándar puede ser cuantificada comparando los valores obtenidos a partir de sujetos normales con una serie de diluciones de controles positivos realizados en el mismo experimento en la que se usa una cantidad conocida de PFI-017 purificado. Los valores estándar obtenidos de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos de muestras procedentes de sujetos potencialmente afectados por un trastorno o una enfermedad relacionada con la expresión de la secuencia codificadora de PFI-017. La desviación entre los valores estándar y los del sujeto determina la presencia del estado patológico. Si se establece la enfermedad, se administra un agente terapéutico existente y pueden generarse el perfil o los valores del tratamiento. Finalmente, puede repetirse el ensayo sobre una base regular para evaluar si los valores progresan o vuelven al patrón normal o estándar. Pueden usarse perfiles de tratamiento sucesivos para mostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un periodo de varios días o varios meses.

Así, la presente invención se refiere al uso de un polipéptido o variante, homólogo, fragmento o derivado del mismo, para producir anticuerpos anti-PFI-017 que pueden ser usados, por ejemplo, con fines de diagnóstico para detectar y cuantificar niveles de PFI-017 en estados patológicos.

La presente invención se refiere además a ensayos y kits para diagnóstico para la detección de PFI-017 en células y tejidos, que comprenden un PFI-017 purificado que puede ser usado como control positivo, y anticuerpos anti-PFI-017. Tales anticuerpos pueden ser usados en tecnologías basadas en soluciones, basadas en membranas o basadas en tejidos, para detectar cualquier estado patológico o condición relacionada con la expresión de proteína PFI-017 o expresión de deleciones, o una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo.

Sondas

Otro aspecto de la presente invención es la provisión de sondas de hibridación de ácidos nucleicos o de PCR, que son capaces de detectar secuencias de polinucleótidos, incluyendo secuencias genómicas, que codifican la región de codificación de PFI-017 o moléculas estrechamente relacionadas, tales como alelos. La especificidad de la sonda, es decir si se deriva de una región o domino altamente conservado, conservado o no conservado, y las condiciones de rigor de la hibridación o amplificación (alto, intermedio o bajo) determinarán si la sonda identifica solamente la secuencia de codificación de PFI-017 de origen natural, o secuencias relacionadas con ella. Las sondas para la detección de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas se eligen entre regiones de nucleótidos conservadas o altamente conservadas de los polinucleótidos de PFI-017, tales como la región 3', y tales sondas pueden ser usadas en una agrupación (pool) de sondas degeneradas. Para la detección de secuencias de ácidos nucleicos idénticas, o cuando se desea la máxima especificidad, las sondas de ácidos nucleicos se eligen entre las regiones de nucleótidos no conservadas o regiones únicas de polinucleótidos de PFI-017. Como se usa en el presente texto, la expresión "región de nucleótidos no conservada" se refiere a una región de nucleótidos que es única para la secuencia de codificación de PFI-017 descrita en el presente texto, y no aparece en secuencias relacionadas.

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La PCR, como se describe p. ej. en los documentos US-A-4683195, US-A-4800195 y US-A-4965188, proporciona usos adicionales para oligonucleótidos basados en la secuencia de PFI-017. Generalmente tales oligómeros son sintetizados químicamente, pero pueden generarse enzimáticamente o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros comprenden generalmente dos secuencias de nucleótidos, una con orientación con sentido (5'\equiv3') y una con antisentido (3'\approx5') empleadas bajo condiciones óptimas para la identificación de un gen o condición específicos. Los dos mismos oligómeros, conjuntos anidados de oligómeros, o incluso un agrupamiento degenerado de oligómeros, pueden emplearse bajo condiciones menos rigurosas para la detección y/o cuantificación de secuencias de DNA o RNA estrechamente relacionadas.

La secuencia de ácidos nucleicos para PFI-017 puede usarse también para generar sondas de hibridación como se describió anteriormente, para cartografiar la secuencia genómica endógena. La secuencia puede ser cartografiada para un cromosoma particular o para una región específica del cromosoma usando técnicas bien conocidas. Estas incluyen hibridación in situ con extensiones cromosómicas (Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City, EE.UU.), preparados cromosómicos clasificados por flujo, o construcciones de cromosomas artificiales tales como cromosomas artificiales de levadura (YACs: Yeast Artificial Chromosomes), cromosomas artificiales de bacterias (BACs: Bacterial Artificial Chromosomes), construcciones de PI bacterianas o genotecas de cDNA de cromosomas individuales.

La hibridación in situ de preparados cromosómicos y las técnicas de cartografiado físico tales como el análisis de enlace usando marcadores cromosómicos establecidos, son inestimables en la extensión de mapas genéticos. Pueden encontrarse ejemplos de mapas genéticos en Science (1995; 270: 410f y 1994; 265: 1981f). Frecuentemente el emplazamiento de un gen en el cromosoma de otra especie de mamífero puede revelar marcadores asociados incluso aunque no se conozca el número de brazos de un cromosoma humano en particular. Pueden asignarse nuevas secuencias a brazos cromosómicos, o partes de las mismas, mediante cartografiado físico. Esto proporciona una valiosa información a los investigadores que buscan genes de enfermedades usando clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez que la enfermedad o el síndrome, tal como ataxia telangiectasia (AT), ha sido localizada de forma tosca por unión genética a una región genómica particular, por ejemplo AT a 1lq22-23 (Gatti et al. (1988) Nature 336: 577-580), cualquier secuencia que cartografíe para esa área puede representar genes asociados o reguladores para posterior investigación. La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede usarse también para detectar diferencias en la localización cromosómica debidas a translocación, inversión, etc., entre individuos normales, portadores o afectados.

Productos farmacéuticos

También se describe una composición farmacéutica para el tratamiento de un individuo en necesidad del mismo, debido a la actividad de PFI-017, comprendiendo la composición una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que modula (por ejemplo antagoniza o agoniza) dicha actividad, y un vehículo, diluyente, excipiente o coadyuvante aceptable farmacéuticamente.

Así pues, también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes de la presente invención (un agente capaz de modular el patrón de expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención o la actividad del producto de la expresión del mismo y/o un agente identificado por un ensayo de acuerdo con la presente invención. En este aspecto, y en particular para la terapia humana, incluso aunque los agentes pueden ser administrados solos, generalmente se administrarán mezclados con un vehículo, coadyuvante, excipiente o diluyente farmacéutico elegido teniendo en cuenta la vía de administración y la práctica farmacéutica estándar.

A título de ejemplo, en las composiciones farmacéuticas los agentes pueden ser mezclados con uno cualquiera o varios aglutinantes, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de recubrimiento o agentes solubilizantes.

En general, una dosis diaria de los agentes, oral o intravenosa, efectiva terapéuticamente puede encontrarse en el intervalo entre 0,01 mg y 50 mg/kg de peso corporal del sujeto que ha de ser tratado, preferentemente de 0,1 a 20 mg/kg. Los agentes pueden administrarse también por infusión intravenosa, a una dosis que puede oscilar entre 0,001 y 10 mg/Kg.h.

Así pues, se describe también un método para el tratamiento de un individuo en necesidad del mismo debido a la actividad de PFI-017, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de la composición farmacéutica mencionada anteriormente.

Típicamente, el médico determinará la dosificación real que sea la más adecuada para un paciente concreto y que variará con la edad, el peso, el sexo y la respuesta de ese paciente en particular. Las dosis anteriores son ejemplos del caso de tipo medio. Desde luego, puede haber casos individuales en los que se precisen intervalos de dosificación más altos o más bajos, y tales casos caen también dentro del alcance de la presente invención.

En los casos apropiados, las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por inhalación, en forma de supositorio o pesario, tópicamente en forma de loción, solución, crema, ungüento o polvo fino, o usando un parche cutáneo, oralmente en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos, bien sea sólo o mezclado con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o colorantes, o pueden ser inyectados parenteralmente, por ejemplo por vía intracavernosa, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para administración parenteral, lo mejor puede ser usar las composiciones en forma de solución acuosa estéril, que puede contener otras sustancias, por ejemplo sales o monosacáridos suficientes para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Para administración bucal o sublingual, las composiciones pueden ser administradas en forma de comprimidos o pastillas que pueden ser formulados de una manera convencional.

Para la administración oral, parenteral, bucal y sublingual a sujetos (tales como pacientes), el nivel diario de dosificación de los agentes puede estar típicamente entre 10 y 500 mg (en dosis únicas o divididas). Así pues, y a título de ejemplo, los comprimidos o las cápsulas pueden contener de 5 a 100 mg de agente activo para administración única, o dos o más a la vez, según convenga. También es posible administrar los agentes en formulaciones de liberación prolongada.

En algunas aplicaciones, generalmente en personas, la administración oral de los agentes es la vía preferida, siendo la más conveniente, y en algunos casos puede evitar inconvenientes asociados con otras vías de administración, como los que trae consigo la administración intracavernosa (i. c.). En circunstancias en las que el receptor padece de algún trastorno de deglución o de problemas de adsorción del fármaco después de la administración oral, el fármaco puede ser administrado por vía parenteral, sublingual o bucal.

Para uso veterinario, el agente se administra típicamente como formulación adecuadamente aceptable, de acuerdo con la práctica veterinaria normal, y el veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de administración que sea la más apropiada para un animal en particular. Sin embargo, como ocurre con los tratamientos de personas, puede ser posible administrar el agente solo para tratamientos veterinarios.

Típicamente, las composiciones farmacéuticas, que pueden ser para uso animal o humano, comprenderán uno cualquiera o varios diluyentes, vehículos, excipientes o coadyuvantes aceptables farmacéuticamente. La elección del vehículo, excipiente, coadyuvante o diluyente farmacéutico puede hacerse teniendo en cuenta la vía de administración que se pretende utilizar y la práctica farmacéutica estándar. Como se indicó antes, las composiciones farmacéuticas pueden comprender como vehículo, excipiente, coadyuvante o diluyente, o además de ellos, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento o agente solubilizante adecuado.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más de los siguientes elementos: un agente que ha sido cribado mediante un ensayo de la presente invención; un agente que es capaz de interaccionar con la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2 incluyendo derivados, fragmentos, homólogos, análogos o variantes de los mismos, o secuencias capaces de hibridarse con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1.

Se incluye en el alcance de la presente invención secuencias de nucleótidos, moléculas de RNA y DNA antisentido y ribozimas, que actúan desestabilizando el mRNA de PFI-017 e inhibiendo la traducción de PFI-017. Una molécula de PFI-017 antisentido puede proporcionar la base para el tratamiento de varias condiciones anómalas relacionadas, p. ej., con el incremento de la actividad de PFI-017.

Pueden usarse vectores de expresión derivados de retrovirus, adenovirus, virus herpes o virus vaccinia, o de varios plásmidos bacterianos, para el suministro de moléculas con sentido o antisentido de PFI-017 recombinante a la población de células señalada. Métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden ser usados para construir vectores recombinantes que contienen PFI-017. Alternativamente, puede suministrarse PFI-017 recombinante a las células diana en liposomas.

La secuencia de cDNA de longitud completa y/o sus elementos reguladores permite a los investigadores usar el PFI-017 como herramienta en investigaciones con sentido (Youssoufian H y HF Lodish (1993) Mol Cell Biol 13: 98-104) o antisentido (Eguchi et al. (1991) Annu Rev Biochem 60: 631-652) de la función génica. Pueden usarse in vivo o in vitro oligonucleótidos, designados a partir del cDNA o secuencias de control obtenidas a partir del DNA genómico para inhibir la expresión. Tal tecnología es ahora bien conocida en la técnica, y pueden designarse oligonucleótidos con sentido o antisentido o fragmentos mayores, a partir de varias localizaciones a lo largo de las regiones de codificación o de control. Los oligonucleótidos apropiados, que pueden tener una longitud de 20 nucleótidos, pueden ser usados para aislar secuencias de PFI-017 o moléculas estrechamente relacionadas, a partir de genotecas humanas.

Adicionalmente, la expresión de PFI-017 puede ser modulada transfectando una célula o tejido con vectores de expresión que expresan niveles elevados de un fragmento de PFI-017 en condiciones en las que sería preferible bloquear la actividad de PFI-017. Tales construcciones pueden inundar las células con secuencias con sentido o antisentido intraducibles. Incluso en ausencia de integración en el DNA, tales vectores pueden continuar transcribiendo moléculas de RNA hasta que todas las copias del vector sean inhabilitadas por nucleasas endógenas. Tal expresión transitoria puede durar un mes o más con un vector no replicante, e incluso más si los elementos de replicación apropiados forman parte del sistema vector.

Pueden obtenerse modificaciones de la expresión génica diseñando secuencias antisentido para las regiones de control del gen PFI-017, tales como los promotores, intensificadores e intrones.

Se prefieren los oligonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la transcripción, p. ej. entre las regiones -10 y +10 de la secuencia guía. También pueden diseñarse moléculas de DNA y RNA antisentido que bloqueen la traducción del mRNA evitando que el material transcrito se una a los ribosomas. Del mismo modo, puede conseguirse la inhibición usando la metodología del apareamiento de bases de Hogeboom, conocida también como apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice de abrirse lo suficiente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras.

Así pues, se describe también una composición farmacéutica que comprende un agente identificado por los métodos de la presente invención (o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente, o un solvato del mismos aceptable farmacéuticamente) junto con un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo aceptable farmacéuticamente. La composición farmacéutica puede ser para uso veterinario (es decir, uso animal) o humano.

Así pues, se describen también composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de moduladores (p. ej. antagonistas o agonistas) de la proteína PFI-017 (incluyendo secuencias antisentido de ácidos nucleicos) en mezcla con un diluyente, vehículo, excipiente o coadyuvante aceptable farmacéuticamente (incluyendo combinaciones de los mismos).

Las composiciones farmacéuticas descritas pueden comprender toda o parte de las secuencias de polinucleótidos de PFI-017, moléculas antisentido de PFI-017, polipéptidos PFI-017, proteínas, péptidos o moduladores orgánicos de la bioactividad de PFI-017, tales como antagonistas (incluyendo anticuerpos) o agonistas, solos o en combinación con al menos otro agente tales como un compuesto de estabilización, y pueden ser administradas en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua.

Referencias de la metodología general

Aunque por lo general las técnicas mencionadas en el presente texto son bien conocidas en este campo, puede hacerse referencia en particular a Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4º ed., John Wiley and Sons, Inc. La PCR se describe en los documentos US-A-4683195, US-A-4800195 y US-A-4965188.

Depósitos

La muestra que se indica a continuación fue depositada de acuerdo con el tratado de Budapest en el depositario reconocido The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), en St. Machar Drive 23, Aberdeen, Escocia, AB2 IRY, Reino Unido, el 23 de agosto de 2000.

El número NCIMB 41074 es Escherichia coli Pfi-017.

El depositante fue Pfizer Central Research, Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Reino Unido.

Un experto en la técnica podría desarrollar fácilmente el clon de E. coli antes mencionado (NCIMB 41074) en caldo de Luria que contiene ampicilina, y aislar el DNA de plásmido del clon, p. ej. usando el método de lisis con álcali que se describe en Sambrook et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, USA. El método de terminación didesoxi que se describe en Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1977), 74 (12): 5463-5467), y modificado por Applied Biosystems (véase la literatura de los fabricantes Applied Biosystem) para la detección fluorescente podría entonces usarse para secuenciar el DNA e identificar el PFI-017. El plásmido contenido en este clon de E. coli contiene la secuencia que codifica PFI-017^{*}, como se muestra en la SEC ID Nº: 5.

También se describen secuencias derivables y/o expresables a partir de ese depósito, y realizaciones que las contienen. La presente invención también abarca secuencias parciales derivables y/o expresables a partir de ese depósito, y realizaciones que las contienen, en donde esas secuencias parciales codifican polipéptidos activos. También se describen proteínas que comprenden secuencias derivables y/o expresables a partir de ese depósito, y realizaciones que las comprenden. La presente invención también abarca proteínas consistentes en secuencias parciales derivables y/o expresables a partir de ese depósito, y realizaciones que las contienen, en donde esas secuencias parciales codifican polipéptidos activos.

Ejemplos

La presente invención será ahora descrita, solamente a título de ejemplo, con referencia a las Figuras y Listas de Secuencias anexas, en las que:

La Figura 1 muestra un esquema para el análisis bioinformático de PFI-017 (db = base de datos).

La Figura 2 muestra un alineamiento usando ClustalW de PFI-017 con el receptor de cisteinil leucotrieno 1.

La Figura 3 muestra el mapa citogenético de la región del cromosoma 13, en donde está localizado el gen de PFI-017.

La Figura 4 muestra la curva de respuesta a la dosis de PFI-017^{*} al leucotrieno C_{4}.

La Figura 5 muestra la curva de respuesta a la dosis de PFI-017^{*} al leucotrieno D_{4}.

La SEC ID Nº: 1 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica PFI-017.

La SEC ID Nº: 2 muestra la correspondiente secuencia de aminoácidos que codifica PFI-017.

Las SEC ID Nº: 3 y Nº 4 muestran los cebadores de PCR usados en los Ejemplos.

La SEC ID Nº: 5 muestra la secuencia de nucleótidos para PFI-017^{\text{*}}, correspondiente al número de entrada de GenBak AF254664, y el producto de traducción de la misma.

El polinucleótido que codifica el GPCR (receptor acoplado a proteína G) de la presente invención fue clonado y las secuencias de DNA y aminoácidos se analizaron usando varias herramientas bioinformáticas. El GPCR codificado por las secuencias descritas en el presente texto ha sido denominado PFI-017.

Ejemplos Identificación de PFI-017

El PFI-017 fue identificado en información de secuencia genómica no anotada que fue liberada por los Genome Sequencing Centers (Centros de Secuenciación de Genomas) buscando las secuencias con miembros conocidos de la familia del receptor acoplado a proteína G (GPCR) usando el algoritmo BLAST.

Estudios bioinformáticos

Con el fin de confirmar que PFI-017 era un miembro de la familia de GPCR se llevaron a cabo varios planteamientos bioinformáticos.

(a): Búsqueda BLAST frente a Swissprot.

Se buscó la secuencia de aminoácidos de PFI-017 (SEC ID No: 2) frente a la base de datos Swissprot usando el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (Altschul SF (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul, SF et al. (1990) J. Mol. Biol. 215. 403-410)) para identificar la concordancia más próxima de proteína. En este caso, el mejor resultado fue con el receptor del cisteinil leucotrieno humano.

Estos resultados indican que PFI-017 es un miembro de la familia de GPCR.

(b) Alineamiento con ClustalW de PFI-017 con el receptor de cisteinil leucotrieno.

Estos resultados se muestran en la Figura 2.

(c) Búsqueda con BLAST frente a una base de datos de GPCR humano no redundante.

La secuencia de aminoácidos de PFI-017 se buscó frente a una base de datos de GPCR humano no redundante, que comprende principalmente secuencias procedentes de GenBank y la base de datos Derwent Geneseq, con el fin de identificar la clase de agonista para este receptor. Los diez mejores resultados se exponen a continuación:

AF119711	receptor de cisteinil leucotrieno (CYSLT1)
GPRH_HUMAN	receptor acoplado a proteína G GPR17
EBI2_HUMAN	receptor acoplado a proteína G inducido por EBV
P2YR_HUMAN	purinorreceptor P2Y 1 (P2Y1)
P2UR_HUMAN	purinorreceptor P2U 1 (P2Y1)
P2Y5_HUMAN	purinorreceptor P2Y 5 (P2Y5)
P2Y9_HUMAN	purinorreceptor P2Y 9 (P2Y9)
PAFR_HUMAN	receptor del factor de activación de las plaquetas
PAR2_HUMAN	receptor 2 activado por proteinasa (PAR-2)
AF118670	receptor acoplado a proteína G GPR34

Estos resultados demuestran PFI-017 es lo más parecido al receptor de cisteinil leucotrieno y sugieren que PFI-017 codifica un nuevo GPCR cuyo ligando es probablemente una molécula de eicosanoide.

Varios ESTs que cartografían en la secuencia de nucleótidos de SEC ID No: 1 fueron encontrados en una genoteca de cDNA basada en eosinófilos aislados de un paciente que padece asma.

El cóntigo BAC (Bacterial Artificial Chromosome) que contiene PFI-017 está anotado como derivado de 13q14.12-21.1. Esta región (véase la Fig. 3) contiene un marcador, D13S153, que se ha demostrado que está fuertemente ligado al asma atópico en poblaciones australianas (Daniels et al., 1996 Nature 383: 247-) y japonesas (Kimura et al., Hum. Mol. Genet. 8: 1487-). La caja de la izquierda (Fig. 3) denota el marcador D13S153. La caja de la derecha indica la región de la que se derivó el BAC PFI-017.

Por consiguiente, es probable que el receptor de la presente invención tenga una función asociada con la respuesta inmunitaria, en particular el asma. Además, es probable que los agonistas o antagonistas de este receptor sean útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la respuesta inmunitaria, en particular el asma.

Aislamiento de PFI-017

La secuencia codificadora de longitud completa de PFI-017^{*} se clonó a partir de DNA genómico humano (Promega) usando PCR.

Racción PCR: La reacción PCR se ajustó de la forma siguiente: dNTPs (10 mM) - 1 \mul, cebador directo (10 \muM) - 1 \mul, cebador inverso (10 \muM) - 1 \mul, 5 x tampón de reacción - 10 \mul, Elongasa (Life Technologies, Inc.) - 1 \mul, DNA genómico - 1 \mug; llevado a 50 \mul con agua.

Cebadores de la PCR:

Cebador directo (=PFI-017 directo):

5'-ACCATGGAGAGAAAATTTATGTCC-3' (SEC ID No: 3)

Cebador inverso (=PFI-017 inverso):

5'-TTATACTCTTGTTTCCTTTCTC-3' (SEC ID No: 4)

Condiciones para la PCR: 94ºC - 3 minutos. Después 30 ciclos de 94ºC - 1 minuto, 58ºC - 1 minuto, 72ºC - 2 minutos. Ciclo final = 72ºC - 10 minutos.

El producto de PCR PFI-017^{\text{*}} se extrajo en gel usando el kit de extracción en gel QIAgen, siguiendo las instrucciones del fabricante. El producto resultante se clonó de acuerdo con la metodología de clonación TA (Invitrogen TA cloning) en el vector pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayo funcional: activación por leucotrieno de PFI-017^{\text{*}}

Se empleó la tecnología del lector de placas de imagen de fluorescencia (FLIPR®: FLuorescence Imaging Plate Reader) como medio para detectar la activación de PFI-017^{\text{*}} por los leucotrienos C4 y D4 en un ensayo basado en células.

5 x 10^{6} células de ovario de hamster chino (CHO) que expresan el gen G\alpha15 de ratón fueron transfectadas transitoriamente con 7,5 \mug de vector de cDNA de PFI-017^{*} (contenido dentro del plásmido pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen)), o vector solo, usando reactivo Lipofectamine Plus® (Gibco BRL) siguiente el protocolo del fabricante. A las 24 horas de la transfección, las células se desprendieron del frasco usando solución de tripsina/EDTA (LTI) y se sembraron en una placa de 96 pocillos de lados negros y fondo claro (Corning Costar) a una densidad de 5 x 10^{4} células por pocillo. Las placas se dejaron durante la noche para permitir a las células adherirse al fondo de los pocillos. El medio se retiró de las células y se reemplazó con 100 \mul de solución de carga de colorante templada (37ºC) (50 \mug de Fluo4 (Molecular Probes) en 20 \mul de DMSO + 20% de ácido plurónico en DMSO, añadido a 11 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco que contiene 1 x Probenecid (100 x Probenecid - se disolvieron 0,71 g de Probenecid en 5 ml de NaOH 1M y 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco, por placa. El probenecid (Molecular Probes) inhibe la actividad de la proteína de transporte aniónico, mejorando así la carga de colorante). Las placas se incubaron después durante 1 h a 37ºC. Posteriormente las placas se lavaron con 150 \mul de tampón de lavado por pocillo (5 ml 100x solución madre de Probenecid + 495 ml de PBS, pH 7,4) 3 veces. Las placas se devolvieron al incubador a 37ºC/5% de CO_{2} durante 15 minutos antes del procesado dentro del instrumento FLIPR®. El procesado FLIPR® implicaba la lectura de la fluorescencia para todas las muestras durante 2 minutos; durante este tiempo se determinó la línea base de fluorescencia durante 10 segundos. La cantidad deseada de compuesto (es decir leucotrieno C4 o D4) fue después transferida automáticamente a los pocillos, y la fluorescencia se vigiló de forma continua durante el resto del tiempo. Los leucotrienos se diluyeron en tampón para lavado que contiene ditiotreitol 1 mM con el fin de mantener los compuestos en estado reducido.

La curva de respuesta a la dosis para el leucotrieno C4 se muestra en la Figura 4; el valor observado de ED_{50} es aproximadamente 1,2 \muM. La curva de respuesta a la dosis para el leucotrieno D4 se muestra en la Figura 5; el valor observado de ED_{50} es aproximadamente 0,41 \muM. Sin embargo, los leucotrienos son bastante lábiles, es probable que la ED_{50} para leucotrieno C4 y D4 completamente intacto esté en el margen nanomolar.

\newpage

Por consiguiente, es probable que PFI-017 represente un receptor de leucotrieno, y ahora se le denomina también receptor CysLT_{2} (Heise, C. E. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 30531-30539, Takasaki, J. et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 316-322; ambos trabajos publicados después de la fecha de prioridad de esta solicitud).

Se apreciará que lo que antecede se proporciona solamente a título de ejemplo y que pueden hacerse modificaciones de detalle sin apartarse del alcance de la invención.

(parte de la descripción)

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<110> Pfizer Ltd. (EP (GB) solamente); Pfizer Inc (EP excepto GB, US y JP)

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<120> Receptor de cisteinil leucotrieno humano (CysLT_{2})

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<130> PCS10914BXP

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<150> 0008504.3

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<151> 2000-04-05

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<160> 4

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 993

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

1

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<210> 2

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<211> 330

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

2

3

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<210> 3

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

accatggaga gaaaatttat gtcc

\hfill

24

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<210> 4

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttatactctt gtttcctttc tc

\hfill

22

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<210> 5

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<211> 1041

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1041)

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<400> 5

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4

5

6

Claims

1. Un polinucleótido aislado y/o purificado que consiste en uno o más de:

(a) un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1; o

(b) el complemento del polinucleótido de (a).

2. Un vector que comprende una secuencia codificadora que consiste en el polinucleótido según la reivindicación 1ª.

3. Una célula hospedadora aislada transformada o transfectada con el vector según la reivindicación 2ª.

4. La célula hospedadora transformada o transfectada según la reivindicación 3ª, que es una célula de mamífero, de insecto, fúngica, bacteriana o de levadura.

5. Un procedimiento para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula hospedadora transformada o transfectada según las reivindicaciones 3ª o 4ª bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido o fragmento.

6. El procedimiento según la reivindicación 5ª, en el que dicho polipéptido se expresa en la superficie de dicha célula.

7. El procedimiento según las reivindicaciones 5ª o 6ª, que incluye además recuperar el polipéptido del cultivo.

8. Un procedimiento para producir células capaces de expresar un polipéptido, que comprende transformar o transfectar células con el vector según la reivindicación 2ª.

9. Células aisladas producidas mediante el procedimiento según la reivindicación 8ª.

10. Un preparado de membranas de las células según la reivindicación 9ª.

11. Un polipéptido producido mediante el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5ª a 8ª.

12. Un polipéptido que consiste en:

(a) la secuencia de aminoácidos deducida, traducida a partir de la secuencia de polinucleótidos de SEC ID No:

\hbox{1; o}

(b) un polipéptido de la SEC ID No: 2.

13. Un método para identificar un compuesto que se une, y lo modula, al polipéptido según la reivindicación 12ª, que comprende poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto candidato, y determinar si tiene lugar la modulación.

14. Un método según la reivindicación 13ª, que comprende:

(a) poner en contacto un compuesto con células que expresan el polipéptido según la reivindicación 12ª en su superficie, estando asociado dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido, siendo dicho contacto bajo condiciones suficientes para permitir la unión de los compuestos al polipéptido; y

(b) identificar un compuesto capaz de unirse al polipéptido detectando la señal producida por dicho segundo componente.

15. Un método según la reivindicación 14ª, que comprende:

(a) poner en contacto (i) un primer componente detectable, que se sabe que se une al polipéptido según la reivindicación 12ª, y (ii) un compuesto, con células que expresan el polipéptido según la reivindicación 12ª en su superficie celular, asociándose dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; siendo dicho contacto bajo condiciones suficientes para permitir la unión de los compuestos al polipéptido; y

(b) determinar si el primer componente se une al polipéptido detectando la ausencia o no de una señal producida por la interacción del primer componente con el polipéptido.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 15ª, en el que dicho compuesto se une al polipéptido según la reivindicación 12ª y lo antagoniza o lo antagoniza selectivamente.

17. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 15ª, en el que dicho compuesto se une al polipéptido según la reivindicación 12ª y lo agoniza.

18. Células modificadas por ingeniería genética ex vivo para expresar, sobre expresar, subexpresar o para mostrar inserción o deleción dirigidas del polipéptido según la reivindicación 12ª.

19. Células no humanas modificadas por ingeniería genética in vivo para expresar, sobreexpresar, subexpresar o para mostrar inserción o deleción dirigidas del polipéptido según la reivindicación 12ª.

20. Un método para aclarar la estructura tridimensional del polipéptido según la reivindicación 12ª, que comprende las etapas de (a) purificar el polipéptido; (b) cristalizarlo, y (c) aclarar la estructura, en particular mediante cristalografía de rayos X.

21. Un método para modelar la estructura del polipéptido según la reivindicación 12ª, que comprende las etapas de: (a) alinear la secuencia con una secuencia de una proteína de estructura tridimensional conocida, en particular rodopsina; (b) cartografiar las diferencias de secuencia detectadas del polipéptido según la reivindicación 12ª en la estructura conocida; (c) derivar un modelo de homología del polipéptido según la reivindicación 12ª.