ES2247017T3 - Receptor humano de cistenil leucotrieno 2(cyslt2). - Google Patents
Receptor humano de cistenil leucotrieno 2(cyslt2).Info
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Abstract
Un polinucleótido aislado y/o purificado que consiste en uno o más de: (a) un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1; o (b) el complemento del polinucleótido de (a).
Description
Receptor humano de cisteinil leucotrieno 2
(CysLT_{2})
La presente invención se refiere a una secuencia
de polinucleótidos que codifica un polipéptido que pertenece a la
clase de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteínas G
(GPCRs: G-Protein Coupled Receptors). La presente
invención se refiere también, entre otras cosas, a procedimientos
para producir el polipéptido y a sus usos.
Las células y los tejidos responden a una amplia
variedad de moléculas de señalización extracelulares mediante la
interacción de estas moléculas con receptores específicos de la
superficie de la célula. Una de estas clases de receptores se conoce
como receptores acoplados a proteína G (GPCRs:
G-Protein Coupled Receptors), y se caracteriza
porque contiene una serie de 7 segmentos transmembrana hidrófobos.
Al unir un ligando extracelular a su receptor, se inician señales
extracelulares por medio de interacciones con proteínas G
heterotriméricas que, a su vez, pueden conducir a cierto número de
eventos intracelulares distintos que dependen de cual es el receptor
que ha sido activado. Por ejemplo, algunos GPCRs influyen sobre la
actividad de la adenil ciclasa mientras que otros actúan a través de
la fosfolipasa C.
Los miembros de la superfamilia de GPCR responden
a una amplia variedad de ligandos, incluyendo aminas de molécula
pequeña (tales como serotonina, dopamina, acetilcolina), mediadores
derivados de lípidos (tales como LpA), derivados de aminoácidos
(tales como glutamato) y péptidos neurotransmisores y hormonas
(tales como neuroquinina, galanina, glucagón, gastrina). Aunque los
GPCRs son activados por una amplia gama de ligandos, hay que tener
en cuenta que los GPCRs individuales tienen un repertorio de
ligandos pequeño y muy específico. Basándose en un análisis de la
estructura primaria de un nuevo GPCR, ahora es posible clasificarlos
en subfamilias específicas, estrechando así la gama de ligandos
potenciales.
En muchos casos, los ligandos endógenos de los
GPRCs son relativamente pequeños, permitiéndoles mimetizarse o
bloquearse por análogos sintéticos. Por ejemplo, fármacos tales como
la prazosina, la doxazosina, la cimetidina o la ranitidina, son
todos ellos antagonistas eficaces de sus respectivos GPCRs diana.
Así, como la modulación de los GPCRs puede tener consecuencias
terapéuticas, hay una necesidad continuada de proporcionar nuevos
GPCRs y sus agonistas y antagonistas asociados.
El número de entrada AL137118, EMBL Sequence
Database, versión 5 (GI: 7406543), fecha disponible el
04/1/2000, contenía cromosoma 13 humano, secuencia map q14.12-21.1 del clon RP11-108P5 en 5 piezas desordenadas. No se proporcionó ningún comentario de ninguna secuencia de codificación contenida en ella, pero en la versión 20 de esta entrada, que se puso a disposición pública el 13 de marzo de 2001, se añadió la anotación al efecto de que en este segmento está comprendida una secuencia del receptor CysLT_{2}.
04/1/2000, contenía cromosoma 13 humano, secuencia map q14.12-21.1 del clon RP11-108P5 en 5 piezas desordenadas. No se proporcionó ningún comentario de ninguna secuencia de codificación contenida en ella, pero en la versión 20 de esta entrada, que se puso a disposición pública el 13 de marzo de 2001, se añadió la anotación al efecto de que en este segmento está comprendida una secuencia del receptor CysLT_{2}.
En un aspecto amplio, la presente invención se
refiere a secuencias de aminoácidos. En relación con esto, se ha
aislado una secuencia específica de aminoácidos, y se ha de entender
que la invención cubre esa secuencia y las variantes, fragmentos,
derivados y homólogos de la misma.
En otro aspecto amplio, la presente invención se
refiere a secuencias de ácidos nucleicos. En relación con esto, se
ha aislado una secuencia específica de ácidos nucleicos, y se ha de
entender que la invención cubre esa secuencia así como las
variantes, fragmentos, derivados y homólogos de la misma.
Así pues, de forma resumida, algunos aspectos de
la presente invención se refieren a:
1. Secuencias de aminoácidos.
2. Secuencias de nucleótidos.
3. Ensayos que utilizan dichas secuencias.
4. Sistemas de expresión que comprenden o
expresan dichas secuencias.
Otros aspectos concernientes a la secuencia de
aminoácidos de la presente invención y/o a la secuencia de
nucleótidos de la presente invención, incluyen: una construcción que
contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la presente
invención; un vector que un plásmido que contiene o que es capaz de
expresar las secuencias de la presente invención; una célula
transfectada o transducida viralmente con una
construcción/vector/plásmido que contiene o que es capaz de expresar
las secuencias de la presente invención; un tejido que contiene o
que es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un
órgano que contiene o que es capaz de expresar las secuencias de la
presente invención; un hospedador transformado que contiene o que
es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; y un
organismo transformado que contiene o que es capaz de expresar las
secuencias de la presente invención. La presente invención comprende
también métodos para expresarla, tal como la expresión en un
microorganismo, incluyendo métodos para transferirla. La presente
invención comprende también purificar y cristalizar el polipéptido,
opcionalmente seguido por la aclaración de la estructura
tridimensional, preferentemente mediante cristalografía de rayos X.
La presente invención comprende también derivar un modelo de
homología de la estructura tridimensional del polipéptido de la
presente invención.
Para facilitar la consulta, se discuten ahora
aspectos de la presente invención bajo los encabezamientos
apropiados de cada sección. Sin embargo, las enseñanzas bajo cada
sección no están necesariamente limitadas a cada sección en
particular.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un polinucleótido aislado y/o purificado
que consiste en uno o más de:
(a) un polinucleótido que codifica el polipéptido
que se expone en la SEC ID No: 2;
(b) un polinucleótido que consiste en una
secuencia de nucleótidos de la SEC ID No: 1;
(c) un polinucleótido que comprende una secuencia
de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con el
polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) o (b);
(d) un complemento del polinucleótido según uno
cualquiera de los apartados (a) a (c); o
(e) un fragmento polinucleotídico del
polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d).
Preferentemente, el polinucleótido consiste en
una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 75% de identidad
con el polinucleótido según uno cualquiera de los apartados (a) o
(b). Más preferentemente, el polinucleótido consiste en una
secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad,
incluso más preferentemente al menos un 85% de identidad, incluso
más preferentemente al menos un 90% de identidad, incluso más
preferentemente al menos un 95% de identidad, lo más preferentemente
al menos un 98% de identidad, con el polinucleótido de los apartados
(a) o (b).
El polinucleótido descrito anteriormente codifica
preferentemente un receptor acoplado a proteína G (GPCR). Incluso
más preferentemente, el polinucleótido codifica un receptor
cisteinil leucotrieno, incluso más preferentemente un receptor
CysLT_{2}.
La presente invención proporciona también una
sonda o cebador de polinucleótido que comprende al menos 15
nucleótidos contiguos del polinucleótido descrito anteriormente.
La presente invención proporciona además un
vector que contiene el polinucleótido descrito anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona una célula hospedadora transformada o
transfectada con el vector descrito anteriormente. Preferentemente,
la célula hospedadora es una célula de mamífero, de insecto,
fúngica, bacteriana o de levadura.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona el producto de RNA transcrito del
polinucleótido descrito anteriormente. También se proporciona una
molécula de RNA o un fragmento del mismo que es antisentido en
relación con el producto de RNA y es capaz de hibridarse con el
mismo.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para producir un
polipéptido, que comprende cultivar dicha célula hospedadora bajo
condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido.
Preferentemente, dicho polipéptido se expresa en la superficie de
dicha célula. Preferentemente el procedimiento incluye además
recuperar el polipéptido del cultivo.
También se proporciona mediante la presente
invención un procedimiento para producir células capaces de expresar
un polipéptido, que comprende transformar o transfectar células con
el vector descrito anteriormente. De acuerdo con otra realización de
la presente invención, se proporcionan células producidas por el
procedimiento descrito anteriormente. También se proporciona un
preparado de membranas de dichas células.
También se describe en la memoria descriptiva el
microorganismo depositado bajo el número de entrada NCIMB 41074 en
las National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un polipéptido que consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos deducida, traducida a partir de la secuencia de polinucleótido de la SEC ID No: 1; o
- (b)
- un polipéptido de SEC ID No: 2.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para identificar un compuesto,
que se une y modula el polipéptido descrito anteriormente, que
comprende poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto
candidato, y determinar si tiene lugar la modulación.
Preferentemente, dicho método comprende:
- (a)
- poner en contacto un compuesto (o una mezcla de compuestos) con células que expresan el polipéptido descrito anteriormente sobre su superficie celular, estando asociado dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; siendo dicho contacto bajo condiciones adecuadas para permitir la unión de compuestos al polipéptido; y
- (b)
- identificar un compuesto capaz de unión con el polipéptido detectando la señal producida por dicho segundo componente.
Alternativamente, dicho método comprende:
- (a)
- poner en contacto (i) un primer componente detectable, que se sabe que se une al polipéptido descrito anteriormente y (ii) un compuesto, con células que expresan el polipéptido anterior en su superficie celular, estando asociado dicho polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho polipéptido; siendo dicho contacto bajo condiciones suficientes para permitir la unión de compuestos al polipéptido; y
- (b)
- determinar si el primer componente se une al polipéptido detectando la ausencia o no de una señal generada a partir de la interacción del primer componente con el polipéptido.
Alternativamente, dicho método comprende:
- (a)
- poner en contacto células que expresan el polipéptido descrito en su superficie celular (o membranas preparadas a partir de dichas células) con un compuesto de ensayo o una mezcla de compuestos de ensayo, junto con, o seguido por, un compuesto con un marcador detectable, que se sabe que se une al polipéptido, y
- (b)
- determinar si el compuesto de ensayo o uno o más componentes de la mezcla de compuestos de ensayo se une al polipéptido detectando una disminución (o no) del marcador detectable unido al polipéptido.
El compuesto identificado por cualquiera de los
métodos anteriores preferentemente se une y (i) antagoniza o
antagoniza selectivamente al polipéptido descrito anteriormente, o
(ii) agoniza o agoniza selectivamente al polipéptido descrito
anteriormente.
Como los GPCRs están implicados en la
transducción de la señal, los moduladores (p. ej. agonistas o
antagonistas) del polipéptido de la presente invención pueden
encontrar uso para interferir en el proceso de transducción de la
señal.
Los anticuerpos, compuestos y composiciones que
pueden modular el polipéptido de la presente invención, pueden
encontrar aplicación en muchas áreas terapéuticas que incluyen, pero
sin limitarse a ellas, obesidad, diabetes y enfermedad metabólica,
enfermedad neurológica, psicoterapia, enfermedad urogenital,
medicina sexual y de la reproducción, inflamación, cáncer,
reparación de tejidos, dermatología, pigmentación de la piel, foto
envejecimiento, debilidad, osteoporosis, enfermedad cardiovascular,
enfermedad gastrointestinal, infecciones, alergia y enfermedades
respiratorias, trastornos de órganos sensoriales, trastornos del
sueño y pérdida del cabello. Preferentemente tales anticuerpos,
compuestos y composiciones se usan para tratar a pacientes con
trastornos alérgicos, trastornos inflamatorios tales como
enfermedades intestinales inflamatorias, trastornos inmunológicos,
enfermedades pulmonares tales como la enfermedad pulmonar
obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), enfermedades
infecciosas, enfermedades neoplásicas y mieloproliferativas,
enfermedades granulomatosas vasculíticas, así como enfermedades
cardíacas. Más preferentemente, tales anticuerpos, compuestos y
composiciones se usan para tratar pacientes con rinitis alérgica o
asma; incluso más preferentemente, tales anticuerpos, compuestos y
composiciones se usan para tratar la congestión nasal, bien sean
solos o en combinación con terapias
anti-histamínicas.
En consecuencia, también se describe el uso del
compuesto descrito anteriormente en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de modular el
polipéptido descrito anteriormente. Preferentemente, el tratamiento
es para un paciente que necesita antagonizar o antagonizar
selectivamente el polipéptido. Alternativamente, el tratamiento es
para un paciente que necesita agonizar el polipéptido.
También se describe el uso del anticuerpo
descrito anteriormente en la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de un paciente que tiene necesidad de modular el
polipéptido descrito anteriormente. Preferentemente, dicho método es
para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de
antagonizar o antagonizar selectivamente el polipéptido.
Alternativamente, dicho método es para el tratamiento de un paciente
que necesita agonizar el polipéptido.
También se describe un método para el tratamiento
de un paciente que tiene necesidad de modular el polipéptido
descrito anteriormente, que comprende administrar al paciente una
cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo descrito
anteriormente. Preferentemente, dicho método es para el tratamiento
de un paciente que tiene necesidad de antagonizar o antagonizar
selectivamente el polipéptido. Alternativamente, dicho método es
para el tratamiento de un paciente que necesita agonizar el
polipéptido.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, se proporcionan células modificadas por ingeniería
genética ex vivo o in vivo para que expresen, sobre
expresen, subexpresen o muestren inserción o deleción direccionadas
(dirigidas a la diana) del polipéptido de la presente invención.
La presente invención se refiere también al uso
de las nuevas secuencias de ácido nucleicos y aminoácidos en el
diagnóstico y tratamiento de la enfermedad.
El término "polipéptido", que es
intercambiable con el término "proteína" y que a veces se
menciona también como "secuencia de aminoácidos", incluye
moléculas de polipéptido de cadena simple, así como complejos de
múltiples polipéptidos en los que los polipéptidos constituyentes
individuales están unidos por medios covalentes o no covalentes.
Preferentemente, el polipéptido de la presente invención es un
polipéptido de cadena simple.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
estar en forma sustancialmente aislada. Se entenderá que el
polipéptido puede ser mezclado con vehículos o diluyentes que no
interfieran con el propósito que se pretende para el polipéptido, y
ser considerado aún como sustancialmente aislado. Un polipéptido de
la presente invención puede también estar en forma sustancialmente
purificada, en cuyo caso comprenderá generalmente el polipéptido en
un preparado en el que más del 90%, p. ej. el 95%, el 98% o el 99%
del polipéptido del preparado, es un polipéptido de la presente
invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser
modificados, por ejemplo mediante la adición de restos de histidina,
para facilitar su purificación.
El polipéptido PFI-017 puede ser
el mismo que la forma de origen natural (para este aspecto,
preferentemente el polipéptido PFI-017 no está en su
entorno natural) o es una variante, un homólogo, un fragmento o un
derivado del mismo. El polipéptido PFI-017 no está
cubierto por la invención cuando ha sido expresado por su secuencia
de nucleótidos codificadora nativa que está también en su entorno
natural y cuando esa secuencia de nucleótidos está bajo el control
de su promotor nativo, que está también en su entorno natural.
Además, o en la alternativa, el polipéptido PFI-017
es polipéptido PFI-017 aislado y/o polipéptido
PFI-017 purificado. El polipéptido
PFI-017 puede ser obtenido a partir de, o producido
por cualquier fuente adecuada, sea natural o no, o puede ser
sintético, semisintético o recombinante.
La secuencia codificadora de
PFI-017 puede ser la misma que la forma de origen
natural (para este aspecto, preferentemente la secuencia
codificadora de PFI-017 no está en su entorno
natural) o es una variante, un homólogo, un fragmento o un derivado
del mismo. Además, o en la alternativa, la secuencia codificadora de
PFI-017 es una secuencia codificadora de
PFI-017 aislada y/o secuencia codificadora de
PFI-017 purificada. La secuencia codificadora de
PFI-017 puede ser obtenida a partir de, o producida
por, cualquier fuente adecuada, sea natural o no, o puede ser
sintética, semisintética o recombinante. La secuencia de aminoácidos
de la presente invención puede ser producida mediante expresión de
una secuencia de nucleótidos que la codifica en un sistema de
expresión
adecuado.
adecuado.
Además, o en la alternativa, la propia proteína
podría producirse usando métodos químicos para sintetizar un
polipéptido PFI-017, en conjunto o en parte. Por
ejemplo, pueden sintetizarse los péptidos mediante técnicas en fase
sólida, separarse de la resina y purificarse mediante cromatografía
de líquidos de alta eficacia preparativa (p. ej. Creighton (1983)
Protein Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co.,
Nueva York, NY, EE.UU.). La composición de los péptidos sintéticos
puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos
(p. ej. el procedimiento de degradación de Edman).
La síntesis directa de péptidos puede realizarse
usando varias técnicas en fase sólida (Roberge JY et al.,
Science, Vol. 269, 1995, 202-204) y puede
conseguirse la síntesis automática usando, por ejemplo, el
sintetizador de péptidos ABI 431 A (Perkin Elmer) siguiendo las
instrucciones proporcionadas por el fabricante. Adicionalmente, la
secuencia de aminoácidos de PFI-017, o cualquier
parte de la misma, puede ser alterada durante la síntesis directa
y/o combinada usando métodos químicos con una secuencia procedente
de otras subunidades, o cualquier parte de la misma, para producir
un polipéptido variante.
En otra realización de la invención, una
secuencia de aminoácidos PFI-017 natural, modificada
o recombinante, puede ser ligada a una secuencia heteróloga para
codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el cribado de
bibliotecas en relación con compuestos y agonistas y antagonistas
peptídicos de actividad GPCR de PFI-017, puede ser
útil codificar una proteína PFI-017 quimérica que
expresa un epítopo heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo
disponible comercialmente. También puede construirse por ingeniería
genética una proteína de fusión que contenga un sitio de
segmentación localizado entre una secuencia de
PFI-017 y la secuencia de la proteína heteróloga, de
forma que la PFI-017 pueda ser segmentada y separada
pura del resto heterólogo.
La PPI-017 puede expresarse
también como proteína recombinante con uno o más dominios
polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación
de la proteína. Tales dominios que facilitan la purificación
incluyen, pero no se limitan a ellos, péptidos quelantes de metales
tales como módulos de histidina-triptófano que
permiten la purificación en metales inmovilizados (Porath, J.,
Protein Expr. Purif. Vol. 3, 1992 p. 263-281),
dominios de proteína A que permiten la purificación en
inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema
de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle,
WA, USA). La inclusión de una secuencia enlazadora segmentable tal
como Factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA, USA) entre
el dominio de purificación y PFI-017 es útil para
facilitar la purificación.
Una vez purificada la proteína, pueden obtenerse
cristales con métodos similares a los descritos por Palczewski et
al. en Science, 289, 739-745 (2000), y la
estructura puede ser resuelta mediante cristalografía de rayos X
como se describe en esta publicación, u otras técnicas biofísicas.
Alternativamente, o adicionalmente, la estructura tridimensional del
polipéptido de la invención puede ser modelada también mediante
modelación por homología, que comprende las etapas de alinear la
secuencia del polipéptido de la invención con la secuencia de un
polipéptido similar de estructura conocida, preferentemente
rodopsina, cartografiar las diferencias de secuencia en la
estructura conocida, derivando así un modelo para la estructura
tridimensional del polipéptido de la invención. La estructura
tridimensional, derivada bien sea mediante la determinación de la
estructura o mediante modelación por homología, puede usarse después
para diseñar compuestos que pueden unirse al polipéptido de la
invención, o para la predicción de si los compuestos se unirán a
él.
Los términos "variante", "homólogo",
"fragmento", "análogo" o "derivado" en relación con
la secuencia de aminoácidos para el polipéptido de la presente
invención, incluyen cualquier sustitución, variación, modificación,
reemplazamiento, deleción o adición de un aminoácido (o más), de la
secuencia o a la secuencia, con la condición de que el polipéptido
resultante tenga actividad de GPCR, preferentemente siendo al menos
tan activo biológicamente como el polipéptido que se muestra en la
SEC ID No: 2 anexa. En particular, el término "homólogo" cubre
la homología con respecto a la estructura y/o a la función. Con
respecto a la homología de secuencia, hay al menos un 70%,
preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un
80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al
menos un 90%, más preferentemente al menos un 95% de homología con
la secuencia mostrada en SEC ID No:2. Lo más preferentemente hay al
menos un 98% de homología con la secuencia mostrada en SEC ID No:
2.
Típicamente, para la variante, homólogo o
fragmento de la presente invención, los tipos de sustituciones de
aminoácidos que podrían hacerse deben mantener la
hidrofobicidad/hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos. Pueden
hacerse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10,
20 ó 30 sustituciones, siempre y cuando la secuencia modificada
conserve la capacidad para actuar como GPCR de acuerdo con la
presente invención. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir
el uso de análogos que no sean de origen natural.
El polipéptido PFI-017 y/o su
secuencia codificadora, y/o una secuencia capaz de hibridarse con la
misma, es o son útiles para ensayar la selectividad de los fármacos
candidatos entre distintos GPCRs.
Se ha demostrado (en el presente texto) que el
PFI-017 es lo más parecido a los receptores de
leucotrieno y que el PFI-017 codifica un nuevo GPCR
cuyos ligandos son cisteinil leucotrienos, p. ej. LTC_{4} y
LTD_{4}. Por tanto el PFI-017 se denomina también
receptor cysLT_{2}. PFI-017 se refiere a una
secuencia que comprende la SEC ID No 2, o una variante, fragmento,
homólogo o derivado de la misma;
PFI-017^{\text{*}} se refiere específicamente a la
secuencia codificadora y/o al producto de traducción como se publica
en Heise, C.E. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275,
30531-30539, y Takasaki, J. et al., (2000)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 316-322; ambos
trabajos publicados después de la fecha de prioridad de esta
solicitud. Esta secuencia se muestra en SEC ID No: 5.
La expresión "secuencia de nucleótidos" como
se usa en el presente texto se refiere a una secuencia de
oligonucleótidos o una secuencia de polinucleótidos, y variantes,
homólogos, fragmentos, análogos y derivados de las mismas. La
secuencia de nucleótidos puede ser DNA o RNA, que pueden ser de
origen genómico o sintético o recombinante, que pueden ser de doble
cadena o de cadena simple, tanto si representan la cadena con
sentido como antisentido.
Preferentemente, la expresión "secuencia de
nucleótidos" significa DNA. Más preferentemente, la expresión
"secuencia de nucleótidos" significa DNA preparado mediante el
uso de técnicas de DNA recombinante (es decir, DNA
recombinante).
En una realización preferida, la secuencia de
nucleótidos de la presente invención por sí misma no cubre la
secuencia de nucleótidos codificadora nativa en su entorno natural,
cuando está bajo el control de su promotor nativo que está también
en su entorno natural. Para facilitar la referencia, los autores de
la presente invención han denominado esta realización preferida
"la secuencia de nucleótidos no nativa".
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden incluir dentro de ellas nucleótidos sintéticos o
modificados. Se conocen en la técnica diversos tipos de modificación
a nucleótidos. Estos incluyen esqueletos de metilfosfonato y
fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los
extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la presente
invención, se ha de entender que las secuencias de nucleótidos
descritas en el presente texto pueden ser modificadas por cualquier
método disponible en la técnica. Tales modificaciones pueden ser
llevadas a cabo para favorecer la actividad in vivo o lapso
de vida de las secuencias de nucleótidos de la presente
invención.
La presente invención comprende también
secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias
presentadas en el presente texto, o cualquier variante, homólogo,
análogo, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es
complementaria a un fragmento de la misma, entonces esa secuencia
puede ser usada como sonda para identificar secuencias codificadoras
similares en otros organismos, etc.
También se describen secuencias de nucleótidos
que son capaces de hibridarse con las secuencias presentadas en el
presente texto y sus complementos, o cualquier variante, homólogo,
análogo, fragmento o derivado de las mismas. Preferentemente dichas
secuencias de nucleótidos son capaces de hibridarse bajo condiciones
entre intermedias y rigurosas, más preferentemente bajo condiciones
rigurosas (p. ej. 65ºC y 0,1xSSC {0,1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato
Na_{3} 0,015M pH 7,0}) con las secuencias de nucleótidos
presentadas en el presente texto.
Los ejemplos de ácidos nucleicos pueden
caracterizarse alternativamente como aquellas secuencias de
nucleótidos que codifican una proteína PFI-017 y se
hibridan con la secuencia de DNA mostrada en la SEC ID No: 1. Se
prefieren las secuencias que codifican PFI-017 tales
que se hibridan bajo condiciones muy rigurosas con la secuencia
mostrada en la SEC ID No: 1, o el complemento de las mismas.
Ventajosamente se describen también secuencias de
ácidos nucleicos que son capaces de hibridarse, bajo condiciones
rigurosas, con un fragmento de la secuencia mostrada en la SEC ID
No: 1 o su complemento. Preferentemente, el fragmento tiene una
longitud entre 15 y 50 bases. Ventajosamente, es de una longitud de
aproximadamente 25
bases.
bases.
Los términos "variante", "homólogo",
"análogo", "derivado" o "fragmento", en relación con
la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido preferido de
la presente invención incluyen cualquier sustitución, variación,
modificación, reemplazamiento, deleción o adición de uno o más
nucleótidos desde o a la secuencia, con la condición de que la
secuencia de nucleótidos resultante codifique o sea capaz de
codificar un polipéptido que tiene actividad de receptor de
PFI-017, preferentemente siendo al menos tan activo
biológicamente como el polipéptido codificado por la secuencia
mostrada en SEC ID No: 1. En particular, el término "homólogo"
cubre la homología con respecto a la estructura y/o a la función,
con la condición de que la secuencia de nucleótidos resultante
codifica o es capaz de codificar un polipéptido que tiene actividad
como GPCR de PFI-017. Con respecto a la homología de
secuencia, preferentemente hay al menos un 70%, preferentemente al
menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más
preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un
90%, más preferentemente al menos un 95% de homología con la
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos
mostrada en SEC ID No:2. Lo más preferentemente hay al menos un 98%
de homología con una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID No: 2. Con respecto a la
homología de secuencia, preferentemente hay al menos un 70%,
preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un
80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al
menos un 90%, más preferentemente al menos un 95% de homología con
la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID No: 1. Lo más
preferentemente hay al menos un 98% de homología con la secuencia de
nucleótidos mostrada en SEC ID No: 1.
Como se ha indicado, la presente invención se
refiere a una secuencia de DNA (preferentemente una secuencia de
cDNA) que codifica PFI-017. En particular, la
presente invención se refiere a secuencias de cDNA que codifican
PFI-017. Se apreciará que una gama de
polinucleótidos diferentes codifican una secuencia de aminoácidos
dada como consecuencia de la degeneración del código genético.
La presente invención se refiere también a
segmentos de DNA que comprenden la secuencia de DNA mostrada en SEC
ID No: 1 o variaciones alélicas de la misma.
La presente invención se refiere también a
polipéptidos producidos por expresión en una célula hospedadora en
la que han sido incorporadas las anteriores secuencias de DNA o
variaciones alélicas de las mismas.
La presente invención proporciona también DNA,
preferentemente DNA no nativo, más preferentemente DNA recombinante,
que comprende la secuencia de DNA mostrada en la SEC ID No: 1 o
variaciones alélicas de la misma.
Conociendo las secuencias de aminoácidos
expuestas en el presente texto es posible imaginar secuencias
parciales y de longitud completa de ácidos nucleicos tales como cDNA
y/o clones genómicos que codifican los polipéptidos de la presente
invención. Por ejemplo, pueden obtenerse polinucleótidos de la
presente invención usando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) degenerada que use cebadores diseñados para dirigirse a
secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos presentadas
en el presente texto. Los cebadores contendrán típicamente múltiples
posiciones degeneradas. Sin embargo, para reducir al mínimo la
degeneración, se elegirán las secuencias que codifican regiones de
las secuencias de aminoácidos presentadas en el presente texto que
contienen aminoácidos, tales como metionina, que son codificados por
tan sólo un triplete. Además, se elegirán las secuencias teniendo en
cuenta el uso de codón en el organismo cuyo ácido nucleico es usado
como DNA molde para el procedimiento de PCR. La PCR se usará en
condiciones de rigor más bajas que las usadas para clonar secuencias
con cebadores de secuencia única (no degenerada) frente a secuencias
conocidas.
Las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas por
PCR, que codifican fragmentos de polipéptido de la presente
invención, pueden ser usadas entonces para obtener secuencias
mayores usando técnicas de cribado de genotecas por hibridación. Por
ejemplo, puede marcarse un clon de PCR con átomos radiactivos y ser
usado para cribar una genoteca de cDNA o genómica de otra especie,
preferentemente otra especie de mamífero. Las condiciones de
hibridación serán típicamente condiciones de rigor medio a alto (por
ejemplo cloruro sódico 0,03M y citrato sódico 0,03M, a una
temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC).
Las sondas de ácido nucleico degeneradas que
codifican toda o parte de la secuencia de aminoácidos pueden ser
usadas también para sondar cDNA y/o bibliotecas genómicas de otras
especies, preferentemente de otras especies de mamífero. Sin
embargo, se prefiere llevar a cabo técnicas de PCR inicialmente para
obtener una secuencia simple para ser usada en posteriores
procedimientos de cribado.
De acuerdo con la presente invención, las
secuencias de polinucleótidos que codifican PFI-017,
fragmentos del polipéptido, proteínas de fusión o equivalentes
funcionales de las mismas, pueden ser usadas para generar moléculas
de DNA recombinante que dirigen la expresión de
PFI-017 en células hospedadoras apropiadas. Debido a
la inherente degeneración del código genético, pueden usarse otras
secuencias de DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia
de aminoácidos o una secuencia funcionalmente equivalente, para
clonar y expresar PFI-017. Como entenderán los
expertos en la técnica, puede ser ventajoso producir secuencias de
nucleótidos que codifican PFI-017 que poseen codones
que no son de origen natural. Los codones preferidos por un
hospedador procariótico o eucariótico particular (Murray E. et
al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508) pueden
elegirse, por ejemplo, para aumentar la tasa de expresión de
PFI-017 o para producir transcritos de RNA
recombinante que tengan las propiedades deseables, tales como una
vida mitad más larga, que los transcritos producidos a partir de
secuencias de origen natural.
Las secuencias de polinucleótidos de la presente
invención obtenidas usando las técnicas descritas anteriormente
puede ser usadas para obtener otras secuencias homólogas y variantes
usando las técnicas descritas antes. También pueden ser modificadas
para ser usadas para expresar los polipéptidos de la presente
invención en una diversidad de sistemas de células hospedadoras, por
ejemplo para optimizar las preferencias de codón para una célula
hospedadora particular en la que están siendo expresadas las
secuencias de polinucleótidos. Pueden desearse otros cambios en las
secuencias con el fin de introducir sitios de reconocimiento de
enzimas de restricción, o de alterar la propiedad o la función de
los péptidos codificados por los polinucleótidos.
Las secuencias de polinucleótidos
PFI-017 alteradas que pueden ser usadas de acuerdo
con la invención incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de
diferentes restos de nucleótidos que tienen por resultado un
polinucleótido que codifica el mismo PFI-017 o uno
funcionalmente equivalente. La proteína puede tener también
deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que
tienen por resultado un PFI-017 funcionalmente
equivalente. Pueden hacerse sustituciones deliberadas de aminoácidos
sobre la base de la similitud de polaridad, carga, solubilidad,
hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los
restos, siempre y cuando se conserve la actividad biológica de
PFI-017. Por ejemplo, los aminoácidos cargados
negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los
aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina, y los
aminoácidos con grupos polares de cabeza no cargados que tienen
valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina,
valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
fenilalanina y tirosina.
Incluidos en el alcance de la presente invención
están los alelos de PFI-017. Como se usa en el
presente texto, un "alelo" o una "secuencia alélica" es
una forma alternativa de PFI-017. Los alelos
resultan de una mutación, es decir, un cambio en la secuencia de
ácidos nucleicos, y generalmente producen mRNAs alterados o
polipéptidos cuya estructura y función pueden estar alteradas o no.
Cualquier gen dado puede tener ninguna, una o muchas formas
alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a alelos se
adscriben generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones de
aminoácidos. Cada uno de estos tipos de cambio puede ocurrir solo o
en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia
dada.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden ser modificadas mediante ingeniería genética con el
fin de alterar una secuencia codificadora de PFI-017
por diversas razones, incluyendo, pero sin limitarse a ellas,
alteraciones que modifican la clonación, el procesado y/o la
expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse
mutaciones usando técnicas que son bien conocidas en este campo, p.
ej. mutagénesis sitio-dirigida para insertar nuevos
sitios de restricción, para alterar los patrones de glicosilación o
para cambiar la preferencia codónica.
Los polinucleótidos de la presente invención
pueden usarse para producir un cebador, p. ej. un cebador de PCR, un
cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda p.
ej. marcada con un marcador de revelado por medios convencionales
usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los
polinucleótidos pueden ser clonados en vectores. Tales cebadores,
sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15,
preferentemente al menos 20, por ejemplo al menos 25, 30 o 40
nucleótidos, y están también comprendidos en la expresión
"polinucleótidos de la presente invención" como se usa en el
presente texto.
Los polinucleótidos o cebadores de la presente
invención pueden llevar un marcador de revelado. Los marcadores
adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P ó ^{35}S,
marcadores enzimáticos, u otros marcadores de proteína tales como
biotina. Tales marcadores pueden ser añadidos a los polinucleótidos
o cebadores de la presente invención y pueden detectarse usando
técnicas conocidas en este campo.
Los polinucleótidos tales como un polinucleótido
de DNA y cebadores de acuerdo con la presente invención pueden ser
producidos por vía recombinante, por síntesis o por cualquier medio
disponible para los expertos en la técnica. También pueden ser
clonados por técnicas estándar.
En general, los cebadores serán producidos por
métodos de síntesis, que implican una elaboración en etapas de la
secuencia de ácidos nucleicos deseada, un nucleótido cada vez. Los
métodos para realizar esto usando técnicas automáticas son ya
disponibles en la técnica.
Generalmente se producirán polinucleótidos más
largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de
clonación por PCR. Esto implicará hacer un par de cebadores (p. ej.
de aproximadamente 15-30 nucleótidos) para una
región de la secuencia de nucleótidos que se desea clonar, poniendo
los cebadores en contacto con mRNA o cDNA obtenidos a partir de una
célula eucariótica o procariótica, llevando a cabo una reacción en
cadena de polimerasa bajo condiciones que ocasionan la amplificación
o multiplicación de la región deseada, aislando el fragmento
amplificado (p. ej. purificando la mezcla de reacción en un gel de
agarosa) y recuperando el DNA amplificado. Los cebadores pueden
diseñarse para que contengan sitios adecuados de reconocimiento de
enzimas de restricción, para facilitar la clonación del DNA
amplificado en un vector adecuado.
Las moléculas de DNA pueden ser modificadas para
aumentar la estabilidad intracelular y la vida mitad. Las
modificaciones posibles incluyen, pero sin limitarse a ellas, la
adición de secuencias flanqueantes de los extremos 5' y/o 3' de la
molécula o el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en
vez de uniones fosfodiesterasa dentro del esqueleto de la
molécula.
Como se mencionó con anterioridad, también se
describen secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse
con toda o parte de la secuencia mostrada en SEC ID No: 1 o una
variación alélica de la misma. Estas secuencias de nucleótidos
pueden usarse en técnicas antisentido para modificar la expresión de
PFI-017. Alternativamente, estas secuencias (o
porciones de las mismas) pueden ser usadas como sonda, o para
amplificar la totalidad o parte de tal secuencia cuando se usa como
cebador para PCR.
Además de las secuencias de DNA recombinante, las
secuencias genómicas son también de utilidad en el contexto del
descubrimiento de fármacos. Puede ser valioso inhibir la
transcripción del mRNA de una isoforma en particular en vez de
inhibir su proteína traducida. Esto puede ser cierto con el
PFI-017, si hay variantes de ayuste y en donde esas
diferentes variantes de ayuste pueden ser transcritas a partir de
diferentes promotores.
Otra utilidad de la invención es que las
secuencias de DNA, una vez conocidas, dan la información necesaria
para diseñar ensayos para detectar específicamente isoformas o
variantes de ayuste. Los pares de cebadores de PCR específicos de la
isoforma no son más que un ejemplo de ensayo que depende
completamente del conocimiento de la secuencia de DNA específica de
la isoforma o variante de ayuste. Tal ensayo permite la detección
del mRNA para la isoforma para evaluar la distribución en el tejido
y la relevancia biológica de cada isoforma para un estado patológico
en particular. También permite la identificación de líneas de
células que pueden expresar naturalmente solamente una isoforma, un
descubrimiento que podría obviar la necesidad de expresar genes
recombinantes. Si se demuestra que isoformas específicas de
PFI-017 están asociadas con un estado patológico en
particular, la invención sería valiosa en el diseño de ensayos de
diagnóstico para detectar la presencia de la isoforma del
mRNA.
mRNA.
Un nivel anormal de secuencias de nucleótidos que
codifican un receptor PFI-017 en una muestra
biológica puede reflejar una anomalía cromosómica tal como una
deleción o mutación de ácidos nucleicos. En consecuencia, las
secuencias de nucleótidos que codifican un receptor
PFI-017 proporcionan la base para sondas que pueden
ser usadas con fines de diagnóstico para detectar anomalías
cromosómicas tales como deleciones, mutaciones o translocaciones
cromosómicas en el gen que codifica PFI-017. La
expresión del gen PFI-017 puede ser alterada en
tales estados patológicos o puede haber una anomalía cromosómica
presente en la región del gen que codifica
PFI-017.
En una realización alternativa de la invención,
la secuencia codificadora de PFI-017 podría ser
sintetizada, en su totalidad o en parte, usando métodos químicos
bien conocidos en la técnica (véanse Caruthers MH et al.
(1980), Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 215-23, Horn T
et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser.
225-232).
Como se usa en el presente texto, "origen
natural" se refiere a un PFI-017 con una
secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza
Como se usa en el presente texto, los términos
"aislado" y "purificado" se refieren a moléculas, bien
sean de ácido nucleico o de aminoácidos, que son retiradas de su
entorno natural y aisladas o separadas de al menos otro componente
con el que están asociadas de forma natural.
Como se usa en el presente texto,
"biológicamente activo" se refiere a un PFI-017
según la presente invención, tal como un PFI-017
recombinante, que tiene una función estructural similar (pero no
necesariamente en el mismo grado), y/o una función reguladora
similar (pero no necesariamente en el mismo grado), y/o una función
bioquímica similar (pero no necesariamente en el mismo grado), y/o
una función inmunológica similar (pero no necesariamente en el mismo
grado) al PFI-017 de origen natural.
Específicamente, un PFI-017 de la presente invención
tiene la capacidad de actuar como GPCR, que es una de las
actividades características del polipéptido PFI-017
de la presente invención.
Como se usa en el presente texto, se define
"actividad inmunológica" como la capacidad del
PFI-017 natural, recombinante o sintético, o
cualquier oligopéptido del mismo, para inducir una respuesta
inmunitaria específica en animales o células apropiados y para
unirse con anticuerpos específicos.
El término "derivado", como se usa en el
presente texto en relación con la secuencia de aminoácidos, incluye
la modificación química de un PFI-017. Ilustrativa
de tales modificaciones sería el reemplazamiento de hidrógeno por un
grupo alquilo, acilo o amino.
El término "análogo", como se usa en el
presente texto en relación con la secuencia de aminoácidos (o la
secuencia codificadora de la misma) incluye la modificación química
de un PFI-017 o la secuencia codificadora del mismo.
Ilustrativo de tales modificaciones sería el reemplazamiento de
restos de aminoácidos naturales o nucleótidos naturales con restos
de aminoácidos no naturales (p. ej. D-aminoácidos,
beta-alanina, hidroxiprolina) o nucleótidos no
naturales (p. ej. inosina, dimetil-citidina).
Como se usa en el presente texto, se define una
"deleción" o "borrado" como un cambio en la secuencia de
nucleótidos o bien de aminoácidos, en la que uno o más restos de
nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, están ausentes.
Como se usa en el presente texto, una
"inserción" o "adición" es un cambio en una secuencia de
nucleótidos o de aminoácidos que ha tenido por resultado la adición
de uno o más nucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente,
en comparación con el PFI-017 de origen natural.
Como se usa en el presente texto, la
"sustitución" es el resultado del reemplazamiento de uno o más
nucleótidos o aminoácidos por nucleótidos o aminoácidos diferentes,
respectivamente.
El término "homólogo" con respecto a la
secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de
aminoácidos de la presente invención, incluirá variaciones alélicas
de las secuencias.
Aquí, la homología de secuencia con respecto a la
secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de
aminoácidos de la presente invención puede ser determinada usando
programas informáticos a disposición del público que pueden calcular
el porcentaje (%) de homología entre dos o más secuencias. Ejemplos
típicos de tales programas informáticos son los programas FASTA o
BLAST.
El cálculo del % de homología entre dos
secuencias requiere en primer lugar la producción de un alineamiento
óptimo, introduciendo huecos (gaps) donde fuesen necesarios
para conseguir un alineamiento óptimo. Programas de ordenador
adecuados para llevar a cabo tal alineamiento están incluidos en el
paquete GCG (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et
al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387), p. ej. Gap o
Bestfit. Los ejemplos de otros programas que pueden llevar a cabo
comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitarse a ellos, el
paquete BLAST, preferentemente BLAST2 (véase Ausubel et al.,
199 ibid - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990,
J. Mol. Biol., 403-410), ClustalW (Thompson, J. D.
et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22 4673-80), y
la serie GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como
FASTA son disponibles para investigación
off-line y on-line
(Ausubel et al., 1999 ibid, páginas
7-58 a 7-60). Sin embargo, para
algunas aplicaciones se prefiere usar el programa GCG Bestfit.
Aunque el % de homología final puede medirse en
términos de identidad, en algunos casos el propio proceso de
alineamiento típicamente no se basa en una comparación de pares todo
o nada. En vez de ello, se usa generalmente una matriz de puntuación
de similitud escalada que asigna puntuaciones a cada comparación de
pares acertada basándose en la similitud química o la distancia
evolutiva. Un ejemplo de tal matriz usada comúnmente es la matriz
BLOSUM62, la matriz por defecto de la serie de programas BLAST. Los
programas GCG Wisconsin usan generalmente o bien los valores por
defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos
personalizada, si se suministra (véase el manual del usuario para
obtener más detalles). Se prefiere usar los valores por defecto
públicos para el paquete GCG o, en el caso de otro programa, la
matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez que el programa de ordenador ha producido
un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología,
preferentemente el % de identidad de secuencia. Típicamente el
programa informático hace esto como parte de la comparación de
secuencias y genera un resultado numérico.
Como se ha indicado, para algunas aplicaciones
puede determinarse la homología (o identidad) de secuencias usando
cualquier algoritmo de homología adecuado, que emplee por ejemplo
parámetros por defecto. Para una discusión de los temas básicos en
la búsqueda de similitud de bases de datos de secuencias, véase
Altschul et al. (1994) Nature Genetics
6:119-129. Para algunas aplicaciones se emplea el
algoritmo BLAST, con los parámetros ajustados en los valores por
defecto. El algoritmo BLAST se describe con detalle en
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. Ventajosamente,
"homología sustancial", cuando es establecida por BLAST,
equivale a secuencias que coinciden con un valor EXPECT de al menos
aproximadamente e-7, preferentemente al menos
aproximadamente e-9, y lo más preferentemente
e-10 o inferior. El umbral por defecto para EXPECT
en la busca de BLAST es normalmente
10.
10.
Si cuando se determina la identidad de secuencias
se deben usar penalizaciones por huecos (GAP Penalties), que
permiten al usuario controlar el número o longitud de los huecos que
el programa introduce para optimizar el alineamiento, entonces
preferentemente se usan los parámetros por defecto del programa
informático.
El término "hibridación", como se usa en el
presente texto, incluye "el proceso por el cual una cadena de
ácido nucleico se junta con una cadena complementaria mediante el
apareamiento de bases" (Coombs J (1964) Dictionary of
Biotechnology, Stockton Press, Nueva York, NY, EE.UU.) así como el
proceso de amplificación llevado a cabo en tecnologías de PCR, como
se describe en Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY,
EE.UU.).
Las condiciones de hibridación se basan en la
temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de ácido nucleico,
como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning
Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San
Diego, CA, EE.UU.) y confieren un "rigor" definido como se
explica más adelante.
El rigor de la hibridación se refiere a las
condiciones bajo las cuales los híbridos de ácidos polinucleicos son
estables. Tales condiciones son evidentes para un profesional con
una experiencia normal en este campo. Como saben los expertos en la
técnica, la estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura
de fusión (Tm) del híbrido, que disminuye aproximadamente 1 a 1,5ºC
con cada 1% de disminución en la homología de la secuencia. En
general, la estabilidad de un híbrido es función de la concentración
de ion sodio y de la temperatura. Típicamente, la reacción de
hibridación se lleva a cabo bajo condiciones de rigor más alto,
seguida por lavados de rigor variable.
Como se usa en el presente texto, un rigor
elevado se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de
solamente aquellas secuencias de ácidos nucleicos que forman
híbridos estables en Na^{+} 1 M a 65-68ºC. El
máximo rigor tiene lugar típicamente a aproximadamente Tm - 5ºC (5ºC
por debajo de la Tm de la sonda).
El rigor elevado tiene lugar a aproximadamente
5ºC a 10ºC por debajo de la Tm de la sonda. Por ejemplo, pueden
proporcionarse condiciones de rigor elevado mediante la hibridación
en una solución acuosa que contiene 6x SSC, 5x Denhardt, 1% de SDS
(dodecil sulfato sódico), 0,1 pirofosfato Na^{+} y 0,1 mg/mL de
DNA de esperma de salmón desnaturalizado como competidor no
específico. Después de la hibridación, puede hacerse un lavado de
rigor elevado en varias etapas, con un lavado final (aproximadamente
30 minutos) a la temperatura de hibridación en
0,2-0,1x SSC, 0,1% de SDS.
El rigor moderado, o intermedio, tiene lugar a
aproximadamente 10ºC a 20ºC por debajo de la Tm de la sonda. El
rigor moderado se refiere a condiciones equivalentes a la
hibridación en la solución anteriormente descrita, pero a
aproximadamente 60-62ºC. En ese caso el lavado final
se realiza la temperatura de hibridación en 1x SSC, 0,1% de SDS.
El rigor bajo tiene lugar típicamente a
aproximadamente 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm de la sonda. El
rigor bajo se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en
la solución antes descrita a aproximadamente
50-52ºC. En ese caso, el lavado final se lleva a
cabo a la temperatura de hibridación en 2x SSC, 0,1% de SDS.
Como entenderán los expertos en la técnica, puede
usarse una hibridación de rigor elevado para identificar o detectar
secuencias idénticas de polinucleótidos, mientras que una
hibridación de rigor intermedio (o moderado) puede usarse para
identificar o detectar secuencias de polinucleótidos similares o
relacionadas.
Se entiende que estas condiciones pueden ser
adaptadas y duplicadas usando una diversidad de tampones, p. ej.
tampones basados en formamida, y temperaturas. La solución de
Denhardt y SSC son bien conocidos por los expertos en la técnica, al
igual que otros tampones de hibridación adecuados (véanse, p. ej.,
Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, EE.UU.,
o Ausubel et al., ed. (1990) Current Protocols en Molecular
Biology, John Wiley and Sons, Inc.). Las condiciones de hibridación
óptimas se han de determinar empíricamente, ya que la longitud y el
contenido de GC de la sonda desempeña también un papel.
Los polinucleótidos de la invención capaces de
hibridarse selectivamente con las secuencias de nucleótidos
presentadas en el presente texto, o con su complemento, serán
generalmente al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, más
preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un
85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al
menos un 95%, lo más preferentemente al menos un 98%, homólogos
respecto a las correspondientes secuencias de nucleótidos
presentadas en el presente texto, sobre una región de al menos 20,
preferentemente al menos 25 ó 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100,
o más, nucleótidos contiguos.
La expresión "hibridable selectivamente"
significa que el polinucleótido usado como sonda se usa bajo
condiciones en las que se observa que un polinucleótido diana de la
presente invención se hibrida con la sonda a un nivel
significativamente por encima del de fondo. La hibridación de fondo
puede ocurrir a causa de otros polinucleótidos presentes, por
ejemplo, en la genoteca de cDNA o DNA genómico que se está usando.
En tal caso, el fondo supone un nivel de señal generada por
interacción entre la sonda y un miembro de DNA no específico de la
genoteca, que es menos de 10 veces, preferentemente menos de 100
veces tan intensa como la interacción específica observada con el
DNA diana. La intensidad de la interacción puede medirse, por
ejemplo, marcando la sonda radiactivamente, por ejemplo con
^{32}P.
En un aspecto preferido, la presente invención
cubre secuencias de nucleótido que pueden hibridarse con una
cualquiera, o más, de las secuencias de nucleótidos de la presente
invención bajo condiciones rigurosas (p. ej. 65ºC y 0,1x SSC).
Preferentemente, el polinucleótido de la presente
invención está unido operativamente a una secuencia reguladora que
es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificadora,
tal como por la célula hospedadora elegida. A título de ejemplo, la
presente invención cubre un vector que comprende el polinucleótido
de la presente invención unido operativamente a tal secuencia
reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.
La expresión "unido operativamente" se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos
están en una relación que les permite actuar en la manera
pretendida. Una secuencia reguladora "unida operativamente" a
una secuencia codificadora está ligada de manera tal que la
expresión de la secuencia codificadora se consigue bajo condiciones
compatibles con las secuencias de control.
La expresión "secuencias reguladoras"
incluye promotores e intensificadores, y otras señales de regulación
de la expresión. El término "promotor" se usa en el sentido
normal en la técnica, p. ej. un sitio de unión de RNA
polimerasa.
La intensificación de la expresión del
polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención
puede también conseguirse mediante la selección de regiones
reguladoras heterólogas, p. ej. región del promotor, guía de
secreción y del terminador, que sirven para aumentar la expresión y,
si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés
desde el hospedador de expresión elegido, y/o para proporcionar el
control inducible de la expresión del polipéptido de la presente
invención. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de la
presente invención puede estar unida operativamente al menos a un
promotor.
Aparte del promotor original respecto al gen que
codifica el polipéptido de la presente invención, pueden usarse
otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la
presente invención. El promotor puede seleccionarse por su eficacia
para dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención
en el hospedador de expresión deseado.
En otra realización, puede elegirse un promotor
constituyente para dirigir la expresión del polipéptido de la
presente invención deseado. Tal construcción de expresión puede
proporcionar ventajas adicionales ya que soslaya la necesidad de
cultivar los hospedadores de expresión en un medio que contiene un
sustrato inductor.
Ejemplos de promotores adecuados serían LTR, SV40
y CMV en sistemas de mamíferos; lac o trp de E.
coli en sistemas bacterianos; promotor poliedro de baculovirus
(polh) en sistemas de insectos, y otros promotores que se
sabe que controlan la expresión en células eucarióticas y
procarióticas o sus virus.
Los ejemplos de promotores constitutivos y/o
inducibles fuertes que son preferidos para ser usados en
hospedadores de expresión fúngicos son aquellos que pueden obtenerse
a partir de los genes fúngicos para los promotores xilanasa
(xlnA), fitasa, ATP-sintetasa, subunidad 9
(oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol
deshidrogenasa (AdhA), \alpha-amilasa
(amy), amiloglucosidasa (AG, procedente del gen glaA),
acetamidasa (amdS) y
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (gpd). Los ejemplos de promotores fuertes de
levadura son aquellos que pueden obtenerse a partir de los genes
para alcohol deshidrogenasa, lactasa,
3-fosfoglicerato cinasa y triosafosfato
isomerasa.
Ejemplos de promotores bacterianos fuertes son
los promotores \alpha-amilasa y SP02, así
como promotores procedentes de genes de proteasa extracelular.
También pueden usarse promotores híbridos para
mejorar la regulación inducible de la construcción de expresión.
El promotor puede incluir adicionalmente
características que aseguren o que aumenten la expresión en un
hospedador adecuado. Por ejemplo, las características pueden ser
regiones conservadas tales como una caja Pribnow o una caja TATA. El
promotor puede incluso contener otras secuencias que afecten (por
ejemplo que mantengan, potencien o reduzcan) a los niveles de
expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención.
Por ejemplo, entre otras secuencias adecuadas se incluye el intrón
ShI o un intrón ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles,
tales como elementos inducibles por la temperatura, la composición
química, la luz o el estrés. También pueden estar presentes
elementos adecuados para intensificar la transcripción o la
traducción. Un ejemplo de estos últimos elementos es la secuencia
señal TMV 5' (Sleat, Gene 217 [1987] 217-225; y
Dawson, Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).
El vector de expresión puede contener también
secuencias que actúan sobre el promotor amplificando la expresión,
por ejemplo los elementos de acción cis (intensificadores) SV40, CMV
y polioma, y un marcador seleccionable puede proporcionar un rasgo
fenotípico para selección (p. ej. dihidrofolato reductasa o
resistencia a la neomicina para células de mamíferos o resistencia a
la ampicilina/tetraciclina para E. coli). La selección del
vector apropiado que contiene el promotor y el marcador de selección
apropiados cae dentro del nivel de conocimientos de los expertos en
la técnica.
El término "construcción", que es sinónimo
de términos tales como "conjugado", "casete" e
"híbrido", incluye la secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la presente invención unida directa o indirectamente a un promotor.
Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo
espaciador adecuado tal como una secuencia intrón, tal como el
intrón Sh1 o el intrón ADH, entre el promotor y la secuencia de
nucleótidos de la presente invención. Otro tanto es cierto para el
término "fusionado" en relación con la presente invención, que
incluye unión directa o indirecta. En cada caso, los términos no
cubren la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína asociada normalmente con el promotor del gen de
tipo silvestre y cuando están ambos en su entorno natural.
La construcción puede incluso contener o expresar
un marcador que permite la selección de la construcción genética en,
por ejemplo, células de mamífero, de levadura, de insecto, fúngicas
o bacterianas.
Existen varios marcadores que pueden usarse,
tales como, por ejemplo, los que proporcionan resistencia a los
antiobióticos contra G418, higromicina, bleomicina, kanamicina y
gentamicina.
Preferentemente la construcción de la presente
invención comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la
presente invención unida operativamente a un promotor.
El término "vector" incluye vectores de
expresión, vectores de transformación, vectores de clonación y
vectores lanzadera. El término "vector de expresión" significa
una construcción capaz de expresión "in vivo" o "in
vitro".
La expresión "vector de transformación"
significa una construcción capaz de ser transferida de una entidad a
otra, que puede ser de la misma especie o puede ser de una especie
diferente. Si la construcción es capaz de ser transferida desde una
especie a otra, por ejemplo desde un vector viral tal como MMLV o
FIV a una célula o línea celular primaria humana o de mamífero,
entonces el vector de transformación se denomina a veces "vector
lanzadera".
Puede usarse una gran variedad de sistemas de
expresión en hospedadores diferentes. Por ejemplo, sistemas
episomal, cromosómico y derivados de virus (p. ej. vectores
derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, virus papova tal
como SV40, virus vaccinia, adenovirus y retrovirus).
La secuencia de DNA puede ser insertada en el
vector por una diversidad de técnicas. En general la secuencia de
DNA se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado
por procedimientos conocidos en la técnica y que se consideran al
alcance de los expertos en este campo. La secuencia de DNA en el
vector de expresión se une operativamente a secuencias de control
apropiadas que dirigen la síntesis de mRNA (es decir, el
promotor).
Los vectores de la presente invención pueden ser
transformados en una célula hospedadora adecuada como se describe
más adelante para proporcionar la expresión de un polipéptido de la
presente invención. Así, en otro aspecto, la invención proporciona
un procedimiento para preparar polipéptidos de acuerdo con la
presente invención, que comprende cultivar una célula hospedadora
transformada o transfectada con un vector de expresión como se
describió antes, bajo condiciones que proporcionan la expresión por
el vector de una secuencia codificadora que codifica los
polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de
plásmido, virus o bacteriófago (fago), provistos de un origen de la
replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del
polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.
Los vectores de la presente invención pueden
contener uno o más genes marcadores seleccionables. Los sistemas de
selección mas adecuados para microorganismos industriales son los
formados por el grupo de marcadores de selección que no requieren
una mutación en el organismo hospedador. Ejemplos de marcadores
fúngicos de selección son los genes para acetamidasa (amdS),
ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), fleomicina y resistencia al benomil (benA). Los
ejemplos de marcadores de selección no fúngicos son el gen
bacteriano de resistencia a la neomicina (este puede usarse también
en células de mamíferos y de levadura, pero no en hongos
filamentosos, el gen de la resistencia a la ampicilina (E.
coli), y el gen uidA de E. coli, que codifica la
glucuronidasa (GUS).
Los vectores pueden usarse in vitro, por
ejemplo para la producción de RNA o proteína (en sistemas de
transcripción/traducción in vitro), o usarse para transfectar
o transformar una célula hospedadora.
Así pues, los polinucleótidos de la presente
invención pueden ser incorporados en un vector recombinante
(típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de
clonación o de expresión. El vector puede usarse para replicar el
ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Así, en otra
realización, la invención proporciona un método para preparar
polinucleótidos de la presente invención introduciendo un
polinucleótido de la presente invención en un vector replicable,
introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y
desarrollando la célula hospedadora bajo condiciones que producen la
replicación del vector. El vector pude ser recuperado de la célula
hospedadora. Células hospedadoras adecuadas se describen más
adelante en relación con los vectores de expresión.
La presente invención se refiere también al uso
de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que
expresan un polipéptido PFI-017 o una variante,
homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, en métodos de
cribado para la identificación de moduladores (p. ej. antagonistas o
agonistas) de PFI-017. Tales células hospedadoras
modificadas por ingeniería podrían usarse para cribar librerías de
péptidos o moléculas orgánicas capaces de modular la actividad de
PFI-017. Los moduladores (p. ej. antagonistas) del
polipétido PFI-017, tales como anticuerpos, péptidos
o pequeñas moléculas orgánicas, proporcionarán la base para
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades
asociadas, por ejemplo, con PFI-017. Tales
moduladores (p. ej. antagonistas) pueden ser administrados solos o
en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de
tales enfermedades.
La presente invención se refiere también a
vectores de expresión y células hospedadoras que comprende
secuencias de polinucleótido que codifican PFI-017 o
una variante, un homólogo, un fragmento, un análogo o un derivado
del mismo para la producción in vivo o in vitro de
proteína PFI-017 o para cribar agentes que pueden
afectar a la expresión o la actividad de
PFI-017.
El término "tejido", como se usa en el
presente texto, incluye tejido tal cual u órgano.
La expresión "célula hospedadora", en
relación con la presente invención, incluye cualquier célula que
pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína recombinante de acuerdo con la presente invención y/o
productos obtenidos de la misma, en donde un promotor puede permitir
la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la
presente invención, cuando está presente en la célula
hospedadora.
Así pues, otra realización de la presente
invención proporciona células hospedadoras transformadas o
transfectadas con un polinucleótido de la presente invención.
Preferentemente, dicho polinucleótido es portado en un vector para
la replicación y expresión de dicho polinucleótido. Las células se
escogerán para que sean compatibles con dicho vector y, por ejemplo,
pueden ser procarióticas (por ejemplo células bacterianas), o
eucarióticas (es decir, células de mamífero, fúngicas, de insecto y
de levadura).
La introducción de polinucleótidos en células
hospedadoras puede efectuarse por métodos como los que se describen
en Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York,
NY, EE.UU. Estos métodos incluyen, pero sin limitarse a ellos,
transfección con fosfato cálcico, transfección mediada con
DEAE-dextrano, tranfección mediada por lípidos
catiónicos, electroporación, microinyección, transducción, carga por
raspado e introducción balística.
Los ejemplos de hospedadores representativos
incluyen células bacterianas (p. ej. E. coli,
Streptomyces), células fúngicas tales como células de
levaduras y Aspergillus, células de insectos tales como
células de Drosophila S2 y Spodoptera SF9, células de
animales tales como las células CHO, COS, HEK293, HeLa y 3T3. La
selección del hospedador apropiado se considera al alcance de los
expertos en la técnica.
Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido
que codifica el polipéptido de la presente invención, y/o si es de
desear posterior procesamiento de la proteína expresada, pueden
preferirse los hospedadores eucarióticos tales como levaduras u
otros hongos. En general, las células de levadura se prefieren sobre
las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin
embargo, algunas proteínas o son escasamente expresadas o segregadas
de la células de levadura, o bien en algunos casos no son procesadas
apropiadamente (p. ej. hiperglicosilación en levadura). En estos
casos, debe elegirse un organismo hospedador fúngico diferente.
Ejemplos de hospedadores de expresión adecuados
dentro del alcance de la presente invención son hongos tales como
las especies de Aspergillus (tal como se describen en los
documentos EP-A-0184438 y
EP-A-0284603) y las especies de
Trichoderma; bacterias tales como las especies de
Escherichia, las especies de Streptomyces y las
especies de Pseudomonas; y levaduras tales como las especies
de Kluyveromyces (tales como las descritas en los documentos
EP-A-0096430 y
EP-A-0301670) y las especies de
Saccharomyces. A título de ejemplo, los hospedadores de
expresión típicos pueden elegirse entre Aspergillus niger,
Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var.
awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus
nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei
Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe,
Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae.
El uso de células hospedadoras adecuadas, tales
como las células hospedadoras de mamífero, levadura, insectos y
fúngicas, puede proporcionar modificaciones
post-traduccionales (p. ej. miristoilación,
glicosilación, truncamiento y fosforilación de tirosina, serina o
treonina) como puede ser necesario para conferir actividad biológica
óptima en productos de expresión recombinantes de la presente
invención.
El término "organismo" en relación con la
presente invención incluye cualquier organismo, excepto humano, que
pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína recombinante de acuerdo con la presente invención, y/o
productos obtenidos de la misma, en el que un promotor puede
permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la presente invención cuando está presente en el organismo. Los
ejemplos de organismos incluyen hongos, levaduras o protozoos.
La expresión "organismo transgénico" en
relación con la presente invención incluye cualquier organismo,
excepto humano, que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína de acuerdo con la presente invención, y/o
productos obtenidos de la misma, en el que el promotor puede
permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la presente invención dentro del organismo. Preferentemente la
secuencia de nucleótidos está incorporada en el genoma del
organismo.
El organismo transgénico de la presente invención
incluye un organismo que comprende una cualquiera, o combinaciones,
de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos de acuerdo con la presente invención, construcciones de
acuerdo con la presente invención (incluyendo combinaciones de las
mismas), vectores de acuerdo con la presente invención, plásmido de
acuerdo con la presente invención, células de acuerdo con la
presente invención, y tejidos de acuerdo con la presente invención,
o los productos de los mismos. La célula u organismo transformados
podrían preparar cantidades aceptables del compuesto deseado que
sería fácilmente recuperable de la célula o del organismo.
Como se indicó anteriormente, el organismo
hospedador puede ser un organismo procariótico o uno eucariótico. Un
ejemplo de hospedador procariótico adecuado es E. coli. Las
enseñanzas sobre la transformación de hospedadores procarióticos
están bien documentadas en la técnica, por ejemplo véanse Sambrook
et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., 1989,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY, EE.UU.) y
Ausubel et al., (Current Protocols in Molecular Biology
(1995), John Wiley and Sons, Inc.).
En una realización preferida, el hospedador
transformado es una célula de mamífero o, por ejemplo, una célula de
insecto, en la que la introducción de polinucleótidos en dichas
células hospedadoras puede ser realizada por métodos como se
describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York, NY, EE.UU.). Estos métodos incluyen,
pero sin limitarse a ellos, transfección con fosfato cálcico,
transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección
mediada por lípidos catiónicos, electroporación, microinyección,
transducción, carga por raspado e introducción balística.
En otra realización el organismo transgénico
puede ser una levadura. En relación con esto, las levaduras han sido
también muy utilizadas como vehículo para la expresión génica
heteróloga. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene un
largo historial de uso industrial, incluyendo su uso para la
expresión génica heteróloga. La expresión de genes heterólogos en
Saccharomyces cerevisiae ha sido revisada por Goodey et
al. (1987, Yeast Biotechnology, D. R. Berry et al., ed.,
pp 401-429, Allen and Unwin, Londres) y por King
et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F.
Walton y G. T. Yarronton, ed., pp, 107-133, Blackie,
Glasgow). Una revisión de los principios de la expresión génica
heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de los
productos génicos viene dada en E. Hinchcliffe y E. Kenny ("Yeast
as a vehicle for the expresión of heterologous genes", 1993,
Yeasts, Vol. 5, Anthony H. Rose y J. Stuart Harrison, ed., 2ª
edición, Academic Press Ltd.). Se dispone de varios tipos de
vectores de levadura, incluyendo vectores integradores, que
requieren la recombinación con el genoma hospedador para su
mantenimiento, y vectores de plásmido que replican de forma
autónoma.
Para preparar el Saccharomyces
transgénico, se preparan construcciones de expresión insertando la
secuencia de nucleótidos de la presente invención en una
construcción diseñada para la expresión en levadura. Se han
desarrollado varios tipos de construcciones usadas para la expresión
heteróloga. Las construcciones contienen un promotor activo en
levadura fusionado con la secuencia de nucleótidos de la presente
invención, normalmente se usa un promotor originario de levadura,
tal como el promotor GAL1. Normalmente se usa una secuencia señal
originaria de levadura, tal como la secuencia que codifica el
péptido señal SUC2. Un terminador activo en levadura finaliza el
sistema de expresión.
Para la transformación de levadura se han
desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, puede
prepararse un Saccharomyces transgénico de acuerdo con la
presente invención siguiendo las enseñanzas de Hinnen et al.
(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,
75: 1929); Beggs, J. D, (1978, Nature, Londres, 275: 104) y Ito, H.
et al. (1983, J. Bacteriology 153:
163-168).
Las células de levadura transformadas se eligen
usando varios marcadores selectivos. Entre los marcadores usados
para la transformación hay cierto número de marcadores auxotróficos
tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores dominantes de resistencia
a antibióticos, tales como marcadores del antibiótico
aminoglicósido, p. ej. el G418.
Así pues, la presente invención proporciona
también un método para transformar una célula hospedadora con una
secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEC
ID No: 1 o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de
la misma.
Las células hospedadoras transformadas con una
secuencia de nucleótidos codificadora de PFI-017
pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión y
recuperación de la proteína codificada (en membranas de células) del
cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante
puede ser expresada en la superficie de la célula, segregada, o
puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia
y/o el vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, los
vectores de expresión que contienen secuencias codificadoras de
PFI-017 permitirán generalmente la expresión en la
membrana de la célula. Otras construcciones recombinantes pueden
reunir la secuencia codificadora de PFI-017 con una
secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptido que
facilite la purificación e identificación de la proteína (Kroll D.
J. et al. (1993) DNA Cell Biol. Vol. 12 p
441-53; véase también la anterior discusión de
vectores que contienen proteínas de fusión).
Una célula, preferentemente una célula animal,
que está "modificada genéticamente" es heterocigótica u
homocigótica para una modificación que se introduce en la célula, o
en una célula progenitora, mediante ingeniería genética. Los métodos
estándar de ingeniería genética de los que se dispone para
introducir la modificación incluyen recombinación homóloga, trampa
génica de vector viral, irradiación, mutagénesis química y la
expresión transgénica de una secuencia de nucleótidos que codifica
RNA antisentido solo o en combinación con ribozimas catalíticos. Los
métodos preferidos para la modificación genética son la
recombinación homóloga y la trampa génica de vector viral, que
modifican ambos un gen endógeno insertanto una secuencia extraña de
ácidos nucleicos en el locus del gen. Una secuencia de ácidos
nucleicos que es extraña al gen es una secuencia exógena que no se
presenta en el gen de forma natural. Esta inserción de DNA extraño
puede ocurrir dentro de cualquier región del gen de
PFI-017, p. ej. en un intensificador, un promotor,
una región reguladora, una región no codificadora, una región
codificadora, un intrón o un exón. El método más preferido de
ingeniería genética es la recombinación homóloga, en la que la
secuencia extraña de ácidos nucleicos es insertada de manera
dirigida a la diana, bien sea sola o en combinación con una deleción
de una parte de la secuencia génica endógena.
Por un gen de PFI-017 que está
"interrumpido funcionalmente" se entiende un gen de
PFI-017 que está modificado genéticamente de forma
que la actividad celular del polipéptido PFI-017
codificado por el gen interrumpido está disminuida en células que
normalmente expresan la versión de tipo silvestre del gen de
PFI-017. Cuando la modificación genética elimina
efectivamente todas las copias de tipo silvestre del gen de
PFI-017 en una célula (p. ej. la célula modificada
genéticamente, preferentemente una célula animal, es homocigótica
para la interrupción del gen de PFI-017 o todas las
copias de tipo silvestre del gen de PFI-017
originalmente presentes están ahora interrumpidas), entonces la
modificación genética tiene por resultado una reducción de la
actividad del polipéptido PFI-017 (es decir,
expresión del receptor reducida) en comparación con una célula
testigo apropiada que expresa el gen PFI-017 de tipo
silvestre. Esta reducción de la actividad del polipéptido
PFI-017 (es decir, expresión del receptor reducida)
resulta de la expresión reducida del gen PFI-017 (es
decir, los niveles de mRNA de PFI-017 están
efectivamente reducidos y producen niveles reducidos de polipéptido
PFI-017) y/o porque el gen PFI-017
interrumpido codifica un polipéptido mutado con función o
estabilidad reducida en comparación con un polipéptido
PFI-017 de tipo silvestre. Preferentemente, la
actividad (es decir, expresión del receptor reducida) del
polipéptido PFI-017 en la célula modificada
genéticamente está reducida al 50% o menos de los niveles de la del
tipo silvestre, más preferentemente al 25% o menos, e incluso más
preferentemente al 10% o menos de los niveles del tipo silvestre. Lo
más preferentemente, la interrupción del gen PFI-017
tiene por resultado una mutación nula.
Por una "célula animal modificada
genéticamente" que contiene un gen PFI-017
funcionalmente interrumpido se entiende una célula animal,
incluyendo una célula humana aislada, creada tratándola por
ingeniería genética para que contenga un gen PFI-017
funcionalmente interrumpido, así como células hijas que heredan el
gen PFI-017 interrumpido. Estas células pueden ser
modificadas genéticamente en cultivo de acuerdo con cualquier método
estándar conocido en la técnica. Como alternativa a la modificación
genética de las células en cultivo, también pueden aislarse células
de mamífero no humanas a partir de un mamífero no humano modificado
genéticamente que contiene una interrupción del gen
PFI-017. Las células animales de la presente
invención pueden obtenerse a partir de células primarias o
preparados de tejidos, así como de líneas de células adaptadas en
cultivo, tumorigénicas o transformadas. Esta células y líneas de
células se derivan, por ejemplo, de células endoteliales, células
epiteliales, islotes, neuronas y otras células derivadas de tejido
nervioso, células mesoteliales, osteocitos, linfocitos, condrocitos,
células hematopoyéticas, células inmunitarias, células de las
glándulas u órganos principales (p. ej. hígado, pulmón, corazón,
estómago, páncreas, riñón y piel), células musculares (incluyendo
células del músculo esquelético, músculo liso y músculo cardíaco),
células exocrinas o endocrinas, fibroblastos y células madre no
humanas embrionarias y otras totipotenciales o pluripotenciales (p.
ej. células madre embrionarias (ES: Embryonic Stem cells), células
similares a ES y células germinales embrionarias (EG), y otras
células madre tales como células progenitoras y células madre
derivadas de tejidos). Las células modificadas genéticamente
preferidas son las células ES, más preferentemente células ES de
ratón o de rata.
Una "región de homología" usada en un vector
de direccionamiento para recombinación homóloga con un gen
PFI-017 está relacionada (es decir, es
complementaria) con una porción del gen PFI-017 o
una secuencia que flanquea el gen PFI-017 en un
grado suficiente para permitir que tenga lugar la hibridación entre
la región de homología y la secuencia génica de
PFI-017 en condiciones estándar de rigor bajo
conocidas en la técnica (p. ej. como se describe en Current
Protocols in Human Genetics, unit 4.1, John Wiley and Sons, Nueva
York, NY, 2000).
Por "célula ES" o "célula similar a, o del
tipo ES" se entiende una célula madre pluripotencial derivada de
un embrión no humano, de una célula germinativa primordial no humana
o de un teratocarcinoma, que es capaz de autorrenovación indefinida
así como de diferenciación en tipos de células que son
representativas de las tres capas germinativas embrionarias.
Por "reducido" se entiende una disminución
estadísticamente significativa (es decir, p<0,1).
Las células animales modificadas genéticamente,
incluyendo células humanas aisladas, de la invención son
heterocigóticas u homocigóticas para una modificación que interrumpe
funcionalmente el gen PFI-017. Las células animales
pueden derivarse tratando por ingeniería genética células en
cultivo, o, en el caso de células de mamífero no humano, las células
pueden ser aisladas de mamíferos no humanos modificados
genéticamente.
El locus del gen PFI-017
está interrumpido funcionalmente por una de las diversas técnicas
para modificación genética conocidas en este campo, incluyendo
mutagénesis química (Rinchik, Trends in Genetics 7:
15-21, 1991, Russell, Environmental and Molecular
Mutagenesis 23 (Supl. 24) 23-29, 1994), irradiación
(Russell, supra), expresión transgénica de RNA antisentido
del gen PFI-017, bien solo o en combinación con una
secuencia de ribozima de RNA catalítica (Luyckx et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 96: 12174-79, 1999; Sokol et
al., Transgenic Research 5: 363-71, 1996; Efrat
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
2051-55, 1994; Larsson et al., Nucleic Acids
Research 22: 2242-48, 1994) y, como se discute más
adelante con mayor detalle, la interrupción del gen
PFI-017 por la inserción de una secuencia de ácidos
nucleicos extraña en el locus del gen
PFI-017. Preferentemente, la secuencia extraña es
insertada por recombinación homóloga o por inserción de un vector
viral. Lo más preferentemente, el método de interrupción del gen
PFI-017 es recombinación homóloga, e incluye una
deleción de una porción de la secuencia del gen endógeno de
PFI-017.
La integración de la secuencia extraña interrumpe
funcionalmente el gen PFI-017 a través de uno o más
de los siguientes mecanismos: interfiriendo con el proceso de
transcripción o de traducción del gen PFI-017 (p.
ej. interfiriendo con el reconocimiento del promotor, o
introduciendo un sitio de terminación de la transcripción o un codón
de parada de la traducción en el gen PFI-017; o
distorsionando la secuencia codificadora del gen
PFI-017 de forma que deje de codificar un
polipéptido PFI-017 con función normal de receptor
(p. ej. insertando una secuencia codificadora extraña en la
secuencia codificadora del gen PFI-017,
introduciendo una mutación del marco de lectura o sustitución de uno
o varios aminoácidos, o, en el caso de un evento de entrecruzamiento
doble, borrando una porción de la secuencia codificadora del gen
PFI-017 que se requiere para la expresión de una
proteína receptora funcional).
Para insertar una secuencia extraña en un
locus del gen PFI-017 en el genoma de una
célula, se introduce en la célula la secuencia extraña de DNA de
acuerdo con un método estándar conocido en la técnica, tal como
electroporación, precipitación con fosfato cálcico, infección
retroviral, microinyección, biobalística, transfección con
liposomas, transfección con DEAE-dextrano, o
transferinfección (véanse, p. ej., Neumann et al., EMBO J. 1:
841-845, 1982; Potter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 7161-65, 1984; Chu et al.,
Nucleic Acids Res. 15: 1311-26, 1987; Thomas y
Capecchi, Cell 51: 503-12, 1987; Baum et al.,
Biotechniques 17: 1058-62; Biewenga et al.,
J. Neuroscience Methods 71: 67-75, 1997; Zhang et
al., Biotechniques 15: 868-72, 1993; Ray y Gage,
Biotechniques 13: 598-603, 1992; Lo, Mol. Cell.
Biol. 3: 1803-14, 1983; Nickoloff et al.,
Mol. Biotech. 10: 93-101, 1998; Linney et
al., Dev. Biol.. (Orlando) 213: 207-16, 1999;
Zimmer y Gruss, Nature 338: 150-153, 1989; y
Robertson et al., Nature 323: 445-48, 1986).
El método preferido para introducir DNA extraño en una célula es la
electroporación.
El método de recombinación homóloga direcciona el
gen PFI-017 para la interrupción introduciendo un
vector de direccionamiento de PFI-017 en una célula
que contiene un gen PFI-017. La capacidad del vector
para direccionar el gen PFI-017 para la interrupción
procede de usar una secuencia de nucleótidos en el vector que es
homóloga respecto de la del gen PFI-017. Esta región
de homología facilita la hibridación entre el vector y la secuencia
endógena del gen PFI-017. Al hibridarse, la
probabilidad de un evento de entrecruzamiento entre el vector de
direccionamiento y las secuencias genómicas aumenta en gran medida.
Este evento de entrecruzamiento tiene por resultado la integración
de la secuencia del vector en el locus del gen de
PFI-017 y la interrupción funcional del gen
PFI-017.
Los principios generales relativos a la
construcción de vectores usados para direccionamiento se revisan en
Bradley et al. (Biotechnol. 10: 534, 1992). Pueden usarse dos
tipos de ejemplos de vector distintos para insertar DNA por
recombinación homóloga; un vector de inserción o un vector de
reemplazamiento. Un vector de inserción es DNA circular que contiene
una región de homología con el gen PFI-017 con una
rotura de la doble hebra. Después de la hibridación entre la región
de homología y el gen PFI-017 endógeno, un evento
simple de entrecruzamiento en la rotura de la doble hebra tiene por
resultado la inserción de la secuencia del vector entera en el gen
endógeno en el sitio de entrecruzamiento.
El vector más preferido para ser usado para
recombinación homóloga es un vector de reemplazamiento que es
colineal en vez de circular. La integración del vector de
reemplazamiento en el gen PFI-017 requiere un evento
de doble entrecruzamiento, es decir entrecruzamiento en dos sitios
de hibridación entre el vector de direccionamiento y el gen
PFI-017. Este doble evento de entrecruzamiento tiene
por resultado la integración de la secuencia del vector que está
emparedada entre los dos sitios de entrecruzamiento en el gen
PFI-017 y la deleción de la correspondiente
secuencia génica PFI-017 endógena que originalmente
se extendía entre los dos sitios de entrecruzamiento (véanse, p. ej.
Thomas y Capecchi et al., Cell 51: 503-12,
1987; Mansour et al., Nature 336: 348-52,
1988; Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
7688-7692, 1990; y Mansour, GATA 7:
219-227, 1990).
Una región de homología en un vector de
direccionamiento es generalmente de al menos 100 nucleótidos de
longitud. Lo más preferentemente, la región de homología es al menos
de 1 a 5 kilobases (Kb) de longitud. Aunque no se ha demostrado una
longitud mínima o un grado mínimo de relación requerido para una
región de homología, la eficiencia de direccionamiento para la
recombinación homóloga se corresponde generalmente con la longitud y
el grado de relación entre el vector de direccionamiento y el
locus del gen PFI-017. En el caso en que se
use un vector de reemplazamiento, y una parte del gen
PFI-017 endógeno se borre al tener lugar la
recombinación homóloga, una consideración adicional es el tamaño de
la parte borrada del gen PFI-017 endógeno. Si esta
parte del gen PFI-017 endógeno tiene una longitud
mayor que 1 Kb, se recomienda entonces una casete de
direccionamiento con regiones de homología que son más largas que 1
Kb para mejorar la eficiencia de recombinación. Otras
recomendaciones relativas a la selección y el uso de secuencias
efectivas para recombinación homóloga se describen en la
bibliografía (véanse, p. ej., Deng y Capecchi, Mol. Cell. Biol.. 12:
3365-3371, 1992; Bollag et al., Annu. Rev.
Genet. 23: 199-225, 1989; y Waldman y Liskay, Mol.
Cell. Biol. 8: 5350-5357, 1988).
Puede usarse una gran variedad de vectores de
clonación como esqueletos de vectores en la construcción de vectores
de direccionamiento del gen PFI-017, incluyendo
plásmidos relacionados con pBluescript (p. ej. pBluescript KS+11),
pQE70, pQE60, pQE-9, pBS, pD10, phagescript,
phi-X-174, pBK Phagemid, pNH8A,
pNH16a, pNH18Z, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540 y pRIT5 PWLNEO, pSV2CAT, pXT1, pSG
(Stratagene), pSVK3, PBPV, PMSG y pSVL, PBR322 y vectores basados en
PBR322, pBM9, PBR325, pKH47, pBR328, pHC79, fago Charon 28, pKB11,
pKSV-10, plásmidos relacionados con pK19, plásmidos
pUC, y la serie pGEM de plásmidos. Estos vectores están disponibles
en una gran variedad de fuentes comerciales (p. ej. Boehringer
Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN; Qiagen, Valencia, CA;
Stratagene, La Jolla, CA; Promega, Madison, WI; y New England
Biolabs, Beverly, MA). Sin embargo, puede usarse cualquier otro
vector, p. ej. plásmidos, virus o partes de los mismos, siempre y
cuando sea replicable y viable en el hospedador deseado. El vector
puede comprender también secuencias que le permitan replicarse en el
hospedador cuyo genoma se va a modificar. El uso de tal vector puede
agrandar el periodo de interacción durante el cual puede tener lugar
la recombinación, aumentando la eficacia del direccionamiento (véase
Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Unit 9.16, Fig.
9.16.1).
El hospedador específico empleado para propagar
los vectores de direccionamiento descritos antes no es crítico. Los
ejemplos incluyen E. coli K12 RR1 (Bolivar et al.,
Gene 2: 95, 1977), E. coli K12 HB101 (ATCC nº 33694), E.
coli MM21 (ATCC nº 336780), E. coli DH1 (ATCC nº 33849),
E. coli cepa DH5\alpha, y E. coli STBL2.
Alternativamente, pueden usarse hospedadores tales como S.
cerevisiae. Los hospedadores anteriormente mencionados son
disponibles comercialmente (p. ej. Stratagene, La Jolla, CA; y Life
Technologies, Rockville, MD).
Para crear el vector de direccionamiento, se
añade una construcción de direccionamiento del gen
PFI-017 al esqueleto del vector antes mencionado.
Los construcciones de direccionamiento del gen
PFI-017 descritas antes tienen al menos una región
de homología del gen PFI-017. Para hacer las
regiones de homología del gen PFI-017 se usa una
secuencia relacionada con el gen PFI-017 como base
para producir cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Estos cebadores se usan para amplificar o multiplicar la
región deseada de la secuencia de PFI-017 mediante
amplificación por PCR de alta fidelidad (Mattila et al.,
Nucleic Acids Res. 19: 4967, 1991; Eckert y Kunkel 1: 17, 1991; y
patente de EE.UU. nº 4.683.202). La secuencia genómica se obtiene a
partir de una genoteca de clones genómicos o de una preparación de
DNA genómico, preferentemente procedente de la especie animal que se
va a direccionar para la interrupción del gen
PFI-017.
Preferentemente, las construcciones de
direccionamiento descritas antes incluyen también una secuencia de
nucleótidos exógena que codifica una proteína marcador positivo. La
expresión estable de un marcador positivo después de la integración
del vector confiere una característica identificable en la célula
sin comprometer la viabilidad de la misma. Por consiguiente, en el
caso de un vector de reemplazamiento, el gen marcador se sitúa entre
dos regiones de homología flanqueantes de forma que se integra en el
gen PFI-017 después del evento de doble
entrecruzamiento.
Se prefiere que la proteína marcador positivo sea
una proteína seleccionable; la expresión estable de tal proteína en
una célula confiere una característica fenotípica seleccionable, es
decir, la característica intensifica la supervivencia de la célula
bajo condiciones que, de otra forma, serían letales. Así, imponiendo
la condición seleccionable se pueden aislar células que expresan
establemente el marcador seleccionable positivo sobre la base de la
viabilidad. Los ejemplos de proteínas marcador seleccionable
positivo (y sus agentes de selección) incluyen Neo (G148 o
kanamicina), Hyg (higromicina), HisD (histidinol), Gpt (xantina),
Ble (bleomicina) y Hprt (hipoxantina) (véanse, p. ej., Capecchi y
Thomas, patente de EE.UU. nº 5.464.764, y Capecchi, Science 244:
1288-92, 1989). Otros marcadores positivos que
también pueden usarse como alternativa para un marcador
seleccionable incluyen proteínas informadoras ("reporter")
tales como \beta-galactosidasa, luciferasa de la
luciérnaga o proteína fluorescente verde (véanse, p. ej., Current
Protocols in Cytometry, Unit 9.5, y Current Protocols in Molecular
Biology, Unit 9.6, John Wiley ans Sons, Nueva York, NY, 2000).
El esquema de selección positiva anteriormente
descrito no distingue entre células que han integrado el vector por
recombinación homóloga direccionada en el locus del gen
PFI-017, frente a la integración aleatoria no
homóloga de la secuencia vectora en cualquier posición cromo
somática. Por tanto, cuando se usa un vector de reemplazamiento para
la recombinación homóloga, se prefiere también incluir una secuencia
de nucleótidos que codifique una proteína marcador seleccionable
negativo. La expresión de un marcador seleccionable negativo hace
que una célula que exprese el marcador pierda viabilidad cuando se
expone a un determinado agente (esto es, la proteína marcadora se
hace letal para la célula bajo ciertas condiciones seleccionables).
Los ejemplos de marcadores seleccionables negativos (y sus agentes
de letalidad) incluyen timidina cinasa del virus herpes simplex
(gancyclovir o
1,2-desoxi-2-fluoro-\alpha-d-arabinofuranosil-5-yodouracilo),
Hprt (6-tioguanina o 6-tioxantina) y
toxina de difteria, toxina ricina y citosina desaminasa
(5-fluorocitosina).
La secuencia de nucleótidos que codifica el
marcador seleccionable negativo se sitúa fuera de las dos regiones
de homología del vector de reemplazamiento. Dada esta posición, las
células solamente integrarán y expresarán establemente el marcador
seleccionable negativo si la integración ocurre por recombinación
aleatoria no homóloga; la recombinación homóloga entre el gen
PFI-017 y las dos regiones de homología en la
construcción de direccionamiento excluye de la integración la
secuencia que codifica el marcador seleccionable negativo. Así,
imponiendo la condición negativa, las células que han integrado el
vector de direccionamiento por recombinación aleatoria no homóloga
pierden viabilidad.
La combinación antes descrita de marcadores
seleccionables positivos y negativos se prefiere porque puede
diseñarse una serie de pasos de selección positiva y negativa para
seleccionar más eficientemente solamente aquellas células que han
experimentado la integración del vector por recombinación homóloga
y, por tanto, tienen un gen PFI-017 potencialmente
interrumpido. Otros ejemplos de esquemas de selección
positiva-negativa, marcadores seleccionables y
construcciones de direccionamiento se describen, por ejemplo, en la
patente de EE.UU. nº 5.464.764, el documento WO 94/06908, y en
Valancius y Smithies, Mol. Cell. Biol.. 11: 1402, 1991.
Para que una proteína marcadora se exprese
establemente al integrarse el vector, el vector de direccionamiento
puede ser diseñado de forma que la secuencia codificadora del
marcador esté unida operativamente al promotor del gen
PFI-017 endógeno al tener lugar la integración del
vector. La expresión del marcador es después impulsada por el
promotor del gen PFI-017 en células que expresan
normalmente el gen PFI-017. Alternativamente, cada
marcador en la construcción de direccionamiento del vector puede
contener su propio promotor que impulsa la expresión
independientemente del promotor del gen PFI-017.
Este último esquema tiene la ventaja de permitir la expresión de
marcadores en células que típicamente no expresan el gen
PFI-017 (Smith y Berg, Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 49: 171, 1984; Sedivy y Sharp, Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 86: 227: 1989; Thomas y Capecchi, Cel 51: 503, 1987).
Los promotores exógenos que pueden ser usados
para impulsar la expresión génica del marcador incluyen promotores
específicos de la célula o específicos de la etapa, promotores
constitutivos, y promotores inducibles o regulables. Los ejemplos no
limitantes de estos promotores incluyen el promotor de timidina
cinasa del herpes simplex, promotor/intensificador del
citomegalovirus (CMV), promotores SV40, promotor PGK,
PMC1-neo, promotor de metalotioneína, promotor
tardío del adenovirus, promotor 7,5K del virus vaccinia, promotor de
beta globina aviar, promotores de histona (p. ej. histona
H3-614 de ratón), promotor de beta actina, enolasa
específica de las neuronas, promotor de actina del músculo, y el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (véase de un modo
general, Sambrook et al., Molecular Cloning, vol.
I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1989, y Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 2000; Stratagene,
La Jolla, CA).
Para confirmar si las células han integrado la
secuencia vectora en el locus del gen PFI-017
direccionado, pueden usarse cebadores o sondas genómicas que son
específicas para el evento de integración del vector deseada, en
combinación con PCR o análisis de transferencia Southern para
identificar la presencia de la integración del vector deseada en el
locus del gen PFI-017 (Erlich et al.,
Science 252: 1643-51, 1991; Zimmer y Gruss, Nature
338: 150, 1989; Mouellic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
87: 4712, 1990; y Shesely et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:
4294, 1991).
Otro método disponible para insertar una
secuencia extraña de ácido nucleico en el locus del gen
PFI-017 para interrumpir funcionalmente el gen
PFI-017, es la trampa de genes. Este método se
aprovecha de la maquinaria celular presente en todas las células de
mamífero, que corta y empalma exones en mRNA para insertar en un gen
una secuencia codificadora de un vector de trampa de genes, de una
forma aleatoria. Una vez insertado, el vector trampa de genes crea
una mutación que puede interrumpir funcionalmente el gen
PFI-017 atrapado. Al contrario que la recombinación
homóloga, este sistema de mutagénesis crea mutaciones muy
aleatorias. Así, para obtener una célula modificada genéticamente
que contiene un gen PFI-017 interrumpido
funcionalmente, han de identificarse células que contienen esta
mutación en particular y seleccionarlas entre un conjunto de células
que contienen mutaciones aleatorias en una diversidad de genes.
Se han descrito sistemas de trampa de genes y
vectores para ser usados para modificar genéticamente células
murinas y otros tipos de células (véanse, p. ej., Allen et
al., Nature 333: 852-55, 1988; Bellen et
al., Genes Dev. 3: 1288-1300, 1989; Bier et
al., Genes Dev. 3: 1273-1287, 1989; Bonnerot
et al., J. Virol. 66: 4982-91; Brenner et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 5517-21,
1989; Chang et al., Virology 193: 737-47,
1993; Friedrich y Soriano, Methods Enzymol. 225:
681-701, 1993; Friedrich y Soriano, Genes Dev. 5:
1513-23, 1991; Goff, Methods Enzymol. 152:
469-81, 1987; Gossler et al., Science 244:
463-65, 1989; Hope, Develop. 113:
399-408, 1991; Kerr et al., Cold Spring Harb.
Symp. Quant. Biol. 2: 767-776, 1989; Reddy et
al., J. Virol. 65: 1507-1515, 1991; Reddy et
al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 6721-25,
1992; Skarnes et al., Genes Dev. 6: 903-918,
1992; von Melchner y Ruley, J. Virol. 63: 3227-3233,
1989; y Yoshida et al., Transgen. Res. 4:
277-87, 1995).
Los vectores trampa del promotor (trampa 5')
contienen, en orden 5' a 3', una secuencia aceptora de ayuste
seguida por un exón, que está caracterizada típicamente por un codón
de iniciación de la traducción y marco de lectura abierto (ORF) y/o
un sitio interno de entrada al ribosoma. En general, estos vectores
trampa de promotor no contienen promotores ni secuencias donadoras
de ayuste enlazadas operativamente. En consecuencia, después de la
integración en el genoma celular de la célula hospedadora, la
secuencia del vector trampa del promotor intercepta el ayuste normal
del gen secuencia arriba y actúa como un exón terminal. La expresión
de la secuencia codificadora del vector es dependiente del vector
que se integra en un intrón del gen interrumpido en el marco de
lectura apropiado. En tal caso, la maquinaria celular de ayuste
corta y empalma exones del gen atrapado secuencia arriba de la
secuencia codificadora del vector (Zambrowicz et al., WO
99/50426).
Un método alternativo para producir un efecto
similar al vector trampa de promotor anteriormente descrito es un
vector que incorpora un juego anidado de codones de parada presente,
o si no construido por ingeniería genética, en la región entre el
aceptor de ayuste del vector trampa del promotor y el codón de
iniciación de la traducción o secuencia de poliadenilación. La
secuencia de codificación puede ser también construida por
ingeniería genética para que contenga un sitio independiente de
entrada al ribosoma (IRES: Independent Ribosome Entry Site) de forma
que la secuencia de codificación se expresará de una manera en gran
medida independiente del sitio de integración dentro del genoma de
la célula hospedadora. Típicamente, pero no necesariamente, se usa
un IRES junto con un conjunto anidado de codones de parada.
Otro tipo de esquema de atrapamiento de genes
utiliza un vector trampa de genes 3'. Este tipo de vector contiene,
en combinación operativa, una región promotora, que media en la
expresión de una secuencia de codificación contigua, la secuencia de
codificación, y una secuencia donadora de ayuste que define el
extremo 3' del exón de la secuencia codificadora. Después de la
integración en el genoma de una célula hospedadora, el transcrito
expresado por el promotor del vector es empalmado a una secuencia
aceptora de ayuste a partir del gen atrapado que está situado
secuencia abajo de la secuencia del vector trampa de genes
integrado. Así, la integración del vector tiene por resultado la
expresión de un transcrito de fusión que comprende la secuencia de
codificación de la casete trampa de genes 3' y cualquier exón
celular secuencia abajo, incluyendo el exón terminal y su señal de
poliadenilación. Cuando tales vectores se integran en un gen, la
maquinaria celular de ayuste empalma la secuencia codificadora del
vector secuencia arriba de los exones 3' del gen atrapado. Una
ventaja de tales vectores es que la expresión de los vectores trampa
de genes 3' está impulsada por un promotor en el interior de la
casete de trampa de genes y no requiere integración en un gen que
sea expresado normalmente en la célula hospedadora (Zambrowicz et
al., WO 99/50426). Los ejemplos de promotores transcripcionales
e intensificadores que pueden incorporarse al vector trampa de genes
3' incluyen los que se han discutido anteriormente con respecto a
vectores de direccionamiento.
El esqueleto del vector viral usado como
componente estructural para el promotor o vector trampa de genes 3'
puede elegirse entre una variedad de vectores que pueden ser
insertados en el genoma de una célula diana. Los vectores esqueleto
adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, vectores de virus
del herpes simples, vectores de adenovirus, vectores de virus
adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores
lentivirales, virus de la pseudorrabia, vectores de virus de
alfa-herpes, y similares. Puede encontrarse una
revisión minuciosa de los vectores virales, en particular vectores
virales adecuados para modificar células no replicantes, y de cómo
usar estos vectores junto con la expresión de una secuencia de
polinucleótidos exógena, en Viral Vectors; Gene Therapy and
Neuroscience Applications, Ed. Caplitt y Loewy, Academic Press,
San Diego, 1995.
Preferentemente se usan vectores retrovirales
para el atrapamiento de genes. Estos vectores pueden ser usados
junto con líneas de células de empaquetamiento retrovirales tales
como las descritas en la patente de EE.UU. nº 5.449.614. Cuando se
usan células de mamífero no murino como célula diana para la
modificación genética, pueden usarse líneas de células de
empaquetamiento anfotrópicas o pantrópicas para empaquetar los
vectores adecuados (Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93; 11400-11406, 1996). Vectores retrovirales
representativos que pueden ser adaptados para crear los vectores
trampa de genes 3' descritos actualmente, se describen, por ejemplo,
en la patente de EE.UU. nº 5.521.076.
Los vectores trampa de genes pueden contener uno
o más de los genes marcadores positivos discutidos anteriormente en
relación con los vectores de direccionamiento usados para la
recombinación homóloga. Al igual que su uso en vectores de
direccionamiento, estos marcadores positivos se usan en vectores
trampa de genes para identificar y seleccionar células que han
integrado el vector en el genoma celular. El gen marcador puede ser
construido para que contenga un sitio independiente de entrada al
ribosoma (IRES) de forma que el marcador se exprese de manera
independiente en gran medida de la posición en la que el vector se
ha integrado en el genoma de la célula
diana.
diana.
Dado que los vectores trampa del gen se
integrarán en el genoma de células hospedadoras infectadas, de una
manera completamente aleatoria, una célula modificada genéticamente
que tiene un gen PFI-017 interrumpido ha de ser
identificada entre una población de células que han experimentado la
integración aleatoria del vector. Preferentemente, las
modificaciones genéticas en la población de células son de
aleatoriedad y frecuencia suficientes como para que la población
represente mutaciones en esencialmente cada gen que se encuentra en
el genoma de la célula, haciendo probable que se identifique entre
la población una célula con un gen PFI-017
interrumpido (véanse Zambrowicz et al., WO 99/50426; Sands
et al., WO 98/14614).
Las líneas de células mutantes que contienen un
gen PFI-017 interrumpido se identifican en una
población de células mutadas usando, por ejemplo, transcripción
inversa y PCR (RT-PCR) para identificar una mutación
en una secuencia del gen PFI-017. Este proceso puede
hacerse más eficiente agrupando clones. Por ejemplo, para encontrar
un clon individual que contiene un gen PFI-017
interrumpido, se realiza la RT-PCR usando un cebador
anclado en el vector trampa del gen y el otro cebador situado en la
secuencia del gen PFI-017. Un resultado positivo de
la RT-PCR indica que la secuencia del vector está
codificada en el transcrito del gen PFI-017,
indicando que el gen PFI-017 ha sido interrumpido
por un evento de integración de la trampa de genes (véase, por
ejemplo, Sands et al., WO 98/14614).
Una interrupción funcional del gen
PFI-017 endógeno puede ocurrir en etapas de
desarrollo o ciclos celulares específicos (interrupción temporal) o
en tipos de células concretos (interrupción espacial). La
interrupción del gen PFI-017 puede ser también
inducible cuando están presentes determinadas condiciones. Puede
usarse un sistema de escisión de recombinasa, tal como un sistema
Cre-Lox, para activar o inactivar el gen
PFI-017 en una etapa del desarrollo específica, en
un tipo particular de tejido o de célula, o bajo condiciones
particulares del entorno. Generalmente, se llevan a cabo métodos que
utilizan la tecnología de Cre-Lox, como se describe
en Torres y Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional Gene
Targeting, Oxford University Press, 1997. También puede
utilizarse una metodología similar a la descrita para el sistema
Cre-Lox utilizando el sistema
FLP-FRT. Se proporcionan más indicaciones relativas
al uso de sistemas de escisión con recombinasa para interrumpir
genes condicionalmente por recombinación homóloga o inserción viral,
por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.626.159, patente de EE.UU.
nº 5.527.695, patente de EE.UU. nº 5.434.066, documento WO 98/29533,
Orban et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:
6861-65, 1992; O'Gorman et al., Science 251:
1321-55, 1991; Sauer et al., Nucleic Acids
Research 17: 147-61, 1989; Barinaga, Science 265:
26-28, 1994; y Akagi et al., Nucleic Acids
Res. 25: 1766-73, 1997. Puede usarse más de un
sistema de recombinasa para modificar genéticamente una célula
animal.
Cuando se usa recombinación homóloga para
interrumpir el gen PFI-017 de un modo temporal,
espacial o inducible, usando un sistema de recombinasa tal como el
sistema Cre-Lox, una parte de la región de
codificación del gen PFI-017 es reemplazada por una
construcción de direccionamiento que comprende la región de
codificación del gen PFI-017 flanqueada por sitios
loxP. Las células animales que llevan esta modificación genética
contienen un gen funcional PFI-017 flanqueado por
loxP. El aspecto temporal, espacial o inducible de la interrupción
del gen PFI-017 es causado por el patrón de
expresión de un transgén adicional, un transgén de recombinasa Cre,
que se expresa en la célula animal bajo el control del promotor
deseado regulado espacialmente, regulado temporalmente o inducible,
repectivamente. Una recombinasa Cre direcciona los sitios loxP para
la recombinación. Por consiguiente, cuando se activa la expresión de
Cre, los sitios loxP experimentan recombinación para escindir la
secuencia de codificación del gen PFI-017
emparedada, dando por resultado una interrupción funcional del gen
PFI-017 (Rajewski et al., J. Clin. Invest. 98:
600-03, 1996; St.-Onge et al., Nucleic Acids
Res. 24: 3875-77, 1996; Agah et al., J. Cli.
Invest. 100; 169-79, 1997; Brocard et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14559-73, 1997; Feil
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:
10887-90, 1996; y Kühn et al., Science 269:
1427-29, 1995).
Puede generarse una célula que contiene tanto un
trasgén de recombinasa Cre como un gen PFI-017
flanqueado por loxP, mediante técnicas trasgénicas estándar. Otras
indicaciones relativas al uso de promotores específicos para los
sistemas de recombinasa para interrumpir el gen
PFI-017 temporalmente, espacialmente o
condicionalmente se encuentran, por ejemplo, en Sauer, Meth. Enz.
225: 890-900, 1993, Gu et al., Science
265:103-06, 1994, Araki et al., J. Biochem.
122: 977-82, 1997, Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci.
93: 6191-96, 1996, y Meyers et al., Nature
Genetics 18: 136-41, 1998.
Una interrupción inducible del gen
PFI-017 puede conseguirse también usando un sistema
binario con respuesta a la tetraciclina (Gossen y Bujard, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51, 1992). Este
sistema implica modificar genéticamente una célula para introducir
un promotor Tet en el elemento regulador del gen
PFI-017 endógeno y un trasgén que expresa un
represor controlable por tetraciclina (TetR). En tal célula, la
administración de tetraciclina activa el TetR que, a su vez, inhibe
la expresión del gen PFI-017 y, por consiguiente,
interrumpe funcionalmente el gen PFI-017
(St-Onge et al., Nucleic Acids Res. 24:
3875-77, 1996, patente de EE.UU. nº 5.922.927).
Los sistemas anteriormente descritos para
interrupciones temporal, espacial e inducible del gen
PFI-017 pueden adoptarse también cuando se usa la
trampa de genes como método de modificación genética, por ejemplo,
como se describe en el documento WO 98/29533.
Los métodos de modificación genética antes
descritos pueden ser usados para interrumpir funcionalmente un gen
PFI-017 en prácticamente cualquier tipo de célula
somática o célula madre derivada de un animal. Las células animales
modificadas genéticamente de la presente invención incluyen, pero
sin limitarse a ellas, células de mamífero, incluyendo células
humanas, y células de ave. Estas células pueden derivarse de la
ingeniería genética de cualquier línea de células animales, tales
como líneas de células adaptadas en cultivo, tumorigénicas o
transformadas, o pueden ser aisladas de un mamífero no humano
modificado genéticamente, que lleve la modificación genética de
PFI-017 deseada.
Las células pueden ser heterocigóticas u
homocigóticas para el gen PFI-017 interrumpido. Para
obtener células que son homocigóticas para la interrupción del gen
PFI-017 (PFI-017-/-), puede
realizarse el direccionamiento directo secuencial de ambos alelos.
Este proceso puede facilitarse reciclando un marcador seleccionable
positivo. De acuerdo con este esquema, la secuencia de nucleótidos
que codifica el marcador seleccionable positivo es elimina después
de la interrupción de un alelo usando el sistema
Cre-Lox P. Así, el mismo vector puede ser usado en
una posterior ronda de direccionamiento para interrumpir el segundo
alelo del gen PFI-017 (Abuin y Bradley, Mol. Cell.
Biol. 16: 1851-56, 1996; Sedivy et al.,
T.I.G. 15: 88-90, 1999; Cruz et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7170-74, 1991; Mortensen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:
7036-40, 1991; te Riele et al., Nature 348:
649-651, 1990).
Una estrategia alternativa para obtener células
ES no humanas que son PFI-017-/- es la
homogenotización de células a partir de una población de células que
es heterocigótica para la interrupción del gen
PFI-017 (PFI-017+/-). El método
utiliza un esquema en el que se seleccionan clones direccionados de
PFI-017+/- que expresan un marcador seleccionable de
resistencia a un fármaco frente a una concentración de fármaco muy
elevada; esta selección favorece a las células que expresan dos
copias de la secuencia que codifica el marcador de la resistencia al
fármaco y son, por tanto, homocigóticos para la interrupción del gen
PFI-017 (Mortensen et al., Mol. Cell. Biol.
12: 2391-95, 1992).
Después de la modificación genética de la célula
o línea celular deseada, el locus del gen
PFI-017 puede ser confirmado como sitio de
modificación por análisis de PCR de acuerdo con métodos estándar de
PCR o de transferencia Southern conocidos en la técnica (véanse, p.
ej., la patente de EE.UU. nº 4.683.292; y Erlich et al.,
Science 252: 1643, 1991). También puede hacerse una posterior
verificación de la interrupción funcional del gen
PFI-017 si los niveles de RNA mensajero (mRNA) del
gen PFI-017 y/o los niveles de polipéptido
PFI-017 están reducidos en las células que
normalmente expresan el gen PFI-017. Pueden
obtenerse medidas de los niveles de mRNA del gen
PFI-017 usando la reacción en cadena de la
polimerasa mediada por transcriptasa inversa
(RT-PCR), análisis de transferencia Northern o
hibridación in situ. La cuantificación de los niveles de
polipéptido PFI-017 producido por las células puede
hacerse, por ejemplo, por métodos estándar de inmunoensayo conocidos
en la técnica. Tales inmunoensayos incluyen, pero sin limitarse a
ellos, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que
utilizan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de
inmunosorbente ligado a una enzima), inmunoensayos de tipo
"sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de
precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión,
inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcadores
enzimáticos o de radioisótopos, por ejemplo), transferencias
Western, análisis en gel bidimensional, reacciones de precipitación,
ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de
inmunoelectroforesis.
Las células animales modificadas genéticamente
preferidas son las células madre embrionarias (ES) no humanas y
células del tipo ES. Estas células se derivan de la preimplantación
de embriones y blastocitos de varias especies, tales como ratones
(Evans et al., Nature 129: 154-156, 1981);
Martin, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78: 7635-7638,
1981), cerdos y ovejas (Notanianni et al., J. Reprod. Fert.
Suppl., 43: 255-260, 1991; Campbell et al.,
Nature 380: 64-68, 1996) y primates (Thomson et
al., patente de EE.UU. nº 5.843.780, Thomson et al.,
Science 282: 1145-1147, 1995; y Thomson et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848,
1995).
Estos tipos de células son pluripotenciales. Es
decir, bajo las condiciones apropiadas, se diferencian en una amplia
variedad de tipos de células derivados de las tres capas germinales
embrionarias: ectodermo, mesodermo y endodermo. Dependiendo de las
condiciones de cultivo, puede cultivarse indefinidamente una muestra
de células ES como células madre, permitiendo que se diferencien en
una amplia variedad de tipos distintos de células dentro de una
célula individual, o dirigiéndolas a diferenciarse en un tipo de
célula específico, tal como células similares a los macrófagos,
células neuronales, cardiomiocitos, adipocitos, células del músculo
liso, células endoteliales, células del músculo esquelético,
queratinocitos, y células hematopoyéticas, tales como eosinófilos,
mastocitos, células progenitoras eritroides, o megacariocitos. La
diferenciación dirigida se realiza incluyendo factores de
crecimiento específicos o componentes matriz en las condiciones de
cultivo, como se describe con más detalle, por ejemplo, en Keller
et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7: 862-69,
1995, Li et al., Curr. Biol. 8: 971, 1998, Klug et
al., J. Clin. Invest. 98: 216-24, 1996, Lieschke
et al., Exp. Hematol. 23: 328-34, 1995,
Yamane et al., Blood 90: 3516-23, 1997, y
Hirashima et al., Blood 93: 1253-63,
1999.
La línea particular de células madre embrionarias
que se usa para modificación genética no es crítica; los ejemplos de
líneas de células ES murinas incluyen AB-1 (McMahon
y Bradley, Cell 62: 1073-85, 1990), E14 (Hooper
et al., Nature 326: 292-95, 1987), D3
(Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87:
27-45, 1985), CCE (Robertson et al., Nature
323: 445-48, 1986), RW4 (Genome Systems, St. Louis,
MO) y DBA/1lacJ (Roach et al., Exp. Cell Res. 221:
520-25, 1995).
De acuerdo con la presente invención, la
producción del polipéptido de la presente invención puede llevarse a
cabo mediante el cultivo de hospedadores de expresión eucarióticos o
procarióticos, que han sido transformados con uno o más
polinucleótidos de la presente invención, en un medio nutriente de
fermentación convencional. La selección del medio apropiado puede
basarse en la elección de los hospedadores de expresión y/o basarse
en los requerimientos reguladores de la construcción de expresión.
Tales medios son bien conocidos por los expertos en la técnica. Si
se desea, el medio puede contener componentes adicionales que
favorezcan a los hospedadores de expresión transformados, sobre
otros microorganismos potencialmente contaminantes.
Así pues, la presente invención proporciona
también un método para producir un polipéptido que tiene actividad
de PFI-017, comprendiendo el método las etapas de
(a) transformar una célula hospedadora con una secuencia de
nucleótidos mostrada en SEC ID No: 1 o un derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento del mismo; y (b) cultivar la célula
hospedadora transformada, bajo condiciones adecuadas para la
expresión de dicho polipéptido.
La presente invención se refiere también a un
método para producir un polipéptido que tiene actividad de
PFI-017, comprendiendo el método las etapas de (a)
cultivar una célula hospedadora que ha sido transformada con una
secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEC
ID No: 1 o un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del
mismo bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho
polipéptido; y (b) recuperar dicho polipéptido del cultivo de
células hospedadoras.
La presente invención se refiere también a un
método para producir un polipéptido que tiene actividad de
PFI-017, comprendiendo el método las etapas de (a)
transformar una célula hospedadora con una secuencia de nucleótidos
que comprende la secuencia mostrada en SEC ID No: 1 o un derivado,
homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo; (b) cultivar la
célula hospedadora transformada bajo condiciones adecuadas para la
expresión de dicho polipéptido; y (c) recuperar dicho polipéptido
del cultivo de células hospedadoras.
Las ribozimas son moléculas de RNA enzimáticas
capaces de catalizar la segmentación específica de RNA. El mecanismo
de la acción de las ribozimas implica la hibridación, específica
para la secuencia, de la molécula de ribozima con RNA diana
complementario, seguida por segmentación endonucleolítica. Dentro
del alcance de la presente invención están moléculas construidas por
ingeniería genética de ribozima de motivo "cabeza de martillo"
que catalizan de forma específica y eficiente la segmentación
endonucleolítica de secuencias de RNA de
PFI-017.
Los sitios específicos de segmentación de la
ribozima dentro de cualquier diana potencial de RNA se identifican
inicialmente explorando la molécula diana en relación con sitios de
segmentación de la ribozima que incluyen las siguientes secuencias:
GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, pueden evaluarse secuencias
cortas de DNA de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la
región del gen diana que contiene el sitio de segmentación en
relación con características estructurales secundarias que pueden
hacer inoperante a la secuencia oligonucleotídica. La adecuación de
las dianas candidatas puede ser también evaluada probando la
accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios
usando ensayos de protección de ribonucleasa.
Tanto las moléculas antisentido de RNA y DNA como
las ribozimas de la presente invención pueden ser preparadas por
cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de ácidos
nucleicos. Estos métodos incluyen técnicas para sintetizar
químicamente oligonucleótidos, tales como síntesis química en fase
sólida con fosforamidita. Alternativamente, pueden generarse
moléculas de RNA por transcripción in vitro o in vivo
de secuencias de DNA que codifican la molécula de RNA antisentido.
Tales secuencias de DNA pueden ser incorporadas en una amplia
variedad de vectores con promotores de RNA polimerasa adecuados
tales como T7 o SP6. Alternativamente, pueden introducirse
construcciones de cDNA antisentido que sintetizan RNA antisentido
constitutivamente o induciblemente, en las líneas de células, las
células o los tejidos.
La presencia de la secuencia de codificación del
polinucleótido PFI-017 puede ser detectada mediante
hibridación de DNA-DNA o DNA-RNA o
amplificación usando sondas, porciones o fragmentos de la secuencia
presentada en SEQ ID Nº: 1. Los ensayos basados en la amplificación
de ácidos nucleicos implican el uso de oligonucleótidos u oligómeros
basados en la secuencia de codificación de PFI-017
para detectar transformantes que contienen DNA o RNA de
PFI-017. Como se usa en el presente texto,
"oligonucleótidos" u "oligómeros" pueden referirse a una
secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 10
nucleótidos y como mucho aproximadamente 60 nucleótidos,
preferentemente aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos, y más
preferentemente aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, que puede
usarse como sonda o amplímero. Preferentemente, los oligonucleótidos
se derivan de la región 3' de la secuencia de nu cleótidos mostrada
en SEQ ID Nº: 1.
Se conocen en la técnica una diversidad de
protocolos para detectar y medir la expresión del polipéptido
PFI-017, como por ejemplo usando anticuerpos bien
sea policlonales o bien monoclonales, específicos para la proteína.
Los ejemplos incluyen el ensayo en inmunosorbente ligado a una
enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células
activadas por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo de
base monoclonal, de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales
reactivos para dos epítopos no interferentes en un polipéptido
PFI-017, pero también puede emplearse un ensayo de
unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen, entre otras
publicaciones, en Hampton R et al. (1990, Serological
Methods, A Laboratory Manual, APS Pres, St. Paul, MN, EE.UU.) y
Maddox DE et al. (1983, J. Exp. Med. 15, 8: 1211).
Una amplia variedad de marcadores y técnicas de
conjugación son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden
usarse en varios ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los
medios para producir la hibridación marcada o sondas de PCR para
detectar secuencias de polinucleótidos de PFI-017
incluyen oligomarcaje, traslación de mella, marcaje final o
amplificación por PCR usando un nucleótido marcado.
Alternativamente, la secuencia de codificación de
PFI-017, o cualquier parte de ella, puede ser
clonada en un vector para la producción de una sonda de mRNA. Tales
vectores son conocidos en la técnica, son disponibles
comercialmente, y pueden usarse para sintetizar sondas de RNA in
vitro mediante la adición de una RNA polimerasa apropiada, tal
como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados.
Hay varias firmas, como Pharmacia Biotech
(Piscataway, NJ, USA), Promega (Madison, WI, USA) y US Biochemical
Corporation (Cleveland, OH, USA) que suministran kits
comerciales y protocolos para estos procedimientos. Las moléculas
informadoras (repórter) o marcadores adecuados incluyen los
radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes
o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores,
partículas magnéticas y similares. Entre las patentes que enseñan el
uso de tales marcadores se incluyen los documentos
US-A-3817837,
US-A-3850752,
US-A-3939350,
US-A-3996345,
US-A-4277437,
US-A-4275149 y
US-A-4366241. También pueden
producirse inmunoglobulinas recombinantes como se indica en el
documento US-A-4816567.
Otros métodos para cuantificar la expresión de
una molécula en particular incluyen el radiomarcaje (Melby PC et
al., 1993, J. Immunol. Methods Vol. 159 p
235-44) o nucleótidos de biotinilación (Duplaa C
et al., 1993, Anal Biochem Vol 229 p36),
co-amplificación de un ácido nucleico de control, y
curvas patrón en las que se interpolan los resultados
experimentales. La cuantificación de muestras múltiples puede ser
acelerada realizando el ensayo en un formato ELISA en el que el
oligómero de interés se presenta en varias diluciones y una
respuesta espectrofotométrica o colorimétrica da una cuantificación
rápida.
Aunque la presencia/ausencia de expresión del gen
marcador sugiere que el gen de interés está también presente, su
presencia y su expresión han de ser confirmadas. Por ejemplo, si la
secuencia de codificación de PFI-017 se inserta
dentro de una secuencia del gen marcador, las células recombinantes
que contienen regiones de codificación de PFI-017
pueden ser identificadas por la ausencia de función del gen
marcador. Alternativamente, puede ponerse en tándem un gen marcador
con una secuencia codificadora de PFI-017 bajo el
control de un único promotor. La expresión del gen marcador en
respuesta a la inducción o selección indica normalmente también la
expresión de PFI-017.
Alternativamente, las células hospedadoras que
contienen la secuencia de codificación de PFI-017 y
expresan regiones de codificación de PFI-017 pueden
ser identificadas por una diversidad de procedimientos conocidos por
los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no
se limitan a ellos, hibridación DNA-DNA o
DNA-RNA, y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de
proteínas que incluyen tecnologías basadas en membranas, basadas en
solución, o basadas en chips para la detección y/o cuantificación
del ácido nucleico o la proteína.
La secuencia de aminoácidos de la presente
invención puede ser usada también para generar anticuerpos, tal como
mediante el uso de técnicas estándar, contra la secuencia de
aminoácidos.
Pueden usarse procedimientos bien conocidos en la
técnica para la producción de anticuerpos contra polipéptidos
PFI-017. Tales anticuerpos incluyen, pero sin
limitarse a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales,
quiméricos, de cadena simple, fragmentos Fab, y fragmentos elegidos
entre bibliotecas de expresión de Fab o Fv de cadena simple (sc:
Single Chain). Los anticuerpos neutralizantes, es decir, aquellos
que antagonizan la actividad biológica de polipéptidos
PFI-017, son especialmente preferidos para
diagnóstico y terapia.
Para la producción de anticuerpos, varios
hospedadores entre los que se incluyen cabras, conejos, ratas,
ratones, etc. pueden ser inmunizados mediante la inyección del
polipéptido PFI-017 o cualquier parte, variante,
homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo, u oligopéptido
que conserve las propiedades inmunogénicas. Tales fragmentos u
oligopéptidos pueden ser acoplados a proteínas portadoras, usando
métodos bien conocidos en la técnica. Dependiendo de la especie
hospedadora, pueden usarse varios coadyuvantes para aumentar la
respuesta inmunológica. Tales coadyuvantes incluyen, pero sin
limitarse a ellos, coadyuvante de Freund, geles minerales tales como
hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como
lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones
oleosas, y hemocianina de la lapa de California. Los BCG (Bacilli
Calmette-Guerin) y el Corynebacterium
parvum son útiles coadyuvantes humanos que pueden ser
empleados.
Los anticuerpos monoclonales contra la secuencia
de aminoácidos pueden prepararse usando cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas
celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero sin
limitarse a ellas, la técnica de hibridomas originalmente descrita
por Koehler y Milstein (1975, Nature Vol. 256 p.
495-497), la técnica del hibridoma con células B
humanas (Kosbor et al. (1983) Immunol. Today Vol. 4 p. 72;
Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) Vol. 80 p.
2026-2030) y la técnica del
EBV-hibridoma (Cole et al., (1985) Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, p.
77-96). Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos", el ayuste de
genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para
obtener una molécula con una especificidad de antígeno y una
actividad biológica apropiadas (Morrison et al. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) Vol 81 p 6851-6855; Neuberger
et al. (1984) Nature Vol 312 p 604-608;
Takeda et al. (1985) Nature Vol 314 p
452-454). Alternativamente, pueden adaptarse
técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena
simple (documento US-A-4946779),
para producir anticuerpos de cadena simple específicos del
polipéptido.
También pueden producirse anticuerpos induciendo
in vivo la producción en la población de linfocitos o
cribando bibliotecas de inmunoglobulina recombinante o paneles de
reactivos de unión altamente específicos, como se describe en
Orlandi et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) Vol 86, p
3833-3837), y Winter G y Milstein C (1991, Nature
349 p 293-299).
También pueden generarse fragmentos de
anticuerpos que contienen sitios específicos para
PFI-017. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen,
pero sin limitarse a ellos, los fragmentos F(ab')_{2} que
pueden ser producidos por digestión con pepsina de la molécula de
anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden ser generados por
digestión con papaína de la molécula de anticuerpo.
Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab
para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab
monoclonales con la especificidad deseada (Huse WD et al.
(1989) Science Vol. 256 p 1275-1281).
Una técnica alternativa implica el cribado de
bibliotecas de exposición de fago en las que, por ejemplo, el fago
expresa fragmentos scFv en la superficie de su revestimiento con una
gran variedad de regiones que determinan la complementariedad (CDRs:
Complementarity Determinig Regions). Esta técnica es bien conocida
en este campo.
Los anticuerpos específicos para
PFI-017 son útiles para el diagnóstico de
condiciones y enfermedades asociadas con la expresión del receptor
PFI-017. Son bien conocidos en la técnica una
diversidad de protocolos para unión competitiva o ensayos
inmunorradiométricos que usan anticuerpos policlonales o bien
monoclonales con especificidades establecidas. Tales inmunoensayos
implican típicamente la formación de complejos entre el polipéptido
PFI-017 y su anticuerpo específico (o molécula de
unión de PFI-017 similar), y la medida de la
formación del complejo. Se prefiere un inmunoensayo de dos sitios de
base monoclonal, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a
dos epítopos no interferentes en una proteína
PFI-017 específica, pero también puede emplearse un
ensayo de unión no competitiva. Estos ensayos de describen en Maddox
DE et al. (1983, Journal of Experimental Medicine, Vol.
158,
p. 1211).
p. 1211).
Los anticuerpos
anti-PFI-017 son útiles para el
diagnóstico de trastornos que implican trastornos o enfermedades
caracterizadas por una expresión anormal de un receptor
PFI-017. Los ensayos de diagnóstico para
PFI-017 incluyen métodos que utilizan el anticuerpo
y un marcador para detectar un polipéptido PFI-017
en fluidos corporales humanos, células, tejidos o secciones o
extractos de tales tejidos. Los polipéptidos y anticuerpos de la
presente invención pueden ser usados con o sin modificación.
Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados
uniendo a ellos, bien sea de forma covalente o bien no covalente,
una molécula informadora. Los expertos en la técnica conocen una
amplia variedad de moléculas informadoras.
Pueden usarse anticuerpos en un método para
detectar polipéptidos de la invención presentes en muestras
biológicas, que comprende: (a) proporcionar un anticuerpo de la
presente invención; (b) incubar una muestra biológica con dicho
anticuerpo bajo condiciones que permiten la formación de un complejo
anticuerpo-antígeno; y (c) determinar si se forma el
complejo anticuerpo-antígeno que comprende dicho
anticuerpo.
Pueden unirse anticuerpos a un soporte sólido y/o
empaquetado en kits, en un envase adecuado, junto con los
adecuados reactivos, controles, instrucciones, y demás.
La presente invención se refiere también a un
método de ensayo para detectar la presencia de
PFI-017 en células (tales como células humanas) que
comprende: (a) realizar una reacción en cadena de la polimerasa
asistida con transcriptasa inversa (RT-PCR) en RNA
(como el RNA total) de tales células, usando un par de cebadores de
PCR que son específicos para PFI-017, según se
determina a partir de la secuencia de DNA indicada en SEC ID No: 1 o
una variación alélica de la misma; y (b) ensayar la aparición de un
fragmento de PCR del tamaño apropiado, por ejemplo mediante
electroforesis en gel de agarosa.
Hay numerosos ensayos en los que el polipéptido
de la presente invención puede ser usado para cribar moduladores (p.
ej. antagonistas o agonistas) del polipéptido. Los ejemplos de tales
ensayos incluyen:
Ensayo funcional: Un ejemplo de un método para
cribar receptores para identificar agonistas de los mismos es
vigilar el efecto inhibidor o estimulador sobre la acumulación de
cAMP o de adenilato ciclasa. Tal ensayo implica transfectar una
célula de mamífero con el receptor de la presente invención para la
expresión en la superficie de la célula. La célula se expone después
a agonistas putativos y se mide la cantidad de acumulación de cAMP.
Si el agonista putativo se
une al receptor los niveles de actividad de adenilato ciclasa o cAMP mediada por receptor aumentarán o disminuirán.
une al receptor los niveles de actividad de adenilato ciclasa o cAMP mediada por receptor aumentarán o disminuirán.
Ensayo funcional usando un lector de placas de
formación de imagen fluorométrica (FlipR: Fluorometric Imaging Plate
Reader): Una técnica usada para cribar e incluye el uso de células
que expresan el receptor de la presente invención (por ejemplo,
células HEK293 transfectadas) en un sistema que mide p. ej. cambios
del calcio intracelular causados por la activación del receptor. En
esta técnica, las células que expresan el receptor de la presente
invención pueden ponerse en contacto con compuestos (p. ej. pequeñas
moléculas, péptidos, lípidos, nucleótidos o glicoproteínas) que
pueden provocar una respuesta del segundo mensajero, p. ej. un
cambio en los niveles de calcio. Estos cambios se utilizan para
determinar si el compuesto potencial activa o inhibe al
receptor.
Ensayo de unión de ligando: Este tipo de ensayo
puede probar la unión de un compuesto candidato, en el que la unión
a las células que contienen el receptor de la presente invención se
detecta por medio de un marcador asociado directa o indirectamente
con el compuesto candidato o en un ensayo que implica competición
con un competidor marcado. Los ensayos estándar para llevar a cabo
cribados que determinan si el compuesto activa o inhibe al receptor
son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La presente invención, por tanto, se refiere
también a un método para identificar agentes (tales como compuestos,
otras sustancias o composiciones que los contienen) que afectan (por
ejemplo antagonizan, agonizan o modifican de alguna otra forma) la
actividad de PFI-017 y/o la expresión del mismo,
comprendiendo el método poner en contacto el
PFI-017, o la secuencia de nucleótidos que lo
codifica, con el agente, y después medir la actividad de
PFI-017 y/o la expresión de la misma.
La presente invención se refiere también a un
método para modificar agentes (tales como compuestos, otras
sustancias o composiciones que las comprenden) que afectan
selectivamente (por ejemplo antagonizan, agonizan o modifican de
alguna otra forma) a la actividad de PFI-017 y/o a
la expresión de la misma, comprendiendo el método poner en contacto
PFI-017, o la secuencia de nucleótidos que lo
codifica, con el agente, y después medir la actividad de
PFI-017 y/o la expresión de la misma.
La presente invención se refiere también a un
método para identificar agentes (tales como compuestos, otras
sustancias o composiciones que las comprenden) que afectan (por
ejemplo antagonizan, agonizan o modifican de alguna otra forma) o
afectan selectivamente a la actividad de PFI-017 y/o
la expresión de la misma, comprendiendo el método medir la actividad
de PFI-017 y/o la expresión de la misma en presencia
del agente o después de la adición del agente en: (a) una línea de
células en la que se ha incorporado DNA recombinante que comprende
la secuencia de DNA mostrada en SEC ID Nº: 1 o una variación alélica
de la misma, o (b) una población de células o una línea de células
que expresa selectivamente de modo natural PFI-017.
Preferentemente, la actividad de PFI-017 se
determina mediante los métodos de ensayo descritos
anteriormente.
La presente invención se refiere también a un
método para cribar un agente para modulación (preferentemente para
modulación específica) de la actividad de PFI-017 (o
un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la
expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica al mismo
(incluyendo un derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del
mismo), comprendiendo el método las etapas de (a) proporcionar un
agente candidato; (b) combinar PFI-017 (o el
derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la
secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (o el derivado,
homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) con el agente
candidato durante un tiempo suficiente para permitir la modulación
bajo condiciones adecuadas; y (c) detectar la modulación del agente
candidato para PFI-017 (o el derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de
nucleótidos codificadora del mismo (o el derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento de la misma), con el fin de determinar
si el agente candidato modula la actividad de
PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo
o fragmento del mismo), o la expresión de la secuencia de
nucleótidos que codifica al mismo (o el derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento de la misma).
La presente invención se refiere también a un
método para cribar un agente en cuanto a la afinidad de unión
específica con PFI-017 (o un derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de
nucleótidos que codifica al mismo (incluyendo un derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento de la misma), comprendiendo el método
las etapas de (a) proporcionar un agente candidato; (b) combinar
PFI-017 (o el derivado, homólogo, variante, análogo
o fragmento del mismo) o la secuencia de nucleótidos que codifica al
mismo (o el derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento de la
misma) con el agente candidato durante un tiempo suficiente para
permitir la unión bajo condiciones adecuadas; y (c) detectar la
unión del agente candidato a PFI-017 (o el derivado,
homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo) o la secuencia de
nucleótidos codificadora del mismo (o el derivado, homólogo,
variante, análogo o fragmento de la misma), con el fin de determinar
si el agente candidato se une a PFI-017 (o el
derivado, homólogo, variante, análogo o fragmento del mismo), o la
secuencia de nucleótidos que codifica al mismo (o el derivado,
homólogo, variante, análogo o fragmento de la misma).
Así, en ciertas realizaciones de la presente
invención, el PFI-017 o una variante, homólogo,
fragmento, análogo o derivado del mismo y/o una célula que expresa
el PFI-017 o una variante, homólogo, fragmento,
análogo o derivado del mismo, pueden usarse para cribar anticuerpos,
péptidos u otros agentes, tales como moléculas orgánicas o
inorgánicas, que actúan como moduladores (p. ej. antagonistas o
agonistas) de la actividad de PFI-017 o para la
expresión del mismo, identificando con ello un agente terapéutico
capaz de modular el receptor. Alternativamente, el cribado de
bibliotecas de péptidos o librerías orgánicas hecho mediante química
combinatoria con PFI-017 expresado de forma
recombinante, o una variante, homólogo, fragmento, análogo o
derivado del mismo, o líneas de células que expresan
PFI-017 o una variante, homólogo, fragmento, análogo
o derivado del mismo, puede ser útil para la identificación de
agentes terapéuticos que actúan modulando el receptor. Compuestos
sintéticos, productos naturales y otras fuentes de materiales
potencialmente activos biológicamente pueden ser cribados de varias
formas consideradas rutinarias por los expertos en la técnica. Por
ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican la región
N-terminal de PFI-017 pueden
expresarse en una línea de células, que puede ser usada para cribar
moduladores alostéricos, bien sean agonistas o bien antagonistas, de
la actividad de PFI-017.
Un polipéptido PFI-017, sus
fragmentos inmunogénicos o los oligopéptidos de los mismos, pueden
ser usados para cribar compuestos terapéuticos en una cualquiera
entre diversas técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido
empleado en tal ensayo puede estar libre en solución, fijado a un
soporte sólido, dispuesto sobre la superficie de una célula o
situado intracelularmente. Puede medirse la formación de complejos
de unión entre un polipéptido PFI-017 y el agente
que se está ensayando.
En consecuencia, la presente invención se refiere
a un método para cribar uno o diversos compuestos para la modulación
(preferentemente modulación específica, tal como una afinidad de
unión específica) de PFI-017, o la expresión del
mismo, o una parte del mismo, o variante, homólogo, fragmento,
análogo o derivado del mismo, que comprende proporcionar uno o
varios compuestos; combinar un PFI-017 o una
secuencia de nucleótidos que codifica al mismo, o una parte del
mismo, o variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado del
mismo, con el compuesto o con cada uno de una diversidad de
compuestos, durante un tiempo suficiente para permitir la modulación
bajo condiciones adecuadas; y detectar la unión de un
PFI-017, o parte del mismo, o variante, homólogo,
fragmento, análogo o derivado del mismo, a cada uno de una
diversidad de compuestos, identificando así el compuesto o
compuestos que modulan un PFI-017 o una secuencia de
nucleótidos que codifica al mismo. En tal ensayo, la diversidad de
compuestos puede ser producida por técnicas de química combinatoria
conocidas por los expertos en la técnica.
Otra técnica para el cribado de fármacos
proporciona cribados de alta productividad (HTS: High Throughput
Screenings) de compuestos que tiene una adecuada afinidad de unión a
los polipéptidos PFI-017, y se basa en el método
descrito con detalle en Geysen, WO 84/03564, publicado el 13 de
septiembre de 1984. De una forma resumida, un gran número de
pequeños compuestos peptídicos de ensayo diferentes se sintetizan
sobre un sustrato sólido, tal como varillas de material plástico o
alguna otra superficie. Los compuestos peptídicos de ensayo se hacen
reaccionar con fragmentos de PFI-017 y se lavan.
Entonces se detecta un PFI-017 unido, por ejemplo
mediante la apropiada adaptación de métodos bien conocidos en la
técnica. También puede aplicarse como recubrimiento directamente un
PFI-107 purificado, sobre placas de las usadas en
las técnicas de cribado de fármacos antes mencionadas.
Alternativamente, pueden usarse anticuerpos no neutralizantes para
capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.
Esta invención considera también el uso de
ensayos competitivos de cribado de fármacos en los que anticuerpos
neutralizantes capaces de unirse al polipéptido
PFI-017 compiten específicamente con un compuesto de
ensayo por la unión con un PFI-017. De esta manera,
los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de
cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos
con un PFI-017.
El método de ensayo de la presente invención
puede ser un cribado de alta productividad (HTS). En relación con
esto, las enseñanzas del documento WO 84/03564 pueden ser adaptadas
para el PFI-017 de la presente invención. Las
enseñanzas del documento
US-A-5738985 pueden también
adaptarse para el método de ensayo de la presente invención.
El agente identificado por los métodos de la
presente invención puede ser, por ejemplo, un compuesto orgánico o
un compuesto inorgánico. El agente puede ser, por ejemplo, una
secuencia de nucleótidos que es antisentido para toda o parte de la
secuencia mostrada en SEC ID Nº: 1.
El agente descrito anteriormente (o incluso una
sal del mismo aceptable farmacéuticamente, o un solvato del mismo
aceptable farmacéuticamente), o una composición farmacéutica que
contiene cualquiera de los expuestos antes, puede ser usado como
medicamento.
La presente invención proporciona también una
composición para diagnóstico para la detección de secuencias de
polinucleótidos de PFI-017. La composición para
diagnóstico puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 1 o
una variante, homólogo, fragmento, análogo o derivado de la misma, o
una secuencia capaz de hibridarse con toda o parte de la secuencia
de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1 o una variación alélica de
la misma.
Para proporcionar una base para el diagnóstico de
la enfermedad, deben establecerse valores normales o estándar a
partir de una expresión del polipéptido PFI-017.
Esto se consigue combinando fluidos corporales o extractos de
células o tejidos tomados de sujetos normales, sean animales o
humanos, con anticuerpos contra un polipéptido
PFI-017, bajo condiciones adecuadas para la
formación de complejo que son bien conocidas en la técnica. La
cuantía de la formación de complejo estándar puede ser determinada
comparándola con una serie de diluciones de controles positivos en
la que una cantidad conocida de anticuerpo se combina con
concentraciones conocidas de un polipéptido PFI-017
purificado. Después, los valores estándar obtenidos de muestras
normales pueden compararse con valores obtenidos de muestras
procedentes de sujetos potencialmente afectados por un trastorno o
una enfermedad relacionada con la expresión de un polipéptido
PFI-017. La desviación entre los valores estándar y
los del sujeto determina la existencia de este estado
patológico.
Un polinucleótido PFI-017, o
cualquier parte del mismo, puede proporcionar la base para un
compuesto para diagnóstico y/o terapéutico. Con fines diagnósticos,
las secuencias de polinucleótido PFI-017 pueden ser
usadas para detectar y cuantificar la expresión génica en
condiciones, trastornos o enfermedades en las que puede estar
implicada la actividad de PFI-017.
La secuencia de polinucleótidos que codifica
PFI-017 puede ser usada para el diagnóstico de
enfermedades resultantes de la expresión de PFI-017.
Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos que codifica
PFI-017 puede ser usada en ensayos de hibridación o
de PCR de tejidos procedentes de biopsias o autopsias o fluidos
biológicos tales como suero, líquido sinovial o biopsia tumoral,
para detectar anomalías en la expresión de PFI-017.
La forma de tales métodos cualitativos o cuantitativos puede incluir
análisis Southern o northern, transferencia de mancha (dot
blot) o cualquier otra tecnología basada en membranas;
tecnologías PCR; tecnologías dip stick, pin o
chip; y ELISA y otras tecnologías de formato de muestra
múltiple. Todas estas técnicas son bien conocidas en este campo y
son, de hecho, la base de muchos kits de diagnóstico
disponibles comercialmente.
Tales ensayos pueden ser hechos a la medida para
evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico en
particular y pueden usarse en estudios con animales, en experimentos
clínicos o en la vigilancia del tratamiento de un paciente concreto.
Con el fin de proporcionar una base para el diagnóstico de una
enfermedad, debe establecerse un perfil normal o estándar para la
expresión de PFI-017. Esto se realiza combinando
fluidos corporales o extractos de células tomados de sujetos
normales, sean animales o humanos, con PFI-017 o una
porción del mismo, bajo condiciones adecuadas para la hibridación o
la amplificación. La hibridación estándar puede ser cuantificada
comparando los valores obtenidos a partir de sujetos normales con
una serie de diluciones de controles positivos realizados en el
mismo experimento en la que se usa una cantidad conocida de
PFI-017 purificado. Los valores estándar obtenidos
de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos de
muestras procedentes de sujetos potencialmente afectados por un
trastorno o una enfermedad relacionada con la expresión de la
secuencia codificadora de PFI-017. La desviación
entre los valores estándar y los del sujeto determina la presencia
del estado patológico. Si se establece la enfermedad, se administra
un agente terapéutico existente y pueden generarse el perfil o los
valores del tratamiento. Finalmente, puede repetirse el ensayo sobre
una base regular para evaluar si los valores progresan o vuelven al
patrón normal o estándar. Pueden usarse perfiles de tratamiento
sucesivos para mostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un
periodo de varios días o varios meses.
Así, la presente invención se refiere al uso de
un polipéptido o variante, homólogo, fragmento o derivado del mismo,
para producir anticuerpos
anti-PFI-017 que pueden ser usados,
por ejemplo, con fines de diagnóstico para detectar y cuantificar
niveles de PFI-017 en estados patológicos.
La presente invención se refiere además a ensayos
y kits para diagnóstico para la detección de
PFI-017 en células y tejidos, que comprenden un
PFI-017 purificado que puede ser usado como control
positivo, y anticuerpos
anti-PFI-017. Tales anticuerpos
pueden ser usados en tecnologías basadas en soluciones, basadas en
membranas o basadas en tejidos, para detectar cualquier estado
patológico o condición relacionada con la expresión de proteína
PFI-017 o expresión de deleciones, o una variante,
homólogo, fragmento, análogo o derivado del mismo.
Otro aspecto de la presente invención es la
provisión de sondas de hibridación de ácidos nucleicos o de PCR, que
son capaces de detectar secuencias de polinucleótidos, incluyendo
secuencias genómicas, que codifican la región de codificación de
PFI-017 o moléculas estrechamente relacionadas,
tales como alelos. La especificidad de la sonda, es decir si se
deriva de una región o domino altamente conservado, conservado o no
conservado, y las condiciones de rigor de la hibridación o
amplificación (alto, intermedio o bajo) determinarán si la sonda
identifica solamente la secuencia de codificación de
PFI-017 de origen natural, o secuencias relacionadas
con ella. Las sondas para la detección de secuencias de ácidos
nucleicos relacionadas se eligen entre regiones de nucleótidos
conservadas o altamente conservadas de los polinucleótidos de
PFI-017, tales como la región 3', y tales sondas
pueden ser usadas en una agrupación (pool) de sondas
degeneradas. Para la detección de secuencias de ácidos nucleicos
idénticas, o cuando se desea la máxima especificidad, las sondas de
ácidos nucleicos se eligen entre las regiones de nucleótidos no
conservadas o regiones únicas de polinucleótidos de
PFI-017. Como se usa en el presente texto, la
expresión "región de nucleótidos no conservada" se refiere a
una región de nucleótidos que es única para la secuencia de
codificación de PFI-017 descrita en el presente
texto, y no aparece en secuencias relacionadas.
\newpage
La PCR, como se describe p. ej. en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188, proporciona usos
adicionales para oligonucleótidos basados en la secuencia de
PFI-017. Generalmente tales oligómeros son
sintetizados químicamente, pero pueden generarse enzimáticamente o
producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros
comprenden generalmente dos secuencias de nucleótidos, una con
orientación con sentido (5'\equiv3') y una con antisentido
(3'\approx5') empleadas bajo condiciones óptimas para la
identificación de un gen o condición específicos. Los dos mismos
oligómeros, conjuntos anidados de oligómeros, o incluso un
agrupamiento degenerado de oligómeros, pueden emplearse bajo
condiciones menos rigurosas para la detección y/o cuantificación de
secuencias de DNA o RNA estrechamente relacionadas.
La secuencia de ácidos nucleicos para
PFI-017 puede usarse también para generar sondas de
hibridación como se describió anteriormente, para cartografiar la
secuencia genómica endógena. La secuencia puede ser cartografiada
para un cromosoma particular o para una región específica del
cromosoma usando técnicas bien conocidas. Estas incluyen hibridación
in situ con extensiones cromosómicas (Verma et al.
(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon
Press, New York City, EE.UU.), preparados cromosómicos clasificados
por flujo, o construcciones de cromosomas artificiales tales como
cromosomas artificiales de levadura (YACs: Yeast Artificial
Chromosomes), cromosomas artificiales de bacterias (BACs: Bacterial
Artificial Chromosomes), construcciones de PI bacterianas o
genotecas de cDNA de cromosomas individuales.
La hibridación in situ de preparados
cromosómicos y las técnicas de cartografiado físico tales como el
análisis de enlace usando marcadores cromosómicos establecidos, son
inestimables en la extensión de mapas genéticos. Pueden encontrarse
ejemplos de mapas genéticos en Science (1995; 270: 410f y 1994; 265:
1981f). Frecuentemente el emplazamiento de un gen en el cromosoma de
otra especie de mamífero puede revelar marcadores asociados incluso
aunque no se conozca el número de brazos de un cromosoma humano en
particular. Pueden asignarse nuevas secuencias a brazos
cromosómicos, o partes de las mismas, mediante cartografiado físico.
Esto proporciona una valiosa información a los investigadores que
buscan genes de enfermedades usando clonación posicional u otras
técnicas de descubrimiento de genes. Una vez que la enfermedad o el
síndrome, tal como ataxia telangiectasia (AT), ha sido localizada de
forma tosca por unión genética a una región genómica particular, por
ejemplo AT a 1lq22-23 (Gatti et al. (1988)
Nature 336: 577-580), cualquier secuencia que
cartografíe para esa área puede representar genes asociados o
reguladores para posterior investigación. La secuencia de
nucleótidos de la presente invención puede usarse también para
detectar diferencias en la localización cromosómica debidas a
translocación, inversión, etc., entre individuos normales,
portadores o afectados.
También se describe una composición farmacéutica
para el tratamiento de un individuo en necesidad del mismo, debido a
la actividad de PFI-017, comprendiendo la
composición una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que
modula (por ejemplo antagoniza o agoniza) dicha actividad, y un
vehículo, diluyente, excipiente o coadyuvante aceptable
farmacéuticamente.
Así pues, también se describen composiciones
farmacéuticas que comprenden los agentes de la presente invención
(un agente capaz de modular el patrón de expresión de la secuencia
de nucleótidos de la presente invención o la actividad del producto
de la expresión del mismo y/o un agente identificado por un ensayo
de acuerdo con la presente invención. En este aspecto, y en
particular para la terapia humana, incluso aunque los agentes pueden
ser administrados solos, generalmente se administrarán mezclados con
un vehículo, coadyuvante, excipiente o diluyente farmacéutico
elegido teniendo en cuenta la vía de administración y la práctica
farmacéutica estándar.
A título de ejemplo, en las composiciones
farmacéuticas los agentes pueden ser mezclados con uno cualquiera o
varios aglutinantes, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de
recubrimiento o agentes solubilizantes.
En general, una dosis diaria de los agentes, oral
o intravenosa, efectiva terapéuticamente puede encontrarse en el
intervalo entre 0,01 mg y 50 mg/kg de peso corporal del sujeto que
ha de ser tratado, preferentemente de 0,1 a 20 mg/kg. Los agentes
pueden administrarse también por infusión intravenosa, a una dosis
que puede oscilar entre 0,001 y 10 mg/Kg.h.
Así pues, se describe también un método para el
tratamiento de un individuo en necesidad del mismo debido a la
actividad de PFI-017, que comprende administrar a
dicho individuo una cantidad efectiva de la composición farmacéutica
mencionada anteriormente.
Típicamente, el médico determinará la
dosificación real que sea la más adecuada para un paciente concreto
y que variará con la edad, el peso, el sexo y la respuesta de ese
paciente en particular. Las dosis anteriores son ejemplos del caso
de tipo medio. Desde luego, puede haber casos individuales en los
que se precisen intervalos de dosificación más altos o más bajos, y
tales casos caen también dentro del alcance de la presente
invención.
En los casos apropiados, las composiciones
farmacéuticas pueden ser administradas por inhalación, en forma de
supositorio o pesario, tópicamente en forma de loción, solución,
crema, ungüento o polvo fino, o usando un parche cutáneo, oralmente
en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón
o lactosa, o en cápsulas u óvulos, bien sea sólo o mezclado con
excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que
contienen agentes saborizantes o colorantes, o pueden ser inyectados
parenteralmente, por ejemplo por vía intracavernosa, intravenosa,
intramuscular o subcutánea. Para administración parenteral, lo mejor
puede ser usar las composiciones en forma de solución acuosa
estéril, que puede contener otras sustancias, por ejemplo sales o
monosacáridos suficientes para hacer que la solución sea isotónica
con la sangre. Para administración bucal o sublingual, las
composiciones pueden ser administradas en forma de comprimidos o
pastillas que pueden ser formulados de una manera convencional.
Para la administración oral, parenteral, bucal y
sublingual a sujetos (tales como pacientes), el nivel diario de
dosificación de los agentes puede estar típicamente entre 10 y 500
mg (en dosis únicas o divididas). Así pues, y a título de ejemplo,
los comprimidos o las cápsulas pueden contener de 5 a 100 mg de
agente activo para administración única, o dos o más a la vez, según
convenga. También es posible administrar los agentes en
formulaciones de liberación prolongada.
En algunas aplicaciones, generalmente en
personas, la administración oral de los agentes es la vía preferida,
siendo la más conveniente, y en algunos casos puede evitar
inconvenientes asociados con otras vías de administración, como los
que trae consigo la administración intracavernosa (i. c.). En
circunstancias en las que el receptor padece de algún trastorno de
deglución o de problemas de adsorción del fármaco después de la
administración oral, el fármaco puede ser administrado por vía
parenteral, sublingual o bucal.
Para uso veterinario, el agente se administra
típicamente como formulación adecuadamente aceptable, de acuerdo con
la práctica veterinaria normal, y el veterinario determinará el
régimen de dosificación y la vía de administración que sea la más
apropiada para un animal en particular. Sin embargo, como ocurre con
los tratamientos de personas, puede ser posible administrar el
agente solo para tratamientos veterinarios.
Típicamente, las composiciones farmacéuticas, que
pueden ser para uso animal o humano, comprenderán uno cualquiera o
varios diluyentes, vehículos, excipientes o coadyuvantes aceptables
farmacéuticamente. La elección del vehículo, excipiente, coadyuvante
o diluyente farmacéutico puede hacerse teniendo en cuenta la vía de
administración que se pretende utilizar y la práctica farmacéutica
estándar. Como se indicó antes, las composiciones farmacéuticas
pueden comprender como vehículo, excipiente, coadyuvante o
diluyente, o además de ellos, cualquier aglutinante, lubricante,
agente de suspensión, agente de recubrimiento o agente solubilizante
adecuado.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender
uno o más de los siguientes elementos: un agente que ha sido cribado
mediante un ensayo de la presente invención; un agente que es capaz
de interaccionar con la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2 incluyendo
derivados, fragmentos, homólogos, análogos o variantes de los
mismos, o secuencias capaces de hibridarse con la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1.
Se incluye en el alcance de la presente invención
secuencias de nucleótidos, moléculas de RNA y DNA antisentido y
ribozimas, que actúan desestabilizando el mRNA de
PFI-017 e inhibiendo la traducción de
PFI-017. Una molécula de PFI-017
antisentido puede proporcionar la base para el tratamiento de varias
condiciones anómalas relacionadas, p. ej., con el incremento de la
actividad de PFI-017.
Pueden usarse vectores de expresión derivados de
retrovirus, adenovirus, virus herpes o virus vaccinia, o de varios
plásmidos bacterianos, para el suministro de moléculas con sentido o
antisentido de PFI-017 recombinante a la población
de células señalada. Métodos que son bien conocidos por los expertos
en la técnica pueden ser usados para construir vectores
recombinantes que contienen PFI-017.
Alternativamente, puede suministrarse PFI-017
recombinante a las células diana en liposomas.
La secuencia de cDNA de longitud completa y/o sus
elementos reguladores permite a los investigadores usar el
PFI-017 como herramienta en investigaciones con
sentido (Youssoufian H y HF Lodish (1993) Mol Cell Biol 13:
98-104) o antisentido (Eguchi et al. (1991)
Annu Rev Biochem 60: 631-652) de la función génica.
Pueden usarse in vivo o in vitro oligonucleótidos,
designados a partir del cDNA o secuencias de control obtenidas a
partir del DNA genómico para inhibir la expresión. Tal tecnología es
ahora bien conocida en la técnica, y pueden designarse
oligonucleótidos con sentido o antisentido o fragmentos mayores, a
partir de varias localizaciones a lo largo de las regiones de
codificación o de control. Los oligonucleótidos apropiados, que
pueden tener una longitud de 20 nucleótidos, pueden ser usados para
aislar secuencias de PFI-017 o moléculas
estrechamente relacionadas, a partir de genotecas humanas.
Adicionalmente, la expresión de
PFI-017 puede ser modulada transfectando una célula
o tejido con vectores de expresión que expresan niveles elevados de
un fragmento de PFI-017 en condiciones en las que
sería preferible bloquear la actividad de PFI-017.
Tales construcciones pueden inundar las células con secuencias con
sentido o antisentido intraducibles. Incluso en ausencia de
integración en el DNA, tales vectores pueden continuar
transcribiendo moléculas de RNA hasta que todas las copias del
vector sean inhabilitadas por nucleasas endógenas. Tal expresión
transitoria puede durar un mes o más con un vector no replicante, e
incluso más si los elementos de replicación apropiados forman parte
del sistema vector.
Pueden obtenerse modificaciones de la expresión
génica diseñando secuencias antisentido para las regiones de control
del gen PFI-017, tales como los promotores,
intensificadores e intrones.
Se prefieren los oligonucleótidos derivados del
sitio de iniciación de la transcripción, p. ej. entre las regiones
-10 y +10 de la secuencia guía. También pueden diseñarse moléculas
de DNA y RNA antisentido que bloqueen la traducción del mRNA
evitando que el material transcrito se una a los ribosomas. Del
mismo modo, puede conseguirse la inhibición usando la metodología
del apareamiento de bases de Hogeboom, conocida también como
apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de
triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice de abrirse
lo suficiente para la unión de polimerasas, factores de
transcripción o moléculas reguladoras.
Así pues, se describe también una composición
farmacéutica que comprende un agente identificado por los métodos de
la presente invención (o una sal del mismo aceptable
farmacéuticamente, o un solvato del mismos aceptable
farmacéuticamente) junto con un diluyente, coadyuvante, excipiente o
vehículo aceptable farmacéuticamente. La composición farmacéutica
puede ser para uso veterinario (es decir, uso animal) o humano.
Así pues, se describen también composiciones
farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de moduladores (p.
ej. antagonistas o agonistas) de la proteína PFI-017
(incluyendo secuencias antisentido de ácidos nucleicos) en mezcla
con un diluyente, vehículo, excipiente o coadyuvante aceptable
farmacéuticamente (incluyendo combinaciones de los mismos).
Las composiciones farmacéuticas descritas pueden
comprender toda o parte de las secuencias de polinucleótidos de
PFI-017, moléculas antisentido de
PFI-017, polipéptidos PFI-017,
proteínas, péptidos o moduladores orgánicos de la bioactividad de
PFI-017, tales como antagonistas (incluyendo
anticuerpos) o agonistas, solos o en combinación con al menos otro
agente tales como un compuesto de estabilización, y pueden ser
administradas en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible
estéril, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, solución salina,
solución salina tamponada, dextrosa y agua.
Aunque por lo general las técnicas mencionadas en
el presente texto son bien conocidas en este campo, puede hacerse
referencia en particular a Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Short
Protocols in Molecular Biology (1999) 4º ed., John Wiley and Sons,
Inc. La PCR se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188.
La muestra que se indica a continuación fue
depositada de acuerdo con el tratado de Budapest en el depositario
reconocido The National Collections of Industrial and Marine
Bacteria Limited (NCIMB), en St. Machar Drive 23, Aberdeen, Escocia,
AB2 IRY, Reino Unido, el 23 de agosto de 2000.
El número NCIMB 41074 es Escherichia coli
Pfi-017.
El depositante fue Pfizer Central Research,
Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Reino
Unido.
Un experto en la técnica podría desarrollar
fácilmente el clon de E. coli antes mencionado (NCIMB 41074)
en caldo de Luria que contiene ampicilina, y aislar el DNA de
plásmido del clon, p. ej. usando el método de lisis con álcali que
se describe en Sambrook et al., eds. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Nueva York, NY, USA. El método de terminación didesoxi que se
describe en Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
(1977), 74 (12): 5463-5467), y modificado por
Applied Biosystems (véase la literatura de los fabricantes Applied
Biosystem) para la detección fluorescente podría entonces usarse
para secuenciar el DNA e identificar el PFI-017. El
plásmido contenido en este clon de E. coli contiene la
secuencia que codifica PFI-017^{*}, como se
muestra en la SEC ID Nº: 5.
También se describen secuencias derivables y/o
expresables a partir de ese depósito, y realizaciones que las
contienen. La presente invención también abarca secuencias parciales
derivables y/o expresables a partir de ese depósito, y
realizaciones que las contienen, en donde esas secuencias parciales
codifican polipéptidos activos. También se describen proteínas que
comprenden secuencias derivables y/o expresables a partir de ese
depósito, y realizaciones que las comprenden. La presente invención
también abarca proteínas consistentes en secuencias parciales
derivables y/o expresables a partir de ese depósito, y realizaciones
que las contienen, en donde esas secuencias parciales codifican
polipéptidos activos.
La presente invención será ahora descrita,
solamente a título de ejemplo, con referencia a las Figuras y Listas
de Secuencias anexas, en las que:
La Figura 1 muestra un esquema para el análisis
bioinformático de PFI-017 (db = base de datos).
La Figura 2 muestra un alineamiento usando
ClustalW de PFI-017 con el receptor de cisteinil
leucotrieno 1.
La Figura 3 muestra el mapa citogenético de la
región del cromosoma 13, en donde está localizado el gen de
PFI-017.
La Figura 4 muestra la curva de respuesta a la
dosis de PFI-017^{*} al leucotrieno C_{4}.
La Figura 5 muestra la curva de respuesta a la
dosis de PFI-017^{*} al leucotrieno D_{4}.
La SEC ID Nº: 1 muestra la secuencia de
nucleótidos que codifica PFI-017.
La SEC ID Nº: 2 muestra la correspondiente
secuencia de aminoácidos que codifica PFI-017.
Las SEC ID Nº: 3 y Nº 4 muestran los cebadores de
PCR usados en los Ejemplos.
La SEC ID Nº: 5 muestra la secuencia de
nucleótidos para PFI-017^{\text{*}},
correspondiente al número de entrada de GenBak AF254664, y el
producto de traducción de la misma.
El polinucleótido que codifica el GPCR (receptor
acoplado a proteína G) de la presente invención fue clonado y las
secuencias de DNA y aminoácidos se analizaron usando varias
herramientas bioinformáticas. El GPCR codificado por las secuencias
descritas en el presente texto ha sido denominado
PFI-017.
El PFI-017 fue identificado en
información de secuencia genómica no anotada que fue liberada por
los Genome Sequencing Centers (Centros de Secuenciación de Genomas)
buscando las secuencias con miembros conocidos de la familia del
receptor acoplado a proteína G (GPCR) usando el algoritmo BLAST.
Con el fin de confirmar que
PFI-017 era un miembro de la familia de GPCR se
llevaron a cabo varios planteamientos bioinformáticos.
- (a)
- Búsqueda BLAST frente a Swissprot.
Se buscó la secuencia de aminoácidos de
PFI-017 (SEC ID No: 2) frente a la base de datos
Swissprot usando el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool (Altschul SF (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300;
Altschul, SF et al. (1990) J. Mol. Biol. 215.
403-410)) para identificar la concordancia más
próxima de proteína. En este caso, el mejor resultado fue con el
receptor del cisteinil leucotrieno humano.
Estos resultados indican que
PFI-017 es un miembro de la familia de GPCR.
(b) Alineamiento con ClustalW de
PFI-017 con el receptor de cisteinil
leucotrieno.
Estos resultados se muestran en la Figura 2.
(c) Búsqueda con BLAST frente a una base de datos
de GPCR humano no redundante.
La secuencia de aminoácidos de
PFI-017 se buscó frente a una base de datos de GPCR
humano no redundante, que comprende principalmente secuencias
procedentes de GenBank y la base de datos Derwent Geneseq, con el
fin de identificar la clase de agonista para este receptor. Los diez
mejores resultados se exponen a continuación:
| AF119711 | receptor de cisteinil leucotrieno (CYSLT1) |
| GPRH_HUMAN | receptor acoplado a proteína G GPR17 |
| EBI2_HUMAN | receptor acoplado a proteína G inducido por EBV |
| P2YR_HUMAN | purinorreceptor P2Y 1 (P2Y1) |
| P2UR_HUMAN | purinorreceptor P2U 1 (P2Y1) |
| P2Y5_HUMAN | purinorreceptor P2Y 5 (P2Y5) |
| P2Y9_HUMAN | purinorreceptor P2Y 9 (P2Y9) |
| PAFR_HUMAN | receptor del factor de activación de las plaquetas |
| PAR2_HUMAN | receptor 2 activado por proteinasa (PAR-2) |
| AF118670 | receptor acoplado a proteína G GPR34 |
Estos resultados demuestran
PFI-017 es lo más parecido al receptor de cisteinil
leucotrieno y sugieren que PFI-017 codifica un nuevo
GPCR cuyo ligando es probablemente una molécula de eicosanoide.
Varios ESTs que cartografían en la secuencia de
nucleótidos de SEC ID No: 1 fueron encontrados en una genoteca de
cDNA basada en eosinófilos aislados de un paciente que padece
asma.
El cóntigo BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
que contiene PFI-017 está anotado como derivado de
13q14.12-21.1. Esta región (véase la Fig. 3)
contiene un marcador, D13S153, que se ha demostrado que está
fuertemente ligado al asma atópico en poblaciones australianas
(Daniels et al., 1996 Nature 383: 247-) y japonesas
(Kimura et al., Hum. Mol. Genet. 8: 1487-). La caja de
la izquierda (Fig. 3) denota el marcador D13S153. La caja de la
derecha indica la región de la que se derivó el BAC
PFI-017.
Por consiguiente, es probable que el receptor de
la presente invención tenga una función asociada con la respuesta
inmunitaria, en particular el asma. Además, es probable que los
agonistas o antagonistas de este receptor sean útiles en el
tratamiento de enfermedades asociadas con la respuesta inmunitaria,
en particular el asma.
La secuencia codificadora de longitud completa de
PFI-017^{*} se clonó a partir de DNA genómico
humano (Promega) usando PCR.
Racción PCR: La reacción PCR se ajustó de la
forma siguiente: dNTPs (10 mM) - 1 \mul, cebador directo (10
\muM) - 1 \mul, cebador inverso (10 \muM) - 1 \mul, 5 x
tampón de reacción - 10 \mul, Elongasa (Life Technologies, Inc.) -
1 \mul, DNA genómico - 1 \mug; llevado a 50 \mul con agua.
Cebadores de la PCR:
Cebador directo (=PFI-017
directo):
5'-ACCATGGAGAGAAAATTTATGTCC-3'
(SEC ID No: 3)
Cebador inverso (=PFI-017
inverso):
5'-TTATACTCTTGTTTCCTTTCTC-3'
(SEC ID No: 4)
Condiciones para la PCR: 94ºC - 3 minutos.
Después 30 ciclos de 94ºC - 1 minuto, 58ºC - 1 minuto, 72ºC - 2
minutos. Ciclo final = 72ºC - 10 minutos.
El producto de PCR
PFI-017^{\text{*}} se extrajo en gel usando el
kit de extracción en gel QIAgen, siguiendo las instrucciones
del fabricante. El producto resultante se clonó de acuerdo con la
metodología de clonación TA (Invitrogen TA cloning) en el
vector pcDNA3.1/V5-His-TOPO
(Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se empleó la tecnología del lector de placas de
imagen de fluorescencia (FLIPR®: FLuorescence Imaging Plate Reader)
como medio para detectar la activación de
PFI-017^{\text{*}} por los leucotrienos C4 y D4 en
un ensayo basado en células.
5 x 10^{6} células de ovario de hamster chino
(CHO) que expresan el gen G\alpha15 de ratón fueron transfectadas
transitoriamente con 7,5 \mug de vector de cDNA de
PFI-017^{*} (contenido dentro del plásmido
pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen)),
o vector solo, usando reactivo Lipofectamine Plus® (Gibco BRL)
siguiente el protocolo del fabricante. A las 24 horas de la
transfección, las células se desprendieron del frasco usando
solución de tripsina/EDTA (LTI) y se sembraron en una placa de 96
pocillos de lados negros y fondo claro (Corning Costar) a una
densidad de 5 x 10^{4} células por pocillo. Las placas se dejaron
durante la noche para permitir a las células adherirse al fondo de
los pocillos. El medio se retiró de las células y se reemplazó con
100 \mul de solución de carga de colorante templada (37ºC) (50
\mug de Fluo4 (Molecular Probes) en 20 \mul de DMSO + 20% de
ácido plurónico en DMSO, añadido a 11 ml de medio de Eagle
modificado por Dulbecco que contiene 1 x Probenecid (100 x
Probenecid - se disolvieron 0,71 g de Probenecid en 5 ml de NaOH 1M
y 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco,
por placa. El probenecid (Molecular Probes) inhibe la actividad de
la proteína de transporte aniónico, mejorando así la carga de
colorante). Las placas se incubaron después durante 1 h a 37ºC.
Posteriormente las placas se lavaron con 150 \mul de tampón de
lavado por pocillo (5 ml 100x solución madre de Probenecid + 495 ml
de PBS, pH 7,4) 3 veces. Las placas se devolvieron al incubador a
37ºC/5% de CO_{2} durante 15 minutos antes del procesado dentro
del instrumento FLIPR®. El procesado FLIPR® implicaba la lectura de
la fluorescencia para todas las muestras durante 2 minutos; durante
este tiempo se determinó la línea base de fluorescencia durante 10
segundos. La cantidad deseada de compuesto (es decir leucotrieno C4
o D4) fue después transferida automáticamente a los pocillos, y la
fluorescencia se vigiló de forma continua durante el resto del
tiempo. Los leucotrienos se diluyeron en tampón para lavado que
contiene ditiotreitol 1 mM con el fin de mantener los compuestos en
estado reducido.
La curva de respuesta a la dosis para el
leucotrieno C4 se muestra en la Figura 4; el valor observado de
ED_{50} es aproximadamente 1,2 \muM. La curva de respuesta a la
dosis para el leucotrieno D4 se muestra en la Figura 5; el valor
observado de ED_{50} es aproximadamente 0,41 \muM. Sin embargo,
los leucotrienos son bastante lábiles, es probable que la ED_{50}
para leucotrieno C4 y D4 completamente intacto esté en el margen
nanomolar.
\newpage
Por consiguiente, es probable que
PFI-017 represente un receptor de leucotrieno, y
ahora se le denomina también receptor CysLT_{2} (Heise, C. E.
et al. (2000) J. Biol. Chem. 275,
30531-30539, Takasaki, J. et al. (2000)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 316-322; ambos
trabajos publicados después de la fecha de prioridad de esta
solicitud).
Se apreciará que lo que antecede se proporciona
solamente a título de ejemplo y que pueden hacerse modificaciones de
detalle sin apartarse del alcance de la invención.
(parte de la
descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Pfizer Ltd. (EP (GB) solamente);
Pfizer Inc (EP excepto GB, US y JP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Receptor de cisteinil leucotrieno
humano (CysLT_{2})
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCS10914BXP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 0008504.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-04-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 993
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggaga gaaaatttat gtcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatactctt gtttcctttc tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1041)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Un polinucleótido aislado y/o purificado que
consiste en uno o más de:
(a) un polinucleótido que consiste en una
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1; o
(b) el complemento del polinucleótido de (a).
2. Un vector que comprende una secuencia
codificadora que consiste en el polinucleótido según la
reivindicación 1ª.
3. Una célula hospedadora aislada transformada o
transfectada con el vector según la reivindicación 2ª.
4. La célula hospedadora transformada o
transfectada según la reivindicación 3ª, que es una célula de
mamífero, de insecto, fúngica, bacteriana o de levadura.
5. Un procedimiento para producir un polipéptido,
que comprende cultivar la célula hospedadora transformada o
transfectada según las reivindicaciones 3ª o 4ª bajo condiciones
adecuadas para la expresión de dicho polipéptido o fragmento.
6. El procedimiento según la reivindicación 5ª,
en el que dicho polipéptido se expresa en la superficie de dicha
célula.
7. El procedimiento según las reivindicaciones 5ª
o 6ª, que incluye además recuperar el polipéptido del cultivo.
8. Un procedimiento para producir células capaces
de expresar un polipéptido, que comprende transformar o transfectar
células con el vector según la reivindicación 2ª.
9. Células aisladas producidas mediante el
procedimiento según la reivindicación 8ª.
10. Un preparado de membranas de las células
según la reivindicación 9ª.
11. Un polipéptido producido mediante el
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5ª a
8ª.
12. Un polipéptido que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos deducida,
traducida a partir de la secuencia de polinucleótidos de SEC ID No:
\hbox{1; o} (b) un polipéptido de la SEC ID No: 2.
13. Un método para identificar un compuesto que
se une, y lo modula, al polipéptido según la reivindicación 12ª, que
comprende poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto
candidato, y determinar si tiene lugar la modulación.
14. Un método según la reivindicación 13ª, que
comprende:
(a) poner en contacto un compuesto con células
que expresan el polipéptido según la reivindicación 12ª en su
superficie, estando asociado dicho polipéptido con un segundo
componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a
la unión de un compuesto a dicho polipéptido, siendo dicho contacto
bajo condiciones suficientes para permitir la unión de los
compuestos al polipéptido; y
(b) identificar un compuesto capaz de unirse al
polipéptido detectando la señal producida por dicho segundo
componente.
15. Un método según la reivindicación 14ª, que
comprende:
(a) poner en contacto (i) un primer componente
detectable, que se sabe que se une al polipéptido según la
reivindicación 12ª, y (ii) un compuesto, con células que expresan el
polipéptido según la reivindicación 12ª en su superficie celular,
asociándose dicho polipéptido con un segundo componente capaz de
proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un
compuesto a dicho polipéptido; siendo dicho contacto bajo
condiciones suficientes para permitir la unión de los compuestos al
polipéptido; y
(b) determinar si el primer componente se une al
polipéptido detectando la ausencia o no de una señal producida por
la interacción del primer componente con el polipéptido.
16. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13ª a 15ª, en el que dicho compuesto se une al
polipéptido según la reivindicación 12ª y lo antagoniza o lo
antagoniza selectivamente.
17. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13ª a 15ª, en el que dicho compuesto se une al
polipéptido según la reivindicación 12ª y lo agoniza.
18. Células modificadas por ingeniería genética
ex vivo para expresar, sobre expresar, subexpresar o para
mostrar inserción o deleción dirigidas del polipéptido según la
reivindicación 12ª.
19. Células no humanas modificadas por ingeniería
genética in vivo para expresar, sobreexpresar, subexpresar o
para mostrar inserción o deleción dirigidas del polipéptido según la
reivindicación 12ª.
20. Un método para aclarar la estructura
tridimensional del polipéptido según la reivindicación 12ª, que
comprende las etapas de (a) purificar el polipéptido; (b)
cristalizarlo, y (c) aclarar la estructura, en particular mediante
cristalografía de rayos X.
21. Un método para modelar la estructura del
polipéptido según la reivindicación 12ª, que comprende las etapas
de: (a) alinear la secuencia con una secuencia de una proteína de
estructura tridimensional conocida, en particular rodopsina; (b)
cartografiar las diferencias de secuencia detectadas del polipéptido
según la reivindicación 12ª en la estructura conocida; (c) derivar
un modelo de homología del polipéptido según la reivindicación
12ª.
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