ES2270828T3 - Secuencias de adn y produccion por recombinacion de un alergeno de la familia de las gramineas. - Google Patents
Secuencias de adn y produccion por recombinacion de un alergeno de la familia de las gramineas. Download PDFInfo
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Abstract
Una molécula de ADN recombinante, que contieneuna secuencia de nucleótidos del alergeno PhI p13 de Phleum pratense según SEQ ID NO 1, que codificaun polipéptido, que presenta el efecto del alergenoPhI p 13 de Phleum pratense.
Description
Secuencia de ADN y producción por recombinación
de un alergeno de la familia de las gramíneas.
La invención se refiere a la identificación y a
la caracterización de un alergeno de polen de gramíneas así como de
la molécula de ADN recombinante que lo codifica. Como materias
primas naturales sirven los pólenes de Phleum pratense. Las
moléculas de ADN recombinantes y los polipéptidos derivados pueden
aprovecharse para la terapia de enfermedades alérgicas al polen.
Además las proteínas recombinantes preparadas pueden utilizarse
para la diagnosis de alergias al polen.
Las alergias del tipo 1 tienen un significado
mundial. Hasta el 20 % de la población de los países
industrializados sufre de molestias tales como rinitis alérgica,
conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por
los alergenos, que se encuentran en el aire (aéroalergenos), que son
liberados por fuentes de diverso origen tales como pólenes de
plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de
tipo 1 presenta, a su vez, reactividad específica IgE en el caso de
los pólenes de la familia de las gramíneas (Freidhoff et al.,
1986. J Allergy Clin Immunol 78, 1190-201).
Las substancias que generan las alergias de tipo
1 están constituidas por proteínas, glicoproteínas y polipéptidos.
Estos alergenos reaccionan, tras su absorción a través de las
mucosas, con las moléculas IgE enlazadas sobre la superficie de los
mastocitos. Si se enlazan entre sí, debido a una alergia, dos
moléculas de IgE, esto conduce a la descarga de mediadores (por
ejemplo histamina, prostaglandina) y citoquinas por parte de las
células efectoras y, por lo tanto, conduce a los síntomas clínicos
correspondientes.
En función de la frecuencia relativa de los
alérgicos, que presentan anticuerpos IgE contra determinados
alergenos, se distingue entre alergenos mayores y menores. En el
caso del fleo de los prados (Phleum pratense) se han caracterizado
hasta el presente PhI p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy
Clin. Immunol. 92, 789-796), PhI p 5 (Matthiesen
und Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21,
297-307; Petersen et al., 1992), PhI p 6
(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108,
49-54) y PhI p 2/3 (Dolecek et al., 1993,
FEBS 335 (3), 299-304) como alergenos mayores y PhI
p 4 (Löwenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) así
como los grupos 10 y 11 procedentes de Lolium perenne (Ansari
et. al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80,
229-235) como alergenos menores.
En relación con la presente invención, tiene un
interés especial el alergeno PhI p 4, puesto que tiene un peso
molecular de aproximadamente 55 kDa (Fischer et. al., 1996,
J. Allergy Clin Immunol. 98 (1), 189-98) similar al
del nuevo alergeno y por lo tanto es comparable, de manera más
próxima, con el alergeno preparado según la invención,
diferenciándose, sin embargo, claramente desde el punto de vista
inmunológico y bioquímico. En contra de lo que ocurre en el caso de
los otros alergenos anteriormente citados, el PhI p 4 es el único,
cuya secuencia genómica o transcriptiva (cDNA) no ha sido
identificada todavía. Existen datos de las secuencias, entre otros,
de PhI p 1 (Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin. Immunol.
94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J.
Allergy Clin. Immunol. 95(5). 987-994), de
PhI p 5 (Vrtala et al., 1993, J. Immunol. 151 (9),
4773-4781), de PhI p 6 (Petersen et al.,
1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108 (1), 55-59) y
de PhI p 2 (Dolecek et. al., 1993, FEBS 335 (3),
299-304). Con ayuda de las secuencias cADN es
posible la preparación de alergenos recombinantes, que puedan
encontrar aplicación en la diagnosis y en la terapia (Scheiner and
Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).
Una tesis clásica para el tratamiento
terapéutico efectivo de alergias está representada por la
inmunoterapia específica o por la hiposensibilización (Fiebig,
1995, Allergo J. 4 (6), 336-339, Bousquet et
al., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102(4),
558-562). En este caso se inyectan subcutáneamente
al paciente extractos de alergenos naturales en dosis crecientes.
Desde luego, en este método existe el peligro de reacciones
alérgicas o incluso de un shock anafiláctico. Para minimizar estos
riesgos se emplean preparados innovativos en forma de alergoides.
Éstos están constituidos por extractos de alergenos químicamente
modificados, que presentan una reactividad IgE claramente reducida,
pero sin embargo una reactividad idéntica de las células T en
comparación con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4
(7), 377-382).
Sería posible una optimización de la terapia,
todavía mayor, con alergenos preparados de manera recombinante.
Determinadas mezclas, elegidas en caso dado para pacientes
individuales, de alergenos de gran pureza, preparados de manera
recombinante, podrían sustituir a los extractos procedentes de
fuentes de alergenos naturales, puesto que éstos contienen, además
de los diversos alergenos, un gran número de proteínas acompañantes
inmunógenas, pero no alergénicas. Los alergenos recombinantes
mutados de manera específica ofrecen perspectivas realísticas, que
conducirían a una hiposensibilización segura con productos de
expresión, en los cuales se han eliminado específicamente los
epitopos IgE sin que se perjudiquen los epitopos de las células T
esenciales para la terapia (Schramm et al., 1999, J.
Immunol. 162,
2406-2414).
2406-2414).
Otra posibilidad para producir un influjo
terapéutico del equilibrio perturbado de las células Th en el caso
de los alérgicos consiste en el tratamiento con ADN capaces de
expresión, que codifiquen los alergenos relevantes. Se han podido
obtenerse las primeras confirmaciones experimentales para el efecto
específico de los alergenos sobre la respuesta inmune en roedores
mediante la inyección de ADN codificante de los alergenos (Hsu et
al., 1996, Nature Medicine 2 (5), 540-544).
La invención puede emplearse ventajosamente para
la diagnosis in vitro y para la diagnosis in vivo de
enfermedades alérgicas, especialmente de polinosis. Para ello se
lleva a cabo la ligadura de los ácidos nucleicos clonados con un
vector de expresión y esta construcción se expresa en un tipo
celular adecuado. Tras la purificación bioquímica está disponible
este alergeno recombinante para la detección de anticuerpos IgE en
procedimientos usuales. Por otro lado, puede emplearse la invención
como un componente esencial en un preparado, que contengan
alergenos recombinantes o ácidos nucleicos para la inmunoterapia
específica. En este caso se ofrecen varias posibilidades. Por un
lado, la proteína modificada en la estructura primaria puede ser
parte integrante del preparado. Por otro lado, el ácido nucleico
puede representar un preparado en sí mismo, cuando esté ligado con
un vector de expresión eucariótico, que modifique el estado inmune,
alérgico, en el sentido terapéutico cuando se aplique
directamente.
En el caso de la invención se trata de una
molécula de ADN recombinante, que está constituida por una secuencia
de ácidos nucleicos (figura 1) y que codifica un alergeno. Como
materias primas naturales sirven los granos de polen de las
gramíneas, tales como por ejemplo Phleum pratense, Lolium
perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon,
Holcus tanatus y similares.
Tras la purificación y el aislamiento del
alergeno natural se llevó a cabo una secuenciación proteica
N-terminal. Tomando como base la secuencia de
ácidos nucleicos, deducida a partir de dicha secuenciación, se lleva
a cabo la obtención de un iniciador. Con ayuda de este iniciador se
obtuvieron, se clonaron y se caracterizaron los cADN
correspondientes a partir de una población de cADN de polen por
medio de PCR.
El alergeno se purificó tras la expresión de la
molécula de ADN recombinante mediante vectores de expresión
adecuados en sistemas celulares.
La purificación del alergeno natural a partir de
polen de fleo de los prados se llevó a cabo en un procedimiento con
dos etapas. Tras la extracción acuosa del polen se separó el
extracto obtenido en dos fracciones por medio de cromatografía de
interacción hidrófoba, la fracción migratoria y el eluato. La
fracción migratoria contenía tres alergenos, PhI p 1
(30-35 kDa), PhI p 2/3 (11-14 kDa) y
un alergeno desconocido (55-60 kDa). Estas proteínas
se separaron entre sí mediante filtración de gel con Superdex
75.
Este alergeno, desconocido hasta ahora
(denominación de trabajo p55, denominación definitiva "Phi p
13"; Suck et al., Clin. Exp. Allergy 30 (3), 2000,
324-332) se separó por medio de
SDS-PAGE, a continuación se distribuyó en forma de
manchas sobre una membrana de PVDF y se aisló una fracción
exactamente definida. A partir de esta molécula p55 se determinó
una secuencia de aminoácidos N-terminal mediante la
degradación de Edman (figura 2).
Para la obtención y la clonación del cADN
correspondiente del p55 se construyó, según la invención, un
iniciador ADN específico (21 mero) basado en la secuencia
N-terminal (figura 3). Como segundo iniciador se
utilizó una secuencia de fijación, que estaba localizada en el
iniciador oligo-dT utilizado para la transcripción
inversa. Se llevó a cabo con un cDNA, que se preparó a partir de la
población representativa de mRNA del polen de
Phleum-pratense, y con el de la invención así como
con el iniciador de fijación, se llevó a cabo una reacción PCR bajo
condiciones de restricción. Se identificó en la electrofóresis
analítica de gel de la reacción PCR un producto amplificado con un
tamaño de 1,65 kb. Este producto amplificado se enlazó con un vector
pCR2.1 y se transformó con éxito. La secuenciación de los insertos
de dos clones diferentes proporcionó la secuencia
idéntica.
idéntica.
En este producto amplificado primario se
identificó una pauta de lectura abierta (ORF) de 1.492 bp (véase la
figura 1).
Para la obtención de la correspondiente proteína
recombinante (figura 4) a partir de estos ácidos nucleicos se llevó
a cabo en primer lugar una transclonación del vector pCR2.1 mediante
enzimas de restricción en el vector de expresión pProEx Htb. Tras
la expresión y la purificación bioquímica del producto de la
expresión se llevaron a cabo varios análisis con respecto a las
características alergenas de la proteína desarrollada. En todos los
análisis, por ejemplo Western Blot y Dot Blot, la proteína
recombinante reaccionó específicamente con IgE de proteínas que
presentaban los síntomas clínicos diagnosticadores de una alergia
debida al polen de las gramíneas. Como controles se empleó el p55
natural. Por lo tanto la proteína recombinante está constituida
claramente por un alergeno. Este producto de expresión sirve, por lo
tanto, para una diagnosis mejorada, altamente específica, de
alergias debidas al polen de las gramíneas.
Cuando se enlace el ácido nucleico, que codifica
la p55, con un vector de expresión humano, estas construcciones
podrán emplearse, igualmente, como preparados para la inmunoterapia
específica.
Por lo tanto, el objeto de la invención está
constituido por
- (a)
- una molécula de ADN recombinante, que presenta una secuencia de nucleótidos del alergeno PhI p 13 procedente de Phleum pratense según SEQ ID NO 1, que codifica un polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense,
- (b)
- una molécula de ADN, que tiene una secuencia de nucleótidos, que es complementaria con la secuencia de nucleótidos definida en (a) del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense,
- (c)
- un vector de expresión de ADN recombinante o un sistema de clonación constituido por la molécula de ADN recombinante, que contiene una secuencia de nucleótidos del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense según SEQ ID NO 1, como se ha definido en (a), enlazado funcionalmente con una secuencia de control de la expresión,
- (d)
- alergeno natural PhI p 13 de Phleum pratense, que es codificado por el ácido nucleico según (a),
- (e)
- un polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense, que es codificado por el ácido nucleico según (a),
- (f)
- un método para la obtención de un polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense, mediante cultivo de células procariotas o eucariotas, que están transformadas con un vector de expresión según (c), y la obtención de la proteína o bien del péptido correspondiente a partir del cultivo,
- (g)
- un método para la diagnosis de la alergia al polen in vitro con empleo del polipéptido según (d) o (e),
- (h)
- una preparación farmacéutica, que contiene un polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense, según (d) o (e), para el tratamiento terapéutico de los seres humanos o de los animales alérgicos al polen,
- (i)
- el empleo de un polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense, según (d) o (e) para la obtención de un medicamento para el tratamiento de los seres humanos o de los animales alérgicos al polen,
- (j)
- el empleo de las construcciones definidas en (c), que contienen una secuencia de nucleótidos del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense según SEQ ID NO 1, para la obtención de un medicamento para la vacunación por medio de ADN de los seres humanos o de los animales alérgicos al polen,
- (k)
- el empleo de los vectores, definidos en (c), que contienen una secuencia de nucleótidos del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense según SEQ ID NO 1, que contienen segmentos de ADN inmunoestimulantes, para la obtención de un medicamento para la vacunación por medio de ADN de seres los humanos o de los animales alérgicos al polen.
La invención sirve, por lo tanto, para mejorar
el diagnosis in vitro en el ámbito de una identificación,
generadora de componentes alergenos, del espectro de
sensibilización específico del paciente. La invención sirve,
igualmente, para la obtención de preparados claramente mejorados
para la inmunoterapia específica de alergias debidas al polen de
las gramíneas.
<110> Merck Patent GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencia de ADN y obtención
recombinante de un alergeno de gramíneas
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<130> Secuencia de ADN
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<140>
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<141>
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<160> 4
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1187
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<212> DNA
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<213> gramíneas
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial: iniciador específico p55
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Asp Glu Lys Lys
Glu Ser Gly Asp Ala}
\sac{Ala Ser Xaa Ala}
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<210> 3
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> descripción de la secuencia
artificial: iniciador específico p55
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<220>
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<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
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<223> n = inosina
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<220>
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<221> variación
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<222> (6)
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<223> n = inosina
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = inosina
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
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<223> n = inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = inosina
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = inosina
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<220>
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<221> variación
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<222> (21)
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<223> n = inosina
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> variación
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<222> (24)
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<223> n = inosina
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipggnaanaang anganaanaa nganga
\hfill26
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<210> 4
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<211> 394
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<212> PRT
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<213> gramíneas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (11)
1. Una molécula de ADN recombinante, que
contiene una secuencia de nucleótidos del alergeno PhI p 13 de
Phleum pratense según SEQ ID NO 1, que codifica un
polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de
Phleum pratense.
2. Una molécula de ADN, que tiene una secuencia
de nucleótidos, que es complementaria de la secuencia de
nucleótidos definida en la reivindicación 1 del alergeno PhI p 13 de
Phleum pratense.
3. Un vector recombinante de expresión de ADN o
un sistema de clonación constituido por una molécula recombinante
de ADN, que contiene una secuencia de nucleótidos del alergeno PhI p
13 de Phleum pratense según SEQ ID NO 1, como se ha definido
en la reivindicación 1, enlazado funcionalmente con una secuencia de
control de la expresión.
4. Alergeno natural PhI p 13 de Phleum
pratense, que codifica el ácido nucleico según la reivindicación
1.
5. Un polipéptido, que presenta el efecto del
alergeno PhI p 13 de Phleum pratense, que es codificado por
el ácido nucleico según la reivindicación 1.
6. Un método para la obtención de un
polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de
Phleum pratense, mediante cultivo de células procariotas o
eucariotas, que han sido transformadas con un vector de expresión
según la reivindicación 3, y la obtención de la proteína o bien del
polipéptido correspondiente a partir del cultivo.
7. Un método para la diagnosis de alergias
debidas al polen in vitro con el empleo del polipéptido de
las reivindicaciones 4 o 5.
8. Una preparación farmacéutica, que contiene un
polipéptido, que presenta el efecto del alergeno PhI p 13 de
Phleum pratense, según las reivindicaciones 4 o 5, para el
tratamiento terapéutico de los seres humanos o de los animales
alérgicos al polen.
9. Empleo de un polipéptido, que presenta el
efecto del alergeno PhI p 13 de Phleum pratense, según las
reivindicaciones 4 o 5, para la obtención de un medicamento para el
tratamiento de los seres humanos o de los animales alérgicos al
polen.
10. Empleo de las construcciones definidas en la
reivindicación 3, que contienen una secuencia de nucleótidos del
alergeno PhI p 13 de Phleum pratense según SEQ ID NO 1, para
la obtención de un medicamento para la vacunación por ADN de los
seres humanos o de los animales alérgicos al polen.
11. Empleo de los vectores definidos en la
reivindicación 3, que contienen una secuencia de nucleótidos del
alergeno PhI p 13 de Phleum pratense según SEQ ID NO 1 así
como segmentos de ADN inmunoestimulantes, para la obtención de un
medicamento para la vacunación por ADN de los seres humanos o de los
animales alérgicos al polen.
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