ES2291759T3 - Ligandos piridino pentaazamacrociclicos sustituidos. - Google Patents
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Abstract
Ligando orgánico macrocíclico que tiene la siguiente fórmula, en la que un nitrógeno del macrociclo y los dos átomos de carbono adyacentes a los que está unido independientemente forman un heterociclo W insaturado sustituido que contiene nitrógeno y que tiene de 2 a 20 átomos de carbono, que puede ser un heterociclo aromático, en cuyo caso el hidrógeno unido al nitrógeno que forma parte tanto del heterociclo como del macrociclo y los grupos R unidos a los átomos de carbono que forman parte tanto del heterociclo como del macrociclo, están ausentes; en la que R, R1, R2, R''2, R3, R''3, R4, R''4, R5, R''5, R6, R''6, R7, R''7, R8, R''8, R9 y R''9 representan, independientemente, hidrógeno o radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilcicloalquilo, cicloalquenilalquilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquenilcicloalquenilo, heterocíclicos, arilo y aralquilo sustituidos o no sustituidos.
Description
Ligandos piridino pentaazamacrocíclicos
sustituidos.
El enzima superóxido dismutasa cataliza la
conversión de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno, según
la ecuación (1) (en adelante identificada como dismutación).
(1)2O_{2}^{-} + 2 H^{+}
\rightarrow O_{2} +
H_{2}O_{2}
se ha demostrado que los
metabolitos de oxígeno activo procedentes de superóxido contribuyen
a la patología del tejido en un determinado número de enfermedades
y trastornos inflamatorios, tales como la lesión por en el
miocardio isquémico, la enfermedad de intestino inflamado, artritis
reumatoide, osteoartritis, aterosclerosis, hipertensión,
metástasis, psoriasis, rechazo por trasplante de órganos, lesión
inducida por radiación, asma, gripe, ictus, quemaduras y
traumatismos. Ver, por ejemplo, Simic, M.G., et al., Oxygen
Radicals in Biology and Medecine, Basic Life Sciences, Vol. 49,
Plenum Press, New York and London, 1988; Weiss J.Cell. Biochem.,
1991 Supple. 15C, 216 Abstract C110 (1991); Petkau, A. Cancer treat.
Rev. 13, 17 (1986); McCord, J. Free Radicals Biol. Med.,
2, 307 (1986); and Bannister, JV., et al., Crit. Rev.
Biochem., 22, 111
(1987).
Es también conocido que el superóxido está
involucrado en la rotura del factor relajante vascular procedente
del endotelio (EDRF), el cual ha sido identificado como óxido
nítrico (NO), y que el EDRF está protegido frente a la rotura a
través de la superóxido dismutasa. Esto sugiere un papel central
para las especies de oxígeno activado procedentes de superóxido en
la patogénesis de la hipertensión, el vasoespasmo, la trombosis y la
ateroesclerosis. Ver, por ejemplo, Gryglewski, R.J. et al.,
"Superoxide Anion is Involved in the Breakdown of
Endothelium-derived Vascular Relaxing Factor",
Nature, Vol. 320, pp. 454-56 (1986) and Palmer,
R.M.J. et al., "Nitric Oxide Release Acounts for the
Biological Activity of Endotelium Derived Relaxing Factor",
Nature, Vol. 327, pp. 523-26 (1987).
Mary C. Rakowski et al., "Synthesis and
characterization of transition metal complexes containing a
pentadentate macrocyclic ligand" describe ligandos y complejos
que comprenden una estructura de
2,13-dimetil-3,6,9,12,18
pentaazabiciclo
[12.3.1]-octadeca-1(18),14,16-trieno,
en la que el grupo piridino no está sustituido.
WO 98/58636 describe complejos y ligandos
basados en estructuras pentaazamacrocílicas y su utilización en el
tratamiento del dolor en humanos y animales inferiores.
Se han completado, o están en curso de hacerlo,
ensayos clínicos y estudios animales con enzimas superóxido
dismutasa de origen natural, recombinantes y modificados, para
demostrar la eficacia terapéutica de la reducción de niveles de
superóxido en los estados de enfermedad descritos anteriormente. No
obstante, han surgido numerosos problemas con la utilización de los
enzimas como potenciales agentes terapéuticos, incluyendo la falta
de actividad oral, semividas cortas in vivo, inmunogenicidad
de enzimas derivados de no humanos y pobre distribución en
tejido.
En un esfuerzo para superar los problemas
asociados con los enzimas superóxido dismutasa, se han llevado a
cabo diversas investigaciones en relación con el diseño de
catalizadores no proteínicos para la dismutación de superóxido y su
uso en el tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con
superóxido. Un grupo de catalizadores que ha demostrado ser casi
tan eficaces como los enzimas superóxido dismutasa de origen natural
son los complejos de hierro y manganeso de ligandos
pentaazaciclopentadecano, descritos en las patentes de EE.UU. Nos.
5.610.293, 5.637.578 y 5.874.421. Estos ligandos son descritos como
macrociclos pentaazaciclopentadecano con diversos sustituyentes
sobre los carbonos del macrociclo, o con estructuras cíclicas o
heterocíclicas unidas a los carbonos del macrociclo. Se ha
demostrado que estos compuestos poseen actividad catalítica
dismutante de superóxido, al igual que actividad antiinflamatoria y
para la prevención del daño oxidativo. Además, se ha demostrado que
estos compuestos poseen actividad analgésica en el modelo de
hiperplasia de carragenina en pata de rata, tal como se indica en
la solicitud de patente de EE.UU Nº 09/057831. Dos de los citados
compuestos imitadores son el Compuesto A y el Compuesto B:
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está dirigida a ligandos
tal y como se describen en las reivindicaciones. Los solicitantes
de la presente han averiguado que, de forma sorprendente, la adición
de sustituyentes a un grupo heterocíclico insaturado que contiene
nitrógeno sobre el macrociclo de pentaazaciclopentadecano de los
compuestos descritos anteriormente, puede alterar drásticamente la
actividad catalítica de la superóxido dismutasa e incrementar la
eficacia de estos complejos como agentes farmacéuticos. Los
solicitantes han averiguado que los compuestos que comprenden
grupos heterocíclicos insaturados sustituidos que contienen
nitrógeno muestran, de forma sorprendente, un marcado incremento en
la potencia para la prevención o inversión de la tolerancia a
opioides, en comparación con la de los complejos descritos
previamente con grupos heterocíclicos no sustituidos que contienen
nitrógeno. Además, estos compuestos heterocíclicos insaturados
sustituidos que contienen nitrógeno son hasta diez veces más
potentes como agentes farmacéuticos para composiciones
antiinflamatorias y analgésicas y son tan buenos como o, a menudo,
mejores que, los compuestos no sustituidos de partida en
aplicaciones tales como el tratamiento de la hipotensión rebelde
provocada por endotoxina. Por lo tanto, los compuestos muestran
mejoras no anticipadas en importantes características para
productos farmacéuticos, en relación con los complejos
pentaazaciclopentadecanos descritos con anterioridad con grupos
heterocíclicos no sustituidos que contienen nitrógeno.
La presente invención va dirigida a ligandos
macrocíclicos de quince elementos que contienen nitrógeno, los
cuales comprenden un grupo heterocíclico insaturado sustituido que
contiene nitrógeno, más preferiblemente aquellos con sustituyentes
ciclohexilo, hidroxialquiltio, éster alquílico (2-ácido tioacético),
benciloxi, metoxiariltio, alcoxicarbonilariltio y éster arilo
(ácido 2-tioacético).
La presente invención va también dirigida a
macrociclos de pentaazaciclopentadecano que comprenden un grupo
heterocíclico insaturado sustituido que contiene nitrógeno.
Otros objetos y características resultarán en
parte evidentes y en parte apuntados de ahora en adelante.
Figura 1: un gráfico de datos de presión
arterial promedio, obtenidos a partir de ratas endotoxémicas,
Ejemplo 16. \blacklozenge Grupo que recibió solución salina
(control); Grupo que recibió tan solo LPS; \Delta Grupo que
recibió LPS y una infusión de 0,25 mg/kg/hr de Compuesto A una vez
transcurrida 1 hora; \ding{115} Grupo que recibió LPS y una
infusión de 0,25 mg/kg/hr de Compuesto A una vez transcurridas 5
horas.
Figura 2: un gráfico de datos de presión
arterial promedio, obtenidos a partir de ratas endotoxémicas,
Ejemplo 16. \blacklozenge Grupo que recibió solución salina
(control); \Box Grupo que recibió tan solo LPS; \Delta Grupo
que recibió LPS y una infusión de 0,075 mg/kg/hr de Compuesto 25 una
vez transcurridas 3 horas.
Figura 3: un gráfico de datos de presión
arterial promedio, obtenidos a partir de ratas endotoxémicas,
Ejemplo 16. \blacklozenge Grupo que recibió solución salina
(control); \Box Grupo que recibió tan solo LPS; \Delta Grupo
que recibió LPS y una infusión de 0,075 mg/kg/hr de Compuesto 31 una
vez transcurridas 3 horas.
Figura 4: un gráfico de las modificaciones en el
volumen de pata en modelo de carragenina en pata de rata, Ejemplo
14. \ding{110} Grupo que recibió únicamente inyección de
carragenina; \bullet Grupo que recibió una infusión de 6
mg/kg/hora de Compuesto A, 15 minutos antes de la inyección de
carragenina.
Figura 5: un gráfico de las modificaciones en el
volumen de pata en modelo de carragenina en pata de rata, Ejemplo
14. \ding{110} Grupo que recibió únicamente inyección de
carragenina; \bullet Grupo que recibió una infusión de 10
mg/kg/hora de Compuesto 13, 15 minutos antes de la inyección de
carragenina.
Figura 6: un gráfico de las modificaciones en el
volumen de pata en modelo de carragenina en pata de rata, Ejemplo
14. \ding{110} Grupo que recibió únicamente inyección de
carragenina; \bullet Grupo que recibió una infusión de 1
mg/kg/hora de Compuesto 14, 15 minutos antes de la inyección de
carragenina. \ding{115} Grupo que recibió una infusión de 10
mg/kg/hora de Compuesto 14, 15 minutos antes de la inyección de
carragenina.
Figura 7: un gráfico de las modificaciones en el
volumen de pata en modelo de carragenina en pata de rata, Ejemplo
14. \ding{110} Grupo que recibió únicamente inyección de
carragenina; \bullet Grupo que recibió una infusión de 10
mg/kg/hora de Compuesto 25, 15 minutos antes de la inyección de
carragenina.
Figura 8: un gráfico de las modificaciones en el
volumen de pata en modelo de carragenina en pata de rata, Ejemplo
14. \ding{110} Grupo que recibió únicamente inyección de
carragenina; \bullet Grupo que recibió una infusión de 10
mg/kg/hora de Compuesto 31, 15 minutos antes de la inyección de
carragenina.
Figura 9: un gráfico que representa los efectos
protectores del Compuesto A en un modelo de rata de shock inducido
por E. Coli viva. La Figura 9a describe el efecto protector
del Compuesto A, a la hora de evitar una caída en la MAP. La Figura
9B describe el efecto protector del Compuesto A, a la hora de evitar
una caída en la frecuencia cardíaca.
Figura 10: representa la estructura molecular
del Compuesto 25 de la presente invención.
Tal como se utiliza en el presente documento, la
expresión "imitador SOD" significa un catalizador de bajo peso
molecular para la conversión de aniones superóxido en peróxido de
hidrógeno y oxígeno molecular. Estos catalizadores comprenden un
ligando orgánico que tiene una parte pentaazaciclopentanodecano y un
ión metal de transición quelado, preferiblemente manganeso y
hierro. El término puede incluir catalizadores que contienen
polipéptidos de cadena corta (menos de 15 aminoácidos) o estructuras
macrolíticas procedentes de aminoácidos, como el ligando orgánico.
El término explícitamente excluye un enzima superóxido dismutasa
obtenido a partir de cualquier tipo de fuente de origen
natural.
El término "ligando precursor" significa el
ligando orgánico de un imitador SOD, sin el catión de metal de
transición quelado y aniones neutralizadores de carga.
El término "sustituido" significa que el
resto descrito tiene uno o más sustituyentes que comprenden al menos
1 carbono o heteroátomo y comprende, además, entre 0 y 22 átomos
de carbono, más preferiblemente entre 1 y 15 átomos de carbono y
que comprende entre 0 y 22, más preferiblemente entre 0 y 15,
heteroátomos seleccionados de entre el grupo que comprende: O, S,
N, P, Si, B, F, Cl, Br, o I. Estos átomos pueden estar dispuestos
en un determinado número de configuraciones, creando grupos
sustituyentes que non insaturados, saturados, o aromáticos. Entre
los ejemplos de los citados sustituyentes se incluyen alquilo,
alquenilo, o alquinilo, lineales o ramificados, ciclos,
heterociclos, arilo, heteroarilo, alilo, policicloalquilo,
policicloarilo, policicloheteroarilo, iminas, aminoalquilo,
hidroxialquilo, hidroxilo, fenol, óxidos de amina, tioalquilo,
carboalcoxialquilo, ácidos carboxílicos y sus derivados ceto, éter,
aldehido, amina, amida, nitrilo, halo, tiol, sulfóxido, sulfona,
ácido sulfónico, sulfuro, disulfuro, ácido fosfónico, ácido
fosfínico, ácido acrílico, sulfonamidas, aminoácidos, péptidos,
proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, lípidos,
nitro, hidroxilaminas, ácidos hidroxámicos, tiocarbonilos, boratos,
boranos boraza, sililo, silaza, siloxi y combinaciones de los
mismos.
El término "alquilo", solo o en
combinación, significa un radical alquilo de cadena lineal o de
cadena ramificada, que contiene entre 1 y aproximadamente 22 átomos
de carbono, preferiblemente entre 1 y aproximadamente 18 átomos de
carbono y, muy preferiblemente, entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 12 átomos de carbono. Entre los ejemplos de los
citados radicales se incluyen, sin que ello suponga ninguna
limitación, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, pentilo, iso-amilo,
hexilo, octilo, nonilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo,
octadecilo y eicosilo.
El término "alquenilo", solo o en
combinación, significa un radical alquilo que tiene uno o más dobles
enlaces. Entre los ejemplos de los citados radicales alquenilo se
incluyen, sin que ellos suponga una limitación, etenilo, propenilo,
1-butenilo,
cis-2-butenilo,
trans-2-butenilo, isobutenilo,
cis-2-pentenilo,
trans-2-pentenilo,
3-metil-1-butenilo,
2,3-dimetil-2-butenilo,
1-pentenilo, 1-hexenilo,
1-octenilo, decenilo, dodecenilo, tetradecenilo,
hexadecenilo, cis y
trans-9-octadecenilo,
1,3-pentadienilo, 2,4-pentadienilo,
2,3-pentadienilo, 1,3-hexadienilo,
2,4-hexadienilo,
5,8,11,14-eicosatetraenilo y
9,12,15-octadecatrienilo.
El término "alquinilo", solo o en
combinación, significa un radical alquilo que tiene uno o más
triples enlaces. Entre los ejemplos de tales grupos alquinilo se
incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, etinilo,
propinilo (propargilo), 1-butinilo,
1-octinilo, 9-octadecenilo,
1,3-pentadiinilo, 2,4-pentadiinilo,
1,3-hexadiinilo, y
2,4-hexadiinilo.
El término "cicloalquilo", solo o en
combinación, significa un radical cicloalquilo que contiene entre 3
y aproximadamente 10, preferiblemente entre 3 y aproximadamente 8,
y muy preferiblemente entre 3 y aproximadamente 6 átomos de
carbono. Entre los ejemplos de los citados radicales cicloalquilo se
incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, ciclopropilo,
ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, cilcooctilo y
peridronaftilo.
El término "cicloalquilalquilo" significa
un radical alquilo, tal como se ha definidlo anteriormente, que
está sustituido por un radical cicloalquilo, tal como se ha definido
anteriormente. Entre los ejemplos de radicales cicloalquilalquilo
se incluyen, sin que ello suponga ninguna imitación,
ciclohexilmetilo, ciclopentilmetilo,
(4-isopropilciclohexil)metilo,
(4-t-butil-ciclohexil)metilo,
3-ciclohexilpropilo,
2-ciclohexilmetilpentilo,
3-ciclopentilmetilhexilo.
El término "cicloalquilcicloalquilo"
significa un radical cicloalquilo, tal como se ha definido
anteriormente, que está sustituido por otro radical cicloalquilo,
tal como se ha definido anteriormente. Entre los ejemplos de
radicales cicloalquilcicloalquilo se incluyen, sin que ello suponga
ninguna limitación, ciclohexilciclopentilo y
ciclohexilciclohexilo.
El término "cicloalquenilo", solo o en
combinación, significa un radical cicloaquilo que tiene uno o más
dobles enlaces. Entre los ejemplos de radicales cicloalquenilo se
incluyen, sin que ellos suponga ninguna limitación, ciclopentenilo,
ciclohexenilo, ciclooctenilo, ciclopentadienilo, cicohexadienilo y
ciclooctadienilo.
El término "cicloalquenilalquilo" significa
un radical alquilo, tal como se ha definido anteriormente, que está
sustituido por un radical cicloalquenilo, tal como se ha definido
anteriormente. Entre los ejemplos de radicales cicloalquenilalquilo
se incluye, sin que ello suponga ninguna limitación,
2-ciclohexen-1-ilmetilo,
1-ciclopenten-1-ilmetilo,
2-(1-ciclohexen-1-il)etilo,
3-(1-ciclopenten-1-il)propilo,
1-(1-ciclohexen-1-ilmetil)pentilo,
1-(1-ciclopenten-1-il)hexilo,
6-(1-ciclohexen-1-il)hexilo,
1-(1-ciclopenten-1-il)hexilo,
6-(1-ciclohexen-1-il)hexilo,
1-(1-cicloenten-1-il)hexilo.
Los términos "alquilcicloalquilo" y
"alquenilcicloalquilo" significan un radical cicloalquilo, tal
como se ha definido anteriormente, que está sustituido por un
radical alquilo o alquenilo, tal como se ha definido anteriormente.
Entre los ejemplos de radicales alquilcicloalquilo y
alquenilcicloalquilo se incluyen, sin que ellos suponga ninguna
limitación, 2-etilciclobutilo,
1-metilciclopentilo,
1-hexilciclopentilo,
1-metilciclohexilo,
1-(9-octadecenil)ciclopentilo y
1-(9-octadecenil)ciclohexilo.
Los términos "alquilcicloalquenilo" y
"alquenilcicloalquenilo" significan un radical cicloalquenilo,
tal como se ha definido anteriormente, que está sustituido por un
radical alquilo o alquenilo, tales como los definidos
anteriormente. Entre los ejemplos de radicales alquilcicloalquenilo
y alquenilcicloalquenilo se incluyen, sin que ello suponga ninguna
limitación,
1-metil-2-ciclopentilo,
1-hexil-2-ciclopentenilo,
1-etil-2-ciclohexenilo,
1-butil-2-ciclohexenilo,
1-(9-octadecenil)-2-ciclohexenilo
y
1-(2-pentenil)-2-ciclohexenilo.
El término "arilo", solo o en combinación,
significa un radical fenilo o naftilo, el cual soporta opcionalmente
uno o más sustituyentes seleccionados de entre alquilo,
cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heterociclo, alcoxiarilo,
alquilarilo, alcoxi, halógeno, hidroxi, amino, ciano, nitro,
alquiltio, fenoxi, éter, trifluorometilo y similares, tales como
fenilo, p-tolilo, 4-metoxifenilo,
4-(terc-butoxi)fenilo,
4-fluorofenilo, 4-clorofenilo,
4-hidroxifenilo, 1-naftilo,
2-naftilo y similares.
El término "aralquilo", solo o en
combinación, significa un radical alquilo o cicloalquilo, tal como
se ha definido anteriormente, en el cual un átomo de hidrógeno esta
sustituido por un radical arilo, tal como se ha definido
anteriormente, tal como bencilo, 2-feniletilo y
similares.
El término "heterociclo" significa
estructuras de anillo que contienen al menos otro tipo de átomos,
además de carbono, en el anillo. Entre los tipos de átomos más
habituales se incluyen nitrógeno, azufre y oxígeno. Entre los
ejemplos de heterociclos se incluyen, sin que ello suponga ninguna
limitación, grupos pirrolidinilo, piperidilo, imidazolidinilo,
tetrahidrofurilo, tetrahidrotienilo, furilo, tienilo, piridilo,
quinolilo, isoquinolilo, piridazinilo, indolilo, imidazolilo,
oxazolilo, tiazolilo, pirazolilo, piridinilo, benzoxadiazolilo,
benzotiadiazolilo, triazolilo y tetrazolilo.
El término "ciclo saturado, parcialmente
saturado o insaturado" significa estructuras de anillo fusionadas
en las cuales dos átomos de carbono del anillo forman también parte
del ligando macrocíclico de quince elementos. La estructura de
anillo puede contener entre 3 y 20 átomos de carbono,
preferiblemente entre 5 y 10 átomos de carbono y puede también
contener uno o más tipos diferentes de átomos además de carbono.
Entre los más habituales de estos tipos de átomos se incluyen
nitrógeno, oxígeno y azufre. La estructura de anillo pude también
contener más de un anillo.
El término "estructura de anillo saturado,
parcialmente saturado o insaturado" significa una estructura de
anillo en la cual un carbono del anillo forma también parte del
ligando macrocíclico de quince elementos. La estructura de anillo
puede contener de 3 a 20, preferiblemente entre 5 y 10, átomos de
carbono y puede también contener átomos de nitrógeno, oxígeno y/o
de azufre.
El término "heterociclo que contiene
nitrógeno" significa estructuras de anillo en las cuales 2
carbonos y un nitrógeno del anillo forman también parte del ligando
macrocíclico de 15 elementos. La estructura del anillo puede
contener entre 2 y 20, preferiblemente entre 4 y 10, átomos de
carbono, puede estar sustituida o no sustituida, parcial o
completamente insaturada o saturada y puede también contener
nitrógeno, oxígeno y/o átomos de azufre en las partes del anillo
que no forman parte del ligando macrocíclico de quince
elementos.
El término "estados de enfermedad y trastornos
en los cuales están involucrados los aniones superóxido"
significa cualquier estado de enfermedad o trastorno acerca de cual
se sabe o se sospecha que los aniones superóxido o los productos de
reacción que involucran aniones superóxido (tales como
peroxinitrato), son un factor en el avance del estado de la
enfermedad o trastorno. Entre los ejemplos de los citados estados de
enfermedad, se incluyen la inflamación y la lesión por reperfusión
isquémica.
El término "anión ácido orgánico" se
refiere a aniones ácido carboxílico que tienen aproximadamente entre
1 y aproximadamente 18 átomos de carbono.
El término "haluro" significa cloruro,
fluoruro, yoduro o bromuro.
Tal como se utiliza en el presente documento,
grupos "R" significan la totalidad de grupos R unidos a los
átomos de carbono del macrociclo, a saber, R, R', R_{1}, R'_{1},
R_{2}, R'_{2}, R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R'_{4}, R_{5},
R'_{5}, R_{6}, R'_{6}, R_{7}, R'_{7}, R_{8}, R'_{8},
R_{9}.
Todas las referencias citadas en el presente
documento se incorporan explícitamente por referencia.
Los caracteres de referencia correspondientes
indican las partes correspondientes a lo largo de los dibujos.
La presente invención va dirigida a ligandos
macrocíclicos de quince elementos que contienen nitrógeno, los
cuales se describen a través de la fórmula:
en la que un nitrógeno del
macrociclo y los dos átomos de carbono adyacentes a los que está
unido independientemente forman un heterociclo W insaturado
sustituido que contiene nitrógeno y que tiene de 2 a 20 átomos de
carbono, más preferiblemente de 4 a 10 átomos de carbono, que puede
ser un heterociclo aromático, en cuyo caso el hidrógeno unido al
nitrógeno que forma parte tanto del heterociclo como del macrociclo
y los grupos R unidos a los átomos de carbono que forman parte
tanto del heterociclo como del macrociclo, están
ausentes;
en la que R, R_{1}, R_{2}, R'_{2},
R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R'_{4}, R_{5}, R'_{5}, R_{6},
R'_{6}, R_{7}, R'_{7}, R_{8}, R'_{8}, R_{9} y R'_{9}
representan, independientemente, hidrógeno o radicales alquilo,
alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo,
cicloalquilalquilo, cicloalquilcicloalquilo, cicloalquenilalquilo,
alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo,
alquenilcicloalquenilo, heterocíclicos, arilo y aralquilo
sustituidos o no sustituidos;
y, opcionalmente, uno o más de R_{2} o
R'_{2} y R_{3} o R'_{3}, R_{4} o R'_{4} y R_{5} o
R'_{5}, R_{6} o R'_{6} y R_{7} o R'_{7}, o R_{8} o
R'_{8} y R_{9} o R'_{9}, conjuntamente con los átomos de
carbono a los cuales están independientemente unidos forman un
heterociclo, sustituido o no sustituido, que contiene nitrógeno y
que tiene entre 2 y 20 átomos de carbono, el cual puede ser un
heterociclo aromático, en cuyo caso el hidrógeno unido al nitrógeno
que forma parte tanto del heterociclo como del macrociclo y los
grupos R unidos a los átomos de carbono que forman parte tanto del
heterociclo como del macrociclo, están ausentes;
y, opcionalmente, uno o más de R_{2} y
R'_{2}, R_{3} y R'_{3}, R_{4} y R'_{4}, R_{5} y
R'_{5}, R_{6} y R'_{6}, R_{7} y R'_{7}, R_{8} y
R'_{8}, y R_{9} y R'_{9}, conjuntamente con el átomo de
carbono al que están unidos forman, independientemente, un anillo
cíclico o heterocíclico saturado, parcialmente saturado o
insaturado, que tiene entre 3 y 20 átomos de carbono;
y, opcionalmente, uno de R, R_{1}, R_{2},
R'_{2}, R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R'_{4}, R_{5}, R'_{5},
R_{6}, R'_{6}, R_{7}, R'_{7}, R_{8}, R'_{8}, R_{9} y
R'_{9}, conjuntamente con uno diferente de R, R_{1}, R_{2},
R'_{2}, R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R'_{4}, R_{5}, R'_{5},
R_{6}, R'_{6}, R_{7}, R'_{7}, R_{8}, R'_{8}, R_{9} y
R'_{9}, que está unido a un átomo de carbono diferente en el
ligando macrocíclico, puede estar unido para formar una banda
representada a través de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
-(CH_{2})_{x}-M-(CH_{2})_{w}-L-(CH_{2})_{z}-J-(CH_{2})_{y}-
\vskip1.000000\baselineskip
en la que w, x, y y z son,
independientemente, números enteros entre 0 y 10 y M, L y J se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo,
alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, alquilarilo,
alquilheteroarilo, aza, amida, amonio, oxa, tia, sulfonilo,
sulfinilo, sulfonamida, fosforilo, fosfinilo, fosfino, fosfonio,
ceto, éster, alcohol, carbamato, urea, tiocarbonilo, boratos,
boranos, boraza, sililo, siloxi, silaza y combinaciones de los
mismos; y combinaciones de cualquiera de los indicados
anteriormente.
Por consiguiente, los ligandos de la presente
invención pueden tener cualquier tipo de combinación de grupos R
sustituidos o no sustituidos, estructuras anulares cíclicas
insaturadas, parcialmente saturadas o saturadas, heterociclos que
contienen nitrógeno, o bandas tal como se ha definido
anteriormente.
Los grupos "R" unidos a los átomos de
carbono del macrociclo pueden estar en posición axial o ecuatorial
en relación con el macrociclo. Cuando el grupo "R" es
diferente a hidrógeno, o cuando dos grupos "R" adyacentes, a
saber, sobre átomos de carbono adyacentes, conjuntamente con los
átomos de carbono a los cuales se encuentran unidos forman un ciclo
saturado, parcialmente saturado o insaturado o un heterociclo que
contiene nitrógeno, o cuando dos grupos R sobre el mismo átomo de
carbono conjuntamente con el átomo de carbono al cual los mismos se
encuentran unidos forman una estructura de anillo saturado,
parcialmente saturado o insaturado, resulta preferible que al menos
uno de los grupos "R" esté en posición ecuatorial, por razones
de mejoría de la actividad y de estabilidad. Esto es
particularmente cierto cuando el complejo contiene más de un grupo
"R" que no es hidrógeno.
Los compuestos preferidos de la presente
invención son aquellos descritos por la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que los grupos R, W, M, X, Y
y Z son tal y como se han definido anteriormente, y en la que U y V
son estructuras cíclicas saturadas, que contienen entre 3 y 20,
preferiblemente entre 4 y 10 átomos de carbono y que forman un
anillo cicloalquilo con los átomos de carbono a los que están
unidos. En realizaciones más preferidas de la presente invención, U
y W son anillos fusionados trans-ciclohexano. En
realizaciones más preferidas de la presente invención, W es una
piridina sustituida, y R, R_{1} y el H en el nitrógeno del
macrociclo de W están ausentes. En realizaciones particularmente
preferidas de la presente invención, W es una piridina sustituida,
y U y W son anillos fusionados trans-ciclohexano.
Las sustituciones preferidas sobre W son aquellas que incrementan
la potencia del catalizador para aplicaciones farmacéuticas. Por
ejemplo, cuando el objetivo del catalizador es un tejido hidrófobo
del paciente, resultan preferidos los sustituyentes lipofílicos.
Además de alterar la actividad catalítica o log P y los efectos
concomitantes de dirección a objetivo/farmacocinética, los
solicitantes han descubierto que determinados sustituyentes
incrementan generalmente la potencia del catalizador que tiene que
ser utilizado en composiciones farmacéuticas. Entre estos
sustituyentes preferidos se encuentran ciclohexilo,
hidroxilalquiltio, ésteres de alquilo (ácido
2-tioacético), benciloxi, metoxiariltio,
alcoxicarbonilariltio y esteres de arilo (ácido
2-tioacético). Entre los ejemplos de complejos que
incluyen los ligandos se incluyen compuestos que tiene las
siguientes
fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de estos catalizadores para la
dismutación de superóxido puede ser demostrada utilizando la técnica
de análisis cinético a flujo parado descrita en el Ejemplo 3 y en
Riley, D.P., Rivers, W.J. and Weiss, R. H.
"Stopped-Flow Kinetic Análisis for Monitoring
Superoxide Deacay in Aqueous Systems", Anal. Biochem., 196,
344-349 (1991), que es incorporado en el presente
documento a título de referencia. El análisis cinético a flujo
parado constituye un procedimiento correcto y directo para
monitorizar las velocidades de desintegración de superóxido en
agua. Las constantes catalíticas proporcionadas para los compuestos
ejemplarizados en la tabla indicada anteriormente fueron
determinadas utilizando este procedimiento.
Tal como puede ser observado a partir de la
tabla, por medio de la actividad dismutante del superóxido, pueden
sintetizarse, de forma rápida, una amplia variedad de complejos
heterocíclicos sustituidos, no saturados. El mecanismo de acción
comúnmente aceptado para los enzimas SOD basados en manganeso
conlleva la ciclación del centro manganeso entre los dos estados de
oxidación (II, III). Ver J.V. Bannister, W.H. Bannister and G.
Rotilio, Crit. Rev. Bioche. 22, 111-180
(1987).
1)Mn(II)
+ HO_{2} \rightarrow Mn(III) +
HO_{2}^{-}
2)Mn(III) + O_{2}^{-}
\rightarrow Mn(II) +
O2
Los potenciales redox formales para los pares
O_{2}^{-}/O_{2} y HO_{2}/HO_{2}^{-} a pH 7 son
-0,33 v y 0,87 v, respectivamente. Ver A.E.G. Cass, in
Metalloproteins: Part 1, Metal Proteins with Redox Roles, ed. P.
Harrison, P. 121. Verlag Chemie (Weinheim, GDR) (1985). Para el
mecanismo descrito anteriormente, estos potenciales requieren que
un catalizador SOD putativo sea capaz de sufrir cambios en el estado
de oxidación en la banda de -0,33 v a 0,87 v. Por lo
tanto, en la medida en que el potencial redox del ión se encuentre
en la banda en la cual el anión superóxido pueda reducir el metal
oxidado y el superóxido protonado pueda oxidar al metal reducido y
el impedimento estérico del planteamiento de anión superóxido sea
mínimo, el catalizador funcionará con una K_{cat} de
aproximadamente 10^{-6} a 10^{-8}.
Los complejos derivados de Mn(II) y la
clase general de ligandos [15]anoN_{5} sustituidos en el
átomo de C descritos en el presente documento, han sido
caracterizados utilizando voltametría cíclica para medir sus
potenciales redox. Los complejos sustituidos en el C descritos en el
presente documento presentan oxidaciones reversibles de
aproximadamente +0,7v (SHE). La colorimetría indica que esta
oxidación es un proceso de un electrón, s a saber, es la oxidación
del complejo Mn(II) al complejo Mn(III). Por
consiguiente, para que estos complejos pueden funcionar como
catalizadores SOD, el estado de oxidación Mn(III) se ve
involucrado en el ciclo catalítico. Esto significa que los
complejos Mn(III) de todos estos ligandos son igualmente
competentes como catalizadores SOD, dado que no importa que forma
de Mn(II) o Mn(III) se encuentra presente cuando está
presente el superóxido, dado que el superóxido simplemente reducirá
el Mn (III) a Mn(II), liberando oxígeno.
Si pretender quedar limitados a ninguna teoría
en particular, los solicitante proponen que el mecanismo descrito
en Riley et al., 1999, constituye una aproximación razonable
a como estos catalizadores dismutan al superóxido. Con vistas a que
el complejo muestre actividad superóxido dismutasa, el ligando debe
ser capaz de doblarse en una configuración que permita la
estabilización del complejo octaédrico entre un ligando axial y los
cinco nitrógenos del anillo ligando. Si un compuesto contiene
diversos dobles enlaces conjugados dentro del anillo de 15
elementos principal, del ligando, el cual mantiene al anillo en una
conformación rígida, no se espera del compuesto que muestre
actividad catalítica. De los grupos R unidos al ligando macrocíclico
que lo cierran en una conformación plana, se espera que se
comporten como catalizadores pobres. Un experto ordinario en la
materia no se vería sorprendido por el hecho de que estos tipos de
derivados carecieran de actividad superóxido dismutasa.
Específicamente, un experto en la materia evitaría utilizar
materiales que modificasen la flexibilidad del macrocliclo mediante
la adición de muchos grupos grandes, lo cual provocaría impedimento
estérico o colocar demasiados dobles enlaces en el anillo
principal. Este efecto se encontraría también presente en
determinadas disposiciones geométricas de grupos R más pequeños,
los cuales restringen el complejo a una geometría plana, rígida.
Teniendo en cuenta estos ejemplos y orientaciones, un experto en la
materia sería capaz de reconocer cuales de los complejos
pentaazaciclopentadecano de la presente invención conservarían
actividad superóxido dismutante.
Los catalizadores pueden ser producidos a través
de los procedimientos descritos en la patente de EE.UU Nº.
5.610.293. No obstante, resulta preferido que los catalizadores sean
sintetizados a través del procedimiento plantilla, esquematizado
más adelante. Este procedimiento de síntesis presenta ventajas en
relación con los procedimientos descritos con anterioridad, en el
sentido de que los rendimientos de ciclación utilizando el
procedimiento de plantilla son habitualmente de aproximadamente el
90%, en comparación con el 20% proporcionado por los procedimientos
anteriores. Como productos de partida se dispone de diversas
diaminas comercialmente disponibles, o puede sintetizarse una
diamina. Las diaminas se hacen reaccionar con cloruro de titrilo en
cloruro de metileno anhidro, a 0ºC, y se dejan calentar a
temperatura ambiente durante el transcurso de una noche, con
agitación. El producto es combinado posteriormente con glioxal en
metanol y sometido a agitación durante un período de 16 horas. El
producto glioxal bisimina es entonces reducido con un borohidruro en
THF. Si se desea obtener un producto simétrico, pude utilizarse una
diamina como producto de partida. Además, si se desea disponer de
grupos que cuelguen del macrociclo, en posición opuesta a la
piridina (R_{5} y R_{6}), puede utilizarse glioxal sustituido.
En lugar de la glioxal bisimina reducida pueden utilizarse también
tetraaminas que sean comercialmente disponibles. Después de la
reducción de la glioxal bismimina, el producto se combina con
piridina sustituida por dicarbonilo en posiciones 2,6, tal como la
2,6-dicarboxaldehídopiridina o la
2,6-diacetilpiridina y una sal de manganeso o de
hierro en condiciones básicas. Il ión de metal de transición sirve
como plantilla para favorecer la ciclación de la piridina
sustituida y la tetraamina. En el comercio se encuentran disponibles
diversas piridinas sustituidas en las posiciones 2,6 por
dicarbonilo, circunstancia esta que permite la fácil producción de
una diversidad de ligandos con grupos que cuelgan del macrociclo,
próximos a la piridina (R_{2} y R_{9}). Cuando se sintetizan
los catalizadores con vistas a obtener el grupo heterocíclico
insaturado sustituido, se utilizan piridinas con uno o más
sustituyentes (R_{A}, R_{B} y R_{C}). Una vez concluida la
ciclación, el producto es reducido con formiato amónico y con un
catalizador de paladio, durante un período de entre 3 y 4 horas.
Alternativamente, la bisimina puede ser reducida con un reductor
hidruro, tal como NaBH_{4}, o con gas hidrógeno y un catalizador
metálico. Además de las sustituciones "R", los grupos "R"
pueden también estar también sustituidos en los mismos carbonos.
Los grupos "R" y "R'" pueden ser cualquiera de los que se
han indicado anteriormente. El procedimiento puede ser modificado
según principios bien conocidos por un experto en la materia, con
vistas a alojar diversos materiales de partida.
Si bien la bisimina producida en el paso de
reacción de ciclación con plantilla indicado anteriormente puede
ser reducida a través de medios más convencionales utilizando gas
hidrógeno, resulta preferido que la bismina sea reducida con
formiato amónico en presencia de un catalizador, tal como se ilustra
en el Ejemplo 2. El catalizador preferido para ser utilizado en
este procedimiento comprende paladio, si bien podrían ser también
potencialmente utilizable un catalizador que comprendiera otros
metales catalíticos, tales como níkel rodio, óxido de platino, y
rutenio. Este procedimiento ofrece las ventajas de una seguridad
incrementada y una elevada eficacia de reducción de los enlaces
imina, al tiempo que conserva los dobles enlaces de los grupos
piridina en el resto heterocíclico de los compuestos preferidos.
Además, este procedimiento puede ser llevado a la practica en un
medio más concentrado en comparación con la reducción con hidrógeno
o con borohidruro, permitiendo como consecuencia la obtención de
tiempos de reacción más rápidos.
Otro procedimiento de análisis que resulta de
utilidad a la hora se preparar diversos catalizadores es el esquema
de sustitución nucleófila posterior a la quelación mostrado en el
Ejemplo 7. Al utilizar este procedimiento se adquieren diversas
ventajas. En primer lugar, se adquiere la capacidad de usar
reactivos disponibles comercialmente, o sintetizados de una forma
relativamente fácil, los reactivos sintetizados en la síntesis de
ciclación con plantilla indicado anteriormente, tales como la
4-cloro-2,6-dicarboxilaldehidopiridina
y de modificar después el ligando macrocíclico quelado resultante,
sin reacciones laterales con el grupo sustituido. En segundo lugar,
dado que este procedimiento permite la modificación del ligando
quelado, no resulta necesaria ninguna reacción de modificación
posterior con cloruro de manganeso, simplificándose de este modo el
procedimiento de síntesis. Como material de partida en la reacción
de modificación se utiliza un ligando pentaazaciclopentadecano
piridina quelado sustituido por un grupo saliente. Los
sustituyentes nucleofílicos 4-piridino preferidos,
que son buenos grupos salientes, son los haluros. Cl, Br y I son
los sustituyentes más preferidos. Al catalizador imitador SOD en
DMF (o en otro disolvente adecuado), a temperatura reducida, se le
añade un nucleófilo (1 eq.), gota a gota, y la mezcla de reacción
es sometida a agitación durante el transcurso de una noche. El
disolvente es extraído después al vacío. El catalizador imitador
SOD puede ser después purificado por medio de cromatografía en
columna flash. Los nucleófilos que tienen que ser utilizados en esta
reacción de modificación pueden ser cualquiera de los nucleófilos
fuerte. Los solicitantes han averiguado que los tiolatos han
proporcionado una amplia variedad de reactivos de modificación
posterior a la quelación, los cuales resultan útiles para obtener
los compuestos. Si bien este procedimiento ha sido utilizado
principalmente con los compuestos piridino preferidos, el mismo
procedimiento de síntesis podría ser utilizado con otros imitadores
SOD, los cuales tienen restos arilo que contienen nitrógenos
sustituidos por nucleófilo, tales como un complejo
4-cloropirimidino.
Si bien el manganeso es habitualmente utilizado
como ión metal de transición quelado en los ejemplos de esta
descripción, debe darse por entendido que los ligandos descritos
pueden ser fácilmente complejados con cationes hierro (II) o hierro
(III), obtenidos a partir de sales tales como FeCl_{3}. En
general, se ha observado una actividad catalítica mejorada con la
utilización de manganeso como ión metálico de transición quelado,
si bien K_{cat}'s que son tan elevadas como 10^{-7} son todavía
observados con la utilización de hierro. Por lo tanto, el manganeso
resulta preferido como ión metálico de transición quelado en los
complejos.
Los pentaazamacrociclos de la presente invención
pueden poseer uno o más átomos de carbono asimétricos y resultan
por tanto capaces de existir en forma de isómeros ópticos, al igual
que en forma de mezclas racémicas o no racémicas de los mimos. Los
isómeros ópticos pueden ser obtenidos por medio de resolución de
mezclas racémicas, según procedimientos convencionales, por
ejemplo, mediante la formación de sales de diasteroisómeros por
medio de tratamiento con un ácido ópticamente activo. Constituyen
ejemplos de ácidos apropiados, los ácidos tartárico,
diacetiltartárico, dibenzoiltartárico, ditoluoiltartárico y
canforsulfónico y la posterior separación de la mezcla de
diasteroisómeros por recristalización, seguido de liberación de las
bases ópticamente activas a partir de estas sales. Un procedimiento
diferente para la separación de isómeros ópticos conlleva la
utilización de una columna de cromatografía quiral, óptimamente
elegida para maximizar la separación de los enantiómeros. Todavía
otro procedimiento disponible conlleva la síntesis de moléculas de
diasteroisómeros covalentes, haciendo reaccionar uno o más grupos
amino secundarios de los compuestos de la invención con un ácido
ópticamente activo en una forma activada o con un isocianato
ópticamente puro. Los diasteroisómeros sintetizados pueden ser
separados a través de medios convencionales, tales como
cromatografía, destilación, cristalización o sublimación y después
hidrolizados para proporcionar el ligando enantioméricamente puro.
Los compuestos ópticamente activos pueden, de forma similar, ser
obtenidos mediante la utilización de materiales de partida
ópticamente activos, tales como aminoácidos de origen natural.
Se ha demostrado que los compuestos presentan
una potencia y utilidad remarcables en diversos modelos de
enfermedad. En el Ejemplo 14, se demuestra la utilidad de los
compuestos para el tratamiento del dolor y de la inflamación en el
modelo de carragenina en pata de rata. Los compuestos heterocíclicos
insaturados sustituidos que contienen nitrógeno difieren a veces de
forma remarcable del compuesto base (Compuesto A), en términos de su
potencia, inicio de analgesia y duración del efecto. Tal como puede
ser observado, la sustitución de diversos grupos éster pequeños
sobre el grupo heterociclo que contiene nitrógeno genera un inicio
muy rápido de la acción analgésica. Además, el complejo sustituido
por éter bencílico resulta particularmente potente en este modelo,
si lo comparamos con el Compuesto A o con el Compuesto B, los cuales
presentan velocidades de dismutación de superóxido más elevadas.
Debido a los diferentes perfiles de duración de analgesia de estos
compuestos, los mismos pueden ser utilizados para aplicaciones
especiales en diferentes áreas de tratamiento de dolor. O diversos
de los mismos pueden ser combinados, con vistas a proporcionar un
nivel estable de alivio del dolor. En términos globales, los
compuestos muestran una remarcable variedad de efectos, en
comparación con el Compuesto A de origen.
En el Ejemplo 15, se muestra la eficacia de los
compuestos en un modelo murino de inversión de tolerancia a
opioides, tanto a través de la vía de administración iv como a
través de la administración subcutánea. En comparación con los
Compuestos A y B descritos anteriormente, varios de los compuestos
muestran una eficacia sorprendente en la prevención de la
tolerancia a la morfina en este modelo. Por ejemplo, en la
administración por vía iv., los compuestos 13 y 14 muestran una
inversión muy significativa de la tolerancia a la morfina a una
concentración 1/30 de la concentración necesaria para alcanzar
alrededor de 1/30 de la concentración necesaria para obtener
aproximadamente 1/2 del efecto con el Compuesto A. Se muestra que el
compuesto 28 presenta una inversión del 100% en la tolerancia a la
morfina, a una concentración 1/100 de la necesaria para lograr el
mismo efecto con el Compuesto A, por vía de administración iv.
Similares resultados se obtuvieron mediante la administración
subcutánea, en la cual el Compuesto 3 mostraba el 100% de inversión
de la tolerancia a la morfina a 1/100 de la dosis necesaria para
alcanzar el mismo efecto con el Compuesto A. Por consiguiente, los
compuestos muestran una actividad remarcable para prevenir o
invertir la tolerancia a los opioides.
Además, los Compuestos 25 y 31 fueron también
objeto de comprobación para determinar su capacidad de prevenir la
hipotensión rebelde en un modelo de rata endotoxémico, Ejemplo 16.
Ambos compuestos resultaron eficaces a la hora de prevenir la
hipotensión en animales endotoxémicos a un 1/3 de la dosis utilizada
para alcanzar un efecto similar con el Compuesto A.
Tal como se demuestra en los Ejemplos 14, 15 y
16, los complejos o compuestos pueden ser utilizados para tratar
numerosos estados y trastornos de enfermedad en un paciente que
precise de los mismos. Los términos "paciente" y "sujeto"
incluyen animales humanos y no humanos que precisen tratamiento.
Entre los citados estados de enfermedad o trastornos se incluyen,
sin que ello suponga ninguna limitación: la lesión por reperfusión a
un órgano isquémico, tal como la lesión por reperfusión al
miocardio isquémico, la inflamación general, la inflamación del
intestino, la artritis reumatoide, la osteoartritis, la
hipertensión, la psoriasis, los rechazos por trasplante de órganos,
la hipotensión rebelde, la conservación de órganos, las lesiones
provocadas por radiación, la agregación plaquetaria, los trastornos
autoinmunes, la dificultad respiratoria en adultos, la
carcinogénesis, el dolor crónico agudo, la hiperalgesia y la
septicemia. Los complejos son excelentes analgésicos y pueden ser
utilizados para tratar o prevenir el dolor en un sujeto, que se
origina como consecuencia de cualquier estado hiperalgésico. Los
complejos presentan adicionalmente actividad para prevenir o reducir
la tolerancia a los opiaceos y para potenciar la actividad
analgésica de los opiaceos sin favorecer la depresión respiratoria
asociada con estos compuestos. Además, los complejos resultan
útiles para el tratamiento de los síntomas de retirada asociados
con la adicción a opiáceos, a la nicotina, o a otros fármacos. Los
complejos pueden ser también utilizados de forma generalizada o
tópica para prevenir o invertir los síntomas de envejecimiento
mediados por radical oxigeno libre, tales como el arrugamiento de
la piel, y para prevenir o invertir el daño medioambiental provocado
por la exposición a luz ultravioleta o a los agentes químicos.
La dosis total diaria administrada a un sujeto,
a dosis única o dividida, puede expresarse en cantidades, por
ejemplo entre aproximadamente 0,00025 y aproximadamente 20 mg/kg de
peso corporal por día, más preferiblemente entre aproximadamente
0,001 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día y, más
habitualmente, aproximadamente entre aproximadamente 0,01 y
aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, por día, cuando se aplican
por medio de inyección parenteral o infusión continua. Las
composicions unitarias de dosificación pueden contener las
cantidades submúltiples de las mismas que resulten necesarias para
componer las dosis diarias. La cantidad de ingrediente activo que
puede ser combinada con los materiales soporte para producir una
forma de dosificación única variará en función del sujeto tratado y
del particular modo de administración. Por ejemplo, sistemas tales
como la administración transdérmica o administración oral, los
cuales resultan sistemas de suministro sustancialmente menos
eficaces, pueden requerir dosis de al menos un orden de magnitud por
encima de las requeridas para la administración parenteral. El
régimen de dosificación para el tratamiento de una enfermedad con
los compuestos y/o las composiciones es seleccionado según una
diversidad de factores, incluyendo el tipo, la edad, el peso, el
sexo, la alimentación y la condición médica del paciente, la
gravedad de la enfermedad, la vía de administración, las
consideraciones farmacológicas tales como la actividad, la eficacia,
la farmocinética y los perfiles toxicológicos del compuesto
particular utilizado, de si se utiliza un sistema de suministro de
fármaco o de si el compuesto se administra como formando parte de
una combinación de fármacos. Por lo tanto, el régimen de
dosificación realmente utilizado puede variar ampliamente y, por
consiguiente, desviarse del régimen de dosificación preferido
expuesto anteriormente.
Los compuestos pueden ser administrados a través
de cualquier técnica que resulte conocida por los expertos en la
materia, incluyendo, sin que ellos suponga ninguna limitación, la
administración oral, parenteral, mediante inhalación por rociado,
rectal, tópica, nasal, vaginal u ocular, en formulaciones unitarias
de dosificación que contienen soportes farmacéuticamente aceptables
no tóxicos, adyuvantes, y vehículos, si así se desea. La
administración tópica puede también conllevar la utilización de
administración transdérmica, tal como los parches transdérmicos o
los dispositivos de iontoporesis. El término parenteral, tal como se
utiliza en el presente documento, incluye las inyecciones
subcutáneas, las intravenosas, las intramusculares, las inyecciones
intrasternales, técnicas de infusión o intratecales. Las
preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones
oleaginosas o acuosas inyectables estériles pueden ser formuladas
según la técnica conocida, utilizando agentes dispersantes o
humectantes y agentes para suspensión. La preparación inyectable
estéril puede ser también una solución estéril inyectable o una
suspensión en un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente
aceptable, por ejemplo, como una solución en
1,3-butanodiol. Entre los vehículos aceptables y
disolventes que pueden ser utilizados se encuentra el agua, la
solución e Ringer y la solución de cloruro sódico isotónica. Además,
como medios de suspensión o disolventes se utilizan
convencionalmente aceites fijos, estériles. A este propósito, puede
utilizarse cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono o
diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables
pueden utilizarse ácidos grasos, tales como el ácido oleico.
Para la administración del fármaco por vía
rectal pueden prepararse supositorios, mezclando el fármaco con un
excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao y
polietilenglicoles, los cuales son sólidos a temperatura ambiente
pero líquidos a la temperatura rectal y se funden por tanto en el
recto, liberando el fármaco. Entre las formas de dosificación
sólida para administración oral se pueden incluir cápsulas,
comprimidos, píldoras, polvos, gránulos y geles. En las citadas
formas de dosificación sólida, el compuesto activo puede encontrase
mezclado con al menos un diluyente inerte, tal como sucrosa, lactosa
o almidón. Las citadas formas de dosificación pueden también
comprender, tal como ocurre en la práctica normal, sustancias
adicionales diferentes a diluyentes inertes, por ejemplo, agentes
lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de
cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación pueden
también comprender agentes tamponantes. Los comprimidos y las
píldoras pueden ser preparadas adicionalmente con revestimentos
entéricos. Entre las formas de dosificación líquidas para
administración oral se pueden incluir emulsiones, soluciones,
suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que
contienen diluyentes inertes habitualmente utilizados en la técnica,
tales como agua. Las citadas composiciones pueden también
comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes
emulsionantes y para suspensión y edulcorantes, aromatizantes y
perfumantes.
Si bien los compuestos pueden ser administrados
en forma de agentes farmacéuticos únicos, los mismos pueden ser
también utilizados en combinación con uno o más compuestos que
resultan conocidos por ser eficaces frente al estado específico de
enfermedad que constituye el objetivo del tratamiento.
Tal como se muestra en la Tabla 1, los
compuestos constituyen catalizadores excepcionales para la
dismutación de superóxido. Por lo tanto, los mismos pueden ser
utilizados en esta capacidad catalítica en una variedad de
aplicaciones in vivo o in vitro, cuando se desee una
reducción en la concentración de superóxido.
Los compuestos imitadores SOD pueden ser también
añadidos para enjuagar o almacenar soluciones para órganos y
tejidos, tales como para trasplante de órganos o para enjuagues
quirúrgicos. Por ejemplo, los órganos extirpados son habitualmente
colocados en una solución de conservación con anterioridad a que se
produzca su trasplante al receptor. La inclusión de al menos una
especie de imitador de SOD en la solución de conservación,
habitualmente a una concentración de aproximadamente 0,01 mM a 10
mM, resulta deseable para reducir el daño debido a isquemia durante
el almacenamiento y lesión por reperfusión subsiguiente a la
reimplantación en el receptor. Para la inclusión de estos
compuestos, resultan adecuadas diversas soluciones descritas en el
estado de la técnica, incluyendo, sin que ello signifique ninguna
imitación, las descritas en las patentes de EE.UU, Nº 5.145.771;
Bayersdorf (1990) Chem. Abst. 113: 84849w; patente de EE.UU Nº.
4.879.283; patente de EE.UU Nº. 4.873.230; y patente de EE.UU Nº.
4.798.824, incorporadas aquí a título de referencia. Los compuestos
pueden ser también añadidos a sangre extravasada para transfusión,
con vistas a inhibir el daño causado por oxiradical a las células
sanguíneas y a los componentes durante el almacenaje; de forma
similar, estos compuestos pueden también reducir el daño por
oxiradical a las células sanguíneas in vivo.
Habitualmente, el imitador SOD se encuentra
presente en la solución de enjuague o almacenamiento a una
concentración de entre aproximadamente 0,001 mM hasta
aproximadamente 10 mM y, muy habitualmente se encuentra presente a
1 mM. Por ejemplo, una solución para enjuague adecuada comprende
solución de Ringer (NaCl 102 mM, KCl 4 mM, CaCl_{2} 3 mM, lactato
sódico 28 mM, pH 7,0) o solución de Ringer con adenosina 0,1 m y
Compuesto 1 a una concentración final de 1 mM. La solución de
enjuague puede comprender adicionalmente antioxidantes (por ejemplo,
glutationa, alopurinol). Las soluciones para conservación o las
soluciones para enjuague que contiene un imitador SOD pueden ser
utilizadas para proporcionar un almacenaje reforzado o irrigación de
órganos (por ejemplo, riñón, hígado, páncreas, pulmón, tejido
neural fetal, corazón, injertos vasculares, hueso, ligamento,
tendón, piel), lo cual se considera que refuerza la viabilidad del
tejido e incrementa la resistencia al daño oxidativo (por ejemplo,
al que se origina como consecuencia de isquemia/reperfusión).
Alternativamente, la capacidad de los compuestos
para catalizar la descomposición de especies de oxígeno reactivas
puede ser utilizada con ventaja para inhibir o reducir el daño a los
tejidos biológicos y a las células. Por ejemplo, el daño a los
tejidos conjuntivos inducido por oxiradical (por ejemplo, colágeno)
relacionado con la exposición a luz UV, el fumar cigarrillos, y el
envejecimiento puede ser reducido mediante la administración de un
compuesto imitador SOD coincidiendo aproximadamente con la
exposición a luz UV, el fumar cigarrillos u otros procedimientos
generadores de oxiradical (por ejemplo, envejecimiento celular).
Los imitadores SOD pueden ser también formulados
en una base lipófila (o, si se desea, un soporte acuoso) para
aplicación tópica en cosméticos o cremas y lociones para prevención
de las quemadas solares. Una crema o loción típica para cosmética o
prevención de quemaduras solares comprenderá aproximadamente entre 1
MG y 50 MG de compuesto imitador SOD, por gramo de crema o de
loción cosmética o para la prevención de quemaduras solares. Los
compuestos pueden ser formulados en una base cosmética a través de
oxígeno molecular y hoz radicales. Las composiciones farmacéuticas
/ cosméticas formuladas como soluciones incluyen, habitualmente, un
disolvente orgánico farmacéutica o cosméticamente aceptable. Los
términos "disolvente orgánico farmacéuticamente aceptable" y
"disolvente orgánico cosméticamente aceptable" se refieren a un
disolvente orgánico el cual, además de ser capaz de tener
dispersado o disuelto en el mismo al compuesto
salen-metal y opcionalmente también un agente
antiinflamatorio, posee también una seguridad aceptable (por
ejemplo, características de irritación y de sensibilización), al
igual que buenas propiedades estéticas (por ejemplo, no tiene
apariencia grasienta o pegajosa). El ejemplo más típico del citado
disolvente es isopropanol. Entre los ejemplos de otros disolventes
orgánicos adecuados se incluyen: propilenglicol, polietilenglicol
(200-600), polipropilenglicol
(425-2025), glicerol,
1,2,4-butanotriol, ésters de sorbitol,
1,2,6-hexanotriol, etanol, butanodiol, agua y
mezclas de los mismos. Estas soluciones contienen entre
aproximadamente el 0,001 y aproximadamente el 20%, preferiblemente
entre aproximadamente el 0,1 y aproximadamente el 10%, de complejo
antioxidante salen-metal, entre aproximadamente el
0,01 y aproximadamente el 5%, preferiblemente entre aproximadamente
el 0,5 y aproximadamente el 2% de un agente antiinflamatorio y
entre aproximadamente el 80 y aproximadamente el 99%,
preferiblemente entre aproximadamente el 90 y aproximadamente el
98% de un disolvente orgánico aceptable.
Tal como se usa en el presente documento,
"emolientes" hace referencia a materiales utilizados para la
prevención o el alivio de la sequedad, al igual que para la
protección de la piel. Se conocen una amplia variedad de emolientes
adecuados, los cuales pueden ser utilizados aquí. Sagarin,
Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp
32-43 (1972), incorporado aquí a título de
referencia, contiene numerosos ejemplos de materiales adecuados.
Entre los emolientes particularmente útiles que proporcionan
suavizantes de la piel se incluyen glicerol, hexanotriol,
butanotriol, ácido láctico y sus sales, urea, ácido pirrolidona
carboxílico y sus sales, aminoácidos, guanidina, diglicerol y
triglicerol. Los derivados propoxilados de glicerol son los agentes
suavizantes de la piel preferidos.
Los compuestos imitadores SOD pueden ser
aplicados a una diversidad de hidrocarburos para reducir la
oxidación y/o la polimerización no deseadas, o para apagar una
reacción de polimerización en un momento determinado de formación
de polímero (por ejemplo, a una determinada longitud de cadena
promedio). Entre los ejemplos de los citados hidrocarburos
saturados y no saturados se incluyen: destilados de petróleo y
productos petroquímicos, aguarrás, pintura, caucho de origen
natural y sintético, aceites vegetales y ceras, grasas animales,
resinas polimerizables, poliolefinas y similares.
Los compuestos pueden también ser utilizados
para proteger células y tejidos de agentes productores de radicales
libres, tales como radiación ionizante y agentes de quimioterapia
(por ejemplo, la bleomicina). Preferiblemente, una dosis protectora
que comprende al menos 0,001 mg de imitador SOD/kg de peso corporal
es administrada a través de una o diversas rutas (por ejemplo,
oral, intravenosa, intraperitoneal, lavado intragástrico, enema,
infusión en vena portal, tópica, o inhalación de pulverizado) para
proteger células normales, por ejemplo, frente a toxicidad generada
por radicales libres asociada con quimioterapia o radioterapia de un
neoplasma. Los compuestos son preferiblemente
pre-administrados a un paciente con anterioridad al
inicio de la quimioterapia y/o de la radioterapia, habitualmente
dentro de aproximadamente 24 horas del inicio y preferiblemente
dentro de aproximadamente 3-6 horas del inicio de
la quimioterapia y/o radioterapia. Los compuestos pueden ser
administrados de manera continua al paciente durante el transcurso
de la terapia.
Los imitadores SOD pueden ser también
administrados a individuos para prevenir lesión por radiación o
lesión química imputable a agentes generadores de radicales libres.
Los compuestos pueden ser administrados profilácticamente a
personal militar y a personal que trabaje en las industrias
nucleares, de medicina nuclear y/o químicas. Los mismos pueden ser
también utilizados como agentes quimioprotectores para prevenir la
carcinogénesis química; particularmente por medio de carcinógenos
que forman intermedios epoxi reactivos (por ejemplo, benzopireno,
benzoantraceno) y por agentes carcinógenos o favorecedores que
forman, directa o indirectamente, radicales libres (por ejemplo,
fenobarbital, TPA, proliferadores de benzoilperoxiprolieroxisoma:
ciprofibrato, clofibrato). Las personas expuestas a los citados
carcinógenos químicos son tratadas previamente con los compuestos
para reducir la incidencia de riesgo de desarrollar neoplasia.
Las reacciones químicas descritas anteriormente
están generalmente descritas en términos de su aplicación más
amplia para la preparación de los compuestos. Ocasionalmente, las
reacciones pueden no resultar aplicables, tal como se describe para
cada uno de los compuestos incluidos dentro del campo descrito. Los
compuestos para los cuales ocurre esto serán rápidamente
reconocidos por los expertos en la materia. En todos estos casos, o
bien la reacción puede ser llevada acabo por medio de modificaciones
convencionales, conocidas por los expertos en la materia, por
ejemplo, mediante la protección adecuada de los grupos que
interfieren, cambiando a reactivos convencionales alternativos,
mediante modificación rutinaria de las condiciones de reacción y
similares, o resultarán aplicables otras reacciones descritas en el
presente documento o de alguna forma convencionales, para la
preparación de los compuestos correspondientes. En todos los
procedimientos preparativos, la totalidad de materiales de partida
resulta conocida o puede ser preparada rápidamente a partir de
materiales de partida conocidos.
Se efectuó cromatografía de capa fina (TLC)
sobre placas Analtech de 0,15 mm de gel de sílice
60-GF. Se consiguió la visualización con luz UV,
exposición a yoduro o por medio de oxidación con ácido
fosfomolíbdico. Los disolventes para extracciones eran de grado
HPLC o ACS. La cromatografía se llevó a cabo a través del
procedimiento de Still con gel de sílice 60 de Merck (tamiz
230-400), con el sistema de disolventes indicado. La
totalidad de reacciones se llevaron a cabo bajo una presión
positiva de argón. Los espectros de NMR se recogieron sobre
espectrómetros Varian Unity 400, VXR-400 y
VXR-300. Los espectros de ^{1}H NMR fueron
reportados en ppm a partir de escala \delta de tetrametilsilano.
Los datos fueron reportados del siguiente modo: desplazamiento
químico, multiplicidad (s= singulete, d= doblete; t= triplete; q =
cuartete; m= multiplete; br= ampliado; obs= obscurecido);
constantes de acoplamiento (Hz) de integración relativa. Los
espectros ^{13}C NMR son reportados en ppm desde el pico de
disolvente deuterado central (por
ejemplo, 39,0 ppm para DMSO-d_{6}). Los datos se facilitan del siguiente modo: desplazamiento químico, multiplicidad.
ejemplo, 39,0 ppm para DMSO-d_{6}). Los datos se facilitan del siguiente modo: desplazamiento químico, multiplicidad.
A una solución de
(1R,2R)-diaminociclohexano (250 g, 2,19 mol) en
CH_{2}Cl_{2} anhidro (3,5 L) a 0ºC se le añadió una solución de
cloruro de tritilo (254 g, 912 mol) en CH_{2}Cl_{2} (2L), gota a
gota, durante un período de 4 horas. La mezcla resultante se dejó
calentar hasta temperatura ambiente y se mantuvo en agitación
durante el transcurso de una noche. La mezcla de reacción fue lavada
con agua hasta que el pH de los lavados acuosos estuvo por debajo
de 8,0 (4 x 2000 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La filtración
y la concentración del disolvente proporcionó 322,5 g (rendimiento
99%) de
N-(trifenilmetil)(1R,2R)-dia-minociclohexano,
en forma de cristal: 1_{H} NMR (300 MH_{z},
DMSO-d^{6}) d 7,50 (d,J=7,45 Hz, 6H); 7,26 (app t,
J = 7,45 Hz, 6H); 7,16 (app t, J= 7,25 Hz, 3H); 2,41 (dt, J= 10,3;
2,62 Hz; 1H); 1,70 (m, 1H); 1,54-0,60 (complejo m,
8H). ^{13}C NMR (75 MHz, DMSO-d^{6}) dc 147,2
(s); 128,4 (d); 127,3(d); 69,9 (s)(; 59,0 (d);
54,4(d); 36,6(t); 32,5(t); 24,6(t);
24,3(t); MS (LR-FAB)m/z= 363 [M +
Li]+.
A una solución de
N-(trifenilmetil)-(1R,2R)-diaminociclohexano (322,5
g; 905 mmol) en metanol (4L) se le añadió glioxal (51,9 ml de una
solución al 40% en agua, 452,3 mmol), gota a gota, durante un
período de 30 minutos. Seguidamente, la mezcla resultante fue
sometida a agitación durante un período de 16 horas. El producto
precipitado fue aislado por medio de filtración y secado al vacío
para proporcionar 322,1 g (rendimiento 97%) de bisimina, en forma
de sólido de color blanco: 1_{H} NMR (300 MHz, CDCL_{3}) d 7,87
(s, 2H); 7,51 (d, J=8,1 Hz), 12H); 7,16-7,05 (m,
18H); 2,95 (bm, 2H); 2,42 (bm, 2H); 1,98-0,81
(complejo m, 18H); ^{13}C NMR (100 MHz, CDCl_{3}) dc 161,67
(d), 147,24 (s); 147,22 (s); 128,90 (d); 128,81 (d); 127,73 (d);
127,61 (d); 126,14 (d); 73,66 (s); 70,86 (d); 70,84 (d); 56,74 (d);
32,45 (t); 31,77 (t); 24,02 (t); 23,62 (t). MS
(LR-ESI) m/z 757 [M + Na]+.
La glioxalbisimina de
N-(trifenilmetil)-(1R,2R)-diaminociclohexano (586
g, 798 mmol) fue disuelta en THF (6L) y tratada con LiBH_{4} (86,9
g, 4,00 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla fue sometida a
agitación durante un período de 12 horas a temperatura ambiente y
calentada seguidamente hasta 40ºC durante un período de 4 horas. La
reacción fue apagada cuidadosamente con agua (1 L) y se extrajo el
THF a presión reducida. La suspensión residual fue dividida entre
CH_{2}Cl_{2} (3 L) y agua (1 L adicional). Las capas fueron
separadas y la capa acuosa fue extraída de nuevo con
CH_{2}Cl_{2} (1L). Las capas de CH_{2}Cl_{2} combinadas
fueron secadas (MgSO_{4}), filtradas y concentradas para
proporcionar 590 g (rendimiento 100%) de
N,N'-bis{(1R,2R)[2-trifenilmetilamino)]-ciclohexil}-1,2-diaminoetano,
en forma de espuma de color blanco: MS (LR-ESI) m/z
739[M+H]+.
A una solución de
N,N'-bis{(1R,2R)-[2-(trifenilmetilamino)]ciclohexil}-1,2-diaminoetano
(590 g; 798 mmol) en acetona (3L) se le añadió HCl concentrado (1,5
L). La reacción fue agitada durante un período de 2 horas y se
concentró. El resto fue dividido entre agua (2L) y CH_{2}Cl_{2}
(1L). Las capas fueron separadas y se concentró la capa acuosa,
secándose al vacío para producir 257 g (rendimiento 80%) del
tetrahidrocloruro, en forma de sólido granular de color blanco
apagado: 1_{H} NMR (300 MHz, CDCl_{3}) d
3,82-3,57 (complejo m, 8H); 2,42 (d, J=9,9 Hz, 2H);
2,29 (d, J=9,3 Hz, 2H); 2,02-1,86 (complejo m, 4H);
1,79-1,60 (complejo m, 4H);
1,58-1,42 (complejo m, 4H). ^{13}C NMR (75 MHz,
CDCl_{3}) dc 59,1 (d); 51,3 (d); 40,8(t); 29,2 (t); 26,0
(t); 22,3 (t); 22,2 (t). MS (LR-FAB) m/z 255
[M+H]+.
El precursor de bisimina purificado para el
compuesto B (15,0 g; 29,6 mmol) fue disuelto en 1,5 L de MeOH
anhidro y el matraz tratado con nitrógeno durante unos pocos
minutos, añadiéndose después 3% de Pd/C (7,5 g; 50% en peso). A
medida que se calentaba la suspensión se le añadía con cuidado
formiato amónico sódico (7,5 g; 118,9 mmol, 4 equiv.). Transcurrida
una hora desde que se alcanzó el reflujo, se añadió una segunda
parte de formiato (3,75 g; 59,5 mmol, 2 equiv.). La suspensión de
color negro fue dejada enfriar hasta temperatura ambiente después
de 2,5 horas de reflujo (en este punto, el sobrenadante era
virtualmente incoloro) y se filtró a través de un lecho de ½
pulgada de alúmina Al_{2}O_{3}, grado Brockmann, neutra,
lavándose previamente con MeOH). El lecho de catalizador y de
alúmina se lavó con MeOH (2x100 mL) y se eliminó el disolvente
combinado a presión reducida. Tras secado al vacío a temperatura
ambiente durante el transcurso de una noche, la espuma de color
amarillo claro residual fue sometida a agitación con
CH_{2}Cl_{2} (500 mL) durante un período de
15-20 minutos, después se filtró a través de un
filtro de 10\mu. Tras la extracción del disolvente, se aislaron
14,7g de una espuma de color amarillo claro. La espuma fue disuelta
en 600 mL de agua desionizada y el pH de la solución de color verde
fue elevado desde el valor inicial 4,9 hasta 7,5 ca. Con NaOH acuoso
0,5N. Posteriormente, se añadieron 90 g de NaCl para elevar el
contenido en NaCl hasta el 15%. Una vez constituida la solución, se
procedió a la extracción con CH_{2}Cl_{2} (4 x 250 mL), las
capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre Na_{2}SO_{4}
por espacio de 15 minutos, posteriormente filtradas y se eliminó el
disolvente a presión reducida para proporcionar una espuma de color
amarillo claro-verde (14,5 g; rendimiento 96%). La
HPLC efectuada sobre este material indicaba una relación de isómeros
S,S a S,R de 3,8:1 y una pureza combinada \geq 98%.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados de transferencia de
hidrógeno
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si un compuesto puede catalizar
la dismutación de superóxido se ha utilizado el análisis cinético a
flujo parado (Riley, D.P., Rivers, W.J. and Weiss, R.H.,
"Stopped-Flow Kinetic Análisis for Monitoring
Superoxide Decay in Aqueous Systems", Anal. Biochem, 196:
344-349, 1991). Para la obtención de mediciones
consistentes y ajustadas, la totalidad de los reactivos eran
biológicamente limpios y estaban exentos de metal. Para conseguir
esto, todos los tampones (Calbiochem) eran de grado biológico,
estaban exentos de metal y se manipulaban con utensilios que habían
sido lavados primeramente con HCl 0,1N, y después con agua
purificada, seguido de un enjuague en un baño de EDTA 10^{-4} M,
a pH 8, seguido de un enjuague con agua purificada a 65ºC, por
espacio de varias hora. Se prepararon soluciones de DMSO anhidro de
superóxido potásico (Aldrich) en atmósfera seca, inerte de argón,
en una guantera Vacuum Atmospheres, utilizando objetos de cristal
secados. Las soluciones de DMSO fueron preparadas inmediatamente
antes de cada experimento de parada de flujo. Para triturar el
superóxido potásico de color amarillo (aproximadamente 100 mg) se
utilizó un mortero y una mano. El polvo fue después molido con unas
pocas gotas de DMSO y la suspensión transferida a un matraz que
contenía 25 mL adicionales de DMSO. La suspensión resultante fue
sometida a agitación por espacio de ½ hora y después fue filtrada.
Este procedimiento proporcionó reproduciblemente concentraciones 2
mM de superóxido en DMSO. Estas soluciones fueron transferidas a
una bolsa para guantes en atmósfera de nitrógeno en viales sellados,
con anterioridad al cargado de la jeringa con nitrógeno. Debe
destacarse que las soluciones DMSO/supróxido son extremadamente
sensibles al agua, al calor, al aire y a los metales extraños. Una
solución pura, fresca, tiene una tonalidad muy ligeramente
amarillenta.
Se suministro agua para soluciones tampón desde
un sistema de agua desionizada propia hacia un sistema de agua
Barnstead Nanopure Ultrapure Series 550 y, seguidamente, se procedió
a destilar por partida doble, primeramente a partir de permanganato
potásico alcalino y después a partir de una solución de EDTA
diluida. Por ejemplo, una solución que contenía 1,0 g de
permanganato potásico, 2 litros de agua y el hidróxido sódico
adicional necesario para elevar el pH hasta 9,0, fueron añadidos a
un matraz de 2 litros equipado con una cabeza de destilación de
disolvente. Esta destilación oxidará cualquier traza de componente
orgánico en el agua. La destilación final fue llevada a cabo en
atmósfera de nitrógeno en un matraz de 2,5 litros que contenía 1500
ml de agua procedente del primer alambique. Este paso elimina las
trazas remanentes de metal en el agua pura. Para evitar que la
neblina de EDTA se volatilice sobre el brazo de reflujo hacia la
cabeza del alambique, el brazo vertical de 40 cm se rellenó con
bolitas de vidrio y se envolvió con aislamiento. Este sistema
produce agua desoxigenada que puede ser medida para que tenga una
conductividad por debajo de 2,0 nanoohms/cm^{2}.
El sistema de espectrómetro a flujo parado fue
diseñado y fabricado por Kinetic Instruments Inc. (Ann Arbor,
Mich.) y se interconectó a un ordenador personal MAC IICX. El
software para el análisis de flujo parado fue proporcionado por
Kinetics Instrument Inc. y estaba escrito en QuickBasic, para
controladores MacAdios. Volúmenes de inyector habituales (0,10 ml
de tampón y 0,006 ml de DMSO) fueron calibrados a los efectos de que
se mezclaran conjuntamente un gran exceso de agua en relación con
la solución de DMSO. La relación real era de aproximadamente 19/1,
por lo que la concentración inicial de superóxido en la solución
acuosa estaba comprendida en la banda de 60-120
\muM. Dado que el coeficiente de extinción publicado para el
superóxido en H_{2}O a 245 nm es de aproximadamente 2250
M^{-1}cm^{-1}, cabía esperar un valor de absorbancia inicial de
aproximadamente 0,3-0,5 para una célula de longitud
de recorrido de 2 cm, y esto fue observado experimentalmente. Las
soluciones acuosas que tenían que ser mezcladas con la solución de
DMSO de superóxido se prepararon utilizando concentraciones 80 mM
del tampón Hepes, pH 8,1 (ácido libre + forma Na). Una de las
jeringas reservorio fue rellenada con 5 ml de solución de DMSO
mientras la otra era rellenada con 5 ml de la solución tampón
acuosa. El bloque entero de inyección y la celda de espectrómetro
fueron sumergidos en un baño de agua circulante con termostato de
21,0\pm0,5ºC. Con anterioridad a la recogida de datos para la
descomposición del superóxido, se obtuvo un valor de base mediante
el inyectado de diversas dosis de tampón y de soluciones DMSO en el
interior de la cámara de mezclado. Estas dosis fueron promediadas y
se almacenaron como base. Las primeras dosis que se recogieron
durante una serie de pruebas lo fueron con soluciones acuosas que no
contenían catalizador. Esto asegura que cada una de las series de
ensayos estaban exentos de contaminación capaz de generar perfiles
de descomposición de superóxido de primer orden. Si las
descomposiciones observadas para diversas dosis de la solución
tampón eran de segundo orden, podían utilizarse soluciones de
complejos de manganeso (II). En general, el catalizador SOD
potencial fue cribado sobre una amplia banda de concentraciones.
Dado que la concentración inicial de superóxido tras mezclado de
DMSO con el tampón acuoso era de aproximadamente 1,2 veces
10^{-4}M, quisimos usar una concentración de complejo manganeso
(II) que fuera al menos 20 veces inferior a la del sustrato
superóxido. Consecuentemente, sometimos generalmente a cribado
compuestos con actividad dismutante de superóxido utilizando
concentraciones oscilantes entre 5 x 10^{-7} y 8 x 10^{-6}M. Los
datos obtenidos a partir del experimento fueron importados a un
programa matemático adecuado (por ejemplo, Cricket Graph), a los
efectos de que pudieran llevarse a cabo análisis cinéticos
estándar. Las constantes de velocidad catalítica para la dismutación
de superóxido por medio de complejos de manganeso (II) fueron
determinadas a partir de gráficos lineales de constantes de
velocidad observadas (Kobs), frente a la concentración de complejos
de manganeso (II). Los valores Kobs fueron obtenidos a partir de
gráficos lineales de absorbancia ln a 245 nm frente a tiempo de
dismutación de superóxido mediante complejos de manganeso (II).
A una suspensión agitada de ácido quelidámico
(200 g; 1,10 mol) en CHCl_{3} (2,00 L) se le añadió PCl_{5}
(1,00 kg; 4,80 mol), por partes, durante un período de 2 horas, a
temperatura ambiente y en atmósfera de nitrógeno. La mezcla fue
luego sometida a reflujo por espacio de 3 horas y la solución de
color marrón claro resultante fue enfriada a 0ºC, añadiéndose, gota
a gota, una solución de trietilamina (215 mL; 1,54 mol) en MeOH
(2,30 L) durante un período de 5-6 horas,
manteniéndose la temperatura a entre 0 y -10ºC. Después
ser sometida a agitación durante un período adicional de 15
minutos, la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante
el transcurso de una noche. La concentración de la solución al vacío
proporcionó por cristalización un sólido de color blanco, el cual
fue filtrado y secado para proporcionar 110 g (rendimiento 43%)
del producto en forma de agujas incoloras: pf
141-2ºC; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz); \delta
8,31 (s, 2H); 4,05 (s, 6H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 75 MHz)
\delta 164,09; 149,44; 146,79; 128,29; 53,48; espectro de masas
FAB (NBA-Li) m/z (intensidad relativa) 252
(30)]M+Na]^{+}, 236 (91)[M+Li]^{+},
230(100)[M+H]^{+}.
A una solución agitada de cloruro de
ciclohexilmagnesio (78,5 mL de 2M en éter etílico, 157 mmol) a
-78ºC se le añadió una solución de ZnBR_{2} (35,5 g,
157 mmol) en THF anhidro (150 mL) a -78ºC. La mezcla fue
sometida a agitación por espacio de 1 hora a -78ºC y
luego se dejó calentar hasta la temperatura ambiente. Se añadió
entonces una solución de tetrakis-(trifenilfosfina)paladio
(0) (7,50 g; 6,47 mmol) en THF anhidro (100 mL) a temperatura
ambiente, seguido de
4-cloro-2,6-piridinodicarboxilato
de dimetilo (30,0 g; 131 mmol) en THF anhidro (150 mL). La mezcla
fue después calentada a 50ºC por espacio de 3 horas y se dejó en
reposo a temperatura ambiente durante el transcurso de una noche.
La reacción fue después apagada con NH_{4}Cl saturado (250 mL) y
H_{2}O (50 mL). Las capas fueron separadas y la capa acuosa
extraída con acetato de etilo (3 x 80 mL). Las capas orgánicas
combinadas fueron lavadas con NaCl saturado (2 x 50 mL) y secadas
sobre MgSO_{4}. La filtración y extracción al vacío del
disolvente proporcionó 41 g de un producto sólido de color marrón
oscuro. El material impuro fue purificado por medio de cromatografía
flash (gel de sílice, 60:40 a 50:50 gradiente
hexano-CH_{2}Cl_{2}), seguido de cristalización
a partir de acetato de etilo-hexano, para dar 17,9
g (rendimiento 49,3%) del producto sólido de un color blanco
apagado: pf 113-115ºC; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300
MHz) \delta8,16 (s, 2H); 4,02 (s, 6H); 2,64-2,73
(m, 1H); 1,88-1,96 (m, 4H);
1,77-1,81 (m, 1H); 1,22-1,56 (m,
5H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 75 MHz) \delta165,44; 159,72;
148,24; 126,79; 53,13; 44,88; 33,23; 26,35; 25,72; espectro de
masas (NBA-Li) m/z (intensidad relativa) 561
(13)[2M+Li]^{+}; 284(27)[M+Li]^{+};
278(100)[M+H]^{+};
218(18)[M-HCO_{2}CH_{3}]^{+};
Anal. Calcd, para C_{15}H_{19}NO_{4}; C 64,97; H 6,91; N,
5,05. Encontrado C 64,98; H 6,84; N 5,05.
A una solución agitada de
4-ciclohexil-2,6-piridinocarboxilato
de dimetilo (6,50 g; 22,5 mmol) en THF anhidro (225 mL) se le
añadió LiBH_{4} (1,96 g; 90,2 mmol) a temperatura ambiente,
moderando la temperatura con un baño de hielo. La solución de color
naranja fue sometida a agitación durante un período de 1,5 horas en
atmósfera de argón y después apagada mediante la adición lenta de
H_{2}O (100 mL). El disolvente fue eliminado al vacío y el resto
disuelto en una mezcla de acetato de etilo (500 mL) y H_{2}o (250
mL). Las capas fueron separadas y la capa de acetato de etilo
lavada con NaHCO_{3} saturado (2 x 250 mL), NaCl saturado (250 mL)
y después secado sobre Na_{2}SO_{4}. La filtración y extracción
del disolvente al vació proporcionó un producto sólido cristalino
de color blanco, el cual fue purificado por medio de
recristalización con acetato de etilo-hexano para
dar 4,65 g (rendimiento 92,7%) del producto, en forma de agujas
incoloras:pf 106-8ºC; ^{1}H NMR (400 MHz,
CDCl_{3}) \delta 7,04 (s, 2H); 4,73 (s,4H); 3,85 (s, 2H); 2,52
(m, 1H); 1,74-1,87 (m, 5H);
1,19-1,47 (m, 5H); ^{13}C NMR (100 MHz,
CDCl_{3}) \delta 158,89; 158,32; 118,13; 64,35; 44,06; 33,50;
26,48; 25,89; espectro de masas FAB (NBA-Li) m/z 228
[M+Li]^{+}.
A una solución agitada de cloruro de oxalilo
(11,1 g; 87,2 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (50 mL) a
-60ºC se le añadió una solución de DMSO anhidro (14,9
g; 190 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (25 mL), gota a gota y por espacio
de 5 minutos. Después de aplicarse agitación durante un período de 5
minutos a -60ºC, se añadió, gota a gota y durante un
período de 5 minutos) una solución de
4-ciclohexil-2,6-piridinometanol
(4,39 g; 19,8 mmol) en DMSO anhidro (25 mL) y la mezcla resultante
fue sometida a agitación durante un período de 20 minutos
a-60ºC. Después, se añadió trietilamina (111 mL, 796
mmol) durante 5 minutos y después de someter la mezcla a agitación
durante un período de 5 minutos a -60ºC, se dejó
calentar la mezcla hasta alcanzar la temperatura ambiente. Una vez
transcurridas 2 horas, se añadió H_{2}O (300 mL) y se extrajo la
mezcla con CH_{2}Cl_{2} (3 x 250 mL). Los extractos se
combinaron, se lavaron con NaCl saturado (250 mL) y se secaron sobre
Na_{2}SO_{4}. La filtración y la extracción del disolvente al
vacío proporcionaron 5,38 g de un producto sólido de color canela,
el cual fue purificado por medio de cromatografía flash (gel de
sílice (98:2 CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para proporcionar 3,86 g
(rendimiento del 89,7%) de un producto sólido cristalino de color
canela: ^{1}H NMR (400 MHz, C_{6}D_{6}) \delta10,05 (s,
2H); 7,72 (s, 2H); 1,97 (d(t), J=9,7; 3,5 Hz, 1H);
1,50-1,54 (m, 3H); 1,33-1,37 (m,
2H); 0,83-1,08 (m, 5H); ^{13}C NMR (100MHz,
C_{6}D_{6}) \delta 192,32; 159,31; 153,55; 123,31; 43,49;
33,00; 26,38; 25,64; espectro de masas FAB (NBA-Li)
m/z 224 [M+Li]^{+}; espectro de masas HR (ESI) m/z
218,1124[M+H]^{+} (218,1181 calculd. Para
C_{13}H_{16}NO_{2}).
A una suspensión agitada de tetrahidrocloruro de
tetraamina, preparada tal como se indica en el Ejemplo 1 (2,80 g;
7,00 mmol) en etanol absoluto (70 mL) se le añadió KOH (1,79 g, 88%;
28,0 mmol) y la mezcla fue objeto de agitación a temperatura
ambiente, en atmósfera de argón. Una vez transcurridos 30 minutos,
se añadió MnCl_{2} (881 mg; 7,00 mmol) y la suspensión fue
sometida a agitación durante un período adicional de 30 minutos. A
la mezcla de color verde oscuro se le añadió entonces
4-ciclohexil-2,6-piridinodicarboxaldehido
(1,52 g; 7,00 mmol) y se sometió a reflujo. Una vez transcurridas
65 horas, la reacción se había completado; tan solo se observaba la
bis(imina): espectro de masas (ESI) m/z (intensidad relativa)
525 (100) [M-Cl]^{+},
245(73)[M-2Cl]^{++}. A la solución
de color naranja se le añadió entonces metanol (35 mL) y, tras
enfriamiento a 0ºC, se le añadió NaBH_{4} (1,06 g; 28 mmol). La
mezcla fue sometida a agitación durante 1 hora a 0ºC y después se
dejó calentar hasta alcanzar la temperatura ambiente. Una vez
transcurridas 5 horas, se le añadió NaBH_{4} adicional (1,06 g;
28,0 mmol) y la mezcla fue sometida a agitación durante un período
de 18 horas. La mezcla fue enfriada de nuevo a 0ºC, se le añadió
NaBH_{4} adicional (1,06 g; 28,0 mmol) y se sometió de nuevo a
agitación durante un período adicional de 3 días. Se extrajo el
disolvente al vacío y se disolvió el resto en una mezcla de
H_{2}O (50 mL), NaCl saturado (250 mL) y CH_{2}Cl_{2} (250
mL). Las capas fueron separadas y se extrajo la solución acuosa con
CH_{2}Cl_{2} (250 mL). Los extractos fueron combinados, se
lavaron con NaCl saturado (250 mL) y fueron secados sobre
MgSO_{4}. La filtración y extracción del disolvente al vacío
proporcionó un producto sólido de color marrón. El producto crudo
fue purificado por medio de cromatografía de flash (gel de sílice,
98:2 CH_{2}Cl_{2}:MeOH), para proporcionar 2,22 g (rendimiento
del 56,1%) de un producto sólido de color blanco apagado: espectro
de masa ESI m/z (intensidades relativas) 529
(78)[M-Cl]^{+},
247(100)[M-Cl]^{++}; espectro de
masa (ESI) MHz (intensidad relativa) 531,2738 (31)/529,2748
(100)[M-Cl]^{+} (531,2714/529,2744 calcl.
Para C_{27}H_{45}N_{5}MnCl). HPLC (Vydac 218TP54 proteína y
péptido C18; 82% H_{2}O con 0,1% TFA/20%CH_{3}CN hasta 100%
H_{2}O con 0,1% TFA durante 10 minutos; flujo= 2 mL/min; 5 \muL
iny. vol.)T_{\tau} =15,2 (pureza 100%).
A una solución agitada de
N-(trifenilmetil)-(1R,2R)-diaminociclohexano,
sintetizado tal como se indica en el Ejemplo 1 (224 g, 628 mmol) en
1,50 L de MeOH, se le añadió una solución de aldehido pirúvico (48,0
mL-40% en H_{2}O, 314 mmol), a temperatura
ambiente y en atmósfera de argón. El precipitado que se formó dentro
de los siguientes 30 minutos fue triturado y se dejó en reposo
durante 16 horas. Se filtró el producto sólido, se lavó con MeOH y
se secó al vacío para proporcionar 170 g (rendimiento del 72,3%) de
producto, en forma de polvo de color blanco: espectro de masa (ESI)
m/z (intensidad relativa) 755 (1)[M+Li]^{+}, 243
(100)[(C_{6}H_{5})_{3}C]^{+}; espectro de
masas (ESI) m/z 749,4597 [M+H]^{+} (749,4583 calculado para
C_{53}H_{57}N_{4}).
A una solución agitada de
N,N'-Bis{(1R,2R)-2-[(trifenilmetil)amino]ciclohexil}-(1R)-metil-1,2-diiminoetano
(170 g; 227 mmol) en una mezcla de THF anhidro (1,50L) y MeOH (1,50
L) se le añadió NaBH_{4} (85,8 g; 2,27 mol) a -10ºC y
la mezcla fue dejada calentar hasta alcanzar la temperatura
ambiente. Una vez transcurridos 5 días, se extrajeron los
disolventes al vacío, el resto fue disuelto en una mezcla de
H_{2}O (500 mL) y CH_{2}CL_{2} (1,00 L) y las capas fueron
separadas. La capa de CH_{2}Cl_{2} fue lavada con H_{2}O (500
mL), NaCl saturado (250 mL) y secada sobre MgSO_{4}. La
filtración y extracción del disolvente al vacío proporcionó 178 g
del producto, con el rendimiento cuantitativo esperado, en forma un
producto sólido de color amarillo: ^{1}H NMR (C_{6}D_{6}, 300
MHz) \delta 7,66-7,80 (m, 12H);
6,97-7,17 (m, 18H); 3,88 (br s, 1H); 3,28 (br s,
1H); 2,43-2,63 (m, 2H); 2,10-2,38
(m, 6H); 1,64-1,90 (m, 5H);
1,32-1,55 (m, 5H); 0,94-1,21
(m,7H); 0,52-0,85 (m, 6H); ^{13}C NMR
(C_{6}D_{6}, 75 MHz) \delta 148,23; 147,99; 129,43; 129,35;
127,88; 127,82; 126,36; 71,19; 71,13; 61,31; 58,88; 57,61; 50,90;
33,72; 33,31; 32,43; 31,14; 25,72; 24,92; 24,84; 24,61; 20,20;
espectro de masas /ESI) m/z (intensidad relativa) 753 (3)
[M+H]^{+}, 243
(100)[(C_{6}H_{5})_{3}C]^{+}; espectro de
masas HR (ESI) m/z 753,4900 [M+H]^{+} (753,4896 calcl. Para
C_{53}H_{61}N_{4}).
A un matraz que contenía
N,N'-Bis{(1R,2R)-2-[(trifenilmetil)amino]ciclohexil}-(1R)-metil-1,2-diaminoetano,
preparado tal como se indica en el Ejemplo 2B (40,0 g; 53,1 mmol),
se le añadió solución de HCl concn. (250 mL), se sometió la
suspensión a agitación durante un período de 1 hora y se dejó
después en reposo durante un período de 16 horas, a temperatura
ambiente. Después de la adición de H_{2}O (250 mL), se extrajo el
producto sólido por filtración y se extrajo el disolvente al vacío.
El agua remanente fue extraída mediante la formación de un
azeótropo con etanol absoluto (2 x 250 mL), para dar 17,9 g
(rendimiento del 81,1%) del producto en forma de sólido de color
canela: ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}, 400 MHz) \delta
10,22 (br s, 4H); 8,94 (br s, 3H); 8,81 (br s, 3H);
3,07-3,75 (m, 7H); 1,06-2,17 (m,
19H); ^{13}C NMR (DMSO-d_{6}, 100 MHz) \delta
58,50; 54,95; 50,73; 50,09 br; 48,37 br; 47,16; 29,11 br; 28,87;
28,69; 28,58; 25,67 br; 22,65; 22,49; 22,37; 22,09; 14,28; espectro
de masas HR (ESI) 269,2692 [M+H]^{+} (269,2705 calcl. Para
C_{15}H_{33}N_{4}).
A una solución agitada de tetrahidrocloruro de
bis-ciclohexiltetramina (4,29 g; 10,4 mmol) en
etanol absoluto (100 mL) se le añadió KOH (2,64 g; 88%, 41,4 mmol)
y la mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante
30 minutos en atmósfera de argón. Se añadió entonces MnCl_{2}
(1,30 g; 10,4 mmol) y después de someter la suspensión a un período
adicional de agitación de 30 minutos, se añadió
4-ciclohexil-2,6-piridinodicarboxaldehido
(2,25 g; 10,4 mmol) a la mezcla de color marrón, la cual fue
después sometida a reflujo. Una vez transcurridas 24 horas, la
reacción se había completado; únicamente se observaba la
bis(imina): espectro de masa (ESI) m/z (intensidad relativa)
539(25)[M-Cl]^{+},
252(100)[M-2Cl]^{++}. Después de la
adición de MeOH (50 mL) se enfrió la mezcla a 0ºC, se añadió
NaBH_{4}(1,57 g, 41,4 mol) y se sometió la mezcla a
agitación por espacio de 30 minutos. Se añadió entones NaBH_{4}
adicional (1,57 g, 41,4 mmol) a 0ºC y se dejó calentar la mezcla
hasta alcanzar la temperatura ambiente, mientras se continuaba con
la agitación durante un período adicional de 60 horas. Se extrajo
el disolvente al vacío y el aceite residual fue disuelto en la
mezcla de CH_{2}Cl_{2} (250 mL) y H_{2}O (250 mL). La mezcla
fue filtrada para extraer una pequeña cantidad de producto sólido
de color marrón, se añadió NaCl saturado (250 mL) y se separaron las
capas. La capa acuosa fue extraída con CH_{2}Cl_{2} (250 mL) y
los extractos fueron combinados. Los extractos combinados fueron
lavados con NaCl saturado (250 mL) y se secaron sobre MgSO_{4}.
La filtración y extracción del disolvente al vacío proporcionó 5,86
g de una espuma de color marrón. El producto crudo fue purificadoa
través de cromatografía flash (gel de sílice, 98:2
CH_{2}Cl_{2}-MeOH) para dar 1,78 g (rendimiento
del 29,7%) del producto en forma de sólido de color amarillo
pálido: espectro de masa HR (ESI)m/z (intensidad relativa)
543,2902(100)/545,2892
(35)[M-Cl]^{+} (543,2901/545,2871 calcld
para C_{28}H_{47}N_{5}MnCl); Anal. Calcd. Para
C_{28}H_{47}N_{5}MnCl_{2}: C 58,03; H 8,17; N 12,08; Cl
12,23. Encontrado C 57,11; H 8,12; N11,85; Cl 11,95. HPLC (Vydac
218TP54 proteína y péptido C18; 65% H_{2}o con
0,1%TFA/35%CH_{3}CN; flujo= 2 mL/min; 5 \muL iny. vol.)
T_{\tau}= 7,58 min (pureza del 99,9%).
4-cloro-2,6-piridinodicarboxilato
de dimetilo, preparado tal como se indica en el Ejemplo 4, (85,0 g;
370 mmol) fue disuelto en MeOH (2,3 L). La solución fue enfriada a
0ºC. A la solución enfriada se le añadió NaBH_{4} (63,0 g; 167
mmol), en pequeñas porciones. La mezcla de reacción fue agitada a
0ºC durante 1 hora, se mantuvo a temperatura ambiente por espacio
de entre 2-3 horas. Una vez transcurridas
aproximadamente 3 horas, la mezcla fue dejada en reflujo durante el
transcurso de una noche. Se le añadió acetona (425 mL) a la mezcla
de reacción. La solución fue calentada a reflujo por espacio de 1
hora, y posteriormente fue concentrada al vacío. Se añadió al
concentrado solución de Na_{2}CO_{3} saturada (650 mL) y se
aplicó reflujo durante un período de 45 minutos. Se dejó que el
matraz alcanzase la temperatura ambiente y se mantuvo a esta
temperatura por espacio de 16 horas. El matraz contenía un
precipitado de color blanco, el cual fue filtrado y lavado con
cloroformo (30 mL). El producto sólido de color blanco fue disuelto
en THF caliente (300 mL), se seco sobre sulfato de magnesio y se
filtró, concentrándose después in vacuo para proporcionar 32,1 g de
4-cloro-2,6-dihidroximetilpiridina,
en forma de sólido de color blanco. El filtrado fue concentrado. El
producto sólido de color blanco resultante fue calentado en THF
(500 mL), secado sobre sulfato de magnesio y filtrado. Este
procedimiento se repitió después de que el sólido fuese agitado en
200 mL de CHCl_{3} y filtrado, para proporcionar 23,6 g
adicionales de
4-cloro-2,6-dihidroximetilpiridina
pura (rendimiento global del 87%), en forma de sólido de color
blanco: ^{1}H NMR /CD_{3}OD, 400 MHz) \delta 7,62 (s, 2H)
5,02 (s, 2H) 4,83 (s, 4H). ^{13}C NMR (CD_{3}OD, 100 MHz)
\delta 162,57; 145,75; 118,76; 63,74.
En un matraz de tres bocas de fondo redondo, de
1 L de capacidad, se colocaron cloruro de oxalilo (126,93 g; 154
mmol) y CH_{2}Cl_{2} (80 mL). La solución se enfrió a
-60ºC. A la solución enfriada se le añadió DMSO (24 mL)
en CH_{2}Cl_{2} (80 mL), durante un período de 5 minutos, por
medio de un embudo de goteo. Una vez transcurridos 10 minutos, se
añadió
4-cloro-2,6-dihidroximetilpiridina
(12,13 g; 69,9 mmol) en DMSO (40 mL), también a través de embudo de
goteo. Una vez transcurridos 20 minutos, se añadió trietilamina (200
mL) y se sometió la reacción a agitación a -60ºC
durante un período adicional de 5 minutos. Se permitió entonces que
la mezcla de reacción alcanzase la temperatura ambiente. Se añadió
agua (400 mL) al matraz. La mezcla acuosa fue extraída con diversas
partes de CH_{2}Cl_{2} y las fracciones orgánicas se añadieron
conjuntamente, se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y
concentraron. El producto crudo fue eluido a través de una columna
de gel de sílice (Aldrich, tamiz 200-400, 60
\ring{A}) con CH_{2}Cl_{2}, para proporcionar 8,20 g
(rendimiento del 69%) de
4-cloropiridino-2,6-dicarboxaldehido
puro, en forma de sólido de color amarillo brillante. ^{1}H NMR
(300MHz, CDCl_{3}) \delta 10,12 (s); 8,1 (S). ^{13}C NMR
(CD_{3}OD, 100 MHz) \delta 191,26; 154,24; 147,55; 125,53. pf=
163ºC.
Tetrahidrocloruro de
N,N'-bis{(1R,2R)-[2-(amino)ciclohexil}-1,2-diaminoetano,
preparado tal como se ha indicado en el Ejemplo 1, (29,98 g; 72,4
mmol) fue colocado en un matraz con EtOH (750 mL). A la suspensión
agitada se le añadió KOH (18,90 g; 289,7 mmol). El KOH se disolvió
y precipitó KCl finamente dividido. Una vez transcurridos 30
minutos, se añadió MnCl_{2} (9,18 g; 72,4 mmol). El MnCl_{2} se
disolvió lentamente y proporcionó una suspensión de color verde.
Una vez disuelto el MnCl_{2}, se añadió
4-cloropiridino-dicarboxaldehido,
preparado tal como se indica en el Ejemplo 3B (12,28; 72,4 mmol).
La mezcla de reacción fue sometida a agitación por espacio de una
hora a temperatura ambiente, después fue calentada a reflujo durante
varios días. La mezcla de reacción fue enfriada a temperatura
ambiente y se añadió MeOH (350 mL). El matraz fue enfriado hasta 0ºC
en un baño de agua-hielo. A la mezcla de reacción
se le añadió NaBH_{4} (5,57 g; 144,8 mmol), en pequeñas
porciones. Se dejó que el matraz llegase a temperatura ambiente. Se
añadió agua y se concentró la mezcla de reacción. El material crudo
fue extraído con cantidades iguales (500 mL cada una de ellas) de
CH_{2}Cl_{2} y salmuera. La capa acuosa fue lavada con diversas
partes de CH_{2}Cl_{2}. Las fracciones orgánicas fueron
acumuladas conjuntamente, secadas sobre Na_{2}SO_{4}, filtradas
y concentradas. El material crudo fue disuelto en CHCl_{3} y se
purificó mediante cromatografía de gel de sílice (Aldrich tamiz
200-400, 60 \ring{A}). El producto fue eluido a
través de la columna con 1% MeOH/CHCl_{3}, incrementando hasta 2%
MeOH/CHCl_{3}. La purificación proporcionó 32,71 g (rendimiento
del 90%) de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R,-24-cloro-3,10,13,20,26-penta-azatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]-hexacosa-1(26),22(23),
24-trieno)].
MS(LR-ESI)m/z481
(M-Cl)^{+}, 445
(M-Cl-HCl)^{+},
223 (M-2Cl)^{++}. And. Cal. Para C_{21}H_{34}N_{5}MnCl_{3}.CH_{3}OH: C 48,06; H 6,87; N 12,74; Cl 19,34. Encontrado C 47,62; H 6,79; N 12,97; Cl 19,77.
223 (M-2Cl)^{++}. And. Cal. Para C_{21}H_{34}N_{5}MnCl_{3}.CH_{3}OH: C 48,06; H 6,87; N 12,74; Cl 19,34. Encontrado C 47,62; H 6,79; N 12,97; Cl 19,77.
La síntesis se esquematiza seguidamente:
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 1,2% (peso/volumen) de
2-mercaptoetilamina (1 eq.) en etanol a 0ºC se le
añadió etóxido sódico (1,1 eq.) para generar el tiolato. Una vez
sometida a agitación durante un período de 1,75 h, la solución de
tiolato fue añadida, gota a gota, a una solución de 1,3%
(peso/volumen) de Compuesto 1 (1 eq.) en DMF a 0ºC. La mezcla de
reacción se dejó en agitación durante el transcurso de una noche. Se
extrajo el disolvente al vacío, siendo extraída la mezcla con
cloruro de metileno y concentrada al vacío. Para llevar a cabo la
purificación se utilizó cromatografía en columna flash, utilizando
cloruro de metileno:metanol (9:1) como eluyente. Se monitorizó el
proceso a través de HPLC.
El
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R.19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se indica en el Ejemplo 6, (1,00g; 1,94 mmol) fue
colocado en un matraz y disuelto en DMF (80 mL). En un matraz
separado se disolvió 2-dietilaminoetanotiol.HCl (3l4
mg, 2,14 mmol) en DMF (20 mL). El matraz fue enfriado a 0ºC en un
baño con agua-hielo. Al matraz se le añadió NaH
(102 mg, 8,5 mmol). Después de someterse a agitación durante un
período de 30 minutos, la solución de
2-dietilaminoetanotiolato fue añadida a la solución
de manganeso(II)dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo
[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
a través de una cánula. Se obtuvieron muestras de la mezcla de
reacción después de un período de 2 horas de agitación para ser
analizadas por medio de HPLC. Los análisis de HPLC confirmaron la
presencia de tan solo material de partida. El matraz fue equipado
con condensador de reflujo y calentado a 80ºC en un baño de aceite,
durante el transcurso de una noche. La mezcla de reacción fue
enfriada a temperatura ambiente y se tomaron muestras para efectuar
análisis por medio de HPLC. Los análisis mediante HPLC confirmaron
únicamente la presencia de material de partida. El matraz fue
enfriado a 0ºC en un baño con agua-hielo. A un
matraz separado se le añadió
2-dietilaminoetanotiol.HCl (725 mg; 4,27 mmol). El
2-dietilaminoetanotiol.HCl fue disuelto en etanol
(45 mL). El matraz se enfrió a 0ºC en un baño de agua helada A la
solución se le añadió NaOEt (3 mL, 21% en peso, 8,54 mmol). A la
solución enfriada de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-dietilaminomercapto-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno)
se le añadió la solución de
2-dietilaminoetanotiolato, a través de una cánula.
El matraz fue calentado a 80ºC, mientras se sometía a agitación
durante el transcurso de una noche. Se obtuvieron muestras de la
mezcla de reacción para su análisis mediante HPLC. El análisis de
HPLC confirmó la presencia de únicamente material de partida. Se
añadió agua (50 mL) al matraz de reacción. La DMF, el agua y el EtOH
fueron extraídos al vacío. El concentrado fue extraído con solución
saturada de NaCl (250 mL), agua (250 mL) y CH_{2}Cl_{2} (250
mL). La capa acuosa fue lavada con diversas partes de
CH_{2}Cl_{2}. Las fracciones orgánicas fueron combinadas,
secadas sobre Na_{2}SO_{4} y concentradas al vacío.
El material crudo fue purificado por medio de
cromatografía de gel de sílice (Aldrich, tamiz
200-400, 60 \ring{A}). El producto fue eluido a
través de columna con 1% de MeOH/CH_{2}Cl_{2}, incrementando
ligeramente hasta el 6% MeOH/CH_{2}Cl_{2}. Las fracciones
fueron analizadas mediante HPLC y combinadas para proporcionar 504
mg (rendimiento del 43%) de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-(N,N'-dietilaminoetiltio)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno).
MS (LR-FAB) m/z
578(M-Cl)^{+}. HRMS, calculado para
C_{24}H_{48}ClMnN_{6}S: 578,2730. Encontrado:578,2764.
Manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se describe en el Ejemplo 6 (1,01 g; 1,96 mmol)
fue colocado en un matraz y disuelto en DMF (60 mL). En un matraz
separado, se disolvió 2-mercaptopropano (165 mg;
2,15 mmol) en DMF (60 mL). El matraz fue enfriado a 0ºC en un baño
de agua-hielo. Al matraz se le añadió NaH (51 mg;
2,13 mmol). Después de someterse a agitación durante un período de
30 minutos, la solución de 2-tiopropano fue añadida
a la solución de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
a través de una cánula. El matraz estaba equipado con un condensador
de reflujo y se calentó a 80ºC en un baño de aceite, por espacio de
2 días. La mezcla de reacción fue enfriada a temperatura ambiente y
se tomaron muestras de la misma para el análisis de HPLC. El
análisis de HPLC confirmó la presencia de únicamente material de
partida. El matraz fue enfriado a 0ºC en un baño de
agua-hielo. A un matraz conteniendo EtOH (10 mL) se
le añadió 2-mercaptopropano (328 mg; 4,31 mmol). El
matraz fue enfriado a 0ºC en un baño de agua-hielo.
A la solución se le añadió NaOEt (3 mL, 21% en peso, 8,62 mmol). A
la solución de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno)
se le añadió la solución de 2-tiopropano, a través
de una cánula. El matraz fue calentado a 80ºC, con agitación
durante el transcurso de toda una noche. Se tomaron muestras de la
mezcla de reacción para ser analizadas por medio de HPLC. El
análisis mediante HPLC confirmó la presencia de producto y la
ausencia de material de partida. Se añadió agua (50 mL) al matraz
de reacción. La DMF, el agua y el EtOH fueron extraídos al vacío.
El concentrado fue extraído con solución de NaCl saturada (250 mL)
y agua (250 mL), extrayéndose después con CH_{2}Cl_{2}. Se
combinaron las fracciones orgánicas, se secaron sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentraron al vacío. El material crudo fue
purificado por medio de cromatografía de gel de sílice (Aldrich
tamiz 200-400, 60 \ring{A}). El producto fue
eluido a través de la columna con 1% MeOH/CH_{2}Cl_{2},
incrementándose lentamente hasta 2% MeOH/CH_{2}Cl_{2}. Las
fracciones fueron analizadas mediante HPLC y combinadas para
proporcionar 504 mg (rendimiento del 46,6%) de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,
14R,19R-24-S-(2-tiopropano)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno)
puro. HRMS. Calcd. Para C_{24}H_{41}N_{5}SMnCl: 521,2152.
Encontrado: 521,2136.
Manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se indica en el Ejemplo 6 (1,01 g; 1,96 mmol) fue
colocado en un matraz y disuelto en DMF (80 mL). En un matraz
separado, se disolvió 2-mercaptobutano (191 mg; 2,12
mmol) en DMF (20 mL). El matraz fue enfriado a 0ºC en un baño de
agua-hielo. Al matraz se le añadió NaH (51 mg; 2,13
mmol). Una vez sometida a agitación durante un periodo de 30
minutos, la solución de 2-tiobutano fue añadida a la
solución de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
por medio de una cánula. El matraz fue equipado con un condensador
de reflujo y calentado a 80ºC en un baño de aceite, durante el
transcurso de una noche. La mezcla de reacción fue enfriada a
temperatura ambiente y se tomaron muestras para análisis mediante
HPLC. Los análisis de HPLC confirmaron la presencia de únicamente
una pequeña cantidad de producto. El matraz fue enfriado a 0ºC en un
baño de agua-hielo. A un matraz que contenía EtOH
(20 mL) se le añadió 2-mercaptobutano (415 mg; 4,27
mmol). El matraz fue enfriado a 0ºC en un baño de
agua-hielo. A la solución se le añadió NaOEt (3 mL,
21% en peso, 8,62 mmol). A la solución de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno)
enfriada se le añadió la solución de
2-mercaptobutano, a través de una cánula. El matraz
fue calentado a 80ºC, manteniéndose la agitación durante el
transcurso de una noche. Se tomaron muestras de la mezcla de
reacción para ser analizadas mediante HPLC. El análisis mediante
HPLC confirmó la presencia de producto y la ausencia de material de
partida. Al matraz de reacción se le añadió agua (50 mL). La DMF,
el agua y el EtOH fueron extraídos al vacío. El concentrado fue
extraído con solución saturada de NaCl (250 mL), agua (250 mL) y
CH_{2}Cl_{2} (250 mL). La capa acuosa fue lavada con diversas
porciones de CH_{2}Cl. Las fracciones orgánicas fueron
combinadas, secadas sobre Na_{2}SO_{4} y concentradas al vacío.
El material crudo fue purificado por medio de cromatografía de gel
de sílice (Aldrich tamiz 200-400, 60 \ring{A}).
El producto fue eluido a través de columna con 1% de
MeOH/CH_{2}Cl_{2}, incrementándose lentamente hasta 2%
MeOH/CH_{2}Cl_{2.} Las fracciones fueron analizadas por medio de
HPLC y se combinaron para proprocionar 680 mg (rendimiento del 61%)
de
manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-(2-butanotio)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno)
puro. MS (LR-FAB) m/z 535
(M-Cl)^{+}. HRMS. Calculado para
C_{25}H_{43}ClMnN_{5}S: 535,2308. Encontrado:535,2312.
Manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se indica en el Ejemplo 6 (1,00 g; 1,93 mmol) fue
colocado en un matraz y disuelto en DMF (80 mL). En un matraz
separado se disolvió ciclohexilmercaptano (247 mg; 2,12 mmol) en DMF
(20 mL). El matraz fue enfriado a 0ºC en un baño de
agua-hielo. Al matraz se le añadió NaH (51 mg; 2,13
mmol). Una vez aplicada agitación durante un período de 30 minutos,
se añadió la solución de ciclohexiltiolato a la solución de
manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
a través de una cánula. El matraz fue dejado en agitación a
temperatura ambiente durante el transcurso de una noche. Se tomaron
muestras de la mezcla de reacción para análisis de HPLC. Los
análisis de HPLC confirmaron la presencia de únicamente una pequeña
cantidad de producto. El matraz fue enfriado a 0ºC en un baño de
agua-hielo. A un matraz que contenía EtOH (10 mL)
se le añadió ciclohexilmercaptano (475 mg; 4,25 mmol). El matraz fue
enfriado a 0ºC en un baño de agua-hielo. A la
solución se le añadió NaOEt (3 mL, 21% en peso; 8,62 mmol). A la
solución enfriada de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno)
se le añadió la solución de 2-mercaptobutano, a
través de una cánula. Se tomaron muestras de la mezcla de reacción
para ser analizadas mediante HPLC. El análisis mediante HPLC
confirmó la presencia de producto y la ausencia de material de
partida. Al matraz de reacción se le añadió agua (50 mL). La DMF, el
agua y el EtOH fueron extraídos al vacío. El concentrado fue
diluido con CH_{2}Cl_{2} (250 mL), después lavado con solución
de NaCl saturado combinada (250 mL) y agua (250 mL). La capa acuosa
fue lavada con varias porciones de CH_{2}Cl_{2}. Las fracciones
orgánicas fueron combinadas, secadas sobre Na_{2}SO_{4} y
concentradas al vacío. El material crudo fue purificado mediante
cromatografía de gel de sílice (Aldrich, tamiz
200-400 \ring{A}) . El producto fue eluido a
través de columna con 1% de MeOH/CH_{2}Cl_{2}, incrementándose
ligeramente hasta 2% MeOH/CH_{2}Cl_{2}. Las fracciones fueron
analizadas por medio de HPLC y se combinaron para proporcionar 675
mg (rendimiento del 59%) de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-(ciclohexiltio)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno).MS
(LR-ESI) m/z 561
(M-Cl)^{+};
263(M-2Cl)^{++}; 222
(M-2Cl-ciclohexeno)^{++}.
HRMS. Calc. Para C_{27}H_{45}ClMnN_{5}S. 561,2465. Encontrado:
561,2477.
Manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se indica en el Ejemplo 6 (22,26 g; 42,99 mmol)
fue colocado en un matraz de cuatro bocas de fondo redondo, de 5 L
de capacidad, equipado con una barra de agitación magnética y en
atmósfera de argón. Al matraz se le añadió DMF anhidra (2L) y se
disolvió el sólido. El matraz fue colocado en un un baño de
agua-hielo. Se depositó hidruro sódico (3,40 g; 142
mmol) en el interior de un matraz de 500 mL, equipado con una barra
de agitación, en atmósfera inerte. Al hidruro sódico se le añadió
DMF anhidra (230 mL) y se creó una suspensión. El matraz fue
enfriado en un baño de agua-hielo y a la suspensión
se le añadió, de forma gradual, tioglicolato de etilo (16,97 mL;
155 mmol). Una vez hubo cesado la emanación de gas, se eliminó el
baño de hielo y 120 mL de la solución de tiolato fueron añadidos a
la solución de complejo de manganeso. Se eliminó el baño de
enfriamiento. Una vez transcurridas 4,6 horas, se le añadieron a la
reacción 100 mL adicionales de la solución de tiolato. La mezcla
de reacción fue dejada en agitación durante el transcurso de una
noche. Los análisis de HPLC indicaron que la reacción se había
completado. Se extrajo la DMF al vacío para obtener un resto que
fue disuelto en 850 mL de cloruro de metileno, 250 mL de agua y 250
mL de NaCl saturada. Las capas fueron mezcladas y separadas. La
capa acuosa fue extraída tres veces con 250 mL de cloruro de
metileno. Las capas de cloruro de metileno fueron combinadas,
secadas sobre Na_{2}SO_{4}, filtradas y concentradas, hasta
obtener una mezcla aceitosa, cruda, con un peso de 40 g. El material
crudo fue purificado mediante cromatografía de gel de sílice,
utilizando CHCl_{3}, seguido de 1-2% de EtOH en
CHCl_{3} para eluir el producto. Las fracciones impuras fueron
combinadas y concentradas formando un material sólido, el cual fue
triturado con éter en CH_{2}Cl_{2} para proporcionar el
producto puro, el cual fue combinado con las fracciones puras
procedentes de la columna y concentrado para generar un rendimiento
de 15,61 g (60%) de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-S(etil-2-tioacetato)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
en forma de sólido de color blanco. Se obtuvo una estructura
cristalina por rayos X, la cual confirmó la estructura del producto.
MS ESI: m/z 565 (M-Cl)^{+}; 265
(M-Cl_{2})^{++}; 251
(M-C_{2}H_{5}-Cl_{2})^{++};
222
(M-SCH_{2}C_{2}H_{5}-Cl_{2})^{++};
Anal. Calc. para C_{25}H_{41}N_{5}O_{2}SMnCl_{2}
0,5(C_{2}H_{5}OH): C 50,00; H 7,10; N 11,21; S 5,13; Cl
11,35. Encontrado, C 50,19; H 7,14; N 11,17; S 5,29; C 11,14.
A una suspensión de NaH (50,9 mg; 2,12 mmol) en
10 mL de DMF anhidra se le añadió metiltioglicolato (190 \muL,
2,12 mmol), enfriándose en un baño de agua-hielo. Se
permitió que la mezcla se calentase hasta alcanzar la temperatura
ambiente.
Manganeso(II)dicloro(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se indica en el Ejemplo 6, (1,00 g; 1,93 mmol)
fue añadido, como suspensión en 10 mL de DMF, a la solución de
tiolato. La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente
y después calentada a 80ºC en un baño de aceite por espacio de 2
horas. A la reacción se le añadió DMF adicional (100 mL) y se
sometió a agitación a temperatura ambiente durante un período de 4
días. A la mezcla de reacción se le añadió salmuera (20 mL) y se
recogió un precipitado sólido. El filtrado fue concentrado y
extraído con éter para proporcionar 962 mg de producto crudo. El
producto crudo fue purificado a través de cromatografía de columna
sobre gel de sílice, eluyendo con 1% MeOH en CHCl_{3}. El
rendimiento fue de 627 mg (55% de 97% puro mediante HPLC). MS ESI:
m/z 551 (M-Cl)^{+}, 258
(M-Cl_{2})^{++}. HRMS, calcl. para
C_{24}H_{39}N_{5}O_{2}SMnCl: 551,1894. Encontrado:
551,1886.
A una solución enfriada de
3-mercapto-1-propanol
(600 \muL; 6,95 mmol) en DMF (150 mL) se le añadió hidruro sódico
(153 mg; 6,37 mmol). El baño de hielo fue eliminado y al cabo de
transcurridos 10 minutos, se añadió a la suspensión manganeso (II)
dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se indica en el Ejemplo 6 (3,00 g; 5,79 mmol). La
solución se volvió de un color amarillo canela. Después de estar
sometida a agitación durante el transcurso de una noche, la
reacción adquirió una tonalidad marrón púrpura. Según la HPLC y MS,
se encontraban presentes los productos de partida y el producto. Se
la añadieron 200 \muL adicionales de
3-mercapto-1-propanol
y 51 mg de NaH en 40 mL de DMF, seguido de 20 mL adicionales de
DMF. Transcurridas varias horas, se llevó a cabo otra adición de
tiolato, consistente en 125 \muL de
3-mercapto-1-propanol
y 34 mg de NaH en DMF. Se demostró que la reacción se había
completado mediante HPLC. La mezcla de reacción fue concentrada al
vacío y tratada con cloruro de metileno y salmuera. La capa acuosa
fue extraída diversas veces con cloruro de metileno. Las capas de
CH_{2}Cl_{2} fueron combinadas, secadas sobre Na_{2}SO_{4},
filtradas y concentradas. El material crudo fue purificado mediante
cromatografía de columna, utilizando gel de sílice y eluyendo con
CH_{2}Cl_{2}, seguido de 1-3% de MeOH en
CH_{2}Cl_{2}. Las fracciones puras fueron combinadas para
generar manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-S-(3-hidroxipropanotio)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
en forma de polvo de color blanco apagado, peso 2,17 g (65%). La
HPLC indica una pureza del 99%. MS ESI: m/z 537
(M-Cl)^{+}; 501
(M-HCl-Cl)^{+}; 251
(M-2Cl)^{++}; 222
(M-2Cl-C_{3}H_{6}OH)^{++}.
Una estructura cristalina por rayos X confirmó la estructura del
producto.
Según el procedimiento de preparación de
manganeso(II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-S-(3-hidroxipropanotio)3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
(Ejemplo 7H), se formó una solución de tiolato utilizando
N-Me mercaptoacetamida (196\muL; 2,22 mmol) e
hidruro sódico (51 mg; 2,12 mmol). Manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa1(26),22(23),24-trieno),
preparado tal como se indica en el Ejemplo 6 (1,00 g; 1,93 mmol)
fue añadido a la solución de tiolato. La reacción fue llevada a
cabo y purificada para proporcionar 372 mg de manganeso (II)
dicloro(4R,9R,14R,19R-24-S-(N-metil-2-tiocetamida)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno)
(33%, 99% de pureza por medio de HPLC), en forma de un producto
sólido de color blanco apagado. MS ESI: m/z 550
(M-Cl)^{+}; 258
(M-2Cl)^{++}. HRMS. Calcd. Para
C_{24}H_{40}N_{6}OSMnCl: 550,2053. Encontrado: 550,2062.
Manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-S-(2-tioacetatodeetilo)-10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.
0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno), preparado tal como se indica en el Ejemplo 7 (1,16 g; 1,93 mmol) fue disuelto en THF (25 mL), NaHCO_{3} sat. (50 mL) y agua (50 mL). La mezcla fue sometida a agitación durante el transcurso de varios días, hasta que la HPLC indicó que se había producido la completa hidrólisis del éster. El THF fue extraído al vacío, se añadió salmuera (50 mL) y la mezcla acuosa fue extraída con cloruro de metileno. La capa de cloruro de metileno fue secada sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y concentró para proporcionar el producto crudo. El material crudo fue purificado mediante cromatografía de gel de sílice eluyendo con 2-3% de MeOH en CHCl_{3}. Rendimiento 820 mg de manganeso (II) dicloro (4R,9R,14R,19R-24-S-(2-tioacetato)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno), en forma de sólido de color blanco apagado. Anal. Calcld. para C_{23}H_{36}N_{5}SO_{2}MnCl H_{2}O: C 49,77; H 6,90; N 12,62; S 5,78; Cl 6,39. Encontrado C 49,63; H 6,91; N 12,49; S 5,78; Cl 6,47.
0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno), preparado tal como se indica en el Ejemplo 7 (1,16 g; 1,93 mmol) fue disuelto en THF (25 mL), NaHCO_{3} sat. (50 mL) y agua (50 mL). La mezcla fue sometida a agitación durante el transcurso de varios días, hasta que la HPLC indicó que se había producido la completa hidrólisis del éster. El THF fue extraído al vacío, se añadió salmuera (50 mL) y la mezcla acuosa fue extraída con cloruro de metileno. La capa de cloruro de metileno fue secada sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y concentró para proporcionar el producto crudo. El material crudo fue purificado mediante cromatografía de gel de sílice eluyendo con 2-3% de MeOH en CHCl_{3}. Rendimiento 820 mg de manganeso (II) dicloro (4R,9R,14R,19R-24-S-(2-tioacetato)-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno), en forma de sólido de color blanco apagado. Anal. Calcld. para C_{23}H_{36}N_{5}SO_{2}MnCl H_{2}O: C 49,77; H 6,90; N 12,62; S 5,78; Cl 6,39. Encontrado C 49,63; H 6,91; N 12,49; S 5,78; Cl 6,47.
A una suspensión de NaH (0,26 g; 11 mmol) en 5
mL de DMF a 0ºC, se le añadió lentamente una solución de
mercaptometilfosfonato de dietilo (2,2 g; 12 mmol) en 15 mL de DMF.
La suspensión resultante fue sometida a agitación durante un
período de 1 hora a temperatura ambiente y transferida, mediante una
cánula, a una solución de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparada tal como se indica en el Ejemplo 6, (2,84 g; 5,50 mmol)
en 100 mL de DMF, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante
fue sometida a agitación a temperatura ambiente por espacio de 48
horas. A la mezcla de reacción se le añadió tiolato adicional,
preparado tal como se ha indicado anteriormente a partir de
mercaptometilfosfonato de dietilo (0,43 g; 2,3 mmol) y NaH (53 mg;
2,2 mmol), en 4 mL de DMF y la suspensión fue calentada a 60ºC
durante un periodo de 18 horas, en cuyo momento, el análisis
espectral de masas confirmó que complejo de material de partida
4-cloropiridina se había consumido completamente.
Se evaporó el disolvente, y se dividió el resto entre
CH_{2}Cl_{2} (100 mL) y salmuera (50 mL). La capa acuosa fue
separada y extraída con CH_{2}Cl_{2} (3 x 50 mL). Las capas
orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de magnesio y
evaporadas hasta formar un aceite de color marrón. La purificación
del producto crudo se alcanzó a través de cromatografía en columna
flash, sobre 100 g de gel de sílice preparado en etanol al 100%. El
producto eluyó en cloroformo al 100%. Las fracciones fueron
analizadas a través de HPLC de fase inversa. Las fracciones puras
fueron combinadas y concentradas para proporcionar un aceite de
color amarillo. El aceite fue tratado con 5 mL de CH_{2}Cl_{2} y
cristalizado mediante la adición lenta de éter dietílico (75 mL).
El precipitado fue aislado por medio de filtración, lavado con éter
dietílico y secado al vacío por espacio de 18 horas a temperatura
ambiente para proporcionar el producto deseado en forma de sólido
de color banco apagado, 0,55 g (15%), p.f. > 300ºC (d), FABMS
m/z= 664, 629 [M-Cl]^{+}. Anal. Alc. para
C_{26}H_{46}N_{5}Cl_{2}PSO_{3}Mn. 1,0 H_{2}O: C 45,68; H
7,08; N 10,25; S 4,69; Cl 10,37: Encontrado: C 45,69; H 7,01; N
10,10; S 4,68 Cl 10,41.
A una suspensión agitada, enfriada, de hidruro
sódico (0,27 g; 6,75 mmol), en atmósfera de nitrógeno, en 15 mL de
DMF a 0ºC se le añadió lentamente alcohol
2-mercaptobencílico (1,04 g; 7,44 mmol) disuelto en
5 mL de DMF. La solución resultante fue dejada calentar a
temperatura ambiente y sometida a agitación por espacio de 30
minutos. Fue transferida después, a través de una cánula, hacia el
interior de una solución de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparada tal como se indica en el Ejemplo 6, (1,5 g; 2,89 mmol) en
80 mL de DMF, en atmósfera de nitrógeno, a presión reducida.
Durante la adición se formó un precipitado sólido. La reacción fue
después sometida a agitación a 58ºC durante un período de tres
días, en cuyo momento el análisis de espectroscopia de masas reveló
que el producto de partida, el complejo
4-cloropiridina, se había consumido completamente.
El disolvente fue extraído al vacío y el aceite resultante lavado
con 100 mL de salmuera y extraído con diclorometano (3 x 50 mL).
Los extractos fueron combinados, secados sobre sulfato de magnesio y
filtrados. La purificación del producto crudo fue realizada
mediante cromatografía en columna flash sobre 100 mL de gel de
sílice, eluyendo en primer lugar con diclorometano al 100% y
después con metanol al 2% en diclorometano. Las fracciones fueron
analizadas mediante HPLC de fase inversa. Fracciones similares
fueron combinadas y concentradas para proporcionar un aceite de
color naranja. Este aceite fue tratado con cloruro de metileno/éter
dietílico (60/40, v/v), decantado y después se le añadió éter
dietílico a la solución hasta que el producto precipitó
completamente. El precipitado resultante fue recogido por medio de
filtración y secado al vacío a temperatura ambiente durante el
transcurso de una noche, proporcionando 330 mg (18%) del producto
deseado en forma de un sólido amorfo de color amarillo claro
(aprox. 87% de pureza, según HPLC). FABMS m/z= 620,585
[M-Cl]^{+}, ESMS m/z=
585[M-Cl]^{+}, 275
[M-2Cl]^{+2}.
A una solución de NaH (78 mg de una dispersión
al 60% en aceite, 2,0 mmol) en DMF (4 ml) a 0ºC se le añadió
fosfito de dietilo (0,27 ml de una pureza del 98%, 2,1 mmol). La
mezcla de reacción fue dejada calentar a temperatura ambiente y,
después de transcurridos aproximadamente 45 minutos, la emanación de
gas ya no resultaba evidente. El anión resultante fue entonces
añadido a una mezcla del complejo del Ejemplo 6 (503 mg; 0,97 mmol)
en DMF (30 mL). La mezcla de reacción fue sometida a agitación
durante el transcurso de una noche a temperatura ambiente. En este
momento, el análisis de espectrometría de masas indicaba la
presencia del fosfato éster dietílico, sustituido en la posición 4,
m/z= 599 [M-Cl]^{+}, al igual que el
4-fosfonato deseado, en forma de producto éster
monoetílico, m/z= 555 [M-Cl]^{+} y algo del
producto de partida complejo de manganeso no reaccionado m/z =481
([M-Cl]^{+} y 223
([M-2Cl]^{++}.
A una suspensión enfriada, sometida a agitación,
de hidruro sódico (0,32 g; 8,11 mmol) en atmósfera de nitrógeno en
10 mL de DMF a 0ºC se le añadió lentamente
3-mercaptobenzoato de etilo (1,62 g; 8,88 mmol)
disueltos en 5 mL de DMF. La solución de color amarillo claro
resultante fue dejada calentar a temperatura ambiente y se sometió
a agitación por espacio de 60 minutos. La misma fue después
transferida, a través de una cánula, a una solución sometida a
agitación de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparada tal como se indica en el Ejemplo 6, (2,0 g; 3,86 mmol),
en 100 mL de DMF, en atmósfera de nitrógeno, a temperatura
ambiente. Durante la adición se formó un precipitado sólido. La
reacción fue después sometida a agitación a 58ºC durante un período
de tres días, en cuyo momento la MS confirmó que el complejo de
partida se había consumido completamente. El disolvente fue
extraído al vacío. El aceite resultante fue lavado con 100 mL de
salmuera y extraído con cloroformo (3 x 50 mL). Los extractos fueron
combinados, secados sobre sulfato de magnesio y filtrados. La
purificación del producto crudo se logró mediante cromatografía en
columna flash, sobre 200 mL de gel de sílice preparado en etanol al
100%. El producto fue eludió en cloroformo al 100%. Las fracciones
fueron analizadas mediante PLC de fase inversa. Las fracciones puras
fueron combinadas y concentradas para proporcionar un aceite de
color naranja. Este aceite fue tratado con 6 mL de THF, se añadieron
0,5 mL de agua y después se le añadió
t-butil-metil-éter a la solución,
hasta que el producto precipitó completamente. El producto sólido
de color amarillo claro resultante fue recogido mediante filtración
y secado al vacío a temperatura ambiente durante el transcurso de
una noche, proporcionando el producto puro deseado en forma de
sólido de color amarillo pálido, 835 mg (32%), p.f. >300ºC (d).
ESMS m/z= 662,627 [M-Cl]^{+}; 296
[M-2Cl]^{+2}. Anal. Calcl. para
C_{30}H_{43}N_{5}Cl_{2}SO_{2}Mn.0,5 H_{2}O: C 53,57; H
6,59; N 10,41; S 4,77; Cl 10,54; Encontrado: C 53,64; H 6,62; N
10,23; S 4,82; Cl 10,52.
A una suspensión enfriada, sometida a agitación,
de hidruro sódico (0,27 g; 6,75 mmol) en atmósfera de nitrógeno, en
10 mL de DMF, a 0ºC, se le añadió lentamente
3-metoxitiofenol (1,03 g; 7,34 mmol) disuelto en 5
mL de DMF. La solución incolora, clara, resultante se dejó calentar
a temperatura ambiente y se sometió a agitación por espacio de 30
minutos. La misma fue transferida después, a través de una cánula, a
una solución agitada de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparada tal como se indica en el Ejemplo 6, (1,51 g; 2,89 mmol),
en 80 mL de DMF, en atmósfera de nitrógeno, a temperatura ambiente.
Durante la adición se formó un precipitado sólido. La reacción fue
entonces sometida a agitación a 58ºC durante un período de tres
días, en cuyo momento la MS confirmó que el complejo de partida
4-cloropiridina se había consumido completamente.
El disolvente fue extraído al vacío. El aceite resultante fue lavado
con 100 mL de salmuera y extraído con cloroformo (3 x 50 mL). Los
extractos fueron combinados, secados sobre sulfato de magnesio y
filtrados. La purificación del producto crudo se alcanzó mediante
cromatografía en columna flash, sobre 100 mL de gel de sílice,
eluyendo primero con cloroformo al 100% y después con 2% de metanol
en cloroformo. Se analizaron fracciones mediante HPLC en fase
inversa. Las fracciones puras fueron combinadas y concentradas para
proporcionar un aceite de color naranja. Esta aceite fue disuelto
en cloroformo/éter dietílico (72/25, v/v), decantado y a la
solución se le añadió después éter dietílico, hasta que el producto
hubo precipitado completamente. Los cristales resultantes de color
amarillo claro fueron recogidos por filtración y secados al vacío a
temperatura ambiente durante el transcurso de una noche,
proporcionando el producto deseado en forma de cristales de color
amarillo claro, 555 mg (31%), p.f. > 300ºC (d). ESMS m/z = 620,
585 [M-Cl]^{+},
275[M-2Cl]^{+2}. Anal. Calc. para
C_{28}H_{41}N_{5}Cl_{2}SOMn: C 54,11; H 6,65; N 11,27; S
5,16; Cl 11,41. Encontrado: C 54,11; H 6,70; N 11,15; S 5,06; Cl
11,47.
A una suspensión agitada, sometida a agitación,
de hidruro sódico (0,27 g; 6,75 mmol) en atmósfera de nitrógeno, en
10 mL de DMF, a 0ºC, se le añadió lentamente
3-metoxitiofenol (1,04 g; 7,44 mmol) disuelto en 5
mL de DMF. La solución incolora, clara, resultante se dejó calentar
a temperatura ambiente y se sometió a agitación por espacio de 30
minutos. La misma fue transferida después, a través de una cánula, a
una solución agitada de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo-[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparada tal como se indica en el Ejemplo 6, (1,5 g; 2,89 mmol),
en 80 mL de DMF, en atmósfera de nitrógeno, a temperatura ambiente.
Durante la adición se formó un precipitado sólido. La reacción fue
entonces sometida a agitación a 58ºC durante un período de tres
días, en cuyo momento la MS confirmó que el complejo de partida
4-cloropiridina se había consumido completamente.
El disolvente fue extraído al vacío. El aceite resultante fue lavado
con 100 mL de salmuera y extraído con cloroformo (3 x 50 mL). Los
extractos fueron combinados, secados sobre sulfato de magnesio y
filtrados. La purificación del producto crudo se alcanzó mediante
cromatografía en columna flash, sobre 100 mL de gel de sílice,
eluyendo en primer lugar con cloroformo al 100% y después con 2% de
metanol en cloroformo. Se analizaron fracciones mediante HPLC en
fase inversa. Las fracciones puras fueron combinadas y concentradas
para proporcionar un aceite de color naranja. Esta aceite fue
disuelto en cloroformo/éter dietílico (60/40, v/v), decantado y a
la solución se le añadió después éter dietílico, hasta que el
producto hubo precipitado completamente. El producto sólido
resultante, de color amarillo claro, fue recogido por medio de
filtración y secado al vacío a temperatura ambiente durante el
transcurso de una noche, proporcionando el producto deseado en forma
de sólido amorfo de color amarillo claro, 240 mg (13%), p.f. >
300ºC (d). ESMS m/z = 620,585 [M-Cl]^{+},
275[M-2Cl]^{+2}. Anal. Calc. para
C_{28}H_{41}N_{5}Cl_{2}SOMn.2H_{2}O: C 51,14; H 6,90; N
10,65; S 4,88; Cl 10,78. Encontrado: C 51,41; H 6,82; N 10,46; S
4,88; Cl 10,62.
A una solución de
bis(acetonitrilo)-dicloropaladio (II) (17 mg;
0,05 mmol) y cloruro de tetrafenilfosfonio (111 mg; 0,3 mmol) en
DMF (5 mL), a temperatura ambiente, se le añadió trietilamina (170
\muL de una pureza del 99%; 1,2 mmol), seguido de fosfito de
dietilo (160 \muL de una pureza del 98%; 1,2 mmol). A esta mezcla
se le añadió una solución de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro,3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparada tal como se indica en el Ejemplo 6, (500 mg; 1,0 mmol) en
DMF (30 mL). La mezcla de reacción fue calentada a 90ºC y sometida
a agitación durante el transcurso de toda una noche. En este
momento, el análisis espectral indicaba la presencia del producto
4-dietilfosfonato deseado, m/z= 583
[M-Cl]^{+}, al igual que el producto
parcialmente hidrolizado, m/z= 555
[M-Cl]^{+}, junto con algo de complejo de
partida no reaccionado, MS (LRFAB) m/z=
481[M-Cl]^{+}.
A una suspensión enfriada, sometida a agitación,
de hidruro sódico (0,65 g; 16,22 mmol), en atmósfera de nitrógeno,
en 15 mL de DMF, a 0ºC, se le añadió lentamente
4-mercaptobenzoato de etilo (3,2 g; 17,76 mmol)
disueltos en 5 mL de DMF. La solución resultante fue dejada
calentar a temperatura ambiente y sometida a agitación durante un
período de 60 minutos. Posteriormente fue transferida, a través de
una cánula, a una solución agitada de manganeso (II) dicloro
(4R,9R,14R,19R-24-cloro-3,10,13,20,26-pentaazatetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno),
preparada tal como se indica en el Ejemplo 6, (4,0 g; 7,72 mmol) en
80 mL de DMF, en atmósfera de nitrógeno, a temperatura ambiente.
Durante la adición se formó un precipitado sólido. La reacción fue
después sometida a agitación a 58ºC durante un período de tres
días, en cuyo momento el análisis de espectroscopia de masas
confirmó que el complejo de partida 4-cloropiridina
se había consumido por completo. El disolvente fue extraído al
vacío y el aceite resultante lavado con 100 mL de salmuera y
extraído con cloroformo (3 x 50 mL). Los extractos fueron
combinados, secados sobre sulfato de magnesio y filtrados. La
purificación del producto crudo fue lograda por medio de
cromatografía en columna flash, sobre 40 mL de gel de sílice
preparado en etanol al 100% y eluyendo con cloroformo al 100%. Se
analizaron fracciones a través de HPLC de fase inversa. Fracciones
similares fueron combinadas y concentradas para dar 1,8 g (35%) del
producto deseado, en forma de aceite de color naranja (con una
pureza en torno al 87%, mediante HPLC). FABMS m/z= 662,627
[M-Cl]^{+}.
A una solución de acetato amónico al 10% agua
(31,0 ml; 3,10 g; 39,2 mmol) se le añadió de forma rápida
formaldehído (394 mg; 13,1 mmol) y
4,4-dimetoxi-3-oxo-butirato
de etilo (5,00 g; 26,3 mmol). Esta mezcla fue diluida con etanol
(30 mL) y sometida a reflujo durante un período de 16 horas. El
etanol fue evaporado y la mezcla acuosa extraída con
CH_{2}Cl_{2} (3 x 100 ml). Los extractos combinados fueron
secados (MgSO_{4}), filtrados y concentrados para proporcionar
3,8 g (rendimiento 78%) del producto en forma de aceite de color
amarillo: ^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,41 (bs,1H);
5,99 (s,2H); 4,25 (q, J= 7,20 Hz, 4H); 3,48 (s, 12H); 3,42 (d, J=
11,7 Hz, 2H); 1,36 (t, J=7,2 Hz, 6H). ^{13}C NMR (75 MHz,
CDCl_{3}) dc 166,64 (s); 144,39(s); 100,39 (s); 98,43 (d);
60,02 (t); 54,98 (q); 24,99 (t); 14,29(q). MS
(LR-ESI) m/z 374 [M+H]+.
A una solución de
2,6-bis-[(dimetoxi)metil]-1,4-dihidroxipiridino-3,5-dicarboxilato
de dietilo (3,40 g; 9,10 mmol) en tolueno (200 ml) se le añadió
dióxido de manganeso activado (3,96 g; 45,5 mmol) y la mezcla
resultante fue calentada a reflujo por espacio de dos horas. En
este momento, se añadieron otros 3,96 g(45,5 mmol) de
dióxido de manganeso activado y se continuó con el reflujo durante
un período adicional de 2 horas. Se dejó enfriar la reacción a
temperatura ambiente, se filtró a través de celita y se concentró
para proporcionar 3,10 g (92% de rendimiento) de
2,6-bis[(dimetoxi)metil]-3,5-piridinodicarboxilato
de dietilo, en forma de aceite incoloro: ^{1}H NMR (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 8,29 s, 1H); 5,93 (s, 2H); 4,40 (q, J= 7,2 Hz,
4H); 3,48 (s, 12H); 1,41 (t, J=72 Hz, 6H). ^{13}C NMR (75 MHz,
CDCl_{3}) dc 165,68(s); 156,25(s); 138,52(d);
126,59(d); 101,26(d); 61,50(t);
54,08(q); 13,75(q). MS (LR-CI) m/z 372
[M+H]+.
A una solución de
2,6-bis[(dimetoxi)metil]-3,5-piridinodicarboxilato
de dietilo (4,40 g; 11,9 mmol) en THF (80 mL) se le añadió HCL 2N
(80 mL) y la mezcla resultante fue calentada a reflujo a 50ºC
durante 30 minutos. En este momento la mezcla de reacción fue
tratada de nuevo con THF (80 mL) y HCl 2N (80 ml). Una vez
transcurridas un total de 1,5 horas, la TLC indicaba que la
reacción se había completado (10/1 CHCl_{3}/MeOH). La mezcla fue
enfriada y diluida con agua (1L). El pH era de 0,94 y fue por tanto
ajustado a 4,5 con NaHCO_{3}. La mezcla fue extraída con EtOAc (2
x 300 ml) y los extractos combinados secados (MgSO_{4}), filtrados
y concentrados para proporcionar 1,78 g de
3,5-bis(etoxicarbonil)-2,6-piridinodicarboxaldehido,
en forma de aceite de color amarillo: ^{1}H NMR (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 10,42 (s, 2H); 8,49 (s, 1H); 4,57 (q, J= 7,2
Hz, 4H); 1,51 (t, J= 7,2 Hz, 6H). ^{13}C NMR (75 MHz, CDCl_{3})
dc 189,83(s); 164,67(s); 152,17; 138,75; 130,64;
63,11(t); 13,90(q); MS(LR-CI)
m/z 280 [M+H]+.
En un matraz de 500 mL se suspendió
tetrahidrocloruro de
N,N'-Bis{(1R,2R)-[2-(amino)]ciclohexil}-1,2-diaminoetano
(860 mg; 2,15 mmol) en etanol(30 mL) y se trató con KOH
sólido (502 mg de 89%, 8,00 mmol) y la mezcla resultante fue
sometida a agitación a 52ºC (temperatura del baño) durante 20
minutos. En este momento, se añadió MnCl_{2} (264 mg; 2,10 mmol),
de una sola vez. Una vez ranscurridos 5 minutos, se añadió
3,5-bis(etoxicarbonil)-2,6-piridinodicarboxialdehido
(930 mg de material que fue estimado ser puro en un 65%,
aproximadamente 2,10 mmol) y la mezcla resultante fue sometida a
reflujo por espacio de 16 horas. Una vez transcurrido este período,
el producto de plantilla manganeso (II)
dicloro(etil-3,10,13,20,26-pentaaza-25-(etoxicarbonil)tetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),2,20,22(23),24-pentaeno-23-carboxilato)
de color rojo-naranja fue observado en la mezcla de
reacción etanolica, como el único producto significativo: MS
(LR-FAB)m/z 443 [M-Cl]+. HPLC
(Vydac proteína 218TP54 y péptido C18; 80% H_{2}O con
0,1%TFA/20%Acetonitrilo; flujo=1ml/min; 5 ml iny. vol.) TR=3,19
min. Esta mezcla fue utilizada directamente en el siguiente
paso.
La mezcla de reacción etanólica procedente del
paso D anterior fue tratada (con precaución), en atmósfera de
argón, con Pd (negro) (500 mg), 10% de Pd(C) (350 mg) y
formiato amónico (1,6 g). La mezcla resultante fue calentada a
reflujo, en atmósfera de argón, durante un período de 2 horas. La
HPLC (Vydac proteína 218TP54 y péptido C18; 70% H_{2}O con
0,1%TFA/30% Acetonitrilo; flujo= 2 ml/min; 5 ml iny. vol.),
efectuada en este momento mostraba únicamente producto. La mezcla
de reacción fue enfriada y filtrada a través de un filtro de celita
de 1 pulgada, cuidadosamente bajo una protección de argón. El
filtrado fue concentrado y purificado mediante cromatografía en
columna flash (SiO2, 210:1 CHCl_{3}/metanol seguido de 100:1
CHCl_{3}/metanol), para proporcionar 450 mg de manganeso (II)
dicloro(etil-3,10,13,20,26-pentaaza-25-(etoxicarbonil)tetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trien-23-carboxilato,
en forma de espuma de color amarillo: MS (HR-ESI)
m/z 591,2386 [M-Cl]+ (591,2384 calc. para
C_{27}H_{43}N_{5}O_{4}Cl). La HPLC (Vydac proteína 218TP54
y péptido C18; 70% H_{2}O con 0,1% TFA/30% acetonitrilo; flujo= 2
ml/min; 5 ml iny. vol.) TR= 5,05 min (pureza del 97,3%).
Ciclohexanocarboxaldehido (11,22 g; 100 ml) y
4,4-dimetoxi-3-oxo-butirato
de etilo (38,04 g; 200 mmol) fueron rápidamente añadidos a acetato
amónico acuoso (310 mL- solución 10%, 30,83 g, 400
mmol). Se añadió etanol(60 mL) y la reacción fue calentada a
80ºC en un baño de aceite por espacio de 16 horas. La mezcla fue
extraída con cloruro de metileno (3 x 500 mL). La fase orgánica fue
secada sobre MgSO_{4}, filtrada y evaporada para proporcionar
41,1 g de
4-ciclohexil-2,6-bis(dimetoximetil)-1,4-dihidropiridin-3,5-dicarboxilato
de dietilo, en forma de aceite. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta
7,71 (s, 1H); 5,93 (s, 2H); 4,20-3,27 (m, 17H)
1,60-0,80 (m, 16H); ^{13}C NMR (CDCl_{3})
\delta 167,58; 143,62; 103,43; 98,75; 60,00; 54,70; 51,21; 44,57;
3,20; 28,88; 26,62; 14,32.
A una solución de
4-ciclohexil-2,6-bis(dimetoximetil)-1,4-dihidropiridino-3,5-dicarboxilato
de dietilo (30,7 g; 67,54 mmol) en acetona (450 mL) se le añadió
una solución de nitrato amónico cérico (75,05 g; 135,08 mmol) en
agua (125 mL), de forma bastante rápida, a temperatura ambiente.
Después de ser sometida a agitación durante un período de 10
minutos, la solución resultante fue concentrada para extraer la
acetona. Se añadió agua (300 mL) y la mezcla fue extraída con
CH_{2}Cl_{2} (3x500 mL). La fase orgánica fue lavada con
salmuera (600 mL), secada (MgSO_{4}) y evaporada, para
proporcionar 29,23 g de
4-ciclohexil-2,6-bis(dimetoximetil)piridino-3,5-dicarboxilato
de dietilo, en forma de aceite. El aceite fue sometido a
cromatografía sobre gel de sílice, utilizando mezclas de
hexano/acetato de etilo, para proporcionar material en forma de
manchas únicas: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 5,37 (s, 2H) 4,32
(q, J=7,2 Hz, 4H) 3,33 (s, 12H); 2,4-2,6 (m,1H)
1,0-1,8 (m, 16H); ^{13}C NMR (CDCl_{3})
\delta 167,79; 153,25; 151,44; 128,68; 104,01; 61,51; 54,41;
52,18; 44,41; 31,10; 27,19; 25,85; 14,04; MS
(HR-ESI) m/z 460,2534 [M+Li]+ (460,2523 calc. para
C_{23}H_{35}NO_{8}Li). Anal. Calcd. Para
C_{23}H_{35}NO_{8}: C 60,91; H 7,78; N 3,09; Encontrado: C
60,34; H 7,60; N 3,04.
Una solución de
4-ciclohexil-2,6-bis(dimetoximetil)piri-dino-3,5-dicarboxilato
de dietilo (4,8 g; 10,58 mmol) en 1:4 HCl concentrado: ácido
acético (1,5L) fue sometida a agitación durante un período de 16
horas, a temperatura ambiente. La reacción fue evaporada y
coevaporada con agua (500 mL) para proporcionar 3,21 g de
8-aza-6,10-dihidroxi-5,11-dioxatriciclo[7.3.0.0^{3,7}]dodeca-1(9),2,7(8)-trien-4,12-diona,
en forma de producto sólido de color canela. ^{1}H NMR (DMSO)
\delta 8,8 (bs,2H); 6,75 (m, 2H); 4,16-4,24 (m,
1H); 1,2-2,37 (m, 10H). ^{13}C NMR (DMSO) \delta
172,70; 166,14; 160,27; 120,48; 96,75; 36,84; 28,87; 28,80; 28,74;
26,45; 25,41. MS m/z (intensidad relativa) 306 [(M+H)+, 100]. MS
(HR-ESI, ión negativo) m/z 304,0830
[M-H]-(304,0821 calc. para
C_{15}H_{14}NO_{6}).
A una suspensión de tetrahidrocloruro de
N,N'-Bis{(1R,2R)-[2-amino)]ciclohexil}-1,2-diaminoetano
(4,01 g; 10,01 mmol) en etanol (100 mL) se le añadió hidróxido
potásico (2,83 g; 50,54 mmol). La reacción fue sometida a agitación
durante un período de 30 minutos a temperatura ambiente y se le
añadió MnCl_{2} (1,26g; 10,01 mmol). La reacción fue sometida a
agitación durante período de 30 minutos adicionales a temperatura
ambiente. Se le añadió una solución de
8-aza-6,10-dihidroxi-5,11-dioxatriciclo[7.3.0.0^{3,7}]dodeca-1(9),2,7(8)-trieno-4,12-diona
(3,21 g; 10,51 mmol) en etanol (90 mL) y la reacción fue sometida a
reflujo durante un período de 16 horas. En este momento, los
análisis mediante HPLC mostraban únicamente el producto plantilla
Manganeso(II)dicloro(3,10,13,20,26-pentaaza-24-ciclohexil-tetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26(2,20,22(23),24-pentaeno-23,25-diamonio
carboxilato)]: HPLC (proteína 218TP54 Vydac y péptido C18; 80%
H_{2}O con 0,1%TFA/20% acetonitrilo; flujo=2 ml/min; 10 ml iny.
vol.) TR= 3,85 min. La reacción fue enfriada a temperatura ambiente,
pasando directamente al siguiente paso.
La solución etanólica de color rojo naranja
procedente el paso D fue diluida con agua (200 mL). Se le añadió
paladio negro (5 g) y formiato amónico (10 g) y la reacción fue
sometida a reflujo durante un período de 3 horas. La reacción fue
enfriada a temperatura ambiente, filtrada a través de celita y el
pastel lavado con agua (500 mL) y etanol (500 mL). El filtrado fue
evaporado para proporcionar 10g de
Manganeso(II)dicloro(3,10,13,20,26-pentaaza-24-ciclohexiltetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno-23,25-diamonio
carboxilato). HPLCMS, m/z 695,4 [M-2Cl+TFA+.
A una suspensión de
manganeso(II)dicloro(3,10,13,20,26-pentaaza-24-ciclohexiltetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno-23,25-diamonio
carboxilato) (0,65 g; 0,93 mmol) en DMF (15 mL) se le añadió yoduro
de etilo (1,49 g; 9,3 mmol) y la reacción fue sometida a agitación
durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción fue
concentrada y el resto dividido entre salmuera (50 mL) y acetato de
etilo (50 mL). La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), filtró y
evaporó para proporcionar 0,7 g del material crudo, el cual fue
sometido a cromatografía sobre gel de sílice utilizando 100:1
CHCl_{3}/etanol para purificar el
manganeso(II)dicloro(etil3,10,13,20,26-pentaaza-24-ciclo-hexil-25-etoxicarbonil)tetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno-23-carboxilato9]:
MS (HR-ESI) m/z 673,3176
[M-Cl]^{+} (673,3167 calcl. para
C_{33}H_{53}N_{5}O_{4}MnCl). Una muestra fue recristalizada
como hidrato a partir de THF
acuoso/t-butil-metil-éter. Anal.
Calcl. Para C_{33}H_{53}N_{5}O_{4}MnCl_{2} [H_{2}O] 1,5:
C 53,80; H 7,66; N 9,51; Cl 9,62. Encontrado: C 53,90; H 7,68; N
9,30; Cl 9,40.
A una suspensión de
Manganeso(II)dicloro(3,10,13,20,26-pentaaza-24-ciclo-hexiltetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno-23,25-diamonio
carboxilato), descrita en el Ejemplo 9, (6,62 g; 9,49 mmol) en DMF
(132 mL) ase le añadió yoduro de metilo (13,47 g; 94,9 mmol) y la
reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante un
período de 16 horas. La reacción fue concentrada y el resto
dividido entre salmuera (150 mL) y acetato de etilo (150 mL). La
capa orgánica fue secada (MgSO_{4}), filtrada y evaporada para
proporcionar 1,1 g de material crudo, el cual fue cromatografiado
sobre gel de sílice utilizando 100:1 CHCl_{3}:metanol para dar
manganeso(II)dicloro(metil3,10,13,20,26-pentaaza-24-ciclo-hexil-25-tetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa1(26),22(23),24-trieno-23-carboxilato)]
puro. MS (HR-ESI) m/z 645,2896
[M-Cl]^{+} (645,2896 calc. para
C_{31}H_{49}N_{5}O_{4}MnCl).
A un matraz de fondo redondo (200 mL) se le
añadió
manganeso(II)dicloro-(4R,9R,14R,19R)-(3,10,13,20,26-pentaaza-24-bromotetraciclo[20.3.1.0^{4,9}.0^{14,19}]hexacosa-1(26),22(23),24-trieno
(2,09; 3,56 mmol)(Compuesto 23) y carbonato de cesio (1,62 g; 0,267
mmol), acetato de paladio (0,060g; 0,267 mmol) y
S-2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo
(0,155 g; 0,249 mmol), seguido de dioxano (30 mL). Se añadió
piridina (0,36 g; 4,26 mmol), se inertizó el sistema (nitrógeno) y
se calentó la mezcla de reacción a 105ºC. Una vez sometida a
agitación durante el transcurso de una noche, se añadió acetato de
paladio adicional (0,028 g; 0,124 mmol) y
S-2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo
(0,080 g; 0,124 mmol). Al término de la reacción, determinada por
medio de la ausencia de complejo bromo de partida, la mezcla de
reacción fue enfriada a temperatura ambiente, filtrada y se extrajo
el disolvente a presión reducida. El resto fue dividido entre agua
(60 mL) y diclorometano (150 mL). Las capas fueron separadas y la
capa acuosa lavada con diclorometano (50 mL). Las capas de
diclorometano combinadas fueron sometidas a agitación con solución
de cloruro sódico saturada (50 ml), se separó la capa orgánica y fue
sometida de nuevo a agitación con otro volumen de solución de
cloruro sódico. Después de secado (sulfato magnésico) y filtración,
se extrajo el disolvente a presión reducida La cromatografía fue
realizada sobre gel de sílice, eluyendo con entre 2% y 4% de metanol
en diclorometano. Las fracciones 77 a 100 fueron combinadas y
tratadas con dicloruro de manganeso en tres partes (0,053 g; 0,152
g y 0,53 g) en dioxano, durante tres días a 45ºC, debido a la
existencia de evidencias de que se encontraba presente el ligando
libre. Después de la última adición, la mezcla de reacción fue
sometida a reflujo durante el transcurso de una noche. Tras enfriar
a temperatura ambiente y filtrar, se extrajo el disolvente en
condiciones de presión reducida. El resto fue disuelto en
diclorometano (50 mL) y sometido a agitación con cloruro sódico
acuoso saturado. Las capas fueron separadas y se extrajo el
disolvente en condiciones de presión reducida, purificándose el
resto por medio de cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con
99/1 diclorometano/etanol, 0,073g, (0,129 mmol, rendimiento 3,6%).
HRMS ((electrospray) (M^{+}-Cl), calculado para
C_{26}H_{44}O_{35}ClN_{6}Mn, 530,2697; encontrado 530,2709;
calcul. Para C_{26}H_{44}O_{37}ClN_{6}Mn, 532,2667;
encontrado, 532,2679.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de fondo redondo de cuatro bocas,
de dos litros de capacidad, se suspendió
N,N'-bis{(1R,2R)-[2-(amino)]ciclohexil}-1,2-diaminoetanotetrahidrocloruro
(10,88 g; 27,22 mmol) en etanol absoluto (500 mL) y se sometió a
agitación a temperatura ambiente mientras se añadía hidróxido
potásico en polvo (6,94 g; 123,65 mmol). Transcurrida una hora, se
añadió dicloruro de manganeso (3,42 g; 27,2 mmol) y se sometió la
mezcla de reacción a agitación por espacio de 0,5 horas, a
temperatura ambiente. Se añadió
3-benciloxi-5-cloropiridino-dicarboxaldehido
(7,5 g; 27,2 mmol) junto con etanol (200 mL) y la mezcla de
reacción fue sometida a reflujo durante el transcurso de una noche.
Tras enfriar a temperatura ambiente, se añadió metanol (175 mL). La
mezcla de reacción fue enfriada hasta aproximadamente
-5ºC y se añadió borohidruro sódico (3,30 g; 87,2 mmol) en pequeñas
porciones, para controlar la formación de espuma. La mezcla de
reacción fue dejada calentarse lentamente hasta temperatura ambiente
durante el transcurso de una noche. Después de la eliminación del
disolvente en condiciones de presión reducida, se dividió el
producto crudo entre agua (100 mL) y diclorometano (300 mL). La
capa orgánica fue lavada con cloruro sódico saturado (2 x 80 mL).
La capa acuosa fue lavada con diclorometano (2 x 100 mL). Las capas
orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato magnésico y
filtradas. El disolvente fue extraído en condiciones de presión
reducida. La cromatografía sobre sílice, eluyedo con diclorometano
puro, variando gradualmente (en incrementos del 0,1%) hasta el 96%
diclorometano/4% metanol, proporcionó el producto puro, 6,95 g;
11,13 mmol, rendimiento 41,0%. HRMS (electrospray)
(M^{+}-Cl) calc. para
C_{28}H_{40}MnN_{5}O^{35}Cl_{2}, 587,1990; encontrado
587,2000; calcl. Para C_{28}H_{40}MnN_{5}O^{37}Cl_{2},
589,1961; encontrado 589,1983.
\vskip1.000000\baselineskip
Emulsión aceite en agua,
porcentajes en
peso
| Imitador SOD | 0,25 |
| Polietilenglicol polioxietilenado con 50 moles de óxido de etileno | 1,50 |
| Monoestearato de diglicerilo | 1,50 |
| Parafina líquida | 24,00 |
| Alcohol cetilo | 2,50 |
| Trietanolamina | Hasta pH 7,0 |
| Agua | Equilibrio 100% |
Emulsión agua en aceite,
porcentajes en
peso
| Imitador SOD | 0,25 |
| Sesquiisoestearato de poliglicerilo | 4,0 |
| Cera de abaja blanca | 0,5 |
| Estearato de magnesio | 1,5 |
| Estearato de aluminio | 1,0 |
| Aceite de ricino hidrogenado, | |
| Polioxietilenado (con 7 moles de Óxido de etileno) | 3,0 |
| Palmitato de isopropilo | 10,0 |
| Perhidroescualeno | 15,0 |
| Agua | Equilibrio 100% |
\vskip1.000000\baselineskip
Ratas Sprague-Dawley macho
(175-200 g, Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, IN,
USA) fueron alojadas y cuidadas según las indicaciones del
Institutional Animal Care and Use Comitteee y según las guías del
NHI relativas al bienestar de los animales de laboratorio. Las
ratas recibieron una inyección subplanar de carragenina (0,1 ml de
suspensión al 1% en solución salina 0,85%) en la pata trasera. El
volumen de la pata fue medido utilizando un pletismómetro
(Ugo-Basile, Varese, Italia), inmediatamente antes
de la inyección de la carragenina y con posterioridad a intérvalos
horarios de hasta 6 horas. Se expresó el edema como el incremento en
el volumen de la pata (ml) posterior a la inyección de carragenina,
en relación con el valor anterior a la inyección para cada uno de
los animales. Los fármacos fueron administrados por vía intravenosa
(iv), en un volumen de 2,5 ml/kg, 30 min. antes o al menos 3 horas
después de la inyección de carragenina. Una respuesta hiperalgésica
al calor fue determinada en los mismos animales a través del
procedimiento de Hargreaves (Hargreaves et al., 1988). Las
ratas fueron confinadas y aclimatadas individualmente en cámaras de
plexiglás por espacio de 30 minutos. Una unidad móvil, consistente
en un bulbo proyector de elevada intensidad fue ubicado para
suministrar un estímulo térmico directo en una pata trasera
individual, desde debajo de la cámara. El período de latencia de
retirada de las patas traseras inyectadas y de las patas
contralaterales fue determinado como el más próximo a 0,1 seg, con
un circuito de reloj electrónico y un termopar. Si el animal no
respondía a los 20 seg., la prueba se daba por finalizada. Cada uno
de los puntos representa la modificación en la latencia de retirada,
en comparación con las mediciones control efectuadas con
anterioridad a la inyección de carragenina.
La inyección intraplanar de carragenina en ratas
se traducía en un incremento en el volumen de pata en función del
tiempo y en hiperalgesia, que resultaba máximo una vez transcurridas
3-6 horas. Tal como se muestra en las Figuras
4-8, diversos imitadores SOD administrados por vía
iv 15 minutos antes de la inyección de carragenina, inhibían el
edema. Cuando los imitadores SOD fueron suministrados
terapéuticamente en el momento de máxima hiperalgesia (es decir,
tres horas después de la administración de carragenina), los mismos
inhibieron la respuesta hiperalgésica de forma máxima, con un
inicio de acción muy rápido (inicio de acción 5 min.), tal como se
muestra en las siguientes tablas (SE= efectos adversos
cardiovasculares observados, ND= no determinado):
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Se permitió que ratones CD-1
macho (Charles Rive, 28-35 gm) se alimentaran a
voluntad. Los ratones fueron alojados 5-7 por caja
en una habitación con temperatura controlada, con un ciclo de
luz-oscuridad de 12 horas. Los umbrales
nocirreceptores fueron medidos estableciendo una comparación las
latencias de retirada de pata trasera sobre una placa caliente
(Modelo 35, IITC Inc, Woodland Hills, CA) se mantuvo a 57ºC. Los
ratones fueron colocados sobre la superficie calentada, acompañada
de un cilindro de vidrio transparente de 25 cm de altura y 15 cm de
diámetro. Las respuestas de latencia fueron notificadas en función
del numero de veces de levantamiento intermitente o de lamedura de
las patas traseras. Para evitar daños en el tejido en animales que
no ofrecían respuesta, de utilizó una latencia de corte de 20
segundos. La determinación de la nocirrecepción fue valorada entre
las 7:00 y las 10:00 AM. Los grupos consistían en
7-14 ratones y cada uno de los animales fue
utilizado para una dolencia experimental. Los ratones fueron
convertidos en tolerantes mediante inyecciones subcutáneas de
morfina dos veces al día (2 x 10 mg/kg día), durante un período de
cuatro días, tal como se pone de evidencia por una disminución en
la respuesta antinocirrecptora a una dosis de provocación de 3
mg/kg de morfina al quinto día. La latencia a los 3,0 mg/kg de
morfina en ratones no sometidos a experimentación anteriormente
oscilaba entre 11-13 seg., 50 segundos después de la
inyección y se le asigno una señal antinocirreptora máxima del
100%. La morfina fe obtenida en Mallinckrorlt (St. Louis). Los
fármacos fueron disueltos en solución salina con la excepción del
imitador SOD, el cual fue disuelto en bicarbonato sódico (26 mM, pH
8,3). Los volúmenes de inyección eran de 0,01 mL/gm de peso
corporal.
A la latencia para los ratones no sometidos a
experimentación con anterioridad (5,4 \pm 0,7 seg.) se la
denominó como 0% de analgesia. La latencia para los ratones no
sometidos anteriormente a experimentación después de la
administración de 3 mg/kg de morfina (10,4 \pm 0,8 seg.) se la
denomino del 100%. Ver las tablas que se indican seguidamente IV
ADMINISTRACIÓN y ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA. Los ratones tolerantes
mostraban latencias de 6,8 \pm 0,7 seg, tras la administración de
3 mg/kg de morfina, según medición efectuada al quinto día (momento
en el que fue observada a tolerancia). En el quinto día, los
imitadores SOD (mg/kg) fueron inyectados 5 min (estudios iv) y 40
min. (estudios sc) antes de la administración de la morfina y la
antinocirrecepción se midió 5 minutos más tarde. Para cada una de
las dosis se utilizaron entre 9 y 20 ratones. Tal como puede
observarse en las tablas que siguen a continuación, los imitadores
SOD atenuaban el desarrollo de la tolerancia a la analgesia por
morfina de una forma que dependía de la dosis (ver tabla mostrada
más adelante). Los imitadores SOD no provocaban antinocirrecepción
en ratones no sometidos a experimentación con anterioridad,
indicando que, a las dosis utilizadas, no se comportaban como
analgésicos de tipo opioide.
\newpage
IV Administración
(Imitador SOD,
mg/Kg)
\vskip1.000000\baselineskip
Administración subcutánea
[Imitador SOD,
mg/kg]
\vskip1.000000\baselineskip
Ratas Sprague-Dawley macho
(175-200 g, Harlan Spraguey Dawley, Indianapolis,
IN, USA) fueron alojadas y cuidadas según las guías del
Institutional Animal Care y Use Committee y según las guía NIH sobre
el bienestar de los animales de laboratorio. Las ratas fueron
anestesiadas con inactina (100 mg/kg, intraperitonealmente). La
tráquea fue canulada para facilitar la respiración y la temperatura
corporal se mantuvo a 37ºC por medio de una almohadilla de
calentamiento durante la duración total del experimento (9 horas).
La vena femoral izquierda fue canulada para la administración de
fármacos. Después de un período de estabilización de 30 minutos, se
administró lipopolisacárido procedente de E. Coli (LPS; 4
mg/kg, serotipo 0111:B4) en forma de bolus de inyección intravenosa
(i.v.), a un volumen de 0,3 ml y se monitorizó la presión arterial
promedio/frecuencia cardíaca por espacio de 9 horas. Los animales
control recibieron solución salina isotónica con el mismo volumen y
a través de la misma ruta. 1,3 ó 5 horas después del LPS, el
imitador SOD o el vehículo (tampón bicarbonato sódico 26 mM; pH
8,3) fueron administrados por infusión durante un período de 6
horas.
El LPS (4 mg/kg, serotipo 0,111:B4) condujo a
una profunda caída en la presión sanguínea asociada con una elevada
tasa de mortalidad (mortalidad 99 \pm 5% a las 9 horas, n=10). La
administración del Compuesto A a 0,25 mg/kg/h evitó el desarrollo
de la hipotensión (Ver Fig. 1) y reducía enormemente la mortalidad
(mortalidad del 20% a las 9 h, n= 10). Cuando el Compuesto 25 (0,07
mg/kg/h) fue administrado como infusión iv, tres horas después del
LPS, a lo largo de la duración del protocolo experimental, se
evitaron completamente el desarrollo posterior de la hipotensión
(Ver Fig. 2) y la tasa de mortalidad (mortalidad del 0% a las 9 h,
n= 10). Se obtuvieron resultados similares con el Compuesto 31 (Ver
Fig. 3). Por lo tanto, con menos imitador SOD se obtuvieron
resultados mejorados cuando se utilizan los compuestos.
Ratas Sprague-Dawley macho
(300-350 g; Charles River; Milan; Italia) fueron
alojadas en un entorno controlado y se les proporcionó alimento y
agua habitual para roedores. El cuidado de los animales estaba de
acuerdo con la normativa italiana sobre protección de animales
utilizados para fines experimentales y otros fines científicos
(D.M. 116192), al igual que con los reglamentos CEE (O.J. de E.C. L
358/1 12/18/1986). Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano y
se les practicó una incisión en la piel al nivel del espacio
intercostal sexto izquierdo. El músculo subyacente fue diseccionado
y se inyectó solución salina (0,2 ml) o solución salina conteniendo
1% de \lambda-carragenina (0,2 ml), inyectada en
el interior de la cavidad pleural. La incisión en la piel fue
cerrada con sutura y se permitió que el animal se recuperase. El
compuesto 16, el compuesto 31 y el compuesto 25,
(0,5-20 mg/kg, según lo indicado), o un volumen
equivalente (0,3 ml) de vehículo (tampón bicarbonato sódico 26 mM,
pH 8,1-8,3), fue inyectado intraperitonealmente
(i.p.), 15 minutos antes que la carragenina. Cuatro horas antes de
la inyección de la carragenina, los animales fueron sacrificados por
inhalación de CO_{2}. El tórax fue cuidadosamente abierto y la
cavidad pleural enjuagada con 2 ml de solución salina que contenía
heparina (5 U/ml) e indometacina (10 \mug/ml). El exudado y la
solución de lavado fueron extraídas por medio de aspiración y se
midió el volumen total. Se descartó el exudado que estuviera
contaminado con sangre. La cantidad de exudado fue calculada
sustrayendo el volumen inyectado (2 ml) del volumen total
recuperado. Los leucocitos en el exudado fueron suspendidos en
solución salina tampón fosfato (PBS) y sometidos a contaje con un
microscopio óptico en una cámara Burker, tras teñido vital con
Tryptan Blue. La medición de la actividad mieloperoxidasa en tejido
pulmonar y malondialdehído. La actividad de la mieloperoxidasa
(MPO), una hemoproteína localizada en gránulos azurófilos de
neutrófilos, ha sido utilizada como un marcador bioquímico para
infiltración neutrófila en tejidos (Bradley et al., 1982).
En el presente estudio, la MPO fue medida fotométricamente a través
de un procedimiento similar al descrito anteriormente (Laight et
al., 1994). A las cuatro horas de la aplicación de la inyección
intrapeural de carragenina, se obtuvieron y pesaron los tejidos
pulmonares. Cada uno de los trozos de tejido fue homegeneizado en
una solución que contenía 0,5% de bromuro de
hexadecil-trimetil-amonio,
disueltos en tampón fosfato potásico 10 mM (pH 7) y se centrífugo
por espacio de 30 min. A 20,000 x g a 4ºC. Se dejó que una alícuota
de sobrenadante reaccionase con una solución de tetrametilbencidina
(1,6 mM) y H_{2}O_{2} 0,1 mM.
La velocidad de cambio en la absorbancia fue
medida espectrofotométricamente a 650 nm. Se definió la actividad
de la MPO como la cantidad de enzima que degradaba 1 \mumol de
peróxido/min a 37ºC y se expresó en miliunidades por 100 mg en peso
de tejido húmedo. Los niveles de malonaldehído (MDA) en el tejido
pulmonar fueron determinados como indicador de peroxidación de
lípidos (Okhawa et al., 1979). El tejido pulmonar, recogido
en el momento especificado, fue homogeneizado en una solución de
KCl 1,15%. A una mezcla de reacción que contenía 200 \mul de
(8,1% de SDS; 1500 \mul de ácido acético al 20% (pH 3,5); 1500
\mul de ácido tiobarbitúrico al 0,8% y 700 \mul de agua
destilada, se le añadió una alícuota (100 \mul) del homogenado.
Las muestras fueron después hervidas por espacio de 1 hora a 95ºC y
se centrifugaron a 3000 x g, durante 10 minutos. Se midió la
absorbancia del sobrenadante a través de espectrofotometría, a 650
nm.
La inyección de carragenina en la actividad
pleural de las ratas provocó una respuesta inflamatoria aguda
caracterizada por: acumulación de fluido en la actividad pleural que
contenía un gran número de neutrófilos (PMNs), infiltración de PMNs
en tejidos pulmonares (midiendo la mieloperoxidasa en el tejido
pulmonar, MPO) y la peroxidación de lípidos de membranas en el
tejido pulmonar (midiendo los niveles de malonaldehido en el tejido
pulmonar, MDA) y la inducción de la forma inducible de la sintasa de
óxido nítrico. El tratamiento de las ratas con el Compuesto 16, el
Compuesto 31 y el Compuesto 25, (0,5-20 mg/kg
proporcionada por inyección intraperitoneal, i.p. 15 min. Antes que
la carragenina, según se ha indicado), atenuaba todos los parámetros
de la inflamación. Los resultados se indican en la tabla que se
indica seguidamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, los resultados expuestos en la
tabla que sigue a continuación fueron obtenidos cuando el Compuesto
A fue administrado a las ratas a las dosificaciones indicadas. El
Compuesto A, tal como se ha indicado anteriormente, es el compuesto
de partida, no sustituido de los imitadores SOD comprobados en este
modelo de inflamación de pleuresía. Estos datos demuestran
claramente que los tres imitadores SOD muestran mejor comportamiento
antiinflamatorio que el compuesto de partida A, no sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujo un shock septicémico a través de la
inyección de bacterias E. Coli vivas (10^{10}) en ratas
crónicamente instrumentadas. Esto provoca una caída progresiva y
dependiente del tiempo en la presión arterial media (MAP), que
conduce a una mortalidad >90% de los animales dentro de las 24
horas siguientes (Caída de la MAP desde un valor base de 125 mmHg
pre-bacteria a 75 mmHg a las 6 horas y a 25 mmHg a
las 24 horas). El Compuesto 25, el Compuesto 3 y el Compuesto 28
fueron administrados mediante infusión durante un período de 6
horas, a razón de 0,25 mg/kg (dosis total= 1,5 mg/kg): la infusión
dio inicio a las 3 horas después de la inyección de E. Coli
viva, un momento en el que la totalidad de las ratas mostraba
señales de shock. Además, el Compuesto A fue sometido a infusión a
razón de 0,075 mg/kg/h ó 0,25 mg/kg/h, tres horas después de la
inyección de E. Coli viva, durante un período total de 6
horas. La solución salina fue administrada a las ratas como control
tres horas después de la inyección con E. Coli viva, durante
un período total de 6 horas. Las ratas fueron monitorizadas por
espacio de 24 horas, durante el cual se midió el MAP.
Adicionalmente, se monitorizó también la frecuencia cardíaca en
ratas tratadas con el Compuesto A. A la totalidad de animales se les
proporcionó antibióticos 30 minutos y 9 horas después de la
administración de E. Coli viva.
El Compuesto 25, el Compuesto 3 y el Compuesto
28 evitaban completamente la caída de la MAP a lo lago del
transcurso del experimento (la MAP a las 24 horas era de
aproximadamente 125 mmHg, es decir, similar a los valores de base).
Adicionalmente, las Figuras 9a y 9b muestran que la reanimación
fluida de la infusión salina resultaba suficiente para evitar la
caída de la MAP de las ratas control durante el transcurso de las 9
primeras horas de experimento. No obstante, poco después de la
parada de esta infusión, la MAP de estas ratas cayó drásticamente
dando como resultado una tasa de mortalidad del 77% a las 24 horas.
Por el contrario, aquellas ratas tratadas con el Compuesto A a
razón de 25 mg/Kg/h (Figura 9a) quedaron protegidas frente a esta
caída en la MAP y redujeron de manera significativa la tasa de
mortalidad a las 24 horas. Por consiguiente, el tratamiento de las
ratas con los imitadores SOD de la invención evitaba completamente
la hipotensión asociada con el shock septicémico.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
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Claims (9)
1. Ligando orgánico macrocíclico que tiene la
siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que un nitrógeno del
macrociclo y los dos átomos de carbono adyacentes a los que está
unido independientemente forman un heterociclo W insaturado
sustituido que contiene nitrógeno y que tiene de 2 a 20 átomos de
carbono, que puede ser un heterociclo aromático, en cuyo caso el
hidrógeno unido al nitrógeno que forma parte tanto del heterociclo
como del macrociclo y los grupos R unidos a los átomos de carbono
que forman parte tanto del heterociclo como del macrociclo, están
ausentes;
en la que R, R_{1}, R_{2}, R'_{2},
R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R'_{4}, R_{5}, R'_{5}, R_{6},
R'_{6}, R_{7}, R'_{7}, R_{8}, R'_{8}, R_{9} y R'_{9}
representan, independientemente, hidrógeno o radicales alquilo,
alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo,
cicloalquilalquilo, cicloalquilcicloalquilo, cicloalquenilalquilo,
alquilcicloalquilo, alquilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo,
alquenilcicloalquenilo, heterocíclicos, arilo y aralquilo
sustituidos o no sustituidos; y,
opcionalmente, uno o más de R_{2} o R'_{2} y
R_{3} o R'_{3}, R_{4} o R'_{4} y R_{5} o R'_{5},
R_{6} o R'_{6} y R_{7} o R'_{7}, o R_{8} o R'_{8} y
R_{9} o R'_{9}, conjuntamente con los átomos de carbono a los
cuales están independientemente unidos forman un heterociclo,
sustituido o no sustituido, que contiene nitrógeno y que tiene
entre 2 y 20 átomos de carbono, el cual puede ser un heterociclo
aromático, en cuyo caso el hidrógeno unido al nitrógeno que forma
parte tanto del heterociclo como del macrociclo y los grupos R
unidos a los átomos de carbono que forman parte tanto del
heterociclo como del macrociclo, están ausentes; y,
opcionalmente, uno o más de R_{2} y R'_{2},
R_{3} y R'_{3}, R_{4} y R'_{4}, R_{5} y R'_{5}, R_{6}
y R'_{6}, R_{7} y R'_{7}, R_{8} y R'_{8}, y R_{9} y
R'_{9}, conjuntamente con el átomo de carbono al que están unidos
forman, independientemente, un anillo cíclico o heterocíclico
saturado, parcialmente saturado o insaturado, que tiene entre 3 y
20 átomos de carbono; y
opcionalmente, uno de R, R_{1}, R_{2},
R'_{2}, R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R'_{4}, R_{5}, R'_{5},
R_{6}, R'_{6}, R_{7}, R'_{7}, R_{8}, R'_{8}, R_{9} y
R'_{9}, conjuntamente con uno diferente de R, R_{1}, R_{2},
R'_{2}, R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R'_{4}, R_{5}, R'_{5},
R_{6}, R'_{6}, R_{7}, R'_{7}, R_{8}, R'_{8}, R_{9} y
R'_{9}, que está unido a un átomo de carbono diferente en el
ligando macrocíclico, puede estar unido para formar una banda
representada a través de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
-(CH_{2})_{x}-M-(CH_{2})_{w}-L-(CH_{2})_{z}-J-(CH_{2})_{y}-
\vskip1.000000\baselineskip
en la que w, x, y y z son,
independientemente, números enteros entre 0 y 10 y M, L y J se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo,
alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, alquilarilo,
alquilheteroarilo, aza, amida, amonio, oxa, tia, sulfonilo,
sulfinilo, sulfonamida, fosforilo, fosfinilo, fosfino, fosfonio,
ceto, éster, alcohol, carbamato, urea, tiocarbonilo, boratos,
boranos, boraza, sililo, siloxi, silaza y combinaciones de los
mismos; y combinaciones de cualquiera de los indicados
anteriormente.
\newpage
2. Ligando según la reivindicación 1, que se
describe según la fórmula:
en la que U y V son estructuras
cíclicas saturadas que contienen entre 3 y 20 átomos de carbono y
forman un anillo cicloalquilo con los átomos de carbono del
macrociclo al cual están
unidos.
3. Ligando según la reivindicación 2, en el que
U y V son estructuras cíclicas saturadas que contienen entre 4 y 10
átomos de carbono y forman un anillo cicloalquilo con los átomos de
carbono del macrociclo al cual están unidos.
4. Ligando según la reivindicación 2, en el que
U y V son anillos fusionados
trans-ciclohexanilo.
5. Ligando según la reivindicación 2, en el que
W es un grupo piridino sustituido.
6. Ligando según la reivindicación 2, en el que
U y V son anillos fusionados trans-ciclohexanilo y W
es un grupo piridino sustituido.
7. Ligando según la reivindicación 2, en el que
W es un grupo piridino sustituido con por lo menos un sustituyente
seleccionado del grupo que consiste en ciclohexilo y benciloxi.
8. Ligando según la reivindicación 2, en el que
W es un grupo piridino sustituido con por lo menos un sustituyente
seleccionado del grupo que consiste en ésteres alquílicos de ácido
2-tioacético y ésteres arílicos de ácido
2-tioacético.
9. Ligando según la reivindicación 2, en el que
W es un grupo piridino sustituido con por lo menos un sustituyente
seleccionado del grupo que consiste en hidroxilalquiltio,
metoxiariltio y alcoxicarbonilariltio.
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