ES2292182T3 - Compuestos heterociclicos y su empleo en la deteccion de acidos nuclecicos. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE COMPUESTOS DE FORMULA GENERAL (I), SIENDO LOS RADICALES R 1 HASTA R 7 LOS SIGNIFICADOS INDICADOS EN LA SOLICITUD, ASI COMO PROCEDIMIENTOS PARA SU PREPARACION. LOS COMPUESTOS SON EN PARTICULAR APROPIADOS COMO SUSTRATOS PARA POLIMERASAS DE RNA O DE DNA, Y POR TANTO SE PUEDEN INTRODUCIR EN LOS OLIGONUCLEOTIDOS DE RNA O DE DNA, Y SON APROPIADOS EN PARTICULAR PARA EL MARCADO Y PARA LA DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS O PARA LA SECUENCIACION DE DNA.
Description
Compuestos heterocíclicos y su empleo en la
detección de ácidos nucleicos.
La invención se refiere a compuestos
heterocíclicos, que pueden emplearse para el marcado, detección y
secuenciación de ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos tienen como portador o
respectivamente, como transmisor de la información genética, una
importancia capital en la Naturaleza viviente. Por este motivo,
desde su descubrimiento por F. Miescher, han despertado el más
amplio interés de las Ciencias Naturales y han conducido al
esclarecimiento de su función, estructura y forma de actuar.
Una herramienta esencial para el esclarecimiento
de estas relaciones y la solución de los problemas ha sido y es la
detección de los ácidos nucleicos, tanto lo que hace referencia a su
detección específica como también a su secuencia, a saber, su
estructura primaria.
La detectabilidad específica de los ácidos
nucleicos se basa en la propiedad de estas moléculas de entrar en
reciprocidad con otros ácidos nucleicos mediante la formación de
pares de bases unidos mediante puentes de hidrógeno, para
"hibridar". De manera adecuada, pueden emplearse ácidos
nucleicos marcados, es decir, provistos de grupos indicadores
("sondas"), para la detección de ácidos nucleicos
complementarios ("diana").
La determinación de la estructura primaria
("secuencia"), a saber la sucesión de bases heterocíclicas de
un ácido nucleico tiene lugar mediante la técnica de
"secuenciación". Este conocimiento de la secuencia es de nuevo
la condición fundamental para el empleo selectivo y específico de
los ácidos nucleicos en el planteamiento de cuestiones de biología
molecular y técnicas de trabajo. La secuenciación se sirve
finalmente también del principio de la hibridación específica de
los ácidos nucleicos entre sí. A este respecto, se emplean también,
como se ha dicho más arriba, fragmentos de ácidos nucleicos
marcados.
El adecuado marcado de los ácidos nucleicos es
también una condición indispensable de cualquier método de
detección.
Desde hace tiempo se ha empleado para ello ante
todo el marcado radiactivo con isótopos apropiados, como el
P^{32} ó el S^{35}. Los inconvenientes del empleo de reactivos
radiactivos son claramente evidentes: los trabajos correspondientes
necesitan instalaciones especiales espaciosas, autorizaciones
especiales, así como una evacuación controlada y costosa de los
residuos radiactivos. Los reactivos para el marcado radiactivo son
caros. Un almacenamiento largo en el tiempo, de esta clase de sondas
marcadas no es posible a causa del corto tiempo de media reacción
de los anteriores núclidos.
Por estos motivos no han faltado en estos
últimos años ensayos para solventar estas desventajas, es decir,
prescindir de un marcado radiactivo. A este respecto debe mantenerse
al máximo posible la alta sensibilidad de este tipo de marcado.
Se han logrado efectivamente grandes progresos
[véase p. ej., "Nonradioactive Labeling and Detection of
Biomolecules" ("Marcado no radiactivo y detección de
biomoléculas") Kessler, C., Hrsg.), editorial Springer, Berlin,
Heidelberg 1992].
Una condición indispensable de toda detección de
un ácido nucleico es el propio marcado previo. Como se ha indicado
más arriba es deseable que esto se logre de manera no radiactiva.
Durante el marcado radiactivo de los ácidos nucleicos por regla
general tiene lugar mediante la construcción enzimáticamente
catalizada del correspondiente nucleósidotrifosfato radiactivo, un
marcado no radiactivo se logra mediante la inserción de una señal
adecuada o grupo informador.
Como moléculas indicadoras no radiactivas se han
acreditado entre otros, principalmente los haptenos (como la
biotina o la digoxigenina), enzimas (como la fosfatasa alcalina o la
peroxidasa) o colorantes de fluorescencia (como la fluoresceína o
la rodamina). Estos grupos señalizadores pueden aplicarse por
distintos métodos a ó en los ácidos nucleicos.
Un procedimiento relativamente sencillo es p.
ej., el marcado en el extremo 5' de un oligonucleótido provisto de
una función amino en el extremo, mediante una molécula activada de
indicador del tipo indicado más arriba. Sin embargo, esto permite
solamente la introducción de una o pocas moléculas indicadoras en un
oligómero de bajo peso molecular, mientras que un marcado más denso
de ácidos nucleicos de alto peso molecular de cadena larga con el
objetivo de obtener una alta sensibilidad debe lograrse por regla
general mediante la introducción de
nucleósido-trifosfatos provistos de grupos
informadores mediante polimerasas en el sentido de una síntesis
de novo.
Estos procedimientos habituales son conocidos
por el experto como "nick translation" ("desplazamiento de la
mella") [Rigby, P.W. et al. (1977) J. Mol. Biol.. 113,
237] y "random primed labeling" ("marcado encebado al
azar") [Feinberg, A. P. & Vogelstein, B. (1984) Anal.
Biochem. 137, 266]. Otro método es el llamado reacción de la cola
3' con ayuda de la enzima "transferasa terminal" [p. ej.,
Schmitz, G. et al. (1991) Anal. Biochem. 192, 222].
Los nucleósido-trifosfatos
empleados hasta el presente en este procedimiento son casi
exclusivamente los correspondientes derivados modificados de las
bases heterocíclicas de la serie adenina, guanina, citosina y timina
en el desoxirribonucleótido, o respectivamente adenina, guanina,
citosina y uracilo en la serie de ribonucleótidos. Estos derivados
están descritos p. ej., por Langer et al., en Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78, 6635 (1981), Mühlegger et al., Biol.
Chem. Hoppe-Seyler 371, 953 (1990) y en EP 0 063
879. En este caso, los grupos constitutivos que se encuentran de
forma natural en el ADN y ARN, se emplean en forma marcada, es
decir, provistos de grupos señalizadores.
Las desventajas esenciales de estos
N-nucleósidos residen en la sensibilidad de la unión
N-glicosídica frente a condiciones de pH ácido y a
la disgregación por nucleasas.
Los C-nucleósidos individuales
son ya conocidos desde hace mucho tiempo (véase p. ej., Suhadolnik,
R.J. en "Nucleoside Antibiótics" ("Antibióticos
nucleósidos"), Wiley-Interscience, Nueva York
1970) y su empleo en el campo terapéutico (antivíricos o
cancerostáticos).
Además, se describen derivados fluorescentes de
C-nucleósidos y su incorporación en oligonucleótidos
de ADN ó respectivamente ARN (WO 93/16094). La llamada auto
fluorescencia de estos C-nucleósidos es sin embargo
con respecto a la producción en cuantos, un múltiplo menor que los
fluoróferos especiales como p. ej., la fluoresceína o los
correspondientes derivados de rodaminas. Otra desventaja de los
C-nucleósidos autofluorescentes reside en su
relativamente pequeña longitud de onda de excitación y emisión. Esto
tiene como consecuencia que los sistemas de detección, que se basan
en estos derivados, tienen solamente una pequeña sensibilidad a la
detección y por otra parte, son muy notables los efectos
perturbadores espectrales de la medición por el ambiente en que se
encuentran (como es el caso p. ej., de un material biológico,
autofluorescencia de matrices de gel, etc).
Los nucleósidos o respectivamente derivados de
nucleósidos ya conocidos presentan una serie de desventajas, las
cuales actúan negativamente, en particular para la detección de
ácidos nucleicos. La invención toma como base la tarea de
proporcionar la detección de ácidos nucleicos con derivados de
nucleósidos modificados con grupos señalizadores, que no presente
ninguno de los inconvenientes mencionados, es decir, en particular,
que sean particularmente estables así como a la vez enzimáticamente
procesables y sean apropiados para la detección de ácidos nucleicos
mediante una longitud de onda practicable.
El problema se soluciona mediante compuestos
heterocíclicos de fórmula general I:
en la
cual,
R_{1} y R_{2}, los cuales pueden ser iguales
o diferentes, representan hidrógeno, oxígeno, halógeno, hidroxilo,
tio o tio substituido, amino o amino substituido, carboxilo, alquilo
inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, arilo alquiloxilo
inferior, ariloxilo, aralquilo, aralquiloxilo o un grupo
informativo,
R_{3} y R_{4} representan cada uno de ellos,
hidrógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino
substituido, alquiloxilo inferior, alquenoxilo inferior, alquinoxilo
inferior, un grupo de protección o un grupo informativo,
R_{5} representa hidrógeno, hidroxilo, tio o
tio substituido, amino o grupo amino substituido, grupo fosfórico
unido por 3- ó 5- a un grupo reactivo, como p. ej., una función
fosforamidita o una función H-fosfonato, un radical
éster ó amida escindible, o un grupo informativo,
R_{4} y R_{5} forman juntamente, otro enlace
entre el C-2' y C-3', ó una función
acetal,
R_{6} representa hidrógeno o hidroxilo, grupo
tio o tio substituido, amino o amino substituido,
R_{7} representa hidrógeno, un grupo mono, di
o trifosfato, o los análogos alfa, beta o gamma tiosfato de estos
ésteres de ácido fosfórico o un grupo de protección,
así como posibles tautómeros y
sales de los
mismos.
X significa metileno o metino substituido con
halógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino
substituido, carboxilo, alquilo inferior, alquenilo inferior,
alquinilo inferior, arilo, alquiloxilo inferior, ariloxilo,
aralquilo, aralquiloxilo o un grupo informativo, u oxígeno, y n = 0
ó 1,
Z significa nitrógeno o carbono con la condición
de que cuando Z significa nitrógeno, m es cero (0), y cuando X
significa metileno, metileno substituido, o metino substituido, Z no
puede ser carbono, y cuando X significa oxígeno Z no puede ser
nitrógeno, estando el compuesto modificado con un grupo informativo.
Como grupo informativo entran en consideración aquellos grupos
detectables como en particular hapteno, un fluoróforo, un grupo
delator de metales, un lumíforo, un intercalador de proteína o un
intercalador.
Se prefieren aquellos compuestos de fórmula
general I, en los cuales la función acetal de los radicales R_{4}
y R_{5} está substituida con un grupo informador. El grupo
informador puede estar unido directamente o indirectamente, es
decir, mediante una función de engarce. Además, estos compuestos de
fórmula general I se ha acreditado como particularmente apropiados,
en los cuales R_{1} puede representar oxígeno, R_{2} hidrógeno o
un grupo informativo, R_{3} y R_{4}, hidrógeno, R_{5}
hidroxilo, hidrógeno un grupo fosfórico reactivo de unión a 3- ó
5-, R_{6} hidrógeno y R_{7} hidrógeno, grupos mono, di y
trifosfato.
Además, se prefieren los compuestos de fórmula
general I, en los cuales el grupo informativo está unido mediante
un llamado grupo de engarce, al anillo heterocíclico o
respectivamente tetrahidrofurano. Grupos correspondientes de
engarce son ya conocidos por el experto (véase p. ej., Mühlegger, K
et al. (1990) Biol.. Chem. Hoppe-Seyler 371,
953-965 ó Livak, K. J. et al. (1992) Nucl.
Acids Res. 20, 4831-4837).
Además, se prefieren los compuestos de fórmula
general I, en donde R_{1} representa hidrógeno, hidroxilo, un
grupo amino, un grupo amino eventualmente substituido o un grupo
informador, R_{2} representa un grupo amino eventualmente
substituido o un grupo informador, R_{3} representa hidrógeno,
R_{4} representa hidrógeno, hidroxilo, amino o amino substituido,
alquiloxilo inferior, alquenoxilo inferior, alquinoxilo inferior,
R_{5} representa hidrógeno, hidroxilo, tio, un grupo amino
eventualmente substituido, una fosforamidita o un grupo informador,
R_{4} y R_{5} juntamente representan una función acetal, R_{6}
representa hidrógeno y R_{7} representa una función
trifosfato.
Son preferidos también, los compuestos según la
fórmula I, en la cual X significa oxígeno y al mismo tiempo Z
representa carbono substituido con R_{2}, ó Z significa nitrógeno
y al mismo tiempo X significa metileno o metino substituido con
amino o amino substituido, carboxilo o un grupo informador.
Otra versión preferida son los compuestos de
fórmula I, en los cuales X = 0 y Z representa metino substituido
con amino o amino substituido, carboxilo o un grupo informativo.
La síntesis de los compuestos según la invención
puede efectuarse de diferentes maneras. En parte, puede partirse de
precursores que se encuentran en la naturaleza, como por ejemplo la
3-(3,4-dihidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-pirrol-2,5-diona
ó la
3-(3,4-dihidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-oxazin-2,6-diona.
La síntesis de los importantes derivados del
3-(3-desoxi-4-hidroxi-5-hidroxi-metil-tetrahidrofuran-2-ilo)
tiene lugar a partir de estos precursores mediante desoxigenación,
de preferencia según Barton (Barton, D.H.R.& Motherwell, W.B.
(1981) Pure Appl. Chem. 53,15).
Además, la síntesis química de los nuevos
compuestos heterocíclicos, puede efectuarse como se describe por
ejemplo detalladamente por K. A. Watanabe en "Chemistry of
Nucleosides and Nucleotides" ("Química de los nucleósidos y
nucleótidos"), 3, 421-535 (L. B. Townsend, Hrsg),
imprenta Plenum, Nueva York y Londres, 1994.
Otras síntesis de los llamados compuestos de
partida han sido descritas por ejemplo por Hosmane, R y S. et
al. en Bioorg. & Med. Chem. Lett. 3, 2847 (1993) y por
Townsend L. B. et al. en Tetrahedron Lett. 36, 8363
(1995).
El empleo de los compuestos según la invención
para el marcado de ácidos nucleicos con diversos, definidos grupos
de señalización y con ello, la detección y secuenciación de los
ácidos nucleicos, se ha mostrado como particularmente ventajoso.
Las substancias según la invención, de fórmula
general I, poseen en particular frente a los clásicos nucleósidos y
nucleótidos como adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina,
etc. o respectivamente sus correspondientes ésteres de ácido
fosfórico, una serie de ventajas.
Una ventaja es la estabilidad química p. ej.,
frente a condiciones de pH ácido. Otra ventaja esencial es la
estabilidad de estos compuestos frente a la degradación enzimática
mediante endo y exonucleasas. Estas enzimas están contenidas
normalmente en el material biológico y pueden estorbar sensiblemente
la detección del ácido nucleico. Por otra parte, es sabido que la
ADN-polimerasa y ARN-polimerasa son
críticas con respecto a la aceptación de los
nucleósido-5'-trifosfatos más o
menos modificados, es decir, en la síntesis de novo, el
reconocimiento de estos nucleótidos como substratos y su
incorporación. En particular, la ligazón de los grupos de
señalización en el nucleótido influye sobre la incorporación según
la invención y la velocidad de incorporación.
El que los derivados según la invención se
introduzcan de manera muy eficiente mediante polimerasas apropiadas,
en ácidos nucleicos como p. ej., mediante los métodos mostrados más
arriba de la "nick translation" ("desplazamiento de
mella") o de la "random primed labelling" ("marcado
encebado al azar"), no puede deducirse del estado actual de la
ciencia y por ello se considera por el experto como
sorprendente.
El citado procedimiento sirve muy en general
para la detección de ácido nucleico, p. ej., para la detección
cuantitativa mediante las técnicas de transferencia por difusión
sobre membranas o también en placas de microtitulación.
En la secuenciación, es decir, en la detección
de la secuencia de un ácido nucleico, se sintetiza una cadena nueva
opuesta complementaria en el ácido nucleico que hay que secuenciar,
con la ayuda de un corto oligonucleótido (de partida) (cebador), la
adición de un nucleósido trifosfato y una polimerasa, a continuación
se efectúan las mencionadas reacciones de terminación y se separan
los fragmentos de ácido nucleico creados, por cromatografía
sobre
gel.
gel.
En la hibridación in situ para la
detección de determinados genes o fragmentos de genoma, tiene lugar
lo mismo en principio en la célula, a saber la introducción
específica de nucleótidos marcados.
Los cebadores mencionados más arriba, es decir,
los oligonucleótidos de cadena corta deben generar, para garantizar
una función óptima, tanto pares de bases estables con la cadena
matriz, como también no han de ser atacados por las nucleasas
endógenas.
Estas condiciones se cumplen por los
oligonucleótidos, los cuales en lugar de los clásicos nucleósidos,
contienen los compuestos según la invención como elementos
constitutivos.
Lo mismo sirve para los polinucleótidos y
nucleótidos de cadena larga que contienen dichos elementos
constitutivos. También éstos, son objeto de la presente
invención.
Los correspondientes oligonucleótidos así como
sus precursores preparativos, en forma de los llamados
fosforoamiditas y H-fosfonatos son también
igualmente objeto de la invención. Los oligonucleótidos se obtienen
hoy en día por regla general, según métodos ya conocidos en
aparatos de síntesis de ADN/ARN que trabajan automáticamente en
base a una síntesis en fase sólida. Estos procedimientos de síntesis
se basan en esencia en la reacción por pasos de la fosforamidita ó
el H-fosfonato más arriba citados y con ello el
empalme consecutivo de estos elementos constitutivos de monómeros
en oligómeros (véase p. ej., T. Brown en "Oligonukleotides and
Analogues - A Practical Approach" ("Oligonucleótidos y
análogos - Método práctico") (1991) (Eckstein, F., Hrsg.),
imprenta IRL en la Imprenta de la Universidad de Oxford, Oxford,
Nueva York, Tokio).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
I y II significan pBR 328-ADN,
marcado con el inserto DIG-dUTP (estándar), y III
pBR 328-ADN, marcado con el compuesto obtenido
según el ejemplo 6,
3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(digoxigenil-3-O-succinil-aminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona.
La aplicación sobre el gel se hizo en concentraciones de 10
a
0,01 pg.
0,01 pg.
Los siguientes ejemplos aclaran la invención con
más detalle:
Ejemplo
1.1
El compuesto se obtuvo en una síntesis de
novo según Hosmane, R.S. et al., Bioorg & Med. Chem.
Lett. 3, 2847 (1993).
Alternativamente, puede obtenerse mediante
desoxigenación Barton [Barton, D. H. R. & Motherwell, W.B.
(1981) Pure Appl. Chem. 53, 15] a partir del derivado
3,4-dihidroxilo (Showdomicina) obtenido por
fermentación.
\newpage
Ejemplo
1.2
213 mg (1 mmoles) de
3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-pirrol-2,5-diona
obtenida según el ejemplo 1.1, se disuelven en 25 ml con bromo a RT
de agua saturada, y se agita a temperatura ambiente durante 3
horas. Después de esto, se observó por control con DC la existencia
de muy poco material de partida. La solución se liberó del bromo en
exceso por vacío, se ajustó a pH 7 y se evaporó hasta conseguir un
aceite. Se disolvió en poco metanol, y se separó en una columna de
silicagel con una mezcla de cloroformo/metanol 8:2. Después de
evaporar las fracciones se obtuvieron 140 mg (48%) de un aceite de
color amarillo pálido.
Análisis elemental C_{9}H_{10}NO_{3}Br
(p.m. 292,2): C_{calc} 36,9; H_{calc} 3,4; N_{calc} 4,8;
Br_{calc} 27,4; C_{enc} 37,35; H_{enc} 3,6; N_{enc} 4,5;
Br_{enc} 27,8.
Ejemplo
1.3
140 mg (aproximadamente 0,5 mmoles) del
compuesto de bromo del ejemplo 12 se disuelven en 50 ml de etanol,
se mezclan con 1,75 g (aproximadamente 10 mmoles) de dihidrocloruro
de diaminopentano y se calienta durante 5 horas a reflujo. A
continuación se controla mediante DC (silicagel, cloroformo/metanol
8:2) que la reacción se ha efectuado casi cuantitativamente (en
comparación con la mancha que está debajo del compuesto de bromo),
positiva con ninhidrina). La mezcla de reacción se evapora al vacío
y sin más purificación se emplea en el ejemplo 1.4.
Ejemplo
1.4
El residuo aceitoso del ejemplo 1.3
(aproximadamente 2 g) se disuelve en 50 ml de piridina anhidra, se
aspira la parte no disuelta y el filtrado se concentra al vacío
hasta sequedad. Se disuelve en 50 ml de piridina absoluta y se
mezcla con 0,75 ml (aproximadamente 5 mmoles) de anhídrido
trifluoracético. Después de un reposo de 5 horas a temperatura
ambiente, se controló por DC que la acilación había sido completa.
La solución de reacción se evaporó a continuación al vacío y se
coevaporó tres veces con metanol. Se disolvió en aproximadamente 20
ml de etanol, se filtró y cromatografió sobre silicagel con una
mezcla de cloroformo/metanol (9:1). Las fracciones reunidas se
evaporaron, el residuo se disolvió en dioxano y se liofilizó. Se
obtuvieron 110 mg (53% del valor teórico) del compuesto deseado.
Análisis elemental
C_{16}H_{23}N_{3}O_{6}F_{3} (p.m. 410,4): C_{calc} 46,8;
H_{calc} 5,6; N_{calc} 10,2; F_{calc} 13,9; C_{enc} 47,35;
H_{enc} 5,9; N_{enc} 10,5; F_{enc} 13,8.
Ejemplo
1.5
40 mg (0,1 mmoles) del nucleósido protegido del
ejemplo 1.4 se transforman según el método de Yoshikawa et
al. [Tetrahedron Lett. 50, 5065 (1967)] mediante fosforilación
con POCl_{3} en el 5'-monofosfato; a partir del
cual en correspondencia con el procedimiento de Hoard & Ott [J.
Am. Chem. Soc. 87, (1965)] después de la activación con
carbonildiimidazol y reacción con ácido pirofosfórico y subsiguiente
cromatografía de intercambio iónico en
DEAE-Sephadex, se obtiene el trifosfato deseado con
un rendimiento de 30 mg (46%).
P^{31} RMN (0,1 M EDTA/D_{2}O/Eth_{3}N):
-5,2 (d,P-\gamma): -10,3
(d,P-\alpha); -21,0
(t,P-\beta).
Ejemplo
1.6
25 mg (0,038 mmoles) del compuesto protegido con
trifluoracetilo del ejemplo 1.5 se dejan en reposo 1 hora a
temperatura ambiente en 5 ml de solución concentrada de amoníaco, y
a continuación se evapora al vacío. El resíduo se disuelve en 5 ml
de tampón de borato 0,1M, pH 8,5 y se mezcla con una solución de 25
mg (0,05 mmoles) de éster de
5(6)-carboxi-fluorescein-N-hidroxi-succinimida
en 5 ml de dimetilformamida exenta de amina. Se deja durante la
noche a temperatura ambiente en reposo. La mezcla de reacción se
añade a una columna DEAE-Sefadex (30 x 1 cm) y se
eluye con un gradiente lineal de LiCl (cada vez 200 ml de H_{2}O
sobre LiCl 0,4M). Después de purificar las correspondientes
fracciones, evaporar, precipitar el concentrado en acetona/etanol
(2:1) y secar, se obtienen 25 mg (aproximadamente 50%) de la
substancia del título.
Datos espectrales (tampón de fosfato 0,1M, pH
9,0:
Excitación_{máx} [nm]: 495;
Emisión_{máx} [nm]: 521.
Correspondientemente se obtuvo por reacción del
compuesto del ejemplo 1.5 con el éster
N-hidroxi-succinimida del ácido
digoxigenin-3-O-succinil-aminocaprónico,
el
3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(digoxigeni-
nil-3-O-succinil-aminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona.
nil-3-O-succinil-aminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona.
Ejemplo
2.1
El compuesto se obtuvo mediante desoxigenación
Barton (Barton D.H.R. & Motherwell, W. B. (1981) Pure Appl.
Chem. 53, 15] a partir de la fermentación del derivado
3,4-dihidroxilo obtenido.
Ejemplo
2.2
El derivado se obtuvo mediante bromación del
compuesto de partida del ejemplo 2.1. como se ha descrito en el
ejemplo 1.2.
Ejemplo
2.3
150 mg (0,5 mmoles) del compuesto bromado del
ejemplo 2.2 se transformaron análogamente al procedimiento del
ejemplo 1.3, en el compuesto del título. Este se hizo reaccionar sin
ninguna purificación análogamente al procedimiento de los ejemplos
1.4, 1.5 y 1.6, finalmente con trifosfato marcado con
fluoresceína.
Ejemplo
3.1
El derivado se sintetizó de acuerdo con
Townsend, L. B. et al. Tetrahedron Lett. 36, 8363 (1995).
Ejemplo
3.2
264 mg (1 mmoles) de
3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-2,6-diamino-5-cloro-pirazina
del ejemplo 3.1 se sometieron a una reacción de desaminación en una
mezcla de 50 ml de ácido acético al 80% y 700 mg (10 mmoles) de
NaNO_{2}. Después de 5 horas en reposo a temperatura ambiente la
reacción controlada por DC fue casi completa. A la mezcla de
reacción se añadieron 2 g de urea para la descomposición del nitrito
en exceso y se agitó otras 3 horas a temperatura ambiente. A
continuación se añadió la solución a una columna de carbón activo
(Carboraffin C, aproximadamente 50 ml de volumen), se lavó
suficientemente y el producto deseado se eluyó con
etanol/agua/amoníaco. Después de evaporar se obtuvieron 230 mg
(aproximadamente 87%) de un aceite viscoso, el cual sin posterior
purificación se empleó en el próximo paso.
Ejemplo
3.3
200 mg (0,75 mmoles) del aceite del ejemplo 11
se disolvieron en 30 ml de etanol, se mezclaron con 555 mg (3,75
mmoles) de
1,8-diamino-3,6-dioxa-octano
y se calentaron 3 horas a aproximadamente 60ºC.
A continuación se eliminaron el disolvente y la
amina al vacío con bomba de aceite, y el residuo, sin posterior
purificación, se hizo reaccionar de nuevo con anhídrido
trifluoracético en piridina como se ha descrito en el ejemplo
1.4.
\newpage
Ejemplo
3.4
150 mg del derivado trifluoracetilado del
ejemplo 3.3 se transformaron según Yohikawa y Hoard & Ott como
se describe en el ejemplo 1.5, en el compuesto del título. Después
de la cromatografía de intercambio iónico en
DEAE-Sefadex dio como resultado el trifosfato
deseado con un rendimiento de 120 mg (40%).
P^{31} RMN (0,1 M EDTA/D_{2}O/Eth_{3}N):
-5,1 (d,P-\gamma); -10,6
(d,P-\alpha); -20,8
(t,P-\beta).
Ejemplo
3.5
20 mg del trifosfato del ejemplo 3.4 se hicieron
reaccionar, después de escindir el grupo de protección
trifluoracetilo, con solución de amoníaco (como en el ejemplo 1.6
descrito) - con 20 mg del éster N-hidroxisuccinimido
del ácido
tetrametilrodamin-5(6)-carboxílico,
en tampón de borato Na 0,1M, pH 8,5/DMF, como se ha descrito en el
ejemplo 1.6, y se purificaron. Se obtuvieron 12 mg del producto
marcado con TMR.
Datos espectrales (tampón de borato de Na 0,1M,
pH 8,5)
Excitación_{máx} [nm]: 551;
Emisión_{máx} [nm]: 575.
El marcado con ADN y la detección del ADN se
efectuaron con el kit comercialmente adquirible, de la Firma
Boehringer Mannheim (catálogo nº 1093 657). La prescripción de
trabajo reproduce todos los pasos de trabajo esenciales.
Para la reacción de marcado se intercambió en la
mezcla de dNTP del kit, el DIG-dUTP por una
3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(digoxigeninil-3-O-succi-nilaminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona
(obtenida como se ha descrito en el ejemplo 1).
La reacción de detección inmunológica indicó que
la inserción del compuesto según la invención según el ejemplo 1
proporciona una sensibilidad a la detección del marcado con ADN
análoga al empleo del DIG-dUTP.
La demostración del resultado de la detección y
la sensibilidad alcanzada del sistema pueden deducirse de la
figura 1.
figura 1.
Claims (16)
1. Compuestos de fórmula general
en
donde
R_{1} y R_{2} que pueden ser iguales o
diferentes, representan hidrógeno, oxígeno, halógeno, hidroxilo,
tio o tio substituido, amino o amino substituido, carboxilo, alquilo
inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, arilo,
alquiloxilo inferior, ariloxilo, aralquilo, aralquiloxilo o un grupo
informativo,
R_{3} y R_{4} representan cada uno de ellos,
hidrógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino
substituido, alquiloxilo inferior, alquenoxilo inferior, alquinoxilo
inferior, un grupo de protección o un grupo informativo,
R_{5} representa hidrógeno, hidroxilo, tio o
tio substituido, amino o grupo amino substituido, un
grupo fosfórico reactivo unido por 3- ó 5-, como p. ej., una
función fosforamidita o una función H-fosfonato, un
radical éster ó amida escindible, o un grupo informativo,
R_{4} y R_{5} forman juntamente, otro enlace
entre el C-2' y C-3', ó una función
acetal,
R_{6} representa hidrógeno o un hidroxilo,
grupo tio o tio substituido, amino o amino substituido,
R_{7} representa hidrógeno, un grupo mono, di
o trifosfato, o los análogos alfa, beta o gamma tiofosfato de estos
ésteres de ácido fosfórico o un grupo de protección,
así como posibles tautómeros y
sales de los
mismos.
X significa metileno o metino substituido con
halógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino
substituido, carboxilo, alquilo inferior, alquenilo inferior,
alquinilo inferior, arilo, alquiloxilo inferior, ariloxilo,
aralquilo, aralquiloxilo o un grupo informativo, u oxígeno, y n = 0
ó 1,
Z significa nitrógeno o carbono con la condición
de que cuando Z significa nitrógeno, m es cero (0), y cuando X
significa metileno, metileno substituido, o metino substituido, Z no
puede ser carbono, y cuando X significa oxígeno, Z no puede ser
nitrógeno,
en donde el compuesto está modificado con un
grupo informativo.
2. Compuestos según la reivindicación 1, en
donde R_{1} puede representar oxígeno, R_{2} hidrógeno o un
grupo informativo, R_{3} y R_{4}, hidrógeno; R_{5} hidroxilo,
hidrógeno; un grupo fosfórico reactivo de unión a 3- ó 5-, R_{6}
hidrógeno y R_{7} hidrógeno; grupos mono, di y trifosfato.
3. Compuestos según la reivindicación 1, en
donde R_{1} representa hidrógeno, hidroxilo, un grupo amino, un
grupo amino eventualmente substituido o un grupo informativo,
R_{2} un grupo amino eventualmente substituido o un grupo
informativo, R_{3} hidrógeno, R_{4} hidrógeno, hidroxilo, amino
o amino substituido, alquiloxilo inferior, alquenoxilo inferior,
alquinoxilo inferior, R_{5} hidrógeno, hidroxilo, tio, un grupo
amino eventualmente substituido, una fosforamidita o un grupo
informativo, R_{4} y R_{5} juntamente una función acetal,
R_{6} hidrógeno y R_{7} una función trifosfato.
4. Compuestos según la reivindicación 1, en
donde X significa oxígeno y al mismo tiempo Z representa carbono
substituido con R_{2}, ó Z significa nitrógeno y al mismo tiempo X
significa metileno o metino substituido con amino o amino
substituido, carboxilo o un grupo informativo.
5. Compuestos según la reivindicación 1, en
donde X = 0 y Z representa metino substituido con amino o amino
substituido, carboxilo o un grupo informativo.
6. Compuestos según la reivindicación 1, en
donde la función acetal de los radicales R_{4} y R_{5} está
substituida con un grupo informativo.
7. Compuestos según una de las reivindicaciones
1 a 6, en donde el grupo informativo significa un hapteno, un
fluoróforo, un grupo delator de metal, un luminóforo, una proteína o
un intercalador.
8. Compuestos según una de las reivindicaciones
1 a 7, en donde el grupo informativo está empalmado mediante un
grupo de engarce.
9. Empleo de los compuestos según una de las
reivindicaciones 1 a 8, como substrato para ADN y ARN
polimerasas.
10. Empleo de los compuestos según las
reivindicaciones 1 a 8, para el marcado de ácidos nucleicos.
11. Empleo de los compuestos según las
reivindicaciones 1 a 8, para la detección de ácidos nucleicos.
12. Empleo de los compuestos según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en la secuenciación del ADN.
13. Empleo de los compuestos según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en la hibridación in situ.
14. Empleo de los compuestos según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en los cuales R_{7} representa una
fosforamidita o un H-fosfonato, para la síntesis
química de oligonucleótidos.
15. Oligonucleótidos, los cuales contienen uno o
varios de los compuestos mencionados en las reivindicaciones
1 a 8.
1 a 8.
16. Ácidos nucleicos, los cuales contienen uno o
varios de los compuestos mencionados en las reivindicaciones
1 a 8.
1 a 8.
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