ES2292261T3

ES2292261T3 - Antigenos de chlamydia trachomatis.

Info

Publication number: ES2292261T3
Application number: ES99958455T
Authority: ES
Inventors: Giulio Ratti
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: GSK Vaccines SRL; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: DK1140997T3; WO2000037494A3; EP1140997B1; EP1857464B1; US20100098697A1; EP1140997A2; US20060188516A1; CA2355876A1; ATE516299T1; DE69937004T2; CY1107024T1; ATE371668T1; PT1140997E; EP1857464A3; EP1598362A3; EP1857464A2; WO2000037494A2; EP1598362A2; JP2010220622A; GB9828000D0

Abstract

Un método para la conservación de energía de un módem para su uso en un sistema de comunicaciones de datos (100) que tiene una infraestructura (101) y un módem (103), siendo el módem inscribible con la infraestructura (101) y adaptado para proporcionar comunicaciones de datos entre un terminal computador (105) y la infraestructura (101), incluyendo el método las etapas de: recibir, en el módem (103), un mensaje previsto para el terminal computador (105), caracterizado por determinar que el mensaje no se puede entregar al terminal computador (105), y entrar en un modo de conservación de energía, el módem (103) que responde a dicha etapa de determinación.

Description

Antígenos de Chlamydia trachomatis.

Esta invención se refiere a proteínas antigénicas de Chlamydia trachinatis. En particular, se refiere a antígenos que son reconocidos por anticuerpos de sueros de pacientes infectados crónicamente o convalecientes.

Antecedentes

Las Chlamydia son parásitos intracelulares obligados de células eucarióticas que son responsables de infecciones transmitidas sexualmente, tracoma, neumonitis infecciosa y otros varios síndromes de enfermedad. Ocupan una rama filogénica eubacterial exclusiva que no tiene una relación estrecha con cualesquier otros organismos conocidos - se clasifican en su propio orden (Chlamydiales) que contiene una familia individual (Chlamidyaceae) que a su vez contiene un género individual Chlamydia). Actualmente se conocen cuatro especies clamidiales - C. trachomatis, C, pneumoniae, C. pecorum y C. psittaci [por ejemplo, véase la referencia 1]. Recientemente se ha publicado [2] una secuencia genómica de C. trachomatis (serovar D).

Las serovariantes humanas de C. Trachomatis (serovar D) se dividen en dos serovariantes ("biovares"). Los serovares A-K ocasionan infecciones epiteliales principalmente en el tejido ocular (A-C) o el tracto urogenital (D-K). Los serovares L1, L2 y L3 son los agentes del linfogranuloma venéreo invasivo (LGV).

Aunque la infección clamidial en sí causa enfermedad, se cree que, en algunos pacientes, la gravedad de los síntomas se debe de hecho a una respuesta inmune aberrante del huésped. El fallo en la eliminación de la infección da por resultado una estimulación inmune persistente y ello da lugar, más que a ayudar al huésped, a una infección crónica con consecuencias graves, incluidas esterilidad y ceguera [3].

Además, usualmente, la protección conferida por la infección clamidial naturales incompleta, transitoria y específica al género.

Debido a la naturaleza grave de la enfermedad, se desea proporcionar vacunas adecuadas. Éstas pueden ser útiles (a) para inmunización contra la infección clamidial o contra la enfermedad producida por clamidias (vacunación profiláctica) o (b) para erradicar una infección clamidial crónica establecida (vacunación terapéutica). Por ser un parásito intracelular, sin embargo, la bacteria generalmente evade respuestas inmunes mediadas por anticuerpo.

Se han descrito varias proteínas antigénicas para C. trachomatis y la superficie celular ha sido la diana particular de detallada investigación [por ejemplo, 1,4]. Entre ellas están incluidas, por ejemplo, pgp3 (5, 6, 7), MOMP [8], Hsp60 (GroEL) [9] y Hsp70 (de tipo DnaK) [10]: No todas ellas han demostrado ser vacunas eficaces, aunque es objetivo de la invención identificar antígenos clamidiales que inducen una respuesta inmune durante la infección natural con el fin de proporcionar antígenos e inmunógenos adecuados para uso en el desarrollo de vacunas.

Descripción de la invención

La invención está basada en la identificación de proteínas codificadas por Chlamydia trachomatis que son inmunógenas en el hombre como consecuencia de infección.

La descripción proporciona una proteína de C. trachomatis que tiene las características de PM y pI de la proteína 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 presentadas en la Tabla II de páginas posteriores.

Éstas incluyen proteínas que tienen, en la cepa L2 de C. trachomatis, una secuencia de aminoácidos N-terminal descrita en la Tabla II de la pág. 19 y sigts.

La descripción proporciona también proteínas que tienen identidad de secuencia con estas proteínas de C. trachomatis. Dependiendo de la proteína particular, preferiblemente, el grado de identidad es mayor que 50% (por ejemplo, 65%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o más). El grupo de estas proteínas homólogas incluye mutantes, variantes alélicas, serovariantes y biovariantes. La identidad entre proteínas se determina preferiblemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se realiza en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de hueco afín con los parámetros penalización abierta de gap = 12 y penalización por extensión de gap = 1. Típicamente, una identidad de 50% o más entre dos proteínas se considera como indicativa de equivalencia funcional.

La descripción proporciona además proteínas que comprenden fragmentos de proteínas de C. trachomatis de la descripción. Los fragmentos deben comprender como mínimo n aminoácidos consecutivos de las proteínas y, dependiendo de la proteína particular, n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 50, 100 o más). Preferiblemente, los fragmentos comprenden un epitopo de la proteína.

Obviamente, las proteínas de la descripción se pueden preparar por varios procedimientos (por ejemplo, expresión recombínante, purificación de un cultivo de células, síntesis química, etc.) y en varias formas (por ejemplo, nativa, fusiones, etc.). Preferiblemente se preparan en forma sustancialmente aislada o purificada (esto es, sustancialmente exenta de otras proteínas de células de C. trachomatis o de huésped).

De acuerdo con otro aspecto, la descripción proporciona anticuerpos que se unen a estas proteínas. Estos pueden ser policlonales o monoclonales y se pueden producir por procedimientos adecuados.

De acuerdo con otro aspecto más, la descripción proporciona ácido nucleico que codifica las proteínas y fragmentos de las proteínas de la descripción. También se proporciona ácido nucleico que tiene identidad de secuencia con este ácido nucleico. Dependiendo del ácido nucleico particular, el grado de identidad preferiblemente es mayor que 50% (por ejemplo, 65%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o más).

Además, la descripción proporciona un ácido nucleico que puede hibridar a este ácido nucleico, preferiblemente en condiciones de "alta rigurosidad" (por ejemplo, 65ºC en una solución 0,1xSSC, 0,5% de SDS).

También se proporcionan fragmentos de este ácido nucleico. Los fragmentos comprenderían como mínimo n aminoácidos consecutivos de las proteínas y, dependiendo de la proteína particular, n es 10 o más (por ejemplo, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 o más).

Debe tenerse en cuenta también que la descripción proporciona ácido nucleico que comprende secuencias complementarias de las descritas antes (por ejemplo, a fines de antisentido o de sonda).

El ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede preparar, obviamente, de muchas maneras (por ejemplo, por síntesis química, de bibliotecas genómicas o de cDNA, a partir del propio organismo, etc.) y puede tomar varias formas (por ejemplo, de cadena individual, de cadena doble, vectores, sondas, etc.)

Además, el término "ácido nucleico" incluye DNA y RNA y también sus análogos, tales como los que contienen espinazos modificados y también ácidos nucleicos peptídicos (PNA), etc.

De acuerdo con otro aspecto, la descripción proporciona vectores que comprenden ácido nucleico de la descripción (por ejemplo, vectores de expresión) y células hospedantes transformadas con tales vectores.

De acuerdo con otro aspecto, la descripción proporciona proteínas, anticuerpos y/o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Estas composiciones pueden ser adecuadas como composiciones inmunógenas (incluidas vacunas), por ejemplo, o como reactivos para diagnosis.

La descripción proporciona también ácidos nucleicos, proteínas o anticuerpos de acuerdo con la descripción para uso como medicamentos (por ejemplo vacunas) o como reactivos para diagnosis. En particular, la descripción proporciona la proteína 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 presentadas en la Tabla II de la página 19 para uso como inmunógeno clamidial. En particular, la invención proporciona una proteína de C. trachomatis que tiene la secuencia dada en el número de acceso P38001 y que tiene un PM de 15,8 kDa y un pI de 4,80 para uso como medicamento, o un anticuerpo que se une a la proteína de la reivindicación 1 para uso como medicamento, así como un ácido nucleico que codifica la proteína de la reivindicación 1 para uso como medicamento. Si bien se cree que algunas de las proteínas de la Tabla II pueden ser conocidas per se, no han sido descritas como inmunógenos.

La descripción proporciona también el uso de ácido nucleico, proteína o anticuerpo de acuerdo con la descripción en la fabricación de (i) un medicamento para tratar o prevenir una infección debida a Chlamydia; (i) un reactivo para diagnosis para detectar la presencia de Chlamydia o de anticuerpos creados contra Chlamydia; y/o (iii) un reactivo que puede generar anticuerpos contra Chlamydia. Las clamidias pueden ser de cualquier especie o cepa, pero preferiblemente son C. trachomatis. En realizaciones preferentes, la descripción proporciona una proteína de las 55 proteínas de la Tabla II para uso en la fabricación mencionada.

En particular, la invención proporciona:

-: el uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección debida a Chlamydia,

-: el uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de un reactivo para diagnosis para detectar la presencia de Chlamydia o de anticuerpos generados contra Chlamydia, así como

-: el uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de un reactivo que puede generar anticuerpos contra Chlamydia.

La descripción proporciona un procedimiento para tratar un paciente, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido nucleico, proteína y/o anticuerpo de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otros aspectos, la descripción proporciona varios procedimientos.

Se proporciona un procedimiento para producir proteínas de la descripción, que comprende la etapa de cultivar una célula hospedante de acuerdo con la descripción en condiciones que inducen la expresión de la proteína.

Se proporciona un procedimiento para producir proteínas de la descripción, en el que la proteína o el ácido nucleico se sintetiza en parte o enteramente usando medios químicos.

Se proporciona un procedimiento para producir proteínas de la descripción, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico de acuerdo con la invención con una muestra biológica en condiciones de hibridación para formar dúplex; y (b) detectar los mencionados dúplex.

Se proporciona un procedimiento para producir proteínas de la descripción, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con la invención con una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo.-antígeno; y (b) detectar los mencionados complejos. Análogamente, la descripción proporciona un procedimiento para detectar anticuerpos anticlamidiales en una muestra, que comprende las etapas de (a) poner en contacto una proteína de acuerdo con la descripción con una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de complejos de anticuerpo.antígeno; y (b) detectar los mencionados complejos.

La discusión proporciona también kits que comprenden reactivos adecuados para uso en estos procedimientos.

Se proporciona un kit que comprende una sonda nucleica de acuerdo con la descripción y medios para detectar dúplex formados por la sonda. Se proporciona un kit que comprende un anticuerpo de acuerdo con la descripción y medios para detectar complejos de anticuerpo-antígeno formados por el anticuerpo. Se proporciona un kit que comprende una proteína de acuerdo con la descripción y medios para detectar complejos de anticuerpo-antígeno formados por la proteína.

Para evitar dudas,.el término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que constituye", por ejemplo, una composición que "comprende X" puede estar constituida exclusivamente por X o puede incluir algo además de X, tal como X + Y.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el mapa EB electroforético 2D de referencia anotado, que indica también las posiciones de las manchas de proteína inmunorreactiva, marcadas 1-55. Los grupos de manchas que parece que son series isoeléctricas de la misma proteína están juntos rodeados de un círculo y se clasifican con el mismo número de identificación.

La Figura 2 representa inmunomanchas de transferencia. Se representa la superficie total del mapa. Los inmunógenos importantes conocidos están marcados para una fácil comparación. Para otra identificación de manchas, se hace referencia a la Figura 1 y la Tabla II. La mancha de transferencia A es del paciente de PID JO51 (título de MIF 256) y tiene una dilución del suero de 2:5000. La mancha de transferencia B es del paciente JO35 (título de MIF 64) afectado de esterilidad secundaria, y tiene una dilución del suero de 1:2500. La mancha de transferencia C es similar a la B, pero es del paciente JO52. La mancha de transferencia D es del paciente de PID JO31 (título de MIF 256) y tiene una dilución del suero de 1:5000.

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Ejemplos Sueros humanos

Los sueros (Tabla I) se obtuvieron de mujeres que habían respondido a infección clamidial del tracto genital. Los diecisiete sueros (A...Q) se obtuvieron de 4 casos de infección del tracto genital inferior y 13 casos de PID (enfermedad inflamatoria del pelvis) confirmados por laparoscopia, incluidos 2 casos de esterilidad secundaria. Todos los sueros fueron positivos en un ensayo estándar de microinmunofluorescencia (MIF) con cuerpos elementales de L2 de C. trachomatis purificados [11],y fueron confirmados como sueros inmunes de C. trachomatis por un ensayo ELISA con el antígeno pgp3 codificado por el plásmido [5].

De la misma manera, y usando las mismas diluciones que para los sueros de pacientes, se ensayó por inmunotransferencia un grupo de 10 sueros de control seronegativos de donantes de sangre sanos, con el fin de excluir la presencia de reacciones no específicas.

La mayor parte de los sueros se obtuvo de la colección de Chlamydia del Biobanque de Picardie (Amiens, Francia). Algunos sueros de PID y de control de donantes sanos se obtuvieron del Hospédale Policlínico S. Orsola (Bolonia, Italia).

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Preparación de muestras de proteína

Las células clamidiales purificadas se obtuvieron como se describe en la referencia 12 haciendo crecer cultivos de células in Vero de la cepa L2/343/Bu de C. trachomatis de acuerdo con procedimientos estándar, a lo que siguieron dos ciclos de centrifugación en gradiente de densidad [13]. La concentración media de proteína de la preparación del cuerpo elemental purificado (EB) se determinó usando un ensayo de biuret. Partes alícuotas (2 mg de proteína/ml) se almacenaron en agua a -20ºC para posterior análisis electroforético. Las células usadas estaban principalmente en forma de EBs - todos los antígenos clamidiales se han encontrado hasta ahora en cuerpos elementales y no en cuerpos reticulares.

Separación de proteínas clamidiales

Las proteínas clamidiales se separaron usando electroforesis 2D de alta resolución, realizada usando el sistema de línea inmóvil/poliacrilamida esencialmente como se describe en las referencias 14 y 15.

Para los geles analíticos se usaron aproximadamente 45 \mug de proteína de cuerpo elemental en total por gel. Para geles semipreparativos (para microsecuenciación) se usó aproximadamente 1 mg de proteína. Partes alícuotas de las proteínas de EB (cuerpo elemental) se peletizaron por centrifugación a baja velocidad y las pellas se pusieron en suspensión en urea 8M, 4% de CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano sulfonato), base Tris 40 mM, ditioeritrol (DTE) 65 m;M y rastros de azul de bromofenol.

La focalización isoeléctrica se realizó sobre tiras de línea inmóvil obteniéndose un gradiente de pH de 3 a 10 (tiras de IPG, Amersham Pharmacia Biotech.). El voltaje se aumentó linealmente desde 300 a 3500 V durante las tres primeras horas, luego se estabilizó a 5000 V durante 22 horas (producto de total de volts-hr = 110 kVh). Después de la electroforesis, las tiras de IPG se equilibraron durante 12 min frente a urea 6 M, 30% de glicerol, 2% de SDS, Tris•HCl 0,05, pH 6,8 y 2% de DTE. La segunda dimensión se realizó en un sistema de Laemmli sobre geles de gradiente de poliamida de 9-16% (18 cm x 20 cm x 1,5 mm) a corriente constante de 40 mA/gel durante aproximadamente 5 h hasta que el frente de colorante llegó al fondo del gel. Los geles analíticos se tiñeron con nitrato de plata amoniacal [16]. Los mapas de proteína se barrieron con un fotodensímetro de láser (Molecular Dynamics) y se convirtieron en fichas electrónicas que luego se analizaron con el softwarwe de ordenador Melanie II
(Bio-Rad).

La Figura 1 representa el mapa EM de referencia anotada que se usó para identificar proteínas sobre manchas de transferencia. Las coordenadas de PM y pI para el mapa de referencia se calibraron por comigración de las proteínas clamidiales con proteínas de suero humano que actuaban como proteínas de referencia. Los valores del punto isoeléctrico usados para las proteínas de suero eran las descritas en la referencia 17.

Análisis por inmunotransferencia

Los resultados de inmunotransferencia se resumen en la Figura 2 y la Tabla II.

Después de electroforesis bidimensional, los geles se inmunotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa [18], y se procesaron de acuerdo con procedimientos estándar modificados como se describe en la referencia 19. En resumen, antes de la inmunodetección, las membranas se tiñeron en Ponceau \cdot al 0,2% (p/v) en ácido tricloroacético al 3% (p/v) durante 3 min y se marcaron sobre la mancha las posiciones de manchas de anclaje seleccionadas para ayudar a que las inmunomanchas casaran con el mapa teñido con plata. Las manchas de transferencia inmunorreactivas se detectaron por incubación durante la noche a temperatura ambiente con suero de paciente (diluciones 1500-5000x), a lo que siguió la incubación con IgGs antihumano de conejo conjugados con peroxidasa (Cappel, dilución de 7000x) y detección con un kit basado en quiminoluminiscencia (Pharmacia Amersham Biotech).

Típicamente, para cada experimento se prepararon en paralelo seis mapas idénticos de 2D - cinco se transfirieron sobre nitrocelulosa y uno se tiñó con nitrato de plata para posterior correlación con las inmunomanchas y acoplamiento con el mapa de referencia asistado por ordenador.

Las señales de manchas sobre la inmunomancha correspondían casi siempre a una mancha sobre el gel teñido con plata. Sin embargo, en al menos dos casos (manchas 13 y 14 de la Figura 1), el análisis por inmunotransferencia detectó manchas de proteína que no eran visibles en el mapa teñido con plata. Esto revela que esta técnica tiene una sensibilidad superior y debe tomarse en consideración como una valiosa herramienta de ayuda para estudios proteínicos sistemáticos.

Para asistir al acoplamiento de la inmunomancha con el mapa de referencia representado en la Figura 1, las manchas de nitrocelulosa se marcaron con un número de manchas de "anclaje" interno usando tinción transitoria de Rojo de Ponceau. Después de incubación con los sueros y detección por quimioluminiscencia de anticuerpos unidos, las imágenes de inmunomanchas se acoplaron al mapa de referencia y a las manchas se asignaron las correspondientes coordenadas de pI y PM (véase la Tabla II). Cuando la posición y la forma de la mancha (o serie isoeléctrica de manchas) coincidían con un antígeno EB previamente identificado, se registró una respuesta inmune contra tal antígeno. En todos los casos restantes se identificó la mancha de inmunotransferencia por las coordenadas de PM y pI tomadas en el baricentro de la superficie teñida (o el intervalo de coordenadas en el caso de patrones complejos de manchas). Se apreciará que los valores de PM y pI se determinan electroforéticamente y que pueden tener un error potencial medio de \pm 10%. Las medidas de PM superiores tenderán a ser menos precisas.

Si bien las manchas de control eran totalmente negras, las manchas de transferencia de pacientes presentaban configuraciones individualmente diferentes que comprendían varias manchas, que variaban de 2 a 28 con una media de aproximadamente 15 (véase la Tabla II). El número de manchas inmunorreactivas no se correlacionaba con los títulos de MIF de suero (véanse las Tablas I y II), por lo que las configuraciones de las manchas parece que reflejan una variación individual real de respuestas humorales y no precisamente la diferencia de títulos de anticuerpos. Esto se confirmó también por comparación de los resultados de cada suero a varias diluciones.

En la Figura 2 se presentan resultados típicos de inmunotransferencia. El único rasgo constante de todos los sueros examinados era la presencia de anticuerpos contra un conjunto complejo de manchas previamente identificadas como debidas a la proteína OMP2 [12] de la membrana exterior rica en cisteína. Este conjunto se representa como mancha 1 en la Figura 1 - todas las manchas marcadas "1" se calificaron como antígeno individual, pero varias manchas accesorias con valores de MP y pI más bajos que usualmente aparecen asociadas a reactividad de OMP2 se calificaron separadamente, pues no está clara todavía su relación con el polipéptido OMP2. A causa de que la proteína OMP2 es específica a clamidias y no parece que experimente una relación antígena relevante, se puede considerar como probablemente el mejor marcador de la infección clamidial en este estudio.

Las manchas seguidamente más frecuentes que se observaron corresponden a lo siguiente:

-: Mancha 2 - la proteína de tipo GroEL (hsp60) (15/17n pacientes)

-: Mancha 3 - la proteína MOPM principal de membrana exterior (13/17 pacientes)

-: Mancha 4 - la proteína de tipo DnaK (hsp70) (11/17 pacientes)

La reactividad con estos inmunógenos conocidos se puede considerar como un control interno que demuestra la calidad de los sueros humanos usados en este estudio. La falta de reactividad de pgp3 sobre las manchas de transferencia, sin embargo, es significativa puesto que se había encontrado que todos los sueros eran positivos en un ensayo ELISA confirmador con una forma purificada soluble de pgp3. Esto sugiere que la respuesta del anticuerpo a pgp3 en infecciones humanas acaece principalmente frente a epitopos disponibles sólo en estructuras proteínicas correctamente plegadas que se perderían en estos experimentos.

También se detectaron reacciones inmunes frente a las proteínas siguientes [véase ref. 12]:

-: Mancha 10 - factor de alargamiento de la proteína EF-Tu (8/17)

-: Mancha 19 - proteínas ribosomales S1 (5/17)

-: Mancha 12 - proteína ribosomal L7/L12 (7/17)

Además de estas proteínas conocidas, se detectaron varias proteínas inmunorreactivas nuevas con frecuencia variables de 11/7 a 1/17. Las características de PM y pI de estas proteínas se presentan en la Tabla II. Además, en unos pocos casos se hizo un análisis por secuenciación de aminoácidos N-terminales suplementada con búsqueda de homología de bases de datos.

Microsecuenciación de manchas

Se prepararon mapas dimensionales como se ha descrito antes, comenzando con 1 mg de proteína de EB total por tanda, a lo que siguió la transferencia a membranas de poli(difluoruro de vinilideno) (BioRad, membranas de PVDF de 20 x 20 cm, tamaño de poro 0,2 micrómetros) como en la referencia 20. Las manchas de transferencia se tiñeron con Azul Brillante Coomassie R250 al 0,1% (p/v) en metanol acuoso al 50% durante 5 min y luego se destiñeron en 40% de metanol, 10% de ácido acético. Las membranas se secaron a 37ºC y se almacenaron a -20ºC para posterior análisis. Se cortaron manchas de proteína seleccionadas y se sometieron a secuenciación de aminoácidos por degradación de Edman usando un secuenciador automático de proteína/péptido (mod. 470AS; Applied Biosystem Inc.) conectado en línea con un analizador de fenil-tiohindantoín-aminoácido modelo 120A y un módulo de control/Data modelo 900A (Applied Biosystems Inc.). Típicamente se usaron 3 o 4 manchas equivalentes de manchas de transferencia similares, de acuerdo con la cantidad molar estimada de proteína en la mancha.

Los resultados de la secuenciación se presentan en la Tabla III en la página 22.

Análisis de secuencias con ordenador

Usando datos de la secuencia N-terminal se hicieron búsquedas de simlilaridad de proteínas con el programa BLAST [21] asequible de NCBI (http//www.ncbi.nlm.nih.gov) y los programas de software de GCG (Wisconsin Package Versión 9.0) [22]. Se calcularon los valores teóricos de pI y PM con el programa de ordenador pI/MW asequible del servidor de internet ExPASy [http://www.expasy.ch].

Además de los datos de base usuales, se investigaron los datos de secuenciación genómica de la cepa D/UW-3/Cx de C. trachomatis proporcionados por el proyecto Genoma de Chlamydia (http.//chlamydia-www-berkeley. edu:4231). Aunque el presente estudio usó una cepa L2 de serovar de C. trachomatis (biovar de linfogranuloma), que tiene un fenotipo de patogenia diferente, varias secuencias de proteínas se pudieron correlacionar con seguridad con genes de serovar D.

Estas búsquedas con datos N-terminales permitieron correlacionar varias manchas inmunorreactivas con secuencias conocidas (además de las siete indicadas antes).:

-: Mancha 15: predicho que sea una proteína de membrana exterior (actualmente anotada en la base de datos genómicos de serovar D como htrA)

-: Manchas 15 y 18: predicho que sea una proteína de membrana exterior (actualmente anotada en la base de datos genómicos como ompB)

-: Mancha 21: aunque la secuencia de aminoácidos no casa con ninguna de las proteínas antes descritas, presenta homología con una secuencia interna de EF-Tu. Esta proteína puede ser un producto de descomposición o procesamiento de EF-Tu, o una variante

-: Mancha 24: subunidad de RNA polimerasa alfa (rpoA)

-: Mancha 25: homóloga a leucina peptidasas bacterianas (actualmente anotada en la base de datos genómica como pepA)

-: Mancha 38: predicho que sea una proteína de unión de GTP (actualmente anotada como ychF)

Las secuencias N-terminales de las manchas 26, 31 y 33 no casan con ninguna de las secuencias de la base de datos, incluida la secuencia publicada de serovar D.

La Tabla IV presenta un sumario de identificaciones de varios antígenos inmunorreactivos que se obtuvieron por comparación con datos de mapas de 2D previos o por búsqueda de homología con los datos de secuenciación N-terminal obtenidos antes.

Proteínas de interés particular

Son de interés particular las proteínas siguientes, identificadas a partir de las inmunomanchas de transferencia:

Mancha 24. Se cree que esta mancha es la cadena alfa de la RNA polimerasa de C. trachomatis (gi620029), sobre la base de su posición de PM/pL y en su secuencia del término N. Aunque la cadena de RNAP alfa ha sido descrita previamente [23], nunca se ha dado cuenta de que es un inmunógeno clamidial. Cuatro pacientes presentaban reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial. Si bien la naturaleza parasitaria intracelular de Chlamydia significa que generalmente puede evadir respuestas inmunes mediadas por un anticuerpo, la reactividad del anticuerpo demostrada antes indica que el sistema inmune no encuentra estas proteínas durante la infección natural y que la formación de anticuerpos puede, por ejemplo, ayudar también a cebar las respuestas inmunes mediadas por células T.

Manchas 18 y 46. Las manchas 18 y 46 aparecen como que son homólogas al gen ompB del genoma del erotipo D, anotado como que codifica una proteína de membrana exterior putativa. Las secuencia N-terminales y los valores de pI y MW (al menos para la mancha 18 - 5,08/34.09 frente a valores teóricos predichos de 5,06/34,5) xconcuerdan con las propiedades esperadas de un producto del gen ompB después de escisión del péptido señal N-terminal predicho.

También se ha encontrado que ambas manchas, 46 y 18, están presentes en un mapa electroforético de 2D de una preparación purificada de complejo de membrana exterior clamidial, lo que soporta la idea de que las manchas 18 y 46 representan los homólogos del gen ompB del serotipo D.

No se investigó la razón de por qué esta proteína parece que tiene dos especies electroforéticas diferentes, pero usualmente, un desplazamiento de la mancha de este tipo se asocia a una variación de la composición de aminoácidos, debida a una variación de la secuencia de aminoácidos y/o a una derivatización real o artificiosa de algunos restos de aminoácidos.

Cinco pacientes presentaban reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial.

Mancha 25. Se cree que esta mancha es una aminopeptidasa sobre la base de que su MW/posición pI y su secuencia del término N (ambos comparativamente con pepA de la secuencia de serovar D publicada). Cuatro pacientes presentaban reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial.

Mancha 38. Se cree que esta mancha es una proteína de unión na GTP, sobre la base de su MW/posición pI y su secuencia del término N (ambos comparativamente con ychF de la secuencia de serovar D publicada). Dos pacientes presentaban reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial.

Mancha 15. Se cree que esta mancha es una proteasa inducida por tensión, sobre la base de su MW/posición pI y su secuencia del término N (ambos comparativamente con htrA de la secuencia de serovar D publicada). Siete pacientes presentaban reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial.

Mancha 8. Nueve pacientes presentaban reactividad frente a la mancha de la proteína 8, que no se pudo caracterizar por secuenciación N-terminal. Sin embargo, tiene la siguiente composición de aminoácidos de "tipo 2 de constelación" (porcentajes molares):

1

Cys y Trp no se determinan en este tipo de análisis y no es posible distinguir entre Glu/Gln y Asp/Asn.

La incapacidad para obtener la secuencia N.-terminal, a pesar de repetidos intentos, sugiere que el resto N-terminal está bloqueado debido a alguna forma de modificación (por ejemplo, una lipoproteína). Con frecuencia, la modificación es una característica de las proteínas asociadas a membrana en eucariotes, pero también es una característica de proteínas de superficie exterior o proteínas secretadas en especies bacterianas (por ejemplo, lipoproteínas [24+, proteínas de la membrana exterior de micoplasma [25], el factor de virulencia FHA de B pertussis [26], etc.)

Mancha 12. Se cree que esta mancha es debida a la proteína ribosomal L7/L12. Cinco paciente presentaron reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial. Aunque esta proteína ha sido descrita anteriormente en clamidias [número de acceso P38001], nunca se ha indicado que sea inmunógeno clamidial. Se ha descrito, sin embargo como inmunógeno en infecciones de Brucella [27, 28].

Mancha 19. Se cree que esta mancha es debida a la proteína ribosomal S1. Cinco pacientes revelaron reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial. Aunque esta proteína ha sido descrita anteriormente en clamidias [número de acceso P38016)], nunca se ha indicado que sea un inmunógeno.

Mancha 10. Se cree que esta mancha es debida al factor EF-Yu de elongación de la síntesis de proteína. Ocho pacientes revelaron reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial. Ocho pacientes presentaron reactividad a esta proteína, lo que demuestra que es inmunógena en seres humanos como consecuencia de una infección clamidial. Aunque el EF-Tu clamidial ha sido descrito anteriormente en clamidias [número de acceso P26622], nunca se ha indicado que sea un inmunógeno.

Manchas 10, 12, 15, 19 y 24. Dada la importancia en infecciones crónicas de una posible sensibilización previa a antígenos microbiales conservados que pueden desencadenar reacciones immunopatógenas, es de notar que varios de estos nuevos antígenos inmunorreactivos pertenecen a familias conservadas de proteínas bacterianas: cuatro sueros (23%) reaccionaban con la mancha 24 (la subunidad alfa de la RNA polimerasa); cinco (29%) reconocían la mancha 19 (proteína ribosomal S1); ocho (47%) reconocían la mancha 10 (EF-Tu); siete (41%) reconocían 12 (la proteína ribosomal L7/L12).. En el grupo de sueros usados en este estudio, 12/17 (70,6%) reaccionaba con al menos uno de estos cinco antígenos y todos los sueros, incluidos los antígenos hs60 y hsp70. tenían anticuerpos que reaccionaban con entre 1 y 7 (media 3,7) proteínas clamidiales que tenían homólogos en otras bacterias.

De hecho, las teorías que postulan un papel de los mecanismos de sensibilización inmunológica en la patología clamidial, como se describe para el antígeno de tipo GroEL [29], deben extenderse a otros varios antígenos bacterianos comunes que pueden ser inmunógenos en otras infecciones bacterianas. Por ejemplo, el factor de elongación de proteínas EF-Tu es inmunógeno durante la fase aguda de la infección con Haemophilus influenzae y tanto L7/L12 como los homólogos de proteasa inducida por tensión de HtrA son inmunógenos en infecciones de Brucella. En el caso de EF-Tu, la abundancia de esta proteína en la célula bacteriana puede favorecer su "visibilidad" por el sistema inmune. Debe señalarse, no obstante, que el EF-Tu ha sido descrito como asociado a membrana exterior y fracciones celulares periplásmicas [30] y, más recientemente, algunos datos sugieren que el ET-Tu, además de su función en la elongación de péptidos, tiene también actividad asistencial implicada en el plegado de la proteína.y la protección frente a la tensión [31]. Es particularmente intrigante la respuesta a la proteína ribosomal L7/L12, puesto que, en infecciones de Brucella melitensise, el antíigeno homólogo de L7/L12 induce una respuesta mediada por célula DTH [27]. Además, la vacunación de ratones BALB con L7/L12 ha revelado que da protección frente a la infección por B. abortus [32]. El ]inesperado hallazgo de que los anticuerpos a L7/L12 son bastante frecuentes en pacientes infectados con C. trachomatis sugiere que acaso deba prestarse más atención a este antígeno también en la enfermedad inducida por clamidias.

Manchas 5, 6, 7 y 9. Estas proteínas, si bien hasta ahora no se han correlacionado con secuencia alguna de genoma disponible y no han sido secuenciadas, tienen obviamente interés dado su predominio (>50%) en los sueros ensayados.

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TABLA I Sumario de sueros de pacientes

Las letras de la primera columna corresponden a las dadas en la Tabla II. Los códigos de la segunda columna se refieren a la colección original de sueros. La patología asociada con cada paciente se indica en general como cervicitis (infección del tracto genital inferior), PID o esterilidad (consecuencia de infección). Todos los sueros se caracterizaron por el ensayo MIF con cuerpos elementales L2 purificados. El título de MIF dado en la tabla es la dilución de dos veces más alta que da una señal positiva. La "dilución óptima" es la dilución que se encontró que daba fondo mínimo sin pérdida de señal en manchas más débiles.

2

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TABLA III Secuencias N-terminales de proteínas

6

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TABLA IV Identificación de antígenos

"Gen-CT-D" se refiere al nombre del gen de la referencia 2 y da los nombres de genes que probablemente codifican las proteínas homólogas en C. trachomatis.D. Los valores teóricos de pI/PM de la última columna, a comparar con los valores experimentales, se calcularon de las secuencias de genes CT-D.

7

Referencias

1 Raulston (1995) Chlamydial envelope components and pathogen-host cell interactions. Mol Microbiol 15(4): 607-616.

2 Stephens et al. (1998) Genome Sequence ofan Obligate Intracellular Pathogen of Humans: Chlamydia trachomatis. Science 282:754-759.

3 Ward (1995) The immunobiology and immunopathology of chlamydial infections. Apmis. 103:769-96.

4 Moulder (1991) Interaction of Chlamydiae and host cells in vitro. Microbiol Rev 55(1):143-190.

5 Comanducci et al. (1994) Humoral immune responseto plasmid protein pgp3 in patients with Chlamydia trachomatis infection. Infect Immun 62(12):5491-5497.

6 EP-A-0499681.

7 WO95/28487.

8 Murdin et al. (1993) Infect Immun 61:4406-4414.

9 Cerrone et al. (1991) Cloning and sequence of the gene for heat shock protein 60 from Chlamydia trachomatis and immunological reactivity of the protein. Infect Immun 59(1):79-90.

10 Raulston et al. (1993) Molecular characterization and outer membrane association Df a Chlamydia trachomatis protein related to the hsp70 family of proteins. J. Biol. Chem. 268:23139-23147.

11 Wang & Grayston (1970) Immunologic relationship between genital TRIC, lymphogranuloma venereum, and related organisms in a new mcrotiter indirect immunofluorescence test. Am. J. Ophthal mol. 70:367-374.

12 Bini et al. (1996) Mapping of Chlamydia trachomatis proteins by immobiline-polyacrylamide two-dimensional electrophoresis: spot identification by N-terminal sequencing and immunoblotting. Electrophoresis 17:185-190.

13 Schacter & Wyrick (1994) Culture and isolation of Chlamydia trachomatis. Meth Enzymol 236:377-390.

14 Görg et al. (1988) The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 9:531-546.

15 Hochstrasser et al. (1988) Methods for increasing the resolution oftwo-dimensional protein electrophoresis. Anal. Biochem. 173:424-435.

16 Oakley et al. (1980) A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 105:361-363.

17 Bjellqvist et al. (1993) A nonlinear wide-range immobilized pH gradient for two-dimensional electrophoresis and its definition in a relevant pH scale. Electrophoresis 14: 1357-1365.

18 Towbin et al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354.

19 Magi et al. Chapter entitled "Immunoaffinity identification of 2-DE separated proteiris" in Methods in Molecular Biology, 2-D Proteome analysis protocols. AJ Link (ed), Humana Press, Totowa, NJ, USA.

20 Matsudaira (1987) Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted orto polyvinylidene difluoride membranes. J Biol Chem 262:10035-10038.

21 Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410.

22 Devereux et al. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res 12: 387-395.

23 Gu et al. (1995) Chlamydia trachomatis RNA polymerase alpha subunit: sequence and structural analysis. J Bacteriol 177:2594-2601.

24 Nystrsm et al. (1992) Membrane protein acylation. Preference for exogenous myristic acid or endogenous sat-urated chains in Acholeplasma laidlawii. Eur J Biochem 204:231-40.

25 Jan et al. (1995) Acylation and immunological properties of Mycoplasma gallisepticum membrane proteins. Res Microbiol 146:739-50.

26 Lambert-Buisine et al. (1998) N-terminal characterization of the Bordetella pertussis filamentous haemagglutinin. Mol Microbiol 28:1283-93.

27 Bachrach et al. (1994) Brucella ribosomal protein L7/L12 is a major component ir the antigenicity of brucellin INRA for delayed-type hypersensitivity in Brucella-sensitized guinea pigs. Infect. Immun. 62:5361-5366.

28 Roop et al. (1994) Identification of an immunoreactive Brucella abortus HtrA stress; response protein homolog. Infect. Immun. 62:1000-1007.

29 Morrison et al. (1989) Chlamydial disease pathogenesis: the 57-kD chlamydial hypersensitivity antigen is a stress response protein J.Exp.Med. 170:1271-1283. Similarly: Morrison et al. (1989) Chlamydial disease pathogenesis: ocular hypersensitivity elicited by a genus-specific 57-kD protein. J. Exp. Med. 169:663.675.

30 Marques et al. (1998) Mapping and Identification of the Major Cell Wall-Associated Components of Mycobacterium leprae. Infect. Immun. 66: 2625-2631.

31 Caldas et al. (1998) Chaperone properties of bacteria) elongation factor EF-Tu. J Biol. Chem. 273:11478-82.

32 Oliveira & Splitter (1996) Immunization of mice with recombinant L7/L12 ribosomal protein confers protection against Brucella abortus infection. Vaccine 14:959-62.

Claims

1. Una proteína de C. trachomatis que tiene la secuencia dada en el número de acceso P38001 y que tiene un PM de 15,8 kDa y un pI de 4,80, para uso como medicamento.

2. Un anticuerpo que se une a la proteína de la reivindicación 1, para uso como medicamento.

3. Ácido nucleico que codifica la proteína de la reivindicación 1, para uso como medicamento.

4. El uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección debida Chlamydia.

5. El uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en la fabricación de un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de Chlamydia o anticuerpos dirigidos contra Chlamydia.

6. El uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en la fabricación de un reactivo que puede generar anticuerpos contra Chlamydia.