ES2292406T3 - Metodos para producir pigmentacion en la piel. - Google Patents
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Abstract
El uso de un inhibidor de Bowman-Birk en ausencia de inhibidor de tripsina de soja para reducir la pigmentación de la piel en un mamífero, siempre que dicho uso no sea un uso terapéutico.
Description
Métodos para producir pigmentación en la
piel.
Esta invención se relaciona con métodos y
composiciones para producir pigmentación de la piel y/o para causar
despigmentación de la piel. Más particularmente, esta invención se
relaciona con compuestos que afectan a la melanogénesis y que
pueden ser usados como agentes despigmentantes o como agentes para
obscurecer la piel.
La coloración de la piel ha sido una
preocupación para los seres humanos durante muchos años. En
particular, la capacidad para eliminar la hiperpigmentación, tal
como ocurre en las manchas de la edad, las pecas o el
envejecimiento de la piel en general, es de interés para individuos
que desean un cutis uniforme. En ciertas áreas del mundo, es
deseable el blanqueamiento general del cuerpo. Existen también
trastornos de hipopigmentación e hiperpigmentación que son
deseables de tratar. De igual modo, la capacidad para generar un
aspecto tostado sin incurrir en fotolesiones debidas a la radiación
solar es importante para muchos individuos. Se han propuesto muchos
métodos para conseguir la despigmentación, así como para conseguir
el obscurecimiento de la piel. Por ejemplo, se han usado el ácido
cójico, la hidroquinona, los retinoides y otros compuestos químicos
para la despigmentación. La dihidroxiacetona y compuestos químicos
similares han sido usados por su capacidad para "tostar" la
piel sin exposición al sol.
Muchas de estas soluciones previas no han
resultado aceptables. Existe con frecuencia una línea clara de
demarcación entre las áreas de la piel a las que se han aplicado
dichas composiciones previas. Por lo tanto, es necesaria una
aplicación precisa de todos estos compuestos para conseguir el
resultado deseado. Muchos de estos compuestos han resultado ser
bastante irritantes para la piel y, por lo tanto, indeseables para
su uso.
La comprensión de la base química y enzimática
de la melanogénesis está ampliamente documentada. Los melanocitos
migran desde la cresta neural embrionaria hacia la piel para
producir gránulos secretores, los melanosomas, que producen
melanina. La melanogénesis se produce en el melanosoma y la melanina
se distribuye posteriormente a los queratinocitos a través de las
dendritas de los melanocitos. La enzima clave en la melanogénesis
es la tirosinasa, que inicia una cascada de reacciones que
convierten la tirosina en melanina biopolimérica. Se conocen dos
proteínas relacionadas con la tirosinasa (TRP), la
TRP-1 y la TRP-2. Estas proteínas
comparten con la tirosinasa aproximadamente un 40% de homología y
tienen actividades catalíticas, así como papeles reguladores en la
melanogénesis. La TRP-1 es la glicoproteína más
abundante en los melanocitos.
A pesar del hecho de que la base química y
enzimática de la melanogénesis está bien documentada, su regulación
a nivel celular sólo está parcialmente comprendida. La tirosinasa y
las TRP comparten propiedades estructurales y biológicas con la
familia de genes de las proteínas de membrana asociadas a lisosomas
(LAMP), por lo que su abordaje de la membrana del melanosoma podría
inducir su activación. Podría estar implicada una reacción de
fosforilación/desfosforilación en las colas citoplásmicas de estas
proteínas en la regulación de la melanogénesis. La isoforma beta de
la familia de las Proteínas Kinasas C (PKC) ha mostrado regular la
melanogénesis humana a través de la activación de la tirosinasa. La
expresión génica de la tirosinasa, TRP-1 y
TRP-2, está coordinada. Las tres enzimas se expresan
en la epidermis humana. En melanocitos cocultivados con
queratinocitos, estos transcritos se expresan en una proporción de
45:45: 10, respectivamente. En melanocitos cultivados solos, sólo
están presentes los transcritos TRP-1, lo que indica
que está implicada una señal derivada de queratinocitos en la
expresión coordinada de estos genes. La regulación de las
interacciones queratinocito-melanocito y el
mecanismo de transferencia de los melanosomas a queratinocitos no
están aún comprendidos.
El Receptor Activado por
Proteasas-2 (PAR-2) es un receptor
copulado a siete proteínas G de transmembrana, que está relacionado
con, aunque difiere de, los receptores de trombina (TR, también
llamados PAR-1 y PAR-3) en su
secuencia. Ambos receptores son activados proteolíticamente por una
escisión arginina-serina en el dominio
extracelular. Los extremos N recién creados activan entonces estos
receptores como ligandos ligados. Ambos receptores podrían ser
activados por la tripsina, pero sólo los TR se activan por la
trombina. Sólo el PAR-2 se activa por la triptasa
de las células cebadas. Ambos receptores podrían también activarse
por los péptidos que corresponden a sus nuevos extremos N,
independientemente de la escisión del receptor. SLIGRL, el péptido
activador de PAR-2 del ratón, es equipotente en la
activación del receptor humano. Mientras que la función de los TR
está bien documentada, aún no se ha identificado por completo la
biología del PAR-2. Se ha descrito recientemente un
papel para la activación de PAR-2 en la inhibición
del crecimiento y la diferenciación de los queratinocitos (Derian y
col., "Differential Regulation of Human Keratinocyte Growth and
Differentiation by a Novel Family of
Protease-activate Receptors", Cell Growth &
Differentiation, Vol. 8, pp. 743-749, Julio de
1997).
Según esta invención, hemos descubierto un
método para reducir la pigmentación cutánea en mamíferos
consistente en la aplicación tópica a la piel de un mamífero de un
Inhibidor de Bowman-Birk, en ausencia de Inhibidor
de Tripsina de Soja.
Los extractos derivados de soja y las mezclas
que se sugirieron en WO-A-9904752
como agentes despigmentantes contienen tanto STI como BBI. Hemos
visto ahora que BBI solo es efectivo para despigmentar la piel. Se
puede usar BBI en todas las formulaciones y composiciones expuestas
en WO-A-9904752 en el mismo rango de
concentración que STI.
La Figura 1 muestra equivalentes epidérmicos que
contienen melanocitos de un donante Afroamericano. El tratamiento
con BBI reduce la deposición de pigmento en estos equivalentes, como
demuestra la vista superior de los equivalentes, sin tinción.
La Figura 2 muestra equivalentes epidérmicos que
contienen melanocitos de un donante Afroamericano. El tratamiento
con BBI reduce la deposición de pigmento en estos equivalentes, como
demuestra la tinción de Fontana-Mason de secciones
histológicas de estos equivalentes.
La Figura 3 muestra equivalentes epidérmicos que
contienen melanocitos de un donante Afroamericano. El tratamiento
con concentraciones crecientes de BBI reduce la deposición de
pigmento en estos equivalentes de un modo
dosis-dependiente, como demuestra la tinción de
Fontana-Mason de secciones histológicas de estos
equivalentes.
La Figura 4 es un gráfico que cuantifica el
porcentaje de inhibición de la deposición de pigmento tras el
tratamiento con BBI.
La Figura 5 muestra secciones histológicas
teñidas con F&M de piel de cerdo tratada con BBI y STI. La
deposición de melanina en la piel de cerdo se reduce dramáticamente
tras tratamiento con BBI o STI.
La Figura 6 es un gráfico de análisis de imagen
computerizada de la deposición de pigmento en secciones de piel
tales como las demostradas en la Figura 5. El gráfico cuantifica el
porcentaje de inhibición de la deposición de pigmento en la piel de
cerdo tras tratamiento con BBI o STI.
Aunque no deseamos inclinarnos por la siguiente
teoría, teorizamos que los compuestos capaces de afectar a la
pigmentación de la piel lo hacen interaccionando directa o
indirectamente con el PAR-2 de los queratinocitos o
con su proteasa activadora y afectan así a la melanogénesis, directa
o indirectamente. Posiblemente, los compuestos de esta invención
inducen, en caso de un aumento en la pigmentación, o reducen, en el
caso de una reducción en la pigmentación, la señal para transportar
melanosomas por parte de los melanocitos, o para recibir
melanosomas por parte de los queratinocitos en la piel.
Recientemente hemos identificado que el
Inhibidor de Bowman-Birk ("BBI"), un grupo de
proteínas derivadas de legumbres, es un agente despigmentantes.
Mientras que STI es una proteína de 21 KD
primariamente con actividad inhibidora de la tripsina, el BBI
derivado de soja es una proteína de menor tamaño, de 8 KD, que
inhibe la quimotripsina y la tripsina. A diferencia de STI, BBI no
tiene un dominio de tipo Kunitz, lo que sugiere diferentes
interacciones con las serina-proteasas. Se conoce
el BBI en cuanto a su capacidad para prevenir la carcinogénesis en
numerosos modelos in vivo e in vitro. En algunos
modelos de carcinogénesis en animales, se vio que BBI tenía fuertes
efectos antiinflamatorios. BBI es más resistente que STI a la
desnaturalización por calor. Para una revisión sobre BBI, véase
Kennedy AR, Chemopreventive agents: protease inhibitors, Pharmacol
Ther 78: 3, 167-209, Junio de 1998.
Los compuestos que son activos en las
composiciones y en los métodos de esta invención pueden ser
administrados por cualquier medio conocido para los expertos en la
técnica. Si los parámetros de administración del agente
farmacéutico o cosmético tópicamente activo así lo requieren, la
composición tópicamente activa de esta invención puede estar además
preferiblemente compuesta por un vehículo farmacéutica o
cosméticamente aceptable capaz de funcionar como sistema de
administración para permitir la penetración del agente tópicamente
activo en la
piel.
piel.
Un vehículo aceptable para administración tópica
de algunas de las composiciones de esta invención puede contener
liposomas. Los liposomas son más preferiblemente no iónicos y
contienen a) dilaurato de glicerol (preferiblemente en una cantidad
de entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 70% en peso); b)
compuestos que tienen el esqueleto esteroideo que se encuentra en
el colesterol (preferiblemente en una cantidad de aproximadamente
un 5% y aproximadamente un 45% en peso); y c) uno o más éteres de
ácidos grasos que tienen de aproximadamente 12 a aproximadamente 18
átomos de carbono (preferiblemente en una cantidad de entre
aproximadamente un 5% y aproximadamente un 70% en peso
colectivamente), donde los compuestos constituyentes de los
liposomas están preferiblemente en una proporción de
aproximadamente 37,5:12,5:33,3:16,7. Los liposomas constituidos por
dilaurato de glicerol/colesterol/éter
polioxietilen-10-estearílico/éter
polioxietilen-9-laurílico (liposomas
GDL) son los más preferidos. Preferiblemente, los liposomas están
presentes en una cantidad, basada en el volumen total de la
composición, de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL
y más preferiblemente de aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente
50 mg/mL. La más preferida es una proporción de aproximadamente
37,5:12,5:33,3:16,7. Se pueden preparar preferiblemente liposomas
adecuados según el protocolo expuesto en el Ejemplo 1, aunque son
también aceptables otros métodos comúnmente utilizados en la
técnica.
Se puede preparar la composición antes descrita
combinando los componentes deseados en un recipiente adecuado y
mezclándolos en condiciones ambientales en cualquier medio de mezcla
de alto corte convencional bien conocido en la técnica para
preparaciones de liposomas no iónicos, tales como las descritas en
Niemiec y col., "Influence of Nonionic Liposomal Composition On
Topical Delivery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units. An
In Vivo Study Using the Hamster Ear Model", 12 Pharm. Res.
1184-88 (1995) ("Niemiec"), que se incorpora
aquí como referencia en su totalidad. Hemos visto que la presencia
de estos liposomas en las composiciones de esta invención puede
aumentar las capacidades despigmentantes de algunas de las
composiciones de esta invención.
Otras formulaciones preferibles pueden contener,
por ejemplo, formulaciones líquidas derivadas directamente de
legumbres o de otra planta adecuada.
También se pueden utilizar emulsiones de
aceite-en-agua, emulsiones de
agua-en-aceite, formulaciones
basadas en solventes y geles acuosos conocidos para los expertos en
la técnica como vehículos para la administración de las
composiciones de esta invención. Se pueden purificar productos de
extractos naturales según técnicas conocidas en este campo. Quienes
tienen conocimientos ordinarios en la técnica disponen también de
fuentes recombinantes de compuestos.
En realizaciones alternativas, la composición
cosmética tópicamente activa puede ser eventualmente combinada con
otros ingredientes, tales como hidratantes, adyuvantes cosméticos,
antioxidantes, agentes blanqueantes, inhibidores de la tirosinasa y
otros agentes de despigmentación conocidos, surfactantes, agentes
espumantes, acondicionadores, humectantes, fragancias,
viscosificadores, agentes tamponantes, conservantes, pantallas
solares y similares. Las composiciones de esta invención pueden
contener también cantidades activas de retinoides (es decir,
compuestos que se unen a cualquier miembro de la familia de los
receptores de retinoides), incluyendo, por ejemplo, tretinoína,
retinol, ésteres de tretinoína y/o retinol y similares.
La composición cosmética tópicamente activa debe
ser aplicada en una cantidad efectiva para efectuar cambios en la
pigmentación en la piel de mamíferos. Tal como se usa aquí,
"cantidad efectiva" significará una cantidad suficiente para
cubrir la región de superficie de piel en la que se desea un cambio
en la pigmentación. Preferiblemente, la composición es
generosamente aplicada a la superficie de la piel de tal forma que,
en base a un cm de superficie de piel, esté presente de
aproximadamente 2 \mul/cm^{2} a aproximadamente 200
\mul/cm^{2} de agente tópicamente activo cuando se desea un
cambio en la pigmentación.
Se pueden emplear derivados líquidos y extractos
naturales producidos directamente de plantas o fuentes botánicas en
las composiciones de esta invención en una concentración (p/v) de
aproximadamente un 1 a aproximadamente un 99%. Las fracciones de
extractos naturales y de inhibidores de proteasas naturales pueden
tener un rango preferido diferente, de aproximadamente un 0,01% a
aproximadamente un 20% y más preferiblemente de aproximadamente un
1% a aproximadamente un 10% de la composición.
Hemos visto inesperadamente que, cuando se
aplica tópicamente un BBI a la piel de un animal, se conseguía un
cambio significativo en la pigmentación. Preferiblemente, se aplican
agentes despigmentantes (así como otros agentes que afectan a la
pigmentación de esta invención) a la piel de un mamífero a una
concentración y dosis relativamente altas (de aproximadamente un
20% a aproximadamente un 99% para derivados líquidos y extractos de
materiales botánicos y de aproximadamente un 1% a aproximadamente un
20% para fracciones de extractos naturales e inhibidores de
proteasas naturales) entre una y dos veces al día durante un período
de tiempo hasta que la piel evidencia un cambio en la pigmentación.
Esto puede corresponder a de aproximadamente cuatro a
aproximadamente diez semanas o más. A continuación, una vez se ha
conseguido el cambio en la pigmentación, se puede aplicar una menor
concentración y dosis (de aproximadamente un 10% a aproximadamente
un 90% para derivados líquidos y extractos de materiales botánicos
y de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 5% para
fracciones de extractos naturales e inhibidores de proteasas
naturales) de ingrediente activo en un programa de tiempo menos
frecuente, v.g., de aproximadamente una vez al día a aproximadamente
dos veces a la semana. Los efectos de los agentes activos de esta
invención son reversibles, por lo que, para mantener estos efectos,
habría que realizar una aplicación o administración continua. La
invención aquí descrita de forma ilustrativa puede ser llevada
adecuadamente a la práctica en ausencia de cualquier componente,
ingrediente o etapa que no esté aquí específicamente descrito.
La invención aquí descrita de forma ilustrativa
puede ser adecuadamente llevada a la práctica en ausencia de
cualquier componente, ingrediente o etapa que no esté aquí
específicamente descrito. Se exponen a continuación varios ejemplos
para ilustrar aún más la naturaleza de la invención y el modo de
llevarla a cabo, pero no sirven para limitar el alcance de los
métodos y composiciones de esta invención.
Ejemplo
1
Para estudiar los posibles papeles de BBI en la
pigmentación, se usó un sistema de equivalente epidérmico in
vitro que contenía melanocitos. El sistema de equivalente
epidérmico usado en este estudio es el sistema MelanoDerm
mel-300, comercializado por MatTek Co., de Ashland,
MA. Este sistema contiene melanocitos normales humanos, junto con
queratinocitos epidérmicos normales derivados de humano, derivados
de prepucio Afroamericano. Estas células fueron cultivadas para
formar un modelo de múltiples capas, altamente diferenciado, de la
epidermis humana. En los siguientes ejemplos, se trataron los
equivalentes con BBI (0,1%) durante tres días y se recogieron las
muestras al cuarto día después de comenzar el tratamiento. Se
compararon primeramente los equivalentes recogidos en cuanto a su
color sin tinción, siguiendo con un examen histológico con tinción
de Fontana-Mason (F&M), una tinción conocida
para los expertos en la técnica. La tinción F&M es una técnica
de tinción con plata que marca clara y limpiamente las melaninas
que tienen una elevada actividad reductora del nitrato de plata.
También se capturaron imágenes de las secciones teñidas para
análisis de imagen. Se procesaron al menos tres secciones por
equivalente y tres equivalentes por experimento. Se usó la base de
datos Empire Images 1.1 en un ordenador Gateway 2000
P5-100 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD) para
capturar imágenes. Se usó Image Pro Plus, versión 3.0, para el
análisis de imagen. Los parámetros medidos eran el área superficial
de los depósitos de plata en los melanocitos y la densidad de
luminosidad de cada píxel. Se definió un "factor de
pigmentación" como el área superficial de los depósitos de plata
dividida por el área superficial epidérmica total. Se asignó un
valor de uno (100%) a los controles no tratados y se normalizaron
los valores de los grupos de tratamiento con respecto a sus
controles relevantes.
Como se muestra en la Figura 1, los equivalentes
mel-300 sin tratar son visiblemente obscuros sin
tinción alguna. Los equivalentes tratados con BBI eran más claros
que estos controles, lo que demuestra la capacidad de BBI para
reducir visualmente la pigmentación. La Figura 2 muestra las
secciones histológicas de estos equivalentes, después de la tinción
F&M. En esta Figura, las áreas negras representan depósitos de
melanina tanto en melanocitos como en queratinocitos. Como se
muestra en la Figura 2, el tratamiento con BBI da lugar a una menor
deposición de melanina tanto en los melanocitos como en los
queratinocitos de los equivalentes tratados. El análisis de imagen
reveló que los equivalentes tratados con BBI tienen sólo un 50,6% de
depósitos de melanina en relación a los controles.
Ejemplo
2
Se trataron equivalentes epidérmicos que
contenían melanocitos como se describe en el ejemplo 1 con
concentraciones crecientes de BBI, de un 0,001% a un 0,1%. Siguiendo
el mismo procedimiento experimental descrito en el ejemplo 1, se
vio que el efecto despigmentante de BBI era
dosis-dependiente. La Figura 3 muestra secciones
teñidas con F&M de los equivalentes tratados, que demuestran la
dosis-respuesta y el efecto despigmentante de tan
sólo un 0,001% de BBI. El análisis de imagen computerizada, mostrado
en la Figura 4, cuantifica este efecto y demuestra además su
naturaleza de respuesta a la dosis.
Ejemplo
3
Se trató un microcerdo de Yucatan de piel
obscura con BBI o STI, al 1%, en PBS con 20 mg/ml de liposomas. Las
preparaciones de liposomas no iónicos, tales como los descritos en
Niemiec y col., "Influence of Nonionic Liposomal Composition On
Topical Delivery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units: An In
Vivo Study Using the Hamster Ear Model", 12 Pharm. Res.
1184-88 (1995) ("Niemiec"), que se incorpora
aquí como referencia en su totalidad, son bien conocidas en la
técnica y se describen en JBP-430. Hemos visto que
la presencia de estos liposomas en las composiciones de esta
invención puede aumentar las capacidades despigmentantes de algunas
de las composiciones de esta invención. Se prepararon liposomas GDL
como se expone en Niemiec, y col., antes citado, a excepción de los
cambios siguientes: la formulación liposómica no iónica contenía
dilaurato de glicerol (Emulsynt GDL, ISP Van Dyk)/colesterol
(Croda)/éter
polioxietilen-10-estearílico (Brij
76, ICI)/éter
polioxi-etilen-9-laurílico,
en una proporción de 37,5:12,5:33,3:16,7. Se usó tampón Hepes,
0,05M, pH 7,4, (Gibco-BRL, de Gaithersburg, MD)
como la fase acuosa en la preparación de los liposomas.
Se aplicaron cada una de las preparaciones de
BBI, STI y vehículo liposómico en dos sitios del flanco del cerdo
dos veces al día, cinco días a la semana, durante ocho semanas.
Después de ocho semanas de tratamiento, la aplicación de BBI o de
STI dio un efecto aclarador visible. El análisis histológico de
secciones de piel teñidas con F&M de sitios no tratados y
tratados confirmó esta observación. La Figura 5 muestra las
secciones de piel teñidas con F&M del cerdo tratado, lo que
demuestra una dramática reducción en la deposición de pigmento en
sitios tratados con BBI o STL. El análisis de imagen computerizada
mostrado en la Figura 6 cuantifica este efecto y demuestra aún más
el efecto despigmentante de BBI.
Claims (5)
1. El uso de un inhibidor de
Bowman-Birk en ausencia de inhibidor de tripsina de
soja para reducir la pigmentación de la piel en un mamífero,
siempre que dicho uso no sea un uso terapéutico.
2. El uso según la reivindicación 1, donde dicho
inhibidor de Bowman-Birk deriva de una o más de las
familias botánicas leguminosae, solanaceae, gramineae y
cucurbitaceae.
3. El uso según la reivindicación 2, donde dicho
inhibidor de Bowman-Birk deriva de legumbres.
4. El uso según la reivindicación 3, donde dicho
inhibidor de Bowman-Birk deriva de extracto de soja
no desnaturalizado.
5. El uso según la reivindicación 4, donde dicho
inhibidor de Bowman-Birk deriva de fracciones de
extracto de soja no desnaturalizado.
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