ES2312062T3 - Procedimiento para la deteccion de probnp n-terminal. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección de proBNP N-terminal en una muestra con por lo menos dos anticuerpos, que reconocen epítopes distintos del proBNP N-terminal, caracterizado porque como muestra se emplea orina.
Description
Procedimiento para la detección de proBNP
N-terminal.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de proBNP N-terminal
en una muestra de orina con por lo menos dos anticuerpos, que
reconocen diversos epítopes de proBNP N-terminal. El
procedimiento puede aplicarse para la diferenciación o
clasificación de muestras de personas sanas y muestras de pacientes
de los grupos de I a IV según la NYHA. La invención se refiere
además a proBNP N-terminal recombinante, a su
utilización como patrón en un procedimiento para la detección de
proBNP N-terminal, así como anticuerpos, que
reconocen al proBNP N-terminal recombinante y a su
obtención.
La insuficiencia cardíaca es un fenómeno muy
generalizado, sobre todo en el mundo occidental. Según el
diccionario Roche de Medicina (1993, Urban & Schwarzenberg) se
entiende por insuficiencia cardíaca la incapacidad aguda o crónica
del corazón en situación de carga, o incluso en situación de reposo,
para impulsar el caudal sanguíneo necesario y para recibir el
retorno venoso (el denominado fallo de retorno y de impulsión).
Existe, pues, una debilidad de la función de bombeo. Las causas de
la insuficiencia cardíaca pueden ser múltiples. Entre otras cabe
mencionar las alteraciones inflamatorias y degenerativas de la
musculatura cardíaca, los trastornos de la irrigación coronaria, el
infarto y las lesiones cardíacas. Esto se traduce a alteraciones de
la circulación sanguínea periférica, trastornos de la respiración,
de la función renal y del metabolismo de electrolitos (edema) y a
una menor capacidad de la musculatura que mueve el esqueleto.
Según la Asociación Cardíaca de Nueva York
(NYHA) atendiendo a ensayos de carga corporal se puede dividir la
insuficiencia cardíaca en los grupos llamados de NYHA: el grupo I
incluye la total ausencia de molestias cuando el cuerpo se somete a
una carga normal, el II significa una ligera limitación de la carga
corporal asumible, el III significa una fuerte limitación del
esfuerzo corporal, el IV significa que en cualquier actividad
corporal tiene lugar un incremento de la mayor parte de los signos
de insuficiencia, que se notan incluso en reposo.
Para el tratamiento medicamentoso eficaz de la
insuficiencia cardíaca mediante glucósidos, vasodilatadores,
inhibidores ACE y/o bloqueadores \beta es necesario diagnosticar
previamente con exactitud la existencia de la insuficiencia
cardíaca, a ser posible clasificar también su grado de gravedad y
además hacer el seguimiento del tratamiento.
En el estado de la técnica se han discutido
algunos marcadores de suero para el diagnóstico precoz de la
insuficiencia cardíaca, por ejemplo la ANP (la hormona de péptido
natriurético atrial N-terminal) y la proANP, CNP
(péptido C-natriurético), la adrenomedulina, el
neuropéptido Y, la endotelina y el BNP (péptido natriurético
cerebral). La ANP y proANP son indicados en principio como
marcadores para el diagnóstico de la insuficiencia cardíaca, pero
poseen una estabilidad reducida o bien una vida media corta en la
sangre, lo cual dificulta las mediciones del diagnóstico (Clin.
Sci. 95(3), 235-239, 1998; Cleland y col.,
Heart 75, 410-413, 1996).
Un marcado citado con frecuencia y considerado
muy prometedor es el BNP (péptido natriurético cerebral). El BNP se
identificó inicialmente en el cerebro de los cerdos. Se trata de una
hormona cardíaca, que presenta una gran similitud estructural y
funcional con el ANP (péptido natriurético atrial) (Sudoh y col.,
Nature 332, 78-81, 1988). El BNP humano, que
consta de 32 aminoácidos, se segrega sobre todo en los ventrículos
del corazón y circula en el plasma sanguíneo humano. El uso del BNP
como marcador para el diagnóstico se conoce por ejemplo por el
documento EP-A-0 542 255. El BNP
posee un puente disulfuro intramolecular y no es estable como
analito, probablemente por su función fisiológica como hormona, que
se descompone de nuevo rápidamente, por lo cual es idóneo con
limitaciones como marcador para el diagnóstico (Masuta y col., Clin.
Chem. vol. 44, nº 6, suplemento A, 130, 1998; Tsuji y col.,
Clin. Chem. 40, 672, 1994).
La molécula previa del BNP, el proBNP, consta de
108 aminoácidos, de los cuales los 32 aminoácidos
(77-108) C-terminales, que se
denominan BNP, son los que despliegan la acción hormonal propiamente
dicha. Los aminoácidos 1-76
N-terminales desprendidos de la molécula previa se
denominan proBNP N-terminal. Además del BNP
(77-108) circula también el proBNP
N-terminal y otros productos de descomposición
1-76) en el plasma (Hunt y col., Biochem. Biophys.
Res. Com. 214, 1175-1183, 1995), de modo que el
proBNP N-terminal se toma también en consideración
como marcador de la insuficiencia cardíaca. No se ha esclarecido de
modo inequívoco si también la molécula previa proBNP existe también
en el plasma. Pero se ha descrito (Hunt y col., Peptides, vol. 18,
nº 10, 1475-1481, 1997), que en el plasma se puede
detectar una porción menor del proBNP (1-108), pero
que debido a la descomposición parcial rápida del extremo
N-terminal faltan algunos aminoácidos. En la
bibliografía técnica se denomina esta molécula como "high
molecular weight-BNP".
En el documento WO 93/24531 (US 5,786,163) se
describe un procedimiento inmunológico para la detección de proBNP
N-terminal y los anticuerpos empleados para ello.
Para la obtención los anticuerpos se emplean péptidos individuales
de origen sintético de la secuencia del proBNP
N-terminal. En principio la obtención de anticuerpos
es posible por inmunización peptídica, pero la afinidad con la
molécula en su conjunto es por lo general demasiado baja para poder
lograr la sensibilidad requerida en un procedimiento de ensayo.
Además se corre el riesgo de que, empleando péptidos, se obtengan
anticuerpos que reconozcan por ejemplo el extremo C del péptido y,
por tanto, se puedan fijar solamente sobre esta fracción de la
molécula total. De ello se deriva que estos anticuerpos no puedan
fijarse sobre la molécula en conjunto o que lo hagan de forma débil.
En el documento WO 93/24531 se describen anticuerpos policlonales
dirigidos contra un péptido individual derivado del proBNP
N-terminal. Se pone de manifiesto que los
anticuerpos obtenidos se fijan sobre el péptido de inmunización
(aminoácidos 47-64) en formato de ensayo
competitivo. Pero, se pone también de manifiesto que los anticuerpos
son capaces de fijarse sobre el proBNP N-terminal
nativo como molécula total de una muestra. Por otro lado, el ensayo
sandwich descrito en WO 93/24531 no puede realizarse en una muestra
del modo descrito, porque no se dispone de ningún material estándar
apropiado y no se dispone de anticuerpos que se dirijan contra dos
epítopes distintos.
Como material de muestra se describen en
concreto en el WO 93/24531 muestras de sangre, en especial suero y
plasma.
Otro problema del estado de la técnica es la
sensibilidad del ensayo. En base al ensayo competitivo descrito en
WO 93/24531, en el que el péptido 47-64 en forma
marcada compite como trazador con una muestra o con el péptido
estándar sin marcar 47-64 por la fijación con los
anticuerpos policlonales de suero de conejo, después de una
incubación de 48 horas se consigue solamente una competición muy
moderada, de la que en el mejor de los casos puede derivarse un
límite de detección de aprox. 250 fmol/ml. Esto no es suficiente ni
para la diferenciación de las personas y los pacientes de
insuficiencia cardíaca, ni para la clasificación diferenciada de las
muestras de pacientes por el grado de gravedad de la insuficiencia
cardíaca. Además, los períodos de incubación largos del ensayo
competitivo no son aceptables para las mediciones rutinarias de las
muestras en un laboratorio automatizado.
Hunt y col. (Clinical Endocrinology 47,
287-296, 1997) describen también un ensayo
competitivo para la detección del proBNP
N-terminal. Para ello se extrae la muestra de plasma
antes de la medición de forma laboriosa, corriéndose el riesgo de
destruir el analito y llegar a mediciones erróneas. El antisuero que
se emplea se genera de modo similar al descrito en el WO 93/24531
por inmunización con un péptido sintético. Hunt y col. generan el
antisuero por inmunización con los aminoácidos 1-13
del proBNP N-terminal, como patrón emplean el
péptido de los aminoácidos 1-21. También en este
ensayo se necesita un período de incubación largo. Después de una
incubación de 24 horas se alcanza el límite de detección inferior
de 1,3 fmol/ml.
En el estado de la técnica no existe ningún
procedimiento para la detección del proBNP
N-terminal, que con tiempos de incubación cortos
permita una detección fiable y sensible del proBNP
N-terminal nativo.
Es, pues, el objetivo de esta invención
desarrollar un procedimiento para la detección de proBNP
N-terminal en una muestra de orina que evite en su
mayor parte los inconvenientes mencionados del estado de la técnica.
Debería poder conseguirse sobre todo una sensibilidad elevada en el
ensayo, para que pueda realizarse la diferenciación de las muestras
procedentes de personas sanas y de pacientes de los grupos de I a IV
según la NYHA.
Este objetivo se alcanza con el procedimiento
definido en detalle en las reivindicaciones para la detección del
proBNP N-terminal en una muestra. El procedimiento
se caracteriza porque se emplean por lo menos dos anticuerpos, que
reconocen diversos epítopes del proBNP N-terminal, y
como muestra se emplea la orina.
Lo esencial del procedimiento de la invención es
que se detecta el proBNP N-terminal nativo de
muestra. Es decir, los anticuerpos tienen que ser capaces de
reconocer y fijarse específicamente sobre la molécula intacta y el
proBNP eventualmente no descompuesto (1-108) y a ser
posible también sobre los fragmentos digeridos proteolíticamente de
una muestra. En el procedimiento se emplean por lo menos dos
anticuerpos distintos, que se fijan sobre diferentes epítopes del
proBNP N-terminal. Los epítopes pueden ser epítopes
lineales o epítopes llamados de conformación. Los epítopes están
localizados con preferencia de manera que los dos anticuerpos puedan
fijarse sobre ellos al mismo tiempo y no estén demasiado separados
entre sí.
Dado que el método de la invención no permite
diferenciar entre proBNP N-terminal, proBNP y
péptidos muy afines (productos de descomposición), a continuación
se entenderá por NT-proBNP la totalidad de todos los
péptidos reconocidos en el procedimiento de ensayo, en especial el
proBNP N-terminal ya conocido
(1-76).
Según la invención se entiende por el término
"epítope" el sitio de fijación existente en el reactivo de
unión inmunológico, por ejemplo en un antígeno, sobre el cual se
fija específicamente un anticuerpo. Un "epítope" se define por
lo general de manera inequívoca con 6-8 aminoácidos.
Según la invención, el reactivo de unión equivale al proBNP
N-terminal o bien a una secuencia parcial del mismo.
El epítope, sobre el que se fija el anticuerpo, es en tal caso una
zona parcial del reactivo de unión. El epítope puede estar presente
en forma lineal o en forma de epítope de conformación.
Mediante los dos anticuerpos de especificidad
distinta es posible realizar un procedimiento de detección del
analito más rápido que el modelo de ensayo competitivo laborioso del
estado de la técnica. El procedimiento de detección de la invención
puede realizarse por un método homogéneo o heterogéneo. Es preferido
el método heterogéneo y es especialmente preferido el método
sandwich que es familiar a los expertos.
Se lleva a cabo con preferencia un procedimiento
para la determinación del proBNP N-terminal a través
de los pasos siguientes:
a) reacción de la muestra con un primer
anticuerpo específico del proBNP N-terminal, que
lleva un grupo capaz de fijarse sobre la fase sólida, gracias al
cual puede tener lugar la fijación sobre la fase sólida, o reacción
de la muestra con un primer anticuerpo específico del proBNP
N-terminal, que ya esté fijado sobre la fase
sólida,
b) reacción de esta solución con el segundo
anticuerpo, que reconoce un epítope distinto del
NT-proBNP del que reconoce el primer anticuerpo, y
lleva un marcador,
c) fijación del complejo inmune formado sobre
una fase sólida, dicha fase sólida puede estar ya presente en el
paso a),
d) separación de las fases sólida y líquida,
e) detección del marcador en una o en ambas
fases.
Para la determinación cuantitativa se efectúa la
misma medición con una cantidad definida de proBNP
N-terminal como patrón y, después de la
determinación de la muestra se realiza como paso f) una comparación
de los valores medidos del patrón con el valor medido de la muestra
y se cuantifica dicha comparación.
Se entiende por el término "anticuerpos" en
el sentido de la invención los anticuerpos mono- o policlonales,
quiméricos o humanizados o diversos que pueden obtenerse por
modificaciones de ingeniería genética, así como todos los
fragmentos, por ejemplo los F(ab')_{2}, Fab' y los
fragmentos Fab, que los expertos ya conocen. Tiene que garantizarse
únicamente la capacidad de fijación inmunológica específica sobre el
proBNP N-terminal.
El primer anticuerpo, específico del proBNP
N-terminal puede fijarse directamente sobre la fase
sólida o bien la fijación sobre la fase sólida puede tener lugar de
modo indirecto a través de un sistema de fijación específico. La
fijación directa de este anticuerpo sobre la fase sólida se efectúa
por métodos que los expertos ya conocen, por ejemplo por adsorción.
Si la fijación se efectúa de modo indirecto a través de un sistema
específico de fijación, entonces el primer anticuerpo es un
conjugado formado por un anticuerpo contra el proBNP
N-terminal y un reactivo del sistema de fijación
específico.
Se entienden por sistema de fijación específico
dos reactivos que pueden reaccionar específicamente entre sí. La
capacidad de unión puede basarse en una reacción inmunológica o en
otra reacción específica. Como sistema de fijación específico se
emplea con preferencia una combinación de biotina y avidina o de
biotina y estreptavidina. Otras combinaciones preferidas son la
biotina y la antibiotina, el hapteno y el
anti-hapteno, el fragmento Fc de un anticuerpo y el
anticuerpo dirigido contra este fragmento Fc o un hidrato de carbono
y lectina. Entonces, un reactivo del sistema de fijación específico
forma parte del conjugado.
El otro reactivo del sistema específico de
fijación del primer reactivo está presente en forma de recubrimiento
de la fase sólida. Se emplea con preferencia la estreptavidina o la
avidina. La fijación del otro reactivo del sistema de fijación
específico sobre un material sustrato insoluble puede tener lugar
por métodos habituales que los expertos ya conocen. Para ello es
idóneo un enlace covalente y también una fijación de tipo
adsorción.
Como fase sólida son idóneos los tubos de ensayo
o las placas de microvaloración de poliestireno o de plásticos
similares, cuya superficie interior está recubierta con un reactivo
del sistema específico de fijación. Son también idóneas y
especialmente preferidas las sustancias en forma de partículas, por
ejemplo las partículas de látex, las partículas magnéticas, los
materiales de tipo tamiz molecular, las partículas de vidrio, las
mangueras de plástico y similares. Pueden utilizarse también
sustratos laminares porosos, por ejemplo papel o nitrocelulosa. Se
emplean con preferencia especial las bolas magnéticas, también
llamadas "beads", que a su vez pueden estar recubiertas con el
correspondiente reactivo del sistema de fijación específico antes
descrito. Después de la reacción de detección, estas
micropartículas pueden separarse de la fase líquida por ejemplo por
filtración, centrifugación o, en el caso de las partículas
magnéticas, por acción de un imán.
El segundo anticuerpo específico reconoce a un
epítope del proBNP N-terminal distinto del que
reconoce el primer anticuerpo. La distancia entre ambos epítopes
dentro de la molécula tiene que ser lo suficientemente grande, para
que sea posible la unión simultánea de los dos anticuerpos sobre el
proBNP N-terminal sin que se entorpezcan o limiten,
porque de lo contrario no se podría formar ningún complejo
sandwich.
La detección de las reacciones de fijación
específicas entre los anticuerpos contra el proBNP
N-terminal y el proBNP N-terminal
puede realizarse de diversas maneras. En general se marca el segundo
anticuerpo. Los marcadores habituales son los cromógenos, los
fluoróforos, las sustancias capaces de quimio- o
electroquimioluminiscencia, los isótopos radiactivos, los haptenos,
los marcadores enzimáticos o las sustancias que a su vez pueden
formar un par de fijación específico, por ejemplo
biotina/estreptavidina. La detección del complejo inmune se realiza
entonces mediante la señal que emite el marcador. Por ejemplo, el
segundo anticuerpo puede estar marcado con el hapteno digoxigenina.
Este hapteno está fijado a su vez sobre otro anticuerpo específico
de la digoxigenina. El anticuerpo específico de la digoxigenina
está marcado a su vez con una enzima, por ejemplo una peroxidasa.
La detección propiamente dicha se realiza entonces mediante la
reacción de la peroxidasa con un sustrato apropiado, que se traduce
en una variación del color o de la extinción.
Como muestra para la ejecución del procedimiento
de detección del proBNP N-terminal se emplea la
orina.
Además de los ensayos llamadas húmedos, en los
que los reactivos están presentes en fase líquida, pueden utilizarse
también otros formatos habituales de ensayo seco, que son idóneos
para la detección de antígenos, haptenos, péptidos, proteínas,
anticuerpos, etc. Estos ensayos secos o tiras analíticas, como los
descritos en el documento EP-A-0
186 799, contienen en general todos los componentes sobre un
sustrato, excepto la muestra que se tendrá que analizar. La
reacción de detección se efectúa poniendo en contacto la tira
analítica con la muestra líquida.
El procedimiento de la invención se caracteriza
porque el límite inferior de detección del proBNP
N-terminal se sitúa por debajo de 1 fmol/ml
(equivalente a 1 pmol/l). La alta sensibilidad de la invención, de
< 1 fmol/ml, se consigue sin períodos prolongados de incubación.
En total, la duración del procedimiento practicado en una placa de
microvaloración es inferior a 2 horas, con preferencia en los
ensayos de detección más sensibles, como es la
electroquimioluminiscencia, la duración es de 15 minutos. Un límite
superior del procedimiento de detección en lo que respecta a la
concentración a detectar prácticamente no existe. El límite superior
tecnológico viene dado en general por el método de medición
empleado. El procedimiento detecta también en principio las
concentraciones de proBNP N-terminal muy
elevadas.
Otra ventaja del procedimiento de la invención
es la buena diferenciación de las muestras de pacientes con y sin
insuficiencia cardíaca a partir de los valores obtenidos en las
mediciones. El procedimiento de detección es tan sensible que
incluso puede efectuarse la diferenciación entre pacientes sin
enfermedad coronaria y pacientes que tienen una insuficiencia
cardíaca débilmente acusada o que se inicia lentamente de los grupos
I y II según la asociación NYHA. El reconocimiento precoz de una
insuficiencia cardíaca incipiente puede influir en el tratamiento
medicamentoso temprano y, de este modo, prolongar considerablemente
la supervivencia del paciente.
Se describe además un proBNP
N-terminal obtenido por métodos recombinantes. Se
entiende por proBNP N-terminal la parte
N-terminal desgajada de la molécula previa de
proBNP, cuyo tamaño es de 108 aminoácidos. Se entienden también por
proBNP N-terminal las porciones del mismo, que
pueden aparecer en la sangre como consecuencia de reacciones de
descomposición de esta molécula.
En el estado de la técnica no se conoce hasta el
presente ningún proBNP N-terminal recombinante,
porque su obtención no es fácil, debido a que la secuencia de
aminoácidos es corta. Por la aparición de secuencias erróneas y la
fuerte reducción del rendimiento por ciclo de síntesis, la síntesis
química de un péptido de más de 30 aminoácidos no es una buena
alternativa si se compara con la obtención recombinante en un
organismo hospedante.
Sin embargo, para un procedimiento de detección
de diagnóstico se necesita siempre un material patrón o de control,
mediante el cual por un lado puede efectuarse la determinación
cuantitativa del analito y, por otro lado, puede comprobarse la
capacidad funcional del ensayo. Si quiere obtenerse un resultado
cuantitativo, entonces tendrá que realizarse un calibrado
cuantitativo definido mediante una serie de patrones. Tal calibrado
es también oportuno cuando el material empleado como patrón se
comporta en el ensayo inmnológico de manera igual o muy similar al
analito. Es esencial que el patrón tenga una similitud estructural y
sobre todo inmunológica lo suficientemente grande con el analito
para que la fijación del patrón sobre el anticuerpo de detección se
realice de manera que después pueda tener también lugar la fijación
sobre la molécula nativa de la muestra.
En el estado de la técnica no se dispone de
semejante material patrón para el procedimiento de detección del
proBNP N-terminal. Solamente se han descrito
péptidos sintéticos cortos. Según la invención es posible por
primera vez obtener mediante la síntesis genética una secuencia de
DNA que codifica al proBNP N-terminal y después
lograr la expresión recombinante del proBNP
N-terminal en E. coli. El procedimiento se
describe en el ejemplo
1.
1.
Se describe, pues, el uso del proBNP
N-terminal recombinante como patrón en un
procedimiento de detección de proBNP N-terminal en
una muestra mediante por lo menos dos anticuerpos, que reconocen
diferentes epítopes del proBNP N-terminal.
Para fines de inmunización hasta ahora se
emplean en el estado de la técnica solamente péptidos cortos,
derivados del proBNP N-terminal. El inconveniente
de las inmunizaciones peptídicas estriba en que por lo general solo
se obtienen anticuerpos muy poco afines o bien los anticuerpos
obtenidos solamente reaccionan con epítopes lineales y no pueden
fijarse sobre el antígeno nativo doblado existente en la muestra
(ver ejemplo 3).
Es importante, pues, para las inmunizaciones
destinadas a la obtención de anticuerpos utilizar un inmunógeno que
tenga una similitud suficientemente grande con el analito que se
pretende detectar. Solo así se asegura que los anticuerpos se
fijarán con alta afinidad sobre el analito nativo existente en la
muestra.
Se describe, pues, también el uso del proBNP
N-terminal recombinante como inmunógeno para la
obtención de anticuerpos contra el proBNP
N-terminal.
Se describen además anticuerpos contra el proBNP
N-terminal recombinante. La definición del término
anticuerpo se ajusta a la definición de los párrafos de la
ejecución del ensayo. Los anticuerpos de la invención reconocen con
preferencia los epítopes específicos de la porción
N-terminal del proBNP N-terminal,
que tiene un tamaño de 76 aminoácidos, con preferencia el fragmento
de los aminoácidos 10-66, con preferencia especial
el fragmento de los aminoácidos 10-50 o
10-38. Cuando los epítopes reconocidos por los
anticuerpos están localizados de esta manera, es conveniente que
también el proBNP N-terminal, que en una muestra se
haya empezado a digerir proteolíticamente desde los extremos, siga
conservando estos epítopes. Por ello, la estabilidad del analito
dentro de la muestra es de importancia digamos secundaria. Los
epítopes de las regiones preferidas del proBNP
N-terminal pueden ser lineales o estar presentes en
forma de epítopes de conformación.
Se describen, pues, también anticuerpos
monoclonales producidos por las líneas celulares MAK M 10.1.1 y MAK
M 13.4.14, depositadas y registradas con fecha 26.01.1999 en la
colección alemana DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania. Los anticuerpos
producidos por las dos líneas celulares mencionadas son anticuerpos
de tipo IgG. Las líneas celulares M 10.1.11 y M 13.4.14 son también
objeto de esta invención.
Se describen anticuerpos, que, producidos de
manera equivalente por las líneas celulares M 10.1.11 y M 13.4.14,
son capaces de fijación específica sobre el proBNP
N-terminal. Con la expresión "anticuerpos
producidos de manera equivalente" se entiende que los
anticuerpos se obtienen por inmunización con pro-BNP
N-terminal recombinante.
Se describen también procedimientos para la
obtención de anticuerpos, que se fijan específicamente sobre el
proBNP N-terminal.
La obtención de anticuerpos policlonales se
efectúa con preferencia mediante los pasos de: inmunización de un
organismo adecuado, por ejemplo ovejas, con el proBNP
N-terminal obtenido por métodos recombinantes,
aislamiento de los anticuerpos, exploración en busca de los
epítopes más reactivos y purificación de los anticuerpos por
inmunosorción en péptidos idóneos. Tal procedimiento se describe en
el ejemplo 2.
La obtención de anticuerpos monoclonales se
efectúa con preferencia mediante los pasos: inmunización de un
organismo adecuado, por ejemplo ratones, con el proBNP
N-terminal obtenido por métodos recombinantes y
selección de los clones en lo que respecta a la reactividad de los
anticuerpos con el proBNP N-terminal nativo de
diversos conjuntos de sueros de pacientes. Tal procedimiento se
describe en el ejemplo 3.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención
con mayor detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtiene la secuencia de nucleótidos del
proBNP N-terminal (secuencia de aminoácidos
1-76) por síntesis genética. Para conseguir una
expresión óptima del gen en E. coli se ajusta la secuencia de
DNA a los codones empleados con mayor frecuencia en la E.
coli. Las secuencias de los oligonucleótidos empleadas para la
síntesis del gen son las siguientes:
Pro5' (SEQ ID NO 1):
Pro1hum (SEQ ID NO 2):
Pro2hum (SEQ ID NO 3):
Pro3hum (SEQ ID NO 4):
Pro4hum (SEQ ID NO 5):
Pro3' (SEQ ID NO 6):
La síntesis del gen se realiza con estos
cebadores por PCR (polymerase chain reaction). Se clona el gen
amplificado en un vector idóneo, p.ej. en el vector pUC19 y se
secuencia. Para la clonación del gen en el vector de expresión pQE8
se corta el gen por los sitios de restricción Bam HI e Hind III del
vector pUC19, se liga en el vector pQE8, que permite la expresión
de proteínas con marcador histidina N-terminal y se
transforma en E. coli M15 [pREP4].
Para la expresión del gen en E. coli se
inocula un cultivo de una noche de un clon de E. coli
recombinante 1/60 en caldo de cultivo Luria (con 100 \mug/ml de
ampicilina y 50 \mug/ml de canamicina) y se induce en una
densidad óptica (OD) 550 de 1 con IPTG (isopropiltiogalactósido;
concentración final: 1 mM). Después de la inducción, los cultivos
se siguen incuban a 37ºC durante 4 horas más. Se centrifugan los
cultivos y el culote celular se recoge en tampón fosfato Na 50 mM,
pH = 8,0, NaCl 300 mM. Después de la disgregación de la suspensión
celular con ultrasonidos se centrifuga la suspensión y se introduce
el líquido sobrenadante en una columna de Ni-NTA
(nitrilo-triacetato). Después de un paso de lavado
con tampón fosfato Na 50 mM, pH = 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM,
se eluye el proBNP N-terminal marcado con histidina
con tampón fosfato Na 50 mM, pH = 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 300
mM. Se reúnen las fracciones eluidas y se dializan frente a Tris 50
mM, pH = 8,0. Para separar las impurezas se introduce el líquido
dializado en una columna de Q-Sepharose. Se
determina la masa del proBNP N-terminal purificado
por MALDI-TOF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizan ovejas con proBNP
N-terminal recombinante (1-76) en
adyuvante completo de Freund. La dosis aplicada a cada animal es de
0,1 mg. Las inmunizaciones se repiten cada 4 semanas a lo largo de
10 meses. 6 semanas después de la primera inmunización y después
una vez al mes se extraen muestras de suero y se analizan para
determinar la sensibilidad y la concentración.
Del suero en bruto de una oveja inmunizada con
proBNP N-terminal recombinante se eliminan los
componentes lípidos por deslipidación con Aerosil (del 1,5%).
Después se precipitan las inmunoglobulinas con sulfato amónico
(2M). Se dializa el precipitado disuelto frente a KPO_{4} 15 mM,
NaCl 50 mM, pH = 7,0, y se cromatografía en columna
DEAE-Sepharose. La fracción IgG,
PAK<NT-pro-BNP
rec.>S-IgG(DE) se encuentra en el
eluyente.
Para la purificación de anticuerpos policlonales
específicos de NT-proBNP, dirigidos contra los
aminoácidos 1-21,
PAK<NT-pro-BNP
rec.>M-IgG(IS,1-21), se
emplea el péptido biotinilado C-terminal
HPLGSPGSASDLETS
GLQEQR-Bi (1-21-Bi, SEQ ID NO: 7). Se prepara la matriz de afinidad por carga de 10 ml de partículas de polímero metacrilato recubiertas con estreptavidina (Boehringer Mannheim, art. nº 1529188) con 1 mg del péptido
(1-21-Bi).
GLQEQR-Bi (1-21-Bi, SEQ ID NO: 7). Se prepara la matriz de afinidad por carga de 10 ml de partículas de polímero metacrilato recubiertas con estreptavidina (Boehringer Mannheim, art. nº 1529188) con 1 mg del péptido
(1-21-Bi).
Con 10 ml de la matriz de afinidad se rellena la
columna y se equilibra con KPO_{4} 50 mM, NaCl 150 mM,
pH = 7,5 (PBS). Para el primer paso de la cromatografía de afinidad secuencia se introducen en la columna 850 mg de PAK<NT-pro-BNP>SIgG (DE). Se retira el eluyente se recoge para un segundo paso (ver más abajo). Se lava la columna con PBS y KPO_{4} 20 mM, NaCl 500 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,5% de ácido desoxicólico Na, pH = 7,5. La IgG fijada específicamente sobre la matriz de afinidad se eluye con el tampón ImmunoPure® Gentle Ag/Ab Elution Buffer (Pierce, producto nº 21013). Se regenera la matriz de afinidad con ácido propiónico 1M y se almacena en PBS/NaN_{3}.
pH = 7,5 (PBS). Para el primer paso de la cromatografía de afinidad secuencia se introducen en la columna 850 mg de PAK<NT-pro-BNP>SIgG (DE). Se retira el eluyente se recoge para un segundo paso (ver más abajo). Se lava la columna con PBS y KPO_{4} 20 mM, NaCl 500 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,5% de ácido desoxicólico Na, pH = 7,5. La IgG fijada específicamente sobre la matriz de afinidad se eluye con el tampón ImmunoPure® Gentle Ag/Ab Elution Buffer (Pierce, producto nº 21013). Se regenera la matriz de afinidad con ácido propiónico 1M y se almacena en PBS/NaN_{3}.
De igual manera se emplea el péptido
Bi-ELQVEQTSL
(Bi-30-38, SEQ ID NO: 8) para la
preparación de la matriz de afinidad destinada a la purificación
de inmunoglobulinas específicas de NT-proBNP,
dirigidas con los aminoácidos 30-38. El
PAK<NT-pro-BNP
rec.>M-IgG(IS,30-38) se
obtiene del eluyente de la primera purificación de afinidad.
Los anticuerpos purificados por afinidad se
dializan frente al tampón de biotinilización (KPO_{4} 100 mM,
NaCl 70 mM, pH = 8,0) y después se ajusta la solución a una
concentración de proteínas de 1 mg/ml. Se disuelve el éster
D-biotinoil-aminocapronato de
N-hidroxisuccinimida en DMSO y se mezcla con la
solución de anticuerpos en una proporción molar de 1:7,5. Se
interrumpe la reacción por adición de L-lisina y se
elimina el exceso de reactivo marcador por diálisis.
Se dializan los anticuerpos purificados por
afinidad frente al tampón de digoxigenilización (KPO_{4} 100 mM,
NaCl 70 mM, pH = 7,6) y después se ajusta la solución a una
concentración de proteínas de 1 mg/ml. Se disuelve el éster
digoxigenina-3-CME de
N-Hidroxi-succinimida en DMSO y se
mezcla con la solución de anticuerpos en una proporción molar de
1:5. Se interrumpe la reacción por adición de
L-lisina y se elimina el exceso de reactivo
marcador por diálisis.
Se inmunizan ratones balb/c, de
8-12 semanas de edad, con 100 \mug de antígeno
proBNP N-terminal recombinante, con adyuvante
completo de Freund, por vía intraperitoneal. Pasadas 6 semanas se
efectúan otras tres inmunizaciones a intervalos de 4 semanas. Una
semana después de la última inmunización se efectúa una extracción
de sangre y se determina la concentración de anticuerpos en el
suero de los animales sometidos a la prueba. De los ratones que
reaccionan positivamente se obtienen linfocitos B del bazo de estos
animales, que se fusionaron con una línea celular permanente de
mieloma. La fusión se realiza por el procedimiento conocido de
Köhler y Millstein (Nature 256, pp. 495 - 497, 1975). Los
cultivos primarios formados de células híbridas se clonan del modo
habitual, p.ej. empleando un clasificador celular comercial o por
"limiting dilution". Se procesan a continuación solo los
cultivos de clones que en un procedimiento idóneo de ensayo, por
ejemplo un inmunoensayo enzimático (procedimiento ELISA),
reaccionan positivamente con un proBNP N-terminal
recombinante y reconocen al proBNP N-terminal
natural en sueros de pacientes (véase el punto 2.). De este modo se
obtienen varias líneas celulares de hibridoma, que producen los
anticuerpos monoclonales de la invención.
Para producir los ascites se inyectan 5 x
10^{6} células de hibridoma por vía intraperitoneal en ratones
balb/c, que se han tratado previamente con 0,5 ml de Pristan.
Pasadas 2-3 semanas se puede extrae líquido
ascítico de la cavidad abdominal de los ratones. De este líquido
pueden aislarse los anticuerpos por el método habitual. Estos
anticuerpos monoclonales se dirigen específicamente contra el proBNP
N-terminal humano. A continuación se llamarán MAK M
10.1.11 y MAK M 13.4.14, respectivamente. Ambos anticuerpos
monoclonales pertenecen al subgrupo IgG1,cappa.
De este modo se pudieron aislar las dos líneas
celulares de clones M 10.1.11 y M 13.4.14, que se han deposita en
la colección alemana DSMZ, tal como se ha mencionado antes.
Para detectar la presencia y especificidad de
los anticuerpos contra el NT-proBNP en el suero de
ratones inmunizados, en líquidos sobrenadantes de cultivos de
células híbridas o en líquidos ascíticos, se evalúan los clones con
arreglo a los siguientes principios experimentales:
Se recubren placas de microvaloración (empresa
Nunc, Maxisorb), con 2,5 \mug/ml de
NT-pro-BNP recombinante como
antígeno en tampón de carga (empresa Boehringer,
carbonato/bicarbonato sódico 0,2 M, pH = 9,3-9,5, nº
de cat. 726 559) 100 \mul/hoyo, a temperatura ambiente con
agitación durante 1 hora. El tratamiento posterior se realiza en
tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato, empresa Oxid,
código BR 14a) y un 1% de Byco C, durante 30 minutos. Después se
lava con tampón de lavado (solución de cloruro sódico al 0,9% y
Tween 20 al 0,05%). La incubación de anticuerpos se realiza con 100
\mul/hoyo, a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora.
Después se lava de nuevo dos veces con la solución de lavado. Se
realiza otra incubación con el anticuerpo de detección: conjugado
de
PAK<M-Fc\gamma>S-Fab-peroxidasa
(Boehringer Mannheim, nº de cat. 1500 686), 100 mU/ml, 100
\mul/hoyo, a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora.
Después de un nuevo paso de lavado con tampón de lavado se
determina la actividad de peroxidasa por el método habitual (por
ejemplo con ABTS®, 30 minutos a temperatura ambiente), y se lee la
diferencia de extinciones en mE, a 405 nm con un lector de
ELISA.
En este caso se fijan sobre las placas de
microvaloración recubiertas con estreptavidina los conjugados de
péptidos proBNP y biotina de las secuencias 1-10,
8-18, 1-21, 16-30,
30-38, 39-50, 50-63
o 64-76 como antígenos, 250 ng/ml en tampón PBS
(solución salina tamponada con fosfato, empresa Oxid, código: BR
14a) con 0,5% de Byco C, 100 \mul/hoyo, a temperatura ambiente
con agitación durante 1 hora. A continuación se lava con tampón de
lavado (solución de cloruro sódico al 0,9%, Tween 20 al 0,05%). La
incubación de los anticuerpos y la reacción de detección se
realizan del modo descrito en el apartado a). Gracias a la
reactividad con determinados péptidos NT-proBNP se
puede encontrar la posición del epítope.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubren placas de microvaloración (empresa
Nunc, Maxisorb), con 5 \mug/ml de PAK<pro-BNP
humano>S-IgG (IS,(1-21) o bien
(30-38) S-IgG en tampón de carga
(empresa Boehringer, carbonato/bicarbonato sódico 0,2 M, pH =
9,3-9,5, nº de cat. 726 559) 100 \mul/hoyo, a
temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. El tratamiento
posterior se realiza en tampón PBS (solución salina tamponada con
fosfato, empresa Oxid, código BR 14a) y un 1% de Byco C, durante 30
minutos. Después se lava con tampón de lavado (solución de cloruro
sódico al 0,9% y Tween 20 al 0,05%). La incubación con antígeno
nativo en plasma del paciente, diluido en tampón PBS, se realiza
con 100 \mul/hoyo, a temperatura ambiente con agitación durante 1
hora. Después de un nuevo paso de lavado se realiza la incubación
de anticuerpos con 100 \mul/hoyo, a temperatura ambiente con
agitación durante 1 hora. Después se lava de nuevo dos veces con la
solución de lavado y se realiza otra incubación con el anticuerpo
de detección: conjugado de
PAK<M-Fc\gamma>S-Fab-peroxidasa
(Boehringer Mannheim, nº de cat. 1500 686), 100 mU/ml, 100
\mul/hoyo, a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora.
Después de un nuevo paso de lavado con tampón de lavado se determina
la actividad de peroxidasa por el método habitual (por ejemplo con
ABTS®, 30 minutos a temperatura ambiente), y se lee la diferencia de
extinciones en mE, a 405 nm con un lector de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales obtenidos por
inmunizaciones con diferentes péptidos reaccionan con gran
intensidad con los péptidos correspondientes. La reactividad con el
proBNP N-terminal recombinante solo se reconoce en
2 anticuerpos monoclonales, mientras que con el proBNP
N-terminal nativo no se observa ninguna reacción en
el conjunto de pacientes (ver tabla 1).
Los anticuerpos monoclonales obtenidos de la
inmunización con el proBNP N-terminal recombinante
reaccionan de modo aislado con péptidos, pero con gran intensidad
con el proBNP N-terminal recombinante o con el
proBNP N-terminal nativo en un grupo de pacientes.
La no reacción de anticuerpos monoclonales individuales con los
péptidos apunta al reconocimiento de los llamados epítopes de
conformación (ver tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El PAK obtenido reacciona con la máxima
intensidad con los péptidos 1-21 y
30-38. Por este motivo se eligen estos epítopes y
el PAK se inmunosorbe positivamente mediante estos péptidos. El PAK
inmunosorbido con el péptido 1-21 reacciona con la
máxima intensidad con la región 8-20 y de modo
claramente debilitado con la secuencia N-terminal
1-10. Los PAK inmunosorbidos reaccionan con gran
intensidad con el proBNP N-terminal recombinante y
en el formato sandwich PAK/PAK con la muestra nativa (ver tabla
3).
Mediante los anticuerpos obtenidos en los
ejemplos 2 y 3 se puede montar un inmunoensayo muy sensible. En
general son idóneos todos los formados de ensayo, en los que se
emplean 2 anticuerpos con reconocimiento de epítopes distintos.
Como ejemplo se describe un ensayo llamado ELISA sandwich.
Como fase sólida se emplea una placa de
microvaloración (MTP) recubierta con estreptavidina. Se pipetean en
los hoyos de la MTP 10 \mul de muestra sin tratar o de calibrador
junto con 100 \mul de tampón, que contiene los dos anticuerpos
específicos de epítopes, y se incuban a temperatura ambiente durante
1 hora. Como anticuerpos se emplean 1 \mul/ml de PAK
biotinilado<NT-pro-BNP
rec.>S-IgG(IS, 1-21) y 0,5
\mug/ml PAK
digoxigenilado<NT-pro-BNP
rec.>S-IgG(IS,30-38). A
continuación se extrae la solución por succión y se lava 3x con 350
\mul de tampón de lavado. Seguidamente se añaden con pipeta 100
\mul de solución de conjugado y se incuba de nuevo a temperatura
ambiente durante 1 h. Como conjugado se emplea un conjugado de
anticuerpo anti-digoxina/POD en una concentración
de 100 mIU/ml. Después se extrae la solución de conjugado por
succión y se lava 3x con 350 \mul de tampón de lavado. Finalmente
se pipetea a los hoyos una solución de sustrato ABTS® y se mide a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez finalizados los 30
minutos de reacción de sustrato se mide inmediatamente la placa de
microvaloración con un lector de MTP a una longitud de onda de 405
nm frente a la longitud de onda de referencia de 495 nm.
Para la determinación de la sensibilidad se
traza una curva de calibrado y se determina la precisión del patrón
cero (n = 21). Como calibrador se emplea el
EDTA-plasma humano, que se guarda con proBNP
N-terminal recombinante en la concentración
necesaria. Como patrón cero se emplea el plasma bovino. Los
resultados se recogen en la
tabla 4.
tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
En base a la pendiente de la curva de calibrado
de 22,5 mE x ml/fmol y una desviación estándar (SD) de 5,7 mE se
obtiene según la fórmula de Kaiser el siguiente límite inferior de
detección (LID):
LID = 3 SD_{patrón cero}/pendiente curva
calibrado = 3 x 5,7/22,5 = 0,75 fmol/ml
\vskip1.000000\baselineskip
Con el ensayo ELISA sandwich descrito en el
ejemplo 4 se determina la estabilidad del analito proBNP
N-terminal. Para ello se extrae sangre de 4
pacientes del grupo II-III según la asociación NYHA
mediante tubos de recogida que contienen EDTA y se guarda a
temperatura ambiente durante 3 días. Cada día se saca una muestra y
se determina el contenido de proBNP N-terminal. La
muestra de referencia y las muestras para determinar la estabilidad
del plasma con EDTA se enfrían inmediatamente a 4ºC - 8ºC y se
centrifugan durante 15 minutos. Se guardan los plasmas con EDTA a
4ºC y a temperatura ambiente y se efectúan mediciones en diferentes
momentos a lo largo de un período de prueba de 24 horas.
Los resultados se recogen en la tabla 5.
Estos datos confirman que el proBNP
N-terminal dentro del período de prueba estudiado es
completamente estable y, por tanto, puede emplearse como parámetro
rutinario. Este resultado está en contradicción con la bibliografía
técnica (Hunt y col., Clinical Endocrinology 47, 287, 1997) y
confirma la hipótesis de que con la elección y el diseño de este
formato de ensayo con 2 anticuerpos específicos, cuyos epítopes no
están situados en los extremos exteriores del analito, se puede
influir en la estabilidad del analito.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la sensibilidad de diagnóstico
se emplea de nuevo el ensayo descrito en el ejemplo 4. Para ello se
analizan 114 personas sanas y 235 pacientes que se incluyen en los
grupos de I a IV de la clasificación NYHA. Normalmente es muy
importante diferenciar entre personas sanas y pacientes del grupo I
de la NYHA.
Con este ensayo muy sensible se determina en 110
donantes de sangre sanos un valor de mediana de 6,6 fmol/ml de
NT-proBNP con una desviación estándar de 7,3
fmol/ml. El valor más bajo encontrado es de 0,2 fmol/ml. Esto
indica claramente que es necesaria una sensibilidad de < 1,0
fmol/ml para analizar exactamente el intervalo de referencia. Con
esta distribución se halla un intervalo de valor normal superior
(97,5% percentiles) de 26,6 fmol/ml.
Suponiendo un intervalo de valores de referencia
de 0 - 26,6 fmol/ml, de los 233 pacientes incluidos en los grupos
I-IV de la clasificación NYHA solamente 16 pacientes
presenta un valor dentro del intervalo normal. Esto equivale a una
sensibilidad clínica del 93,3%. Si se toman en consideración
solamente los pacientes incluidos en el grupo I de la clasificación
NYHA, entonces se reconocen positivamente 30 de los 37 pacientes,
esto equivale a una sensibilidad del 81,1%.
Este resultado confirma que con este ensayo muy
sensible del proBNP N-terminal puede realizarse una
diferenciación clara entre pacientes de insuficiencia cardíaca del
grupo I de la clasificación NYHA y las personas pertenecientes al
colectivo normal. Esto no se conseguía hasta ahora con los ensayos
disponibles del estado de la técnica (Dagubatti y col.,
Cardiovascular Research 36, 246, 1997).
<110> Roche Diagnostics GmbH; F.
Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección de
proBNP N-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 18931EP1-IR
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm20
Claims (7)
1. Procedimiento para la detección de proBNP
N-terminal en una muestra con por lo menos dos
anticuerpos, que reconocen epítopes distintos del proBNP
N-terminal, caracterizado porque como muestra
se emplea orina.
2. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque los anticuerpos se pueden fijar
simultáneamente sobre el proBNP N-terminal.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2
caracterizado porque el procedimiento se efectúa en forma de
procedimiento heterogéneo.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el procedimiento se realiza en un
formato de ensayo seco.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque gracias a
los valores obtenidos se puede realizar una diferenciación entre
las muestras de los personas sanas y las muestras de los pacientes
de insuficiencia cardíaca pertenecientes a los grupos de I a IV de
la clasificación NYHA.
6. Procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque gracias a los valores obtenidos se puede
efectuar una diferenciación entre las muestras de las personas
sanas y las muestras de pacientes del grupo I de la NYHA.
7. Uso del procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores para la diferenciación entre muestras
de personas sanas y muestras de pacientes de los grupos de I a IV de
la NYHA.
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| DE19903489 | 1999-01-29 | ||
| DE19903489 | 1999-01-29 | ||
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| DE19911044 | 1999-03-12 |
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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