ES2292444T3 - Mimeticos de giro en sentido inverso como inhibidores de la integrina alfa 4b. - Google Patents

Mimeticos de giro en sentido inverso como inhibidores de la integrina alfa 4b. Download PDF

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Abstract

Uso de un compuesto que tiene la estructura: (Ver fórmula) en la que el compuesto es un inhibidor de la integrina 4 1 y en la que Y se selecciona de -CH(R5)-A-N(R1)-, -A-N(R1)-CH(R¿)-, -A-N(R1)-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R1)-, -A-CH(R1)-O- y -A-CH(R1)-N(R¿)-; A es -(CHR¿)n-, en el que n = 0, 1 ó 2; B es -(CHR¿)m-, en el que m = 1, 2 ó 3; R¿, R¿, R2, R3 y R5 son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, un elemento de unión y un soporte sólido. R1 y R4 son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un soporte, una resina de poliestireno que contiene un elemento de unión de 4-hidroximetilfenoxibutirato, aminoácido, resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, péptido, proteína, -OH, -OR, -COR, -COOR, -CONH2, -CONRR, -NH2, -NHR, NRR, -SO2R o -COSR, en el que cada aparición de R se selecciona independientemente de restos alquilo C1 - 12, arilo C6 - 12 y aralquilo C7 - 12 lineales o ramificados, cíclicos o no cíclicos, sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados y en los que cualesquiera dos grupos CH adyacentes o grupos NH y CH adyacentes en el anillo bicíclico condensado pueden formar opcionalmente un doble enlace; para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de asma, alergias, colitis aguda, enfermedad inflamatoria del intestino, encefalomielitis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, enfermedad de Alzheimer, dermatitis atópica, nefritis, aterosclerosis, isquemia de miocardio, restenosis, accidente cerebrovascular, metástasis tumoral y psoriasis, en el que el tratamiento comprende administrar a un animal de sangre caliente que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto.

Description

Miméticos de giro en sentido inverso como inhibidores de la integrina \alpha_{4}\beta.
La presente invención se refiere generalmente a miméticos de giro en sentido inverso, incluyendo inhibidores de enfermedad mediada por adhesión celular, así como una biblioteca química de miméticos de giro en sentido inverso.
La adhesión celular es crítica para la viabilidad de los organismos vivos. La adhesión mantiene los tejidos multicelulares juntos y dirige el desarrollo embrionario. Desempeña papeles importantes en la cicatrización, eliminación de la infección y coagulación sanguínea. Las integrinas son una familia de proteínas de superficie celular íntimamente implicadas. en todas estas funciones. Se han encontrado en casi todos los tipos de célula humana excepto en glóbulos rojos. Las anomalías en la función de las integrinas contribuyen a una variedad de trastornos que incluyen enfermedades inflamatorias, ataque al corazón, accidente cerebrovascular y cáncer.
Las integrinas consisten en heterodímeros de subunidades \alpha y \beta, unidas de forma no covalente entre sí. Estos receptores de superficie celular se extienden a través de la membrana hasta el citoplasma. Se conocen al menos 15 subunidades \alpha distintas y 9 subunidades \beta distintas. Sin embargo, dado que la mayoría de las proteínas a se asocian sólo con una única \beta hay aproximadamente 21 receptores de integrinas conocidos. Sobre la superficie celular se ponen en contacto las cabezas de las dos subunidades entre sí para formar una superficie de unión para ligandos proteicos extracelulares, permitiendo la unión a otras células o a la matriz extracelular. La afinidad de estos receptores puede regularse mediante señales del exterior o dentro de la célula. Por ejemplo, el reclutamiento de los leucocitos al sitio de la lesión o infección implica una serie de interacciones adhesivas. La interacción débil entre las selectinas del endotelio y de los leucocitos y los hidratos de carbono media en la adhesión transitoria y el movimiento de giro del leucocito a lo largo de la pared del vaso. Diversas quimiocinas y otros factores desencadenantes liberados por el sitio de la inflamación sirven como señales para activar las integrinas desde un estado quiescente a un estado de alta afinidad. Estas integrinas activadas unen entonces sus ligandos relacionados sobre la superficie de las células endoteliales, dando como resultado una adhesión fuerte y el aplanamiento del leucocito. Luego, el leucocito migra a través del endotelio hacia el tejido subyacente.
La integrina \alpha_{4}\beta_{1} media en la adhesión celular principalmente a través de la unión a o bien la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1) o una variante de corte y empalme alternativo de fibronectina que contiene el segmento de conexión tipo III (IIICS). Una variedad de células implicadas en la inflamación expresan \alpha_{4}\beta_{1}, incluyendo linfocitos, monocitos, basófilos y eosinófilos, pero no neutrófilos. Los anticuerpos monoclonales frente a la subunidad \alpha_{4} se han utilizado para validar las integrinas que contienen \alpha_{4} como dianas terapéuticas potenciales en modelos animales de artritis reumatoide (Barbadillo et al. Springer Semin Immunopathol 16:427-36, 1995; Issekutz et al. Immunology 88:569-76, 1996), colitis aguda (Podolsky et al. J Clin Invest 92:372-80, 1993), esclerosis múltiple (Yednock et al. Nature 356:63-6, 1992), asma (Abraham et al. J Clin Invest 93:776-87, 1994; documento US 5,871,734) y diabetes (Tsukamoto et al. Cell Immunol 165:193-201, 1995). Más recientemente, se han producido derivados de peptidilo de bajo peso molecular como inhibidores competitivos de \alpha_{4}\beta_{1} y se ha demostrado que uno inhibe las respuestas alérgicas de las vías respiratorias en ovejas (Lin et al. J Med Chem 42:920-34, 1999).
Se ha demostrado que el péptido CS1 de 25 residuos es una secuencia clave de IIICS implicada en la unión a \alpha_{4}\beta_{1}, y dentro de esta secuencia, el motivo menos reconocido es el tripéptido, LDV. Se ha implicado una secuencia similar, IDS, en la unión del VCAM-1 a \alpha_{4}\beta_{1}. Las estructuras cristalinas de rayos X de un fragmento de dos dominios N-terminal de VCAM-1 muestran que la secuencia IDS es parte de un bucle expuesto que une dos cadenas beta (Jones et al. Nature 373:539-44, 1995; Wang et al. Proc Natl Acad Sci USA 92: 5714-8, 1995). Los péptidos cíclicos y derivados de los mismos que adoptan conformaciones de sentido de giro inverso han demostrado -ser inhibidores de la unión de VCAM-1 a \alpha_{4}\beta_{1} (documentos WO 96/00581; WO 96/06108; Doyle et al. Int J Pept Protein Res 47:427-36, 1996). Además, se han descubierto varios inhibidores basados en péptidos cíclicos potentes y selectivos (frente a \alpha_{5}\beta_{1}) (Jackson et al. J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997). También se ha notificado que varios miméticos de giro beta sin peptidilo se unen a \alpha_{4}\beta_{1} con una CI_{50} en el rango micromolar bajo (Souers et al. Bioorg Med Chem Lett 8:2297-302, 1998). También se han descrito numerosos derivados de fenilalanina y tirosina como inhibidores de \alpha_{4}\beta_{1} (documentos WO 99/06390; WO 99/06431; WO 99/06433; WO 99/06434; WO 99/06435; WO 99/06436; WO 99/ 06437; WO 98/54207; WO 99/10312; WO 99/103313; WO 98/53814; WO 98/53817; WO 98/58902). Sin embargo, no se han descrito inhibidores de moléculas pequeñas potentes y disponibles por vía oral.
Una integrina relacionada, la \alpha_{4}\beta_{7}, se expresa sobre la superficie de linfocitos y se une a VCAM-1, fibronectina y la molécula de adhesión celular adresina de la mucosa 1 (MAdCAM-1). La integrina \alpha_{4}\beta_{7} y la MAdCAM median en la recirculación de un subconjunto de linfocitos entre la sangre, el intestino y el tejido linfoide. Existe una secuencia tripeptídica, la LDT, similar a VCAM-1 y a CS-1 de fibronectina, presente en el bucle CD de MAdCAM-1 que es importante para el reconocimiento por \alpha_{4}\beta_{7}. Una estructura cristalina de rayos X muestra que esta secuencia también es parte de una estructura de giro (Tan et al. Structure 6: 793-801, 1998). Estudios recientes han mostrado que la \alpha_{4}\beta_{7} puede desempeñar también un papel en enfermedades tales como el asma (Lobb et al. Ann N Y Acad Sci 796: 113-23, 1996), enfermedad inflamatoria del intestino (Fong et al. Immunol Res 16:299-311, 1997), y diabetes (Yang et al. Diabetes 46:1542-7, 1997). Además, mientras que las integrinas \alpha_{4} parecen estar reguladas por disminución en carcinomas tales como el cervical y el de próstata, parecen estar reguladas por incremento en el melanoma metastático (Sanders et al. Cancer Invest 16:329-44, 1998), sugiriendo que los inhibidores de \alpha_{4}\beta_{1} y \alpha_{4}\beta_{7} pueden ser útiles como agentes antitumorales.
El giro en sentido inverso comprende una de las tres clases de estructura secundaria de proteínas y muestra tres (giro gamma), cuatro (giro beta) o más (bucles) cadenas laterales de aminoácidos en una relación espacial fija entre ellas. Los giros han demostrado su importancia en los acontecimientos de reconocimiento celular (Rose et al. Advances in Protein Chemistry 37: 1-109, 1985) y han generado un campo de investigación creciente en miméticos de molécula pequeña de los mismas (p. ej. Hanessian et al. Tetrahedron 53: 12789-12854, 1997). Muchos miméticos han sido o bien miméticos de giro externos que no permiten la exposición de todas las cadenas laterales importantes fisiológicamente (p. ej. Freidinger et al. Science 210: 656-8, 1980) o bien derivados de péptidos cíclicos de conformación móvil, pequeños (p. ej. Viles et al. Eur J Biochem 242: 352-62, 1996). Sin embargo, se han desarrollado compuestos no peptídicos que imitan fielmente la estructura secundaria de los giros en sentido inverso encontrada en proteínas o péptidos biológicamente activos. Por ejemplo, las patentes US 5,475,085, 5,670,155 y 5,672,681 de Kahn y el documento PCT WO 94/03494 de Kahn describen compuestos restringidos conformacionalmente, no peptídicos que imitan la estructura tridimensional de giros en sentido inverso. Más recientemente, el documento PCT WO97/15577 de Kahn y el documento PCT WO98/49168 de Kahn et al. han descrito heterociclos bicíclicos altamente restringidos adicionales como miméticos de giro en sentido inverso. No obstante, ya que ningún molde puede imitar cada.. tipo de giro, permanece una necesidad en la técnica de moldes de giro en sentido inverso y métodos para su uso.
Aunque que se han hecho avances significativos en la síntesis y la identificación de miméticos restringidos conformacionalmente, de giro en sentido inverso, aún hay una necesidad en la técnica de moléculas pequeñas que imiten la estructura secundaria de los péptidos. Además, hay una necesidad en la técnica de técnicas para sintetizar bibliotecas de tales miméticos y seleccionar los miembros de la biblioteca frente a dianas biológicas para identificar los miembros bioactivos de la biblioteca. Además, hay una necesidad en la técnica de inhibidores de integrinas pequeños disponibles por vía oral, para el uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y enfermedades cardiovasculares, así como algunos cánceres. En particular hay una necesidad de inhibidores de \alpha_{4}\beta_{1} para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide, asma, diabetes y enfermedad inflamatoria del intestino. La presente invención satisface estas necesidades, y proporciona ventajas relacionadas adicionales.
Según la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
1
en la que el compuesto es un inhibidor de la integrina \alpha \alpha_{4}\beta_{1} y en la que
Y se selecciona de -CH(R_{5})-A-N(R_{1})-, -A-N(R_{1})-CH(R')-, -A-N(R_{1})-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R_{1})-, -A-CH(R_{1})-O- y -A-CH(R_{1})- N(R')-;
A es -(CHR')_{n}-, en el que n = 0, 1 ó 2; B es (CHR'')_{m}-, en el que m = 1, 2 ó 3;
R', R'', R_{2}, R_{3} y R_{5} son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, un elemento de unión y un soporte sólido; R_{1} y R_{4} son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un soporte, una resina de poxiestireno que contiene un elemento de unión de 4-hidroximetilfenoxibutirato, aminoácido, resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, péptido, proteína, -OH, -OR, -COR, -COOR, -CONH_{2}, -CONRR, -NH_{2}, -NHR, NRR, -SO_{2}R o -COSR, en el que cada aparición de R se selecciona de restos alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12} lineales o ramificados, cíclicos o no cíclicos, sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados, o; en los que cualesquiera dos grupos CH adyacentes o los grupos NH y CH adyacentes en el anillo bicíclico condensado pueden formar opcionalmente un doble enlace;
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de asma, alergias, colitis aguda, enfermedad inflamatoria del intestino, encefalomielitis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, enfermedad de Alzheimer, dermatitis atópica, nefritis, aterosclerosis, isquemia de miocardio, restenosis, accidente cerebrovascular, metástasis tumoral y psoriasis,
en el que el tratamiento comprende administrar a un animal de sangre caliente que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto.
Las características preferidas adicionales de la presente invención se exponen en las reivindicaciones dependientes adjuntas.
En resumen, la presente invención se refiere al uso de compuestos restringidos conformacionalmente que imitan la estructura secundaria de regiones de giro en sentido inverso de péptidos y proteínas biológicamente activos. Esta descripción también describe bibliotecas que contienen tales compuestos, así como la síntesis y selección de los mismos. Además la invención describe el uso de miméticos de giro en sentido inverso para el tratamiento de enfermedades mediadas por adhesión celular.
Los compuestos de la presente descripción tienen la siguiente estructura general(I):
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2
en la que Y se selecciona de -CH(R_{5})-A-N(R_{1})-, -A-N(R_{1})-CH(R')-, -A-N(R_{1})-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R_{1})-, -A-CH(R_{1})-O-, y -A-CH(R_{1})-N(R')-; A es -(CHR_{1})_{n}-; B es -(CHR'')_{m}-; n = 0, 1 ó 2; m = 1, 2 ó 3; y cualesquiera dos grupos CH adyacentes o grupos NH y CH adyacentes en el anillo bicíclico pueden formar opcionalmente un doble enlace; y en la que R', R'', R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son tal como se definen en la siguiente descripción detallada.
En la realización en la que Y es -CH(R_{5})-A-N(R_{1})-, los compuestos de esta descripción tienen la siguiente estructura (I'):
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3
en la que A y B son tal como se definen anteriormente, y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son tal como se definen en la siguiente descripción detallada.
En la realización en la que Y es -A-N(R_{1})-CH(R')-, los compuestos de esta descripción tienen la siguiente estructura (I''):
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4
en la que A y B son tal como se definen anteriormente, y R', R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen en la siguiente descripción detallada.
En la realización en la que Y es -A-N(R_{1})-C(=O)-, los compuestos de esta descripción tienen la siguiente estructura (I''') :
5
en la que A y B son tal como se definen anteriormente, y R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen en la siguiente descripción detallada.
En la realización en la que Y es -A-C(=O)-N(R_{1})-, los compuestos de esta descripción tienen la siguiente estructura (I''''):
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6 
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en la que A y B son tal como se definen anteriormente, y R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen en la siguiente descripción detallada.
En la realización en la que Y es -A-CH(R_{1})-O-, los compuestos de esta descripción tienen la siguiente estructura (I'''''):
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en la que A y B son tal como se definen anteriormente, y R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen en la siguiente descripción detallada.
En la realización en la que Y es -A-CH(R_{1})-N(R')-, los compuestos de esta descripción tienen la siguiente estructura (I''''''):
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en la que A y B son tal como se definen anteriormente, y R', R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen en la siguiente descripción detallada.
La presente descripción también se refiere a las bibliotecas que contienen compuestos de la estructura (I) anterior, así como a los métodos para sintetizar tales bibliotecas y métodos para la selección de los mismos para identificar compuestos biológicamente activos. Se describen métodos de uso para el tratamiento de enfermedades mediadas por adhesión celular con los compuestos de esta invención. También se describen composiciones que contienen un compuesto de esta invención en combinación con un vehículo o disolvente farmacéuticamente aceptable.
Estos y otros aspectos de esta invención serán evidentes con referencia a las figuras adjuntas y la descripción detallada siguiente. Para este fin, se exponen varias referencias en el presente documento que describen en más detalle ciertos procedimientos, compuestos y/o composiciones, y se incorporan mediante referencia en su totalidad.
La figura 1 ilustra el porcentaje de inhibición de la unión de radioligando a los receptores opiáceos \delta y \mu de un mimético de giro en sentido inverso representativo de esta invención como una función de la concentración.
Las figuras 2-9 ilustran esquemas de reacción representativos de la síntesis de miméticos de giro en sentido inverso de esta invención.
La presente invención se refiere al uso de miméticos de giro en sentido inverso. Los miméticos de giro en sentido inverso usados en la presente invención son útiles como agentes bioactivos, que incluyen (pero no se limitan a) su uso como agentes de diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Las bibliotecas de miméticos de giro en sentido inverso de esta descripción son útiles en la identificación de tales agentes bioactivos. En la práctica de la presente invención, las bibliotecas pueden contener desde decenas hasta de cientos a miles (o más) de miméticos de giro en sentido inverso individuales (también denominados en el presente documento como "miembros").
En un aspecto, se describe un mimético de giro en sentido inverso que tiene la siguiente estructura (I):
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en la que Y se selecciona de -CH(R_{5})-A-N(R_{1})-, -A-N(R_{1})-CH(R')-, -A-N(R_{1})-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R_{1})-, -A-CH(R_{1})-O- y -A-CH(R_{1})-N(R')-; A es -(CHR')_{n}-, B es -(CHR'')_{m}-; n = 0, 1 ó 2; m = 1, 2 ó 3; y cualesquiera dos grupos CH adyacentes o grupos NH y CH adyacentes en el anillo bicíclico pueden formar opcionalmente un doble enlace; y en la que R', R''', R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son tal como se definen posteriormente.
En las estructuras de (I') a (I'''''') anteriores, una designación de línea continua para la unión de los diversos grupos R a un átomo de carbono en el anillo bicíclico condensado indica que estos grupos R pueden estar o bien por encima o bien por debajo del plano de la página. Si un mimético de giro en sentido inverso de esta invención está pensado para imitar un giro en sentido inverso de aminoácidos que se producen de manera natural (es decir, "L-aminoácidos"), los grupos R generalmente se encontrarían por debajo del plano de la página (es decir, "R") en la estructura (I). Sin embargo, si el mimético de giro en sentido inverso de esta invención está pensado para imitar un giro en sentido inverso que contiene uno o más D-aminoácidos, entonces el correspondiente grupo o grupos R se encontrarían por encima del plano de la página (es decir, "
1000
R") en la estructura (I).
En una realización, R_{1} y R_{4} son iguales o distintos y representan el resto del compuesto, y R', R'', R_{2}, R_{3}, y R_{5} son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo. Con respecto a R' y R'', debe entenderse que cada aparición de R' y R'' se selecciona independientemente de restos de cadenas laterales de aminoácidos o derivados de los mismos. Por ejemplo, cuando m=2, B es un resto -CHR'' CHR''-. En este caso, ambas apariciones de R'' se seleccionan independientemente y pueden ser iguales o distintas. De este modo, si la primera aparición de R'' es hidrógeno y la segunda metilo, B tendrá la estructura -CH_{2}CH(CH_{3})-.
Tal como se usa en el presente documento, el término "resto del compuesto" significa cualquier resto, agente, compuesto, soporte, molécula, elemento de unión, aminoácido, péptido o proteína unido de forma covalente al mimético de giro en sentido inverso en o bien las posiciones R_{1} y/o bien R_{4}. Este término también incluye restos de cadenas laterales de aminoácidos y derivados de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "resto de cadena lateral de aminoácido" representa cualquier resto de cadena lateral de aminoácido presente en proteínas que se producen de manera natural que incluyen (pero no se limitan a) los restos de cadenas laterales de aminoácidos que se producen de manera natural identificados en la tabla 1. Otros restos de cadenas laterales de aminoácidos que se producen de manera natural de esta invención incluyen (pero no se limitan a) los restos de cadenas laterales de 3,5-dibromotirosina, 3,5-diyodotirosina, hidroxi-lisina, \gamma-carboxiglutamato, fosfotirosina y fosfoserina. Además, las cadenas laterales de aminoácidos glucosiladas pueden usarse también en la práctica de esta invención, que incluyen (pero no se limitan a) treonina, serina y asparragina glucosiladas.
TABLA 1 Restos de cadenas laterales de aminoácidos 
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Además de los restos de cadenas laterales de aminoácidos que se producen de manera natural, los restos de cadenas laterales de aminoácidos de la presente invención también incluyen diversos derivados de los mismos. Tal como se usa en este documento, un "derivado" de un resto de cadena lateral de aminoácido incluye modificaciones y/o variaciones a los restos de cadenas laterales de aminoácidos que se producen de manera natural. Por ejemplo, los restos de cadenas laterales de aminoácidos de alanina, valina, leucina, isoleucina y fenilalanina pueden clasificarse generalmente como restos alquilo, arilo, o aralquilo de cadena corta. Los derivados de restos de cadenas laterales de aminoácidos incluyen otros restos alquilo, arilo o aralquilo lineales o ramificados, cíclicos o no cíclicos, sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados de cadena corta.
Tal como se usa en el presente documento, los "restos de alquilo de cadena corta" contienen desde 1-12 átomos de carbono, los "restos arilo de cadena corta" contienen desde 6-12 átomos de carbono y los "restos aralquilo de cadena corta" contienen desde 7-12 átomos de carbono. De este modo, en una realización, el derivado de cadena lateral de aminoácido se selecciona de un alquilo C_{1-12}, un arilo C_{6-12} y un aralquilo C_{7-12}, y en una realización más preferida, de un alquilo C_{1-7}, un arilo C_{6-10} y un aralquilo C_{7-11}.
Los derivados de cadenas laterales de aminoácidos de esta invención incluyen además derivados sustituidos de restos alquilo, arilo y aralquilo de cadena corta, en los que el sustituyente se selecciona de (pero no se limitan a) uno o más de estos restos químicos: -OH, -O, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógenos (incluyendo F, Cl, Br y I), en los que cada aparición de R se selecciona independientemente de restos alquilo, arilo y aralquilo lineales o ramificados, cíclicos o no cíclicos, sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados de cadena corta. Además, los restos alquilo, arilo y aralquilo cíclicos de cadena corta de esta invención incluyen naftaleno, así como compuestos heterocíclicos tales como tiofeno, pirrol, furano, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, 3-pirrolina, pirrolidina, piridina, pirimidina, purina, quinolina, isoquinolina y carbazol. Los derivados de cadenas laterales de aminoácidos incluyen además derivados de heteroalquilo de la parte alquilo de los restos alquilo y aralquilo de cadena corta, que incluyen (pero no se limitan a) fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo.
Los restos R_{1} y R_{4} representativos incluyen específicamente (pero no limitados a) -OH, -O, -COR, -COOR,
-CONH_{2}, -CONR, -CONRR, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SO_{2}R y -COSR, en los que cada aparición de R es tal como se define anteriormente.
En una realización adicional, y además de ser un resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo (o el resto del compuesto en el caso de R_{1} y R_{4}), R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, o R_{5} pueden ser un elemento de unión que facilita la unión del compuesto a otro resto o compuesto. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden estar unidos a uno o más compuestos conocidos, tales como biotina, para su uso en ensayos de diagnóstico o selección. Además, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} pueden ser un elemento de unión que una el compuesto a un soporte sólido (tal como un soporte usado en la síntesis de péptidos en fase sólida) o alternativamente, puede ser el propio soporte. En esta realización, la unión a otro resto o compuesto, o a un soporte sólido, es preferible en la posición R_{1} o R_{4}, y más preferiblemente en la posición R_{4}.
En la realización en la que Y es -CH(R_{5})-A-N(R_{1})-, el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (I'):
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en la que A, B, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida, R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2}, R_{3} y R_{5} se seleccionan individualmente de un resto de cadena lateral de aminoácido.
En una realización más específica de estructura (I'), A es -(CH_{2})_{n}-, B es (CH_{2})_{m}-, y el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (Ia'):
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en la que n, m, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2}, R_{3} y R_{5} se seleccionan individualmente de un resto de cadena lateral de aminoácido.
En una realización aún más específica de la estructura (I') A es -(CH_{2})_{n}-, B es (CH_{2})_{m}-, n es 0, m es 1 y el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (Ib'):
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en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2}, R_{3} y R_{5} se seleccionan individualmente de un resto de cadena lateral de aminoácido. En otra realización preferida R_{1} se selecciona de ROC(O)-, RSO_{2}- y RNHC(O)-, en los que R es tal como se define anteriormente. En una realización más preferida, R_{1} se selecciona de ROC(O)-, RSO_{2}- y RNHC(O)- y R se selecciona de restos arilo de cadena corta y restos aralquilo de cadena corta sustituidos o no sustituidos. En otra realización específica, R_{2} y R_{5} se seleccionan independientemente de restos alquilo de cadena corta, sustituidos con COOH o COOR, en los que R es tal como se define anteriormente. En otra realización específica, R_{3} se selecciona de restos arilo de cadena corta o aralquilo de cadena corta, sustituidos o no sustituidos.
En la realización en la que Y es -A-N(R_{1})-CH(R')-, el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (I''):
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en la que A, B, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R' son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida, R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2}, R_{3} y R' se seleccionan individualmente de un resto de cadena lateral de aminoácido.
En una realización de estructura (I'') en la que los dos grupos CH adyacentes en el anillo bicíclico forman un doble enlace, el mimético de giro en sentido inverso incluye la estructura (Ia''):
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en la que A, B, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R' son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida, R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido y R' es hidrógeno.
\newpage
En una realización más específica de la estructura (Ia''), A es -(CH_{2})_{n}-, B es -(CH_{2})_{m}-, R' es hidrógeno, y el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (Ib''):
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en la que n, m, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente.
En la realización en la que Y es -A-N(R_{1})-C(=O)-, el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (I'''):
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en la que A, B, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida, R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido.
En una realización más específica de la estructura (I''), A es -(CH_{2})_{n}-, B es -(CH_{2})_{m}-, y el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (Ia''):
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en la que n, m, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente.
En la realización en la que Y es -A-C(=O)-N(R_{1})-, el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (I''''):
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en la que R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida, R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido.
\newpage
En una realización más específica de la estructura (I''''), A es -(CH_{2})_{n}-, B es -(CH_{2})_{m}-, y el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (Ia''''):
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en la que n, m, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente.
En la realización en la que Y es -A-CH(R_{1})-O-, el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (I'''''):
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en la que R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida, R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido.
En una realización más específica de la estructura (I'''''), A es -(CH_{2})_{n}-, B es (CH_{2})_{m}-, y el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (Ia'''''):
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en la que n, m, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente.
En la realización en la que Y es -A-CH(R_{1})-N(R')-, y los grupos NH y CH adyacentes en el anillo bicíclico forman un doble enlace, los miméticos de giro en sentido inverso incluyen la siguiente estructura (Ia''''''):
23
en la que A, B, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente. En una realización preferida, R_{1} y R_{4} representan el resto del compuesto, y R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido.
\newpage
En una realización más específica de la estructura (Ia''''''), A es -(CH_{2})_{n}-, B es -(CH_{2})_{m}-, y el mimético de giro en sentido inverso tiene la siguiente estructura (Ib''''''):
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en la que n, m, R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son tal como se definen anteriormente.
En una realización preferida de la estructura (I), R_{1} se selecciona de ROC(O)-, RSO_{2}- y RHNC(O)-, en los que R es tal como se define anteriormente. En una realización más específica, R_{1} se selecciona de ROC(O)-, RSO_{2} y RHNC(O) y R se selecciona de restos arilo de cadena corta y restos aralquilo de cadena corta sustituidos o no sustituidos.
En una realización específica de la estructura (I), R_{2} y R_{5} se seleccionan independientemente de restos alquilo de cadena corta, sustituidos con COOH o COOR, en los que R es tal como se define anteriormente. En otra realización específica de la estructura (I), R_{2} y R_{5} se seleccionan independientemente de H- y RC (O) NH- en el que R es tal como se define anteriormente.
En otra realización específica de la estructura (I), R_{3} se selecciona de restos arilo de cadena corta o aralquilo de cadena corta sustituidos o no sustituidos.
En otra realización específica de la estructura (I), R_{3} se selecciona de restos arilo de cadena corta y aralquilo de cadena corta, incluyendo heterocíclicos.
Los miméticos de giro en sentido inverso usados en la presente invención pueden prepararse mediante la utilización de moléculas componentes iniciales (denominadas en adelante en el presente documento "partes componentes"). Brevemente, en la síntesis del mimético de giro en sentido inverso que tiene estructura (I'), las primeras y las segundas partes componentes se acoplan para formar un intermedio primero-segundo combinado, las terceras y cuartas partes componentes se acoplan para formar un intermedio tercero-cuarto (o, si está disponible comercialmente, puede usarse un tercer intermedio único), después se acoplan el intermedio primero-segundo combinado y el intermedio tercero-cuarto (o tercer intermedio) para proporcionar un intermedio primero-segundo-tercero-cuarto (o un intermedio primero-segundo-tercero) que se cicla para dar los miméticos de giro en sentido inverso de esta invención. Alternativamente, los miméticos de giro en sentido inverso de estructura (I') pueden prepararse mediante acoplamiento secuencial de las partes componentes individuales o bien gradualmente en disolución o bien mediante síntesis en fase sólida tal como se realiza habitualmente en la síntesis de péptidos en fase sólida.
Dentro del contexto de la presente invención, una "primera parte componente" tiene la siguiente estructura 1:
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en la que R_{4} y B son tal como se definen anteriormente, y R es un grupo protector adecuado para su uso en síntesis de péptidos. Los grupos R adecuados incluyen grupos alquilo y, en una realización preferida, R es un grupo metilo. Dichas primeras partes componentes puede sintetizarse fácilmente mediante aminación reductora mediante emparejamiento de CH(O)_{2}-(CH_{2})_{m}-CHO con H_{2}N-R_{4}, o mediante sustitución de CH(OR)_{2}-(CH_{2})_{m}-Br. Alternativamente, uno de los grupos R puede ser un elemento de unión y resina. Las resinas de poliestireno, tal como las que se usan normalmente en la síntesis de péptido y que contienen el elemento de unión Wang (4-hidroximetilfenoxibutirato), son adecuadas.
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Una "segunda parte componente" de esta invención tiene la siguiente estructura 2:
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en la que R_{3} es tal como se define anteriormente, P es un grupo protector de amino adecuado para su uso en la síntesis de péptidos, y X representa el grupo saliente del grupo ácido carboxílico activado. Los grupos protectores preferidos incluyen t-butil dimetilsililo (TBDMS), BOC, FMOC, y Alloc (aliloxicarbonilo). Los aminoácidos protegidos en N están disponibles comercialmente. Por ejemplo, los aminoácidos FMOC están disponibles de una variedad de fuentes. La conversión de estos compuestos en las segundas partes componentes de esta invención puede lograrse fácilmente mediante la activación del grupo ácido carboxílico del aminoácido protegido en N. Grupos ácido carboxílico activados adecuados incluyen haluros ácidos en los que X es un haluro tal como cloruro o bromuro, anhídridos ácidos en los que X es un grupo acilo tal como acetilo, ésteres reactivos tales como ésteres de N-hidroxibenzotriazol, ésteres de N-hidroxisuccinimida y ésteres de pentafluorofenilo, y otros intermedios activados tales como el intermedio activo formado en una reacción de acoplamiento usando una carbodiimida tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) o diisopropilcarbodiimida (DIC).
En el caso del derivado azido de un aminoácido que sirva como la segunda parte componente, tales compuestos deben prepararse a partir del aminoácido correspondiente mediante la reacción descrita por Zaloom et al. (J. Org. Chem. 46:5173-76, 1981)
Una "tercera parte componente" de esta invención tiene la siguiente estructura 3:
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en la que R_{2} y R_{5} son tal como se definen anteriormente, y P un grupo protector de ácido carboxílico tal como un grupo metilo o t-butilo.
Una "cuarta parte componente" de esta invención tiene la siguiente estructura 4:
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en la que R_{1} es tal como se define anteriormente. Las cuartas partes componentes adecuadas están disponibles comercialmente de una variedad de fuentes. Alternativamente, las cuartas partes componentes pueden prepararse fácilmente mediante técnicas de síntesis orgánica convencionales utilizadas habitualmente para la síntesis de aminas
primarias.
Mas específicamente, los miméticos de giro en sentido inverso de estructura (I') se sintetizan haciendo reaccionar una primera parte componente con una segunda parte componente para dar un intermedio primero-segundo combinado, seguido de o bien hacer reaccionar el intermedio primero-segundo combinado con las terceras y cuartas partes componentes secuencialmente, o bien hacer reaccionar el intermedio con un intermedio tercero-cuarto combinado para proporcionar un intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado, y después ciclar este intermedio para dar el mimético de giro en sentido inverso.
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La síntesis general de un mimético de giro en sentido inverso que tiene estructura I' puede sintetizarse mediante la siguiente técnica. Una primera parte componente 1 se acopla a una segunda parte componente 2 para dar, tras la desprotección en N, un intermedio primero-segundo combinado 1-2 tal como se ilustra a continuación:
28
La síntesis del mimético de giro en sentido inverso puede ser convergente, en cuyo caso se prepara un intermedio tercero-cuarto combinado 3-4 por el acoplamiento de una tercera parte componente 3 con una cuarta parte componente 4 para dar, tras la desprotección en O, un intermedio tercero-cuarto combinado 3-4 tal como se ilustra a continuación:
29
En el caso en el que n de la estructura (I) anterior es 1 ó 2, puede prepararse un intermedio de la siguiente estructura 3-4' de la manera siguiente:
30
en la que A es (CHR')_{n}. Después, el intermedio 3-4' puede emplearse en lugar del intermedio 3-4 en las siguientes reacciones para dar un mimético de giro en sentido inverso de esta invención que tiene estructura (I'). Alternativamente, en el caso en el que n de la estructura (I) anterior sea 1, 2 ó 3, 3-4' puede prepararse a partir de un derivado de beta, gamma o delta-aminoácido que está acilado o sulfanilado y entonces se desprotegen en 0 de la siguiente manera:
31
El acoplamiento de los intermedios combinados 1-2 y 3-4 proporciona el intermedio 1-2-3-4 que, con cristalización, da el mimético de giro en sentido inverso (I') tal como se ilustra a continuación:
32
Las síntesis de las partes componentes representativas de esta invención se describen en el ejemplo 1. Las síntesis de los intermedios primero-segundo y tercero-cuarto combinados representativos se describen en los ejemplos 2 y 3, respectivamente. El acoplamiento de estos intermedios para formar un intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado representativo se describe en el ejemplo 4. La ciclación de este intermedio para formar un mimético de giro en sentido inverso representativo se describe en el ejemplo 5.
En una realización preferida, el mimético de giro en sentido inverso de la estructura (Ia') puede prepararse según el esquema de reacción expuesto en la fig. 2. En otra realización preferida, el mimético de giro en sentido inverso de estructura (Ia') puede prepararse en fase sólida según el esquema de reacción expuesto en la fig. 8 y descrito en el ejemplo 8. En una realización más preferida, el mimético de giro en sentido inverso de estructura (Ia') puede prepararse en fase sólida según el esquema de reacción expuesto en la fig. 9 y descrito en la fig. 10.
Los miméticos de giro en sentido inverso de las estructuras de (I'') a (I'''''') pueden prepararse mediante técnicas análogas a la síntesis modular descrita anteriormente, pero con las modificaciones apropiadas de las partes componentes. Más específicamente, los miméticos de giro de sentido inverso de estructuras de (I'') a (I'''''') pueden prepararse mediante los esquemas de reacción expuestos en las figuras 3-7. En particular, los miméticos de giro en sentido inverso de estructuras (Ib''), (Ia'''), (Ia''''), (Ia''''') y (Ib'''''') pueden prepararse mediante los esquemas de reacción representativos expuestos en las figuras 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente.
En otro aspecto de esta descripción, se describen las bibliotecas que contienen miméticos de giro de sentido inverso de la presente invención. Una vez ensambladas, las bibliotecas de la presente invención pueden seleccionarse para identificar miembros individuales que tienen bioactividad. Tal selección de miembros bioactivos de las bibliotecas puede implicar, por ejemplo, evaluar la actividad de unión de los miembros de una biblioteca o evaluar el efecto que tienen los miembros de una biblioteca en un ensayo funcional. La selección se consigue normalmente poniendo en contacto los miembros de una biblioteca (o un subconjunto de los miembros de una biblioteca) con una diana de interés, tal como, por ejemplo, un anticuerpo, una enzima, un receptor o una línea celular. Los miembros de una biblioteca que pueden interaccionar con la diana de interés se denominan en el presente documento "miembros bioactivos de biblioteca" o "miméticos bioactivos". Por ejemplo, un mimético bioactivo puede ser un miembro de una biblioteca que puede unirse a un anticuerpo o receptor, que puede inhibir una enzima, o que puede desencadenar o antagonizar una respuesta funcional asociada, por ejemplo, con una línea celular. En otras palabras, la selección de las bibliotecas de la presente invención determina qué miembros de biblioteca pueden interaccionar con una o más dianas biológicas de interés. Además, cuando se produce la interacción el mimético (o miméticos) bioactivo puede identificarse entonces a partir de los miembros de la biblioteca. La identificación de un único (o un número limitado de) mimético(s) bioactivo(s)
de la biblioteca da miméticos de giro en sentido inverso que son activos biológicamente por sí mismos, y por tanto, son útiles como agentes de diagnóstico, profilácticos o terapéuticos, y pueden usarse además para avanzar significativamente en la identificación de compuestos de partida en estos campos.
La síntesis de miméticos peptídicos de la biblioteca puede lograrse usando técnicas de síntesis de péptidos conocidas en combinación con las primeras, segundas y terceras partes componentes de esta invención. Más específicamente, cualquier secuencia de aminoácidos puede añadirse como cualquiera de los restos R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} o R_{5} del mimético de giro en sentido inverso restringido conformacionalmente. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos puede añadirse como los restos R_{1} o R_{4}. Para este fin, pueden sintetizarse los miméticos sobre un soporte sólido (tal como poliestireno utilizando 4-hidroximetilfenoxibutirato como elemento de unión) mediante técnicas conocidas (véase, p. ej. John M. Stewart y Janis D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, Pierce Chemical Comp., Rockford, Illinois; Atherton, E, Shepard R.C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; IRL; Oxford, 1989) o sobre una resina unida a sililo mediante unión por alcohol (véase Randolph et al. J. Am. Chem. Soc. 117:5712-14, 1995).
Además, puede utilizarse una combinación de ambas técnicas de síntesis en fase sólida y en disolución para sintetizar los miméticos peptídicos de esta invención. Por ejemplo, puede utilizarse un soporte sólido para sintetizar la secuencia de péptido lineal hasta el punto en que se añade a la secuencia el mimético de giro en sentido inverso restringido conformacionalmente. Un mimético de giro en sentido inverso restringido conformacionalmente adecuado que se ha sintetizado previamente mediante técnicas de síntesis en disolución puede añadirse entonces como el siguiente "aminoácido" a la síntesis en fase sólida (es decir, el mimético de giro en sentido inverso restringido conformacionalmente, que tiene al menos dos sitios reactivos, puede utilizarse como el siguiente residuo a añadir al péptido lineal). Con la incorporación del mimético de giro en sentido inverso restringido conformacionalmente a la secuencia, pueden añadirse entonces aminoácidos adicionales para completar el péptido unido al soporte sólido. Alternativamente, las secuencias peptídicas protegidas de los extremos N-terminal y C-terminal pueden sintetizarse sobre un soporte sólido, eliminarse del soporte, y acoplarse entonces al mimético de giro en sentido inverso restringido conformacionalmente en disolución usando técnicas de acoplamiento en disolución conocidas.
En otro aspecto de esta descripción, se describen métodos para construirlas bibliotecas. Las técnicas de síntesis combinatoria y paralela tradicionales (véase, p. ej. The Combinatorial Index Bunin, Academic Press, Nueva York, 1998; Gallop et al. J Med Chem 37:1233-51, 1994) permiten un amplio número de compuestos que han de prepararse rápidamente mediante la combinación secuencial de reactivos a un esqueleto molecular básico. Por ejemplo, la síntesis descrita anteriormente puede llevarse a cabo usando la técnica de ordenación directa de Nicolaou y colaboradores (Nicolaou, Xiao et al. Angew. Chem. Int. Ed. 34:2289-2291, 1995). En la actualidad, el equipo para esta técnica está disponible comercialmente de IRORI (La Jolla, CA). Alternativamente, la síntesis descrita anteriormente puede llevarse a cabo mediante síntesis paralela usando una placa de 48 ó 96 pocillos en la que cada pocillo contiene una salida sinterizada para drenar los disolventes y los reactivos (A Practical Guide to Combinatorial Chemistry Czarnik y DeWitt, Eds, American Chemical Society, Washington, D.C., 1997). Robbins (Sunnyvale, CA), Charybdis (Carlsbad, CA) y Bohdan (Chicago, Illinois) ofrecen en la actualidad equipos adecuados para esta
técnica.
En un aspecto adicional, se describen métodos para seleccionar las bibliotecas de bioactividad y aislar los miembros bioactivos de la biblioteca. Las bibliotecas pueden seleccionarse mediante una variedad de técnicas y métodos. Generalmente, el ensayo de selección puede realizarse mediante (1) poner en contacto una biblioteca con una diana biológica de interés, tal como un receptor y dejar que se produzca la unión entre los miméticos de la biblioteca y la diana, y (2) detectar el acontecimiento de unión mediante un ensayo apropiado, tal como mediante el ensayo colorimétrico descrito por Lam et al. (Nature 354;82-84, 1991) o Griminski et al. (Biotechnology 12:1008-1011, 1994). En una realización preferida, los miembros de la biblioteca están en disolución y la diana se inmoviliza en una fase sólida. Alternativamente, puede inmovilizarse la biblioteca en una fase sólida y puede someterse a prueba poniéndola en contacto con la diana en disolución.
Tal como se mencionó anteriormente, los miméticos de giro en sentido inverso de la presente invención son útiles como agentes bioactivos, tales como agentes de diagnóstico, profilácticos y terapéuticos. La actividad de unión de los receptores opiáceos de miméticos de giro en sentido inverso representativos se presenta en el ejemplo 9. En este ejemplo, se demostró que los miméticos de giro en sentido inverso de esta invención inhibieron eficazmente la unión de un derivado de encefalina radiomarcado a los receptores opiáceos \delta y \mu. Los datos demuestran la utilidad de estos miméticos de giro en sentido inverso como antagonistas de receptores y como agentes analgésicos potenciales. En una realización adicional, la actividad de unión de integrinas a miméticos de giro en sentido inverso representativos se presenta en el ejemplo 12. En este ejemplo, se demostró que los miméticos de giro en sentido inverso desplazan eficazmente el péptido CS1 de las células de Ramos. Por tanto, los datos indican la capacidad de los miméticos de giro en sentido inverso para antagonizar las integrinas \alpha_{4}\beta_{1} y servir como agentes antiinflamatorios potenciales.
En otro aspecto, la presente descripción abarca las composiciones farmacéuticas preparadas para el almacenamiento o administración que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención en un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. El tratamiento con inhibidores de la adhesión celular está indicado para el tratamiento y la prevención de una variedad de estados inflamatorios, particularmente en artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino y asma. Aquellos expertos en este campo serán conscientes rápidamente de las circunstancias que necesitan un tratamiento antiinflamatorio. Además, el tratamiento con inhibidores de la adhesión celular está indicado para cualquier estado en el que un exceso de adhesión celular mediada por integrinas es un factor contribuyente, tal como, por ejemplo, la aterosclerosis.
La "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, el tipo de animal de sangre caliente que se trata, y las características físicas del animal en consideración. Estos factores y su relación para determinar esta cantidad son bien conocidos para los profesionales expertos en las técnicas médicas. Esta cantidad y el método de administración pueden ajustarse para conseguir una eficacia óptima pero dependerán de factores tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores que tal como se observó reconocerán los expertos en las técnicas médicas.
La "cantidad terapéuticamente eficaz" del compuesto de la presente invención puede oscilar ampliamente dependiendo de los efectos deseados y de la indicación terapéutica. Normalmente, las dosificaciones estarán entre aprox. 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aprox. 0,01 y 10 mg/kg de peso corporal.
Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" para su uso terapéutico, incluyendo los diluyentes, se conocen bien en la técnica farmacéutica, y se describen, p. ej. en Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (Gennaro Ed. 1985). Por ejemplo, pueden usarse solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico. Pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso aromatizantes en la composición farmacéutica. Por ejemplo pueden añadirse como conservantes benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres del ácido p-hidroxibenzoico. Además pueden añadirse agentes de suspensión y antioxidantes.
Los compuestos de la presente invención son útiles para la prevención y el tratamiento de cualquier estado en el que un exceso de adhesión celular mediada por integrinas es un factor contribuyente. En particular, los compuestos de la presente invención son útiles como agentes para la prevención y el tratamiento de la inflamación y los estados relacionados. En la práctica de los métodos de esta invención, se administra una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de esta invención a un animal de sangre caliente que lo necesita. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden administrarse a un animal de sangre caliente al que se le ha diagnosticado, o está en riesgo de desarrollar un estado seleccionado de artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, asma, alergias, enfermedad inflamatoria del intestino, dermatitis atópica, diabetes tipo I, encefalitis, isquemia de miocardio, esclerosis múltiple, nefritis, restenosis, psoriasis, accidente cerebrovascular y metástasis tumoral.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmunitaria progresivamente debilitante del sistema nervioso central. En la actualidad se desconoce el antígeno exacto que desencadena la respuesta inmunitaria. Sin embargo, los macrófagos parecen atacar e iniciar la destrucción de las vainas de mielina grasas alrededor de las fibras nerviosas del cerebro. En un modelo animal de EM (encefalomielitis alérgica experimental) los anticuerpos monoclonales murinos frente a \alpha_{4}\beta_{1} bloquearon la adhesión de los leucocitos al endotelio y previnieron la inflamación del sistema nervioso central y la parálisis posterior de los animales (Yednock, Cannon et al. Nature 356:63-6, 1992).
Los compuestos de la presente invención pueden usarse de forma única, como una combinación de uno o más compuestos, o en combinación con otros inhibidores de la inflamación conocidos. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden usarse terapéuticamente con corticosteroides, agentes antiinflamatorios no esteroideos, inhibidores de la COX-2, inhibidores de las metaloproteasas de la matriz o inhibidores de la lipoxigenasa. Los compuestos de la invención pueden administrarse en formas orales tales como comprimidos, cápsulas (cada una de las cuales incluye formulaciones de liberación sostenida o liberación temporal), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Del mismo modo, pueden administrarse por vía intravenosa (en bolo o infusión), vía intraperitoneal, vía subcutánea, vía intranasal, vía intrarrectal o vía intramuscular, todas formas de uso conocidas para los expertos ordinarios en las técnicas farmacéuticas. Los compuestos pueden administrarse por vía intraocular o vía tópica así como por vía oral o vía parenteral.
Los compuestos de esta invención pueden administrarse por inhalación, y por tanto, pueden administrarse en la forma de un pulverizador de aerosol de envases a presión o nebulizadores. Los compuestos pueden administrarse también como polvos que pueden formularse y la composición en polvo puede inhalarse con ayuda de un dispositivo inhalador de polvo por insuflación. Un sistema preferido de administración para inhalación es el aerosol de inhalación de dosis medida, que puede formularse como una suspensión o una disolución de un compuesto de la invención en propelentes adecuados, tales como fluorocarburos o hidrocarburos. Otro sistema de administración preferido es el aerosol de inhalación de polvo seco, que puede formularse como un polvo seco de un compuesto esta invención con o sin excipientes adicionales.
Los compuestos de la invención pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o una preparación de implante que puede formularse de tal manera que permita una liberación sostenida del principio activo. El principio activo puede comprimirse en grageas o pequeños cilindros e implantarse por vía subcutánea o vía intramuscular como inyecciones de depósito o implantes. Los implantes pueden emplear materiales inertes, como polímeros biodegradables o siliconas sintéticas, p. ej. Silastic, goma de silicona u otros polímeros fabricados por la Dow-Corning
Corporation.
Los compuestos de la invención también pueden administrarse en forma de sistemas de administración de liposomas, como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Pueden formarse los liposomas a partir de una variedad de fosfolípidos, como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.
Los compuestos de esta invención pueden administrarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los que se acoplan las moléculas del compuesto. Los inhibidores de integrinas también pueden acoplarse con polímeros solubles tales como vehículos de fármacos que pueden usarse como dianas. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxi-propil-metacrilamida-fenol, polihidroxietil-aspartamida-fenol o poli(óxido de etileno)-polilisina sustituidos con residuos de palmitoílo. Además, los inhibidores de integrinas pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles en la consecución de la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque de hidrogeles reticulados o anfipáticos.
La dosis y el método de administración pueden ajustarse para lograr una eficacia óptima pero dependerán de factores como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores que reconocerán aquellos expertos en las técnicas médicas. Cuando la administración ha de ser parenteral, tal como intravenosa de forma diaria, pueden prepararse composiciones farmacéuticas inyectables en formas convencionales, o bien como disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones.
Los comprimidos para la administración oral de los compuestos activos de la invención pueden prepararse de la manera siguiente:
100
Se mezclan y granulan todo el compuesto activo, la celulosa, y una parte del almidón de maíz en pasta de almidón de maíz al 10%. La granulación resultante se tamiza, se seca y se combina con el resto del almidón de maíz y el estearato de magnesio. Después, se comprime la granulación resultante en comprimidos que contienen 25,0, 50,0 y 100,0 mg, respectivamente, de principio activo por comprimido.
Una forma farmacéutica intravenosa de los compuestos activos indicados anteriormente puede prepararse de la manera siguiente:
101
Utilizando las cantidades anteriores, el compuesto activo se disuelve a temperatura ambiente en una disolución preparada previamente de cloruro de sodio, ácido cítrico y citrato de sodio en agua para inyección (USP, véase la pág. 1636 de la Farmacopea de los Estados Unidos/formulario nacional para 1995, publicado por la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos, Inc., Rockville, Maryland, copyright 1994).
Los ejemplos siguientes se proporcionan con fines de ilustración, no de limitación.
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Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de partes componentes
En este ejemplo, se describe la síntesis de partes componentes representativas que pueden combinarse para formar los miméticos de giro en sentido inverso de la presente invención.
A. Primeras partes componentes representativas
Se utilizó una primera parte componente que tiene la siguiente estructura 1:
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33 
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en la que R_{4} es como se define anteriormente, y R representa un grupo protector adecuado para el uso en la síntesis peptídica. Los grupos R adecuados incluyen los grupos alquilo y en una realización preferida, R es un grupo
metilo.
Generalmente, se prepara la primera parte componente mediante N-alquilación de una amina con un dialquilacetal de un 2-haloetanal. La síntesis de una primera parte componente representativa a partir de fenetilamina y el dimetil-acetal de 2-bromoetanal se representa esquemáticamente a continuación:
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En el procedimiento, se añadieron 24 ml (3,43 ml, 20,3 mmol) de bromuro y 2,8 ml (2,71 g, 22,3 mmol) de fenetilamina a 40 ml de THF destilado recientemente en un matraz de fondo redondo de 150 ml cargado con argón equipado con un condensador de reflujo. Se calentó la reacción durante 24 h a reflujo suave, después se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se disolvió el residuo en 200 ml de diclorometano. Se lavó la fase orgánica con 2 x 100 ml de bicarbonato de sodio acuoso saturado, cloruro sódico acuoso saturado y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se secó el residuo durante 3 horas a alto vacío para dar 3,5 g (83%) de la primera parte componente la (m=1) como un aceite marrón claro usado sin purificación adicional.
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B. Segundas partes componentes representativas
Una segunda parte componente representativa de la invención es un aminoácido reactivo protegido en N que tiene un grupo ácido carboxílico activado, o un derivado azido de un aminoácido, como se representa en la siguiente estructura 2:
35
en la que R_{3} es tal como se definió anteriormente, P es en grupo protector de amino adecuado para el uso en síntesis peptídica, y X representa el grupo saliente del grupo ácido carboxílico activado. Los grupos protectores preferidos incluyen t-butil-dimetilsililo (TBDMS), BOC, FMOC, y Alloc (aliloxicarbonilo). Los aminoácidos protegidos en N están disponibles comercialmente. Por ejemplo, los aminoácidos con FMOC están disponibles en una variedad de fuentes. La conversión de estos compuestos en las segundas partes componentes de esta invención puede lograrse fácilmente mediante la activación del grupo ácido carboxílico del aminoácido protegido en N. Los grupos ácido carboxílico activados adecuados incluyen haluros de ácido en los que X es un haluro tal como cloruro o bromuro, anhídridos de ácido en los que X es un grupo acilo tal como acetilo, ésteres reactivos tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida y ésteres de p-nitrofenilo, y otros intermedios activados tales como los intermedios activos formados en una reacción de acoplamiento usando una carbodiimida tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC). De manera similar, puede prepararse el derivado azido correspondiente mediante técnicas conocidas. En una realización preferida, X es hidroxilo para el acoplamiento de HATU (hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriaol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio), o es flúor para el acoplamiento mediado por silicio.
C. Terceras partes componentes representativas
Una tercera parte componente representativa de esta invención es un ácido carboxílico \alpha,\beta-insaturado o derivado del mismo que tiene la siguiente estructura 3:
36
en la que R_{2} y R_{5} son tal como se definieron anteriormente, y P es un grupo protector de ácido carboxílico tal como un grupo metilo o t-butilo. Tales terceras partes componentes pueden obtenerse comercialmente, o sintetizarse a partir del aldehído disponible comercialmente y el iluro de fósforo según el siguiente esquema de reacción:
37
(véase, Wadsworth y Emmons, Org. Syn. 45:44, 1965).
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D. Cuartas partes componentes representativas
Una cuarta parte componente representativa de esta invención es una amina primaria que tiene la siguiente estructura 4:
38
en la que R_{1} es tal como se definió anteriormente. Las cuartas partes componentes adecuadas están disponibles comercialmente en una variedad de fuentes. Alternativamente, pueden prepararse las cuartas partes componentes fácilmente mediante técnicas convencionales de síntesis orgánica utilizadas habitualmente para la síntesis de aminas primarias.
Ejemplo 2 Intermedios primero-segundo combinados: el acoplamiento de las primeras y segundas partes componentes
El acoplamiento de las partes componentes para producir los miméticos de giro en sentido inverso de la presente invención implican generalmente la formación de enlaces amida. Los enlaces amida que unen las partes pueden formarse mediante técnicas de síntesis peptídica convencionales y pueden realizarse mediante síntesis en fase o bien líquida o bien sólida.
El acoplamiento de las primeras y segundas partes componentes proporciona, tras la desprotección, un intermedio primero-segundo combinado que tiene esta estructura 1-2:
39
en la que R, R_{3}, y R_{4} son tal como se describieron anteriormente (en este ejemplo, R'' de la estructura (I') es/son hidrógeno).
La preparación de un intermedio primero-segundo combinado se logra mediante la formación de un enlace amida entre la amina de una a primera parte componente 1 y el grupo ácido carboxílico activado de una segunda parte componente 2 seguida por la desprotección del N. La síntesis de un intermedio primero-segundo combinado representativo se representa esquemáticamente a continuación.
40
En el procedimiento, se añadieron 937 mg (7 mmol) de cianuro de plata (AgCN) a 650 mg (3,17 mmol) de la primera parte componente la preparada tal como se describe en el ejemplo 1A y 1 g (3,17 mmol) de cloruro de FMOC-glicina, 2a, 10 ml de benceno destilado recientemente en un matraz de fondo redondo de 25 ml cargado con argón, y se agitó enérgicamente la mezcla de reacción resultante durante 48 h. Se diluyó la reacción hasta 25 ml con acetato de etilo y se filtró a través de un tapón de celite. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se sometió el residuo a cromatografía usando acetato de etilo:hexano 20:80 como fase móvil sobre gel de sílice de calidad ultrarrápida para dar 1,1 g (71%) de un sólido amorfo.
Se añadió gota a gota 1 ml de dietilamina (DEA) a 400 mg (0,82 mmol) del sólido amorfo en 5 ml de acetonitrilo y se agitó la mezcla de reacción resultante a temperatura ambiente durante 2 h. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se sometió a cromatografía el residuo usando metanol al 5% saturado con amoniaco, diclorometano al 95% como fase móvil sobre gel de sílice de calidad ultrarrápida para dar 207 mg (95%) de un intermedio primero-segundo combinado, 1-2a, como un aceite incoloro espeso.
Ejemplo 3 Intermedios tercero-cuarto combinados: el acoplamiento de las terceras y cuartas partes componentes
El acoplamiento de una componente con una cuarta parte componente proporciona un intermedio tercero-cuarto combinado. La tercera-cuarta parte componente combinada se produce mediante la formación de enlaces amina resultantes de la adición conjugada del grupo amino de una cuarta parte componente 4 al grupo carbonilo \alpha,\beta-insaturado de una tercera parte componente 3.
El acoplamiento de las terceras y cuartas partes componentes proporciona, tras la desprotección, un intermedio tercero-cuarto combinado que tiene esta estructura 3-4:
41
en la que R_{1}, R_{2}, y R_{5} son tal como se describieron anteriormente (en este ejemplo, n de la estructura (I') es O).
La preparación de un intermedio tercero-cuarto combinado se logra mediante la formación de un enlace amina entre el grupo amino primario de una cuarta parte componente 4 y el grupo carbonilo \alpha,\beta-insaturado de una tercera parte componente 3 seguido de desprotección en O. La síntesis de un intermedio tercero-cuarto combinado representativo se representa esquemáticamente a continuación:
42
En el procedimiento, se añadió metanol suficiente para disolver la suspensión a 5 g de tiramina suspendida en 40 ml de tetrahidrofurano (THF) destilado recientemente en un matraz de fondo redondo de 250 ml, cargado con argón. Se añadieron gota a gota 5,3 ml (4,67 g, 36,4 mmol) de acribato de t-butilo a la disolución resultante durante el transcurso de 5 min, y se agitó la mezcla de reacción resultante durante toda la noche a temperatura ambiente. Se añadieron 2 ml adicionales de acrilato de t-butilo para consumir el resto del material de partida y se agitó la reacción durante 4 h adicionales. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se sometió a cromatografía el residuo usando diclorometano:metanol saturado con amoniaco:NH3/MeOH 95:5 como fase móvil sobre gel de sílice de calidad ultrarrápida para dar 6,6 g (68%) del éster, un aceite incoloro que solidificó tras refrigeración durante toda la noche. Se añadieron 80 ml de ácido trifluoroacético (TFA) a una disolución de 1 gramo (3,77 mmol) del éster en 20 ml de diclorometano a 0ºC y se agitó la mezcla de reacción resultante con calentamiento hasta temperatura ambiente durante el transcurso de 24 h. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida para dar 950 mg de un aceite claro. Se disolvió el producto final en diclorometano:metanol 95:5 y se filtró lentamente a través de una almohadilla de alúmina neutra. Se eliminaron los compuestos volátiles del filtrado para dar 750 mg de 3-4a como un sólido amorfo.
Ejemplo 4 Intermedios primero-segundo-tercero-cuarto combinados: el acoplamiento de los intermedios primero-segundo y tercero-cuarto combinados
El acoplamiento de un intermedio primero-segundo combinado con un tercero-cuarto combinado proporciona un intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado. Este último se produce mediante la formación del enlace amida que resulta del acoplamiento del grupo amina de un intermedio primero-segundo combinado 1-2 al grupo ácido carboxílico de un intermedio tercero-cuarto combinado 3-4. El intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado tiene la siguiente estructura 1-2-3-4:
44
en la que R, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son tal como se describieron anteriormente.
La síntesis de un intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado representativo se representa esquemáticamente a continuación.
45
En el procedimiento, se disolvieron 212 mg (1,0 mmol) de 3-4a, 270 mg (1,01 mmol) de 1-2a, y 136 mg (1,01 mmol) de 1-hidroxibenzotriazol hidratado (HOBT) en 10 ml de dimetilformamida (DMF) y se enfrió a 0ºC. Se añadieron 290 mg (1,52 mmol, 1,5 eq) de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) a esta solución y se agitó la mezcla de reacción resultante y se calentó hasta temperatura ambiente durante el transcurso de 24 horas. Se eliminó el DMF a presión reducida y se volvió a disolver el residuo en 200 ml de acetato de etilo. Se lavó la capa de acetato de etilo con bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua, y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se sometió a cromatografía el residuo usando diclorometano:metanol saturado con amoniaco 95:5 como eluyente sobre gel de sílice de calidad ultrarrápida para dar 310 mg (0,68 mm, 67%) de 1-2-3-4a como un aceite incoloro espeso.
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Ejemplo 5 Síntesis de un mimético de giro en sentido inverso representativo: ciclación de un intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado
La ciclación de un intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado proporciona un mimético de giro en sentido inverso de la presente invención. El intermedio primero-segundo-tercero-cuarto combinado 1-2-3-4 se cicla mediante tratamiento con ácido alcanforsulfónico (CSA) o, en una realización preferida, TMSOTF (a 0ºC) para proporcionar un mimético de giro en sentido inverso que tiene la siguiente estructura (Ia):
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47 
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en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, y R_{5} son tal como se describieron anteriormente.
La síntesis de un mimético de giro en sentido inverso representativo de la presente invención se representa esquemáticamente a continuación.
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48
480
En el procedimiento, se convirtieron en azeótropo 0,5 g (2,4 mmol) de ácido alcanforsulfónico (CSA) con porciones de 3-15 ml de tolueno destilado recientemente y se secó a vacío a 40ºC durante 3 h en un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con a condensador de reflujo. Después se añadieron 20 ml de tolueno destilado recientemente y se calentó la disolución de CSA a reflujo enérgico. Se añadió una disolución de 50 mg (0,11 mmol) de 1-2-3-4a en 20 ml tolueno destilado recientemente a esta disolución de CSA sometida a reflujo mediante bomba de jeringa durante el transcurso de 1 h. Se sometió a reflujo la mezcla de reacción resultante durante 12 h, se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó hasta 200 ml en acetato de etilo. Se lavó la capa orgánica con porciones de 2-75 ml de bicarbonato de sodio acuoso saturado, 75 ml de cloruro de sodio acuoso saturado, y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida para dar 22 mg de la como un sólido traslúcido. Se trituró el producto bruto con diisopropil éter:hexano 50/50 para eliminar las impurezas apolares. Después se disolvió el sólido en diclorometano y se filtró para eliminar las impurezas polares. Se secó el residuo por evaporación a vacío durante 24 h.
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Ejemplo 6 Síntesis de una sal de un mimético de giro en sentido inverso representativa
Los miméticos de giro en sentido inverso de la presente invención son bases nitrogenadas y, por tanto, pueden convertirse en sus sales correspondientes mediante tratamiento con diversos ácidos. En este ejemplo, se describe la preparación de una sal de un mimético de giro en sentido inverso representativa.
Se obtuvo la sal del ácido 2,4-dinitrobenzoico del mimético de giro en sentido inverso Ia, preparado tal como se describe en el ejemplo 5, mediante tratamiento del mimético de giro en sentido inverso con el ácido en metanol acuoso. En el procedimiento, se disolvieron 5 mg (12,7 \mumol) de la en 3 ml de metanol:agua 80/20 y se enfrió hasta 0ºC. Se añadieron 2,70 mg (12,7 \mumol, 1,0 eq) de ácido 2,4-dinitrobenzoico a esta disolución, y se agitó la disolución resoltante hasta que se volvió homogénea. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida y se secó el residuo a vacío durante 24 h. Se llevó el residuo a agua caliente y se filtró para eliminar las impurezas insolubles. Después se liofilizó la disolución para dar la sal, 5.
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Ejemplo 7 Síntesis de miméticos de giro en sentido inverso representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis de miméticos de giro en sentido inverso representativos adicionales de esta invención.
Síntesis de la estructura (6)
50
Se añadió Boc-Ala-OH (1,9 g, 10 mmol) a una disolución en agitación de éster etílico de N-bencilglicina (1,93 g, 10 mmol) en THF (50 ml), seguido por HOBt (1,62 g, 12 mmol) y EDCI (2,3 g, 12 mmol) a temperatura ambiente("ta"). Se agitó la disolución resultante a ta durante 5 horas ("h"). Tras la dilución con EtOAc (100 ml), se lavó la disolución con HC1 1N (50 ml), NaHCO_{3} sat. (50 ml), y salmuera (50 mL); se secó (MgSO_{4}), se pasó a través de una almohadilla corta de SiO_{2}, y se concentró para dar un aceite en rendimiento cuantitativo. La TLC mostró que el producto era suficientemente puro para su uso en la siguiente reacción sin purificación adicional. TLC R_{f} 0,6 (hexano:EtOAc = 5:5); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) {se asignó el espectro como una mezcla 2:1 de rotámeros} \delta 1,24 (dos t, 3H, J=6,5 Hz), 1,35 y 1,36 (dos d, 3H, J=6,5 Hz) 1,42 y 1,43 (dos s, 9H), 3,80 (dd, 1H, J= 18 Hz), 4,15 (q, 2H, J=6,5 Hz), 4,40 (dd, 1H), 4,65 (ABq, 2H, J=16,5 Hz), 4,80 (m, 1H), 5,40 (dos d, 1H, J=8 Hz, NH), 7,1-7,3 (m, 5H, fenilo); EM ES+ 365,1
(M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (7) 
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51 
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Se añadió LiOH \cdot H_{2}O (1 g) a una disolución en agitación de 3,8 g de éster etílico bruto (6) en THF/H_{2}O (50/50 ml) a ta. Tras 30 min de agitación a ta, se lavó la disolución con Et_{2}O (50 ml) y se acidificó la fase acuosa con HC1 6N (pH 2), y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Se secaron los extractos orgánicos combinados (MgSO_{4}), se pasó a través de una almohadilla corta de SiO_{2}, y se concentraron para proporcionar una espuma en rendimiento cuantitativo. Se usó el producto para la siguiente reacción sin purificación adicional. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) {mezcla de rotámeros} \delta 1,33 (dos d, 3H, J=7 Hz), 1,41 (dos s, 9H), 3,8-4,8 (conjunto de m, 5H), 5,70 (dos d, 1H, J=8 Hz, NH), 7,2-7,6 (m, 5H, fenilo).
Síntesis de la estructura (8) 
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52 
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Se añadió secuencialmente DIEA (5 ml, 30 mmol), DMAP (250 mg, 2 mmol), y EDCI (2,9 g, 15 mmol) a una disolución en agitación de 3,4 g de ácido (7) y cianometilen-trifenilfosforano (4,1 g, 12 mmol) en diclorometano (100 ml) a ta. Tras 12 h de agitación, se concentró la disolución, y se llevó el residuo resultante a HC1 1N (100 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Se lavaron los extractos combinados con NaHCO_{3} sat. (100 ml), se secaron (MgSO_{4}), se pasaron a través de una almohadilla corta de SiO_{2}, y se concentraron. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía ultrarrápida (hexano:EtOAc = de 50:50 a 30:70 a 20:80) para proporcionar un sólido espumoso (4,40 g, 71%). TLC R_{f} 0,5 (EtOAc); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) {mezcla de rotámeros} \delta 1,28 (dos d, 3H, J=6,5 Hz), 1,44 (dos s, 9H), 4,2-4,7 (conjunto de m, 5H), 5,5 (dos d,1H, J=8 Hz, NH), 7,2 (m, 5H), 7,5-7,8 (m, 15H);EM ES+ m/z 520,3, 620,3 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (9) 
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Se burbujeó una disolución en agitación del fosforano (8) (310 mg, 0,5 mmol) en diclorometano (5 ml) con O_{3} a -78ºC durante 15 min hasta que la disolución se volvió azul verdosa; la TLC mostró el consumo completo del material de partida.
Tras burbujear con Ar para eliminar el exceso de ozono de esta disolución, se añadió éster etílico de N-bencil-glicina (100 ml), y se agitó la disolución a -78ºC durante 30 min. Tras la concentración, se disolvió el residuo en EtOAc (50 ml), se lavó con HC1 1N (20 ml), NaHCO_{3} sat. (20 ml), salmuera (20 ml), se secó (MgSO_{4}), y se concentró de nuevo. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía ultrarrápida (hexano:EtOAc = de 90:10 a 80:20 a 70:30 a 60: 40) para proporcionar un aceite (105 mg, 39%). TLC R_{f} 0,42 (hexano:EtOAc = 60:40); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) {se asignó el espectro como una mezcla 1:1 de rotámeros} \delta 1,25 (dos t, 3H, J= 7 Hz), 1,31 y 1,38 (dos d, 3H, J=7 Hz), 1,41 y 1,43 (dos s, 9H), 3,8-4,8 (conjunto de m, 11H), 5,5 (dos d, 1H, NH), 7,2-7,4 (m, 5H). EM ES+ m/z 440,3, 540,3 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (10) 
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Se trató una disolución de 100 mg de cetoamida (9) (0,18 mmol) en 0,5 ml de diclorometano con 0,5 ml de TFA a ta durante 30 min. Tras la concentración, se disolvió el residuo en MeOH (2 ml) y se trató con ZnCl_{2} (6 mg) y NaBH_{3} CN (15 mg) a ta durante toda la noche (13 h). Tras la concentración, se llevó el residuo a NaHCO_{3} sat. (20 ml), se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml). Se secaron los extractos orgánicos combinados (MgSO_{4}), se concentraron hasta un aceite, y se purificaron mediante TLC preparativa (hexano: EtOAc= 60:40) para proporcionar un sólido vítreo (52 mg, 77%). (La enamina demostró ser resistente a la reducción mediante este método.) TLC R_{f} 0,58 (EtOAc); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,41 (d, 3H, J=6,5 Hz, CHCH_{3}), 3,93 (ABq, 2H, J=18 Hz, CH_{2} en Gly), 4,46 y 4,75 (ABq, 1H cada, J=14,5 Hz, HC_{2}Ph), 4,76 (ABq, 2H, J=14 Hz, CH_{2}F),5,22 (q, 1H, J=7 Hz, CHCH_{3}), 6,83 (s, 1H, =CH), 7,33 (m, 10H, fenilos); ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta 16,63, 49,59, 49,66, 49,84, 50,98, 111,92, 119,16, 128,07, 128,22, 128,29, 128,52, 128,94, 128,97, 134,78, 134,43, 157, 96, 160, 67, 165, 33. EM ES+ m/z 376,3 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (11) 
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Se agitó una disolución de 25 mg de la estructura (10) (0,066 mmol) con PtO_{2} (5 mg) en MeOH (2 ml) bajo atmósfera de H_{2} (20 atm) durante 10 días. Tras la concentración, se purificó el residuo mediante TLC preparativa (hexano:EtOAc= de 60:40 a 50:50) para dar un aceite amarillo claro (14 mg, 56%) con material de partida (10 mg). TLC R_{f} 0,49 (EtOAc); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,14 (d, 1,5H, J=7 Hz, CHCH_{3}), 1,52 (d, 1,5H, J=7 Hz, CHCH_{3}), 3,2-4,8 (conjunto de m, 10H), 7,33 (m, 10H, fenilos); EM ES+ m/z 378 (M+H^{+}). Análisis RP-HPLC: C-18; A: 0,1% TFA (ac); B 0,1% TFA (CH_{3}CN); gradiente: 0-90%/40'; 254 nm tR 24,1' y 24,7' mostró una razón de 2:1.
Ejemplo 8 Síntesis de miméticos de giro en sentido inverso representativos
Este ejemplo ilustra adicionalmente las síntesis de miméticos de giro en sentido inverso de esta invención. Específicamente, se llevó a cabo la preparación de miméticos de giro en sentido inverso [4.4.0] bicíclicos en fase en de disolución (método A) y en fase sólida (métodos B y C). Se proporcionan estructuras de miméticos representativos en la tabla 2. Las síntesis en fase sólida de estos miméticos de giro en sentido inverso demuestran que las bibliotecas que contienen tales miembros pueden prepararse fácilmente.
La síntesis en fase de disolución del método A es análoga a la síntesis en fase sólida del método B y se llevó a cabo esencialmente tal como se ilustra en la figura 2. Los compuestos se purificaron según el método C, a continuación.
La síntesis en fase sólida del método B aparece en la fig. 8. Haciendo referencia a esa figura, se hizo reaccionar resina de aminometilo disponible comercialmente con exceso de ácido 4-bromo–2-butenoico y DIC (diisopropilcarbdiimida) en DMF para dar la resina de 4-bromo-2-butenamida. La sustitución del grupo bromo con una amina primara en DM SO dio la resina de 4-alquilamino-2-butenamida correspondiente. Se realizaron procedimientos de acoplamiento peptídico convencionales en fase sólida para dar resina de N-alquiloxicarbonil-\alpha-alquilo-\beta-alanil-\alpha-alquilglicil-N'-alquilamino-2-butenamida. Se obtuvieron los miméticos de giro en sentido inverso por oxidación con peryodato catalizada por tetróxido de osmio de la resina seguida por el tratamiento del producto monocíclico resultante con una cantidad catalítica de TFA en diclorometano. Los productos brutos dieron un pico principal único mediante HPLC de fase inversa.
La síntesis en fase sólida del método C es similar a la del método B y se proporciona en el ejemplo 11 y se ilustra en la fig. 9. Los compuestos seleccionados se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida o TLC preparativa sobre gel de sílice usando combinaciones adecuadas de EtOAc y MeOH.
Los miméticos se caracterizaron según lo siguiente: se llevó a cabo HPLC de fase inversa C_{18} analítica usando técnicas convencionales (fase móvil: gradientes del 0,1% en agua y acetonitrilo). Mediante estos métodos, los productos brutos sintetizados en fase sólida mostraron generalmente purezas superiores al 80% y todos los compuestos purificados superiores al 95%. Se llevó a cabo espectrometría de masas de electrospray usando técnicas convencionales. Se proporciona el valor observado del ion (M+H^{+}) en la tabla 2 para cada compuesto. Se llevó a cabo ^{1}H-RMN sobre miméticos purificados y los espectros se asignaron mediante una combinación de experimentos COSY y ROESY. Todos los espectros concordaron con las estructuras indicadas a continuación, y mostraron una conformación similar al giro \beta tipo I o II.
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TABLA 2 Miméticos de giro en sentido inverso representativos 
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Ejemplo 9
(No según la presente invención)
Actividad de un mimético de giro en sentido inverso representativo en la unión al receptor opioide
En este ejemplo, se describe la actividad de unión de miméticos de giro en sentido inverso representativos a los receptores opioides delta (\delta) y mu (\mu) así como a una preparación de receptores opioides no selectivos. En estos ensayos de unión competitiva a radioligandos, se evaluó la afinidad de la unión del 5, la sal del ácido 2,4-dinitrobenzoico de un mimético de giro en sentido inverso de la estructura Ia (preparado tal como se describe en el ejemplo 6), y de una variedad de miméticos de giro en sentido inverso preparados tal como se describe en el ejemplo 8.
A. Actividad de unión (\delta) opiácea
En este método, se prepararon membranas de cerebros enteros de cobayas macho y se equilibraron con 2 nM de [^{3}H]DPDPE (D-pen^{3}, D-pen^{5}) encefalina durante 1 hora a 4ºC tras lo cual se añadieron las sustancias de prueba y se incubaron durante 4 horas a 25ºC. Se determinó la unión no específica en presencia de naltrindol 0,3 \muM. Se separó el [^{3}H] DPDPE unido del radioligando libre mediante filtración rápida a través de filtermats de fibra de vidrio y posteriormente se lavó tres veces. Después, se contaron los filtermats en el LKB Betaplate para determinar el [^{3}H]DPDPE unido específicamente. (Ver Mosberg et al., "Structural Requirements for \delta Opiate Receptor Binding", Molec. Farmacol. 31: 599-602, 1987.)
TABLA 3 Efecto de los compuestos de referencia sobre el [^{3}H]DPDPE unido (2 nM)
60
En este ensayo, se determinó que el radioligando, [^{3}H]DPDPE, tenía una K_{d}=0,65 nM con una B_{max}=12,6 fmol/mg de proteína y una unión específica del 60%. Se encontró que, a una concentración de 10 \muM, 5 inhibe la unión del radioligando en el nivel del 60%, y mostró una K_{i} = 1,7 \pm 0,3 \muM y un CI_{50} = 6,9 \pm 1,2 \muM. Estos resultados se presentan en la figura 1 (o) que representa el % de inhibición de la unión del radioligando en función de la concentración del mimético de giro en sentido inverso 5. También se encontró que, a una concentración de 10 \muM, el mimético de giro en sentido inverso 16 inhibía la unión del radioligando al nivel del 92%. Estos resultados demuestran que los miméticos de giro en sentido inverso 5 y 16, en particular, y los miméticos de giro en sentido inverso, en general, inhiben eficazmente la unión al receptor de opiáceos \delta, y tienen actividad analgésica.
B. Actividad de unión (\mu) opiácea
En este método, se prepararon membranas de cerebros enteros de cobayas macho y se incubaron con [^{3}H]DAMGO (D-Ala^{2}, N-metil-phe^{4}, gly-ol^{5})-encefalina) durante 2 horas a 25ºC. Se determinó la unión no específica en presencia de DAMGO 0,5 \muM. Se separó el [^{3}H]DAMGO unido del radioligando libre mediante filtración rápida a través de filtermats de fibra de vidrio y posteriormente se lavó 3 veces. Después se contaron los filtermats en el LKB Betaplate para determinar el [^{3}H]DAMGO unido específicamente (véase Patricia et al., "Pharmacological profiles of fentanyl analogs at \delta, \mu y \kappa opiate repectors", Eur J Pharmacol 213:219-225, 1992).
TABLA 4 Efecto de los compuestos de referencia sobre la unión de [^{3}H]DAMGO
61
En este ensayo, se determinó que el radioligando, [^{3}H]DAMGO, tenía una K_{d}=0,27 con una B_{max}=8,7 pmol/mg de proteína y una unión específica del 70%. A una concentración de 10 \muM, 5 inhibió la unión del radioligando al nivel del 64%, y mostró una K_{i} = 0,64 \pm 0,08 \muM y una CI_{50} = 5,4 \pm 0,7 \muM. Estos resultados se presentan en la figura (\bullet) que representa el de inhibición de la unión del radioligando en función de la concentración del mimético 5. También, se encontró que, a una concentración de 10 \muM, el mimético de giro en sentido inverso 16 inhibía la unión del radio ligando al nivel del 98%. Estos resultados demuestran que los miméticos de giro en sentido inverso 5 y 16, en particular, y los miméticos de giro en sentido inverso, en general, inhiben eficazmente la unión al receptor opiáceos \mu, y tienen actividad analgésica.
C. Actividad de unión (no selectiva) opiácea
En este método (Childers et al. Eur J Pharmacol 55:11, 1979), se prepararon membranas de corteza cerebral de rata y se incubaron con [^{3}H]naloxona (1 nM) y miméticos de giros \beta (de 30 \muM - 0,3 nM) durante 40 min a 22ºC. Tras la incubación, las membranas se filtraron rápidamente a vacío a través de filtros de fibra de vidrio (Filtermat A, Wallac). Se lavaron los filtros varias veces con un tampón helado usando un colector de células (Tomtec). Se midió la radioctividad unida con un contador de centelleo (Betaplate, Wallac) usando centelleo sólido (MultiLex B/HS, Wallac). En el mismo experimento, se sometió a prueba el compuesto de referencia (naloxona) a ocho concentraciones por duplicado para obtener una curva de competición con el fin de validar este experimento.
La unión específica del radioligando a los receptores se define como la diferencia entre la unión total y la unión no específica determinada en presencia de un exceso de ligando no marcado. Los resultados se expresaron como porcentaje de la unión específica del control obtenida en presencia de miméticos de giro \beta. Se determinaron los valores de CI_{50} y de los coeficientes de Hill (nH) mediante análisis de regresión no lineal de las curvas de competición. Estos parámetros se obtuvieron mediante ajuste de curva de la ecuación de Hill. Las constantes de inhibición (Ki) se calcularon a partir de la ecuación de Chen Prusoff (Ki = CI_{50}/(1+L/K_{d}), en la que L = concentración de radioligando en el ensayo y K_{d} = afinidad del radioligando por el receptor).
En este ensayo, se determinó que el radioligando, [^{3}H] naloxona, tenía una CI_{50} de 2,5 nM. Los miméticos de giro en sentido inverso, preparados y purificados como se describió en el ejemplo 8, mostraron una unión específica de hasta el 99% a una concentración de 1 \muM. Se determinó que los compuestos 29 y 30, tenían CI_{50} de 80 y 27 nM respectivamente, con coeficientes de Hill de 0,9. Estos resultados demuestran que los miméticos 29 y 30, en particular, y los miméticos de giro en sentido inverso de la presente invención, en general, inhiben eficazmente la unión (no selectiva) al receptor opioide, y tienen actividad analgésica.
Ejemplo 10
(No según la presente invención)
Actividad in vivo de un mimético de giro en sentido inverso representativo de actividad analgésica
En este ejemplo, se presenta la actividad in vivo de un mimético de giro en sentido inverso representativo como un agente analgésico. Se utilizó el compuesto 5, preparado tal como se describe en el ejemplo 6 (denominado a continuación en el presente documento "compuesto de prueba"), en el ensayo de actividad analgésica en ratón (PanLabs, Pharmascreen Test nº 10402). En este ensayo se mide el tiempo necesario para provocar una respuesta de coletazo a un estímulo de dolor por calor radiante en un grupo de ratones como el umbral de la respuesta al dolor.
Se usaron grupos de cinco (3 grupos de prueba + 1 control con solución salina + 1 control positivo con morfina) ratones ICR macho que pesaban 22(\pm2) gramos cada uno. Se seleccionó previamente cada uno de estos animales y se provocó una respuesta de coletazo en el transcurso de 6 - 7,5 segundos después de que se concentrara un rayo de calor radiante enfocado sobre la superficie dorsal media de la cola del animal. Se disolvieron cantidades específicas del compuesto de prueba (es decir, 10, 30 y 100 \mug) en 5 microlitros (5 \mul) de solución salina que contenían un 6% de DMSA y se administró por vía intracerebroventricular (ICV) a cada animal. Se usó una solución sólo salina como control negativo, con una inyección ICV de una dosis de 10 \mug/5 \mul/animal de morfina como control positivo.
Se midió la respuesta de coletazo un minuto después de la inyección ICV en los grupos de ratones, con un tiempo límite máximo de 15 segundos. Se calculó la media del tiempo de respuesta para cada grupo de tratamiento para hacer una comparación entre antes del tratamiento ("tiempo 0") y 1 minuto después del tratamiento ("1 min"). Se consideró una actividad significativa una prolongación del minuto después del tratamiento de más del 50% ("% prolong."). Los resultados de este experimento se presentan en la tabla 5, y demuestran que el compuesto de prueba tiene actividad analgésica significativa (es decir, aprox. el 10%-15% de la potencia de la morfina)
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TABLA 5 Ensayo de actividad analgésica in vivo
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Ejemplo 11 Síntesis de miméticos de giro en sentido inverso representativos
Este ejemplo ilustra adicionalmente la síntesis de los miméticos de giro inversa de esta invención. Específicamente, se llevó a cabo la preparación de miméticos de giro en sentido inverso [4.4.0] bicíclicos en fase sólida mediante un método alternativo al del ejemplo 8, método B. El método se explica resumidamente en la figura 9.
Síntesis de resina unida a 2-bromo-1-etoxi-etil-1-oxilo(27) 
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En general, se sometió a reflujo un lote de resina (Argogel-OH o hidroximetil-poliestireno) en 1,2-dicloroetano (DCE) durante 4 horas en presencia de 8 equivalentes de dietilacetal de bromoalquilaldehído y 2 equivalentes de p-toluenosulfonato de piridinio (PPTS). En un caso, se suspendieron hidroximetil-poliestireno (10,0 g, 0,7 mmol OH/g, 7 mmol) y 3,5 g de PPTS (14 mmol) en 200 ml de DCE. Después, se añadió con agitación una disolución de 8,5 ml de 2-bromodietoxietano (aprox. 56 mmol) en DCE (100 ml) y se calentó a reflujo la mezcla de reacción (aprox. 80ºC). Tras 4 horas, se separó por filtración la resina y se lavó con 100 ml de dimetilformamida (DMF), 50 ml de dimetilsulfóxido (DMSO), 100 ml de DMF, 200 ml de diclorometano (DCM), 50 ml de 1,4-dioxano y finalmente con 100 ml de metanol. Tras el secado, se obtuvieron 11,73 g de la resina 27. El análisis de bromo indicó carga
cuantitativa.
Síntesis de compuestos representativos de estructura (Ia')
Se llevaron a cabo reacciones en jeringas de plástico desechables del tamaño apropiado, cada una equipada con una frita de polipropileno para retener la resina. Tras cada etapa, se lavaron los lotes de resina con DMF (3 x) y DCM (3 x). Normalmente, se trató una muestra de la resina 27 de 0,03 mmol (p. ej. 50 mg de resina de poliestireno con una carga de 0,6 mmol de Br/g), hinchada previamente en DMF, con 1 ml de una disolución 2,0 M de una amina R_{4}-NH_{2} (2 m mol) en DMSO a 60ºC durante 16-24 h.
A continuación, se hizo reaccionar la resina con 0,09 mmol de aminoácido con Fmoc (FmocNH-CHR_{3}-COOH) en presencia de HATU (34 mg, 0,09 mmol) y DIEA (0,032 ml, 0,18 mmol) en DMF (1 ml) hasta que la prueba de cloranilo fue negativa (normalmente de 1-2 h). Posteriormente, se eliminó la protección de Fmoc mediante tratamiento con una disolución de piperidina/DMF al 25% (v/v) (2 ml) durante 20 min.
Después se hizo reaccionar la resina con 0,09 mmol de un beta-aminoácido con Fmoc (FmocNH-CHR_{5}-CHR_{2}-COOH) en presencia de DIC (0,014 ml, 0,09 mmol) y HOBr (14 mg, 0,09 mol) en DMF (1 ml) hasta que la prueba de Kaiser fue negativa (normalmente, 1 hora). La resina se trató de nuevo con una disolución de piperidina/DMF al 25% (v/v) (2 ml) durante 20 min.
Finalmente, se terminó la secuencia unida a la resina mediante reacción con cloruro de sulfonilo (R_{1}SO_{2}Cl, 0,3 m mol) en presencia de DIEA (0,106 ml, 0,6 mmol) en DCM (1 ml) durante 1 h (prueba de Kaiser negativa). Alternativamente, se usó cloroformiato R_{1}OCOC1 o isocianato R_{1}NCO (el último no necesita presencia de DIEA) en lugar de cloruro de sulfonilo para la introducción del resto R_{1}.
Se hinchó de nuevo la resina lavada y seca en DCM, se drenó y se trató con 1 ml de ácido fórmico (96%) durante toda la noche a ta. En varios casos, fue necesaria una temperatura elevada de hasta 60ºC o un tiempo de reacción prolongado para completar la ciclación (para las condiciones, véase la tabla 2 a continuación). Se recogió el sobrenadante y se combinó con lavados (2 x 0,5 ml de Ácido fórmico). Se volvió a disolver el residuo obtenido tras la evaporación del ácido fórmico en una mezcla de acetonitrilo/agua 50:50, se congeló y se liofilizó.
La tabla 6 presenta compuestos representativos de esta invención sintetizados mediante el procedimiento anterior.
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TABLA 6 Miméticos de giro en sentido inverso representativos 
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\vskip1.000000\baselineskip
66
67
68
Ejemplo 12 Actividad de miméticos de giro en sentido inverso representativos en un ensayo de adhesión celular
Se realizó un ensayo que medía la capacidad de los compuestos del ejemplo 1 para antagonizar la unión del péptido CS1 a la integrina \alpha_{4}\beta_{1}. Se usó una modificación del protocolo de Vanderslice, P. et al. (J Immunol, 1997, 1710-1718) (incorporado a este documento como referencia).
En resumen, se incubaron 100 \mul/pocillo de una disolución de péptido CS1 biotinilado (1 mg/100 ml de solución salina tamponada con fosfato) en una placa NeutrAvidin (Pierce) durante 1 h a temperatura ambiente. Después, se lavó la placa 3x con agua destilada y se trató con 200 \mul de tampón bloqueante (BSA al 3% en PBS) durante al menos 4 h. Se lavaron las placas bloqueadas tal como se explicó anteriormente. Se resuspendieron las células de Ramos recogidas (10^{7}/ml) en PBS que contiene 10 \mul de calceína AM/ml y se incubaron 30 min en oscuridad. Esta suspensión se diluyó con 4,5 ml de PBS y se recogieron las células mediante centrifugación y aspiración. Se resuspendieron las células en tampón de unión (\sim5 x 10^{5}/ml). Si se va a monitorizar la lisis celular, se añadió homodímero de etidio al tampón hasta una concentración final de 5 \muM. Se añadió una disolución (10 \mul) del compuesto que se va a someter a prueba o de péptido control a los pocillos apropiados seguido por 90 \mul de suspensión de células. Se incubó la placa a 37ºC durante 1 h. Cuando se añadió el homodimero de etidio, se midió la fluorescencia a 535/617 antes de enjuagar. En caso contrario, se lavó la placa 3x, se añadieron 50 \mul de tampón de lisis a cada pocillo, se agitó la placa en oscuridad durante 10 min, y se monitorizó la fluorescencia a 485 nm de excitación y 535 nm de emisión.
Los compuestos preparados en el ejemplo 11 mostraron actividad en este ensayo. Como tales, los compuestos de esta invención inhiben eficazmente la adhesión celular y tienen actividad como agentes antiinflamatorios.

Claims (23)

1. Uso de un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
69
en la que el compuesto es un inhibidor de la integrina \alpha_{4}\beta_{1} y en la que
Y se selecciona de -CH(R_{5})-A-N(R_{1})-, -A-N(R_{1})-CH(R')-, -A-N(R_{1})-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R_{1})-, -A-CH(R_{1})-O- y -A-CH(R_{1})-N(R')-;
A es -(CHR')_{n}-, en el que n = 0, 1 ó 2;
B es -(CHR'')_{m}-, en el que m = 1, 2 ó 3;
R', R'', R_{2}, R_{3} y R_{5} son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, un elemento de unión y un soporte sólido.
R_{1} y R_{4} son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un soporte, una resina de poliestireno que contiene un elemento de unión de 4-hidroximetilfenoxibutirato, aminoácido, resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, péptido, proteína, -OH, -OR, -COR, -COOR, -CONH_{2}, -CONRR, -NH_{2}, -NHR, NRR, -SO_{2}R o -COSR, en el que cada aparición de R se selecciona independientemente de restos alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12} lineales o ramificados, cíclicos o no cíclicos, sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados y en los que cualesquiera dos grupos CH adyacentes o grupos NH y CH adyacentes en el anillo bicíclico condensado pueden formar opcionalmente un doble enlace;
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de asma, alergias, colitis aguda, enfermedad inflamatoria del intestino, encefalomielitis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, enfermedad de Alzheimer, dermatitis atópica, nefritis, aterosclerosis, isquemia de miocardio, restenosis, accidente cerebrovascular, metástasis tumoral y psoriasis,
en el que el tratamiento comprende administrar a un animal de sangre caliente que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto.
2. Uso según la reivindicación 1, en que Y es -CH(R_{5}) -A-N(R_{1})- y el compuesto tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
70
en la que A, B y de R_{1} a R_{5} son según la reivindicación 1.
3. Uso según la reivindicación 2, en que A es -(CH_{2})_{n}, B es -(CH_{2})_{m}, y el compuesto tiene la estructura:
71
en la que n, m y de R_{1} a R_{5} son según la reivindicación 1.
4. Uso según la reivindicación 3, en que n es 0, m es 1 y el compuesto tiene la estructura:
72
en la que de R_{1} a R_{5} son según la reivindicación 1.
5. Uso según la reivindicación 1, en que Y es -A-N(R_{1})-CH(R')- y el compuesto tiene la estructura:
73
en la que A, B, R' y de R_{1} a R_{5} son según la reivindicación 1.
6. Uso según la reivindicación 5, en que los dos grupos CH adyacentes del anillo bicíclico condensado forman un doble enlace y el compuesto tiene la estructura:
74
en que A, B, R' y de R_{1} a R_{5} son según la reivindicación 1.
7. Uso según la reivindicación 6, en que A es -(CH_{2})_{n}-, B es -(CH_{2})_{m}-, R' es hidrógeno, y el compuesto tiene la estructura:
75
en la que n, m, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
8. Uso según la reivindicación 1, en que Y es -A-N(R_{1})-C(=O)-, y el compuesto tiene la estructura:
76
en la que A, B, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
9. Uso según la reivindicación 8, en que A es -(CH_{2})_{n}-, B es -(CH_{2})_{m}-, y el compuesto tiene la estructura:
77
en la que n, m, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
10. Uso según la reivindicación 1, en que Y es -A-C(=O)-N(R_{1})-, y el compuesto tiene la estructura:
78
en la que A, B, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
11. Uso según la reivindicación 10, en que A es -(CH_{2})_{n}- y B es -(CH_{2})_{m}-, y el compuesto tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
79
en la que n, m, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
12. Uso según la reivindicación 1, en que Y es -A-CH(R_{1})-O-, y el compuesto tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
80
en la que A, B, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
13. Uso según la reivindicación 12, en que A es -(CH_{2})_{n}-, B es -(CH_{2})_{m}-, y el compuesto tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
81
en la que n, m, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
14. Uso según la reivindicación 1, en que Y es -A-CH(R_{1})-N(R')-, y el compuesto tiene la estructura:
82
en que A, B, R' y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
15. Uso según la reivindicación 14 en el que los dos grupos NH y CH adyacentes en el anillo bicíclico condensado forman un doble enlace y el compuesto tiene la estructura:
83
en la que A, B, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
16. Uso según la reivindicación 15, en que A es -(CH_{2})_{n}- y B es -(CH_{2})_{m}-, y el compuesto tiene la estructura:
84
en la que n, m, y de R_{1} a R_{4} son según la reivindicación 1.
17. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad o trastorno es aterosclerosis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino o esclerosis múltiple.
18. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad es aterosclerosis.
19. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad es asma.
20. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad es enfermedad inflamatoria del intestino.
21. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad es esclerosis múltiple.
22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o de 17 a 21, en el que el compuesto tiene la estructura:
85
en la que
Y es -CH(R_{5})-A-N(R_{1})-;
A es -(CHR')_{n}, en el que n = 0, 1 ó 2;
B es -(CHR'')_{m}, en el que n = 0, 1 ó 2;
R', R'', R_{2}, R_{3} y R_{5} son iguales o distintos y se seleccionan independientemente de un resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, un elemento de unión y un soporte sólido;
R_{1} y R_{4} son iguales o distintos y se seleccionan de un soporte, una resina de poliestireno que contiene un elemento de unión de 4-hidroximetilfenoxibutirato, aminoácido, resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, péptido, proteína, -OH, -OR, -COR, -COOR, -CONH_{2}, -CONRR, -NH_{2}, -NHR, NRR, -SO_{2}R o -COSR, en el que cada aparición de R se selecciona de restos alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12} lineales o ramificados, cíclicos o no cíclicos, sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados y en los que cualesquiera dos grupos CH adyacentes o NH adyacentes y los grupos CH en el anillo bicíclico condensado pueden formar opcionalmente un doble enlace.
23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el compuesto está acoplado a polímeros seleccionados de polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietil-aspartamida-fenol, o poli(óxido de etileno)-polilisina sustituidos con residuos de palmitoílo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolimeros de ácido poliláctico y poliglicólico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policianoacrilatos, y copolimeros de bloque de hidrogeles reticulados o antipáticos.
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