ES2293088T3 - Polipeptidos del factor vii de la coagulacion humana. - Google Patents
Polipeptidos del factor vii de la coagulacion humana. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido del Factor VII comprendiendo al menos dos sustituciones relativas a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro aminoácido, y (ii) donde K337 es sustituido por cualquier otro aminoácido.
Description
Polipéptidos del factor VII de la coagulación
humana.
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos del Factor VIIa de la coagulación humana con actividad
coagulante así como a constructos de polinucleótido que codifican
tales polipéptidos, vectores y células huéspedes que comprenden y
expresan el polinucleótido, composiciones farmacéuticas, usos y
métodos de tratamiento.
La coagulación sanguínea es un proceso que
consiste en una interacción compleja de varios componentes (o
factores) sanguíneos que finalmente dan lugar a un coágulo de
fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos, que participan
en lo que se ha denominado como la "cascada" de coagulación,
son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos)
que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un
activador (que él mismo es un factor de coagulación activado). Los
factores de coagulación que han sufrido tal conversión son
generalmente denominados "factores activos", y están
designados por la adición de la letra "a" al nombre del factor
de coagulación (p. ej. Factor VIIa).
La iniciación del proceso hemostático está
mediada por la formación de un complejo entre el factor tisular,
expuesto como resultado de una lesión en la pared del vaso, y el
Factor VIIa. Este complejo convierte después los factores IX y X en
sus formas activas. El Factor Xa convierte cantidades limitadas de
protrombina en trombina en la célula que alberga el factor tisular.
La trombina activa las plaquetas y los Factores V y VIII en los
Factores Va y VIIIa, ambos cofactores en el proceso adicional
conduciendo a la explosión completa de la trombina. Este proceso
incluye la generación del Factor Xa por el Factor IXa (en un
complejo con el Factor VIIIa) y ocurre en la superficie de las
plaquetas activadas. La trombina finalmente convierte el
fibrinógeno en fibrina dando como resultado la formación de un
coágulo de fibrina. En los últimos años el Factor VII y el factor
tisular han sido encontrados como los iniciadores principales de la
coagulación sanguínea.
El Factor VII es una glicoproteína plasmática de
un elemento traza el cual circula en la sangre como un zimógeno
monocatenario. El zimógeno es catalíticamente inactivo. El factor
VII monocatenario puede ser convertido en factor VIIa bicatenario
por el Factor Xa, Factor XIIa, Factor IXa, Factor VIIa o trombina
in vitro. Se cree que el Factor Xa es el activador
fisiológico más importante del factor VII. Como otras muchas
proteínas plasmáticas implicadas en la hemostasis, el factor VII
depende de la vitamina K por su actividad, que está requerida para
la gamma-carboxilación de múltiples residuos de
ácido glutámico que están reagrupados cerca del terminal amino de
la proteína. Estos ácidos glutámicos
gamma-carboxilados son requeridos para la
interacción inducida por iones metálicos del factor VII con
fosfolípidos. La conversión del factor VII zimógeno en la molécula
bicatenaria activada ocurre por el seccionamiento de un enlace
peptídico interno Arg_{152}-Ile_{153}. En
presencia del factor tisular, los fosfolípidos y los iones de
calcio, el factor VIIa bicatenario activa rápidamente al factor X o
factor IX por proteólisis limitada.
Con frecuencia, es deseable el hecho de
estimular o mejorar la cascada de coagulación en un sujeto. Se ha
usado el Factor VIIa para controlar los trastornos hemorrágicos que
tienen causas diferentes tales como deficiencias del factor de
coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de factores XI o
VII de la coagulación) o de inhibidores del factor de coagulación.
El Factor VIIa también ha sido usado para controlar un
desangramiento excesivo que se produce en sujetos con una cascada
de coagulación sanguínea de funcionamiento normal (ninguna
deficiencia del factor de coagulación o inhibidores contra ninguno
de los factores de coagulación). Esta hemorragia puede, por
ejemplo, ser provocada por una función defectuosa de las plaquetas,
por trombocitopenia o por la enfermedad de von Willebrand. La
hemorragia es también un problema importante con respecto a la
cirugía y otras formas de lesiones tisulares.
La Patente Europea nº. 200.421 (ZymoGenetics) se
refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el factor VII
humano y a la expresión recombinante del factor VII en células
mamíferas.
Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1996) 93, 14379-14384) se refiere a una
variante del Factor VII donde Leu305 ha sido sustituida por Ala
(FVII(Ala305)).
Iwanaga et al. (Thromb. Haemost.
(suplemento de Agosto 1999); 466; resumen 1474) se refiere a las
variantes del factor VIIa donde los residuos 316-320
son deleccionados o los residuos 311-322 son
sustituidos por los residuos de tripsina correspondientes.
Las solicitudes de patentes internacionales WO
01/83725 y WO 02/22776 se refieren a variantes del Factor VIIa con
actividad aumentada.
Hay una necesidad de variantes del Factor VIIa
con actividad coagulante, variantes con una actividad elevada que
pueden ser administradas en dosis relativamente bajas, y de
variantes que no producen los efectos secundarios indeseables tales
como la activación sistémica del sistema de coagulación y
hemorrágico, respectivamente, asociados con las terapias
convencionales.
La presente invención ha sido limitada a un
polipéptido del Factor VII que comprende sustituciones en F379 y
R337 de la SEC ID NO 1. Todas las demás variantes que no comprenden
al menos estas dos mutaciones son meros ejemplos adicionales y no
definen la invención.
Se ha encontrado ahora que las variantes del
polipéptido del Factor VIIa de la coagulación humana en las que el
aminoácido Phe374 y al menos un aminoácido seleccionado
independientemente del grupo que consiste en Lys157, Leu305,
Ser314, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296, y Met298 de la SEC
ID NO:1 son sustituidos por diferentes aminoácidos tienen una
actividad coagulante aumentada en comparación con el Factor VIIa de
la coagulación humana de tipo salvaje.
El término "un aminoácido diferente" como
se utiliza en este caso significa un aminoácido que es diferente
del aminoácido naturalmente presente en esta posición. Éste incluye
pero no se limita a los aminoácidos que pueden ser codificados por
un polinucleótido. En una forma de realización, el aminoácido
diferente tiene una configuración en L natural y puede ser
codificado por un polinucleótido. Un ejemplo específico es la
L-cisteína (Cys).
El término "actividad" como se utiliza en
este caso significa la capacidad de un polipéptido del Factor VII
para convertir su factor X del sustrato al Factor Xa activo. La
actividad de un polipéptido del Factor VII puede ser medida con el
"Ensayo de proteólisis in vitro" (ver ejemplo 4).
El término "actividad inherente" también
incluye la capacidad para generar trombina en la superficie de las
plaquetas activadas en la ausencia del factor tisular.
El residuo Phe374 está localizado en el extremo
de una \alpha-hélice que comienza en el residuo
307. Esta \alpha-hélice se encuentra en la forma
compleja del factor tisular del Factor VIIa. En el Factor VIIa
libre (Factor VIIa no unido al factor tisular) la hélice está
distorsionada y por lo tanto es posiblemente inestable. Se cree que
la hélice es importante para la actividad. Las variantes según la
presente invención pueden lograr la conformación activa, que
normalmente tiene que ser inducida por el factor tisular.
La actividad aumentada puede deberse a una
estabilización de la \alpha-hélice comenzando en
el residuo 307, una reorientación de la hélice o algún otro cambio
en su conformación. La sustitución del residuo Phe374, que está
localizado en la extremidad de la hélice, inducirá una reorientación
y/o estabilización de la hélice.
Debido a la actividad inherente más alta de la
variante del Factor VIIa descrita en comparación con el Factor VIIa
nativo, una dosis inferior será adecuada para obtener una
concentración funcionalmente adecuada en el sitio de acción y así
será posible administrar una dosis inferior al sujeto que tiene
episodios hemorrágicos o que precisa una mejora del sistema
hemostático normal.
Leu305 está localizado en el otro extremo de
esta \alpha-hélice encontrada en la forma
compleja del factor tisular del Factor VIIa, considerándose
importante para la actividad. La sustitución de Leu305 puede también
inducir una reorientación y/o estabilización de la hélice.
Los aminoácidos que comprenden Lys157, Ser314,
Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296, y Met298 están localizados
en un área que se considera que afecta a la inserción del término
amino del dominio de proteasa y de ese modo a la formación de la
configuración catalíticamente activa del Factor VIIa que depende de
un puente de sal entre el grupo amino terminal de Ile153 y la
cadena lateral de Asp343. Las sustituciones pueden eliminar
repulsiones electrostáticas, añadir enlaces de hidrógeno o por el
contrario facilitar la inserción del término amino.
Debido a la actividad inherente más alta de las
variantes del polipéptido del factor VIIa descritas en comparación
con el FVIIa nativo, una dosis inferior puede ser adecuada para
obtener una concentración funcionalmente adecuada en el sitio de
acción y así será posible administrar una dosis inferior al sujeto
que tiene episodios hemorrágicos o que precisa una mejora del
sistema hemostático normal.
Los presentes inventores han descubierto que
mediante la sustitución del aminoácido Phe374 en combinación con
uno o varios Lys en la posición 157 y Lys en la posición 337 y Val
en la posición 158 y Glu en la posición 296 y Met en posición 298 y
Asp en la posición 334 y Ser en la posición 336 y Leu en la
posición 305 y Ser en la posición 314, el Factor VIIa
espontáneamente logrará una configuración más activa que la que
tiene que ser inducida normalmente por el factor tisular. Tales
variantes del polipéptido del Factor VIIa muestran una actividad
inherente que puede ser terapéuticamente útil en situaciones en las
que la actividad procoagulante es independiente del factor tisular
(generación del Factor Xa en la superficie de las plaquetas) así
como cuando se administran grandes dosis de, por ejemplo,
NovoSeven®.
En otra forma de realización adicional, la
sustitución de aminoácidos en el dominio proteasa facilita además
la formación de la configuración activa de la molécula. Se cree, no
obstante, que los efectos más pronunciados se verán cuando las
mutaciones mencionadas arriba se realizan en la proximidad
(secuencia) o tridimensional) de estos siete últimos
aminoácidos.
La invención además comprende la sustitución de
algunos aminoácidos en el dominio Gla N-terminal
(los aminoácidos en la posición correspondiente a
1-37 de la SEC ID NO:1) del Factor VIIa puede
proporcionar la proteína con una afinidad sustancialmente más alta
a los fosfolípidos de la membrana, tales como los fosfolípidos de
la membrana de células que soportan el factor tisular o de las
plaquetas, de ese modo generando variantes del polipéptido del
Factor VII con un efecto procoagulante mejorado.
De esta manera, las variantes del polipéptido
del Factor VIIa mencionadas arriba, además de la sustitución del
aminoácido ya realizada en la posición F374 en combinación con las
sustituciones en las posiciones L305, S314, K157, K337, D334, S336,
V158, E296, y M298 y las sustituciones de los aminoácidos
opcionales en otro lugar en el dominio de la proteasa, también
tienen al menos un aminoácido sustituido en el dominio Gla
N-terminal, de ese modo obteniendo una proteína con
una actividad aumentada al igual que una afinidad aumentada a los
fosfolípidos de la membrana en comparación con el factor VII
nativo. Preferiblemente los aminoácidos en las posiciones 10 y 32
(en referencia a la SEC ID NO:1) del factor VII pueden ser
sustituidos por un aminoácido diferente. Ejemplos de aminoácidos
preferidos para ser incorporados en las posiciones mencionadas
arriba son: el aminoácido Pro en la posición 10 se sustituye por
Gln, Arg, su, Gln, Asn o Lys; y/o el aminoácido Lys en la posición
32 se sustituye por Glu, Gln o Asn.
Otros aminoácidos en el dominio Gla, en base a
las diferentes afinidades de fosfolípidos y secuencias de las
proteínas plasmáticas dependientes de la vitamina K, pueden también
ser considerados para la sustitución.
El término "dominio GLA
N-terminal" significa la secuencia de
aminoácidos 1-37 del Factor VII.
La indicación de tres letras "GLA"
significa (7-carboxiglutamato) de ácido
4-carboxiglutámico.
El término "dominio de proteasa" significa
la secuencia de aminoácidos 153-406 del Factor VII
(la cadena pesada del Factor VIIa).
El término "polipéptido de Factor VII" como
se utiliza en este caso significa cualquier proteína que comprende
la secuencia de aminoácidos 1- 406 del Factor VII nativo humano
(SEC ID NO: 1) o variantes del mismo. Éste incluye pero no se
limita al Factor VII humano, el Factor VII humano y variantes del
mismo.
El término "Factor VII" como se utiliza en
este caso se destina a comprender la molécula monocatenaria
inactiva del Factor VII zimógeno al igual que la molécula
bicatenaria activada del Factor VII (Factor VIIa). Éste incluye las
proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos
1-406 del Factor VII nativo humano o Factor VIIa.
También incluye proteínas con una secuencia de aminoácidos
ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo
N-terminal modificado que incluye deleciones del
aminoácido N-terminal o adiciones al mismo tiempo
que estas proteínas retienen sustancialmente la actividad del
Factor VIIa. El término "Factor VIIa", o "FVIIa" como se
utiliza en este caso significa un producto que consiste en la forma
activada (Factor VIIa). "Factor VII" o "Factor VIIa"
dentro de la definición anterior también incluye variaciones
alélicas naturales que pueden existir y producirse de un individuo a
otro. También, el grado y la ubicación de la glicosilación u otras
modificaciones de post-traducción pueden variar
dependiendo de las células huéspedes elegidas y de la naturaleza
del entorno del huésped celular.
Los términos "variante" o "variantes",
como se utilizan en este caso, se destinan a designar el Factor VII
que tiene la secuencia de la SEC ID NO:1, donde uno o más
aminoácidos de la proteína progenitora ha(n) sido
sustituido(s) por otro aminoácido y/o donde uno o más
aminoácidos de la proteína progenitora ha sido delecionado y/o
donde uno o más aminoácidos ha sido insertado en la proteína y/o
donde uno o más aminoácidos ha sido añadido a la proteína
progenitora. Tal adición puede tener lugar bien en el extremo
N-terminal o en el extremo
C-terminal de la proteína progenitora o en ambos.
La "variante" o "variantes" dentro de esta definición
además tienen actividad FVII en su forma activada. En una forma de
realización, una variante es idéntica en un 70% a la secuencia de
la SEC ID NO:1. En una forma de realización una variante es
idéntica en un 80% a la secuencia de la SEC ID NO:1. En otra forma
de realización una variante es idéntica en un 90% a la secuencia de
la SEC ID NO:1. En otra forma de realización, una variante es
idéntica en un 95% a la secuencia de la SEC ID NO:1. En un primer
aspecto, la invención se refiere a un polipéptido del Factor VII
que comprende al menos dos sustituciones relativas a la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas sustituciones son
(i) sustitución de F374 por cualquier otro aminoácido, y (ii)
sustitución por cualquier otro aminoácido de uno o más aminoácidos
seleccionados del grupo que consiste en L305, S314, K157, K337,
D334, S336, V158, E296, y M298.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un polipéptido del Factor VII con dos sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L305, S314, K157,
K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a
un polipéptido del Factor VII con tres sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de dos
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305, S314,
K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido del Factor VII con cuatro sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de tres
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305, S314,
K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido de factor VII con cinco sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de
cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305,
S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido del Factor VII con seis sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de cinco
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305, S314,
K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido del Factor VII con siete sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de seis
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305, S314,
K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido del Factor VII con ocho sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de siete
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305, S314,
K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido del Factor VII con nueve sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de ocho
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305, S314,
K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido del Factor VII con diez sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de los
aminoácidos L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296, y
M298.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
constructo de polinucleótido que codifica un polipéptido del Factor
VII comprendiendo al menos dos sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido, y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de uno
o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305,
S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298.
El término "constructo" apunta a indicar un
segmento del polinucleótido que puede estar basado en una secuencia
de nucleótidos completa o parcial de origen natural que codifica el
polipéptido de interés. El constructo puede opcionalmente contener
otros segmentos del polinucleótido. En una vía similar, el término
"aminoácidos que pueden ser codificados por constructos del
polinucleótido" comprende los aminoácidos que pueden ser
codificados por los constructos del polinucleótido definidos
arriba, es decir los aminoácidos tales como Ala, Val, Leu, Ile,
Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg,
His, Asp y Gln.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector recombinante que comprende el constructo del polinucleótido
que codifica un polipéptido del Factor VII.
El término "vector", como se utiliza en
este caso, significa cualquier entidad de ácidos nucleicos capaz de
realizar la amplificación en una célula huésped. Así, el vector
puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector,
que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es
independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De
forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en
una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y
se replica con el(los) cromosoma(s) en el que ha sido
integrado. La elección del vector frecuentemente dependerá de la
célula huésped en la que deba ser introducido. Los vectores
incluyen, pero no se limitan a vectores plásmidos, vectores
fágicos, vectores de virus o cósmidos. Los vectores normalmente
contienen un origen de replicación y al menos un gen seleccionable,
es decir, un gen que codifica un producto que es fácilmente
detectable o cuya presencia es esencial para el crecimiento
celular.
En otro aspecto, la invención proporciona una
célula huésped recombinante que comprende el constructo del
polinucleótido o el vector. En una forma de realización, la célula
huésped recombinante es una célula eucariótica. En otra forma de
realización, la célula huésped recombinante es de origen mamífero.
En otra forma de realización la célula huésped recombinante está
seleccionada del grupo que consiste en células CHO, células HEK y
células BHK.
El término "una célula huésped", como se
utiliza en este caso, representa cualquier célula, incluyendo
células híbridas, en las que se puede expresar el ADN heterólogo.
Las células huéspedes típicas incluyen, pero no se limitan a
células de insecto, células de levadura, células mamíferas,
incluidas las células humanas, tales como las células BHK, CHC),
HEK, y COS. Al poner en práctica la presente invención, las células
huéspedes que son cultivadas son preferiblemente células mamíferas,
más preferiblemente una línea celular establecida de mamífero,
incluyendo, sin limitación, las líneas celulares CHO (p. ej., ATCC
CCL 61), COS-1 (p. ej., ATCC CRL 1650), de riñón de
cría de hámster (BHK) y HEK293 (p. ej., ATCC CRL 1573; Graham et
Al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Una línea
celular BHK preferida es la línea celular tk- ts13 BHK (Waechter y
Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110,
1982), de aquí en adelante denominadas células BHK 570. La línea
celular BHK 570 está disponible por la American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852; bajo el número
de acceso CRL 10314 de la ATCC. Una línea celular tk- ts13 BHK está
también disponible por la ATCC bajo el número de acceso CRL 1632.
Otras líneas celulares adecuadas incluyen, sin limitación, células
Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Hep II de rata
(hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmón
humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y DUKX (Urlaub y
Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220,
1980). También son útiles las células 3T3, las células de Namalwa,
mielomas y fusiones de mielomas con otras células.
En otro aspecto, la invención proporciona un
animal transgénico que contiene y expresa el constructo del
polinucleótido.
En otro aspecto, la invención proporciona una
planta transgénica que contiene y expresa el constructo del
polinucleótido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para la producción del polipéptido del Factor VII de la
invención, el método comprendiendo el cultivo de una célula que
comprende el constructo de polinucleótido en un medio de
crecimiento apropiado bajo las condiciones que permiten la expresión
del constructo de polinucleótido y la recuperación del polipéptido
resultante del medio de cultivo.
Como se utiliza en este caso el término "medio
de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene
nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de
células y la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica el polipéptido del Factor VII de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para la producción del polipéptido del Factor VII, el método
comprendiendo la recuperación del polipéptido de leche producido
por el animal transgénico.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para la producción del polipéptido del Factor VII, el método
comprendiendo el cultivo de una célula de una planta transgénica
que comprende el constructo de polinucleótido, y la recuperación
del polipéptido de la resultante planta.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un polipéptido del Factor
VII comprendiendo al menos dos sustituciones relativas a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido, y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de uno
o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L305,
S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298; y, opcionalmente,
un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de un polipéptido del Factor VII comprendiendo al menos dos
sustituciones relativas a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
NO:1, donde dichas sustituciones son (i) sustitución de F374 por
cualquier otro aminoácido, y (ii) sustitución por cualquier otro
aminoácido de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que
consiste en L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298;
para la preparación de un medicamento para el tratamiento de
trastornos hemorrágicos o episodios hemorrágicos o para la mejora
del sistema hemostático normal. En una forma de realización se
utiliza para el tratamiento de la hemofilia A o B.
En este contexto, el término "tratamiento"
se entiende que incluye tanto la prevención de una hemorragia
prevista, como en cirugía, como la regulación de una hemorragia ya
producida, como en un trauma, con el propósito de inhibir o
minimizar la hemorragia. La administración profiláctica del
polipéptido del Factor VIIa según la invención está por tanto
incluida en el término "tratamiento".
El término "episodios hemorrágicos" se
entiende que incluye una hemorragia descontrolada y excesiva. Los
episodios hemorrágicos pueden ser un problema más importante tanto
en relación con la cirugía como otras formas de daños en el tejido.
Una hemorragia descontrolada y excesiva puede ocurrir en sujetos
con un sistema de coagulación normal y sujetos con trastornos de
coagulación o hemorrágicos. Como se utiliza en este caso el término
"trastorno hemorrágico" refleja cualquier defecto, congénito,
adquirido o inducido, de origen celular o molecular que se
manifiesta en las hemorragias. Ejemplos son deficiencias del factor
de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de factores de
coagulación XI o VII), inhibidores del factor de coagulación,
función defectuosa de las plaquetas, trombocitopenia o enfermedad
de von Willebrand.
Las hemorragias excesivas también ocurren en
sujetos con una cascada de coagulación sanguínea con funcionamiento
normal (sin deficiencias del factor de coagulación o -inhibidores
contra cualquiera de los factores de coagulación) y pueden ser
provocados por una función defectuosa de las plaquetas,
trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. En estos casos, las
hemorragias se pueden comparar con las hemorragias provocadas por la
hemofilia porque el sistema hemostático, como ocurre en la
hemofilia, carece de o tiene "compuestos" esenciales de
coagulación anormales (tales como las plaquetas o proteína del
factor de von Willebrand) que causa hemorragias mayores. En sujetos
que experimentan un daño extenso en el tejido asociado con la
cirugía o un trauma grande, el mecanismo hemostático normal puede
ser saturado por la demanda de hemostasis inmediata y pueden
desarrollar una hemorragia a pesar de un mecanismo hemostático
normal. La realización de una hemostasis satisfactoria también es
un problema cuando ocurren hemorragias en órganos tales como el
cerebro, en la región interna de la oreja y en los ojos con
limitada posibilidad de hemostasis quirúrgica. El mismo problema
puede surgir en el proceso de tomar biopsias de varios órganos
(hígado, pulmón, tejido tumoral, tracto gastrointestinal) al igual
que en cirugía laparoscópica. Es común en estas situaciones la
dificultad de proporcionar hemostasis por técnicas quirúrgicas,
(sutura, clips, etc.) siendo también el caso cuando la hemorragia
está difusa (gastritis hemorrágica y hemorragia uterina profusa).
Las hemorragias agudas y profusas pueden también ocurrir en sujetos
en terapia anticoagulante en quienes una hemostasis defectuosa ha
sido inducida por la terapia dada. Estos sujetos pueden precisar
intervenciones quirúrgicas en el caso de que el efecto
anticoagulante tenga que ser contrarrestado rápidamente. La
prostatectomía retropúbica radical es un procedimiento realizado de
forma común en sujetos con cáncer de próstata localizado. La
operación se ve frecuentemente complicada por una pérdida de sangre
significante y a veces masiva. La pérdida de sangre considerable
durante la prostatectomía está principalmente relacionada con una
situación anatómica complicada, con varios sitios densamente
vascularizados que no son fácilmente accesibles para la hemostasis
quirúrgica, y que pueden resultar en una hemorragia difusa de un
área grande. Otra situación que puede causar problemas en el caso
de una hemostasis insatisfactoria es cuando a sujetos con un
mecanismo hemostático normal se les da una terapia anticoagulante
para prevenir una enfermedad tromboembólica. Esta terapia puede
incluir la heparina, otras formas de proteoglicanos, warfarina u
otras formas de antagonistas de la vitamina K al igual que la
aspirina y otros inhibidores de agregación plaquetaria.
En una forma de realización de la invención, la
hemorragia está asociada con la hemofilia. En otra forma de
realización, la hemorragia está asociada con la hemofilia con
inhibidores adquiridos. En otra forma de realización, la hemorragia
está asociada con la trombocitopenia. En otra forma de realización,
la hemorragia está asociada con la enfermedad de von Willebrand. En
otra forma de realización, la hemorragia está asociada con el daño
tisular severo. En otra forma de realización, la hemorragia está
asociada con un trauma severo. En otra forma de realización, la
hemorragia está asociada con la cirugía. En otra forma de
realización, la hemorragia está asociada con la cirugía
laparoscópica. En otra forma de realización, la hemorragia está
asociada con la gastritis hemorrágica. En otra forma de
realización, la hemorragia es una hemorragia uterina profusa. En
otra forma de realización, la hemorragia se produce en órganos con
una limitada posibilidad de hemostasis mecánica. En otra forma de
realización, la hemorragia se produce en el cerebro, en la región
interna de la oreja o en los ojos. En otra forma de realización, la
hemorragia está asociada con el proceso de la toma de biopsias. En
otra forma de realización, la hemorragia está asociada con la
terapia anticoagulante.
El término "sujeto" como se utiliza en este
caso apunta a significar cualquier animal, en particular mamíferos,
tales como los seres humanos, y, si fuera apropiado, puede ser
usado de forma intercambiable con el término "paciente".
El término "mejora del sistema hemostático
normal" significa una mejora de la capacidad para generar
trombina.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para el tratamiento de trastornos hemorrágicos o de
episodios hemorrágicos en un sujeto o para la mejora del sistema
hemostático normal, el método comprendiendo la administración de
una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un
polipéptido del Factor VII comprendiendo al menos dos sustituciones
relativas a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde
dichas sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido, y (ii) sustitución por cualquier otro aminoácido de un
aminoácido o más seleccionado(s) del grupo que consiste en
L305, S314, K157, K337, D334, S336, V158, E296, y M298; en un
sujeto que lo necesite.
En otro aspecto, la invención se refiere al
polipéptido del Factor VII de la invención para el uso como un
medicamento.
En una forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y L305 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y S314 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y K157 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y K337 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y D334 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y S336 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y V158 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y E296 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde F374 es
sustituido por cualquier otro aminoácido y M298 es sustituido por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido en las posiciones restantes en el dominio de la proteasa
ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido. En una forma de
realización, el polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde
un aminoácido en las posiciones restantes en el dominio de la
proteasa ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde como mucho 20
aminoácidos adicionales en las posiciones restantes en el dominio
de la proteasa han sido sustituidos por otros aminoácidos
cualquiera.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 159-170 de la SEC ID NO:1 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 290-304 de la SEC ID NO: ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde R304 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido. En una forma de
realización R304 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado
del grupo que consiste en Tyr, Phe, Leu, y Met.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 306-312 de la SEC ID NO:1 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde M306 ha sido
sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en
Asp, y Asn.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde D309 ha sido
sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en
Ser, y Thr.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 330-339 de la SEC ID NO:1 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde A274 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde A274 ha sido
sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en
Met, Leu, Lys, y Arg.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde K157 ha sido
sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en
Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr,
Asn, Glu, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde K157 ha sido
sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en
Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho K337 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr,
Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho K337 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho D334 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr,
Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, y Gln.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho D334 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Gly, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho S336 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho S336 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Gly, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho V158 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho V158 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho E296 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr,
Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho E296 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Arg, Lys, y Val.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho M298 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, lle, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho M298 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Lys, Arg, Gln, y Asn.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho L305 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho L305 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Val, Tyr y Ile.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho L305 ha
sido sustituido por Val.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho S314 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho S314 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Gly, Lys, Gln y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho F374 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho F374 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Pro y Tyr.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde el aminoácido
ha sido sustituido por un aminoácido diferente que puede ser
codificado por los constructos de polinucleótido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho
polipéptido del Factor VII es el Factor VII humano.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde dicho
polipéptido del Factor VII es el Factor VII humano.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido de Factor VII y la
actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la SEC
ID NO:1 es al menos aproximadamente 1,25. En una forma de
realización la proporción entre la actividad de dicho polipéptido
del Factor VII y la actividad del polipéptido del Factor VIIa
nativo mostrado en la SEC ID NO:1 es al menos aproximadamente 2,0.
En otra forma de realización la proporción entre la actividad de
dicho polipéptido del Factor VII y la actividad del polipéptido del
Factor VIIa nativo mostrado en la SEC ID NO:1 es al menos
aproximadamente 4,0.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la
actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la SEC
ID NO:1 es al menos aproximadamente 1,25 al evaluarse en un ensayo
de actividad del Factor VIIa. En una forma de realización, la
proporción entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y
la actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la
SEC ID NO:1 es al menos aproximadamente 2,0 al evaluarse en un
ensayo de actividad del Factor VIIa. En otra forma de realización,
la proporción entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII
y la actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en
la SEC ID NO:1 es al menos aproximadamente 4,0 evaluado en un
ensayo de actividad del factor VIIa. La actividad del factor VIIa
puede ser medida por los ensayos descritos en los ejemplos 3 o
4.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la
actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la SEC
ID NO:1 es al menos aproximadamente 1,25 evaluado en el "Ensayo de
hidrólisis in vitro". En una forma de realización la
proporción entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y
la actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la
SEC ID NO:1 es al menos aproximadamente 2,0 evaluado en el
"Ensayo de hidrólisis in vitro". En otra forma de
realización la proporción entre la actividad de dicho polipéptido
del Factor VII y la actividad del polipéptido del Factor VIIa
nativo mostrado en la SEC ID NO:1 es al menos aproximadamente 4,0
evaluado en el "Ensayo de hidrólisis in vitro".
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la
actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la SEC
ID NO:1 es al menos aproximadamente 1,25 evaluado en el "Ensayo de
proteólisis in vitro". En una forma de realización, la
proporción entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y
la actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la
SEC ID NO:1 es al menos aproximadamente 2,0 evaluado en el
"Ensayo de proteólisis in vitro". En otra forma de
realización, la proporción entre la actividad de dicho polipéptido
del factor VII y la actividad del polipéptido del Factor VIIa
nativo mostrado en la SEC ID NC:1 es al menos aproximadamente 4,0
evaluado en el "Ensayo de proteólisis in vitro". En otra
forma de realización, la proporción entre la actividad de dicho
polipéptido del Factor VII y la actividad del polipéptido del
Factor VIIa nativo mostrado en la SEC ID NO:1 es al menos
aproximadamente 8,0 evaluado en el "Ensayo de proteólisis in
vitro".
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con al menos dos
sustituciones relativas a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
NO:1, donde dichas sustituciones son (i) F374Y y (ii) uno o más
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en K157X^{1},
K337A, D334X^{2}, S336X^{3}, V158X^{4}, E296V, M298Q, L305V,
S314E, donde X^{1} es Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, o Glu;
X^{2} es Gly o Glu; X^{3} es Gly o Glu; X^{4} es Thr o
Asp.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/V158D-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158D-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/V158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337AN158D-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158D/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158D/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158D/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/S314E-FVII
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/E296V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/S314E/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/E296V/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/K337AN1580-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158D/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158D/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158D/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/E296VN158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/M298QN158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN
158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/S314EN158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII
en otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/S314EN158D-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337AN158T/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/M298QNI58D-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/K337A/E296VN158D-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN
158D/S314E/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158D/S314E/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158D/M298Q/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/S314E/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/S314E/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/M298Q/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/M298Q/K337A/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/E296V/K337A/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/E296V/M298Q/K337A/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/E296V/M298Q/
K337A-FVII.
K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/E296V/M298Q/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es P374YN158D/E296V/M298Q/
K337A-FVII.
K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN158D/E296V/M298Q/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/K337A/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN158D/M298Q/K337A/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN158D/E296V/K337A/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/E296V/
M298Q-FVII.
M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/M298Q/
K337A-FVII.
K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/E296V/
K337A-FVII.
K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/M298Q/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/E296V/
S314E-FVI I .
S314E-FVI I .
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN158T/E296V/M298Q/
K337A-FVII.
K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN158T/E296V/M298Q/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158T/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/M298Q/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374YN158T/E296V/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158T/E296V/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158T/M298Q/
K337A-FVII.
K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158T/E296V/K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158T/M298Q/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es
F374Y/L305VN158T/E296V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/E296V/M298Q/K337A/
V158T/S314E-FVII.
V158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374YN158D/E296V/
M298QIK337A/S314E-FVII.
M298QIK337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/E296V/
M298Q/S314E-FVII.
M298Q/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/E296V/M298Q/
V158T/S314E-FVII.
V158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/E296V/M298Q/
K337AN158T-FVII.
K337AN158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/E296V/K337A/
V158T/S314E-FVII.
V158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/M298Q/K337AA/
158T/S314E-FVII.
158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/E296V/
M298Q/K337A-FVII.
M298Q/K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/E296V/
K337A/S314E-FVII.
K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/M298Q/
K337A/S314E-FVII.
K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305V/E296V/M298Q/
K337AA/158T/S314E-FVII
K337AA/158T/S314E-FVII
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es F374Y/L305VN158D/E296V/
M298Q/K337A/S314E-FVII
M298Q/K337A/S314E-FVII
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) dos sustituciones de aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según la
tabla 1.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) tres sustituciones de aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según la
tabla 1.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) cuatro sustituciones de aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según la
tabla 1.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) sustituciones de cinco aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según la
tabla 1.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) seis sustituciones de aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según
tabla 1.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) siete sustituciones de aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según la
tabla 1.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) sustituciones de ocho aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según la
tabla 1.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del Factor VII es FVII humano con (i) la sustitución
del aminoácido F374Y relativo a la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO:1, y (ii) sustituciones de nueve aminoácidos
independientemente seleccionados de cualquier combinación según la
tabla 1.
En otro aspecto, la invención proporciona
polipéptidos del Factor VIIa de la coagulación humana que han
aumentado la actividad independiente del factor tisular en
comparación con el Factor VIIa nativo de la coagulación humana. En
otro aspecto, la actividad aumentada no está acompañada por cambios
en la especificidad del sustrato. En otro aspecto de la invención,
la unión de las variantes del polipéptido al factor tisular no
debería verse perjudicada y las variantes de los polipéptidos
deberían tener al menos la actividad del Factor VIIa tipo salvaje
al unirse al factor tisular.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La terminología para sustituciones de
aminoácidos utilizada en esta descripción es la siguiente. La
primera letra representa el aminoácido presente de forma natural en
una posición de la SEC ID NO:1. El número siguiente representa la
posición en la SEC ID NO: 1. La segunda letra representa la
substitución del aminoácido diferente por el aminoácido natural. Un
ejemplo es L305V/K337A-FVII, la leucina en la
posición 305 de la SEC ID NO:1 es sustituida por una valina y la
lisina en la posición 337 de la SEC ID NO:1 es sustituida por una
alanina, ambas mutaciones en la misma variante del polipéptido del
Factor VII.
En este contexto las indicaciones de tres letras
o de una sola letra de los aminoácidos han sido usadas en su
significado convencional como se indica en la tabla 2. A menos que
se indique explícitamente, los aminoácidos mencionados aquí son
L-aminoácidos. Además, las extremidades izquierda y
derecha de una secuencia de aminoácidos de un péptido son,
respectivamente, los términos N y C a menos que se indique lo
contrario.
La invención también se refiere a un método de
preparación de variantes del polipéptido del Factor VII humano como
se ha mencionado anteriormente. Las variantes del polipéptido del
Factor VII descritas aquí pueden ser producidas mediante técnicas
de ácidos nucleicos recombinantes. En general, una secuencia de
ácidos nucleicos clonada del Factor VII tipo salvaje es modificada
para codificar la proteína deseada. Esta secuencia modificada es
luego insertada en un vector de expresión, que es sucesivamente
transformado o modificado en células huéspedes. Se prefieren como
células huéspedes las células eucarióticas superiores, en particular
las células mamíferas cultivadas. Las secuencias completas de
nucleótidos y de aminoácidos para el Factor VII humano son
conocidas (ver U.S. 4.784.950, donde se describe la clonación y
expresión del factor VII recombinante humano). La secuencia del
Factor VII bovino se describe en Takeya et Al., J. Biol.
Chem. 263:14868-14872 (1988)).
Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos
pueden ser realizadas por una variedad de técnicas. La modificación
de la secuencia de ácidos nucleicos puede realizarse por
mutagénesis sitio específica. Las técnicas para la mutagénesis
sitio específica son bien conocidas en la técnica y están descritas
en, por ejemplo, Zoller y Smith (DNA 3:479-488,
1984) o "Splicing by extension overlap", Horton et Al.,
Gene 77, 1989; págs. 61-68. De este modo, usando el
nucleótido y las secuencias de aminoácidos del Factor VII, se
puede(n) introducir la(s) alteración(s) de
elección. Asimismo, los procedimientos para preparar un constructo
de ADN usando la reacción en cadena de la polimerasa usando
cebadores específicos son conocidos por los expertos en la técnica
(ver PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California,
EEUU).
El constructo de ácidos nucleicos que codifica
la variante del polipéptido del Factor VII de la invención puede de
manera adecuada ser de origen genómico o de ADNc, por ejemplo se
puede obtener preparando una biblioteca genómica o de ADNc y
seleccionando para la codificación de secuencias de ADN a todo o
parte del polipéptido por hibridación usando sondas de
oligonucleótidos sintéticas conforme a técnicas estándares (ver
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva
York; 1989).
El constructo de ácidos nucleicos que codifica
la variante del polipéptido del Factor VII puede también ser
preparado sintéticamente por métodos estándares establecidos, p.
ej. el método de la fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers,
Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, o el
método descrito por Mattes et Al., EMBO Journal 3 (1984),
801 - 805. Según el método de la fosfoamidita, los oligonucleótidos
son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN automático,
purificados, recocidos, ligados y donados en los vectores
adecuados. Las secuencias de ADN que codifican las variantes del
polipéptido del Factor VII humano pueden también ser preparadas por
reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos,
por ejemplo como se describe en US 4.683.202, Saiki et Al.,
Science 239 (1988), 487 - 491, o Sambrook et al.,
supra.
Además, el constructo de ácidos nucleicos puede
ser de origen sintético y genómico mezclado, sintético y de ADNc
mezclado o genómico y de ADNc mezclado preparado ligando fragmentos
de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), los
fragmentos correspondiendo a varias partes del constructo de ácidos
nucleicos entero, conforme a las técnicas estándares.
El constructo de ácidos nucleicos es
preferiblemente un constructo de ADN. Las secuencias de ADN para el
uso para producir variantes del polipéptido del Factor VII según la
presente invención normalmente codifican un polipéptido prepro en
el término amino del Factor VII para obtener un tratamiento
postraduccional apropiado (p. ej. la
gamma-carboxilación de los residuos del ácido
glutámico) y la secreción de la célula huésped. El polipéptido
prepro puede ser aquel del Factor VII u otra proteína plasmática
dependiente de la vitamina K, tal como el Factor IX, Factor X,
protrombina, proteína C o proteína S. Como será apreciado por los
expertos en la técnica, se pueden hacer modificaciones adicionales
en la secuencia de aminoácidos de las variantes del polipéptido del
Factor VII donde estas modificaciones no perjudican
significativamente a la capacidad de la proteína para actuar como
un coagulante. Por ejemplo, las variantes del polipéptido del Factor
VII pueden también ser modificadas en el sitio de seccionamiento de
la activación para inhibir la conversión del Factor VII del
zimógeno en su forma bicatenaria activada, como está generalmente
descrito en U.S. 5.288,629, incorporada aquí por referencia.
Las secuencias de ADN que codifican las
variantes del polipéptido del Factor VII humano son normalmente
insertadas en un vector recombinante que puede ser cualquier
vector, que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de
ADN recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá
de la célula huésped en la que debe ser introducirlo. Así, el vector
puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector,
que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es
independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De
forma alternativa, el vector puede ser uno que al introducirse en
una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y
se replica con el(los) cromosoma(s) en el(los)
que ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN que codifica las variantes del
polipéptido del Factor VII humano está operativamente enlazado a
segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En
general, el vector de expresión está derivado del plásmido o ADN
vírico, o puede contener elementos de ambos. El término,
"enlazado operativamente" indica que los segmentos están
dispuestos de modo que funcionan en concierto para los fines a los
que están destinados, p. ej. la transcripción se inicia en un
promotor y continua a través de la secuencia de ADN que codifica
para el polipéptido.
Los vectores de expresión que se utilizarán para
expresar las variantes del polipéptido del Factor VIIa comprenderán
un promotor capaz de dirigir la transcripción de un gen clonado o
de ADNc. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que
muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección y
puede derivar de genes que codifican proteínas bien homólogas o
bien heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción del ADN que codifica la variante del polipéptido del
Factor VII humano en células mamíferas son el promotor SV40
(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981);
854-864), el promotor MT-1 (gen de
metalotioneina) (Palmiter et Al., Science 222 (1983); 809 -
814), el promotor CMV (Boshart et Al., Cell
41:521-530, 1985) o el promotor tardío mayor del
adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol;
2:1304-1319, 1982).
Un ejemplo de un promotor adecuado para el uso
en células de insecto es el promotor de polihedrina (US 4.745.051;
Vasuvedan et Al., FEBS. Lett. 311; (1992) 7 - 11), el
promotor P10 (J.M. Vlak et Al., J. Gen. Virology 69, 1988;
págs. 765-776), el promotor de la proteína básica
del virus de la polihedrosis de Autographa californica (EP
397 485), el promotor del gen 1 inmediato temprano baculovirus (US
5.155.037; US 5.162.222), o el promotor del gen 39K retardado
temprano del baculovirus (US 5.155.037; US 5.162.222).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes de levadura incluyen promotores de genes
glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., J. Biol. Chem.
255 (1980); 12073 - 12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1
(1982); 419 - 434) o genes de alcohol-deshidrogenasa
(Young et al., en Genetic Engineering of Microorganisms
for Chemicals (Hollaender et al, eds) Plenum Press, New
York, 1982), o los promotores de TPI1 (US 4.599.311) o de
ADH2-4c (Russell et Al., Nature 304 (1983);
652 - 654).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes de hongos filamentosos son, por ejemplo, el
promotor ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985); 2093 -
2099) o el promotor de tpiA. Ejemplos de otros promotores útiles
son aquellos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de
A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, la \alpha-amilasa de A. niger, la
\alpha-amilasa estable en ácido de A.
niger, la glucoamilasa de A. niger o de A.
awamori (gluA), la lipasa de Rhizomucor miehei, la
proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa
de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans. Se
prefieren los promotores de la TAKA amilasa y de gluA. Promotores
adecuados están mencionados en, p. ej. EP 238 023 y EP 383 779.
Las secuencias de ADN que codifican las
variantes del polipéptido del factor VII humano pueden también, si
fuera necesario, estar operativamente conectadas a un terminador
adecuado, tal como el terminador de la hormona del crecimiento
humana (Palmiter et Al., Science 222, 1983; págs.
809-814) o los terminadores de TPI1 (Alber y
Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982; págs.
419-434) o de ADH3 (McKnight et Al., The EMBO
J. 4, 1985; págs. 2093-2099). Los vectores de
expresión pueden también contener un grupo de sitios de empalme de
ARN localizados en sentido descendente del promotor y en sentido
ascendente del sitio de inserción para la propia secuencia del
Factor VII. Los sitios de empalme de ARN preferidos pueden ser
obtenidos de adenovirus y/o de genes de inmunoglobulina. También en
los vectores de expresión se encuentra contenida una señal de
poliadenilación localizada debajo del sitio de inserción. Las
señales de poliadenilación particularmente preferidas incluyen la
señal temprana o tardía de poliadenilación de SV40 (Kaufman y
Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de la región Elb
del adenovirus 5, el terminador del gen de la hormona del
crecimiento humano (DeNoto et Al. Nucl. Acids Res.
9:3719-3730, 1981) o la señal de poliadenilación
del gen del Factor VII humano o del gen del Factor VII bovino. Los
vectores de expresión pueden también incluir una secuencia líder
vírica no codificante, tal como la secuencia líder tripartita del
adenovirus 2, localizada entre el promotor y los sitios de empalme
del ARN; y secuencias de potenciadores, tales como el potenciador
de SV40.
Para dirigir las variantes del polipéptido del
Factor VII humano de la presente invención en la vía secretora de
las células huéspedes, una secuencia señal secretora (también
conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia
pre) puede ser proporcionada en el vector recombinante. La
secuencia señal secretora se une a las secuencias de ADN que
codifican las variantes del polipéptido del Factor VII humano en el
marco de lectura correcto. Las secuencias señal secretoras se
sitúan de forma común en 5' en la secuencia de ADN que codifica el
péptido. La secuencia señal secretora puede ser aquella que,
normalmente está asociada con la proteína o puede provenir de un
gen que codifica a otra proteína segregada.
Para la secreción de células de levadura, la
secuencia señal secretora puede codificar cualquier péptido señal,
lo que asegura una dirección eficaz de las variantes del polipéptido
del Factor VII humano expresado en la vía secretora de la célula.
El péptido señal puede ser un péptido señal producido de forma
natural, o una parte funcional del mismo, o puede ser un péptido
sintético. Se ha encontrado que los péptidos señal adecuados son el
péptido señal del \alpha-factor (ver. US
4.870.008), el péptido señal de la amilasa salival de ratón (ver.
O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981; págs.
643-646), un péptido señal de carboxipeptidasa
modificada (ver. L.A. Valls et Al., Cell 48, 1987; págs.
887-897), el péptido señal BAR1 de levadura (ver. WO
87/02670), o el péptido señal de la proteasa aspártica 3 de
levadura (YAP3) (ver. M. Egel-Mitani et al.,
Yeast 6, 1990; págs. 127-137).
Para una secreción eficaz en levadura, una
secuencia que codifica un péptido líder puede también ser insertada
en sentido descendente de la secuencia señal y en sentido
ascendente de la secuencia de ADN que codifica las variantes del
polipéptido del Factor VII humano. La función del péptido líder es
permitir al péptido expresado que sea dirigido del retículo
endoplásmico al aparato de Golgi y después a una vesícula secretora
para la secreción en el medio de cultivo (es decir exportación de
las variantes del polipéptido del Factor VII humano a través de la
pared celular o al menos a través de la membrana celular en el
espacio periplásmico de la célula de levadura). El péptido líder
puede ser el líder del alfa-factor de levadura (cuyo
uso está descrito en p. ej. US 4.546.082, US 4.870.008, EP 16 201,
EP 123 294, EP 123 544 y EP 163 529). De forma alternativa, el
péptido líder puede ser un péptido líder sintético, es decir un
péptido líder no encontrado en la naturaleza. Los péptidos líder
sintéticos pueden, por ejemplo, ser construidos como se describe en
WO 89/02463 o WO 92/11378.
Para el uso en hongos filamentosos, el péptido
señal puede convenientemente derivar de un gen que codifica una
amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp., un gen que
codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una
lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido señal está
preferiblemente derivado de un gen que codifica la TAKA amilasa de
A. oryzae, la \alpha-amilasa de A.
niger, la amilasa estable en ácido de A. niger, o la
glucoamilasa de A. niger. Los péptidos señal adecuados están
descritos en, p. ej. EP 238 023 y EP 215 594.
Para el uso en células de insecto, el péptido
señal puede convenientemente derivar de un gen de insecto (ver. WO
90/05783), tal como el péptido señal precursor de la hormona
adipocinética de la Manduca sexta (ver. US 5.023.328).
Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifican para las variantes del polipéptido
del Factor VII humano, el promotor y opcionalmente el terminador
y/o la secuencia señal secretora, respectivamente, y para
insertarlos en los vectores adecuados conteniendo la información
necesaria para la replicación, son conocidos por los expertos en la
técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et Al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York,
1989).
Los métodos de transfección de células mamíferas
y de expresión de secuencias de ADN introducidas en las células
están descritos en p. ej. Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159
(1982), 601 - 621; Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982);
327 - 341; Loyter et Al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 79
(1982); 422 - 426; Wigler et Al., Cell 14 (1978); 725;
Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981); 603, Graham y
van der Eb, Virology 52 (1973), 456; y Neumann et al., EMBO
J. 1 (1982), 841 - 845.
Las secuencias de ADN clonadas son introducidas
en células mamíferas cultivadas, por ejemplo, por transfección
mediada por fosfato de calcio (Wigler et Al., Cell
14:725-732, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell
Genetics 7:603-616, 1981; Graham y Van der Eb,
Virology 52d:456-467, 1973) o por electroporación
(Neumann et Al., EMBO J. 1:841-845, 1982).
Para identificar y seleccionar las células que expresan el ADN
exógeno, se introduce generalmente un gen que confiere un fenotipo
seleccionable (un marcador seleccionable) en las células junto con
el gen o el ADNc de interés. Los marcadores seleccionables
preferidos incluyen genes que confieren resistencia a los fármacos
tales como la neomicina, la higromicina, y el metotrexato. El
marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable
amplificable. Un marcador seleccionable amplificable preferido es
una secuencia de dihidrofolato-reductasa (DHFR).
Los marcadores seleccionables están revisados por Thilly (Mammalian
Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, incorporado
aquí por referencia). Un experto en la materia podrá elegir
fácilmente los marcadores seleccionables adecuados.
Los marcadores seleccionables pueden ser
introducidos en la célula en un plásmido separado al mismo tiempo
que el gen de interés, o pueden ser introducidos en el mismo
plásmido. Si, en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el
gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes
promotores o del mismo promotor, ésta disposición produce un mensaje
bicistrónico. Los constructos de este tipo son conocidos en la
técnica (por ejemplo, Levinson y Simonsen, U.S. 4.713.339). Puede
también ser ventajoso añadir ADN adicional, conocido como "ADN
portador" a la mezcla que se introduce en las células.
Después de que las células han utilizado el ADN,
éstas crecen en un medio de crecimiento apropiado, normalmente 1 a
2 días, para iniciar la expresión del gen de interés. Como se
utiliza en este caso el término "medio de crecimiento
apropiado" significa un medio que contiene nutrientes y otros
componentes requeridos para el crecimiento de células y la expresión
de las variantes del polipéptido del Factor VII humano de interés.
Los medios generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente
de nitrógeno, aminoácidos esenciales, azúcares esenciales,
vitaminas, sales, fosfolípidos, proteína y factores de crecimiento.
Para la producción de proteínas gamma-carboxiladas,
el medio contendrá vitamina K, preferiblemente a una concentración
de aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 5 \mug/ml. La
selección de medicamentos es luego aplicada para seleccionar el
crecimiento de las células que están expresando el marcador
seleccionable en una forma estable. Para las células que han sido
modificadas con un marcador seleccionable amplificable la
concentración de medicamento puede ser aumentada para seleccionar
un número de copias aumentado de las secuencias clonadas,
aumentando así los niveles de expresión. Los clones de las células
modificadas estables son luego seleccionados para la expresión de
la variante del polipéptido del Factor VII humano de interés.
La célula huésped en la que se introducen las
secuencias de ADN que codifican las variantes del polipéptido del
Factor VII humano puede ser cualquier célula, que sea capaz de
producir las variantes del polipéptido del Factor VII humano
modificado postraduccional e incluye levadura, hongos y células
eucarióticas superiores.
Ejemplos de líneas celulares de mamífero para el
uso en la presente invención son las líneas celulares
COS-1 (ATCC CRL 1650), del riñón de cría de hámster
(BHK) y 293 (ATCC CRL 1573; Graham et Al., J. Gen. Virol.
36:59-72, 1977). Una línea celular de BHK preferida
es la línea celular tk-ts13 BHK (Waechter y
Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110,
1982, incorporada aquí por referencia), de ahora en adelante
denominadas células BHK 570. La línea celular BHK 570 ha sido
depositada con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Dr., Rockville, Md. 20852, bajo el número de acceso de ATCC CRL
10314. Una línea celular tk^{-} ts13 BHK está también disponible
por la ATCC bajo el número de acceso CRL 1632. Además, se pueden
usar otras líneas celulares dentro de la presente invención,
incluyendo Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Hep II
de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de
pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC
CCL 61) y células DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU 77:4216-4220, 1980).
Ejemplos de células de levadura adecuadas
incluyen células de Saccharomyces spp. o
Schizosacaromyces spp., en particular cepas de
Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri.
Métodos para transformar células de levadura con ADN heterólogo y
producir polipéptidos heterólogos de los mismos están descritos, p.
ej. en US 4.599.311, US 4.931.373, US 4.870.008, 5.037.743, y US
4.845.075, todos ellos incorporados en la presente por referencia.
Las células transformadas están seleccionadas por un fenotipo
determinado por un marcador seleccionable, de forma común
resistencia a los medicamentos o por la capacidad para crecer en la
ausencia de un nutriente particular, p. ej. la leucina. Un vector
preferido para el uso en la levadura es el vector POT1 descrito en
US 4.931.373. Las secuencias de ADN que codifican las variantes del
polipéptido del Factor VII humano pueden ser precedidas por una
secuencia señal y opcionalmente una secuencia líder, p. ej. según
el modo descrito anteriormente. Otros ejemplos de células de
levadura adecuadas son cepas de Kluyveromices, tales como
K. lactis, Hansenula, p. ej. H. polimorfa, o
Pichia, p. ej. P. pastoris (ver. Gleeson et
Al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986; págs.
3459-3465; US 4.882.279).
Ejemplos de otras células micóticas son células
de hongos filamentosos, p. ej. Aspergillus spp., Neurospora
spp., Fusarium spp. o Trichoderma spp., en particular
cepas de A. oryzae, A. nidulans o A. Niger. El uso de
Aspergillus spp. para la expresión de proteínas se describe
p. ej., en EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438, la transformación de
F. oxysporum puede, por ejemplo, efectuarse como se describe
por Malardier et al.; 1989; Gene 78: 147-156.
La transformación de Trichoderma spp. puede ser realizada
por ejemplo como se describe en EP 244 234.
Cuando se usa un hongo filamentoso como la
célula huésped, puede ser transformado con el constructo de ADN de
la invención, convenientemente mediante la integración del
constructo de ADN en el cromosoma huésped para obtener una célula
huésped recombinante. Esta integración está generalmente
considerada como una ventaja ya que la secuencia de ADN es más
probable que se mantenga estable en la célula. La integración de
los, constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada
según métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o
heteróloga.
La transformación de células de insecto y la
producción de polipéptidos heterólogos en las mismas puede ser
realizada como se describe en US 4.745.051; US 4.879.236; US
5.155.037, 5.162.222; EP 397.485) todos incorporados aquí por
referencia. La línea celular de insecto usada como huésped puede de
manera adecuada ser una línea celular de Leptidoptera, tales
como las células de Spodoptera frugiperda o de
Trichoplusia ni (ver. US 5.077.214). Las condiciones de
cultivo pueden de manera adecuada ser como se describe en, por
ejemplo, WO 89/01029 o WO 89/01028, o cualquiera de las referencias
mencionadas.
La célula huésped transformada o modificada
anteriormente descrita es luego cultivada en un medio nutritivo
adecuado bajo condiciones que permiten la expresión de la variante
del polipéptido del Factor VII humano tras lo cual todo o parte del
péptido resultante puede ser recuperado del cultivo. El medio de
cultivo usado para las células puede ser cualquier meclio
convencional adecuado para hacer crecer las células huéspedes,
tales como medios mínimos o complejos que contienen los suplementos
apropiados. Los medios adecuados están disponibles por proveedores
comerciales o pueden ser preparados conforme a recetas publicadas
(p. ej. en los catálogos de la American Type Culture Collection).
La variante del polipéptido del Factor VII humano producida por las
células puede luego ser recuperada del medio de cultivo por
procedimientos convencionales incluyendo la separación de las
células huéspedes del medio por centrifugado o filtración,
precipitación de los componentes proteináceos del sobrenadante o
filtrado mediante una sal, p. ej. sulfato de amonio, purificación
por una variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej.
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en
gel, cromatografía de afinidad, o similar, dependiendo del tipo de
polipéptido en cuestión.
La tecnología de animales transgénicos puede ser
empleada para producir las variantes del polipéptido del Factor VII
de la invención. Se prefiere producir las proteínas dentro de las
glándulas mamarias de un mamífero hembra huésped. La expresión en
la glándula mamaria y la posterior secreción de la proteína de
interés en la leche supera muchas dificultades encontradas en el
aislamiento de proteínas de otras fuentes. La leche es fácilmente
recogida, está disponible en grandes cantidades, y bioquímicamente
está bien caracterizada. Además, la mayoría de las proteínas de la
leche están presentes en la leche en concentraciones altas
(normalmente de aproximadamente de 1 a 15 g/l).
Desde un punto de vista comercial, es claramente
preferible usar como huésped una especie que tenga un gran
rendimiento en la leche. Aunque se pueden usar animales más
pequeños tales como ratones y ratas (y son preferidos en la
comprobación de la fase principal), se prefiere usar mamíferos de
ganado incluyendo, pero no limitados a cerdos, cabras, ovejas y
vacas. Las ovejas son particularmente preferidas debido a factores
tales como la historia anterior sobre la transgénesis en estas
especies, el rendimiento de la leche, el coste y la rápida
disponibilidad de equipamiento para recolectar la leche de oveja
(ver, por ejemplo, WO 88/00239 para una comparación de los factores
que influyen en la elección de especies huéspedes). Es generalmente
deseable seleccionar una raza de animal huésped que haya sido
criada para el uso en la industria lechera, tal como la oveja East
Friesland, o introducir ganado lechero mediante la cría de la línea
transgénica en una fecha posterior. De cualquier manera, se
deberían usar los animales con buen estado de salud conocido.
Para obtener la expresión en la glándula
mamaria, se usa un promotor de la transcripción de un gen de
proteínas de la leche. Los genes de proteínas de la leche incluyen
aquellos genes que codifican caseínas (ver U.S. 5.304.489),
beta-lactoglobulina, a-lactalbumina,
y proteína acídica de lactosuero. Se prefiere el promotor de
beta-lactoglobulina (BLG). En el caso del gen de la
beta-lactoglobulina ovina, una región proximal de al
menos los 406 bp de la secuencia flanqueadora 5' del gen será
generalmente usada, aunque se prefieren partes mayores de la
secuencia flanqueadora 5', hasta aproximadamente 5 kbp, tales como
un segmento de ADN de -4,25 kbp que comprende la parte promotora
flanqueadora 5' y no codificante del gen de la
beta-lactoglobulina (ver Whitelaw et Al.,
Biochem. J. 286: 31-39 (1992)). Fragmentos
similares del promotor de ADN de otras especies son también
adecuados.
Otras regiones del gen de la
beta-lactoglobulina pueden también ser incorporadas
en los constructos, así como también las regiones genómicas del gen
que debe ser expresado. Está generalmente aceptado en la técnica que
los constructos carentes de intrones, por ejemplo, se expresan mal
en comparación con aquellos que contienen secuencias de ADN de este
tipo (Ver Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw et
al., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO
89/01343; y WO 91/02318, cada uno de ellos incorporado aquí por
referencia). En este sentido, es generalmente preferido, cuando es
posible, usar secuencias genómicas que contienen todos o algunos
intrones nativos de un gen que codifica la proteína o polipéptido de
interés, por lo tanto se prefiere la inclusión adicional de al
menos algunos intrones de, p. ej, el gen de la
beta-lactoglobulina. Tal región es un segmento de
ADN que proporciona la división de intrones y la poliadenilación
del ARN de la región 3' no codificante del gen de la
beta-lactoglobulina ovina. Cuando se sustituye por
las secuencias no codificantes 3' naturales de un gen, este segmento
de beta-lactoglobulina ovina puede realzar y
estabilizar los niveles de expresión de la proteína o del
polipéptido de interés. Dentro de otras formas de realización, la
región que rodea el ATG de iniciación de la secuencia de la variante
del Factor VII es sustituida con secuencias correspondientes de un
gen específico de la proteína de la leche. Tal sustitución
proporciona un entorno de iniciación
tejido-específico putativo para potenciar la
expresión. Es conveniente reemplazar las secuencias enteras no
codificantes prepro y 5' de la variante del Factor VII con aquellas
de, por ejemplo, el gen BLG, aunque se pueden reemplazar regiones
más pequeñas.
Para la expresión de variantes del polipéptido
del Factor VII en animales transgénicos, un segmento de ADN que
codifica la variante del Factor VII está operativamente enlazado a
segmentos de ADN adicionales requeridos para su expresión para
producir unidades de expresión. Tales segmentos adicionales
incluyen el promotor mencionado arriba, al igual que las secuencias
que proporcionan la terminación de la transcripción y la
poliadenilación del ARNm. Las unidades de expresión adicionales
incluyen un segmento de ADN que codifica una secuencia señal
secretora operativamente enlazada al segmento que codifica el
Factor VII modificado. La secuencia señal secretora puede ser una
secuencia señal secretora del Factor VII nativo o puede ser la de
otra proteína, tal como una proteína de la leche (ver, por ejemplo,
von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986);
y Meade et Al., U.S. 4.873.316, que se incorporan aquí por
referencia).
La construcción de unidades de expresión para el
uso en animales transgénicos es convenientemente realizada mediante
la inserción de una secuencia de la variante del Factor VII en un
plásmido o vector fágico conteniendo los segmentos de ADN
adicionales, aunque la unidad de expresión puede ser construida
esencialmente por cualquier secuencia de ligaciones. Es
particularmente conveniente proporcionar un vector conteniendo un
segmento de ADN que codifica unas proteínas de la leche y reemplazar
la secuencia de codificación en la proteína de la leche con la de
una variante del Factor VII; de ese modo creando una fusión génica
que incluye las secuencias de control de la expresión del gen de la
proteína de la leche. De cualquier manera, la clonación de las
unidades de expresión en plásmidos u otros vectores facilita la
amplificación de la secuencia de la variante del Factor VII. La
amplificación es convenientemente realizada en células huéspedes
bacterianas (p. ej. E. coli), así los vectores normalmente
incluyen un origen de replicación y un marcador seleccionable
funcional en las células huéspedes bacterianas. La unidad de
expresión es luego introducida en ovarios fertilizados (incluyendo
los embriones de la fase temprana) de las especies huéspedes
elegidas. La introducción de ADN heterólogo puede ser realizada por
una de varias vías, incluyendo la microinyección (p. ej. patente
estadounidense nº. 4.873.191), infección retrovírica (Jaenisch,
Science 240: 1468-1474 (1988)) o la integración
sitio dirigida usando las células de vástago embrionario (VE)
(revisadas por Bradley et Al., Bio/Technology 10:
534-539 (1992)). Los ovarios son luego implantados
en los oviductos o úteros de hembras seudopreñadas y se dejan
evolucionar hasta el final. La descendencia que lleva el ADN
introducido en su línea germinal puede pasar el ADN en su progenie
en la forma mendeliana normal, permitiendo el desarrollo de greyes
transgénicos. Los procedimientos generales para producir animales
transgénicos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Hogan
et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al.,
Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wall et
al., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler
et Al., Bio/Technology 8: 140-143 (1990);
Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838
(1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:
844-847 (1991); Wall et al., J. Cell.
Biochem. 49: 113-120 (1992); U.S. 4.873.191; U.S.
4.873.316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; y GB 87/00458).
Las técnicas para introducir secuencias de ADN externas en mamíferos
y sus células germinales fueron originalmente desarrolladas en
ratones (ver, p. ej., Gordon et Al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU 77: 7380-7384 (1980); Gordon y Ruddle, Science
214:1244-1246 (1981); Palmiter y Brinster, Cell 41:
343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985); y Hogan et
al. (ibid)). Estas técnicas fueron posteriormente
adaptadas para el uso con animales más grandes, incluyendo especies
de ganado (ver, p. ej., WO 88/00239, WO 90/05188, y WO 92/11757; y
Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183
(1988)). En resumen, en la vía más eficaz usada hasta el momento en
la generación de ratones o ganado transgénicos, varios cientos de
moléculas lineales del ADN de interés son inyectados en uno de los
pronúcleos de un ovario fertilizado según las técnicas
establecidas. También se puede emplear la inyección de ADN en el
citoplasma de un cigoto.
La producción en plantas transgénicas puede
también ser empleada. La expresión puede ser generalizada o
dirigida a un órgano particular, tal como un tubérculo (ver, Hiatt,
Nature 344:469-479 (1990); Edelbaum et Al.,
J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons et
al., Bio/Technology 8:217-.221 (1990); y EP 0 255 378).
Las variantes del polipéptido del Factor VII de
la invención son recuperadas del medio de cultivo celular o de la
leche. Las variantes del polipéptido del Factor VII de la presente
invención pueden ser purificadas por una variedad de procedimientos
conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitadas a, la
cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, de afinidad,
hidrofóbica, de cromatoenfoque, y de exclusión por tamaños),
procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque
preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación
de sulfato amónico), o extracción (ver, p. ej., Protein
Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH
Publishers, New York, 1989). Preferiblemente, éstas pueden ser
purificadas por cromatografía de afinidad en una columna de
anticuerpos anti-factor VII. El uso de anticuerpos
calcio-dependientes monoclonales, como se describe
por Wakabayashi et Al., J. Biol. Chem. 261:
11097-11108; (1986) y Thim et al.,
Biochemistry 27: 7785-7793, (1988), es
particularmente preferido. La purificación adicional puede ser
conseguida por medios de purificación química convencionales, tales
como la cromatografía en fase líquida de alto rendimiento. Otros
métodos de purificación, incluyendo la precipitación de citrato de
bario, son conocidos en la técnica, y pueden ser aplicados a la
purificación de las nuevas variantes del polipéptido del Factor VII
descritas aquí (ver, por ejemplo, Scopes, R., Protein Purification,
Springer-Verlag, N.Y., 1982).
Para fines terapéuticos se prefiere que las
variantes del polipéptido del Factor VII de la invención sean
substancialmente puras. Así, en una forma de realización preferida
de la invención las variantes del polipéptido del Factor VII de la
invención se purifiquen hasta al menos aproximadamente un 90 a un
95% de homogeneidad, preferiblemente al menos aproximadamente hasta
un 98% de homogeneidad. La pureza puede ser evaluada p. ej. por
electroforesis en gel y por secuenciación del aminoácido
aminoterminal.
La variante del Factor VII se secciona en su
sitio de activación para convertirse en su forma bicatenaria. La
activación puede ser realizada conforme a procedimientos conocidos
en la técnica, tales corno los descritos por Osterud, et
al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas,
Patente estadounidense No. 4.456,591; Hedner y Kisiel, J. Clin.
Invest. 71:1836-1841 (1983); o Kisiel y Fujikawa,
Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983). De forma
alternativa, como se describe por Bjoern et al. (Research
Disclosure,; 269 Septiembre 1986; págs. 564-565),
el Factor VII puede ser activado pasándolo a través de una columna
de cromatografía de intercambio iónico, tal como mono Q® (Pharmacia
fine Chemicals) o similar. La variante resultante del Factor VII
activado puede luego ser formulada y administrada como se describe
abajo.
La invención también proporciona ensayos
adecuados para seleccionar las variantes del Factor VIIa según la
invención. Estos ensayos pueden ser realizados como una prueba
simple preliminar in vitro.
Así, el Ejemplo 3 aquí expone una prueba simple
(titulada "Ensayo de Hidrólisis in Vitro") para la
actividad de las variantes del Factor VIIa de la invención. Basado
en esto, las variantes del Factor VIIa que son de interés
particular son las variantes en las que la proporción entre la
actividad de la variante y la actividad del factor VII nativo
mostrada en la Fig. 1 es superior a 1,0, p. ej. al menos
aproximadamente 1,25, preferiblemente al menos aproximadamente 2,0,
tal como al menos aproximadamente 3,0 o, incluso más preferido, al
menos aproximadamente 4,0 cuando se evalúa en el "Ensayo de
hidrólisis in vitro".
La actividad de las variantes puede también ser
medida usando un sustrato fisiológico tal como el Factor X
("Ensayo de proteólisis in vitro") (ver Ejemplo 4), de
manera adecuada a una concentración de 100-1000 nM,
donde el Factor Xa generado es medido después de la adición de un
sustrato adecuado cromogénico (p. ej. S-2765).
Además, el ensayo de actividad puede ser realizado a la temperatura
fisiológica.
La capacidad de las variantes del factor VIIa
para generar trombina puede también ser medida en un ensayo
comprendiendo todos los factores e inhibidores de la coagulación
pertinentes en concentraciones fisiológicas (menos el Factor VIII
cuando imita las condiciones de la hemofilia A) y plaquetas
activadas (como se describe en pág. 543 en Monroe et al.
(1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547 que se
incorpora en la presente como referencia).
Las variantes del polipéptido del Factor VII
según la presente invención pueden ser usadas para controlar los
trastornos hemorrágicos que tienen diferentes causas tales como
deficiencias del factor de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o
deficiencia de factores XI o VII de la coagulación) o inhibidores
del factor de coagulación, o pueden ser usadas para controlar la
hemorragia que ocurre en sujetos con una cascada de coagulación
sanguínea de funcionamiento normal (sin deficiencias del factor de
coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de
coagulación). Las hemorragias pueden ser provocadas por una función
defectuosa de las plaquetas, la trombocitopenia o la enfermedad de
von Willebrand. Éstas pueden también observarse en sujetos en los
que se ha inducido mediante varios estímulos una actividad
fibrinolítica aumentada.
En sujetos que experimentan grandes daños
tisulares asociados con la cirugía o un trauma grande, el mecanismo
hemostático puede verse saturado por la demanda de hemostasis
inmediata y pueden desarrollar hemorragias a pesar de un mecanismo
hemostático normal. La consecución de una hemostasis satisfactoria
es también un problema cuando las hemorragias ocurren en órganos
tales como el cerebro, la región de la oreja interna y los ojos y
puede también ser un problema en casos de hemorragias difusas
(gastritis hemorrágica y hemorragia uterina profusa) cuando la
fuente es difícil de identificar. El mismo problema puede surgir en
el proceso de la toma de biopsias de varios órganos (hígado,
pulmón, tejido tumoral, tracto gastrointestinal) al igual que en
cirugía laparoscópica. Estas situaciones comparten la dificultad de
proporcionar hemostasis por técnicas quirúrgicas, (sutura, clips,
etc.). Las hemorragias agudas y profusas pueden también ocurrir en
sujetos en terapia anticoagulante en los que una hemostasis
defectuosa ha sido inducida por la terapia dada. Estos sujetos
pueden necesitar intervenciones quirúrgicas en el caso de que el
efecto anticoagulante tenga que ser contrarrestado rápidamente.
Otra situación que puede causar problemas en el caso de una
hemostasis insatisfactoria es cuando se da a sujetos con un
mecanismo hemostático normal una terapia anticoagulante para evitar
una enfermedad tromboembólica. Tal terapia puede incluir heparina,
otras formas de proteoglicanos, Warfarina u otras formas de
antagonistas de la vitamina K al igual que la aspirina y otros
inhibidores de la agregación plaquetaria.
Una activación sistémica de la cascada de
coagulación puede llevar a una coagulación intravascular diseminada
(CID). No obstante, tales complicaciones no han sido vistas en
sujetos tratados con dosis altas de Factor VIIa recombinante por un
proceso hemostático localizado del tipo inducido por la formación
compleja entre el Factor VIIa y el FT expuesto en el sitio de la
lesión en la pared del vaso. Las variantes del polipéptido del
Factor VII según la invención pueden ser usadas de esta manera
también en su forma activada para controlar las hemorragias
excesivas asociadas con un mecanismo hemostático normal.
Para el tratamiento relacionado con las
intervenciones deliberadas, las variantes del polipéptido del
Factor VII de la invención normalmente serán administradas dentro
del período de aproximadamente 24 horas antes de realizar la
intervención, y durante 7 días o más. La administración como un
coagulante puede hacerse por una variedad de vías como se describe
en la presente.
La dosis de las variantes del polipéptido del
Factor VII varía de aproximadamente 0,05 mg a 500 mg/día,
preferiblemente de aproximadamente 1 mg a 200 mg/día, y más
preferiblemente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 175
mg/día para un sujeto de 70 kg como dosis de carga y de
mantenimiento, dependiendo del peso del sujeto y de la gravedad de
la enfermedad.
Las composiciones farmacéuticas están
principalmente destinadas a la administración parenteral para un
tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, las
composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, es
decir, por vía intravenosa, subcutáneamente, o intramuscularmente,
o puede ser administrada por infusión continua o pulsátil. Las
composiciones para la administración parenteral comprenden la
variante del Factor VII de la invención en combinación con,
preferiblemente disuelta en, un portador farmacéuticamente
aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Se puede usar una
variedad de portadores acuosos, tales como agua, agua tamponado;
solución salina (0,4%); glicina (0,3%) y similares. Las variantes
del polipéptido del Factor VII de la invención pueden también ser
formuladas en preparaciones de liposomas para la entrega o
focalización de los sitios dañados. Las preparaciones de liposomas
están generalmente descritas, p. ej., en U.S. 4.837.028, U.S.
4.501.728, y U.S. 4.975.282. Las composiciones pueden ser
esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales, bien
conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas
para el uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas,
la preparación liofilizada se combina con una solución estéril
acuosa antes de la administración. Las composiciones pueden
contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente según
se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales
como los agentes reguladores del pH y los agentes tampón, los
agentes reguladores de la tonicidad y similares, por ejemplo,
acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio,
cloruro de
calcio, etc.
calcio, etc.
La concentración de variante del Factor VII en
estas formulaciones puede variar mucho, es decir, de menos de
aproximadamente el 0,5% en peso, normalmente a o al menos
aproximadamente el 1% en peso hasta incluso el 15 o 20% en peso y
será seleccionada principalmente por volúmenes de fluido,
viscosidades, etc., conforme al modo de administración seleccionado
particular.
Así, una composición farmacéutica típica para
infusión intravenosa puede ser realizada para que contenga 250 ml
de solución de Ringer estéril y 10 mg de variante del Factor VII.
Los métodos actuales para preparar composiciones administrables
parenteralmente son conocidos o evidentes para los expertos en la
técnica y están descritos con más detalle en, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing
Company, Easton, PA (1990).
Las composiciones que contienen las variantes
del polipéptido del Factor VII de la presente invención pueden ser
administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En
usos terapéuticos, las composiciones son administradas a un sujeto
que ya padece una enfermedad, según el modo descrito anteriormente,
en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener
parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad
adecuada para realizarlo está definida como "cantidad
terapéuticamente efectiva". Como será entendido por un experto
en la materia, las cantidades eficaces para este propósito
dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión así como del
peso y estado general del sujeto. En general, no obstante, la
cantidad eficaz variará de aproximadamente 0,05 mg hasta
aproximadamente 500 mg de variante del Factor VII al día para un
sujeto de 70 kg, con dosificaciones de aproximadamente 1,0 mg hasta
aproximadamente 200 mg de variante del Factor VII por día siendo la
forma de uso más común.
Los polipéptidos de FVIIa de la presente
invención pueden generalmente ser empleados para una enfermedad
seria o estados de lesión, es decir, situaciones que amenazan o
amenazan potencialmente la vida. En estos casos, vista la
minimización de sustancias extrañas y la carencia general de
inmunogenicidad de las variantes del polipéptido del Factor VII
humano en seres humanos, puede ser considerado deseable por el
médico tratante el hecho de administrar un exceso sustancial de
estas composiciones de la variante del Factor VII.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones
que contienen la variante del Factor VII de la invención son
administradas a un sujeto susceptible de o por el contrario en
riesgo de un estado de enfermedad o lesión para aumentar la propia
capacidad coagulante del sujeto. Tal cantidad está definida como
una "dosis profilácticamente efectiva". En aplicaciones
profilácticas, las cantidades precisas otra vez dependen del estado
de salud y del peso del sujeto, pero la dosis generalmente varía de
aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 500 mg al día para un
sujeto de 70-kilogramos, de forma más común de
aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 200 mg al día para un
sujeto de 70-kilogramos.
Las administraciones individuales o múltiples de
las composiciones puede llevarse a cabo con los niveles de dosis y
modelos seleccionados por el médico tratante. Para sujetos
ambulatorios que requieren niveles de mantenimiento diarios, las
variantes del polipéptido del Factor VII pueden ser administradas
por infusión continua usando p. ej. un sistema de bombeo
portátil.
La entrega local de la variante del Factor VII
de la presente invención, como, por ejemplo, la aplicación tópica
puede ser realizada, por ejemplo, mediante una pulverización,
perfusión, catéteres de balón doble, stent, incorporada en injertos
vasculares o stents, hidrogeles usados para revestir catéteres de
balón, u otros métodos bien establecidos. De cualquier manera, las
composiciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad de
variante del Factor VII suficiente para tratar eficazmente al
sujeto.
La presente invención está ilustrada con mayor
detalle por los ejemplos siguientes los cuales, no obstante, no
deben ser interpretados como limitando el objetivo de protección.
Las características descritas en la descripción precedente y en los
ejemplos siguientes pueden, ambos por separado y en cualquier
combinación de los mismos, ser fundamentales para realizar la
invención de diversas maneras de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
completa del Factor VII de coagulación humana nativo (tipo salvaje)
(SEC ID NO:1).
\vskip1.000000\baselineskip
La terminología para las sustituciones de
aminoácidos usada en los ejemplos siguientes es la siguiente. La
primera letra representa el aminoácido naturalmente presente en una
posición de la SEC ID NO:1. El número siguiente representa la
posición en la SEC ID NO:1. La segunda letra representa la
substitución del aminoácido diferente por el aminoácido natural. Un
ejemplo es L305V/F374Y-FVII, la leucina en la
posición 305 de la SEC ID NO:1 es sustituida por una valina y la
fenilalanina en la posición 374 de la SEC ID NO:1 es sustituida por
una tirosina, ambas mutaciones en la misma variante del Factor
VII.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El ADN que codifica
L305V/S314E/F374Y-FVII,
L305V/K:337A/F374Y-FVII,
L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII, y
V158D/E296V/M298Q/L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII.
Los constructos de ADN que codifican
L305V/S314E/F374Y-FVII,
L305V/K337A/F374Y-FVII, L305V/S314E/
K337A/F374Y-FVII, y V158D/E296V/M298Q/L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII fueron preparados por mutagénesis sitio dirigida usando un vector de ADN bicatenario superenrollado con un injerto de interés y dos cebadores sintéticos que contenían la mutación deseada. Los cebadores siguientes fueron usados (en reacciones de PCR posteriores si fueran necesarias para obtener la variante de FVII deseada):
K337A/F374Y-FVII, y V158D/E296V/M298Q/L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII fueron preparados por mutagénesis sitio dirigida usando un vector de ADN bicatenario superenrollado con un injerto de interés y dos cebadores sintéticos que contenían la mutación deseada. Los cebadores siguientes fueron usados (en reacciones de PCR posteriores si fueran necesarias para obtener la variante de FVII deseada):
\vskip1.000000\baselineskip
Para L305V-FVII:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Para K337A-FVII:
Para V158D-FVII:
Para E296V/M298Q-FVII:
Para S314E-FVII:
Para F374Y-FVII:
Los cebadores oligonucleótidos, cada uno
complementario a cadenas opuestas del vector, fueron extendidos
durante la variación de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa.
Al incorporar los cebadores, se generó un plásmido mutado
conteniendo cortes en bisel. Después de la variación de la
temperatura, el producto fue tratado con Dpnl que es específico para
el ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN
parental y para seleccionar el ADN sintetizado conteniendo la
mutación.
Los procedimientos para preparar un constructo
de ADN para todas las variantes del FVII según la presente
invención usando la reacción en cadena de la polimerasa usando los
cebadores específicos para conseguir la variante de FVII deseada son
conocidos por los expertos en la técnica (ver. PCR Protocols, 1990,
Academic Press, San Diego, California, USA).
Ejemplo
2
Las células BHK fueron modificadas esencialmente
tal y como se ha descrito anteriormente (Thim et al. (1988)
Biochemistry 27, 7785-7793; Persson y Nielsen
(1996) FEBS Lett. 385, 241-243) para obtener la
expresión de la variante del FVII específica. La variante del
Factor VII fue purificada como sigue:
El medio acondicionado fue cargado sobre una
columna de Q-Sefarosa de flujo rápido de
25-ml (Pharmacia Biotech) después de la adición de 5
mM de EDTA; Triton X-100 (0,1%) y 10 mM de Tris,
ajuste de pH a 8.0 y ajuste de la conductividad a
10-11 mS/cm añadiendo agua.
La elución de la proteína fue realizada
avanzando desde 10 mM tris; 50 mM NaCl; Tritón
X-100 (0,1%); pH 8.0 a 10 mM tris; 50 mM NaCl; 25 mM
CaCl_{2}, Tritón X-100 (0,1%), pH 8.0. Las
fracciones conteniendo la variante de FVII específica fueron
agrupadas y aplicadas a una columna de 25-ml
conteniendo el anticuerpo monoclonal F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd,
Dinamarca) acoplada a Sefarosa 4B activada por CNBr (Pharmacia
Biotech).
La columna fue equilibrada con 50 mM de HEPES,
pH 7.5; conteniendo 10 mM de CaCl_{2}, 100 mM de NaCl y Tritón
X-100 (0,02%). Después del lavado con un tampón de
equilibrado y un tampón de equilibrado conteniendo 2 M de NaCl, la
materia unida fue eluida con un tampón de equilibrado conteniendo 10
mM de EDTA en vez de CaCl_{2}. Antes del uso o almacenamiento, se
añadió un exceso de CaCl_{2} sobre EDTA o la variante de FVII
específica fue transferida a un tampón conteniendo Ca^{2+}. El
rendimiento de cada fase fue seguido por las mediciones de ELISA
del Factor VII y la proteína purificada fue analizada por
SDS-PAGE. Otras variantes de las variantes de FVII
según el Ejemplo 1 y todas las demás variantes según la presente
invención pueden ser preparadas por el mismo método.
Ejemplo
3
Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y la variante
del Factor VIIa (ambos de aquí en adelante denominados como
"Factor VIIa") son evaluados en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en
una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El
sustrato cromogénico
D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida
(S-2288; Chromogenix, Suecia), concentración final
1 mM, es añadido al factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50
mM de HEPES pH 7.4; conteniendo 0,1 M de NaCl; 5 mM de CaCl_{2} y
1 mg/mi de albúmina de suero bovino. La absorbancia a 405 nm es
medida continuamente en un lector de placas SpectraMax^{TM} 340
(Molecular Devices, EEUU). La absorbancia desarrollada durante una
incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la
absorbancia en un pocillo blanco que no contiene ninguna enzima, se
utiliza para calcular la proporción entre las actividades de la
variante del Factor VIIa y el Factor VIIa de tipo salvaje:
Proporción =
(A_{405 \ nm} \ variante \ del \ Factor \ VIIa)/(A_{450 \ nm} \
Factor \ VIIa \ tipo \
salvaje)
Ejemplo
4
Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y variante del
factor VIIa (ambos de aquí en adelante denominados "Factor
VIIa") son evaluados en paralelo para comparar directamente sus
actividades específicas. El ensayo se realiza en una placa de
microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). Factor VIIa (10 nm) y
factor X (0,8 microM) en 100 microL de HEPES 50 mM, a pH 7.4;
conteniendo 0,1 M de NaCl; 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina
de suero bovino, son incubados durante 15 min. El seccionamiento
del Factor X es luego detenido por la adición de 50 microL de HEPES
50 mM, pH 7.4; conteniendo 0,1 M de NaCl; 20 mM de EDTA y 1 mg/mi
de albúmina de suero bovino. La cantidad de Factor Xa generada es
medida por la adición del sustrato cromogénico
Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida
(S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final
0,5 mM. La absorbancia a 405 nm es medida continuamente en un
lector de placas SpectraMax^{TM} 340 (Molecular Devices, EEUU).
La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, después de la
sustracción de la absorbancia en un pocillo blanco sin FVIIa, se
utiliza para calcular la proporción entre las actividades
proteolíticas de la variante del Factor VIIa y del Factor VIIa de
tipo salvaje:
Proporción =
(A_{450 \ nm} \ variante \ del \ Factor \ VIIa)/(A_{450 \ nm} \
Factor \ VIIa \ tipo \
salvaje)
Ejemplo
5
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<213> Factor VII de la coagulación
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa significa ácido
4-carboxiglutámico
\hskip1cm(gamma-carboxiglutamato)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgccccgg gtgatgaccc aggac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcctgggtc atcacccggg gcacg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggatggcag cgcggactcc tgcaaggg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccttgcagg agtccgcgct gccatccg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggggggca aggactgccc caaagggg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccctttggg gcagtccttg ccccccac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccacggccc tggtgctcca ggtcctcaac gtgccc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcacgttg aggacctgga gcaccagggc cgtggc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctgcagca ggaacggaag gtgggagact cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaaccgtg ggccactatg gggtgtacac c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 31
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgtacacc ccatagtggc ccacggttgc g
\hfill31
Claims (53)
1. Polipéptido del Factor VII comprendiendo al
menos dos sustituciones relativas a la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i) sustitución de
F374 por cualquier otro aminoácido, y (ii) donde K337 es sustituido
por cualquier otro aminoácido.
2. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 1, donde K157 es sustituido por cualquier otro
aminoácido.
3. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, donde D334 es
sustituido por cualquier otro aminoácido.
4. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-3, donde S336 es
sustituido por cualquier otro aminoácido.
5. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, donde V158 es
sustituido por cualquier otro aminoácido.
6. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-5, donde E296 es
sustituido por cualquier otro aminoácido.
7. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-6, donde M298 es
sustituido por cualquier otro aminoácido.
8. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-7, donde L305 es
sustituido por cualquier otro aminoácido.
9. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-8, donde S314 es
sustituido por cualquier otro aminoácido.
10. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-9, donde al menos un
aminoácido en las posiciones restantes en el dominio de la proteasa
ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
11. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 10, donde como mucho 20 aminoácidos adicionales en
las posiciones restantes en el dominio de la proteasa han sido
sustituidos por cualquier otro aminoácido.
12. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 10-11, donde al menos un
aminoácido correspondiendo a un aminoácido en una posición
seleccionada de 159-170 de la SEC ID NO:1 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
13. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 10-12, donde al menos un
aminoácido correspondiendo a un aminoácido en una posición
seleccionada de 290-304 de SEC ID NO:1 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
14. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 13, donde R304 ha sido sustituido por un aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Phe, Leu, y Met.
15. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 10-14, donde al menos un
aminoácido correspondiendo a un aminoácido a una posición
seleccionada de 306-312 de la SEC ID NO:1 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
16. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 15, donde M306 ha sido sustituido por un aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Asp, y Asn.
17. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 15, donde D309 ha sido sustituido por un aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Ser, y Thr.
18. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 10-17, donde al menos un
aminoácido correspondiendo a un aminoácido en una posición
seleccionada de 330-339 de la SEC ID NO:1 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
19. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 10-18, donde A274 ha sido
sustituido por cualquier otro aminoácido.
20. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 19, donde dicho A274 ha sido sustituido por un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met Leu, Lys, y
Arg.
\newpage
21. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 2; donde dicho K157 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Val,
Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
22. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 1, donde dicho K337 ha sido sustituido por un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Gly, Val,
Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
23. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 3; donde dicho D334 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, y
Glu.
24. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 4; donde dicho S336 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, y
Glu.
25. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 5; donde dicho V158 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Thr,
Asn, Gln, Asp, y Glu.
26. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 6; donde dicho E296 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys,
Ile, Leu y Val.
27. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 7; donde dicho M298 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg,
Gln, y Asn.
28. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 8; donde dicho L305 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr y
Ile.
29. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1, 9; donde dicho S314 ha sido sustituido
por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly, Lys,
Gln y Glu.
30. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-9, donde dicho F374 ha
sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en Pro, y Tyr.
31. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 30, donde dicho F374 ha sido sustituido por Tyr.
32. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-13, 15,
18-19; donde el aminoácido ha sido sustituido por
cualquier otro aminoácido que puede ser codificado por constructos
de polinucleótido.
33. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-32, donde dicho
polipéptido del Factor VII es el Factor VII humano.
34. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-32, donde dicho
polipéptido del Factor VII es el Factor VII humano.
35. Polipéptido del Factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-34, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la
actividad del polipéptido del Factor VIIa nativo mostrado en la SEC
ID NO:1 es al menos aproximadamente 1,25.
36. Polipéptido del Factor VII según la
reivindicación 35, donde dicha proporción es al menos
aproximadamente 2,0, preferiblemente al menos aproximadamente
4,0.
37. Polipéptido del Factor VII que es
F374Y/L305V/S314E/K:337A-FVII.
38. Polipéptido del Factor VII que es
F374Y/L305V/K337A-FVII.
39. Constructo de polinucleótido que codifica
el polipéptido del Factor VII según cualquiera de las
reivindicaciones 1-38.
40. Constructo de polinucleótido según la
reivindicación 39, que es un vector.
41. Célula huésped que comprende el constructo
de polinucleótido según cualquiera las reivindicaciones
39-40.
42. Célula huésped según la reivindicación 41,
que es una célula eucariótica.
43. Célula huésped según la reivindicación 42,
que es de origen mamífero.
44. Célula huésped según la reivindicación 43,
donde la célula está seleccionada del grupo que consiste en células
CHO, células HEK y células BHK.
45. Animal transgénico no humano que contiene y
expresa el constructo de polinucleótido tal y como se define en la
reivindicación 39.
46. Planta transgénica que contiene y expresa
el constructo de polinucleótido tal y como se define en la
reivindicación 39.
47. Método para la producción del polipéptido
del Factor VII definido en cualquiera de las reivindicaciones
1-38, el método comprendiendo el cultivo de una
célula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones
41-44 en un medio de crecimiento apropiado bajo las
condiciones que permiten la expresión del constructo de
polinucleótido y la recuperación del polipéptido resultante del
medio de cultivo.
48. Método para la producción del polipéptido
del Factor VII definido en cualquiera de las reivindicaciones
1-38, el método comprendiendo la recuperación del
polipéptido del Factor VII de la leche producido por el animal
transgénico definido en la reivindicación 45.
49. Método para la producción del polipéptido
del Factor VII definido en cualquiera de las reivindicaciones
1-38, el método comprendiendo el cultivo de una
célula de una planta transgénica tal y como se define en la
reivindicación 46, y la recuperación del polipéptido del Factor VII
de la planta.
50. Composición farmacéutica que comprende un
polipéptido del Factor VII comprendiendo al menos dos sustituciones
relativas a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde
dichas sustituciones son (i) sustitución de F374 por cualquier otro
aminoácido, y (ii) donde K337 es sustituido por cualquier otro
aminoácido; y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente
aceptable.
51. Composición farmacéutica que comprende un
polipéptido del Factor VII tal y como se define en cualquiera de
las reivindicaciones 1-38, y, opcionalmente, un
portador farmacéuticamente aceptable.
52. Uso de un polipéptido del Factor VII
comprendiendo al menos dos sustituciones relativas ala secuencia de
aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i)
sustitución de F374 por cualquier otro aminoácido, y (ii) donde
K337 es sustituido por cualquier otro aminoácido; para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos
hemorrágicos o episodios hemorrágicos o para la mejora del sistema
hemostático normal.
53. Uso de polipéptido del Factor VII tal y
como se define en cualquiera de las reivindicaciones
1-38 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de trastornos hemorrágicos o episodios hemorrágicos o
para la mejora del sistema hemostático normal.
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