ES2353646T3 - Variantes del factor de coagulación vii humano. - Google Patents
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Abstract
Una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde el residuo Leu en la posición 305 ha sido sustituido con Val o Ile, en donde un máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones en el dominio de la proteasa han sido sustituidos y en donde la proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido nativo del factor VII es de al menos aproximadamente 1.25 cuando es probado en un ensayo de hidrólisis in vitro, en el que el Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del factor VIIa son evaluados en paralelo, en una placa de microtitulación, usando 1 mM de D-Ile-pro-Arg-P-nitroanilina, Factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, a un pH de 7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl2 y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y en el que la absorbencia a 405 nm es usada para calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del Factor VII y factor VIIa de tipo salvaje.
Description
Variantes del factor de coagulación VII
humano.
La presente invención se refiere a nuevas
variantes del factor de coagulación VIIa humano que tienen
actividad coagulante al igual que constructos de ácido nucleico que
codifican tales variantes, vectores y células huéspedes que
comprenden y expresan el ácido nucleico, composiciones
farmacéuticas, usos y métodos de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
La coagulación sanguínea es un proceso que
consiste en una compleja interacción de varios componentes
sanguíneos (o factores) que eventualmente da lugar a un coágulo de
fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos, que participan
en lo que se hace referencia como la "cascada" de la
coagulación, son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o
zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción
de un activador (que en sí es un factor de coagulación activado). A
los factores de coagulación que han sido objeto de tal conversión
se hace referencia generalmente como "factores activos", y son
designados por la adición de la letra "a" al nombre del factor
de coagulación (p. ej. factor VIIa).
La iniciación del proceso hemostático es mediada
por la formación de un complejo entre el factor tisular, expuesto
como resultado de una lesión a la pared del vaso, y el factor VIIa.
Este complejo convierte entonces a los factores IX y X a sus formas
activas. El factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina
a trombina en la célula que porta el factor tisular. La trombina
activa las plaquetas y factores V y VIII en Factores Va y VIIIa,
ambos cofactores en el proceso adicional que conduce al completo
estallido de la trombina. Este proceso incluye la generación de
Factor Xa por el factor IXa (en complejo con el factor VIIIa) y
ocurre en la superficie de las plaquetas activadas. La trombina
convierte finalmente el fibrinógeno en fibrina resultando en la
formación de un coágulo de fibrina. En los últimos años se ha
descubierto que el factor VII y factor tisular son los principales
iniciadores de la coagulación
sanguínea.
sanguínea.
El factor VII es una glicoproteína de trazas de
plasma que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El
zimógeno es catalíticamente inactivo. El factor VII monocatenario
puede ser convertido en factor VIIa bicatenario por el Factor Xa,
factor XIIa, factor IXa, factor VIIa o trombina in vitro. El
factor Xa se cree que es el activador fisiológico más importante
del factor VII. Como varias otras proteínas plasmáticas implicadas
en la hemostasis, el factor VII depende de la vitamina K para su
actividad, que se requiere para la
gamma-carboxilación de los múltiples residuos de
ácido glutámico que están agrupados cerca del amino terminal de la
proteína. Estos ácidos glutámicos
gamma-carboxilados se requieren para la interacción
metálica inducida por ión del factor VII con los fosfolípidos. La
conversión del factor VII zimógeno en la molécula bicatenaria
activada ocurre por la escisión de un enlace peptídico
Arg_{152}-Ile_{153} interno. En presencia del
factor tisular, fosfolípidos e iones de calcio, el factor VIIa
bicatenario activa rápidamente el factor X o factor IX por la
proteólisis limitada.
A menudo es deseable estimular o mejorar la
cascada de coagulación en un sujeto. El factor VIIa ha sido usado
para controlar los trastornos sanguíneos que tienen varias causas
tal como las deficiencias del factor de la coagulación (p. ej.
hemofilia A y B o deficiencia de los factores de coagulación XI o
VII) o inhibidores del factor de la coagulación. El factor VIIa
también ha sido usado para controlar el sangrado excesivo que
ocurre en sujetos con una cascada de coagulación sanguínea que
funciona normalmente (ninguna deficiencia del factor de coagulación
o inhibidores contra cualquiera de los factores de la coagulación).
Tal sangrado puede, por ejemplo, ser causado por una función
defectuosa de las plaquetas, trombocitopenia o la enfermedad de Von
Willebrand. El sangrado también es un problema importante en
relación con la cirugía y otras formas de daño tisular.
La Patente europea nº. 200,421 (ZymoGenetics) se
refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el factor VII
humano y la expresión recombinante del factor VII en células
mamíferas.
Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU (1996) 93, 14379-14384) se refiere a una
variante del Factor VII en donde Leu305 ha sido sustituido por Ala
(FVII(Ala305)).
Iwanaga et al. (Thromb. Haemost.
(suplemento de Agosto de 1999), 466, resumen 1474) se refiere a las
variantes del factor VIIa en donde los residuos
316-320 son eliminados o los residuos
311-322 son sustituidos con los correspondientes
residuos de tripsina.
No obstante, sigue habiendo la necesidad de
variantes del factor VIIa que tienen actividad coagulante,
variantes con actividad alta que pueden ser administradas en dosis
relativamente bajas, y variantes que no producen los efectos
secundarios indeseables tal como la activación sistémica del sistema
de coagulación y sangrado, respectivamente, asociado a las terapias
convencionales.
La invención proporciona variantes del factor de
coagulación VII(a) con actividad coagulante. En un primer
aspecto, la invención proporciona una variante del factor
VII(a) de coagulación humano en donde: el residuo Leu en la
posición 305 de la SEC ID nº 1 ha sido sustituida por Val o Ile, un
máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones
del dominio de la proteasa han sido sustituidos, y la proporción
entre la actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido
nativo del factor VII(a) es al menos aproximadamente 1.25
cuando es evaluado en el ensayo de hidrólisis in vitro
definido aquí. Dicha variante del factor VII(a) humano puede
ser codificada por constructos de ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, el residuo Leu en
la posición 305 de la SEC ID nº 1 y como mucho 20 residuos del
aminoácido en las restantes posiciones en el dominio de la proteasa
(posiciones 153-406) han sido sustituidas. En una
forma de realización, como mucho 15 residuos de aminoácidos
adicionales son sustituidos; en otra forma de realización, como
mucho 10 residuos de aminoácidos son sustituidos; en otra forma de
realización, como mucho 5 residuos de aminoácidos son
sustituidos.
En otra forma de realización de la invención el
residuo Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos un
residuo en la posición 274 y/o 300-304 y/o la
posición 306-312 han sido sustituidos.
En otra forma de realización, el residuo Leu en
la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos el residuo en la
posición 274 han sido sustituidos.
En otra forma de realización, el residuo Leu en
la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos un residuo en la
posición 300-304 han sido sustituidos.
En otra forma de realización, el residuo Leu en
la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos un residuo en la
posición 306-312 han sido sustituidos.
En otra forma de realización, el residuo Ala en
la posición 274 ha sido sustituido por Met o Leu o Lys o Arg; y/o
el residuo Arg en la posición 304 ha sido sustituido por Tyr o Phe o
Leu o Met; y/o el residuo Met en la posición 306 ha sido sustituido
por Asp o Asn; y/o el residuo Asp en la posición 309 ha sido
sustituido por Ser o Thr.
En otra forma de realización, el residuo Leu en
la posición 305 es el único residuo de aminoácido que ha sido
sustituido.
En una forma de realización específica, el
residuo Leu en la posición 305 ha sido sustituido por Val.
En otra forma de realización, el residuo Leu en
la posición 305 ha sido sustituido por un residuo de aminoácido
seleccionado del grupo que consiste en Val, y Ile.
En una forma de realización de la invención los
residuos 300-322, 305-322,
300-312, o 305-312 de la SEC ID nº
1 son sustituidos por las correspondientes secuencias de tripsina
(SEC ID Nos 3,7,11,15, respectivamente), trombina (SEC ID Nos
4,8,12,16, respectivamente), Factor Xa (SEC ID nº 5,9,13,17,
respectivamente) u otra serina proteasa constitutivamente activa.
En otra forma de realización más, uno o más de los residuos
313-322 de la SEC ID nº 1 es/son
borrado(s).
La presente invención también proporciona una
variante del Factor de coagulación VII humano, en donde la
proporción entre la actividad de la variante y la actividad del
polipéptido nativo del factor VII que se muestra en la SEC ID nº 1
es al menos aproximadamente 1.25 cuando se evalúa en el "Ensayo de
Hidrólisis In Vitro" definido aquí. En una forma de
realización, la proporción es de al menos aproximadamente 2.0; en
otra forma de realización más, al menos de aproximadamente 4.0.
En otro aspecto, la invención proporciona
variantes del factor de coagulación VIIa humano que han incrementado
la actividad independiente del factor tisular en comparación con el
factor de coagulación VIIa humano nativo. En otro aspecto, la
actividad incrementada no está acompañada de cambios en la
especificidad del sustrato. En otro aspecto de la invención, la
unión de las variantes al factor tisular no debería ser perjudicada
y las variantes deberían tener al menos la actividad del factor
VIIa de tipo salvaje cuando se unen al factor tisular.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un constructo de ácido nucleico, preferiblemente un constructo de
ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una
variante del Factor VII según la inven-
ción.
ción.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector recombinante que comprende el constructo de ácido
nucleico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una célula huésped recombinante, preferiblemente de origen
mamífero, que comprende el constructo de ácido nucleico o el vector
recombinante.
En una forma de realización, las células
huéspedes recombinantes son células CHO o BHK.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un animal transgénico no humano o una planta transgénica que
contiene y expresa el constructo de ácido nucleico.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que comprende una variante
del factor de coagulación VII(a) humano, en donde: el residuo
Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 ha sido sustituido por Val
o Ile, un máximo de 20 residuos de aminoácidos en las posiciones
restantes del dominio de la proteasa han sido sustituidos, y la
proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del
polipéptido nativo del factor VII(a) es al menos
aproximadamente 1.25 cuando se evalúa en el ensayo de hidrólisis
in vitro, en el que el factor VIIa nativo (tipo salvaje) y
dicha variante del factor VIIa son evaluados en paralelo, en una
placa de microtitulación, usando 1 mM de
D-Ile-Pro-Arg-nitroanilina,
factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, un pH
de 7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de Cacl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de
suero bovino y en el que la absorbencia a 405 nm es usada para
calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del
factor VII y del factor VIIa de tipo salvaje; opcionalmente, en
combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Otros
aspectos de la presente invención se refieren a: la variante del
factor de coagulación VII(a) humano para el uso como
medicamento; el uso del factor de coagulación VII(a) humano
para la preparación de una composición para el tratamiento o
profilaxis de los episodios de sangrado o para el realce del
sistema hemostático normal; a un método para el tratamiento o
profilaxis de los episodios de sangrado en un sujeto o para el
realce del sistema de sangrado normal; y a métodos para producir
una variante del factor VII(a) según la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
completa del factor de coagulación VII humano nativo (SEC ID nº
1).
La figura 2 muestra la región
300-322 del factor de coagulación VII humano y la
correspondiente región de serina proteasas homólogas:
- Región 300-322 del factor VII (SEC ID nº 2)
- Correspondiente región de tripsina (SEC ID nº 3)
- Correspondiente región de trombina (SEC ID nº 4)
- Correspondiente región de FXa (SEC ID nº 5)
- Región 305-322 del factor VII (SEC ID nº 6)
- Correspondiente región de tripsina (SEC ID nº 7)
- Correspondiente región de trombina (SEC ID nº 8)
- Correspondiente región de FXa (SEC ID nº 9)
- Región 300-312 del factor VII (SEC ID nº 10)
- Correspondiente región de tripsina (SEC ID nº 11)
- Correspondiente región de trombina (SEC ID nº 12)
- Correspondiente región de FXa (SEC ID nº 13)
- Región 305-312 del factor VII (SEC ID nº 14)
- Correspondiente región de tripsina (SEC ID nº 15)
- Correspondiente región de trombina (SEC ID nº 16)
- Correspondiente región de FXa (SEC ID nº 17).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha descubierto que los variantes del factor
VIIa en donde al menos el residuo de aminoácido Leu305 (y
opcionalmente uno o más residuos adicionales) es/son
sustituido(s) por otro residuo de aminoácido tienen
actividad coagulante.
\newpage
Los residuos Leu305 y Phe374 se ubican a cada
extremo de una \alpha-hélice que empieza en el
residuo 307. Esta \alpha-hélice se encuentra en
la forma compleja del factor tisular del factor VIIa. En el factor
VIIa libre (factor VIIa no unido al factor tisular) la hélice es
distorsionada y por lo tanto posiblemente inestable. La hélice se
cree que es importante para la actividad. Las variantes según la
presente invención consiguen la conformación activa, que
normalmente tiene que ser inducida por el factor tisular.
La actividad puede ser debida a una
estabilización de la \alpha-hélice que empieza en
el residuo 307, una reorientación de la hélice o algún otro cambio
en la conformación. La sustitución del residuo Leu305, ubicado en
un extremo de la hélice, inducirá una reorientación y/o
estabilización de la hélice.
Debido a la superior actividad inherente de la
variante descrita del factor VIIa en comparación con el factor VIIa
nativo, una dosis inferior será adecuada para obtener una
concentración funcionalmente adecuada en el sitio de la acción y
por lo tanto será posible administrar una dosis inferior al sujeto
que tiene episodios de sangrado o que precise un realce del sistema
hemostático normal.
Como se discute brevemente en lo anterior, se ha
descubierto por los presentes inventores que por la sustitución del
residuo Leu en la posición 305 con Val o Ile, el factor VIIa
conseguirá espontáneamente una conformación más activa, la cual
normalmente tiene que ser inducida por el factor tisular.
Por lo tanto, está contemplado por los presentes
inventores que tales variantes del factor VIIa muestran una
actividad inherente que puede ser terapéuticamente útil en
situaciones donde la actividad procoagulante es independiente del
factor tisular (Generación del factor Xa en la superficie de la
plaqueta) tal como cuando son administradas dosis altas de, por
ejemplo, NavoSeven®.
Como se dice, la sustitución de otros residuos
de aminoácidos en la secuencia puede, en adición al efecto obtenido
por la sustitución del residuo Leu305, facilitar además la formación
de la conformación activa de la molécula. En principio estas
posiciones restantes pueden estar en cualquier lugar (excepto, por
supuesto, en la posición 305) en el dominio de la proteasa. Se
cree, no obstante, que los efectos más pronunciados se verán cuando
las mencionadas mutaciones son llevadas a cabo en la proximidad
(secuencial o tridimensional) del residuo 305.
Está bien establecido que la sustitución de
varios residuos de aminoácidos en el dominio Gla
N-terminal (residuos 1-37) del
factor VII puede proporcionar a la proteína una afinidad
sustancialmente superior a los fosfolípidos de membrana, tales como
los fosfolípidos de membrana de las células portadoras del factor
tisular o plaquetarias, generando así derivados del factor VII que
tienen un efecto procoagulante mejorado.
Por lo tanto, las variantes del factor VII
mencionadas arriba pueden, en adición a la sustitución de
aminoácido ya realizada en la posición 305 y las opcionales
sustituciones de aminoácidos en las posiciones 274,
300-304 y 306-310 o en otro lugar en
el dominio de la proteasa, también tienen algunos residuos de
aminoácidos sustituidos en el dominio Gla
N-terminal, obteniendo así una proteína que tiene
una incrementada actividad al igual que una incrementada afinidad a
los fosfolípidos de membrana en comparación con el factor VII
nativo.
Preferiblemente los residuos de aminoácidos en
las posiciones 10 y 32 (en referencia al SEC ID nº 1) del factor
VII pueden ser sustituidos con otro residuo de aminoácido que puede
ser codificado por los constructos de ácido
nucleico.
nucleico.
Ejemplos de los residuos de aminoácido
preferidos para ser incorporados en las posiciones mencionadas
arriba son: el residuo de aminoácido Pro en la posición 10 es
sustituido por Gln, Arg, His, Gln, Asn o Lys; y/o el residuo de
aminoácido Lys en la posición 32 es sustituido por Glu, Gln o
Asn.
Otros residuos en el dominio Gla, basados en las
diferentes afinidades fosfolípidas y secuencias de las proteínas
plasmáticas dependientes de la vitamina K, también pueden ser
considerados para la sustitución.
En el presente contexto las indicaciones de tres
letras o de una letra de los aminoácidos han sido usadas en su
significado convencional como se indica en la tabla 1. Salvo que se
indique explícitamente, los aminoácidos mencionados aquí son
L-aminoácidos. Además, los extremos izquierdos y
derechos de una secuencia de aminoácidos de un péptido son,
respectivamente, el N- y C-terminal salvo que se
especifique lo contrario.
La expresión "dominio de GLA
N-terminal" significa la secuencia de aminoácidos
1-37 del factor VII.
El término "dominio de proteasa" significa
la secuencia de aminoácidos 153-406 del factor VII
(la cadena pesada del factor VIIA).
La indicación de tres letras "GLA"
significa ácido 4-carboxi-glutámico
(y-carboxi-glutamato).
La indicación "FVII(Ala305)"
significa el factor VII como se muestra en la SEC ID nº 1 en donde
el residuo Leu en la posición 305 ha sido sustituido por Ala.
El término "Factor VII" o "FVII" como
se usa aquí pretende comprender la molécula zimógena monocatenaria
inactiva del factor VII al igual que la molécula bicatenaria
activada del factor VII, y puede, en caso de ser apropiado, ser
usada de forma intercambiable con los términos, "polipéptido",
"proteína", "proteasa" y "enzima".
Como se utiliza en este caso el término
"constructo de ácido nucleico" pretende significar cualquier
molécula de ácido nucleico de ADNc, ADN genómico, ADN sintético o de
origen ARN. El término "constructo" pretende indicar un
segmento de ácido nucleico que puede ser mono o bicatenario, y que
puede basarse en una secuencia de nucleótidos de origen natural
completa o parcial que codifica el polipéptido de interés. El
constructo puede contener opcionalmente otros segmentos de ácido
nucleico. De manera similar, el término "residuo de aminoácido
que puede ser codificado por los constructos de ácidos nucleicos"
cubre los residuos de aminoácidos que pueden ser codificados por
los constructos de ácidos nucleicos definidos anteriormente, es
decir aminoácidos tales como Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp,
Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y
Gln.
En el presente contexto, el término
"tratamiento" se pretende que incluya tanto la prevención de un
sangrado previsto, tal como en la cirugía, como la regulación de un
sangrado que ya se está produciendo, tal como en un traumatismo,
con el propósito de inhibir o minimizar el sangrado. La
administración profiláctica de la variante del factor VIIa según la
invención está incluida así en el término "tratamiento".
El término "actividad" significa la
capacidad de generar trombina, los términos "actividad
inherente" también incluyen la capacidad de generar trombina en
la superficie de las plaquetas activadas en la ausencia del
factor
tisular.
tisular.
El término "realce del sistema hemostático
normal" significa un realce de la capacidad de generar
trombina.
Como se utiliza aquí, el término "trastorno de
sangrado" refleja cualquier defecto, congénito, adquirido o
inducido, de origen molecular o celular que se manifiesta en los
sangrados. Ejemplos son las deficiencias del factor de la
coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de los factores de
coagulación XI o VII), inhibidores del factor de la coagulación,
función plaquetaria defectuosa, trombocitopenia o la enfermedad de
Von Willebrand.
El término "episodios de sangrado" se
pretende que incluya el sangrado descontrolado y excesivo que es un
problema importante tanto en relación con la cirugía como con otras
formas de daño tisular. El sangrado descontrolado y excesivo puede
ocurrir en sujetos que tienen un sistema de coagulación normal y
sujetos que tienen trastornos de la coagulación o sangrado. Las
deficiencias del factor de la coagulación (hemofilia A y B,
deficiencia de los factores de la coagulación XI o VII) o
inhibidores del factor de la coagulación pueden ser la causa de los
trastornos de sangrado. Los sangrados excesivos también ocurren en
sujetos con una cascada de coagulación sanguínea de funcionamiento
normal (ningunas deficiencias del factor de la coagulación o
inhibidores contra cualquiera de los factores de la coagulación) y
pueden ser provocados por una función plaquetaria defectuosa,
trombocitopenia o enfermedad de Von Willebrand. En tales casos, los
sangrados pueden ser similares a aquellos sangrados provocados por
la hemofilia debido a que el sistema hemostático, como con la
hemofilia, carece de o tiene "compuestos" esenciales de la
coagulación anormales (tales como plaquetas o proteína de factor de
von Willebrand) que causa sangrados más importantes. En sujetos que
experimentan daño tisular extensivo asociado con la cirugía o
traumatismo grave, el mecanismo hemostático normal puede ser
abrumado por la demanda de hemostasis inmediata y pueden
desarrollar sangrado a pesar de un mecanismo hemostático normal. El
logro de una hemostasis satisfactoria también es un problema cuando
los sangrados ocurren en órganos tales como el cerebro, región
interna de la oreja y ojos con una limitada posibilidad para la
hemostasis quirúrgica. El mismo problema puede surgir en el proceso
de tomar biopsias de varios órganos (hígado, pulmón, tejido tumoral,
tracto gastrointestinal) al igual que en la cirugía laparoscópica.
Lo común de todas estas situaciones es la dificultad de proporcionar
la hemostasis por técnicas quirúrgicas, (suturas, clips, etc.) que
también es el caso cuando el sangrado es difundido (gastritis
hemorrágica y sangrado uterino profuso). Los sangrados agudos y
profusos también pueden ocurrir en sujetos en terapia
anticoagulante en quiénes una hemostasis defectuosa ha sido inducida
por la terapia suministrada. Tales sujetos pueden necesitar
intervenciones quirúrgicas por si acaso el efecto anticoagulante
tiene que ser contrarrestado rápidamente. La prostatectomía
retropúbica radical es un procedimiento comúnmente realizado para
los sujetos con cáncer de próstata localizado. La operación es
complicada frecuentemente por la significante y a veces masiva
pérdida de sangre. La considerable pérdida de sangre durante la
prostatectomía está principalmente relacionada con la situación
anatómica complicada, con varios sitios densamente vascularizados
que no son fácilmente accesibles para la hemostasis quirúrgica, y
que pueden resultar en el sangrado difundido de un área grande.
Otra situación que puede causar problemas en el caso de la
hemostasis insatisfactoria es cuando los sujetos con un mecanismo
hemostático normal son suministrados terapia anticoagulante para
prevenir la enfermedad tromboembólica. Tal terapia puede incluir
heparina, otras formas de proteoglicanos, Warfarina u otras formas
de antagonistas de la vitamina K al igual que aspirina y otros
inhibidores de agregación
plaquetaria.
plaquetaria.
En una forma de realización de la invención, el
sangrado está asociado con la hemofilia. En otra forma de
realización, el sangrado está asociado con la hemofilia con
inhibidores adquiridos. En otra forma de realización, el sangrado
está asociado con la trombocitopenia. En otra forma de realización,
el sangrado está asociado con la enfermedad de von Willebrand. En
otra forma de realización, el sangrado está asociado con el daño
tisular grave. En otra forma de realización, el sangrado está
asociado con el traumatismo grave. En otra forma de realización, el
sangrado está asociado con la cirugía. En otra forma de realización,
el sangrado está asociado con la cirugía laparoscópica. En otra
forma de realización, el sangrado está asociado con la gastritis
hemorrágica. En otra forma de realización, el sangrado es sangrado
uterino profuso. En otra forma de realización, el sangrado ocurre
en órganos con una limitada posibilidad para la hemostasis mecánica.
En otra forma de realización, el sangrado ocurre en el cerebro,
región interna de la oreja u ojos. En otra forma de realización, el
sangrado está asociado con el proceso de tomar biopsias. En otra
forma de realización, el sangrado está asociado con la terapia
anticoagulante.
El término "sujeto" como se usa aquí
pretende significar cualquier animal, en particular mamíferos, tal
como los seres humanos, y puede, cuando sea apropiado, ser usado de
forma intercambiable con el término "paciente".
Como se usa aquí, los términos "medio de
crecimiento apropiado" significan un medio que contiene
nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de
células y la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica la variante del Factor VII de la invención.
Las variantes del factor VII que se describen
aquí pueden ser producidas por medio de técnicas ácido nucleicas
recombinantes. En general, una secuencia ácido nucleica de factor
VII de tipo salvaje clonada se modifica para codificar la deseada
proteína. Esta secuencia modificada es insertada entonces en un
vector de expresión, que a su vez es transformada o transfectada en
las células huéspedes. Las células eucarióticas superiores, en
particular las células mamíferas cultivadas, son preferidas como
células huéspedes. Las secuencias nucleótidas completas y amino
ácidas para el factor VII humano son conocidas (vean EEUU 4,784,950,
dónde la clonación y expresión del recombinante factor VII humano
se describe). La secuencia del factor VII bovino se describe en
Takeya et al., J. Biol. Chem. 263:14868-14872
(1988)).
Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos
pueden ser realizadas por una variedad de técnicas. La modificación
de la secuencia de ácidos nucleicos puede hacerse por mutagénesis
específica del sitio. Las técnicas para la mutagénesis específica
del sitio son bien conocidas en la técnica y se describen en, por
ejemplo, Zoller y Smith (DNA 3:479-488, 1984) o,
"Splicing by extension overlap" Horton et al., Gene 77,
1989, págs. 61-68. Por lo tanto, usando las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos del factor VII, uno puede
introducir la(s) alteración(es) de elección.
Asimismo, los procedimientos para preparar un constructo de ADN
usando la reacción en cadena de polimerasa usando cebadores
específicos son bien conocidos para las personas expertas en la
técnica (cf. PCR Protocolos, 1990, Academic Press, San Diego,
California, EEUU).
El constructo de ácidos nucleicos que codifica
la variante del Factor VII de la invención puede ser adecuadamente
de origen genómico o ADNc, por ejemplo obtenido preparando una
genoteca genómica o de ADNc y seleccionando para secuencias de ADN
que codifican todo o parte del polipéptido por hibridación usando
sondas oligonucleótidas sintéticas conforme a las técnicas estándar
(cf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory
Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor,
Nueva York, 1989).
El constructo de ácidos nucleicos que codifica
la variante del Factor VII también puede ser preparada
sintéticamente por métodos estándar establecidos, por ejemplo el
método de fosfoamidita que se describe por Beaucage y Caruthers,
Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869, o el método que se
describe por Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 -
805. Según el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son
sintetizados, por ejemplo en un sintetizador de ADN automático,
purificados, recocidos, ligados y clonados en los vectores
adecuados.
Además, el constructo de ácidos nucleicos puede
ser de origen genómico, mezclado sintético y de ADNc, o mezclado
genómico y de ADNc preparado por ligamiento de fragmentos de origen
sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), los fragmentos
correspondientes a varias partes del constructo de ácidos nucleicos
íntegro, conforme a las técnicas estándar.
El constructo de ácidos nucleicos es
preferiblemente un constructo de ADN.
Las secuencias de ADN para el uso en la
producción de variantes del factor VII según la presente invención,
codifican típicamente un polipéptido pre-pro en el
término amino del factor VII para obtener el tratamiento
postraduccional oportuno (p. ej. gamma-carboxilación
de los residuos de ácido glutámico) y secreción de la célula
huésped. El polipéptido pre-pro puede ser aquel del
factor VII u otra proteína plasmática dependiente de la vitamina K,
tal como el factor IX, factor X, protrombina, proteína C o proteína
S. Como se apreciará por aquellos expertos en la técnica, las
modificaciones adicionales pueden ser hechas en la secuencia de
aminoácidos de las variantes del factor VII donde aquellas
modificaciones no perjudican significativamente la capacidad de la
proteína para actuar como un coagulante. Por ejemplo, las variantes
del Factor VII también pueden ser modificadas en el sitio de la
escisión de activación para inhibir la conversión del factor VII
zimógeno a su forma bicatenaria activada, como se describe
generalmente en la patente estadounidense nº 5,288,629.
Los vectores de expresión para el uso en la
expresión de las variantes del factor VIIa comprenderán un promotor
capaz de dirigir la transcripción de un gen clonado o ADNc. Los
promotores preferidos para el uso en células mamíferas cultivadas
incluyen los promotores víricos y promotores celulares. Los
promotores víricos incluyen el promotor SV40 (Subramani et
al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) y el
promotor CMV (Boshart et al., Cell
41:521-530, 1985). Un promotor vírico
particularmente preferido es el promotor tardío importante del
adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol.
2:1304-1319, 1982). Los promotores celulares
incluyen el promotor de gen de ratón kappa (Bergman et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 81:7041-7045, 1983) y el
promotor V_{H} de ratón (Loh et al., Cell
33:85-93, 1983). Un promotor celular particularmente
preferido es el promotor de metalotioneína I del ratón (Palmiter
et al., Science 222:809-814, 1983). Los
vectores de expresión también pueden contener un conjunto de sitios
de empalme de ARN ubicados aguas abajo del promotor y aguas arriba
del sitio de inserción de la misma secuencia del factor VII. Los
sitios de empalme de ARN preferidos pueden ser obtenidos del
adenovirus y/o genes de inmunoglobulina. También contenidos en los
vectores de expresión hay una señal de poliadenilación ubicada
aguas abajo del sitio de inserción. Las señales de poliadenilación
particularmente preferidas incluyen la temprana o tardía señal de
poliadenilación de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal
de poliadenilación de la región del adenovirus 5 Elb, el terminador
del gen de la hormona de crecimiento humana (DeNoto et al.
Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) o la señal de
poliadenilación del gen del factor VII humano o el gen del factor
VII bovino. Los vectores de expresión también pueden incluir una
secuencia líder vírica no codificadora, tal como el líder
tripartito del adenovirus 2, ubicado entre los sitios del empalme
promotor y del ARN; y secuencias intensificadoras, tal como el
intensificador SV40.
Las secuencias clonadas de ADN son introducidas
en células mamíferas cultivadas por, por ejemplo, la transfección
mediada por fosfato cálcico (Wigler et al., Cell
14:725-732, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell
Genetics 7:603-616, 1981; Graham y Van der Eb,
Virology 52d:456-467, 1973) o electroporación
(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982).
Para identificar y seleccionar células que expresan el ADN exógeno,
un gen que confiere un fenotipo seleccionable (un marcador
seleccionable) es introducido generalmente en las células junto con
el gen o ADNc de interés. Los marcadores seleccionables preferidos
incluyen genes que confieren resistencia a los fármacos tal como la
neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador seleccionable
puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador
seleccionable amplificable preferido es una secuencia de
dihidrofolato-reductasa (DHFR). Los marcadores
seleccionables son reseñados por Thilly (Mammalian Cell Technology,
Butterworth Publishers, Stoneham, MA, incorporados aquí por
referencia). La persona experta en la técnica podrá elegir
fácilmente los marcadores seleccionables adecuados.
Los marcadores seleccionables pueden ser
introducidos en la célula en un plásmido por separado al mismo
tiempo que el gen de interés, o pueden ser introducidos en el mismo
plásmido. Si en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el
gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores
o el mismo promotor, produciendo ésta última disposición un mensaje
dicistrónico. Los constructos de este tipo son conocidos en la
técnica (por ejemplo, Levinson y Simonsen, US 4,713,339). También
puede ser ventajoso añadir ADN adicional, conocido como "ADN
portador", a la mezcla que se introduce en las células.
Después de que las células han absorbido el ADN,
se crecen en un medio de crecimiento apropiado, típicamente durante
1-2 días, para empezar a expresar el gen de interés.
El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio
convencional adecuado para el crecimiento de las células huéspedes,
tal como medios mínimos o complejos que contienen suplementos
apropiados. Los medios adecuados están disponibles de los
proveedores comerciales o pueden ser preparados según las recetas
publicadas (p. ej. en los catálogos de American Type Culture
Collection). Los medios son preparados usando los procedimientos
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las referencias para
bacterias y levadura; Bennett, J.W. y LaSure, L., editors, More Gene
Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Los medios de
crecimiento incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente
de nitrógeno, aminoácidos esenciales, azúcares esenciales,
vitaminas, sales, fosfolípidos, proteínas y factores de
crecimiento. Para la producción de variantes del factor VII
gamma-carboxiladas, el medio contendrá vitamina K,
preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml
hasta aproximadamente 5 mg/ml. La selección del fármaco es aplicada
entonces para seleccionar para el crecimiento de células que
expresan el marcador seleccionable de forma estable. Para las
células que han sido transfectadas con un marcador seleccionable
amplificable, la concentración del fármaco puede ser incrementada
para seleccionar un incrementado número de copias de las secuencias
clonadas, incrementando así los niveles de expresión. Los clones de
las células establemente transfectadas son seleccionadas por la
expresión de la variante deseada del Factor VII.
Las líneas celulares mamíferas preferidas
incluyen las líneas celulares CHO (ATCC CCL 61),
COS-1 (ATCC CRL 1650), riñón de cría de hámster
(BHK) y 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol.
36:59-72, 1977). Una línea celular BHK preferida es
la línea celular BHK tk^{-} ts13 (Waechter y Baserga, Proc. Natl.
Acad. Sci. EEUU 79:1106-1110, 1982), referida de
aquí en adelante como células BHK 570. La línea celular BHK 570
está disponible de American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Dr., Rockville, MD 20852, bajo el número de registro ATCC CRL
10314. Una línea celular BHK tk^{-} ts13 también está disponible
del ATCC bajo el número de registro CRL 1632. Además, un número de
otras líneas celulares puede ser usada, incluyendo Rat Hep I
(hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (hepatoma de rata;
ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), pulmón humano (ATCC HB 8065),
NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y células DUKX (Urlaub y Chasin, Proc.
Natl. Acad. Sci. EEUU 77: 4216-4220, 1980).
Se puede emplear tecnología animal transgénica
para producir las variantes del factor VII de la invención. Se
prefiere producir las proteínas en las glándulas mamarias de un
mamífero femenino huésped. La expresión en la glándula mamaria y
posterior secreción de la proteína de interés en la leche supera
muchas dificultades halladas en el aislamiento de las proteínas de
otras fuentes. La leche es recogida fácilmente, disponible en
cantidades grandes, y bioquímicamente bien caracterizada. Además,
las proteínas de la leche más importantes están presentes en la
leche en altas concentraciones (típicamente desde aproximadamente 1
a 15 g/l).
Desde un punto de vista comercial, es claramente
preferible usar como huésped una especie que tiene una producción
de leche grande. Mientras que animales más pequeños tales como los
ratones y ratas pueden ser usados (y son preferibles en la prueba
de la fase principal), es preferible usar ganado mamífero
incluyendo, pero no limitado a, cerdos, cabras, ovejas y reses. Las
ovejas son particularmente preferidas debido a tales factores como
la historia precedente de la transgénesis en estas especies,
producción de leche, coste y la fácil disponibilidad del
equipamiento para recolectar la leche de oveja (véase, por ejemplo,
WO 88/00239 para una comparación de los factores que influyen en la
elección de especies huéspedes). Es deseable generalmente
seleccionar una raza de animal huésped que ha sido criado para el
uso lácteo, tal como las ovejas East Friesland, o para introducir
la provisión láctea criando la línea transgénica en una fecha más
posterior. De cualquier manera, deben ser usados animales de un
buen estado de salud conocido.
Para obtener la expresión en la glándula
mamaria, es usado un promotor de la transcripción de un gen de la
proteína de la leche. Los genes de la proteína de la leche incluyen
aquellos genes que codifican caseínas (véase US 5,304,489),
beta-lactoglobulina,
\alpha-lactalbumina, y la proteína acídica del
lactosuero. El promotor de beta-lactoglobulina
(BLG) es preferido. En el caso del gen de
beta-lactoglobulina bovino, será usada generalmente
una región de al menos 406 bp proximales de la secuencia 5'
flanqueadora del gen, aunque son preferibles partes más grandes de
la secuencia flanqueadora 5', hasta cerca de aproximadamente 5 kbp,
tal como un segmento de ADN \sim4.25 kbp que abarca el promotor
flanqueador 5' y la parte no codificadora del gen de
beta-lactoglobulina (véase Whitelaw et al.,
Biochem. J. 286: 31-39 (1992)). Los fragmentos
similares del ADN del promotor de otras especies también son
adecuados.
Otras regiones del gen de
beta-lactoglobulina también pueden ser incorporadas
en constructos, al igual que las regiones genómicas del gen que se
expresa. Es aceptado generalmente en la técnica que los constructos
que carecen de intrones, por ejemplo, que expresan pobremente en
comparación con aquellas que contienen tales secuencias de ADN
(véase Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85:
836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EEUU 88: 478-482 (1991); Whitelaw et
al., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO
89/01343; y WO 91/02318, cada uno de los cuales está incorporado
aquí por referencia). En este respecto, se prefiere generalmente,
donde sea posible, usar secuencias genómicas que contienen todos o
algunos de los intrones nativos de un gen que codifica la proteína
o polipéptido de interés, así la inclusión adicional de al menos
algunos intrones de, p. ej, el gen de
beta-lactoglobulina, es preferida. Una tal región es
un segmento de ADN que proporciona el empalme de intrones y la
poliadenilación de ARN de la región no codificadora 3' del gen de
beta-lactoglobulina bovino. Cuando se sustituyen por
las secuencias no codificadoras 3' naturales de un gen, este
segmento de beta-lactoglobulina ovino puede tanto
intensificar como estabilizar los niveles de expresión de la
proteína o polipéptido de interés. Dentro de otras formas de
realización, la región que circunda el ATG de iniciación de la
secuencia variante del factor VII es sustituida con las
correspondientes secuencias de un gen de la proteína específica de
la leche. Tal sustitución proporciona un entorno de iniciación
putativo tisular específico para intensificar la expresión. Es
conveniente sustituir las secuencias prepro de la variante de
Factor VII entera y no codificadoras 5' con aquellas de,
\hbox{por ejemplo, el gen BLG, aunque regiones más pequeñas
pueden ser sustituidas.}
Para la expresión de las variantes del factor
VII en animales transgénicos, un segmento de ADN que codifica la
variante del factor VII es ligado operativamente a los segmentos de
ADN adicionales requeridos para su expresión para producir unidades
de expresión. Tales segmentos adicionales incluyen el mencionado
promotor, al igual que secuencias que proveen la terminación de la
transcripción y poliadenilación de ARNm. Las unidades de expresión
incluirán además un segmento de ADN que codifica una secuencia señal
secretora ligada operativamente al segmento que codifica el factor
VII. La secuencia señal secretora puede ser una secuencia señal
secretora del factor VII nativo o puede ser aquella de otra
proteína, tal como una proteína de la leche (véase, por ejemplo,
von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); y
Meade et al., US 4,873,316, que son incorporadas aquí por
referencia).
La construcción de unidades de expresión para el
uso en animales transgénicos se lleva a cabo convenientemente
insertando una secuencia de la variante del factor VII en un
plásmido o vector de fago que contiene los segmentos de ADN
adicionales, aunque la unidad de expresión puede ser construida
esencialmente por cualquier secuencia de ligaduras. Es
particularmente conveniente proporcionar un vector que contiene un
segmento de ADN que codifica una proteína de la leche y sustituir
la secuencia codificante para la proteína de la leche con aquella de
un polipéptido de la variante del Factor VII; creando así una
fusión del gen que incluye las secuencias de control de la
expresión del gen de la proteína de la leche. De cualquier manera,
la clonación de las unidades de expresión en plásmidos u otros
vectores facilita la amplificación de la secuencia de la variante
del factor VII. La amplificación se lleva a cabo convenientemente
en células huéspedes bacterianas (p. ej. E. coli), por lo
tanto los vectores incluirán típicamente un origen de replicación y
un marcador seleccionable funcional en las células huéspedes
bacterianas. La unidad de expresión es introducida entonces en
ovarios fertilizados (incluyendo embriones de fase temprana) de las
especies huéspedes elegidas. La introducción de ADN heterólogo
puede ser lograda por una de varias vías, incluyendo la
microinyección (p. ej. patente US nº. 4,873,191), infección
retrovírica (Jaenisch, Science 240: 1468-1474
(1988)) o la integración dirigida al sitio usando células madre
(CM) embrionarias (revisadas por Bradley et al.,
Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Los ovarios son
implantados entonces en los oviductos o úteros de las hembras
pseudoembarazadas y se dejan desarrollar a término. Las crías que
llevan el ADN introducido en su línea de gérmenes puede pasar el ADN
a su progenie de la forma Mendeliana normal, permitiendo el
desarrollo de manadas transgénicas. Los procedimientos generales
para producir animales transgénicos son conocidos en la técnica
(véase, por ejemplo, Hogan et al. Manipulating the Mouse
Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986;
Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183
(1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32:
645-651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology
8: 140-143 (1990); Ebert et al.,
Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort et
al., Biotechnology 9: 844-847 (1991); Wall
et al., J. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler
et al., Bio/Technology 8: 140-143 (1990);
Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838
(1991); Krimpenfort et al., Biotechnology 9:
844-847 (1991); Wall et al., J. Cell.
Biochem. 49: 113-120 (1992); US 4,873,191; US
4,873,316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; y GB 87/00458).
Técnicas para introducir secuencias de ADN extraño en mamíferos y
sus células germinales fueron desarrolladas originalmente en el
ratón (véase, por ejemplo, Gordon et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EEUU 77: 7380-7384 (1980); Gordon y Ruddle,
Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter y Brinster,
Cell 41: 343-345 (1985); Brinster et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 82: 4438-4442 (1985); y
Hogan et al. (ibid.)). Estas técnicas fueron adaptadas
posteriormente para el uso con animales más grandes, incluyendo
especies de ganado (véase, por ejemplo, WO 88/00239, WO 90/05188, y
WO 92/11757; y Simons et al., Bio/Technology 6:
179-183 (1988)). Para resumir, en la vía más eficaz
usada hasta la fecha en la generación de ratones transgénicos o
ganado, varios cientos de moléculas lineales del ADN de interés son
inyectadas en uno de los pro-núcleos de un ovario
fertilizado según las técnicas establecidas. La inyección de ADN en
el citoplasma de un zigoto también puede ser empleada.
La producción en plantas transgénicas también
puede ser empleada. La expresión puede ser generalizada o dirigida
a un órgano particular, tal como un tubérculo (véase, Hiatt, Nature
344:469-479 (1990); Edelbaum et al., J.
Interferon Res. 12:449-453 (1992); Simons et
al., Bio/Technology 8:217-221 (1990); y EP 0 255
378).
Las variantes del Factor VII de la invención son
recuperadas del medio de cultivo celular o leche. Las variantes del
Factor VII de la presente invención pueden ser purificadas por una
variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero
no limitado a, la cromatografía (p. ej., intercambio iónico,
afinidad, hidrofóbico, cromatoenfoque, y exclusión por tamaño),
procedimientos electroforéticos (p. ej., enfoque isoeléctrico
preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación
de sulfato amónico), o extracción (véase, por ejemplo, Protein
Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers,
New York, 1989). Preferiblemente, pueden ser purificados por
cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos
anti-factor VII. El uso de anticuerpos monoclonales
dependientes del calcio, como se describe por Wakabayashi et
al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108; (1986) y
Thim et al., Biochemistry 27: 7785-7793;
(1988), es particularmente preferido. La purificación adicional
puede ser lograda por medios químicos de purificación
convencionales, tal como la cromatografía líquida de alto
rendimiento. Otros métodos de purificación, incluyendo la
precipitación de citrato de bario, son conocidos en la técnica, y
pueden ser aplicados a la purificación de las variantes nuevas del
factor VII que se describen aquí (véase, por ejemplo, Scopes, R.,
Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.,
1982).
Para los propósitos terapéuticos se prefiere que
las variantes del factor VII de la invención sean substancialmente
puros. Por lo tanto, en una forma de realización preferida de la
invención las variantes del factor VII de la invención son
purificadas hasta al menos aproximadamente un 90 a 95% de
homogeneidad, preferiblemente por lo menos aproximadamente 98% de
homogeneidad. La pureza puede ser evaluada por ejemplo por
electroforesis en gel y secuenciación de aminoácidos
aminoterminales.
La variante del Factor VII es dividida en su
sitio de activación a fin de convertirla en su forma bicatenaria.
La activación se puede llevar a cabo según los procedimientos
conocidos en la técnica, tal como aquellos que son divulgados por
Osterud, et al., Biochemistry 11:2853-2857
(1972); Thomas, patente US nº. 4,456,591; Hedner y Kisiel, J. Clin.
Invest. 71:1836-1841 (1983); o Kisiel y Fujikawa,
Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983).
Alternativamente, como se describe por Bjoem et al. (Research
Disclousre, 269 Septiembre 1986, págs. 564-565), el
Factor VII puede ser activado pasándolo a través de una columna de
cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia
fine Chemicals) o similar. La variante resultante activada del
factor VII puede entonces, ser formulada y administrada como se
describe a continuación.
La invención también proporciona ensayos
adecuados para seleccionar variantes de Factor VIIa preferidos
según la invención. Estos ensayos pueden ser realizados como una
prueba simple in vitro preliminar.
Por lo tanto, el Ejemplo 6 divulga aquí una
prueba simple (titulada "Ensayo de Hidrólisis In Vitro")
para la actividad de las variantes del Factor VIIa de la invención.
Basándose en ello, las variantes de Factor VIIa que son de
particular interés son aquellas variantes donde la proporción entre
la actividad de la variante y la actividad del Factor VII nativo
que se muestra en la Fig. 1 es superior a 1.0, por ejemplo al menos
aproximadamente 1.25, preferiblemente al menos aproximadamente 2.0,
tal como al menos aproximadamente 3.0 o, incluso más preferido, al
menos aproximadamente 4.0 cuando es evaluado en el "Ensayo de
Hiidrólisis In Vitro" aquí definido.
La actividad de las variantes también puede ser
medida usando un sustrato fisiológico tal como factor X (véase
ejemplo 7), adecuadamente en una concentración de
100-1000 nM, donde el Factor Xa generado es medido
después de la adición de un sustrato cromogénico adecuado (por
ejemplo, S-2765). Además, el ensayo de la actividad
puede ser ejecutado a temperatura fisiológica.
La capacidad de las variantes de factor VIIa
para generar trombina también puede ser medida en un ensayo que
comprende todos los factores relevantes de coagulación e inhibidores
a concentraciones fisiológicas (menos el factor VIII cuando imita
las condiciones de la hemofilia A) y plaquetas activadas (como se
describe en la p. 543 en Monroe et al. (1997) Brit. J.
Haematol. 99, 542-547 que se incorpora como
referencia en la presente).
Las variantes del factor VII según la presente
invención pueden ser utilizadas para controlar los trastornos del
sangrado que tienen varias causas tales como las deficiencias del
factor de la coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de
los factores de coagulación XI o VII) o inhibidores del factor de la
coagulación, o pueden ser usados para controlar el sangrado
excesivo que ocurre en sujetos con una cascada de coagulación
sanguínea de funcionamiento normal (ninguna deficiencia del factor
de la coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores
de la coagulación). Los sangrados pueden ser provocados por una
función plaquetaria defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von
Willebrand. También pueden ser vistos en sujetos en quienes ha sido
inducida una actividad fibrinolítica por varios estímulos.
En los sujetos que experimentan un daño tisular
extensivo en asociación con la cirugía o traumatismo extenso, el
mecanismo hemostático puede ser abrumado por la demanda de la
hemostasis inmediata y pueden desarrollar sangrados a pesar de un
mecanismo hemostático normal. Lograr una hemostasis satisfactoria
también es un problema cuando los sangrados ocurren en órganos
tales como el cerebro, región interna de la oreja y ojos y también
puede ser un problema en casos de sangrados difundidos (gastritis
hemorrágica y sangrado uterino profuso) cuando es difícil de
identificar la fuente. El mismo problema puede surgir en el proceso
de toma de biopsias de varios órganos (hígado, pulmón, tejido
tumoral, tracto gastrointestinal) al igual que en la cirugía
laparoscópica. Estas situaciones comparten la dificultad de
proporcionar hemostasis por técnicas quirúrgicas, (suturas, clips,
etc.). Los sangrados agudos y profusos también pueden ocurrir en los
sujetos en terapia anticoagulante en quienes una hemostasis
defectuosa ha sido inducida por la terapia suministrada. Tales
sujetos pueden necesitar intervenciones quirúrgicas en caso de que
el efecto anticoagulante tenga que ser contrarrestado rápidamente.
Otra situación que puede causar problemas en el caso de la
hemostasis insatisfactoria es cuando los sujetos con un mecanismo
hemostático normal son suministrados terapia anticoagulante para
prevenir la enfermedad tromboembólica. Tal terapia puede incluir la
heparina, otras formas de proteoglicanos, Warfarina u otras formas
de antagonistas de la vitamina K al igual que aspirina y otros
inhibidores de agregación plaquetaria.
Una activación sistémica de la cascada de
coagulación puede dar lugar a la coagulación intravascular
diseminada (DIC). No obstante, tales complicaciones no han sido
vistas en sujetos tratados con dosis altas de factor VIIa
recombinante debido a un proceso hemostático localizado del tipo
inducido por la formación compleja entre el Factor VIIa y TF
expuesto en el sitio de la lesión de la pared del vaso. Las
variantes del Factor VII según la invención pueden por lo tanto ser
usadas también en su forma activada para controlar tales sangrados
excesivos asociados con un mecanismo hemostático normal.
Para el tratamiento en conexión con las
intervenciones deliberadas, las variantes del factor VII de la
invención serán administradas típicamente dentro de aproximadamente
24 horas antes de realizar la intervención, y durante tanto como 7
días o más a partir de ahí. La administración como un coagulante
puede ser por una variedad de vías como se describe aquí.
La dosis de las variantes del Factor VII oscilan
desde aproximadamente 0.05 mg a 500 mg/día, preferiblemente desde
aproximadamente 1 mg a 200 mg/día, y más preferiblemente desde
aproximadamente 10 mg a aproximadamente 175 mg/día para un sujeto
de 70 kg como dosis de carga y mantenimiento, dependiendo del peso
del sujeto y de la severidad de la condición.
Las composiciones farmacéuticas son destinadas
principalmente para la administración parenteral para el
tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, las
composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, es
decir, por vía intravenosa, subcutáneamente, o intramuscularmente, o
pueden ser administradas por infusión continua o pulsátil. Las
composiciones para la administración parenteral comprenden la
variante del Factor VII de la invención en combinación con,
preferiblemente disuelto en, un portador farmacéuticamente
aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Una variedad de
portadores acuosos pueden ser usados, tal como agua, agua
tamponada, solución salina al 0.4%, glicina al 0.3% y similares. Las
variantes del Factor VII de la invención también pueden ser
formuladas en preparaciones de liposoma para la entrega o en
dirección a los sitios de la lesión. Las preparaciones de liposoma
son descritas generalmente en, por ejemplo, US 4,837,028, US
4,501,728, y US 4,975,282. Las composiciones pueden ser
esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales bien
conocidas. Las resultantes soluciones acuosas pueden ser envasadas
para el uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas,
la preparación liofilizada siendo combinada con una solución acuosa
estéril antes de la administración. Las composiciones pueden
contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como es
requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tal como
el ajuste de pH y agentes tamponadores, agentes que ajustan la
tonicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico,
cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, etc.
La concentración de la variante del Factor VII
en estas formulaciones puede variar ampliamente, es decir, desde
menos de aproximadamente 0.5% en peso, normalmente a o al menos
aproximadamente 1% en peso hasta tanto como 15 o 20% en peso y será
seleccionado principalmente por volúmenes fluidos, viscosidades,
etc., conforme al modo de administración particular
seleccionado.
Por lo tanto, una composición farmacéutica
típica para la infusión intravenosa podría ser hecha para contener
250 ml de la solución estéril de Ringer y 10 mg de la variante del
Factor VII. Los métodos actuales para preparar composiciones
parenteralmente administrables será conocida por los expertos en la
técnica y son descritos en más detalle en, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton,
PA (1990).
Las composiciones que contienen las variantes
del Factor VII de la presente invención pueden ser administradas
para los tratamientos terapéuticos y/o profilácticos. En las
aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un
sujeto que ya sufre de una enfermedad, como se describe
anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o
detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una
cantidad adecuada para lograr esto es definida como "cantidad
terapéuticamente efectiva". Como se entenderá por la persona
experta en la técnica las cantidades eficaces para este propósito
dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión al igual que el
peso y estado general del sujeto. En general, no obstante, la
cantidad eficaz oscilará desde aproximadamente 0.05 mg hasta
aproximadamente 500 mg de la variante del Factor VII por día para un
sujeto de 70 kg, con dosificaciones de desde aproximadamente 1.0 mg
hasta aproximadamente 200 mg de la variante del Factor VII por día
siendo usadas de forma más común.
Hay que tener en cuenta que los materiales de la
presente invención pueden ser empleados generalmente en estados de
enfermedad grave o lesión, es decir, situaciones que ponen en
peligro la vida o ponen potencialmente en peligro la vida. En tales
casos, en vista de la minimización de sustancias extrañas y carencia
general de inmunogenicidad de las variantes del Factor VII humano
en los humanos, es posible y puede estimarse deseable por el médico
tratante administrar un exceso sustancial de estas composiciones de
variante del Factor VII.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones
que contienen la variante del Factor VII de la invención son
administradas a un sujeto susceptible de o en riesgo de un estado de
enfermedad o lesión para intensificar la propia capacidad
coagulante del sujeto. Tal cantidad es definida por ser una "dosis
profiláctica efectiva." En las aplicaciones profilácticas, las
cantidades precisas dependen una vez más del estado de salud y peso
del sujeto, pero la dosis oscila generalmente desde aproximadamente
0.05 mg a aproximadamente 500 mg por día para un sujeto de 70
kilogramos, más comúnmente desde aproximadamente 1.0 mg a
aproximadamente 200 mg por día para un sujeto de 70
kilogramos.
kilogramos.
Las administraciones únicas o múltiples de las
composiciones pueden ser llevadas a cabo con niveles de dosis y
pautas siendo seleccionadas por el médico tratante. Para los sujetos
ambulatorios que requieren niveles de mantenimiento, las variantes
del factor VII pueden ser administradas por la infusión continua
usando por ejemplo un sistema de bomba portátil.
La entrega local de la variante del Factor VII
de la presente invención, tal como, por ejemplo, la aplicación
tópica puede ser llevada a cabo, por ejemplo, por medio de un
pulverizador, perfusión, catéteres de doble balón, endoprótesis,
incorporada en los injertos vasculares o endoprótesis, hidrogeles
usados para revestir los catéteres de balón, u otros métodos bien
establecidos. De cualquier manera, las composiciones farmacéuticas
deberían proporcionar una cantidad de la variante del Factor VII
suficiente para tratar eficazmente al sujeto.
La presente invención es ilustrada además por
los siguientes ejemplos que, no obstante, no han de ser
interpretados como limitadores del alcance de protección. Las
características divulgadas en la descripción siguiente y en los
siguientes ejemplos pueden, tanto por separado como en cualquiera de
sus combinaciones, ser material para realizar la invención en
diversas formas de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La terminología para las sustituciones de
aminoácidos usadas en los siguientes ejemplos son de la siguiente
manera. La primera letra representa el aminoácido presente
naturalmente en una posición de la SEC ID nº 1. El siguiente número
representa la posición en la SEC ID nº 1. La segunda letra
representa el aminoácido diferente que sustituye el aminoácido
natural. Un ejemplo es [l305V]-FVII, donde la
leucina en la posición 305 de la SEC ID nº 1 es sustituida por una
valina. En otro ejemplo,
[l305V/M306D/D309SI-FVII], la leucina en la
posición 305 de la SEC ID nº 1 es sustituida por una valina y la
metionina en la posición 306 de la SEC ID nº 1 es sustituida por un
ácido aspártico y el ácido aspártico en la posición 309 de la SEC ID
nº 1 es sustituido por una serina, todas las mutaciones en el mismo
polipéptido del factor VII.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Constructos de ADN que codifican
[l305V/M306D/D309S]-FVII,
[l305V]-FVII, [l305I]-FVII,
[l305T]-FVII y [F374P]-FVII fueron
preparados por mutagénesis dirigida al sitio usando un vector de ADN
de superhélice bicatenario con un inserto de interés y dos
cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Fueron
usados los siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Para [l305V]-FVII:
- 5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3'
- (SEC ID Nº 18)
- 5'-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3'
- (SEC ID Nº 19)
\vskip1.000000\baselineskip
Para [M306D/D309S]-FVII:
- 5'-TCT AGA TAC CCA GTC TTG CCT GCA GCA GTC ACG GAA-3'
- (SEC ID Nº 20)
- 5'-TTC CGT GAC TGC TGC AGG CAA GAC TGG GTA TCT AGA-3'
- (SEC ID Nº 21)
\newpage
Para [f374P]-FVII:
- 5'-CCG TGG GCC ACC CTG GGG TGT ACA CC-3'
- (SEC ID nº 22)
- 5'-GGT GTA CAC CCC AGG GTG GCC CAC GG-3'
- (SEC ID nº 23)
\vskip1.000000\baselineskip
Para [l305I]-FVII:
- 5'-CCT CAA CGT GCC CCG GAT CAT GAC CCA GGA C-3'
- (SEC ID Nº 24)
- 5'-GTC CTG GGT CAT GAT CCG GGG CAC GTT GAG G-3'
- (SEC ID Nº 25)
\vskip1.000000\baselineskip
Para [l305T]-FVII:
- 5'-CCT CAA CGT GCC CCG GAC GAT GAC CCA GGA C-3'
- (SEC ID Nº 26)
- 5'-GTC CTG GGT CAT CGT CCG GGG CAC GTT GAG G-3'
- (SEC ID Nº 27)
Los cebadores oligonucleótidos, cada uno
complementario a cadenas opuestas del vector, fueron extendidas
durante la variación cíclica de la temperatura por medio de la Pfu
ADN polimerasa. Tras la incorporación de los cebadores, fue
generado un plásmido mutado que contenía muescas escalonadas. Tras
la variación cíclica de la temperatura, el producto fue tratado con
Dpnl que es específico para el ADN metilado y hemimetilado para
digerir el molde parental del ADN y para seleccionar ADN sintetizado
con mutación.
Los procedimientos para preparar un constructo
de ADN usando la reacción en cadena de polimerasa usando cebadores
específicos son bien conocidos por las personas expertas en la
técnica (cf. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego,
California, EEUU).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las células BHK fueron transfectadas
esencialmente como se ha descrito anteriormente (Thim et al.
(1988) Biochemistry 27 7793; Persson y Nielsen (1996) FEBS Lett.
385, 241-243) para obtener la expresión de la
variante [L305V/M306D/D309S] FVII. La variante del Factor VII fue
purificada de la siguiente manera:
El medio acondicionado fue cargado sobre una
columna de 25-ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia
Biotech) después de la adición de 5 mM de EDTA, 0.1% de Triton
X-100 y 10 mM TRIS, el ajuste del pH a 8.0 y ajuste
de la conductividad a 10-11 mS/cm añadiendo agua. La
elución de la proteína fue lograda por un gradiente de 10 mM tris,
50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 a 10 mM tris,
1 M NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 0.1% Triton X-100, pH
7.5. Las fracciones con [l305V/M306D/D309S]-FVII
fueron agrupadas, 10 mM de CaCl_{2} fueron añadidos, y aplicados
a una columna de 25 ml con anticuerpo monoclonal F1A2 (Novo Nordisk,
Bagsværd, Dinamarca) acoplado a la sefarosa 4B activada por CNBr
(Pharmacia Biotech). La columna fue equilibrada con 50 mM de HEPES,
pH 7.5, con 10 mM de CaCl_{2}, 100 mM de NaCl y 0.02% Triton
X-100. Después del lavado con tampón de equilibrio
y tampón de equilibrio con 2 M de NaCl, el material unido fue eluido
con tampón de equilibrio con contenido de 10 mM EDTA en lugar de
Cacl_{2}. Antes del uso o almacenamiento, el exceso de Cacl_{2}
sobre EDTA fue añadido o [l305V/M306D/D309S]-FVII
fue transferido a un tampón con Ca^{2+}. El rendimiento de cada
fase fue seguido por mediciones con ELISA del Factor VII y la
proteína purificada fue analizada por SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las células BHK fueron transfectadas
esencialmente como se ha descrito anteriormente (Thim et al.
(1988) Biochemistry 27 7793; Persson y Nielsen (1996) FEBS Lett.
385, 241-243) para obtener la expresión de la
variante (l305V)-FVII. La variante del Factor VII
fue purificada de la siguiente manera:
El medio acondicionado fue cargado sobre una
columna de 25 ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)
después de la adición de 5 mM EDTA, 0.1% Triton
X-100 y 10 mM Tris, ajuste del pH a 8.0 y ajuste de
la conductividad a 10-11 mS/cm añadiendo agua. La
elución de la proteína fue lograda por un gradiente de 10 mM tris,
50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 a 10 mM Tris,
1 M NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 0.1% Triton X-100, pH
7.5. Las fracciones con contenido de [l305V]-FVII
fueron agrupadas, 10 mM de CaCl_{2} fueron añadidos, y aplicados a
una columna de 25 ml con anticuerpo monoclonal F1A2 (Novo Nordisk,
Bagsværd, Dinamarca) acoplado a la sefarosa 4B activada por CNBr
(Pharmacia Biotech). La columna fue equilibrada con 50 mM de HEPES,
pH 7.5, con 10 mM de CaCl_{2}. 100 mM NaCl y 0.02% Triton
X-100. Después del lavado con tampón de equilibrio y
tampón de equilibrio con 2 M de NaCl, el material unido fue eluido
con tampón de equilibrio con 10 mM EDTA en lugar de CaCl_{2}.
Antes del uso o almacenamiento, el exceso de CaCl_{2} sobre EDTA
fue añadido o [l305V]-FVII fue transferido a un
tampon con Ca^{2+}. El rendimiento de cada fase fue seguido por
mediciones con ELISA del factor VII y la proteína purificada fue
analizada por SDS-PAGE.
Ejemplo
4
Las células BHK fueron modificadas esencialmente
como se describe anteriormente (Thim et al. (1988)
Biochemistry 27 7793; Persson y Nielsen (1996) FEBS Lett. 385,
241-243) para obtener la expresión de la variante
[f374P]-FVII. La variante del Factor VII fue
purificada de la siguiente manera:
El medio acondicionado fue cargado sobre una
columna de 25 ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)
después de la adición de 5 mM EDTA, 0.1% Triton
X-100 y 10 mM Tris, el ajuste del pH a 8.0 y ajuste
de la conductividad a 10-11 mS/cm añadiendo agua.
La elución de la proteína fue lograda por un gradiente de 10 mM
Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 a 10 mM
tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 0.1% Triton X-100,
pH 7.5. Las fracciones con [F374P]-FVII fueron
agrupadas, 10 mM de CaCl_{2} fueron añadidos, y aplicados a una
columna de 25 ml con anticuerpo monoclonal F1A2 (Novo Nordisk,
Bagsværd, Dinamarca) acoplado a la Sefarosa 4B activada por CNBr
(Pharmacia Biotech). La columna fue equilibrada con 50 mM HEPES, pH
7.5, con contenido de 10 mM CaCl_{2}, 100 mM NaCl y 0.02% Triton
X-100. Después del lavado con tampón de equilibrio
y tampón de equilibrio con 2 M de NaCl, el material unido fue eluido
con tampón de equilibrio con 10 mM de EDTA en lugar de CaCl_{2}.
Antes del uso o almacenamiento, el exceso de CaCl_{2} sobre EDTA
fue añadido o [F374P]-FVII fue transferido a un
tampón con Ca^{2+}. El rendimiento de cada fase fue seguido por
mediciones con ELISA del factor VII y la proteína purificada fue
analizada por SDS-PAGE.
Ejemplo
5
Las células BHK son esencialmente transfectadas
como se describe anteriormente (Thim et al. (1988)
Biochemistry 27, 7785-7793; Persson y Nielsen (1996)
FEBS Lett. 385, 241-243) para obtener la expresión
de la variante [L305I]-FVII o
[L305T]-FVII. La variante del Factor VII es
purificada de la siguiente manera:
El medio acondicionado es cargado sobre una
columna de 25 ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)
después de la adición de 5 mM EDTA, 0.1% Triton
X-100 y 10 mM Tris, el ajuste del pH a 8.0 y ajuste
de la conductividad a 10-11 mS/cm añadiendo agua.
La elución de la proteína es lograda por un gradiente de 10 mM de
Tris, 50 mM de NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 a 10
mM de Tris, 1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, 0.1% Triton
X-100, pH 7.5. Las fracciones con
[L305I]-FVII o [l305T]-FVII son
agrupadas, 10 mM de CaCl_{2} es añadido, y aplicado a una columna
de 25 ml con anticuerpo monoclonal F1A2 (Novo Nordisk, Bagsværd,
Dinamarca) acoplado a la sefarosa 4B activada por CNBr (Pharmacia
Biotech). La columna es equilibrada con 50 mM de HEPES, pH 7.5, con
10 mM de CaCl_{2}, 100 mM de NaCl y 0.02% Triton
X-100. Después del lavado con tampón de equilibrio
y tampón de equilibrio con 2 M de NaCl, el material unido fue eluido
con tampón de equilibrio con 10 mM de EDTA en lugar de CaCl_{2}.
Antes del uso o almacenamiento, el exceso de CaCl_{2} sobre EDTA
es añadido o [l305I]-FVII o
[l305T]-FVII son transferidos a un tampón con
Ca^{2+}. El rendimiento de cada fase es seguido por mediciones
con ELISA del factor VII y la proteína purificada es analizada por
SDS-PAGE.
Ejemplo
6
El factor Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y
variante del factor VIIa (ambos de aquí en adelante referidos como
"Factor VIIa") son evaluados en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo es llevado a
cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El
sustrato cromogénico
D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina
(S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final
1 mM, es añadido al factor VIIa (concentración final 100 nm) en 50
mM HEPES, pH 7.4, con contenido de 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}
y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm es
medida continuamente en un lector de placa SpectraMax^{TM} 340
(Molecular Devices, USA). La absorbencia desarrollada durante una
incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la
absorbencia en un pocillo de blanco sin contenido enzimático, es
usado para calcular la proporción entre las actividades de la
variante y tipo salvaje del factor VIIa:
\newpage
Ejemplo
7
El Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y variante
del factor VIIa (ambos de aquí en adelante referidos como "Factor
VIIa") son evaluados en paralelo para comparar directamente sus
actividades específicas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de
microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El factor VIIa (10 nM)
y Factor X (0.8 microM) en 100 microL 50 mM HEPES, pH 7.4, con 0.1
M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero
bovino, son incubados durante 15 min. La escisión del Factor X es
detenida entonces por la adición de 50 microL 50 mM HEPES, pH 7.4,
con contenido de 0.1 M de NaCl, 20 mM de EDTA y 1 mg/ml de albúmina
de suero bovino. La cantidad de Factor Xa generado es medido por la
adición del sustrato cromogénico
z-d-Arg-Gly-Arg-P-nitroanilina
(S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final
de 0.5 mM. La absorbencia a 405 nm es medida continuamente en un
lector de placa SpectraMax^{TM} 340 (Molecular Devices, USA). La
absorbencia desarrollada durante 10 minutos, después de la
sustracción de la absorbencia en un pocillo de blanco sin contenido
de FVIIa, es usada para calcular la proporción entre las
actividades proteolíticas de la variante y tipo salvaje del factor
VIIa:
Ejemplo
8
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet EP 200421 A [0006]
\bullet US 4784950 A [0058]
\bullet US 5288629 A [0064]
\bullet US 4713339 A [0067]
\bullet WO 8800239 A [0071] [0075]
\bullet US 5304489 A [0072]
\bullet WO 8901343 A [0073]
\bullet WO 9102318 A [0073]
\bullet US 4873316 A, Meade [0074]
[0075]
\bullet US 4873191 A [0075]
\bullet WO 9005188 A [0075]
\bullet WO 9211757 A [0075]
\bullet GB 8700458 A [0075]
\bullet EP 0255378 A [0076]
\bullet US 4456591 A [0079]
\bullet US 4837028 A [0089]
\bullet US 4501728 A [0089]
\bullet US 4975282 A [0089]
\bulletDickinson et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93,
14379-14384 [0007]
\bulletIwanaga et al.
Thromb. Haemost., August 1999, vol. 466, 1474
[0008]
\bulletTakeya et al. J.
Biol. Chem., 1988, vol. 263, 14868-14872
[0058]
\bulletZoller; Smith.
DNA, 1984, vol. 3, 479-488 [0059]
\bulletHorton et al. Splicing
by extension overlap. Gene, 1989, vol. 77,
61-68 [0059]
\bulletPCR Protocols, 1990
[0059]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989 [0060]
\bulletBeaucage; Caruthers.
Tetrahedron Letters, 1981, vol. 22,
1859-1869 [0061]
\bulletMatthes et al. EMBO
Journal, 1984, vol. 3, 801-805 [0061]
\bulletSubramani et al. Mol.
Cell. Biol., 1981, vol. 1, 854-864
[0065]
\bulletBoshart et al.
Cell, 1985, vol. 41, 521-530
[0065]
\bulletKaufman; Sharp. Mol.
Cell. Biol., 1982, vol. 2, 1304-1319
[0065]
\bulletBergman et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 81,
7041-7045 [0065]
\bulletLoh et al. Cell,
1983, vol. 33, 85-93 [0065]
\bulletPalmiter et al.
Science, 1983, vol. 222, 809-814
[0065]
\bulletDeNoto et al. Nucl.
Acids Res., 1981, vol. 9, 3719-3730
[0065]
\bulletWigler et al.
Cell, 1978, vol. 14, 725-732
[0066]
\bulletCorsaro; Pearson.
Somatic Cell Genetics, 1981, vol. 7,
603-616 [0066]
\bulletGraham; Van der Eb.
Virology, 1973, vol. 52d, 456-467
[0066]
\bulletNeumann et al. EMBO
J., 1982, vol. 1, 841-845 [0066]
\bulletThilly. Mammalian Cell
Technology. Butterworth Publishers [0066]
\bullet More Gene Manipulations in Fungi.
Academic Press, 1991 [0068]
\bulletGraham et al. J. Gen.
Virol., 1977, vol. 36, 59-72 [0069]
\bulletWaechter; Baserga.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79,
1106-1110 [0069]
\bulletUrlaub; Chasin. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77,
4216-4220 [0069]
\bulletWhitelaw et al.
Biochem. J., 1992, vol. 286, 31-39
[0072]
\bulletBrinster et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85,
836-840 [0073]
\bulletPalmiter et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88,
478-482 [0073]
\bulletWhitelaw et al.
Transgenic Res., 1991, vol. 1, 3-13
[0073]
\bulletHeijne. Nucl. Acids
Res., 1986, vol. 14, 4683-4690 [0074]
\bulletJaenisch. Science,
1988, vol. 240, 1468-1474 [0075]
\bulletBradley et al.
Bio/Technology, 1992, vol. 10, 534-539
[0075]
\bulletHogan et al.
Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, 1986 [0075]
\bulletSimons et al.
Bio/Technology, 1988, vol. 6, 179-183
[0075]
\bulletWall et al. Biol.
Reprod., 1985, vol. 32, 645-651
[0075]
\bulletBuhler et al.
Bio/Technology, 1990, vol. 8, 140-143
[0075]
\bulletEbert et al.
Bio/Technology, 1991, vol. 9, 835-838
[0075]
\bulletKrimpenfort et al.
Biotechnology, 1991, vol. 9, 844-847
[0075]
\bulletWall et al. J. Cell.
Biochem., 1992, vol. 49, 113-120
[0075]
\bulletGordon et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77,
7380-7384 [0075]
\bulletGordon; Ruddle.
Science, 1981, vol. 214,1244-1246
[0075]
\bulletPalmiter; Brinster.
Cell, 1985, vol. 41, 343-345
[0075]
\bulletBrinster et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82,
4438-4442 [0075]
\bulletHiatt. Nature,
1990, vol. 344, 469-479 [0076]
\bulletEdelbaum et al. J.
Interferon Res., 1992, vol. 12, 449-453
[0076]
\bulletSijmons et al.
Bio/Technology, 1990, vol. 8, 217-221
[0076]
\bullet Protein Purification. VCH
Publishers, 1989 [0077]
\bulletWakabayashi et al. J.
Biol. Chem., 1986, vol. 261,11097-11108
[0077]
\bulletThim et al.
Biochemistry, 1988, vol. 27, 7785-7793
[0077] [0102] [0104] [0106] [0108]
\bulletScopes, R. Protein
Purification. Springer-Verlag, 1982
[0077]
\bulletOsterud et al.
Biochemistry, 1972, vol. 11, 2853-2857
[0079]
\bulletHedner; Kisiel. J.
Clin. Invest., 1983, vol. 71, 1836-1841
[0079]
\bulletKisiel; Fujikawa.
Behring Inst. Mitt., 1983, vol. 73,
29-42 [0079]
\bulletBjoem et al. Research
Disclosure, 1986, vol. 269, 564-565
[0079]
\bulletMonroe et al. Brit.
J. Haematol., 1997, vol. 99, 542-547
[0083]
\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences.
Mack Publishing Company, 1990 [0091]
\bullet PCR Protocols. Academic Press,
1990 [0101]
\bulletPersson; Nielsen.
FEBS Lett., 1996, vol. 385, 241-243
[0102] [0104] [0106] [0108]
SEC ID nº. 1 (la secuencia de aminoácidos del
Factor de coagulación VII nativo humano):
\vskip1.000000\baselineskip
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La Figura 2 muestra la región
300-322 del Factor de coagulación VII humano y la
correspondiente región de serina proteasas
homólogas:
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Claims (13)
1. Una variante del Factor de coagulación VII
humano, en donde el residuo Leu en la posición 305 ha sido
sustituido con Val o Ile, en donde un máximo de 20 residuos de
aminoácidos en las restantes posiciones en el dominio de la
proteasa han sido sustituidos y en donde la proporción entre la
actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido nativo
del factor VII es de al menos aproximadamente 1.25 cuando es probado
en un ensayo de hidrólisis in vitro, en el que el Factor
VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del factor VIIa son
evaluados en paralelo, en una placa de microtitulación, usando 1 mM
de
D-Ile-pro-Arg-P-nitroanilina,
Factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, a un pH
de 7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de
suero bovino y en el que la absorbencia a 405 nm es usada para
calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del
Factor VII y factor VIIa de tipo salvaje.
2. La variante del factor de coagulación VII
humano según la reivindicaciones 1, en donde al menos un residuo,
en la(s) posición(es) 274 y/o 300-304
y/o 306-312, ha sido sustituido.
3. La variante del factor de coagulación humano
según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en
donde al menos el residuo en la posición 274 ha sido
sustituido.
4. La variante del factor de coagulación VII
humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
en donde al menos un residuo en la(s) posición(es)
300-304 ha sido sustituido.
5. La variante del factor de coagulación VII
humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-4,
en donde al menos un residuo en la(s) posición(es)
306-312 ha sido sustituido.
6. La variante del factor de coagulación VII
humano según la reivindicación 3, en donde el residuo Ala en la
posición 274 ha sido sustituido por Met o Leu o Lys o Arg; y/o el
residuo Arg en la posición 304 ha sido sustituido por Tyr o Phe o
Leu o Met; y/o el residuo Met en la posición 306 ha sido sustituido
por Asp o Asn; y/o el residuo Asp en la posición 309 ha sido
sustituido por Ser o Thr.
7. La variante del factor de coagulación VII
humano según la reivindicación 1, en donde el residuo Leu en la
posición 305 es el único residuo que ha sido sustituido.
8. Un constructo ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del Factor
VII que se define en cualquiera de las reivindicaciones
1-7.
9. Un vector recombinante que comprende el
constructo de ácido nucleico que se define en la reivindicación
8.
10. Una célula huésped recombinante que
comprende el constructo de ácido nucleico que se define en la
reivindicación 8 o el vector que se define en la reivindicación
9.
11. Un método para producir la variante del
factor de coagulación VII humano que se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, el método que comprende
cultivar una célula, como se define en la reivindicación 10, en un
medio de crecimiento apropiado bajo condiciones que permiten la
expresión del constructo de ácido nucleico, y recuperar el
resultante polipéptido del medio de cultivo.
12. Una composición farmacéutica que comprende
una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde la Leu
en la posición 305 ha sido sustituida por Val o Ile, en donde un
máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones en
el dominio de la proteasa han sido sustituidos y en donde la
proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del
polipéptido nativo del factor VII es de al menos aproximadamente
1.25 cuando es probaba en un ensayo de hidrólisis in vitro,
en el que el factor VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del
factor VIIa son evaluados en paralelo, en una placa de
microtitulación, usando 1 mM de
D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina,
factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, un pH de
7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de
suero bovino y en el cual la absorbencia a 405 nm es usada para
calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del
factor VII y factor VIIa de tipo salvaje; y, opcionalmente un
portador farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición farmacéutica que comprende
una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde la Leu
en la posición 305 ha sido sustituida por Val o Ile, en donde un
máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones en
el dominio de la proteasa han sido sustituidos y en donde la
proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del
polipéptido nativo del factor VII es de al menos aproximadamente
1.25, cuando es probado en el ensayo de hidrólisis in vitro,
en el que el factor VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del
factor VIIa son evaluados en paralelo, en una placa de
microtitulación, usando 1 mM de
D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina,
factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, un pH de
7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de
suero bovino y en el cual la absorbencia a 405 nm es usada para
calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del
Factor VII y Factor VIIa de tipo salvaje, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de episodios de sangrado o para la
intensificación del sistema hemostático normal.
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|---|---|---|---|
| DK200000734 | 2000-05-03 | ||
| DKPA200000734 | 2000-05-03 | ||
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Publications (1)
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01927644T Expired - Lifetime ES2353646T3 (es) | 2000-05-03 | 2001-05-01 | Variantes del factor de coagulación vii humano. |
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2001
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