ES2293662T3 - Purificacion de neurotrofinas. - Google Patents

Abstract

PROCEDIMIENTOS DE PURIFICACION A GRAN ESCALA DE NEUROTROFINAS INCLUYENDO EL FACTOR DE CRECIMIENTO NERVIOSO (FCN) MADURO ADOPTADO DEL USO CLINICO. LOS PROCEDIMIENTOS QUE UTILIZAN MEDIOS QUE PERMITEN LA SEPARACION DE LAS NEUROTROFINAS DE VARIAS FORMAS MENOS DESEABLES, MAL TRATADAS, MAL PLEGADAS, GLICOSILADAS O QUE NO TIENEN EL TAMAÑO ADECUADO O LA CARGA ADECUADA. SE DESCRIBEN TAMBIEN COMPOSICIONES DE NEUROTROFINAS QUE COMPRENDEN EL FCN MADURO, QUE ESTAN DESPROVISTAS DE ESTAS VARIANTES.

Description

Purificación de neurotrofinas.

Campo técnico

Esta invención se refiere a un procedimiento mejorado para purificar neurotrofinas, particularmente aquéllas en la familia NGF, más particularmente el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-4/5 (NT-4/5), y la neurotrofina-3 (NT-3), de variantes, impurezas y contaminantes asociados con las mismas, particularmente cuando se producen mediante cultivo de células bacterianas o de mamífero.

Antecedentes

La producción de grandes cantidades de polipéptidos y proteínas biológicamente activos, relativamente puros, es importante económicamente para la fabricación de formulaciones, enzimas y otros especialidades químicas, humanas y animales. Para la producción de muchas proteínas, las técnicas del ADN recombinante han pasado a ser el procedimiento escogido, porque pueden expresarse grandes cantidades de proteínas exógenas en células huésped de mamífero, y en bacterias, y en otras células huésped.

La estructura primaria de un NGF de mamífero (NGF de ratón) fue elucidada por primera vez por Angeletti y Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68:2417 (1971). La estructura primaria de su precursor, pre-pro-NGF, se ha deducido de la secuencia de nucleótidos del ADNc del NGF de ratón (Scott et al., Nature, 302:538 (1983); Ullrich et al., Nature, 303:821 (1983)).

También se ha identificado el gen homólogo del NGF humano (hNGF) (Ullrich, Symp. on Quant. Biol., Cold Spring Harbor 48:435 (1983); Patente Estadounidense nº 5.288.622, concedida el 22 de febrero de 1994, la cual se incorpora en la presente invención por referencia). Su homología con el NGF del ratón es aproximadamente del 90% y 87% respectivamente a nivel de secuencia de aminoácidos y de nucleótidos. Debido a la escasez del NGF humano de origen natural, éste no se ha preparado a partir de fuentes naturales en cantidades suficientes para caracterizarlo bioquímicamente con extremo detalle.

Desde entonces, se han identificado factores neurotróficos adicionales relacionados con el NGF. Estos incluyen el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Leibrock, et al., Nature, 341:149-152 (1989)), la neurotrofina-3 (NT-3) (Kaisho, et al., FEBS Lett., 266:187 (1990); Maisonpierre, et al., Science, 247:1446 (1990); Rosenthal, et al., Neuron, 4:767 (1990)), y la neurotrofina-4/5 (NT-4/5) (Berkmeier, et al., Neuron, 7:857-866 (1991)). El GDNF, un miembro distante de la superfamilia del TGF-\beta, y la neurturina ("NTN") son dos potentes factores de supervivencia, recientemente identificados, estructuralmente relacionados, de las neuronas del sistema nervioso central y del sistema sensorial simpático (Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993); Henderson et al., Science, 266:1062-1064 (1994); Buj-Bello et al., Neuron, 15:821-828 (1995); Kotzbauer et al., Nature, 384:467-470 (1996)).

La producción de proteína recombinante implica transfectar las células huésped con ADN que codifica la proteína, y hacer crecer las células en condiciones que favorecen la expresión de la proteína recombinante. La procariota E. coli es un huésped favorecido porque puede conseguirse que produzca proteínas recombinantes con rendimientos elevados a bajo coste. Existen numerosas patentes estadounidenses sobre la expresión bacteriana en general, incluyendo la Patente Estadounidense nº 4.565.785 sobre una molécula de ADN recombinante que comprende un gen bacteriano para una proteína portadora extracelular o periplásmica y un gen no bacteriano; la Patente Estadounidense nº 4.673.641 sobre la coproducción de un polipéptido ajeno con un polipéptido formador de agregados; la Patente Estadounidense nº 4.738.921 sobre un vector de expresión con un promotor/operador trp y una fusión trp LE con un polipéptido tal como el IGF-1; la Patente Estadounidense nº 4.795.706 sobre secuencias de control de la expresión para incluirlas con una proteína ajena; y la Patente Estadounidense nº 4.710.473 sobre plásmidos de ADN circular específicos, tales como los que codifican el IGF-I.

Los compuestos bio-farmacéuticos manipulados genéticamente típicamente se purifican a partir de un sobrenadante que contiene una variedad de diversos contaminantes de la célula huésped. En concreto, se ha descrito el NGF purificado hasta diferentes niveles, con varios grados de esfuerzo y éxito, usando un cierto número de procedimientos diferentes. Consultar, por ejemplo, Longo et al., IBRO Handbook, vol. 12, pp 3-30 (1989); Patente Estadounidense nº 5.082.774, la cual describe la producción del NGF en células CHO; Bruce and Heinrich (Neurobio. Aging, 10:89-94 (1989); Schmelzer et al., J. Neurochem., 59:1675-1683 (1992); Burton et al., J. Neurochem., 59:1937-1945 (1992).

Kolbeck et al (Eur J. Biochem, 225:995-1003 (1994)) describen que, cuando el BDNF y la NT-3 se purifican mediante cromatografía en fase inversa, estas neurotrofinas eluyen como dos picos distintos. Belew y Ebendal (Exp Cell Res, 167:550-558 (1986) describen la purificación parcial de un factor similar al NGF, a partir de extractos de embrión de pollo, mediante cromatografía de intercambio catiónico seguida por cromatografía de interacción hidrofóbica sobre octil-sulfuro agarosa. Estos esfuerzos han sido principalmente a escala de laboratorio.

Sin embargo, el aislamiento preparativo del NGF humano recombinante que resulte en una pureza farmacéutica y un rendimiento elevado, esencialmente libre de variantes, ha eludido el estado de la técnica.

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En consecuencia, hay una necesidad en el estado de la técnica de un protocolo eficiente para separar selectivamente las neurotrofinas, particularmente el NGF y la familia NGF de neurotrofinas, de sus variantes y otros moléculas, y de otros polipéptidos con un pI elevado. El procedo de purificar las neurotrofinas a gran escala debería ser aplicable al material de partida procedente de fuentes variables, incluyendo caldos de fermentación, bacterias o células de mamífero lisadas, para suplir las necesidades clínicas. Además, puesto que los presentes inventores han descubierto variantes de neurotrofina previamente desconocidas y difíciles de separar, por ejemplo, variantes del NGF, los procedimientos presentados en la presente invención son particularmente útiles para proporcionar cantidades comercialmente útiles de neurotrofinas recombinantes, incluyendo el NGF humano (rhNGF), la rhNT-3, y la rhNT-4/5, y mutantes genéticamente manipulados deseables de los mismos, que están sustancialmente libres de variantes no deseables. Estos y otros objetivos de la invención serán ahora evidentes para alguien con la formación ordinaria en el campo.

Resumen

En una realización de la invención, se proporciona un proceso para purificar una neurotrofina, particularmente una de la familia NGF, incluyendo el NGF, la NT-3, la NT-4/5, y el BDNF, las cuales comparten el reconocimiento por parte de una familia altamente homogénea de receptores (trks), preferiblemente el rhNGF, la rNT-3, la rhNT-4/5, y el rhBDNF, o formas deseables genéticamente manipuladas de las mismas, mediante el uso de la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). En vista del descubrimiento, por parte de los presentes inventores, de que ciertas variantes no deseables de las neurotrofinas surgen a partir de la producción recombinante de una neurotrofina, tal como se describe en la presente invención, el uso de la HIC puede separar formas químicamente diferentes, o incluso plegadas erróneamente, de una neurotrofina respecto la neurotrofina deseada intacta, correctamente plegada. Las variantes que pueden eliminarse son aquéllas que difieren de la neurotrofina madura, correctamente plegada, en su hidrofobicidad, incluyendo las secuencias precursoras parcialmente procesadas, las formas maduras glicosiladas y las que contienen el precursor (cuando proceden del cultivo de células eucariotas), y las variantes plegadas erróneamente y parcialmente plegadas (procedentes generalmente del cultivo de células bacterianas, cuando se usan pasos de plegado in vitro). Por ejemplo, la HIC es particularmente útil para eliminar secuencias precursoras parcialmente procesadas del NGF, especies glicosiladas del NGF, y precursores (cuando proceden del cultivo de células eucariotas), y variantes plegadas erróneamente y parcialmente plegadas (generalmente procedentes del cultivo de células bacterianas y de pasos de plegamiento in vitro), a partir de mezclas de NGF maduro. El NGF tiene un sitio de glicosilación unido a N en Asn45. En el caso de la rhNT-4/5 plegada de nuevo, expresada en bacterias, la HIC separa la NT-4/5 plegada correctamente de las formas plegadas incorrectamente. Como resultado del proceso descrito en la presente invención, la neurotrofina está esencialmente libre de estas variantes. Para la purificación de neurotrofinas, el grupo funcional de la resina de HIC es preferiblemente un grupo fenilo, mientras que los grupos octilo y butilo pueden ser útiles. Las realizaciones particularmente preferidas incluyen las resinas de HIC: "Phenyl Toyopearl", "Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution", "TSK-Phenyl 5PW", o similares. El procedimiento comprende cargar la mezcla sobre una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica, y eluir la neurotrofina humana recombinante de la resina con un tampón de elución que contiene un solvente orgánico en una concentración entre el 5% y el 25% (v/v).

Otro proceso para purificar un neurotrofina descrita en la presente invención, particularmente una de la familia del NGF, preferiblemente el rhNGF, la rNT-3, la rhNT-4/5, o formas genéticamente manipuladas y deseables de las mismas, es la cromatografía de intercambio catiónico preparativa, las cual separa variantes con carga modificada, tales como las formas oxidadas, isoasp, y desamidadas de las neurotrofina madura. Las realizaciones particularmente preferidas usan las resinas "SP-Sepharose High Performance", "Fractogel EMD SO3", o de ácido poliaspártico, de las cuales es particularmente preferida la "PolyCAT A". A gran escala las más preferidas son las resinas "SP-Sepharose High Performance" o "Fractogel EMD SO3".

La invención puede usar tanto la cromatografía de HIC como la de intercambio catiónico para preparar una composición de una neurotrofina deseada, por ejemplo, el NGF maduro recombinante, preferiblemente el NGF humano, que sea sustancialmente homogénea, es decir, que carezca sustancialmente tanto de variantes de carga como de procesado, por ejemplo, variantes plegadas erróneamente y variantes químicas, y que también sea sustancialmente pura en relación al contenido de proteína.

Otro proceso para separar neurotrofinas descrito en la presente invención, particularmente las de la familia del NGF, preferiblemente el NGF humano recombinante, la NT-3, la NT-4/5, y sus formas genéticamente manipuladas deseables, de sus variantes no deseables, por ejemplo, variantes de la fermentación, cortadas por proteasas, variantes de glicosilación, variantes plegadas erróneamente, es por medio de la cromatografía líquida de fase inversa. Más preferiblemente, el NGF es la forma homodimérica 120/120 o 118/118. Como resultado del proceso descrito en la presente invención, la neurotrofina está preferiblemente esencialmente libre de estas variantes.

El proceso para purificar neurotrofinas, particularmente aquéllas de la familia del NGF, de variantes relacionadas, puede usar condiciones de elución que impliquen un pH fisiológico.

El proceso para purificar una neurotrofina puede resultar en una mejora considerable de su homogeneidad.

El proceso para separar las neurotrofinas pertenecientes a la familia del NGF de las variantes de las mismas puede comprender:

a)

cargar un tampón que contiene la neurotrofina y su variante, a un pH de aproximadamente 5 a 8, sobre una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica;

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b)

lavar la columna;

c)

eluir la neurotrofina con un tampón, a un pH de aproximadamente 5 a 8, que contiene un solvente orgánico a una concentración de entre el 5% y el 25% (v/v);

d)

cargar el eluyente que contiene la neurotrofina sobre una columna de cromatografía de intercambio catiónico, a un pH desde aproximadamente 5 hasta 8; y e) eluir la neurotrofina de la columna con un tampón con un gradiente de sal, a un pH de aproximadamente 5 a 8, preferiblemente a pH 6. La neurotrofina es preferiblemente el rhNGF.

En otra realización, la invención proporciona un proceso para purificar una neurotrofina humana recombinante, el cual comprende:

a)

cargar una mezcla, que comprende la neurotrofina humana recombinante y sus variantes, sobre una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica, a pH 5 a 8;

b)

lavar la resina con un tampón a pH 5 a 8;

c)

eluir la neurotrofina humana recombinante con un tampón a un pH de 5 a 8, el cual contiene un solvente alcohólico o aprótico polar a una concentración del 5 al 25% (v/v);

d)

cargar el eluyente que contiene la neurotrofina humana recombinante sobre una resina de cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, a un pH de 5 a 6; y e) eluir la neurotrofina humana recombinante de la resina de cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones con un tampón a un pH de 5 a 6, el cual contiene un catión con una concentración de 0,2 a 0,5 M.

También se describe en la presente invención un paso de cromatografía en gel de sílice que elimina eficientemente las proteínas de la célula huésped de la fracción de neurotrofina, la cual es preferiblemente una fracción del NGF.

También se describe en la presente invención un paso de procesado en el que el NGF de 120 aminoácidos se somete a un tratamiento, con una proteasa parecida a la tripsina, para eliminar selectivamente el dipéptido RA terminal del extremo C-terminal VRRA, para rendir la especie 118. Se prefiere una columna de tripsina inmovilizada.

La presente solicitud también describe la composición y formulación de neurotrofina preparada mediante los procesos de la invención, y los usos de la composición y formulación. Se proporciona una composición de neurotrofina que es sustancialmente homogénea, es decir, que carece sustancialmente tanto de variantes de procesado como de carga, por ejemplo, variantes plegadas erróneamente o variantes químicas, y es también sustancialmente pura con respecto al contenido de proteína. Preferiblemente, en esta forma se proporcionan un NGF humano maduro, una NT-3 de rata o humana madura, y una NT-4/5 humana madura. En una realización preferida, el NGF es la especi 120, y más preferiblemente la forma 118, lo más preferiblemente como un homodímero, por ejemplo, 118/118.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 ilustra un cromatograma en SP-Sepharose HP. Se cargó una mezcla que contenía el NGF, procedente de una fermentación de 12 kL, después de su cromatografía HIC, sobre una resina "SP-Sepharose High Performance" (dimensiones de la columna, 1,0 \times 35 cm; un volumen de lecho de 27,5 ml) de la resina 25 omnifit SPSHP. El tampón A era NaCl 0,2 M, succinato 20 mM, pH 6,0 (23 ms). El tampón B era NaCl 0,7 M, succinato 20 mM, pH 6,0 (63 ms). La columna se equilibró primero con el Tampón A. La mezcla de HIC de 345 ml a 0,24 mg/ml se ajustó hasta 25 mM de succinato, pH 6,0 (17 ms), de los cuales 362 ml se cargaron proporcionando una carga de resina de 3 mg/ml; se cargaron 82,5 mg de NGF. La velocidad de carga fue de 40 cm por hora. El NGF se eluyó usando un gradiente con un volumen de 22 columnas, del 30% al 80% de Tampón B (NaCl de 0,35 a 0,60 M; de 37 a 57 ms). La velocidad de elución era de 60 cm por hora. Las unidades de absorbancia (280 nm) y los mS/cm se representaron respecto al volumen de elución en ml. Se determinaron las fracciones que contenían NGF y se juntaron. En este caso, se juntaron las fracciones 43 a 60 para obtener una muestra de 99 ml a 0,38 mg/ml de NGF, proporcionando una recuperación de aproximadamente el 46%.

La Figura 2 ilustra un análisis mediante SP-NPR HPLC de intercambio catiónico (HPIEX) del grupo de la Phenyl Sepharose Fast Flow y del grupo de la SP-Sepharose HP. Se identifican los cromatogramas de cada grupo.

La Figura 3 ilustra un análisis mediante C4 RP-HPLC de fracciones seleccionadas (grupo principal, extremo anterior y extremo posterior del grupo del pico principal) procedentes del paso de cromatografía con "SP-Sepharose HP". Las tres señales principales se solapan y corresponden a lo indicado. Como puede observarse, el pico principal (que contiene el NGF maduro) está separado de los varios picos menores que contienen variantes del NGF.

La Figura 4 ilustra la secuencia del prepro-NGF humano (SEQ ID NO: 1). En la figura se indica el primer aminoácido del NGF maduro (posición 1) y el último aminoácido de la forma 120 NGF (posición 120). Una secuencia de aminoácidos del NGF preferida es la de la forma 118 madura (desde la posición 1 hasta la posición 118). También se muestran las formas variantes: madura 120 (posición 1 a la posición 120); madura 117 (posición 1 a la posición 117); R120 (posición -1 a la posición 120); y los sitios para otros procesamientos erróneos que ocurren en los extremos N- y C-terminal, incluyendo las variantes madura 114 (aminoácidos 1 a 114), 115 (aminoácidos 1 a 115) y 117 (aminoácidos 1 a 117). Una variante procesada erróneamente principal, proteolíticamente mal procesada, tiene un corte N-terminal entre los aminoácidos R(-39) y S(-38) en la secuencia pro del NGF. La Met de iniciación más probable está subrayada. Otras variantes N-terminales incluyen las formas truncadas del NGF, teniendo las más comunes un corte entre los aminoácidos H8 y R9 y entre R9 y G10.

La Figura 5 ilustra las secuencias de aminoácidos de las neurotrofinas: NGF humano (SEQ ID NO: 2), NGF de ratón (SEQ ID NO: 3), BDNF (SEQ ID NO: 4), NT-3 (SEQ ID NO: 5) y NT-4/5 (SEQ ID NO: 6). Las regiones encuadradas indican las regiones homólogas que contienen cisteínas implicadas en el motivo del nudo de cisteína (De Young et al., Protein Sci., 5 (8):1554-66 (1996)).

La Figura 6 ilustra el patrón de cromatografía de la rhNT-4/5 en columna de resina DEAE-Sepharose Fast Flow (DEFF). El cromatograma marcado "NT45DE1:1_UV" es una medición de la absorbancia UV a 280 nm. El cromatograma marcado "NT45DE1:1_Condl" es una medición de la conductividad de las fracciones eluidas. Las fracciones que contenían neurotrofina agrupadas se indican mediante la flecha horizontal marcada "Agrupadas".

La Figura 7 ilustra el patrón de cromatografía de la rhNT-4/5 en columna de resina SP-Sepharose Fast Flow. El cromatograma marcado "NT45SFF1:1_UV" es una medición de la absorbancia UV a 280 nm. El cromatograma marcado "NT45SFF1:1_Condl" es una medición de la conductividad de las fracciones eluidas. Las fracciones que contenían neurotrofina agrupadas se indican mediante la flecha horizontal marcada "Agrupadas".

La Figura 8 ilustra un típico patrón de cromatografía preparativa C4-RP-HPLC de la rhNT-4/5 en las condiciones descritas en el texto. Se monitorizó la absorbancia a 280 nm. Las fracciones que contenían neurotrofina agrupadas se indican con una flecha horizontal marcada "Agrupadas".

La Figura 9 proporciona un patrón de cromatografía de HPLC analítica de muestras de la NT-4/5 monitorizadas durante el replegado en los instantes indicados. Las condiciones de la columna se describen en el texto. "NT-4/5 Std." indica el patrón de elución de una NT-4/5 intacta, correctamente plegada, usada como estándar. El patrón marcado "SSFF (0.5m)" muestra el análisis de la NT-4/5 eluida con NaCl 0,5 M de la columna S-Sepharose Fast Flow antes del replegado. A medida que la NT-4/5 se repliega, el patrón de elución se aproxima al del estándar.

La Figura 10 ilustra un cromatograma que muestra la separación de la NT-4/5 correctamente plegada, intacta, de las variantes plegadas erróneamente, sobre una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, columna de Phenyl Toyopearl 650M. Las variantes plegadas erróneamente que son menos hidrofóbicas que la NT-4/5 correctamente plegada eluyen en el flujo inicial, mientras que las variantes plegadas erróneamente (Pico B) que son más hidrofóbicas eluyen en una concentración de solvente orgánico superior a la necesaria para eluir la NT-4/5 correctamente plegada (Pico A).

La Figura 11 ilustra el patrón de elución de la NT-4/5 y sus variantes a partir de una resina de intercambio catiónico, la SP-Sepharose. Se monitorizó la absorbancia a 280 nm. El Pico A contiene las variantes carbamiladas y recortada, mientras que el Pico B contiene la NT-4/5 correctamente plegada, intacta. Las fracciones que contenían NT-4/5 agrupadas se indican mediante la flecha horizontal marcada "Agrupadas".

La Figura 12 ilustra un típico patrón de cromatografía preparativa con resina "poly CAT A" de la rhNT-4/5 en las condiciones descritas en el texto.

La Figura 13 ilustra un análisis PAGE al 16% de SDS (sistema Tris-glicina, vertido previamente, de Novex, Inc., San Diego, CA), en condiciones reductoras, para verificar la pureza y homogeneidad de las muestras tomadas a partir de los pasos indicados del proceso de purificación de la rhNT4/5 descrito en el texto. El gel se tiñó con Coomassie-R250 para detectar las proteínas (Andrews, Electrophoresis, Oxford University Press: Nueva York, 1986). El carril marcado "carga en DE" contiene una muestra de la mezcla PEI que se cargó sobre la columna de DE-Sepharose Fast Flow; el carril marcado "DE FT" contiene una muestra del flujo inicial procedente de la columna de DE-Sepharose Fast Flow; el carril "Grupo S" contiene una muestra de las fracciones agrupadas que contenían NT-4/5 eluidas de las columna de resina S-Sepharose Fast Flow, antes del replegado; el carril "Grupo replegadas" contiene una muestra del grupo una vez se completó el replegado; el carril "Grupo C4" contiene una muestra de las fracciones agrupadas después de la C4 RP-HPLC preparativas; y el carril "Grupo PolyCAT A" contiene una muestra procedente de las fracciones de NT-4/5 procedentes de la columna de HPLC PolyCAT A.

La Figura 14 ilustra el patrón de absorbancia UV de las fracciones procedentes de la cromatografía en S-Sepharose Fast Flow de una mezcla que contenía rhNT-3 sulfoniladas, producidas mediante bacterias.

La Figura 15 ilustra la cromatografía de intercambio catiónico con Macroprep High S de una mezcla que contenía formas replegadas in vitro de la rhNT-3. La resina se adquirió a Biorad. Las dimensiones de la columna eran 9 \times 9 cm. Se cargó un grupo SSFF de 700 ml, que contenía rhNT-3 replegada (después de 36 horas de replegado), pH 6,8, sobre la columna Macroprep a un flujo de aproximadamente 310 ml/min. Las condiciones se indican en el texto.

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La Figura 16 ilustra una cromatografía (cromatografía de interacción hidrofóbica) con "Phenyl Sepharose Fast Flow High Substitution" de rhNT-3 replegada, purificada mediante intercambio catiónico, para eliminar variantes plegadas erróneamente.

La Figura 17 ilustra una cromatografía con SP-Sepharose High Performance del grupo HIC-rhNT-3.

Descripción detallada Definiciones

Tal como se usa en la presente invención, "neurotrofina" se refiere a una neurotrofina, preferiblemente una neurotrofina de la familia del NGF, incluyendo el NGF, la NT-3, la NT-4/5, y el BDNF, procedente de cualquier especie, incluyendo la múrida, bovina, ovina, porcina, equina, aviaria, y preferiblemente la humana, en su secuencia nativa o en una forma genéticamente manipulada, y procedente de cualquier fuente, sea natural, sintética o producida de de forma recombinante. Por ejemplo, el "NGF" se refiere a un factor de crecimiento nervioso procedente de cualquier especie, incluyendo la múrida, bovina, ovina, porcina, equina, aviaria, y preferiblemente la humana, en su secuencia nativa o en una forma variante genéticamente manipulada, y procedente de cualquier fuente, sea natural, sintética o producida de de forma recombinante. Preferiblemente, la neurotrofina se produce de forma recombinante. En un procedimiento preferido, la neurotrofina se clona y se expresa su ADN, por ejemplo, en células de mamífero, en células bacterianas. Los procesos y procedimientos enseñados en la presente invención pueden aplicarse también a las neurotrofinas GDNF y la neurturina.

La preferida para su uso en humanos es el NGF madura, de secuencia nativa, humano, más preferiblemente una secuencia de 120 aminoácidos, e incluso más preferiblemente una secuencia de 118 aminoácidos. Más preferiblemente, este NGF de secuencia nativa se produce de forma recombinante. Las secuencias de aminoácidos preferidas para el pre-pro-NGF humano y el NGF maduro humano se proporcionan en la Patente Estadounidense nº 5.288.622, la cual se incorpora específicamente en la presente invención por referencia. La forma de 120 aminoácidos, sin modificaciones adicionales posteriores a la traducción, es una forma preferida en la forma homodimérica (es decir, 120/120). Es aún más preferida la forma 118, sin modificaciones adicionales posteriores a la traducción, particularmente como un homodímero (es decir, 118/118).

Por "sustancialmente pura" se quiere indicar un grado de pureza de la neurotrofina total, por ejemplo, el NGF, respecto la proteína total, en donde hay al menos un 70% de neurotrofina, más preferiblemente al menos un 80%, y aún más preferiblememente incrementando hasta al menos un 90%, 95% ó 99%. Una pureza particularmente preferida es al menos el 95%. Por "esencialmente pura" se quiere indicar que la composición es al menos un 90% o más pura para la neurotrofina deseada.

Por "sustancialmente libre de variante de neurotrofina" se quiere indicar una composición, en la cual el porcentaje de especies de neurotrofina deseadas respecto la neurotrofina total (incluyendo las especies de neurotrofina menos deseables) es al menos un 70% de las especies de neurotrofina deseadas, más preferiblemente al menos un 80%, y aún más preferiblemente incrementando hasta al menos un 90%, 93%, 95% ó 99%. Por "esencialmente libre" se quiere indicar que la composición contiene al menos un 90% o más de la neurotrofina deseada. Un nivel particularmente preferido es al menos un 95% de la neurotrofina deseada, por ejemplo, la especie de rhNGF 118/118 intacta, correctamente plegada. Las otras especies o formas no deseables pueden ser formas procesada erróneamente o variantes químicas, por ejemplo, variantes con la carga alterada, que resultan de los procesos de fermentación o purificación, o preferiblemente de la totalidad de los precedentes, tal como se describe en la presente invención. Por ejemplo, cuando el NGF se pliega in vitro después de su síntesis en bacteria, las "especies" o "variantes" pueden incluir las formas plegadas erróneamente o parcialmente plegadas.

Por variante "plegada erróneamente" se quiere indicar una variante de la neurotrofina que difiere de la neurotrofina en el emparejamiento de sus residuos cisteína, o en los residuos de cisteína concretos que están libres o bloqueados. Las variantes plegadas erróneamente pueden tener también el mismo emparejamiento de cisteínas que la neurotrofina, pero tener una conformación tridimensional diferente resultante del plegado erróneo.

Por variante "química" se quiere indicar una variante que difiere químicamente de la neurotrofina, por ejemplo, por tener una carga alterada, por carbamilación, desamidación, oxidación, glicosilación, o ruptura proteolítica.

Los tampones para las columnas de esta invención generalmente tienen un pH en el rango de aproximadamente 5 a 8. Los tampones que controlarán el pH dentro de este rango incluyen, por ejemplo, el citrato, succinato, fosfato, MES, ADA, BIS-TRIS Propano, PIPES, ACES, imidazol, ácido dietilmalónico, MOPS, MOPSO, TES, tampón TRIS tal como el TRIS-HCl, HEPES, HEPPS, TRICINE, glicinamida, BICINE, glicilglicina, y los tampones de borato. Un tampón preferido es el tampón MOPSO.

Tal como se usa en la presente invención, "alcoholes" y "solventes alcohólicos" se toman en el sentido de la terminología comúnmente usada para el alcohol, preferiblemente alcoholes con 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, o t-butanol, así como el glicerol, propilenglicol, etilenglicol, hexilenglicol, polipropilenglicol, y polietilenglicol, y lo más preferiblemente etanol o iso-propanol. Tales alcoholes son solventes que, cuando se añaden a una solución acuosa, incrementan la hidrofobicidad de la solución mediante la disminución de la polaridad de la solución.

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MOPSO es el ácido 3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico. HEPES es el ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico. El alcohol reactivo es 95 partes en volumen (alcohol especialmente desnaturalizado, fórmula 3A, y 5 partes en volumen de alcohol isopropílico). MES es el ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico. UF/DF significa ultrafiltración/diafiltración. TMAC es cloruro de tetrametilamonio. TEAC es cloruro de tetraetilamonio. NGF-120 significa factor de crecimiento nervioso 120/120 de longitud completa. NGF-118 significa molécula del NGF madura homodimérica de 118 residuos. NGF oxidado significa una molécula variante del NGF, el metsulfóxido_{37}, la cual se describe en la presente invención que es aproximadamente un 80% tan activa biológicamente como el NGF nativo, maduro. Isoasp NGF significa una molécula variante isomerizada del NGF, Asp93. NGF desamidado significa un NGF que tiene Asn45 convertida en Asp45. RNGF significa una molécula de NGF con un residuo arginina extra en su extremo N-terminal. CHO significa células ováricas de hámster chino.

Las resinas descritas en la presente invención incluyen: la MACROPREP HIGH S de intercambio catiónico (BIO-RAD Laboratories; intercambio catiónico fuerte; grupo funcional SO3; tamaño de partícula nominal de 50 \mum; tamaño de poro nominal de 1000 A); gel de sílice (sin derivar); "Phenyl Sepharose Fast Flow Low Substitution" (Pharmacia; agarosa al 6% altamente entrecruzada; tamaño de partículas de 45-165 micrones); SP-Sepharose HP (Pharmacia; agarosa al 6% altamente entrecruzada; tamaño de partículas de 34 micrones); Phenyl Toyopearl 650 M (TosoHaas; tamaño de partículas de 40-90 micrones); y Fractogel EMD SO3 - 650 S (EM Separations, una empresa estadounidense asociada de E. Merck (Germany); tamaño de partículas de 25-40 \mum).

Modos de realización de la invención

Las neurotrofinas pertenecen a una familia de proteínas pequeñas, básicas, que juegan un papel crucial en el desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso. El primer miembro identificado, y probablemente el mejor conocido, de esta familia es el factor de crecimiento nervioso (NGF). Consultar la Patente Estadounidense nº 5.169.762, concedida el 8 de diciembre de 1992. Recientemente se han identificado polipéptidos secuencialmente relacionados pero distintos, con funciones similares al NGF. Por ejemplo, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), también conocido como neurotrofina-2 (NT2), fue clonado y secuenciado por Leibrock et al. (Nature, 341:49-152 (1989)). Varios grupos identificaron un factor neurotrópico originalmente denominado factor neuronal (NF), y actualmente denominado neurotrofina-3 (NT-3). (Emfors et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87:5454-5458 (1990); Höhn et al., Nature, 344:339 (1990); Maisonpierre et al., Science, 247:1446 (1990), Rosenthal et al., Neuron, 4:767 (1990); Jones and Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8060-8064 (1990); Kaisho et al., FEBS Lett., 266:187 (1990)). Se ha identificado la neurotrofina-4/5 (denominada NT4 o NT5) (Hallbook et al., Neuron, 6:845-858 (1991); Berkmeier et al., Neuron, 7:857-866 (1991); Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 89:3060-3064 (1992)). La Patente Estadounidense nº 5.364.769, concedida el 15 de noviembre de 1994, describe la NT-4/5 humana y los procesos para su expresión recombinante, y se incorpora en la presente invención por referencia. También se han descrito neurotrofinas quiméricas y pantrópicas, tales como las descritas en la Patente Estadounidense nº 5.488.099, concedida el 30 de enero de 1996, en Urfer et al., EMBO J. 13(24):5896-909 (1994), y en WO 95/33829, publicada el 14 de diciembre de 1995 (incorporada en la presente invención por referencia), en la cual la neurotrofina se ha modificado para unirse a más de un receptor, o contiene una actividad de unión a receptor que normalmente no está presente de forma significativa en la neurotrofina nativa. Tienen un interés particular las neurotrofinas denominadas MNTS-1 y D15A NT3. Tienen también un interés particular las neurotrofinas que tienen un esqueleto de aminoácidos del NGF, pero modificado para unirse a receptores distintos del trkA, tales como el trkB o trkC. Se prefieren aquéllas en las que se han hecho sustituciones de aminoácidos del NGF con un aminoácido, procedente de una posición correspondiente en la NT-3, que es responsable de la unión al receptor trk por parte de la NT-3. Tales mutantes del NGF tienen una actividad unidora a receptor similar a la NT-3, a la vez que retienen los comportamientos farmacocinéticos y de purificación del NGF (Urfer, et al., Biochemistry, 36(16):4775-4781 (1997)). Estos mutantes del NGF pueden carecer también de actividad unidora al trkA (Shih et al., J. Biol. Chem., 269 (44):27679-86 (1994)). Tales mutantes del NGF son neurotrofinas particularmente preferidas para su uso en la invención descrita en la presente invención.

El aislamiento de una neurotrofina humana recombinante, por ejemplo, el rhNGF, implica la separación de la proteína de una una variedad de diversos contaminantes de la célula huésped. Cada paso implica tampones especiales que permiten que tenga lugar una separación suficiente. El paso de procesado final o penúltimo para una neurotrofina, está complicado por la presencia de diversas variantes de neurotrofinas que se co-purifican usando medios cromatográficos convencionales. Cuando se incluye un paso de replegado en el proceso de recuperación y purificación, las variantes incluyen formas plegadas erróneamente de la neurotrofina. Las variantes pueden incluir también aquéllas que difieren químicamente de la neurotrofina, tales como las formas carbamiladas, desamidadas o cortadas proteolíticamente. En el caso del NGF, estas especies consisten principalmente de formas diméricas - - -homodiméricas, por ejemplo, 120/120 ó 117/117 cuando se desea la 118/118, o heterodiméricas, por ejemplo 120/118, 117/118- - -, variantes modificadas químicamente - - -isoaspartato, mono-oxidadas, variantes de glicosilación, formas truncadas N-terminal o C-terminalmente, y dímeros de las mismas.

La invención posibilita la producción a gran escala de neurotrofinas, particularmente el rhNGF, en cantidades suficientes para los usos terapéuticos, tales como, por ejemplo, el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, las neuropatías periféricas, incluyendo las neuropatías asociadas a diabetes y SIDA, y similares.

A la vista de la similitud en secuencia y conformación entre el NGF y otras neurotrofinas, preferiblemente aquéllas en la familia del NGF, los procedimientos de la presente invención pueden aplicarse para preparar estas neurotrofinas sustancialmente libres de variantes procesadas erróneamente, plegadas erróneamente o plegadas parcialmente, de glicosilación, y/o carga. En la presente invención, se identifican resinas de columna y condiciones que son favorables para separar selectivamente las neurotrofinas de las variantes de las mismas y de otras variantes estrechamente relacionadas. Las neurotrofinas incluyen la NT-3, NT-4/5, NT-6, el BDNF, y las formas manipuladas, incluyendo las formas heterodiméricas, quiméricas o pantrópicas de las mismas. Preferiblemente las neurotrofinas son humanas o altamente homólogas de la secuencia de aminoácidos humana, preferiblemente más del 80%, más preferiblemente superiores al 90%, y los más preferible más del 95% homólogas de la secuencia humana. Una neurotrofina manipulada retendrá al menos el 50% de la función unidora al receptor trk de la neurotrofina nativa que imita, preferiblemente al menos el 75%, y más preferiblemente al menos el 80%. Esta formas manipuladas son aquéllas que retienen suficiente pI elevado o carácter hidrofóbico de la neurotrofina nativa para retener una prestación similar en los procesos descritos en la presente invención.

Tal como se describe más abajo, los procesos descritos en la presente invención se han aplicado de forma exitosa al rhNGF, la rhNT-3 y la rhNT-4/5. Por ejemplo, la rhNT-4/5, que se había preparado en E. coli, se aisló en cuerpos de inclusión, y se redujo y solubilizó a partir de los cuerpos de inclusión. La NT-4/5 reducida se purificó parcialmente mediante cromatografía con DE Sepharose Fast Flow y con S-Sepharose Fast Flow. El grupo de la S-Sepharose Fast Flow se plegó de nuevo durante 24 horas en un tampón que contenía guanidina. Las formas plegadas erróneamente de la NT-4/5 se eliminaron mediante cromatografía, tal como se describe en la presente invención, a gran escala. Las formas carbamiladas y recortadas (formas procesadas erróneamente) de la NT-4/5 se eliminaron mediante cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones mediante resina de HPLC PolyCat A o resina SP-Sepharose HP, en formato de columna, a gran escala. La rhNT-4/5 purificada se ultrafiltró y diafiltró en un tampón ácido para su formulación.

Una realización de la invención implica purificar una neurotrofina de sus variantes relacionadas, usualmente después de que la neurotrofina se haya purificado respecto de la mayoría de otras impurezas, típicamente al final o cerca del paso final, antes del desalado o diafiltración previo a la formulación. Las variantes relacionadas en la mezcla pueden incluir no sólo las variantes residuales procedentes de la fermentación, sino también las variantes producidas si la neurotrofina se degrada durante el almacenamiento o durante el procesado.

Las neurotrofinas apropiadas para su uso con las realizaciones de la invención pueden prepararse mediante cualquier medio, pero preferiblemente se preparan de forma recombinante. Las moléculas de ácido nucleico que codifique las neurotrofinas descritas en la presente invención están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, a través de la síntesis química usando la secuencia de ADN conocida, o mediante el uso de técnicas de clonación estándares conocidas por los especialistas en la técnica. Los clones de ADNc portadores de la neurotrofina, por ejemplo, la secuencia codificante del hNGF, pueden identificarse mediante el uso de sondas de hibridación oligonucleotídicas diseñadas específicamente en base a la secuencia conocida de la neurotrofina.

Una vez obtenida una molécula que tiene la secuencia codificante de la neurotrofina, la molécula se inserta en un vector de clonación apropiado para la expresión en la célula huésped escogida. El vector de clonación se construye para proporcionar las funciones reguladoras apropiadas requeridas para la transcripción, traducción y procesado eficiente de la secuencia codificante.

Si la neurotrofina se prepara de forma recombinante, las células huésped apropiadas para expresar el ADN que codifica la neurotrofina son las células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Las procariotas apropiadas para este propósito incluyen bacterias tales como las arqueobacterias y las eubacterias. Las bacterias preferidas son las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, enterobacteriaceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella; Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 4 1 P, descrita en DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989); Pseudomonas tales como P. aeruginosa; Streptomyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla; y Paracoccus. Los huéspedes E. coli apropiados incluyen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli 94 (ATCC 31.446), E. coli B, y E. coli X1776 (ATCC 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes.

En la presente invención se incorpora en su totalidad la publicación del PCT WO 95/30686 publicada el 16 de noviembre de 1995. La publicación es particularmente relevante por su descripción de la síntesis bacteriana y plegado in vitro del NGF. Los productos procedentes de ese proceso pueden someterse a los procedimientos de purificación de la presente invención.

También pueden emplearse células mutantes de cualquiera de las bacterias antes mencionadas. Por supuesto, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas tomando en consideración la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies de E. coli, Serratia, o Salmonella pueden usarse de forma conveniente como el huésped cuando se usan plásmidos bien conocidos, tales como el pBR322, pBR325, pACYA 177, o pKN410, para proporcionar el replicón. La cepa W3110 de E. coli es un huésped o progenitor de huésped preferido porqué es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos del ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del huésped, los ejemplos de tales huéspedes incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, la cual tiene el genotipo tonA \Delta completo; E. coli W3110 cepa 9E4, la cual tiene el genotipo tonA \Delta ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA \Delta E15 \Delta (argF-lac)169 \Delta degP \Delta ompT kanR; E. coli W31 10 cepa 37D6, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA \Delta E15 \Delta (argF-lac)169 \Delta degP \Delta ompT \Delta rbs7 ilvG kanR; E. coli W3110 cepa 40 B4, la cual es la cepa 37D6 con un mutación por supresión degP no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplasmática mutante y se describe en la Patente Estadounidense nº 4.946.783 concedida el 7 de agosto de
1990.

El NGF humano se ha expresado en E. coli. El aislamiento y secuenciación del gen que codifica la subunidad \beta del hNGF, y su expresión como una proteína heteróloga en E. coli, se describieron en la Patente Estadounidense nº 5.288.622. Las enseñanzas en ella son también apropiadas para proporcionar NGF humano madura producido en células de mamífero. Mediante el uso de técnicas recombinantes, se expresó el \beta-NGF humano libre de otras proteínas de mamífero. La expresión del hNGF en E. coli usando dos genes que contienen extremos amino-terminales alterados resultó en la expresión de una proteína fusionada, la cual fue descrita por Iwai et al., Chem. Pharm. Bull., 34:4724 (1986).

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de expresión apropiados para los vectores que codifican la neurotrofina. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería, es el más usado entre los microorganismos huéspedes que son eucariotas inferiores. Sin embargo, existe un cierto número de otros géneros, especies y cepas comúnmente disponibles y útiles en la presente invención, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140 (1981); EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (Patente Estadounidense nº 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia [EP 244.234]; Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289(1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)).

Las células huéspedes apropiadas para la expresión del ADN que codifica la neurotrofina pueden derivarse también de organismos multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de actividades de procesado y glicosilación complejas. En principio, cualquier cultivo de célula eucariota superior es apropiada, proceda de cultivo de vertebrado o invertebrado Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas y sus correspondientes células huéspedes de insecto permisivas, procedentes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Consultar, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et al., en Genetic Engineering, editores Setlow, J.K. et al., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985). Una diversidad de tales cepas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV, y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden usarse en la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. El NGF humano se ha producido en células de insecto, tal como se informa en la Patente Estadounidense nº 5.272.063, concedida el 21 de diciembre de 1993.

Los cultivos de células vegetales del algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden usarse como huéspedes. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante la incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, las cuales se han manipulado previamente para contener el ADN que codifica la neurotrofina. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el ADN que codifica la neurotrofina se transfiere a la célula vegetal huésped, de tal forma que se transfecta y, en condiciones apropiadas, expresa el ADN de la neurotrofina. Además, hay disponibles secuencias reguladoras y señal compatibles con las células vegetales, tales como el promotor de la nopalín sintasa y las secuencias señal de poliadenilación (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)). Además, los segmentos de ADN aislados de la región cadena arriba del gen 780 del T-DNA son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en tejidos vegetales que contienen ADN recombinante (EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989).

Son ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamífero útiles la línea CV1 renal de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en cultivos en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]; las células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl Acad Sci. USA, 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células renales de mono (CV1, ATCC CCL 70); las células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); y las células de carcinoma del cuello del útero humanas (HELA, ATCC CCL 2); las células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células hepáticas de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep G2). Un procedimiento preferido es la expresión en células CHO. El exón del NGF humano que contiene el prepro-NGF puede usarse para conseguir la expresión de NGF maduro, secretado (incluyendo las formas 118 y 120) usando promotores y vectores apropiados (Patente Estadounidense nº 5.288.622). Los cultivos de células CHO estables, transfectadas establemente, y que secretan formas maduras del NGF, son útiles en la invención como se discute en los Ejemplos en la presente invención.

Las células huéspedes se transfectan y preferiblemente transforman con los vectores de expresión o clonación descritos más arriba, y se cultivan en medio nutritivo convencional, modificado según sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. La transfección se refiere a la captura de un vector de expresión por parte de una célula huésped, sin importar si de hecho se expresa algún secuencia codificante. Hay numerosos procedimientos de transfección conocidos por el especialista ordinariamente capacitado, por ejemplo, el CaPO_{4} y la electroporación. La transfección exitosa generalmente se reconoce cuando ocurre cualquier indicación de la operación de este vector dentro de la célula huésped.

Transformación significa introducir ADN en un organismo de tal forma que el ADN es replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o la electroporación, se usan generalmente con los procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales en forma de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Además, las plantas podrían transformarse usando el tratamiento con ultrasonidos tal como se describen en WO 91/00358, publicada el 10 de enero de 1991.

Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas huéspedes de células de mamífero han sido descritos por Axel en la Patente Estadounidense nº 4.399.216, concedida el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también podrían usarse otros procedimientos para introducir el ADN en las células, tales como mediante la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, por ejemplo, el polibreno, la poliornitina, etcétera. Para información sobre varias técnicas para transformar células de mamífero, consultar Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Preferiblemente, el gen para el hNGF se inserta en el vector de forma que tenga disponible un codón de iniciación de metionina, preferiblemente uno de los dos codones de iniciación de metionina identificados por Ullrich et al., Nature, 303:821-825 (1983). El gen del hNGF (Ullrich, et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, p. 435 (1983); Patente Estadounidense nº 5.288.622) tiene dos metioninas prácticamente adyacentes, que es probable que se utilicen como codones de inicio de la traducción (la posición 1 se refiere al residuo serina N-terminal del hNGF maduro). Por contra, el ADNc para NGF de la glándula submaxilar del ratón, el más detalladamente estudiado de los factores de crecimiento nerviosos, tiene una metionina en la posición -187, además de aquéllas en las posiciones -121 y -119. En una realización preferida para la expresión en células de mamífero, se presenta la secuencia
prepro-NGF.

Si se usan células procariotas para producir neurotrofina, éstas se cultivan en medio apropiado, en el cual el promotor puede inducirse constitutiva o artificialmente según se describe de forma general, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). Puede incluirse también cualquier suplemento necesario, aparte de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, en las concentraciones apropiadas, introducido solo o como una mezcla con otros suplementos i medios, tales como una fuente de nitrógeno compleja.

Si se usan células huéspedes de mamífero para producir la neurotrofina, éstas deben cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como el F10 de Ham (Sigma), el medio esencial mínimo (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma), son apropiados para cultivar las células huésped. Además, puede usarse como medio de cultivo para las células huéspedes cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979); Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980); Patentes Estadounidenses nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 5.122.469; ó 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; o la Solicitud de Patente Estadounidense con nº de registro 30.985, cuyos descubrimientos de todas ellas se incorporan en la presente invención por referencia. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según fuera necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como la insulina, transferrina o el factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, el calcio, el magnesio, y el fosfato), tampones (tales como el HEPES), nucleósidos (tales como la adenosina y la timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina^{TM}), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente en concentraciones finales del orden micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otros suplementos necesarios podrían incluirse también en las concentraciones apropiadas, las cuales serán conocidas por los especialistas en el campo. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son aquéllas usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el especialista ordinariamente capacitado.

En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células de mamífero pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, editor M. Butler (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991). Los procesos anteriores pueden emplearse tanto si la neurotrofina se produce intracelularmente, se produce en el espacio periplasmático, o se secreta directamente en el medio.

Típicamente, el fluido del cultivo se recolecta después de un período apropiado, y se realizan ensayos de identificación estándares, por ejemplo, inmunoensayos tales como el ELISA y el análisis de transferencia Western, o ensayos biológicos, tales como la diferenciación de células PC12 (Greene, L. A., Trends Neurosci., 7:91 (1986)). Los ensayos para determinar el grado y alcance de las variantes descritas en la presente invención son conocidos en el estado de la técnica, o se proporcionan o citan en los Ejemplos (consultar, por ejemplo, Schmelzer et al. J. Neurochem., 59 (5):1675-83 (1992) y Burton et al., J. Neurochem., 59(5):1937-45 (1992), los cuales se incorporan en la presente por referencia.

La composición de neurotrofina preparada a partir de las células se somete preferiblemente a, al menos, un paso de purificación antes del HIC. Los ejemplos de pasos de purificación apropiados incluyen aquéllos que se describen en la presente invención, incluyendo la cromatografía de afinidad, otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina-Sepharosa, la cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, y SDS-PAGE preparativa, dependiendo de la neurotrofina a recuperar y del cultivo de partida usado.

En una realización en la que la neurotrofina se secreta directamente al medio, el medio se separa de los restos celulares mediante centrifugación, y el caldo o medio de cultivo clarificado se usa entonces para la purificación en gel de sílice. Para la cromatografía en sílice, típicamente se pasa el caldo a través de partículas de sílice sin derivar de tal forma que el polipéptido de la neurotrofina se adhiere a las partículas de sílice; las partículas de sílice se lavan para eliminar los contaminantes; y el polipéptido se eluye de las partículas de sílice con un tampón que comprende un solvente alcohólico o polar aprótico y una tierra alcalina, un metal alcalino, o una sal de amonio inorgánica.

En una realización preferida de la invención, se emplea la cromatografía de intercambio catiónico con Macroprep High S para separar la neurotrofina de sus variantes, así como para disminuir la cantidad de contaminantes. Esta resina puede usarse como un paso temprano en la purificación de una neurotrofina a partir del cultivo de células de mamífero, preferiblemente para el fraccionamiento del medio de cultivo celular recolectado. En otra realización, la cromatografía de intercambio catiónico con Macroprep High S se usa preferiblemente inmediatamente después de un paso de replegado de la proteína. La propiedad de flujo muy elevado de esta columna de intercambio catiónico permite que el volumen elevado de proteína replegada diluida, o de neurotrofina en medio de cultivo de células recolectado, sea fácilmente concentrado antes de los pasos de cromatografía subsiguientes, tales como la HIC o la SP-Sepharose, mediante el ajuste de condiciones de tal forma que las neurotrofina se unan a la columna. Adicionalmente, la naturaleza de intercambio catiónico de la resina permite la eliminación del grueso de las proteínas no unidas, y de algunas variantes procesadas erróneamente y de variantes modificadas químicamente (por ejemplo, con carga alterada, la variante con MET37 oxidada). Mas importante aún, cuando están presentes variantes plegadas erróneamente o variantes modificadas químicamente (por ejemplo, variantes procesadas erróneamente, variantes de glicosilación (como producción en cultivo de células de mamífero)) que difieren en hidrofobicidad respecto la neurotrofina nativa, la resina Macroprep permite al menos una eliminación parcial de estas variantes hidrofóbicas, enriqueciendo sustancialmente en la neurotrofina nativa, según se determina en la presente invención. Aunque no se pretende que sea limitante, se cree que el esqueleto del soporte de la resina contiene un contenido hidrofóbico que promueve las interacciones no específicas entre las neurotrofinas y la resina, de lo que nos aprovechamos tal como se enseña en la presente invención. Típicamente, para un tampón de elución con pH desde aproximadamente 5 hasta 8, más preferiblemente de 6 a 8, es útil una concentración de TMAC de 0 a 3 M. El acetato sódico, cuando está presente para incrementar la fuerza iónica del tampón
de elución, permite el uso de una concentración de TMAC inferior. El cloruro es un sustituto preferido del ion acetato.

En un ejemplo de la realización en donde la neurotrofina se produce en el espacio periplasmático, se centrifuga el medio de cultivo o lisado para eliminar los restos celulares en partículas. Las fracciones de membrana y de proteína soluble pueden entonces separarse si es necesario. La neurotrofina puede entonces purificarse a partir de la fracción de proteína soluble y a partir de la fracción de membrana del lisado del cultivo, dependiendo de si la neurotrofina está unida a la membrana, es soluble, o está presente en una forma agregada. A continuación, la neurotrofina se solubiliza y entonces se repliega subsiguientemente usando un tampón apropiado. Los detalles de este procedimiento de aislamiento a partir del periplasma para producir proteína replegada se describen más abajo.

La neurotrofina no nativa, insoluble, se aísla de las células huéspedes procariotas en un tampón de aislamiento apropiado mediante una técnica apropiada, por ejemplo, una que implique exponer las células a un tampón con la fuerza iónica apropiada para solubilizar la mayoría de proteínas huéspedes, pero en la que la neurotrofina agregada sea sustancialmente insoluble, y romper las células con objeto de liberar los cuerpos de inclusión y hacerlos accesibles para su recuperación, por ejemplo, mediante centrifugación. Esta técnica es bien conocida, y se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense nº 4.511.503.

De forma resumida, se suspenden las células en el tampón (típicamente a pH 5 a 9, preferiblemente aproximadamente 6 a 8, usando una fuerza iónica de aproximadamente 0,01 a 2 M, preferiblemente 0,1 a 0,2 M). Cualquier sal apropiada, incluyendo el cloruro sódico, es útil para mantener un valor de fuerza iónica suficiente. Las células, mientras están suspendidas en este tampón, se rompen mediante lisis usando técnicas empleadas comúnmente, tales como, por ejemplo, los medios mecánicos, por ejemplo, un microfluidizador de prensa Manton-Gaulin, una prensa francesa, o un oscilador sónico, o mediante procedimientos químicos o enzimáticos.

Los ejemplos de procedimientos químicos o enzimáticos para la rotura de células incluyen la formación de esferoplastos, el cual comporta el uso de lisozima para lisar la pared bacteriana (Neu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 17:215 (1964)), y el choque osmótico, el cual implica el tratamiento de células viable con una solución de elevada tonicidad, y con una lavado con agua fría de baja tonicidad, para liberar los polipéptidos (Neu et al., J. Biol. Chem., 240:3685-3692 (1965)). Un tercer procedimiento, descrito en la Patente Estadounidense nº 4.680.262, implica poner en contacto las células bacterianas transformadas con una cantidad efectiva de un alcanol inferior que tiene de 2 a 4 átomos de carbono, durante un tiempo, y a una temperatura suficiente para matar y lisar las células.

Una vez se han roto las células, la suspensión típicamente se centrifuga para apelotonar los cuerpos de inclusión. En una realización, este paso se lleva a cabo a aproximadamente de 500 a 15.000 \times g, preferiblemente a aproximadamente 12.000 \times g, en una centrífuga estándar, durante un tiempo suficiente que depende del volumen y del diseño de la centrífuga, usualmente aproximadamente de 10 minutos a 0,5 horas. El sedimento resultante contiene sustancialmente la totalidad de la fracción polipeptídica insoluble, pero si el proceso de rotura de las células no es completo, puede contener también células intactas o fragmentos de células rotas. La finalización de la rotura celular puede ensayarse resuspendiendo el sedimento en una pequeña cantidad de la misma solución tamponada, y examinando la suspensión con un microscopia de contraste de fase. La presencia de fragmentos de células rotas o de células enteras indica que es necesaria la rotura adicional para eliminar los fragmentos o células, y los polipéptidos no refractivos asociados. Después de tal rotura adicional, si se requiere, la suspensión se centrifuga de nuevo y se recupera el sedimento, se resuspende, y se analiza. El proceso se repite hasta que el examen visual revela la ausencia de fragmentos de células rotas en el material sedimentado, o hasta que el tratamiento adicional no consigue reducir el tamaño del sedimento resultante.

En una realización alternativa, la neurotrofina se aísla del espacio periplasmático mediante solubilización en un tampón apropiado. Este procedimiento puede ser la solubilización in situ, que implica la adición directa de reactivos al recipiente de fermentación después de que la neurotrofina se haya producido de forma recombinante, evitando de ese modo los pasos extras de recolección, homogeneización, y centrifugación para obtener la neurotrofina. Las partículas que permanecen pueden eliminarse mediante centrifugación o filtración, o combinación de las mismas.

Si la neurotrofina está desplegada, el grado de desplegado se determina de manera adecuada mediante cromatografía de la neurotrofina no nativa, incluyendo la RP-HPLC. El área creciente del pico del material ni nativo indica cuánta neurotrofina no nativa está presente.

Una vez se ha obtenido a partir de los cuerpos de inclusión liofilizados, o en una etapa de purificación posterior, la neurotrofina se repliega en una conformación del modo descrito más abajo.

Si la neurotrofina no está ya en una forma soluble antes de plegarla de nuevo, podría solubilizarse mediante incubación en un tampón alcalino que contiene un agente caotrópico y un agente reductor en las cantidades necesarias para solubilizar sustancialmente la neurotrofina. Esta incubación se realiza en condiciones de concentración de neurotrofina, tiempo de incubación, y temperatura de incubación, que permitirán la solubilización de la neurotrofina en el tampón alcalino.

La medición del grado de solubilización de la neurotrofina en el tampón se realiza de modo apropiado mediante la determinación de la turbidez, analizando el reparto de la neurotrofina entre el sobrenadante y el sedimento, después de la centrifugación, en geles de SDS reducidos, mediante ensayo proteico (por ejemplo, el equipo de ensayo de proteínas de Bio-Rad), o mediante HPLC.

El rango de pH del tampón alcalino para la solubilización es típicamente de al menos aproximadamente 7,5, siendo el rango preferido de aproximadamente 8-11. Los ejemplos de tampones apropiados, que proporcionarán un pH dentro de este último rango incluyen la glicina, CAPSO (ácido 3-[ciclohexilamino]-2-hidroxi-1-propanosulfónico), AMP (2-amino-2-metil-1-propanol), CAPS (ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico), CHES (ácido 2-[N-ciclohexilamino]etanosulfónico), y TRIS HCl (Tris[hidroximetil]aminometano hidrocloruro. El tampón preferido en la presente invención es glicina o CAPSO, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 20 mM, y a un pH de aproximadamente 8,5 a 11, preferiblemente aproximadamente 10-11.

La concentración de neurotrofina en la solución tamponada para la solubilización debe ser tal que la neurotrofina estará sustancialmente solubilizada, y parcial o completamente reducida y desnaturalizada. Alternativamente, la neurotrofina puede ser inicialmente insoluble. La cantidad exacta a emplear dependerá, por ejemplo, de las concentraciones y tipos de otros ingredientes en la solución tamponada, particularmente el tipo y cantidad de agente reductor, el tipo y cantidad de agente caotrópico, y el pH del tampón. Por ejemplo, la concentración de neurotrofina puede incrementarse al menos tres veces si la concentración de agente reductor, por ejemplo, DTT, se incrementa al mismo tiempo, para mantener una proporción de DTT:neurotrofina de desde aproximadamente 3:1 a 10:1. Es deseable producir una solución de proteína solubilizada concentrada antes del replegado mediante dilución. Por tanto, la concentración preferida de neurotrofina es al menos 30 mg/ml, con un rango más preferido de 30-50 mg por ml. Por ejemplo, la neurotrofina puede solubilizarse hasta una concentración de aproximadamente 30-50 mg/ml en urea 5 M a 7 M, 10 mM DTT, y diluirse, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 mg/ml para el replegado.

Una vez se ha solubilizado la neurotrofina, se coloca o diluye en un tampón de replegado que contiene 5-40% (v/v) de solvente alcohólico o aprótico, un agente caotrópico, y un metal alcalino, una tierra alcalina, o una sal de amonio. El tampón puede ser también cualquier tampón para la primera solución tamponada, siendo CAPSO, glicina y CAPS los preferidos a pH 8,5-11, particularmente a una concentración de aproximadamente 20 mM, y más preferiblemente CAPSO y glicina. La neurotrofina puede diluirse con el tampón de replegado, preferiblemente al menos cinco veces, más preferiblemente al menos diez veces. Alternativamente, al neurotrofina puede dializarse frente al tampón de replegado. El replegado puede llevarse a cabo a aproximadamente 2ºC-45ºC, más preferiblemente aproximadamente 2ºC-8ºC, durante al menos aproximadamente una hora. La solución opcionalmente también contiene un agente reductor y un osmolito.

El agente reductor se selecciona de forma apropiada de entre los descritos para el paso de solubilización, en el rango de concentración dado. Su concentración dependerá especialmente de las concentraciones de tierra alcalina, metal alcalino, o sal de amonio, neurotrofina, y solvente. Preferiblemente, la concentración de agente reductor es aproximadamente de 0,5 a 8 mM, más preferiblemente aproximadamente 0,5-5 mM, incluso más preferiblemente aproximadamente 0,5-2 mM. Los agentes reductores preferidos son el DTT y la cisteína.

El oxígeno en la solución de replegado puede eliminarse opcionalmente mediante la adición de un gas inerte, por ejemplo, helio o argón, para desplazar le oxígeno.

El osmolito opcional es preferiblemente sacarosa (en una concentración de aproximadamente 0,25-1 M) o glicerol (en una concentración de aproximadamente 1-4 M). Más preferiblemente, la concentración de sacarosa es de aproximadamente 1 M, y la concentración de glicerol es de aproximadamente 4 M.

La concentración inicial de neurotrofina en el tampón de replegado es tal que estará maximizada la proporción de confórmero correctamento plegada respecto el plegado erróneamente, según se determine mediante HPLC, RIA o bioensayo. La concentración preferida de neurotrofina (que resulta en el rendimiento máximo de confórmero correctamente plegado) está en el rango de aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml, más preferiblemente aproximadamente 0,1 a 6 mg/ml, y los más preferiblemente aproximadamente 0,2 a 5 mg/ml.

El grado de replegado que ocurre a partir de esta incubación se determina de forma apropiada mediante la valoración RIA de la neurotrofina, o mediante análisis con HPLC, correlacionándose directamente un título RIA o tamaño de pico de neurotrofina correctamente plegado crecientes con cantidades crecientes de confórmero de neurotrofina correctamente plegado, biológicamente activo, presentes en el tampón. La incubación se carda para maximizar el rendimiento de confórmero de neurotrofina correctamente plegado, y la proporción de confórmero de neurotrofina correctamente plegado respecto confórmero de neurotrofina plegado erróneamente, recuperados, según se determina mediante RIA o HPLC, y para minimizar el rendimiento de neurotrofina asociada, multimérica, según se determina mediante el equilibrio de masas. Alternativamente, las especies pueden determinarse mediante los procedimientos proporcionados más abajo y en los Ejemplos. La guanidina es un agente desnaturalizante preferido para el
replegado.

Una vez se ha replegado la neurotrofina, los procedimientos siguientes, tal como se enseñan en la presente invención, individualmente o en combinación, son ilustrativos de procedimientos de purificación apropiados para obtener una mayor pureza y homogeneidad: el fraccionamiento en columnas de intercambio catiónico; la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC); y la cromatografía en sílice.

Con independencia de si un paso de replegado forma parte del proceso o no, los procedimientos según se reivindican en la presente invención comprenden un paso para la separación de la neurotrofina de sus variantes, mediante la separación en resina de cromatografía de interacción hidrofóbica. Durante la fermentación, la purificación, o en replegado de la proteína in vitro, parte de la proteína puede modificarse químicamente, procesarse erróneamente, o puede no replegarse en su estructura tridimensional nativa, sino en otras estructuras que difieren con respecto de su estabilidad, solubilidad, inmunogenicidad, o bioactividad. Estas variantes deben eliminarse durante la recuperación para evitar efectos secundarios no deseables, tales como la antigenicidad o pérdida de potencia. Si la variante es insoluble, puede eliminarse fácilmente mediante técnicas de separación sólido/líquido, tales como la centrifugación y filtración. Sin embargo, si la variante es soluble, se precisarán técnicas de adsorción con mayor resolución, tales como la cromatografía, para eliminarlas. Cuando se producen en células procariotas, o cuando se repliegan in vitro, las neurotrofinas forman una variante soluble, estable, plegada erróneamente. La neurotrofina plegada erróneamente tiene un patrón de emparejamiento disulfuro, y una estructura tridimensional relativa a la neurotrofina nativa alterados, y carece de actividad farmacológica nativa. Cuando se produce en cultivo celular eucariótico, por ejemplo, cultivo en células de mamífero, las formas variantes son típicamente formas procesadas erróneamente. Éstas típicamente carecen también de actividad farmacológica nativa, y deberían eliminarse. Se ha hallado en la presente invención que la HIC es apropiada para separar estas variantes de la neurotrofina nativa.

La HIC implica la adsorción y desorción secuencial de la proteína de matrices sólidas, medida a través de enlaces hidrofóbicos no covalentes. Generalmente, se cargan sobre la columna de HIC moléculas de la muestra en un tampón elevado en sal. La sal en el tampón interacciona con las moléculas de agua para reducir la solvatación de las moléculas en solución, exponiendo de ese modo las regiones hidrofóbicas en las moléculas de la muestra, las cuales consecuentemente son adsorbidas por la columna de HIC. Cuanto más hidrofóbica es la molécula, menos sal se necesita para promover la unión. Usualmente, se usa un gradiente decreciente de sal para eluir las muestras de la columna. A medida que disminuye la fuerza iónica, aumenta la exposición de las regiones hidrofílicas de las moléculas, y las moléculas eluyen de la columna en orden de hidrofobicidad creciente. La elución de muestra se ha conseguido también mediante la adición de modificadores orgánicos o detergentes suaves al tampón de elución. La HIC es revisa en Protein Purification, 2ª edición, Springer-Verlag, Nueva York, pp. 176-179 (1988).

La fuerza de la asociación entre una proteína y una matriz depende de varios factores, incluyendo el tamaño y el carácter hidrofóbico del grupo funcional inmovilizado, la polaridad y tensión superficial del solvente que las rodea, y la hidrofobicidad de la proteína. La capacidad de unión de las matrices de HIC tiende a ser baja, debido a la necesidad de que el ligando hidrofóbico esté ampliamente espaciado. Además, la capacidad de un medio para una proteína determinada varía inversamente con el nivel de impurezas hidrofóbicas en la preparación de la muestra. Con objeto de resolver una proteína deseada de sus variantes y otras impurezas, mientras que simultáneamente se maximiza su capacidad, es necesario identificar un medio de fase sólida de HIC apropiado, así como fases móviles apropiadas para la carga, lavado y elución.

Según se determinó en la presente invención, los medios más apropiados para separar correctamente neurotrofinas plegadas y plegadas erróneamente, o formas procesadas procesadas erróneamente de las formas intactas, procesadas correctamente, eran aquéllos que tienen inmovilizados grupos funcionales fenilo. Los medios de HIC basados en fenilo procedentes de diferentes vendedores presentaron una eficiencia diferentes para resolver estas formas de neurotrofina. Los mejores resultados se consiguieron con medio Phenyl Toyopearl de TosoHaas y Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub (baja sustitución). La TSK Phenyl 5PW también era apropiada. Otros grupos funcionales inmovilizados de HIC pueden funcionar para separar estas formas. Los ejemplos fueron los grupos octilo, tales como los del medio Octyl Sepharose CL4B de Pharmacia, y los grupos propilo, tales como los de medio High Propyl Baker. Son menos preferidas las resinas con grupos funcionales alcoxilo, butilo e isoamilo.

La HIC fue útil para la separación de neurotrofinas de sus variantes en cultivos de células de mamífero. Por ejemplo, según se determinó en la presente invención, el cultivo de células CHO que expresaban la rhNGF contenía variantes procesadas proteolíticamente de forma incorrecta, tales como aquéllas en las cuales está presente una secuencia precursora parcial, por ejemplo, secuencias precursora de NGF, precursora de NGF híbrida, y precursora de NGF recortada. En el medio de cultivo de células de mamífero también se hallaron formas de NGF glicosiladas y formas glicosiladas de las variantes procesadas proteolíticamente de forma incorrecta. Las formas glicosiladas no deseables, que en el caso del NGF puede observarse como especies de peso molecular más elevado (+2000 kD), pueden generar una respuesta antigénica no deseada en un paciente, y contribuir a una pobre calidad o actividad del producto. La HIC separa efectivamente las variantes hidrofóbicas, principalmente variantes procesadas de forma errónea proteolíticamente en su extremo N-terminal, incluyendo las formas glicosiladas, del rhNGF. Tal como se muestra en los ejemplos, el NGF que contenía la secuencia precursora, y el NGF con la secuencia precursora cortada, y las formas glicosiladas tanto del NGF como del NGF que contiene la secuencia precursora, eluyeron en el extremo anterior del pico de NGF durante la fenil-HIC. Por tanto, puede obtenerse una composición de rhNGF que estaba sustancialmente libre de estas especies, y que era particularmente apropiada para un paso subsiguiente, tal como la cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones. La HIC es aplicable a otras neurotrofinas, así como al NGF, con independencia de la fuente. Por ejemplo, la HIC es útil para separar monómeros del NGF de los dímeros, sean homo- o heterodímeros, dependiendo de las formas monoméricas presentes, así como para distinguir las formas diméricas que difieren también en hidrofobicidad, que se obtienen después del replegado in vitro o cuando se producen y secretan a partir de células de mamífero. El cultivo de células de mamífero es una fuente preferida de mezclas de neurotrofinas para su uso con la HIC, más preferiblemente el cultivo de células CHO. El cultivo se somete preferiblemente a, al menos, un paso de purificación previo, tal como se describe en la presente invención. La HIC es particularmente efectiva para separar variante(s) glicosilada(s) procesada(s) erróneamente de la neurotrofina recombinante nativa. En el caso del rhNGF, las formas glicosiladas y preproNGF son menos hidrofóbicas que el NGF nativo, eluyendo por tanto antes que el NGF nativo. Las formas plegadas erróneamente de las neurotrofinas (cuando se producen de forma bacteriana) son también más hidrofóbicas, eluyendo más pronto que la neurotrofina nativa.

Las resinas de HIC más preferidas para separar formas de la neurotrofina fueron aquéllas que tenían grupos funcionales fenilo inmovilizados. Los medios de HIC basados en fenilo procedentes de diferentes vendedores presentaron una eficiencia diferentes para resolver estas formas del NGF. De las resinas fenil-HIC, el medio Phenyl Toyopearl de TosoHaas es el más preferido, y son preferidas Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub (baja sustitución) y TSK Phenyl 5PW. Los grupos funcionales de HIC preferidos incluyen los grupos alcoxilo, butilo e isoamilo.

Usando la HIC, pueden usarse una variedad de condiciones de fase móvil para lavar y eluir diferencialmente formas de la neurotrofina. Estas fases móviles pueden contener varias especies químicas diferentes, que incluyen de modos diferentes en la asociación entre una neurotrofina y la fase estacionaria. La neurotrofina correctamente plegada y plegada erróneamente, por ejemplo, la NT-4/5, pueden separarse en una columna de HIC mediante gradientes de sal decrecientes o mediante disminución paso a paso, por ejemplo, de la sal de la fase móvil, por ejemplo, sulfato amónico, concentración de NaCl, concentración de acetato. Las sales pueden incluir en la unión de la neurotrofina a la resina modulando la tensión superficial de la fase móvil. Otros agentes que afectaron la tensión superficial fueron el citrato sódico y el cloruro de tetrametilamonio, según se describe en los Ejemplos. También pueden resolverse las variantes durante la cromatografía en columna, mediante la elución de la proteína unida con gradientes crecientes, o el incremento paso a paso, de la concentración de solventes orgánicos relativamente polares. Los ejemplos de solventes apropiados incluyen el etanol, el acetonitrilo, y el propanol. La fuerza de la asociación entre las formas de la neurotrofina y la resina de la HIC depende también del pH de la fase móvil, prefiriéndose las condiciones neutras. La hidrofobicidad relativa de las neurotrofina correctamente plegada y plegada erróneamente depende también del pH de la solución. La separación de las variantes de la neurotrofina nativa puede obtenerse también variando simultáneamente varias propiedades de la fase móvil durante la elución con gradiente o paso a paso. Por ejemplo, una fase móvil que variaba simultáneamente la concentración de sal y la concentración de solvente apolar durante la elución, proporcionó una mejor resolución que cuando sólo se varió la sal.

Para la HIC, pueden usarse las sales descritas en la presente invención, incluyendo el sulfato amónico, el citrato, el acetato, y el cloruro potásico. Dependiendo de la sal usada, la concentración de sal es típicamente de 0,5 M a 3 M, más preferiblemente de 0,5 a 2,5 M, para conseguir la unión de la neurotrofina a la resina. Por ejemplo, para el NGF se prefiere un tampón de unión con sal de 0,8 a 1,5 M, concentraciones salinas más elevadas conducen a la precipitación del NGF sobre la resina, lo que se traduce en una menor recuperación. Para la NT-3 se prefiere un tampón de unión a pH 7 con una concentración de sal de 1,0 a 2,5, siendo más preferible con NaCl de 1,25 a 1,75 M, y siendo 1,5 M las más preferida. Para la NT-4/5 se prefiere un tampón de unión a pH 7 con de 1 a 3 M de sal, siendo más preferido con de 2 a 2,75 M, y siendo con NaCl 2,5 M la más preferida. En el caso de la NT-4/5, cuando se prefería NaCl 2,5 M para la carga, se prefería NaCl 2 M para la elución con solvente orgánico presente (por ejemplo, 10% de alcohol, pH 7). Preferiblemente, se usa una disminución de la concentración de sal para eluir y separar una neurotrofina de sus variantes. Con objeto de conseguir la elución, la concentración de sal en el tampón de elución es típicamente inferior a la del tampón de elución, pero puede ser la misma concentración cuando se compensa con solvente orgánico.

Además, el uso de solvente orgánico tiene otra ventaja, tal como se ha hallado en la presente invención, que la adición de un solvente orgánico mejora el patrón de elución al resultar en perfiles de pico más estrechos. Además del etanol, puede usarse otros solventes orgánicos descritos en la presente invención, incluyendo el propanol, isopropanol y glicoles de alquileno inferior, tales como el propilenglicol, etilenglicol, y hexilenglicol. El solvente orgánico a del 5 al 25% (v/v), más preferiblemente del 5 al 20% (v/v), típicamente eluirá una neurotrofina correctamente plegada. La elución con solvente orgánico puede ser mediante un gradiente o paso a paso. El rango de pH es preferiblemente de cercano a neutro, a ligeramente ácido, desde pH 5 hasta 8, más preferiblemente desde pH 6 hasta 8, pH 6,5 a 7,5, y los más preferiblemente pH 7. Puede emplearse cualquiera de los tampones descritos en la presente invención, incluyendo el MOPSO, MOPS, HEPES, fosfato, citrato, acetato amónico, a condición que tamponen en el pH deseado.

A la vista del descubrimiento, por parte de los presentes inventores, de ciertas variantes de neurotrofina no deseables, que surgen de la producción recombinante de una neurotrofina, tal como se describe en la presente invención, el uso de la cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, preferiblemente en modo preparativo, permite la separación de las variantes con carga modificada, tales como las formas carbamiladas, oxidadas, isoasp, desamidadas, y ciertas formas cortadas (por ejemplo, las formas trucadas C-terminalmente del NGF), de la neurotrofina nativa. Por ejemplo, las formas cortadas N-terminalmente (por ejemplo, supresiones de 2 a 4 aminoácidos N-terminales) que resultan en una alteración de la carga, la cual puede ocurrir durante la fermentación bacteriana, como en el caso de las NT-4/5 y NT-3, puede eliminarse. En el caso de neurotrofinas producidas en cultivos celulares de mamífero, la truncación C-terminal puede ocurrir en las región terminal altamente cargada. Por ejemplo, la forma 118 del NGF puede estar procesada erróneamente, o cortada en su extremo C-terminal, y originar las formas 117, 114 y 115. Estas pueden separarse del 118 NGF nativo mediante la cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones. Las realizaciones particularmente preferidas usan las resinas "SP-Sepharose High Performance", "Fractogel EMD SO3", o de ácido poliaspártico, de las cuales es particularmente preferida la "PolyCAT A". A gran escala las más preferidas son las resinas "SP-Sepharose High Performance" o "Fractogel EMD SO3".

Las composiciones obtenidas mediante los procedimientos descritos en la presente invención serán neurotrofina sustancialmente pura, más usual y preferiblemente esencialmente pura, y estará sustancialmente libre de variantes de la neurotrofina, más preferiblemente esencialmente libre de variantes de la neurotrofina. Por ejemplo, un grupo de SP-Sepharose típico, después de la purificación del NGF a partir del cultivo de células CHO, contiene aproximadamente un 92% de 118, un 4,6% de 120, un 1% de NGF desamidado, un 1% de NGF oxidado, y un 1% de NGF isoasp. Rutinariamente, la cantidad de cada especie oscila desde aproximadamente el 85 hasta el 93% para la 118, del 0 al 5% para la 120 (dependiendo en gran parte del alcance de la proteolisis endógena y/o exógena que se use), del 0 al 5% para la 117, del 0 al 3% para las formas desamidadas, del 0-2% para las formas isoasp, y del 0 al 2% para las formas oxidadas. La pureza del NGF (todas las especies) es rutinariamente superior al 99,5%.

Una vez la neurotrofina se ha eluido de la columna, se formula convenientemente en una composición con un portador, preferiblemente una composición farmacéutica con un portador fisiológicamente aceptable. Las composiciones de neurotrofina son preferiblemente estériles. Las composiciones de neurotrofina de la invención hallaran un uso también in vitro, por ejemplo, para promover el crecimiento y supervivencia de las neuronas en cultivo.

La estabilidad química y física del factor de crecimiento nervioso humano (NGF) en solución acuosa se investigó entre 5 y 37ºC, en el rango de pH de 4,2 a 5,8. La estabilidad química del NGF se incrementó aumentando el pH. En tampón succinato a pH 5,8, la estabilidad física del NGF disminuyó debido a la agregación de la proteína. En base, tanto a datos de estabilidad a 5ºC, como a estudios de degradación a 37ºC, se halló que la formulación óptima era en tampón acetato a pH 5,5 (consultar WO 97/17087, la cual se incorpora en la presente invención por referencia). La HPLC en fase inversa fue el principal procedimiento indicativo de estabilidad, mostrando que la conversión de la Asn-93 a iso-Asp era la vía principal de degradación a 5ºC. La cuantificación de la degradación del NGF mediante cromatografía de intercambio catiónico estuvo complicada por la reordenación, con el tiempo, de las variantes monoméricas del NGF en varios dímeros mezclados (intercambio de dímeros). El tratamiento de las muestras y los controles con ácido diluido rápidamente equilibró la distribución de monómero en los dímeros, permitiendo la cuantificación de la degradación del NGF en ausencia de intercambio de dímeros. Se evaluó la compatibilidad y estabilidad del alcohol bencílico y del fenol con el rhNGF en dos formulaciones líquidas para propósitos de múltiples usos. Estas dos formulaciones consisten en 0,1 mg/ml de proteína, en acetato sódico 20 mM, a pH 5,5, y cloruro sódico 136 mM con y sin 0,01% de ácido plurónico (F68) como tensioactivo. La concentración final de alcohol bencílico y fenol en cada una de estas dos formulaciones fue respectivamente de 0,9 y 0,25%. En base a los datos de estabilidad a 12 meses, el rhNGF es más estable, en estas formulaciones, con alcohol bencílico que con fenol. La formulación del rhNGF conservada con alcohol bencílico, con presencia de tensioactivo, es tan estable como la formulación sin tensioactivo añadido, indicando que no se requiere la adición la adición del F86 a la formulación de múltiples dosis del rhNGF para su estabilidad. Por tanto, se recomienda una formulación consistente en 0,1 mg/ml de proteína en acetato 20 mM, NaCl 136 mM, 0,9% de alcohol bencílico, pH 5,5, para el rhNGF usado para múltiples dosis en ensayos clínicos de fase III. Esta formulación del rhNGF de múltiples dosis superó los ensayos de eficacia del conservante de la USP y EP después de 6 meses a 5ºC, y es tan estable como la formulación líquida actual a 2 mg/mL. Sin embargo, la formulación debería evitar
la exposición a luz intensa, debido a la presencia del alcohol bencílico como conservante, el cual es sensible a la luz.

En general, las composiciones pueden contener otros componentes en cantidades que preferiblemente no perjudiquen la preparación de formas estables, líquidas o liofilizadas, y en cantidades apropiadas para una administración farmacéutica efectiva y segura.

La neurotrofina se formula con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir, con uno que no sea tóxico para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, y que sea compatible con otros ingredientes en la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son perjudiciales para los polipéptidos. Este paso de formulación se consigue desalando o diafiltrando usando tecnología estándar.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contracto la neurotrofina, uniforme e íntimamente, con portadores líquidos, o portadores sólidos finamente divididos, o ambos. Entonces, si es necesarios, el producto se configura en la formulación deseada. Preferiblemente, el portador es un portador parenteral, más preferiblemente, una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen el agua, la solución salina, la solución de Ringer, y la solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos, tales como los aceites fijados y el etiloleato, también son útiles en la presente invención, así como los liposomas.

El portador convenientemente contiene cantidades menores de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), por ejemplo, la poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, l ácido glutámico, el ácido aspártico, o la arginina; los monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la celulosa o sus derivados, la trehalosa, la glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; alcoholes azúcar tales como el manitol o sorbitol; contraiones tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como los polisorbatos, los poloxámeros, o el PEG.

La neurotrofina a usarse para administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estéril (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Las composiciones de neurotrofina terapéuticas generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tienen un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Las formulaciones anteriores son apropiadas también para los usos in vitro.

La neurotrofina ordinariamente se almacenará en contenedores monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para su reconstitución. Como un ejemplo de una formulación liofilizada, se rellenan viales de 10 ml con 5 ml de una solución acuosa de neurotrofina al 1% (p/v) esterilizada mediante filtración, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo la neurotrofina liofilizada usando agua bacteriostática para inyecciones.

Se administra a un paciente una dosis terapéuticamente efectiva de una formulación de neurotrofina. En la presente invención, por "dosis terapéuticamente efectiva" se quiere indicar una dosis que produce los efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del trastorno que debe tratarse, y podrá ser establecida por un experto en la materia usando técnicas conocidas. En general, las formulaciones de neurotrofina de la presente invención se administran a desde aproximadamente 0,01 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg por día. Preferiblemente, desde 0,1 hasta 0,3 \mug/kg. Además, como es bien conocido en la técnica, pueden ser necesarios ajustes por la edad, así como por el peso corporal, estado de salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, interacción del fármaco, y la gravedad de la enfermedad, y podrán ser establecidos con experimentación rutinaria por los especialistas en la técnica. Típicamente, el médico administrará las formulaciones de neurotrofina de la invención hasta que se alcance una dosis que repare, mantenga, y, óptimamente, restablezca la función neuronal. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.

La neurotrofina opcionalmente se combina o se administra concertadamente con otros factores neurotróficos, incluyendo el NGF, la NT-4/5, la NT-3, y/o el BDNF, y se usan con otras terapias convencionales para los trastornos nerviosos.

En el caso del NGF, una composición preferiblemente comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de factor de crecimiento nervioso, y un tampón que contiene acetato farmacéuticamente aceptable. La composición puede tener un pH desde pH 5 hasta 6. El tampón preferiblemente es acetato sódico. La concentración de acetato es preferiblemente de 0,1 a 200 mM. La composición preferiblemente tiene una concentración de NGF de 0,07 a 20 mg/ml. Y, la composición opcionalmente contiene además un conservante farmacéuticamente aceptable, tal como el alcohol bencílico, el fenol, el m-cresol, el metilparabén, o el propilparabén. Preferiblemente, el conservante es el alcohol bencílico. La concentración de alcohol bencílico es preferiblemente del 0,1 al 2,0%. La composición puede contener opcionalmente un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Y la composición puede opcionalmente, pero preferiblemente, contener una concentración fisiológicamente aceptable de cloruro sódico. Una composición más preferida contiene factor de crecimiento nervioso a una concentración de al menos aproximadamente 0,1 mg/ml, y una concentración de ion acetato de 10 mM a 50 mM. Incluso más preferiblemente, la composición contiene factor de crecimiento nervioso a una concentración de 0,1 a aproximadamente 2,0 mg/ml, e ion acetato a una concentración de 10 mM a 50 mM. Una composición más preferida contiene NGF a una concentración de 0,1 mg/ml, una concentración de acetato sódico de 20 mM, pH 5,5, una concentración de cloruro sódico de 136 mM, y alcohol bencílico al 0,9%
(v/v).

Otra realización contiene una concentración de NGF de 2,0 mg/ml, una concentración de acetato sódico de 10 mM, pH 5,5, y una concentración de cloruro sódico de 142 mM. Es preferible formular el NGF a 0,1 mg/ml, con acetato sódico 20 mM, cloruro sódico 136 mM, 0,9% (v/v) de alcohol bencílico, a un pH de 5,5. Tal como se describe en la presente invención, el homodímero 118/118 es una forma preferida del NGF. El NGF se purifica a aproximadamente pH 6 a 8 para mantener la forma dimérica normal. Sin embargo, el porcentaje de formas (proteolíticamente) recortadas representa las formas monoméricas, las cuales pasan a ser evidentes y pueden determinarse mediante HPLC de fase inversa. Las condiciones ácidas de la HPLC analítica disocian los dímeros. La existencia de diferentes formas diméricas del NGF-120/120, 120/118, 118/118, etcétera, ha sido publicada (Schmelzer et al., J. Neurochem., 59:1675-1683 (1992), la cual se incorpora específicamente en la presente invención en su totalidad, principalmente por sus ensayo analíticos y bioensayos, que se usaron en los estudios actuales, así como por sus enseñanzas generales). Esa publicación informó que las actividades in vitro eran las mismas para cada forma dimérica. Sin embargo, por contra, los presentes estudios en la presente invención, usando un ensayo basado en radiorreceptor, demuestran, por primera vez, que el dímero 120/120 es menos activo, aproximadamente un 80-90% tan activo como la especie 118/118. En una forma del ensayo, se aislaron membranas de células PC-12 de rata, y se usaron para la unión competitiva entre el NGF estándar y las diversas especies de ensayo. El RRA tiene tanto receptores P75 como trkA. También se halló en la presente invención que la especie 117/117 es tan activa como la especie 118/118. Además, el uso en la presente invención de un ensayo basado en PC-12 confirmó el hallazgo del ensayo basado en receptor, mostrando que la forma 120/120 es aproximadamente un 60% tan activa como la forma 118/118. También se incorpora en su totalidad, específicamente por referencia, Burton et al., J. Neurochem., 59:1937-1945 (1992), principalmente por su ensayo analíticos y bioensayos, que se usaron en los estudios actuales, así como por sus enseñanzas generales).

Se cree que la forma 118/118 es más biodisponible en paciente humanos que la forma 120/120. El incremento en biodisponibilidad es al menos de 4 a 5 veces. Esta diferencia es significativa, sorprendente, e inesperada en vista del estado de la técnica.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los descubrimientos de todas las citas en la especificación se incorporan de forma expresa en la presente invención por referencia.

Ejemplos Ejemplo I Purificación del homodímero 118/118 NGF

Este ejemplo ilustra la purificación del NGF y la razón de cada paso. Al igual que en cada uno de los Ejemplos, un experto en la materia puede fácilmente determinar y ajustar las dimensiones de la columna y las velocidades de flujo para compensar los volúmenes de cultivo y las concentraciones de proteína iniciales, tal y como es bien conocido en la técnica.

Fluido del cultivo de células recolectado

Se transfectaron células CHO recombinantes con un vector de expresión que contenía la secuencia de ADN que codificaba los 120 aminoácidos del NGF humano. Para promover la secreción y procesado también estaba presente la secuencia prepro del NGF. Después de cultivar las células CHO recombinantes, se recolectó el medio de cultivo. El fluido del cultivo de células recolectado (HCCF) contenía las especies 120, 118 y 117 del NGF. Aproximadamente el 40-70% del NGF era típicamente un homodímero 118/118, siendo el resto heterodímeros 120/118, 120/120, y una pequeña cantidad 118/117. Tal y como se enseña en la presente invención, estas especies pueden separarse mediante la columna de SP-Sepharose HP.

El fluido del cultivo de células recolectado se concentró aproximadamente 20 veces usando membranas Millipore con un límite de corte de 10 Kd (se usaron de forma intercambiable, bien de celulosa, material compuesto, o polisulfona). Al concentrado se le añadieron 0,1 volúmenes de Tris 1,0 M, pH 8,2. El material diluido se microfiltró usando un filtro de 0,22 \mum, y se transfirió a un depósito de retención a 37ºC durante de 2 a 18 horas. La conversión de la forma 120/120 a la forma 118/118 está catalizada por un proteasa endógeno durante la retención.

Cromatografía en gel de sílice

El microfiltrado se ajustó hasta NaCl 1 M, y se aplicó a una columna de gel de sílice equilibrada en NaCl 1 M, MOPSO 25 mM, pH 7. La columna se lavó con NaCl 1 M, MOPSO 25 mM, pH 7. El rango de pH apropiado es aproximadamente desde 6 hasta 8, con un pH preferido de 7. La columna se lavó entonces con MOPSO 25 mM, pH 7. Un lavado de baja conductividad elimina las proteínas de la célula huésped. El NGF unido se eluyó con MOPSO 50 mM, TMAC 0,5 M, 20% de alcohol calidad anhidro (alcohol al 94-96%, desnaturalizado especialmente, fórmula 3A (5 volúmenes de metanol y 100 volúmenes de etanol "proof 200"), y 4-6% de isopropanol). Pueden usarse otros alcohole, tales como el propanol al 20%, isopropanol al 20%, y metanol al 20%. Tal y como se usa en la presente invención, "alcoholes" y "solventes alcohólicos" se toman en el sentido de la terminología comúnmente usada para el alcohol, preferiblemente alcoholes con 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, o t-butanol, y más preferiblemente etanol o iso-propanol. Tales alcoholes son solventes que, cuando se añaden a una solución acuosa, incrementan la hidrofobicidad de la solución mediante la disminución de la polaridad de la solución. El etanol es el más preferido. El límite inferior de alcohol es cualquier porcentaje que eluye, y el límite superior está fijado por la necesidad de evitar la desnaturalización de la proteína. El solvente es preferiblemente del 5% al 25%, más preferiblemente del 5 al 20%, incluso más preferiblemente del 5 al 15%. TMAC es cloruro de tetrametilamonio, el cual está presente para eluir el NGF. El TMAC puede oscilar desde 0,1 hasta 1 M. Siendo el rango de 0,3 a 0,7 M el más preferido. La cantidad de TMAC usada para eluir el NGF es una función del pH y de la concentración de alcohol. Cuanto menor es el pH, menos cantidad de alcohol y TMAC se requiere. El pH puede estar entre aproximadamente pH 4 y 8. En este ejemplo, el pH preferido fue 7, el cual permite ajustes muy mínimos de las fracciones agrupadas antes de cargarlas sobre la siguiente columna. El límite de pH superior está determinado por el pH necesario para cargar la columna siguiente, y el límite inferior por aquél que es útil para eluir el NGF eficientemente.

Cromatografía "Fast Flow" con S-Sepharose

El eluyente que contenía el NGF se agrupó, se diluyó hasta una conductividad inferior a 15,5 ms/cm con agua purificada, y se ajustó el pH a 7,0. El material no se conservó más de 8 horas, puesto que varias proteasas estaban todavía presentes; sin embargo, no se observó ninguna actividad de la proteasa endógena que convierte el NGF de 120 aminoácidos a la forma 118. El material se aplicó sobre una columna de cromatografía Fast Flow S-Sepharose (una resina de intercambio catiónico S-SEPHAROSE TM, agarosa Fast Flow TM (Pharmacia)) equilibrada en MOPSO 25 mM, pH 7. Se lavó la columna con MOPSO 25 mM, pH 7. Un rango de pH apropiado es desde aproximadamente 6 hasta 8, siendo pH 7 el preferido. La columna se lavó entonces con NaCl 0,16 M, pH 7. El NGF unido se eluyó con NaCl 0,5 M, pH 7. La molaridad de la sal de elución puede oscilar desde 0,3 hasta 1,0 M, más preferiblemente 0,4 a 0,6 M. El límite inferior está determinado por la utilidad para eluir todo el NGF, y el límite superior está determinado por la necesidad de evitar la eliminación de contaminantes y causar interacciones hidrofóbicas en la columna que pudieran interferir con la elución del NGF. Pueden usarse otras sales, siendo KCl una alternativa preferida. Se prefiere la elución con NaCl 0,5 M, pH 7, con objeto de obtener una mezcla con un volumen pequeño. A concentraciones de sal superiores, por ejemplo, por encima de 1 M, los contaminantes intensamente unidos pueden eluir.

Cromatografía con Phenyl Toyopearl 650M

Las fracciones de la columna SSFF que contenían el NGF se agruparon, se ajustaron hasta NaCl 1 M, y se aplicaron a una columna Phenyl Toyopearl 650M. La columna se lavó con MOPSO 25 mM, pH 7. Un pH apropiado está en el rango de aproximadamente pH 5 a 8. El NGF se eluyó con un gradiente lineal de 10 CV (volúmenes de columna), empezando con un tampón A de gradiente (MOPSO 25 mM, pH 7, NaCl 1,0 M), y finalizando con un tampón B de gradiente (20% de alcohol en 80% de MOPSO 25 mM, pH 7). Las fracciones que contenían el NGF se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, SDS-PAGE, para determinar qué fracciones albergaban la especie de NGF precursora. Las fracciones que contenían el NGF se seleccionaron y agruparon para eliminar principalmente las variantes procesadas incorrectamente, tales como aquéllas en las cuales está presente una secuencia precursora parcial, por ejemplo, por ejemplo, secuencias de NGF precursora, precursora de NGF híbrida, y precursora de NGF recortada, para obtener una composición de NGF sustancialmente libre de cualesquiera secuencias precursoras del NGF. La columna de fenilo también eliminó la pequeña cantidad de secuencias de NGF glicosiladas y precursora del NGF glicosilada. Las secuencias del NGF precursora y precursora recortada, junto con las formas glicosiladas de ambos, el NGF y el NGF precursor, eluyeron en la parte anterior del pico de NGF. Por tanto, esta columna fácilmente separó el NGF de varias especies del NGF, para obtener una composición de NGF sustancialmente libre de estas especies. En este paso, variantes hidrofóbicas del NGF, principalmente variantes procesadas erróneamente, incluyendo variantes proteolíticas y glicosiladas, se separaron usando HIC.

Los medios más apropiadas para separar formas del NGF fueron aquéllos que tenían grupos funcionales fenilo inmovilizados. Los medios de HIC basados en fenilo procedentes de diferentes vendedores presentaron una eficiencia diferentes para resolver estas formas del NGF. Los mejores resultados se consiguieron con medio Phenyl Toyopearl de TosoHaas. Las resinas de HIC, Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub (baja sustitución) y TSK Phenyl 5PW funcionaron correctamente. Otros grupos funcionales de la HIC son menos apropiados, y menos efectivos, en estas condiciones, incluyendo los grupos alcoxilo, butilo e isoamilo.

El grupo Phenyl Toyopearl contenía un 75% de 118, un 10% de 120, un 7% de 117, un 1,8% de NGF desamidado, un 1,4% de NGF oxidado, y un 2,0% de NGF isoasp, siendo el 2,8% restante otras especies de NGF no identificadas.

Opcionalmente, las fracciones agrupadas se trataron con ácido, para conseguir la inactivación vírica, a un pH inferior a 3,95 durante un mínimo de 15 minutos.

Cromatografía en SP-Sepharose HP

El conjunto HIC se diluyó con de 0,5 a 1 volúmenes de agua, y el conjunto diluido se ajustó a pH 6. El conjunto se cargó sobre una columna SP-Sepharose HP, equilibrada con cloruro sódico 0,2 M, succinato 20 mM, pH 6, conteniendo un 5% de alcohol reactivo (como en el paso de la columna de gel de sílice). La columna se lavó con NaCl 0,2 M, succinato 20 mM, pH 6, conteniendo un 5% de alcohol reactivo (alcohol de la Fórmula SDA-3A; el alcohol está opcionalmente presente). El alcohol ayuda a reducir las interacciones no específicas (mayoritariamente hidrofóbicas) del NGF con el esqueleto de la resina. Un rango de alcohol apropiado es desde aproximadamente el 0 hasta el 10%. El pH de carga es desde aproximadamente pH 5 hasta 8, y se escoge para conseguir y mantener la máxima estabilidad del NGF y de la separación de las variantes del NGF. La columna se lavó con dos volúmenes de columna del tampón de equilibrado. El NGF unido se eluyó y separó de las variantes con un gradiente lineal de 22 volúmenes de columna, mediante la mezcla de 11 volúmenes de columna de tampón de gradiente A (NaCl 0,25 M, succinato 0,02 M, pH 6, conteniendo un 5% de alcohol), y 11 volúmenes de columna de tampón de gradiente B (NaCl 0,5 M, pH 6). El alcohol es opcional. El NGF 118/118 típicamente eluyó a una concentración de NaCl de 0,35 M a 0,40 M.

Se analizó el contenido de NGF y de NGF variante en las fracciones de columna. Las fracciones se analizaron preferiblemente mediante C4 RP-HPLC, tal como describieron Schmelzer et al. (1992), ver más arriba, y Burton et al. (1992), ver más arriba. Se seleccionaron las fracciones y se agruparon para obtener una composición de NGF que estaba sustancialmente libre de variantes de NGF modificadas, por ejemplo, especies cargadas tales como especies del NGF oxidadas, desamidadas, e isoasp. La columna de HIC previa no puede eliminar efectivamente otras formas variantes del NGF, tales como el NGF oxidado e isoasp. La columna HIC elimina efectivamente las proteínas plegadas erróneamente y glicosiladas, las cuales se unen con más fuerza a la resina de la HIC que el NGF correctamente plegado, puesto que tienden a ser más hidrofóbicas. En consecuencia, la resina de intercambio catiónico, por ejemplo, la SP-Sepharose HP, se usó para eliminar las variantes con carga alterada no eliminadas por la resina de la HIC.

El conjunto de la SP-Sepharose típicamente contenía aproximadamente un 92% de 118, un 4,6% de 120, un 1% de NGF desamidado, un 1% de NGF oxidado, y un 1% de NGF isoasp. Rutinariamente, la cantidad de cadas especie oscila desde aproximadamente el 85 hasta el 93% para el 118, del 0 al 5% para el 120, del 0 al 5% para el 117, del 0 al 3% para las formas desamidadas, 0-2% para las formas isoasp, y del 0 al 2% para las formas oxidadas. La pureza del NGF (todas las especies) es rutinariamente superior al 99,5%.

Formulación

El conjunto de la SP-Sepharose HP se preparó para su formulación mediante ultrafiltración/diafiltración en un tampón de formulación. Preferiblemente se usa un tampón ácido, preferiblemente acetato a pH 5 tal como se describió más arriba. La composición de NGF 118/118 está sustancialmente libre de variantes del NGF, y es NGF sustancialmente puro. El material formulado es apropiado para tratar trastornos neuronales, particularmente la neuropatía periférica asociadas con la diabetes, y la neuropatía sensorial periférica asociadas con el SIDA.

Ejemplo II Purificación del homodímero de NGF 120/120 a gran escala Fluido del cultivo de células recolectado

El HCCF se obtuvo a partir de 12.000 litros de cultivo de células CHO, generalmente tal como se describe en el Ejemplo 1. La distribución de especies del NGF en el HCCF era, aproximadamente 40-65% de homodímero 120/120 con heterodímero 120/118, con el resto como homodímero 118/118. El medio típicamente se proceso rápidamente para minimizar la conversión proteolítica del 120 al 118.

Cromatografía de intercambio catiónico con Macroprep High S

El HCCF se cargó sobre una columna de intercambio catiónico Macroprep High S, se lavó con acetato sódico 1,5 M, HEPES 50 mM, pH 7. El NGF unido se eluyó con NaCl 1,5 M, TMAC 0,25 M, tiodiglicol 0,2%, pH 7. La columna Macroprep puede usarse a pH 5 a 8, con ajuste de la concentración de acetato. El cloruro es un sustituto preferido del ion acetato. El NGF eluyó debido al gradiente de TMAC. La TMAC es una sal que tiene tanto carácter iónico como hidrofóbico, lo cual es una propiedad útil, puesto que el esqueleto de soporte de algunas resinas contiene contenido hidrofóbico que promueve las interacciones no específicas entre el NGF y la resina. Típicamente, para un tampón de elución con pH desde aproximadamente 6 hasta 8, es útil una concentración de TMAC de 0-3 M. Las fracciones que contenían NGF se agruparon.

Cromatografía en gel de sílice

El conjunto se aplicó directamente sobre una columna de cromatografía en gel de sílice. El sílice proporciona una resina de cromatografía de modo mixto, y tiene interacciones iónicas, de polaridad, e hidrofóbicas que desempeñan un papel en las características de unión de proteína. La columna se equilibró con NaCl 1 M, MOPSO 25 mM, pH 7. La columna se lavó con NaCl 1 M, MOPSO 25 mM, pH 7 (preferiblemente aproximadamente pH 5,0 a 8,5, más preferiblemente pH 6 a 8, y lo más preferiblemente pH 7). El NGF unido se eluyó con succinato 25 mM, pH 3,9, TEAC 50 mM (cloruro de tetraetilamonio). El TEAC es un eluyente más potente que el TMAC. El pH preferiblemente oscila desde aproximadamente pH 3,5 a 8. Sin embargo, debería evitarse un pH por encima de 7,5 durante períodos de tiempo prolongados, con objeto de prevenir o reducir la formación de la especie de NGF desamidado. Generalmente, cuanto menor es el pH del tampón, menor es la concentración de la sal de propiedades mixtas, por ejemplo, TMAC o TEAC, requerida para eluir el NGF de la columna de sílice. Los tampones que tienen una buena capacidad tamponante cerca de pH 4 a 5 son apropiados para su uso. La presencia de sal en el tampón de elución es opcional, de tal forma que la columna puede lavarse con tampón MOPSO sin sal antes de la aplicación del tampón de elución.

Cromatografía con Phenyl Sepharose Fast Flow

Las fracciones que contenían NGF se identificaron y agruparon. El conjunto se ajustó hasta acetato 0,7 M, pH 7, MOPSO 25 mM. El conjunto ajustado se cargó sobre una columna de cromatografía Phenyl Sepharose Fast Flow, equilibrada con un tampón de gradiente A (acetato 0,7 M, MOPSO 25 mM, pH 7). La columna se lavó con un gradiente desde el 90% de tampón de gradiente A (acetato 0,7 M, MOPSO 25 mM, pH 7) hasta el 10% de tampón de gradiente B (MOPSO 25 mM, pH 7, 20% de propilenglicol). Pueden emplearse otros glicoles, tales como el hexilenglicol. Típicamente, el lavado era de aproximadamente 2 a 3 CV, o hasta que se alcanzaba una línea base de OD estable. El lavado eliminó algunas proteínas de las células huésped. El NGF se eluyó con un gradiente lineal de 10 CV, desde una mezcla del 90% de tampón de gradiente A y 10% de tampón de gradiente B, hasta una mezcla del 10% de tampón de gradiente A y 90% de tampón de gradiente B. El NaCl o sulfato sódico pueden sustituir el acetato en los tampones para HIC. El pH es preferiblemente desde aproximadamente pH 5 hasta 8, más preferiblemente aproximadamente 5,5 a 7,5, siendo pH 6 a 8 aceptable, y los más preferiblemente aproximadamente 7. La columna separó cualesquiera secuencias precursora, secuencias precursoras parciales, o formas glicosiladas restantes, presentes como un homodímero o como un heterodímero de un monómero de NGF maduro y un monómero de NGF que aún tiene una parte de la secuencia precursora presente. Las formas precursora y glicosilada del NGF están presentes en el extremo anterior del pico de elución, de tal forma que las fracciones que contenían el NGF se agruparon para excluir sustancialmente estas especies.

El conjunto de la HIC contenía aproximadamente un 72% de monómero 120, un 17% de monómero 118, un 2,8% de monómero 117, un 3,6% de monómero R120, un 0,8% de formas isoasp, un 1,3% de formas oxidadas, y un 1% de formas desamidadas, según se separaron y detectaron en un sistema de HPLC analítica.

Cromatografía en SP-Sepharose HP

Las fracciones que contenían NGF procedentes del paso de HIC se agruparon. A gran escala, esto se consiguió dirigiendo el efluente de la columna en el momento apropiado a un tanque de reserva (depósito de retención). El pH del conjunto se ajustó a pH 6, y se aplicó a una columna de cromatografía SP-Sepharose HP. La columna se lavó con succinato 20 mM, NaCl 0,2 M, pH 6 (tampón de gradiente A). El NGF unido se eluyó con un gradiente de 22 CV, empezando con una mezcla de 70% de tampón de gradiente A y 30% de tampón de gradiente B, hasta una mezcla final de 80% de tampón de gradiente B (NaCl 0,7 M/pH 6) y 20% de tampón de gradiente A. El pH es preferiblemente de pH 5 a 8, más preferiblemente pH 5,7 a 6,5, y lo más preferiblemente pH 6. En la Figura 1 se muestra un cromatograma representativo.

El conjunto de la SP-Sepharose rutinariamente contenía aproximadamente un 95% de la forma 120, un 3% de la forma R120, un 0,65% de la forma isoasp, un 0,6% de la forma oxidada, un 0,6% de la forma desamidada. Otras formas no identificadas del NGF estaban a aproximadamente el 0,6%, y comprendían el NGF di-oxidado (Met37 y Met 92) con un Asn45 desamidado presente. En la Figura 2 se muestra un análisis HPIEX que comprobaba un conjunto de HIC representativo (cargado sobre la resina de SP-Sepharose) y el conjunto obtenido después de la cromatografía en SP-Sepharose. Cada una de las tres formas principales recortadas del NGF, la 120, 118 y 117, pueden tener variantes, pero las variantes, tales como las formas oxidadas y isoasp, de la forma recortada predominante durante una purificación (la 120 en este ejemplo) puede enmascarar el análisis de las variantes de las formas menos predominantes (118 y 117 en este ejemplo). En la Figura 3 se muestra un análisis mediante HPLC de fracciones procedentes de un análisis representativo.

La SP-Sepharose HP eliminó efectivamente las variantes presentes en el conjunto de la HIC. La forma R120 tiene un residuo arginina adicional en el extremo N-terminal del NGF; usualmente la secuencia de aminoácidos N-terminal del rhNGF es SSSHP, pero la R120 tiene una secuencia N-terminal que es RSSSHP. Por tanto, la forma R120 es más básica que el NGF maduro, y se separó mediante SP-SHP. Tiene también una bioactividad inferior, probablemente relacionada con el hecho de que el extremo N-terminal del NGF es necesario para la unión al receptor (trkA). La forma del NGF oxidada es una forma mono-oxidada que tiene la metionina en la posición 37 oxidada, rindiendo una forma más ácida que eluye en el borde anterior del pico del NGF. La forma isoasp contiene una modificación del ácido aspártico en el aminoácido 93. La forma isoasp es ligeramente más básica y, por tanto, se une ligeramente con más fuerza a la resina de SP-Sepharose HP. La especie de NGF que contenían isoAsp93 eluyeron en el borde posterior del pico de elución. La desamidación ocurre en los residuos asparagina, típicamente en la asparagina en la posición 45. El NGF que contenía la Asn desamidada, la cual rinde un Asp en la posición 45, es ligeramente más ácido, apareciendo en el borde anterior del pico de elución.

La Fractogel EMD SO3 es una resina alternativa menos preferida que la resina SP-Sepharose HP para separar variantes cargadas de las especie del NGF. Cuando se usa esta resina menos preferida, se precisan concentraciones de NaCl más elevadas para eluir el NGF.

Formulación

El material a granel se formuló mediante UF/DF en un tampón de formulación como en el ejemplo anterior. En el producto a granel final, la forma 120 osciló rutinariamente desde aproximadamente el 92 hasta el 97%, la R120 desde aproximadamente el 1 hasta el 4%, la forma isoasp desde aproximadamente el 0,2 hasta el 1,5%, la forma oxidada desde aproximadamente el 0,2 hasta el 2%, y la forma desamidada desde aproximadamente el 0,2 hasta el 2%. Las formas 117 y 118 eran rutinariamente menos de aproximadamente el 2%. El producto a granel final era rutinariamente al menos un 99,5% NGF puro (incluyendo todas las especies).

Ejemplo III Aislamiento del 118/118

En una realización preferida para obtener una composición de NGF 118/118 sustancialmente puro, que esté sustancialmente libre de variantes del NGF, se siguió el procedimiento del Ejemplo II con las siguientes modificaciones. Se usó una columna de tripsina inmovilidad entre la columna Macroprep High S y la columna de sílice. El conjunto de Macroprep se cargó directamente sobre la columna de tripsina inmovilizada, después de ajustar el pH a entre aproximadamente pH 5 a 8,5, más típicamente 6,5 a 7,5, si era necesario. El conjunto se pasó a través de la columna, tiempo durante el cual la mayoría del NGF se convirtió a la forma 118. La digestión con proteasa convierte la forma 120 en la forma 118 mediante el corte del VRRA C-terminal a VR. Para conseguir el corte limitado y selectivo, se usa una tripsina o proteasa similar a la tripsina, preferiblemente una tripsina, más preferiblemente la tripsina porcina fácilmente asequible, o, alternativamente, la tripsina bovina o una tripsina recombinante. Puede usarse cualquier procedimiento proteolítico que proporcione un corte limitado y selectivo, pero el preferido es una columna de tripsina inmovilizada, con objeto de minimizar la contaminación de la muestra de NGF. La columna se usa a un pH que conduce a la actividad proteasa, preferiblemente pH 5,5 a 8,5, más preferiblemente 6,0 a 8,0, y lo más preferible 6,5 a 7,5.

En este ejemplo, el NGF glicosilado se eliminó mediante HIC tal como se describió más arriba en la presente invención. A continuación de un paso en SP-Sepharose HP, como se ha descrito en la presente invención en el Ejemplo II, pero preferiblemente usando un gradiente de sal de 0,3 M a 0,55 M de 22 volúmenes de columna, se obtuvo una composición preferida de NGF para uso clínico. Puede obtenerse una composición con más del 70% de monómero 118, menos del 10% de monómero 120, y menos del 15% de monómero 117, según se determinó mediante ensayos RP-HPLC. Típicamente se obtienen composiciones superiores o iguales al 90% de rhNGF 118/118, más usualmente superiores o iguales al 93% de rhNGF 118/118, con menos de o igual a aproximadamente el 7% de variantes desamidadas, isoAsp y oxidadas. Una forma para conseguir una pureza mayor es evitar seleccionar fracciones con cantidades significativas de variantes, tales como pueden hallarse en los bordes anterior y posterior del pico de neurotrofina principal, por ejemplo, el pico de rhNGF 118/118.

Ejemplo IV Purificación parcial y replegado de la rhNT-4/5 procedente de cuerpos de inclusión bacterianos

En este ejemplo, empezando con una fermentación de 10 ó 60 litros, se purificó la rhNT-4/5. El huésped usado para producir el NT-4/5 humana recombinante, en la fermentación descrita en este ejemplo, fue una cepa de E. coli denominada 27C7/pmNT5DT; aunque la NT-4/5 producida por otras cepara y organismos es apropiada para los procesos de purificación descritos en la presente invención. El plásmido de expresión usado en este ejemplo contiene secuencia codificante de la NT-4/5 madura, bajo secuencias de control transcripcional y de traducción requeridas para la expresión del gen NT-4/5 en E. coli. En el plásmido que expresa la NT-4/5, las secuencias transcripcionales usadas para la expresión del gen en E. coli las proporcionó la secuencia del promotor de la fosfatasa alcalina. El terminador transcripcional to de lambda se situó adyacente al codón de terminación de la NT-4/5. La secreción de la proteína desde el citoplasma estuvo dirigida por la secuencia señal STII. La mayoría de la rhNT-4/5 se halló en el espacio periplasmático celular como cuerpos refractivos. El plásmido confería resistencia a la tetraciclina al huésped transformado. El proceso de fermentación se realizó a 35ºC-39ºC y pH 7,0-7,8. Se dejó progresar la fermentación durante 25-40 horas, momento en el cual el cultivo se congeló antes de recolectarlo. El cultivo se inactivó mediante tratamiento con calor usando un aparato de flujo continuo a 60ºC, o usando la inactivación por calor en el depósito a esa temperatura durante 5-15 minutos. El cultivo inactivado por calor se centrifugó usando una centrífuga Alpha-laval AX o equivalente. Las células de E. coli se recuperaron en el precipitado.

La células de E. coli, que expresaban la NT-4/5 humana recombinante en cuerpos de inclusión, se lisaron mediante medios estándares para preparar un pasta que contenía la NT-4/5 en cuerpos de inclusión. No se incluyeron inhibidores de proteasas en el tampón.

Para aislar los cuerpos de inclusión de los restos celulares, la pasta de NT-5 de E. coli se resuspendió en Tris 0,02 M, pH 8, EDTA 5 mM (10 ml de tampón/gramo de pasta) usando una dispositivo de dispersión mecánica, rotatorio, por ejemplo un Turrax. La suspensión de células se pasó a través de un microfluidizador tres veces a 6000 psi. El homogenado resultante se centrifugó en una centrífuga Sorvall RC-3B a 5000 r.p.m. durante aproximadamente 45 minutos. Se descartó el sobrenadante, y el precipitado se resuspendió en Tris 20 mM, pH 8, EDTA 5 mM (tampón de extracción), usando un Turrax durante 2 a 3 minutos a velocidad media. El homogenado se centrifugó tal como se describió más arriba. El precipitado se resuspendió en tampón de extracción y se centrifugó como se describió más arriba. El precipitado o precipitados resultantes (denominados como cuerpos de inclusión o cuerpos refractivos de NT-4/5) se almacenaron a -70ºC.

La NT-4/5 se aisló de los cuerpos de inclusión como sigue. Los precipitados de cuerpos de inclusión se suspendieron en Tris 20 mM, pH 8, urea 6 M, DTT 25 mM (10 ml de tampón/gramo de cuerpo de inclusión), usando un Turrax a velocidad media durante 10 minutos. La suspensión se agitó durante 40 minutos a 2-8ºC, y se centrifugó en una Sorvall RC3B a 5000 r.p.m. durante aproximadamente 45 minutos. Se añadió PEI (polietilenimina) al 0,1% al sobrenadante, el cual se agitó a 2-8ºC durante 30 minutos. La PEI precipita el ácido nucleico y otras moléculas cargadas ácidas. La mezcla se centrifugó en una Sorvall RC3B a 5000 r.p.m. durante aproximadamente 45 minutos. El sobrenadante PEI se cargó sobre una columna de Fast Flow DEFF Sepharose column (10 cm \times 14 cm; DEFF es una resina de dietilaminoetil) equilibrada en Tris 0,02 M, urea 6 M, DTT 10 mM, pH 8. Se cargó el equivalente a 1 kg de cuerpos refractivos solubilizados sobre la columna DEFF. Puesto que la NT-4/5 reducida y desnaturalizada no se une a la resina DEFF, el grupo del flujo inicial que contenía la NT-4/5 y urea 6 M se recogió (Figura 6), y el pH del conjunto se disminuyó hasta 5,0 con ácido acético. El conjunto del flujo inicial de la DEFF, con el pH ajustado, se cargó sobre una columna S-Sepharose Fast Flow (S se refiere al grupo funcional SO3 de la resina) equilibrada en acetato 20 mM, pH 5, que contenía urea 6 M, condiciones en las que la NT-4/5 se une a la resina. Después de cargarla, la columna de S-Sepharose Fast Flow se lavó con varios volúmenes de columna de tampón de equilibrado. La NT-4/5 unida se eluyó con NaCl 0,5 M, acetato sódico 20 mM, urea 6 M, pH 5 (Figura 7). El conjunto de 0,5 M NaCl SSFF se dializó durante la noche frente a Tris 20 mM, NaCl 0,14 M, pH 8, condiciones que permiten que la NT-4/5 se repliegue, aunque incorrectamente. Las moléculas de rhNT-4/5 plegadas erróneamente se agregaron para formar un precipitado.

La rhNT-4/5 plegada erróneamente, agregada, se procesó para obtener la NT-4/5 correctamente plegada. La rhNT-4/5 plegada erróneamente, agregada, se recolectó mediante centrifugación como un precipitado. El precipitado se resuspendió en Tris 0,2 M, pH 8, urea 4 M, DTT 5 mM, y se agitó a 2-8ºC durante aproximadamente de 1 a 2 horas, o hasta que el precipitado se disolvió. La concentración de proteína final se ajustó a aproximadamente 10 mg/ml de proteína, en base al coeficiente de extinción de 1,8 a 280 nm. Se añadió glutatión oxidado a la solución de precipitado solubilizado hasta una concentración final de 20 mM, seguido por agitación suave durante de 15 a 30 minutos a 2-8ºC. El glutatión oxidado reacciona con los grupos sulfhidrilo de la NT-4/5 para rendir el disulfuro mixto NT-4/5-S-glutatión. El disulfuro mixto NT-4/5-S-glutatión se diluyó hasta una concentración final de 0,1 a 0,5 mg/ml de proteína en Tris 100 mM, glicina 20 mM, 15% de PEG-300, guanidina-HCl 1 M, pH 8,3. Para iniciar el replegado corrector de la NT-4/5, se añadió cisteína a la mezcla de replegado a una concentración de 2 a 4 mM, seguida por la aireación (mediante burbujeo) de la solución con nitrógeno o helio, durante de 5 a 60 minutos, antes de sellar el contenedor para excluir el oxígeno. El replegado de la NT-4/5 se dejó progresar durante de 18 a 24 horas a de 2 a 8ºC.

Alternativamente, la rhNT-4/5 se replegó usando la sulfitolisis como sigue. Los precipitados de los cuerpos de inclusión (110 g) se suspendieron en 1,1 litros de Tris 20 mM, urea 7 M, glicina 10 mM, sulfito sódico 100 mM, tetrationato sódico 10 mM, y se solubilizaron usando un Turrax durante 10 minutos a velocidad media. La mezcla (1260 ml) se agitó entonces a de 2 a 8ºC durante 45 minutos. Se añadió la PEI hasta una concentración final de 0,1% de PEI. La mezcla se agitó durante 30 minutos adicionales a 4ºC, y se centrifugó durante 45 minutos a 5500 r.p.m. en una centrífuga RC3B. El sobrenadante se cargó sobre una columna DEFF (4,4 cm \times 25 cm) equilibrada en Tris 20 mM, urea 6 M, pH 8. El flujo inicial de la DEFF se ajustó a pH 5 con ácido acético, y se cargó sobre una columna S-Sepharose Fast Flow (4,4 cm \times 25 cm) equilibrada con acetato 20 mM, urea 6 M, pH 5. La NT-4/5 se eluyó con MOPSO 25 mM, NaCl 0,5 M, pH 7.

El conjunto de la SSFF, cloruro sódico 0,5 M, que contenía la rhNT-4/5 sulfonilada se diluyó a aproximadamente 0,1 mg/ml de proteína, y se ajustó a guanidina hidrocloruro 1 M, Tris 100 mM, glicina 20 mM, 15% de PEG-300, pH 8,3. El replegado de la NT-4/5 se inició mediante la adición de cisteína de 2 a 4 mM. La reacción de replegado se había completado esencialmente en 24 horas. La aireación con un gas inerte, por ejemplo, helio o nitrógeno, para sustituir el oxígeno de la solución, puede realizarse de forma óptima.

Ejemplo V de referencia

Aislamiento de la rhNT-4/5 correctamente plegada de variantes conformacionales (plegadas erróneamente)

La mezcla replegada de la rhNT-4/5 del Ejemplo IV se dializó frente a una solución de pH de 4 a 5, durante la noche, para eliminar la guanidina y otros reactivos. Para clarificar la solución, la solución se centrifugó durante 45 minutos a 5000 r.p.m. o se pasó a través de un filtro de 0,2 \mum.

El sobrenadante clarificado, que contenía de 0,5 a 5 gramos de proteína, se ajustó a pH de 3 a 5 mediante la adición de ácido acético glacial, y se cargó sobre una columna C4 de RP-HPLC o se almaceno a -20ºC hasta que estuvo listo para su purificación. En este ejemplo, la solución acidificada y clarificada se cargó sobre una columna C4 RP-HPLC (3 cm \times 50 cm), a cuya resina se unió la rhNT-4/5 plegada. La NT-4/5 correctamente plegada se eluyó usando un gradiente de acetonitrilo en un sistema de solvente con 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA): un gradiente de acetonitrilo del 26% al 40% (a lo largo de un período de 95 minutos) en 0,05% de TFA, a una velocidad de flujo de 25 ml/min. Las fracciones se recogieron a intervalos de 1 a 1,5 minutos (Figura 8). Las fracciones se analizaron en busca de NT-4/5 correctamente plegada, comparando el tiempo de elución en una columna C4 HPLC Vydac (0,21 \times 15 cm) con el de un estándar de NT-4/5 correctamente plegada (Figura 9). El estándar correctamente plegado, NT-4/5 intacta, típicamente eluía a los 19 minutos a una velocidad de flujo de 2,5 ml por minuto, con un sistema tampón 0,5% de TFA/acetonitrilo. Las fracciones que contenían la rhNT-4/5 correctamente plegada se agruparon y se ajustó su pH a de 5 a 7. Este conjunto de rhNT-4/5 correctamente plegada contenía también las formas carbamilada y recortada de forma N-terminal de la NT-4/5.

La resina de cromatografía líquida en fase inversa preparativa es preferiblemente un medio que tiene un diámetro de partícula de aproximadamente 10-40 micrómetros, un tamaño de poro de aproximadamente 200-400 Angstroms, y un grupo alquilo C4, C8 ó C18. Más preferiblemente, la resina tiene un diámetro de partícula de aproximadamente 15-40 micrómetros, y un tamaño de poro de aproximadamente 300 Angstroms, y es un medio de sílice C4.

Ejemplo VI Un aislamiento alternativo de la rhNT-4/5 correctamente plegada de variantes conformacionales (plegadas erróneamente)

La mezcla de rhNT-4/5 replegada del Ejemplo IV se concentró aproximadamente 10 veces usando un sistema de ultrafiltración Millipore-Pellicon, con una membrana de 20 metros cuadrados de celulosa (o polisulfona, o equivalente), con un valor de corte de peso molecular de 10 kD. La mezcla concentrada, o se dializó durante la noche frente a 50 l de acetato 50 mM, pH 5,5, NaCl 50 mM, o se diafiltró en acetato 50 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5, antes de filtrarla a través de una membrana de 0,2 micrómetros.

La mezcla de replegado filtrada se ajustó a NaCl 2,5 M, MOPSON 20 mM, pH 7, y se cargó sobre una columna de HIC, columna fenil Toyopearl 650M (10 cm \times 19 cm), equilibrada previamente en NaCl 2,5 M, MOPSO 20 mM, pH 7. La columna se lavó entonces con tampón de equilibrado. Algunas formas plegadas erróneamente de la molécula rhNT-4/5 eluyeron en las fracciones de flujo inicial, mientras que otras formas plegadas erróneamente eluyeron a concentraciones más elevadas de solventes orgánicos, tales como del 20 al 40% de alcohol reactivo. La rhNT-4/5 correctamente plegada se eluyó ed la columna de fenilo usando cloruro sódico 2 M, 10% de alcohol reactivo, pH 7 (Figura 10). Pueden usarse otras resinas de fenilo, tales como la fenil-Sepharose, en lugar del esqueleto de Toyopearl. Pueden usarse las sales descritas en la presente invención, incluyendo el sulfato amónico, el citrato, el acetato, y el cloruro potásico. Dependiendo de la sal usada, la concentración de sal es típicamente de 1 M a 3 M, prefiriéndose NaCl 2,5 M para la carga, y NaCl 2 M para la elución, cuando está presente el solvente orgánico. Preferiblemente, se usa una disminución de la concentración de sal para eluir y separar una neurotrofina de sus variantes. Con objeto de conseguir la elución, la concentración de sal en el tampón de elución es típicamente inferior a la del tampón de elución, pero puede ser la misma concentración cuando se compensa con solvente orgánico. Además, el uso de solvente orgánico tiene otra ventaja, tal como se ha hallado en la presente invención, que la adición de un solvente orgánico mejora el patrón de elución al resultar en perfiles de pico más estrechos. Además del etanol, puede usarse otros solventes orgánicos descritos en la presente invención, incluyendo el propanol, isopropanol y glicoles de alquileno inferior, tales como el propilenglicol, etilenglicol, y hexilenglicol. El solvente orgánico del 5 al 25% (v/v), más preferiblemente del 5 al 20% (v/v), incluso más preferiblemente del 5 al 15% (v/v), típicamente eluirá una neurotrofina correctamente plegada. La elución con solvente orgánico puede ser mediante un gradiente o paso a paso. El rango de pH es preferiblemente de cercano a neutro, a ligeramente ácido, desde pH 5 hasta 8, más preferiblemente desde pH 5,5 hasta 7,5, y los más preferiblemente pH 7. Puede emplearse cualquiera de los tampones descritos en la presente invención, incluyendo el MOPSO, MOPS, HEPES, fosfato, citrato, acetato amónico, a condición que tamponen en el pH deseado.

Ejemplo VII Purificación de la rhNT-4/5 correctamente plegada de las variantes químicas

La separación de la rhNT-4/5 intacta, correctamente plegada, de sus variantes químicas, incluyendo las formas carbamiladas y recortadas N-terminalmente de la rhNT-4/5, se consiguió mediante cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, usando la resina SP-Sepharose HP, o PolyCat, una resina de HPLC.

Cuando se usó la columna C4 de RP-HPLC para eliminar variantes plegadas erróneamente, el conjunto de C4 HPLC se ajustó a pH de 5 a 7, y se cargó sobre una columna de 7 cm \times 19 cm de SP-Sepharose HP, equilibrada en succinato 20 mM, pH 6, 5% de alcohol reactivo, NaCl 0,2 M. La resina con la NT-4/5 unida se lavó con tampón de equilibrado. La rhNT-4/5 unida se eluyó y separó de las formas carbamiladas y recortada N-terminalmente usando un gradiente de 22 volúmenes de columna (CV), desde NaCl 0,2 M hasta NaCl 0,4 M, a pH 6 (es decir, un gradiente salino en el tampón de equilibrado) (Figura 11). Las fracciones que contenían la NT-4/5 se agruparon y formularon en acetato 0,05 M, pH de 4 a 5. La rhNT-4/5 intacta se identificó y distinguió de las variantes en las fracciones preferiblemente mediante RP-HPLC analítica, o mediante SDS-PAGE, tal como se describe en la presente invención, comparándola con un estándar.

Alternativamente, las formas variantes de la NT-4/5 se eliminaron mediante HPLC de intercambio catiónico de elevadas prestaciones sobre una columna de ácido poliaspártico (PolyCAT a, PolyLC, Columbia, Md.) (9,4 \times 200 mm) (Figura 12). El conjunto de C4 HPLC se ajustó a pH de 5 a 6, y a continuación se cargó sobre la columna PolyCAT. Las condiciones cromatográficas fueron: el Tampón A era fosfato 20 mM, 5% de acetonitrilo, pH 6; el Tampón B era fosfato 20 mM, 5% de acetonitrilo, KCl 0,8 M, pH 6. La rhNT-4/5 se eluyó usando un gradiente del 25% al 60% de Tampón B, a lo largo de 65 minutos. Las fracciones se recogieron a intervalos de 1 minuto, y se analizaron mediante HPLC en C4 analítica, según se describió más arriba.

Cuando se usó la HIC para eliminar las variantes plegadas erróneamente (Ejemplo VI anterior), el conjunto de NT-4/5 correctamente plegada se dializó durante la noche, en succcinato 20 mM, NaCl 0,1 M, alcohol reactivo al 5%, pH 6, o se ultrafiltró/diafiltró en el tampón succinato 20 mM. El conjunto dializado o UF/DF se cargó a continuación sobre una columna SP-Sepharose HO o PolyCAT tal como se describió más arriba.

Formulación. Las fracciones que contenían la NT-4/5 intacta, correctamente plegada (procedentes de un paso de HPLC con SP-Sepharose HP ó PolyCAT) se agruparon y se concentraron a 1 a 5 mg/ml en acetato 20 mM, pH 4 a 5, tampón de formulación.

Alternativamente, la NT-4/5 se formuló usando ultrafiltración/diafiltración.

La solución final a granel se analizó mediante el análisis de aminoácidos, el análisis de la secuencia N-terminal, espectrometría de masas, SDS-PAGE (Figura 13), y ensayos biológicos. Se usó un ensayo de activación del receptor quinasa (KIRA), que detecta la activación por parte de la NT-4/5 de la autofosforilación de su receptor quinasa de tirosina (trkB) ubicado en la membrana celular, para caracterizar la rhNT-4/5 purificada. Se usaron células CHO que expresaban el trkB con una etiqueta gD. La WO 95/14930, publicada el 1 de junio de 1995, describe el ensayo KIRA, y se incorpora en la presente invención por referencia. La rhNT-4/5 tenía una EC50 de 12,6 ng/ml en este ensayo. Típicamente, la EC50 de la NT-4/5 intacta, correctamente plegada, purificada según se describe en la presente invención, es de 5 a 30, más preferiblemente de 10 a 20.

La pureza de la rhNT-4/5 con respecto a las proteínas que no son NT-4/5 era típicamente del 90 al 99 por ciento. La homogeneidad de la NT-4/5 con respecto a las variantes carbamilada y recortada N-terminalmente era del 90 al 99 por ciento. Más típica, y preferiblemente, la pureza y homogeneidad eran del 99% o superiores.

Ejemplo VIII de referencia

Purificación inicial, replegado, y purificación final de la rhNT-3 procedente de cuerpos de inclusión bacterianos

Para aislar los cuerpos de inclusión procedentes de los restos celulares, la pasta de NT-3 de E. coli (1 kg) se resuspendió en 10 l de acetato sódico 100 mM, pH 5, usando una dispositivo de dispersión mecánica, rotatorio, por ejemplo un Turrax. La suspensión de células se pasó a través de un microfluidizador tres veces a 6000 psi. El homogenado resultante se centrifugó en una centrífuga Sorvall RC-3B a 5000 r.p.m. durante 30 minutos.

La NT-3 se aisló de los cuerpos de inclusión como sigue. Los precipitados de cuerpos de inclusión se suspendieron en Tris 100 mM, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, sulfito sódico 100 mM, tetrationato sódico 10 mM, urea 7,5 M, pH 8,3, (10 ml/gramo de cuerpo de inclusión), usando un Turrax a velocidad media durante 10 minutos. La suspensión se agitó durante aproximadamente una hora a 2-8ºC. Se añadió PEI (polietilenimina) al 0,15% (concentración final) y se agitó a 2-8ºC durante 30 minutos. La mezcla se centrifugó en una Sorvall RC3B a 5000 r.p.m. durante aproximadamente 30 minutos. El sobrenadante se filtró con un cartucho Gelman Preflow. El sobrenadante filtrado se diluyó con 3 volúmenes de tampón de equilibrado para S-Sepharose Fast Flow (acetato sódico 50 mM, urea 5 M, pH 5). El sobrenadante filtrado diluido (conductividad inferior a 7 mS) se cargó sobre una columna de FF S-Sepharose equilibrada con acetato sódico 50 mM, urea 5 M, pH 5,0. La columna se lavó primero con acetato sódico 50 mM, urea 5 M, pH 5, seguidos por MOPS 50 mM, urea 5 M, glicina 10 mM, pH 7.0. La NT-3 sulfitolizada se eluyó de la columna usando un gradiente de 10 volúmenes de columna, desde NaCl 0-0,6 M en MOPS 50 mM, urea 5 M, glicina 10 mM, pH 7.

La NT-3 parcialmente purificada se replegó diluyendo el conjunto de S-Sepharose FF hasta aproximadamente 0,1 mg/ml de proteína en tampón de replegado que contenía Tris 0,1 M, urea 2 M, NaCl 0,1 M, un 15% de PEG 300, glicina 10 mM, etanolamina 25 mM, pH 9,1. El replegado se inició añadiendo cisteína hasta aproximadamente 5 mM, y agitando durante 2-5 días a 2-8ºC. Opcionalmente, el tampón de replegado puede airearse con He o Argón para reducir la concentración de oxígeno en la solución de replegado.

El pH del conjunto replegado se ajustó a pH 7, se filtró, y se cargó sobre una columna de cromatografía de intercambio catiónico Macroprep High S, equilibrada en HEPES 50 mM, pH 7. Después de cargar el conjunto de replegado con el pH ajustado sobre la columna Macroprep, se lavó primero la columna con MOPS 50 mM, pH 7, seguido por MOPS 50 mM, TMAC 0,1 M, NaCl 0,3 M, pH 7. La NT-3 se eluyó con MOPS 50 mM, TMAC 0,25 M, NaCl 1,5 M, pH 7.

El conjunto Macroprep se purificó a continuación adicionalmente sobre columna Phenyl Sepharose Fast Flow High Substitution. La columna de fenilo se equilibró en HEPES 50 mM, NaCl 1,5 M, pH 7, y el conjunto Macroprep se cargó directamente sobre la columna de fenilo. La columna se lavó con tampón de equilibrado, y a continuación se eluyó la NT-3 correctamente replegada usando un gradiente de 15 volúmenes de columna, que iba desde HEPES 50 mM, NaCl 1,5 M, pH 7 hasta HEPES 50 mM, 10% de alcohol reactivo, pH 7. Las fracciones se analizaron bien mediante HPLC con C4 o mediante SDS-PAGE, y las fracciones que contenían la NT-3 correctamente plegada se agruparon.

El conjunto Fenilo se diluyó hasta menos de 25 mS (típicamente aproximadamente 2 volúmenes de agua), y se cargó sobre una columna SP-Sepharose HP previamente equilibrada en MOPSO 25 mM, pH 7. La columna se lavó primero con tampón de equilibrado, y la NT-3 se eluyó de la columna usando un gradiente de 20 volúmenes de columna que iba desde TMAC 0,35 M hasta TMAC 0,65 M, en MOPSO 25 mM, pH 7. Las fracciones que contenían rhNT-3 (según se juzgó mediante el ensayo de HPLC con C4) se agruparon.

El conjunto SP-Sepharose HP se concentró hasta aproximadamente 1 mg/ml sobre una membrana de peso molecular 10.000, y a continuación se diafiltró con 6 volúmenes de acetato 10 mM, NaCl 140 mM, pH 5,0.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se haya tenido un gran cuidado en recoger las referencias, no puede excluirse la presencia de errores u omisiones y por ello la EPO declina cualquier responsabilidad a este respecto.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Purificación de Neurotrofinas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(B)

CALLE: 1 DNA Way

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete flexible de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE LA SOLICITUD PREVIA:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 60/030838

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 15-NOV-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE LA SOLICITUD PREVIA:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 60/047855

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 29-MAY-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Torchia, PhD., Timothy E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.700

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: P1063R2PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELEFONO: 650/225-8674

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650/952-9881

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 241 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 120 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 2:

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 120 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 119 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 5:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 6:

6

Claims (19)

1. Proceso para aislar una neurotrofina humana recombinante, o una forma genéticamente manipulada de la misma, a partir de una mezcla que contiene otras proteínas y una variante de esta neurotrofina humana recombinante que puede incluir una variante plegada erróneamente, una variante procesada proteolíticamente de forma incorrecta, o una variante de glicosilación, de esa neurotrofina humana recombinante, que comprende separar la neurotrofina humana recombinante de las otras proteínas y de la variante de la neurotrofina humana recombinante en la mezcla, mediante el uso de resina de cromatografía de interacción hidrofóbica, en donde la separación comprende cargar la mezcla sobre una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica y eluir la neurotrofina humana recombinante de la resina con un tampón de elución que contiene un solvente orgánico a una concentración de entre el 5% al 25% (v/v), en condiciones en las que la neurotrofina humana recombinante se separa de la variante.

2. El proceso según la reivindicación 1, en el cual la resina comprende un grupo funcional fenilo.

3. El proceso según la reivindicación 1, en donde la mezcla cargada sobre la resina de cromatografía de interacción hidrofóbica tiene un pH de 5 a 8.

4. El proceso según la reivindicación 1, en donde la mezcla cargada sobre la resina tiene una concentración de sal de 0,5 M a 3 M.

5. El proceso según la reivindicación 4, en donde la mezcla cargada sobre la resina tiene una concentración de sal de 0,5 M a 2,5 M.

6. El proceso según la reivindicación 5, en donde la mezcla cargada sobre la resina tiene una concentración de sal de 0,7 M de acetato, ó de 1,0 a 2,5 M de NaCl.

7. El proceso según la reivindicación 1, en donde el solvente orgánico es del 5% al 20% en volumen.

8. El proceso según la reivindicación 1, en donde el pH del tampón de elución es de pH 5 a pH 8.

9. El proceso según la reivindicación 1, en donde la elución comprende un gradiente de sal decreciente.

10. El proceso según la reivindicación 1, en donde la neurotrofina humana recombinante está en la superfamilia del NGF.

11. El proceso según la reivindicación 10, en donde la neurotrofina humana recombinante es el NGF, la NT-4/5, o la NT-3.

12. El proceso según la reivindicación 1, en donde la neurotrofina humana recombinante se prepara a partir de cultivo bacteriano, y se repliega in vitro antes de usar la resina de interacción hidrofóbica.

13. El proceso según la reivindicación 1, en donde la neurotrofina humana recombinante se aísla de un cultivo de células de mamífero.

14. El proceso según la reivindicación 1, que comprende además separar la neurotrofina humana recombinante de sus variantes químicas, usando resina de cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones.

15. El proceso según la reivindicación 14, en donde el paso de separación, mediante la cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, incluye cargar una mezcla que comprende la neurotrofina humana recombinante y una variante química de esa neurotrofina humana recombinante, sobre una resina de cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, y eluir la neurotrofina humana recombinante de la resina en condiciones en las cuales la neurotrofina humana recombinante se separa de la variante química, y en donde la neurotrofina human recombinante tiene un pI elevado.

16. El proceso según la reivindicación 15, en donde la resina de intercambio catiónico de elevadas prestaciones es una resina SP-Sepharose HP, poli ácido aspártico, de intercambio catiónico de polisulfoetil, o Fractogel EMD
SO3.

17. El proceso según la reivindicación 15, en donde el eluato que contiene la neurotrofina humana recombinante, procedente de la resina de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, se desala o somete a diafiltración, y a continuación se formula con un portador.

18. El proceso según la reivindicación 1, que comprende además separar la neurotrofina humana recombinante de otras proteínas usando resina de gel de sílice.

19. Proceso para purificar una neurotrofina humana recombinante, el cual comprende:

(a) cargar una mezcla, que comprende la neurotrofina humana recombinante y sus variantes, sobre una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica, a pH 5 a 8;

(b) lavar la resina con un tampón a pH 5 a 8;

(c) eluir la neurotrofina humana recombinante con un tampón a un pH de 5 a 8, el cual contiene un solvente alcohólico o aprótico polar a una concentración del 5 al 25% (v/v);

(d) cargar el eluyente que contiene la neurotrofina humana recombinante sobre una resina de cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, a un pH de 5 a 6; y

(e) eluir la neurotrofina humana recombinante, de la resina de cromatografía de intercambio catiónico de elevadas prestaciones, con un tampón a un pH de 5 a 6, el cual contiene un catión con una concentración de 0,2 a 0,5 M.