ES2293726T3 - Acidos grasos poliinsaturados en plantas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para producir ácido estearidónico en una semilla vegetal, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una planta que tiene integrado en su genoma un primer constructo de ADN que comprende, en la dirección de transcripción 5'' a 3'', un promotor funcional en una célula de semilla vegetal, una secuencia de ADN que codifica una delta-seis desaturasa, y una región de terminación de la transcripción funcional en una célula vegetal, y un segundo constructo que comprende en la dirección de transcripción 5'' a 3'', un promotor funcional en una célula de semilla vegetal, y una secuencia de ADN que codifica una delta-15 desaturasa y cultivar dicha planta bajo condiciones mediante las cuales se expresan dicha delta-seis desaturasa y dicha delta-15 desaturasa.
Description
Ácidos grasos poliinsaturados en plantas.
Esta invención se refiere a niveles moduladores
de enzimas y/o componentes de enzima capaces de alterar la
producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFAS)
en una planta huésped.
Tres familias principales de ácidos grasos
poliinsaturados (PUFA) son los ácidos grasos \omega3,
ejemplificados por el ácido araquidónico, los ácidos grasos
\omega9 ejemplificados por el ácido Mead, y los ácidos grasos
\omega3, ejemplificados por el ácido eicosapentenoico. Los PUFA
son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula,
donde se pueden encontrar en formas tales como fosfolípidos. Los
PUFA también actúan como precursores de otras moléculas de
importancia en los seres humanos y animales, que incluyen las
prostaciclinas, leucotrienos y prostaglandinas. Los PUFA son
necesarios para el desarrollo propiamente dicho, particularmente en
el desarrollo del cerebro del niño, y para la formación y reparación
tisular.
Los cuatro PUFA de cadena larga principales
incluyen el ácido docosahexenoico (DHA) y ácido eicosapentenoico
(EPA), que se encuentran fundamentalmente en distintos tipos de
aceites de pescado, el ácido gamma-linolénico
(GLA), que se encuentra en las semillas de una serie de plantas, que
incluyen la primavera (Oenothera biennis), la borraja
(Borago officinalis) y el grosellero negro (Ribes
nigrum), y el ácido estearidónico (SDA), que se encuentra en
aceites marinos y semillas vegetales. El GLA y otro PUFA de cadena
larga importante, el ácido araquidónico (ARA), se encuentran en los
hongos filamentosos. El ARA se puede purificar a partir de tejidos
animales que incluyen el hígado y la glándula suprarrenal. El ácido
Mead se acumula en animales que carecen de ácido graso
esencial.
esencial.
Para el DHA, existe una serie de fuentes para la
producción comercial que incluyen una variedad de organismos
marinos, aceites obtenidos de pescado de agua fría, y fracciones de
yema de huevo. Para el ARA, se pueden usar microorganismos que
incluyen los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y
Porphyridium para la producción comercial. Las fuentes
comerciales de SDA incluyen los géneros Trichodesma y
Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen primavera,
grosellero negro y borraja. Sin embargo, existen diversos
inconvenientes asociados con la producción comercial de los PUFA a
partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de los PUFA,
tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de
aceite altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos de estas
fuentes pueden por tanto requerir una extensa purificación para
aislar uno o más PUFA deseados o para producir un aceite que esté
enriquecido en uno o más PUFA. Las fuentes naturales también están
sujetas a fluctuaciones incontrolables en la disponibilidad. Las
reservas de peces pueden sufrir variación natural o se pueden
agotar por sobrepesca. Los aceites de pescado tienen sabores y
olores desagradables, que pueden ser económicamente imposibles de
separar del producto deseado, y pueden hacer que tales productos
resulten inaceptables como suplementos alimenticios. Los aceites
animales, y particularmente los aceites de pescado, pueden acumular
contaminantes ambientales. El clima y la enfermedad pueden provocar
fluctuación en la producción de las fuentes vegetales y de pescado.
El terreno de cultivo disponible para la producción de cosechas
alternas productoras de aceite está sujeto a competencia a partir de
la continua expansión de las poblaciones humanas y la mayor
necesidad asociada de producción de alimentos en las tierras de
cultivo que quedan. Los cultivos que producen PUFA, tales como la
borraja, no han sido adaptados al desarrollo comercial y pueden no
rendir bien en monocultivo. Por tanto el desarrollo de tales
cultivos no es económicamente competitivo cuando se pueden
implantar cultivos mejor establecidos y más aprovechables. La
fermentación a gran escala de organismos tales como
Mortierella también es costosa. Los tejidos animales
naturales contienen bajas cantidades de ARA y son difíciles de
procesar. Microorganismos tales como Porphyridium y
Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial.
Los suplementos dietéticos y formulaciones farmacéuticas que
contienen PUFA pueden mantener los inconvenientes de la fuente del
PUFA. Suplementos tales como cápsulas de aceite de pescado pueden
contener bajos niveles del componente particular deseado y por lo
tanto requerir dosis grandes. Las dosis elevadas causan la
ingestión de altos niveles de componentes no deseados. Se debe
tener cuidado al proporcionar suplementos de ácidos grasos, ya que
la sobreadición puede desembocar en la supresión de rutas
biosintéticas endógenas y llevar a la competencia con otros ácidos
grasos necesarios en diversas fracciones lipídicas in vivo,
llevando a resultados indeseados. Por ejemplo, los esquimales que
tienen una dieta alta en ácidos grasos \omega3 tienen una mayor
tendencia a sangrar (Patente de EE.UU. Nº 4.874.603). Los sabores y
olores desagradables de los suplementos pueden volver tales
regímenes indeseables, y pueden inhibir la aceptación por el
paciente.
Una serie de enzimas están implicadas en la
biosíntesis de PUFA. El ácido linoleico (LA, 18:2 \Delta9, 12) se
produce a partir del ácido oleico (18:1 \Delta9) mediante una
desaturasa-\Delta12. El GLA (LA, 18:3 \Delta6,
9, 12) se produce a partir del ácido linoleico (LA, 18:2 \Delta9,
12) mediante una desaturasa-\Delta6. La
producción de ARA (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) a partir de DGLA (20:3
\Delta8, 11, 14) está catalizada por una
desaturasa-\Delta5. Sin embargo, los animales no
pueden desaturar más allá de la posición \Delta9 y por lo tanto
no pueden transformar ácido oleico (18:1 \Delta9) en ácido
linoleico (18:2 \Delta9, 12). Asimismo, el ácido
\alpha-linolénico (ALA, 18:3 \Delta9, 12, 15) no
puede ser sintetizado por mamíferos. Otros eucariotas, que incluyen
hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones
\Delta12 y \Delta15. Los principales ácidos grasos
poliinsaturados derivan por tanto de la dieta y/o desaturación y
elongación del ácido linoleico (ALA, 18:2 \Delta9, 12) o ácido
\alpha-linolénico (18:3 \Delta9, 12, 15).
Los ácidos grasos poliinsaturados se consideran
útiles para propósitos nutricionales, farmacéuticos, industriales y
otros. Un suministro expansivo de ácidos grasos poliinsaturados a
partir de fuentes naturales y de síntesis química no basta para las
necesidades comerciales. Por lo tanto es de interés obtener material
genético implicado en la biosíntesis de PUFA a partir de especies
que producen estos ácidos grasos de manera natural y expresar el
material aislado por separado o en combinación en un sistema
heterogéneo que se puede manipular para permitir la producción de
cantidades comerciales de PUFA.
Se proporcionan composiciones y procedimientos
nuevos para la preparación de ácido estearidónico y desaturasas en
plantas y células vegetales. Los procedimientos implican cultivar
una planta que tiene integrado en su genoma un primer constructo de
ADN que comprende, en la dirección de transcripción 5' a 3', un
promotor funcional en una célula de semilla vegetal, una secuencia
de ADN que codifica una delta-seis desaturasa, y una
región de terminación de la transcripción funcional en una célula
vegetal, y un segundo constructo que comprende en la dirección de
transcripción 5' a 3', un promotor funcional en una célula de
semilla vegetal, y una secuencia de ADN que codifica una
delta-15 desaturasa y cultivar dicha planta bajo
condiciones mediante las cuales se expresen dicha
delta-seis desaturasa y dicha
delta-15 desaturasa. Preferiblemente, dicha planta
tiene un tercer constructo integrado en su genoma, en el que dicho
tercer constructo tiene en la dirección de transcripción 5' a 3',
un promotor funcional en una célula de semilla vegetal, y una
secuencia de ADN que codifica una desaturasa delta 12. La expresión
del polipéptido de desaturasa proporciona una alteración del perfil
de PUFA de las célula de la planta huésped como consecuencia de
concentraciones alteradas de enzimas implicadas en la biosíntesis
de PUFA. Es de particular interés el control selectivo de la
producción de PUFA en semillas vegetales. La invención encuentra
uso en la producción a gran escala de ácido estearidónico y
modificación de la forma del perfil de ácido graso de semillas y/o
aceites de semillas vegetales.
La invención proporciona además una planta
transgénica o semilla de la misma que tiene integrado en su genoma
un primer constructo de ADN que comprende, en la dirección de
transcripción 5' a 3', un promotor funcional en una célula de
semilla vegetal, un ADN que codifica una delta-seis
desaturasa, y una región de terminación de la transcripción
funcional en una célula vegetal, y un segundo constructo que
comprende, en la dirección de transcripción 5' a 3', un promotor
funcional en una célula de semilla vegetal, y una secuencia de ADN
que codifica una delta-15 desaturasa, que es capaz
de expresar la delta-seis desaturasa y la
delta-15 desaturasa y de producir aceite de semilla
que contenga ácido estearidónico también es parte de la invención.
La semilla de la planta transgénica anterior comprende
preferiblemente aproximadamente un 5 por ciento en peso del ácido
estearidónico mayor como componente de los ácidos grasos totales que
se encuentran en el aceite de semilla. La invención proporciona
además aceite de semilla obtenido a partir de la semilla de dicha
planta transgénica y un tejido de semilla vegetal de dicha planta
transgénica que comprende dicho aceite de semilla.
La Figura 1 muestra posibles rutas para la
síntesis de ácido Mead (20:3 \Delta5, 8, 11), ácido araquidónico
(20:4 \Delta5, 8, 11, 14) y ácido estearidónico (18:4 \Delta6,
9, 12, 15) a partir de ácido palmítico (C_{16}) de una variedad de
organismos, que incluyen algas, Mortierella y humanos. Estos
PUFA pueden actuar como precursores de otras moléculas importantes
para humanos y otros animales, que incluyen prostaciclinas,
leucotrienos, y prostaglandinas, algunas de las cuales se
muestran.
La Figura 2 muestra posibles rutas para la
producción de PUFA además de ARA, que incluyen ácido taxoleico y
pinolénico, de nuevo reunidos a partir de una variedad de
organismos.
Para asegurar una total comprensión de la
invención, se proporcionan las siguientes definiciones:
\Delta5-Desaturasa: La
\Delta5-desaturasa es una enzima que introduce un
doble enlace entre los carbonos 5 y 6 desde el extremo carboxilo de
una molécula de ácido graso.
\Delta6-Desaturasa: La
\Delta6-desaturasa es una enzima que introduce un
doble enlace entre los carbonos 6 y 7 desde el extremo carboxilo de
una molécula de ácido graso.
\Delta9-Desaturasa: La
\Delta9-desaturasa es una enzima que introduce un
doble enlace entre los carbonos 9 y 10 desde el extremo carboxilo de
una molécula de ácido graso.
\Delta12-Desaturasa: La
\Delta12-desaturasa es una enzima que introduce un
doble enlace entre los carbonos 12 y 13 desde el extremo carboxilo
de una molécula de ácido graso.
\newpage
Ácidos grasos: Los ácidos grasos son una
clase de compuestos que contienen una cadena hidrocarbonada larga y
un grupo carboxilato terminal. Los ácidos grasos incluyen los
siguientes:
Teniendo en cuenta estas definiciones, la
presente invención está dirigida a constructos de ADN relacionados
con la producción de ácidos grasos en plantas. Se proporcionan
procedimientos y composiciones que permiten la modificación del
contenido en ácido graso poliinsaturado de cadena larga de las
células vegetales. Las células vegetales se transforman con un
casete de expresión que comprende un ADN que codifica un polipéptido
capaz de aumentar la cantidad de uno o más PUFA en una célula
vegetal. Los constructos de integración proporcionan la integración
del casete de expresión en el genoma de una célula huésped. Las
células huésped se manipulan para expresar un ADN sentido que
codifica un(os) polipéptido(s) que tiene(n)
actividad desaturasa. Por "desaturasa" se quiere decir un
polipéptido que puede desaturar uno o más ácidos grasos para
producir un ácido graso mono- o poli-insaturado o
un precursor de interés del mismo. Por "polipéptido" se quiere
decir cualquier cadena de aminoácidos, sin tener en cuenta la
longitud o modificación post-traduccional, por
ejemplo, glicosilación o fosforilación. El/los sustrato(s)
para la enzima expresada puede(n) ser producido(s) por
la célula huésped o se pueden suministrar exógenamente.
Para conseguir la expresión en una célula
huésped, el ADN transformado se asocia operativamente con las
regiones reguladoras de iniciación y terminación transcriptora y
traductora que son funcionales en la célula huésped. Los
constructos que comprenden el gen que se va a expresar proporcionan
integración en el genoma de la célula huésped. Para la producción
de SDA, los casetes de expresión incluyen un casete que proporciona
actividad desaturasa \Delta6, particularmente en una célula
huésped que produzca o pueda absorber ALA.
La producción de ácidos grasos por plantas
transgénicas ofrece diversos inconvenientes sobre la purificación a
partir de fuentes naturales tales como el pescado o las plantas. La
producción de ácidos grasos a partir de plantas recombinantes
proporciona la capacidad de alterar el perfil de ácidos grasos en
plantas que aparece de manera natural proporcionando nuevas rutas
sintéticas en el huésped, incrementando de este modo los niveles de
los PUFA deseados, o formas conjugadas de los mismos, y reduciendo
los niveles de los PUFA no deseados. La producción de ácidos grasos
en plantas transgénicas también ofrece la ventaja de que la
expresión de genes de desaturasa en tejidos y/o partes vegetales
particulares significa que se pueden lograr los niveles de los PUFA
deseados aumentados en gran parte en esos tejidos y/o partes,
haciendo más económica la recuperación a partir de esos tejidos.
Los PUFA deseados se pueden expresar en semillas; los procedimientos
de aislamiento de aceites de semillas están bien establecidos.
Además de proporcionar una fuente para la purificación de los PUFA
deseados, los componentes de aceite de semilla pueden manipularse
mediante la expresión de genes de desaturasa, por separado o en
combinación con otros genes tales como los de elongasas, para
proporcionar aceites de semillas que tengan un perfil de PUFA
particular en forma concentrada. Los aceites de semillas
concentrados que pueden añadirse a leches animales y/o leches
sintéticas o semi-sintéticas para actuar como
fórmulas para bebés en las que el cuidado humano es imposible o
indeseado, o en casos de malnutrición o enfermedad en adultos y
bebés.
Para la producción de ácido estearidónico,
dependiendo de la célula huésped, la disponibilidad de sustrato, y
el/los producto(s) final(es) deseado(s),
diversos polipéptidos, particularmente desaturasas, resultan de
interés incluyendo aquellos polipéptidos que catalizan la conversión
de ALA en SDA, de ácido oleico en LA, o de LA en ALA, que incluyen
enzimas que desaturan en las posiciones \Delta6, \Delta12 ó
\Delta15. Las consideraciones para elegir un polipéptido
específico que tenga actividad desaturasa incluyen el pH óptimo del
polipéptido, si el polipéptido es una enzima limitante de la
velocidad o un componente de la misma, si la desaturasa usada es
esencial para la síntesis de un ácido graso
poli-insaturado deseado, y/o cofactores requeridos
por el polipéptido. El polipéptido expresado preferiblemente tiene
parámetros compatibles con el ambiente bioquímico de su ubicación
en la célula huésped. Los análisis de la K_{m} y la actividad
específica del polipéptido en cuestión se consideran por lo tanto
en la determinación de la aptitud de un polipéptido dado para
modificar la producción de PUFA en una célula huésped dada. Por
tanto el polipéptido usado en un situación particular es uno que
puede funcionar bajo las condiciones presentes en la célula huésped
deseada pero de otra forma puede ser cualquier polipéptido que
tenga actividad desaturasa que tenga las características deseadas
de ser capaz de modificar la producción relativa de ácido
araquidónico. En la Figura 1 se muestra un esquema ejemplar para la
síntesis de ácido araquidónico (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) a partir
de ácido palmítico (C_{16}). Una enzima clave en esta ruta es una
desaturasa-\Delta5 que transforma el ácido DH-
\gamma-linolénico (DGLA, ácido eicosatrienoico)
en ARA. También se muestra la conversión de ácido
\alpha-linolénico (ALA) en ácido estearidónico
por una desaturasa-\Delta6. En la Figura 2 se
muestra la producción de los PUFA junto con la de ARA, que incluyen
EPA y DHA. Una enzima clave en la síntesis de ácido araquidónico
(20:4 \Delta5, 8, 11, 14) a partir de ácido esteárico (C_{18})
es una \Delta6-desaturasa que transforma el ácido
linoleico en ácido \gamma-linolénico. También se
muestra la conversión de ácido \alpha-linolénico
(ALA) en ácido estearidónico por una
\Delta6-desaturasa. La elección de la combinación
de casetes usados depende en parte del perfil de PUFA de la célula
huésped.
Las fuentes de polipéptidos que tienen actividad
desaturasa y de oligonucleótidos que codifican para tales
polipéptidos son organismos que producen un ácido graso
poliinsaturado deseado. A modo de ejemplo, microorganismos cuyo GLA
o SDA se puede usar como fuente de genes de
\Delta6-desaturasa y/o
\Delta12-desaturasa. Tales microorganismos
incluyen, por ejemplo, aquellos pertenecientes a los géneros
Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicillium,
Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus,
Rhodotorula, y Entomophthora. En el contexto de la
invención, la secuencia codificadora de la
desaturasa-\Delta6 es preferiblemente de los
genes de Mortierella. Dentro del género Porphyridium,
es de particular interés Porphyridium cruentum. Dentro del
género Mortierella, son de particular interés Mortierella
elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella
ramanniana var. angulispora, y Mortierella alpina. Dentro
del género Mucor, son de particular interés Mucor
circinelloides y Mucor javanicus.
Los ADN que codifican para desaturasas deseadas
pueden identificarse de una variedad de maneras. A modo de ejemplo,
una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo bibliotecas
genómicas o de ADNc de Mortierella, se explora con sondas
sintetizadas enzimática o químicamente detectables, que pueden estar
hechas de ADN, ARN, o nucleótidos que no aparecen de forma natural,
o de mezclas de los mismos. Las sondas pueden sintetizarse
enzimáticamente a partir de ADN de desaturasas conocidas para
procedimientos de hibridación normal o de rigor reducido. También
pueden usarse sondas de oligonucleótidos para explorar fuentes y
pueden basarse en secuencias de desaturasas conocidas, que incluyen
secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias
peptídicas obtenidas a partir de la proteína purificada deseada. Las
sondas de oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos
pueden degenerarse para englobar la degeneración del código
genético, o pueden predisponerse a favor de los codones preferidos
del organismo fuente. También se pueden usar oligonucleótidos como
cebadores para PCR a partir de ARNm transcrito inverso a partir de
una fuente conocida o sospechosa; el producto del PCR puede ser el
ADNc de longitud completa o se puede usar para generar una sonda
para obtener el ADNc de longitud completa deseado. De manera
alternativa, se puede secuenciar totalmente una proteína deseada y
llevar a cabo la síntesis completa de un ADNc que codifique para ese
polipéptido.
Una vez que se ha aislado el genoma o ADNc
deseado, se puede secuenciar mediante procedimientos conocidos. Se
admite en la técnica que tales procedimientos están sujetos a
errores, tales como que la secuenciación múltiple de la misma
región es habitual y aún así se espera que produzca tasas medibles
de fallos en la secuencia resultante deducida, particularmente en
regiones que tienen dominios repetidos, una estructura secundaria
extensa, o composiciones e bases inusuales, tales como regiones con
elevado contenido en bases GC. Cuando surgen discrepancias, se
puede hacer resecuenciación y se pueden emplear procedimientos
especiales. Los procedimientos especiales pueden incluir alterar
las condiciones de secuenciación usando; distintas temperaturas;
distintas enzimas; proteínas que alteren la capacidad de los
oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior;
nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; distintas
composiciones de geles, por ejemplo añadiendo formamida; distintos
cebadores o cebadores localizados a distintas distancias de la
región problema; o distintas plantillas tales como ADN de cadena
simple. También puede emplearse secuenciación de ARNm.
Para la mayor parte, algunas o todas las
secuencias codificadoras para el polipéptido que tiene actividad
desaturasa son de una fuente natural. En algunas situaciones, no
obstante, es deseable modificar todos o una parte de los codones,
por ejemplo, para mejorar la expresión, empleando codones preferidos
del huésped. Se pueden determinar los codones preferidos del
huésped a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas
expresadas en la mayor cantidad en una especie huésped particular
de interés. Por tanto, la secuencia codificadora para un
polipéptido que tenga actividad desaturasa puede sintetizarse
completa o en parte. También puede sintetizarse todo o partes del
ADN para eliminar secuencias o regiones desestabilizantes
cualesquiera de estructura secundaria que aparecerían en el ARNm
transcrito. También puede sintetizarse todo o partes del ADN para
cambiar la composición de bases a una más preferible en la célula
huésped deseada. En la literatura están bien establecidos los
procedimientos para sintetizar secuencias y reunir secuencias.
Puede emplearse mutagénesis y selección in vitro, mutagénesis
dirigida al sitio, u otros medios para obtener mutaciones de genes
de desaturasa que aparecen de forma natural para producir un
polipéptido que tenga actividad desaturasa in vivo con
parámetros físicos y cinéticos más deseados para operar en la
célula huésped, tal como una vida media más larga o una mayor tasa
de producción de un ácido graso poliinsaturado deseado.
Los ADNc deseables tienen menos del 60% de
composición de A+T, preferiblemente menos del 50% de composición de
A+T. Sobre una escala localizada de una ventana móvil de 20 pares de
bases, es preferible que haya regiones no localizadas del ADNc con
más del 75% de composición de A+T; con una ventana de 60 pares de
bases, es preferible que haya regiones no localizadas del ADNc con
más del 60%, más preferiblemente regiones no localizadas con más del
55% de composición de A+T.
Son de particular interés la
\Delta6-desaturasa, la
\Delta12-desaturasa y la
\Delta15-desaturasa de Mortierella alpina.
El gen que codifica la \Delta6-desaturasa de
Mortierella alpina se puede expresar en plantas o animales
transgénicos para efectuar una mayor síntesis de ácido estearidónico
(SDA) a partir de ALA. También pueden usarse otros ADN que son
sustancialmente idénticos en secuencia al ADN de la
\Delta6-desaturasa de Mortierella alpina,
o que codifican para polipéptidos que son sustancialmente idénticos
en secuencia al polipéptido de la
\Delta6-desaturasa de Mortierella
alpina.
El gen que codifica la
\Delta12-desaturasa de Mortierella alpina
se puede expresar en plantas transgénicas para efectuar una mayor
síntesis de LA a partir de ácido oleico. También pueden usarse otros
ADN que son sustancialmente idénticos al ADN de la
\Delta12-desaturasa de Mortierella alpina,
o que codifican para polipéptidos que son sustancialmente idénticos
al polipéptido de la \Delta12-desaturasa de
Mortierella alpina.
Por sustancialmente idénticos en secuencia se
quiere decir una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido
nucleico que exhibe en orden de preferencia creciente al menos un
60%, 80%, 90% ó 95% de homología con la secuencia de aminoácidos o
secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos
de la desaturasa de Mortierella alpina. Para los
polipéptidos, la longitud de secuencias de comparación es
generalmente de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente de al
menos 20 aminoácidos, o más preferiblemente de 35 aminoácidos. Para
los ácidos nucleicos, la longitud de secuencias de comparación es
generalmente de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de al
menos 60 nucleótidos, más preferiblemente de 75 nucleótidos, y más
preferiblemente, 110 nucleótidos. La homología se mide típicamente
usando un software de análisis de secuencias, por ejemplo, el
paquete de software de Análisis de Secuencias del Genetics Computer
Group, Universidad de Wisconsin, Centro de Biotecnología, Avenida
Universidad 1710, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc.,
S. Park St. 1228, Madison, Wisconsin 53715), y MacVector (Oxford
Molecular Group, Avenida S. Bascom 2105, Suite 200, Campbell,
California 95008). Tal software une secuencias similares asignando
distintos grados de homología a diversas sustituciones, deleciones,
y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas incluyen
típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina
y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido
glutámico, asparagina, y glutamina; serina y treonina; lisina y
arginina; y fenilalanina y tirosina. También se pueden hacer
sustituciones en base a la hidrofobicidad o hidrofilia conservadas
(Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:
105-132, 1982) o en base a la capacidad de asumir
una estructura secundaria polipeptídica similar. (Chou y Pasman,
Adv. Enzymol. 47: 45-148, 1978).
Una vez se ha obtenido el ADN que codifica un
polipéptido de desaturasa, se sitúa en un vector capaz de replicarse
en una célula huésped, o se propaga in vitro por medio de
técnicas tales como PCR o PCR long. Los vectores replicantes pueden
incluir plásmidos, fagos, virus y cósmidos. Los vectores deseables
incluyen aquellos útiles para la mutagénesis del gen de interés o
para la expresión del gen de interés en células huésped. La técnica
del PCR long ha hecho posible la propagación in vitro de
constructos grandes, para que puedan tener lugar modificaciones del
gen de interés, tales como mutagénesis o adición de señales de
expresión, y la propagación de los constructos resultantes
totalmente in vitro sin el uso de un vector replicante o una
célula huésped.
Para la expresión de un polipéptido de
desaturasa, las regiones funcionales de iniciación y terminación
transcriptora y traductora están operativamente ligadas al ADN que
codifica el polipéptido de desaturasa. Las regiones de iniciación y
terminación transcriptora y traductora derivan de una variedad de
fuentes no exclusivas, que incluyen el ADN que se va a expresar,
genes que se sabe o se sospecha que son capaces de expresarse en el
sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un
locus endógeno en una célula huésped. La expresión en un tejido y/o
parte vegetal presenta ciertos aprovechamientos, particularmente
cuando el tejido o parte es uno que puede recogerse fácilmente,
como una semilla, hojas, frutos, flores, raíces, etc. La expresión
puede dirigirse a esa localización dentro de la planta usando
secuencias reguladoras específicas, tales como las de los
documentos USPN 5.463.174, USPN 4.943.674, USPN 5.106.739, USPN
5.175.095, USPN 5.420.034, USPN 5.188.958, y USPN 5.589.379. De
manera alternativa, la proteína expresada puede ser una enzima que
produzca un producto que pueda incorporarse, bien directamente o
tras modificaciones adicionales, en una fracción de fluido de la
planta huésped. En el caso presente, la expresión de genes de
desaturasa puede alterar los niveles de ácido estearidónico que se
encuentra en la semilla vegetal y/o tejidos de semillas vegetales.
La región de iniciación es un promotor funcional en una célula de
semilla vegetal. Preferiblemente, el promotor del primer constructo
de ADN es un promotor de napina o es de la región de iniciación de
la transcripción de la subunidad 7S de la
\beta-conglicina de la soja. La región de
terminación es funcional en una célula vegetal. Puede derivar de la
región 3' del gen a partir del cual se obtuvo la región de
iniciación o de un gen distinto. Se conoce un gran número de
regiones de terminación que se ha encontrado que son satisfactorias
en una diversidad de huéspedes del mismo y de distintos géneros y
especies. La región de terminación se selecciona habitualmente más
según un criterio de conveniencia que por alguna propiedad
particular.
La elección de una célula huésped viene influida
en parte por el perfil de PUFA deseado de la célula transgénica, y
el perfil nativo de la célula huésped. A modo de ejemplo, para la
producción de ácido linoleico a partir de ácido oleico, la
secuencia de ADN usada codifica un polipéptido que tiene actividad
\Delta12-desaturasa, y para la producción de GLA
a partir de ácido linoleico, la secuencia de ADN usada codifica un
polipéptido que tiene actividad
\Delta6-desaturasa. El uso de una célula huésped
que expresa actividad \Delta12-desaturasa y
carece de actividad \Delta15-desaturasa o está
reducida, se puede usar con un casete de expresión que proporcione
sobreexpresión de la \Delta6-desaturasa por
separado generalmente es suficiente para proporcionar una
producción mejorada de GLA en la célula transgénica. En casos
particulares en los que la expresión de la
\Delta6-desaturasa está emparejada con la
expresión de una actividad \Delta12-desaturasa, es
deseable que la célula huésped tenga de forma natural, o sea mutada
para que tenga, una baja actividad
\Delta15-desaturasa. De manera alternativa, una
célula huésped para la expresión de actividad
\Delta6-desaturasa puede tener, o ser mutada para
que tenga, elevada actividad
\Delta12-desaturasa.
La expresión en una célula huésped puede
llevarse a cabo de forma temporal o estable. La expresión temporal
puede tener lugar a partir de constructos introducidos que contienen
señales de expresión funcionales en la célula huésped, pero cuyos
constructos no se replican y raramente se integran en la célula
huésped, o cuando la célula huésped no se está multiplicando.
También puede llevarse acabo la expresión temporal induciendo la
actividad de un promotor regulable ligado operativamente al gen de
interés, aunque tales sistemas inducibles frecuentemente exhiben un
bajo nivel basal de expresión. La expresión estable se puede
conseguir mediante la introducción de un constructo que pueda
integrarse en el genoma del huésped o que se replique de forma
autónoma en la célula huésped. La expresión estable del gen de
interés se puede seleccionar mediante el uso de un marcador
seleccionable localizado en o transferido con el constructo de
expresión, seguido por la selección de células que expresen el
marcador. En la presente invención, la expresión estable en la
planta deviene de la integración. La integración de constructos
puede suceder aleatoriamente dentro del genoma del huésped o puede
dirigirse mediante el uso de constructos que contengan regiones de
homología con el genoma del huésped suficientes para dirigir la
recombinación con el locus del huésped. Cuando los constructos se
dirigen aun locus endógeno, todas o algunas de las regiones
reguladoras transcriptoras y traductoras pueden ser proporcionadas
por el locus endógeno.
\newpage
Cuando se desee una mayor expresión del
polipéptido de desaturasa en la planta fuente, pueden emplearse
diversos procedimientos. Pueden introducirse genes adicionales que
codifiquen para el polipéptido de desaturasa en el organismo
huésped. También se puede incrementar la expresión del locus de
desaturasa nativo mediante recombinación homóloga, por ejemplo
insertando un promotor más fuerte en el genoma del huésped para
provocar un aumento de la expresión, eliminando secuencias
desestabilizantes del ARNm o de la proteína codificada borrando esa
información del genoma del huésped, o añadiendo secuencias
estabilizantes al ARNm (véanse documentos USPN 4.910,141 y
USPN 5.500.365).
Cuando es deseable expresar más de un gen
distinto, regiones reguladores apropiadas y procedimientos de
expresión, se pueden propagar genes introducidos en la célula
huésped mediante integración en el genoma del huésped. Cada
constructo introducido debería tener un medio diferente de selección
y debería de carecer de homología con los otros constructos para
mantener la expresión estable y evitar el intercambio de elementos
entre constructos. Las elecciones acertadas de regiones
reguladoras, medios de selección y procedimiento de propagación del
constructo introducido pueden determinarse experimentalmente de
modo que todos los genes introducidos se expresen en los niveles
necesarios para proporcionar la síntesis de los productos
deseados.
Los constructos que comprenden el gen de interés
se pueden introducir en una célula huésped mediante técnicas de
referencia. Estas técnicas incluyen la transfección, infección,
impacto bolístico, electroporación, microinyección, raspado, o
cualquier otro procedimiento que introduzca el gen de interés en la
célula huésped (véanse documentos USPN 4.743.548, USPN
4.795.855, USPN 5.068.193, USPN 5.188.958, USPN 5.463.174, USPN
5.565.346 y USPN 5.565.347). Por conveniencia, una célula huésped
que se haya manipulado mediante cualquier procedimiento para
originar una secuencia de ADN o constructo aquí será referida como
"transformada" o "recombinante". El huésped sujeto tendrá
al menos una copia del constructo de expresión y puede tener dos o
más, dependiendo de si el gen solamente está integrado en el genoma
o si adicionalmente está amplificado, o si está presente en un
elemento extracromosómico que tenga cantidades múltiples de
copias.
La célula huésped transformada se puede
identificar mediante la selección de un marcador contenido en el
constructo introducido. De manera alternativa, se puede introducir
un marcador distinto con el constructo deseado, puesto que muchas
técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en las
células huésped. Típicamente, los huéspedes transformados se
seleccionan por su capacidad para crecer en medios selectivos. Los
medios selectivos pueden incorporar un antibiótico o carecer de un
factor necesario para el crecimiento del huésped no transformado,
tal como un nutriente o un factor de crecimiento. Un gen marcador
introducido puede por tanto conferir resistencia a los
antibióticos, o codificar para un factor de crecimiento o enzima
esencial, y permitir el crecimiento en medios selectivos cuando se
expresa en la célula huésped transformada. De forma ideal, son de
interés la resistencia a la kanamicina y el aminoglicósido G418
(ver documento USPN 5.034.322). La selección de un huésped
transformado puede tener lugar también cuando la proteína marcadora
expresada pueda detectarse, directa o indirectamente. La proteína
marcadora se puede expresar aislada o fusionada con otra proteína.
La proteína marcadora se puede detectar por su actividad
enzimática; por ejemplo la \beta-galactosidasa
puede transformar el sustrato X-gal en un producto
coloreado, y la luciferasa puede transformar la luciferina en un
producto emisor de luz. La proteína marcadora se puede detectar por
sus características productoras de luz o modificadoras; por ejemplo
la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria fluorece
cuando se le ilumina con luz azul. Se pueden usar anticuerpos para
detectar la proteína marcadora o una marca molecular en, por
ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la
proteína marcadora o la marca pueden seleccionarse, por ejemplo,
visualmente, o mediante técnicas tales como FACS o separando usando
anticuerpos.
El ácido estearidónico producido usando los
procedimientos y composiciones de la invención se puede encontrar
en el tejido y/o semilla de la planta huésped como ácidos grasos
libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles,
fosfolípidos, sulfolípidos o glicolípidos, y se puede extraer de la
célula huésped mediante una variedad de medios bien conocidos en la
técnica. Tales medios pueden incluir la extracción con disolventes
orgánicos, sonicación, extracción de fluido supercrítico usando por
ejemplo dióxido de carbono, y medios físicos tales como prensas, o
combinaciones de los mismos. Es de particular interés la extracción
con hexano o metanol y cloroformo. Cuando se desee, se puede
acidificar la capa acuosa para protonar las partículas cargadas
negativamente e incrementar de este modo la división de los
productos deseados en la capa orgánica. Tras la extracción, se
pueden eliminar los disolventes orgánicos mediante evaporación bajo
un flujo de nitrógeno. Cuando estén aislados en formas conjugadas,
los productos se separan enzimática o químicamente para liberar el
ácido graso libre o un conjugado de interés menos complejo, y
después se someten a manipulaciones adicionales para producir un
producto final deseado. De forma ideal, las formas conjugadas de
ácidos grasos se separan con hidróxido potásico.
Sorprendentemente, como se demuestra de forma
más completa en los ejemplos que siguen, la expresión de la
\Delta6-desaturasa de Mortierella conduce a
la producción de ácido estearidónico en el aceite extraído del
tejido de la semilla de las células de la planta huésped. Además, la
expresión de la \Delta6-desaturasa con
desaturasas adicionales proporcionó la mejora de la producción de
SDA en el aceite de semilla.
Por tanto, la presente invención proporciona
procedimientos para la producción de ácido estearidónico (C18:4) en
semillas de plantas huésped. Los procedimientos permiten la
producción de SDA en semillas de plantas huésped que varían del
0,3% en peso hasta al menos el 30% en peso; preferiblemente del 5%
en peso hasta al menos el 25% en peso; más preferiblemente del 7%
en peso hasta al menos el 25% en peso. El SDA se produce
preferiblemente en el aceite de la semilla de plantas huésped que
contengan uno o más constructos de expresión como aquí se ha
descrito.
Además, la presente invención proporciona una
nueva fuente de aceites vegetales que contienen ácido estearidónico.
Los aceites se obtienen preferiblemente del tejido de la semilla de
la planta o extrayendo el aceite de dicha semilla vegetal. Los
aceites de semilla contienen cantidades de SDA que varían del 0,3%
en peso hasta al menos el 30% en peso, preferiblemente del 5% en
peso hasta al menos el 25% en peso, más preferiblemente del 7% en
peso hasta al menos el 25% en peso.
Si es necesaria una mayor purificación, se
pueden emplear procedimientos habituales. Tales procedimientos
incluyen extracción, tratamiento con urea, cristalización
fraccionaria, HPLC, destilación fraccionaria, cromatografía sobre
gel de sílice, centrifugación o destilación de alta velocidad, o
combinaciones de estas técnicas. Se puede efectuar la protección de
los grupos reactivos, tales como los grupos ácido o alquenilo, en
cualquier etapa mediante técnicas conocidas, por ejemplo
alquilación o yodación. Los procedimientos usados incluyen la
metilación de los ácidos grasos para producir ésteres de metilo. De
forma similar, se pueden eliminar los grupos protectores en
cualquier etapa. De manera ideal, la purificación de fracciones que
contengan ARA, DHA y EPA se consigue mediante tratamiento con urea
y/o destilación fraccionaria.
Los usos de los ácidos grasos de la invención
temática son diversos. Las sondas basadas en los ADN de la presente
invención pueden encontrar uso en procedimientos para aislar
moléculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos
que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, los ADN u
oligonucleótidos necesitan ser detectables. Esto se consigue
habitualmente fijando una marca en cualquier lugar interno, por
ejemplo por medio de la incorporación de un residuo modificado, o
en el terminal 5' o 3'. Tales marcas pueden detectarse
directamente, pueden unirse a una molécula secundaria que esté
marcada de forma detectable, o pueden unirse a una molécula
secundaria no marcada y a una molécula terciaria que esté marcada de
forma detectable; este proceso se puede extender tanto como sea
práctico para lograr una señal satisfactoriamente detectable sin
niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios,
terciarios y de puenteado pueden incluir el uso de anticuerpos
dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo marcas u otros
anticuerpos, o puede involucrar a moléculas cualesquiera que se
unan entre sí, por ejemplo un sistema de
biotina-estreptavidina/avidina. Las marcas
detectables incluyen típicamente isótopos radiactivos, moléculas que
producen o alteran la luz química o enzimáticamente, enzimas que
producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas,
moléculas fluorescentes o moléculas cuyas características de
fluorescencia o de emisión de luz cambian tras la unión. Pueden
hallarse ejemplos de procedimientos de marcaje en el documento USPN
5.011.770.
De manera alternativa, la unión de moléculas
diana puede detectarse directamente midiendo el cambio de calor de
la solución sobre la unión de la sonda al objetivo por medio de
calorimetría de titulación isotérmica, o recubriendo la sonda u
objetivo sobre una superficie y detectando el cambio con un barrido
de luz de la superficie producida por la unión del objetivo o
sonda, respectivamente, como se puede hacer con el sistema
BIAcore.
La invención se entenderá mejor mediante
referencia a los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad
\Delta15/\omega-3 de Brassica napus se
puede incrementar mediante la expresión de una
\omega-3-desaturasa de C.
elegans. El clon de ADNc fat-1 (Genbank accesión
L41807; Spychalla, J. P., Kinney, A. J., y Browse, J. 1997.
P.N.A.S. 94, 1142-1147) se obtuvo de John Browse en
la Washington State University. El ADNc fat-1 se
modificó mediante PCR para introducir sitios de clonación usando los
siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebadores permitieron la amplificación de
toda la región codificadora y añadieron los sitios PstI y NotI a
los extremos 5' y 3', respectivamente. El producto del PCR se
subclonó en pAMP1 (GIBCOBRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCOBRL)
para crear el pCGN5562. Se comprobó la secuencia secuenciando ambas
cadenas para estar seguros de que no se habían introducido cambios
mediante el PCR.
Se observó una diferencia en un par de bases en
la región codificadora fat-1 de pCGN5562 en
oposición a la secuencia Genbank fat-1. La C en la
posición 705 de la secuencia fat-1 se había cambiado
por una A en pCGN5562. Esto genera un cambio de un codón GAC a GAA,
cambiando el residuo Asp en la posición 231 de fat-1
a un residuo Glu. Este cambio idéntico se observó en productos de
dos reacciones de PCR independientes usando una plantilla de
fat-1 y lo más probable es que no sea resultado de
una mala incorporación de un nucleótido al PCR. Para la expresión
específica de semillas, la región codificadora fat-1
se recortó del pCGN5562 como un fragmento PstI/NotI y se insertó
entre los sitios PstI/NotI del vector binario, pCGN8623, para crear
pCGN5563. El pCGN5563 se puede introducir en Brassica napus
por medio de transformación mediada por Agrobacterium.
La región de poliunión del casete del promotor
de napina, pCGN7770, se sustituyó ligando los siguientes
oligonucleótidos:
Estos oligonucleótidos se ligaron al pCGN7770
digerido en SalI/XhoI para producir pCGN8619. Estos oligonucleótidos
codifican los sitios de restricción BamHI, NotI, HindIII y PstI.
pCGN8619 contiene los oligonucleótidos orientados tal que el sitio
PstI está más próximo a la región reguladora 5' de la napina. Se
retiró un fragmento que contenía la región reguladora 5' de la
napina, de poliunión, y la región 3' de la napina del pCGN8619
mediante digestión con Asp7181. Se despuntó el extremo del
fragmento rellenando los salientes 5' con fragmento de Klenow,
después se ligó al pCGN5139 que había sido digerido con Asp7181 y
HindII y se despuntó rellenando los salientes 5' con fragmento de
Klenow. Un plásmido que contenía el inserto orientado de modo que el
promotor de napina estuviera más próximo al sitio HindIII
despuntado del pCGN5139 y el 3' de la napina estuviera más próximo
al sitio HindIII despuntado se sometió a análisis de secuencias para
confirmar la orientación del inserto y la integridad de las uniones
de clonación. El plásmido resultante se designó pCGN8623.
Para producir elevados niveles de ácido
estearidónico en Brassica, se puede combinar la
\omega-3-desaturasa de C.
elegans con las \Delta6- y
\Delta12-desaturasas y de Mortierella
alpina. Pueden cruzarse plantas con pCGN5563 transformada con
plantas con pCGN5544 transformada que expresen las \Delta6- y
\Delta12-desaturasas, descritas en lo que
sigue.
Se puede analizar el contenido de ácido
estearidónico de las semillas F1 resultantes y pueden usarse las
plantas F1 seleccionadas para auto-polinización
para producir semillas F2, o como donantes para la producción de
dihaploides, o cruces adicionales.
Un procedimiento alternativo para combinar el
ADNc fat-1con las \Delta6- y
\Delta12-desaturasas de M. alpina es combinarlos
en un ADN-T para transformación. La región
codificadora fat-1 de pCGN5562 se puede recortar
como un fragmento PstI/NotI e insertarse en pCGN8619 digerido en
PstI/NotI. La unidad transcriptora constituida por la región
reguladora 5' de la napina, la región codificadora
fat-1, y la región reguladora 3' de la napina se
pueden recortar como un fragmento Sse83871 e insertarse en el tramo
pCGN5544 con el Sse83871. El plásmido resultante contendría tres
unidades transcriptoras de napina que contienen la
\omega-3-desaturasa de C.
elegans, la \Delta6-desaturasa de M.
alpina, y la \Delta12-desaturasa de M.
alpina, todas orientadas en la misma dirección que la unidad
transcriptora 35S/nptII/tml usada para la selección del tejido
transformado.
La actividad de la
\Delta15-desaturasa de Brassica napus puede
incrementarse mediante sobre-expresión del clon de
ADNc de la \Delta15-desaturasa.
Se obtuvo un clon de ADNc de la
\Delta15-desaturasa de B. napus mediante
amplificación de PCR del ADNc de la primera cadena derivado de la
variedad 212/86 de B. napus. Los cebadores se basaron en la
secuencia publicada: Genbank # L01418 Arondel et al, 1992
Science 258:1353-1355.
Se usaron los siguientes cebadores:
Estos cebadores permitieron la amplificación de
toda la región codificadora y añadieron los sitios SacI y EcoRI a
los extremos 5' y 3', respectivamente.
El producto del PCR se subclonó en pAMP1
(GIBCOBRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para crear
pCGN5520. Se comprobó la secuencia secuenciando ambas cadenas para
asegurarse de que la estructura de lectura abierta permanecía
intacta. Para la expresión específica de semillas, la región
codoficadora de la \Delta15-desaturasa se recortó
del pCGN5520 como un fragmento BamHI/SalI y se insertó entre los
sitios BgIII y XhoI del pCGN7770, para crear el pCGN5557. El
fragmento PstI de pCGN5557 que contiene la región reguladora 5' de
la napina, la \Delta15-desaturasa de B.
napus, y la región reguladora 3' de la napina se insertan en el
sitio PstI del vector binario, pCGN5138, para producir pCGN5558. El
pCGN5558 se introdujo en Brassica napus por medio de
transformación mediada por Agrobacterium.
Para producir elevados niveles de ácido
estearidónico en Brassica, se puede combinar la
\Delta15-desaturasa con las \Delta6- y
\Delta12-desaturasas de Mortierella alpina.
Pueden cruzarse plantas con pCGN5558 transformada con plantas con
pCGN5544 transformada que expresen las \Delta6- y
\Delta12-desaturasas. Se analiza el contenido de
ácido estearidónico de las semillas F1 resultantes. El análisis
GC-FAME de las medias semillas F1 reveló una
acumulación significativa de SDA en el aceite de semilla de las
líneas de Brassica. Los niveles de SDA (18:4) superiores a
aproximadamente el 25% se obtuvieron en líneas hemizigóticas y se
proporcionan en la Tabla 1. Las plantas F1 seleccionadas se pueden
usar para auto-polinización para producir semillas
F2, o como donantes para la producción de dihaploides, o cruces
adicionales.
\newpage
Un procedimiento alternativo para combinar la
\Delta15-desaturasa de B. napus con las
\Delta6- y \Delta12-desaturasas de M.
alpina es combinarlas en un ADN-T para
transformación. El casete de transcripción constituido por la
región reguladora 5' de la napina, la región codificadora de la
\Delta15-desaturasa, y la región reguladora 3' de
la napina se pueden recortar del pCGN5557 como un fragmento de Swal
e insertarse en el pCGN5544 digerido en SwaI. El plásmido
resultante, pCGN5561, contiene tres unidades transcriptoras de la
napina que contienen las \Delta6- y
\Delta12-desaturasas de M. alpina, la
\Delta15-desaturasa de B. napus, y las
\Delta6- y \Delta12-desaturasas de M.
alpina, todas orientadas en la misma dirección que la unidad
transcriptora 35S/nptII/tml usada para la selección del tejido
transformado. Además, la secuencia codificadora de la
\omega-3-desaturasa de C.
elegans también se clonó en el pCGN5544 para crear el constructo
pCGN5565.
Semillas T2 agrupadas de plantas que contienen
5561 contienen cantidades significativas de SDA (18:4), como se
muestra en la Tabla 2. En semillas que segregan 5561 se obtienen
niveles mayores de aproximadamente el 7% de SDA. Además, se
obtuvieron niveles significativos de SDA de semillas agrupadas de
líneas 5565 de Brassica, como también se muestra en la Tabla
2. Como se muestra en la Tabla 2, con los constructos 5561 y 5565,
pueden obtenerse niveles de SDA que oscilan desde aproximadamente el
0,8% en peso hasta más del 7% en peso.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
(Ejemplo de
Referencia)
La Ma29 es una
\Delta15-desaturasa putativa de M. alpina
según se determinó mediante homología de secuencias. Este
experimento se diseñó para determinar si las hojas que expresan la
Ma29 (determinado mediante análisis Northern) podían transformar el
DGLA (20:3) aplicado exógenamente en ARA (20:4).
Se modificó el ADNc de la Ma
29-desaturasa mediante PCR para introducir sitios de
restricción convenientes para clonación. Se ha insertado la región
codificadora de la desaturasa en un casete d35 bajo el control del
promotor doble 35S para la expresión en hojas de Brassica
(pCGN5525) siguiendo protocolos habituales (ver los
documentos USPN 5.424.200 y USPN 5.106.739). Se generaron plantas
transgénicas de Brassica que contenían el pCGN5525 siguiendo
protocolos habituales (ver los documentos USPN 5.188.958 y
USPN 5.463.174).
En el primer experimento, se usaron tres
plantas: una control, LP004-1, y dos transgénicas,
5525-23 y 5525-29. LP004 es una
variedad de Brassica baja en linolénico. Se seleccionaron
hojas de cada una para uno de entre tres tratamientos: agua, GLA o
DGLA. El GLA y DGLA se adquirieron como sales sódicas en NuChek Prep
y se disolvieron en agua a razón de 1 mg/ml. Se taparon alícuotas
bajo N_{2} y se almacenaron a -70ºC. Se trataron las hojas
aplicando una gota de 50\mul a la superficie superior y
extendiendo suavemente con un dedo enguantado para cubrir toda la
superficie. Se hicieron aplicaciones aproximadamente 30 minutos
antes del final del ciclo de luz para minimizar cualquier
fotooxidación de los ácidos grasos aplicados. Después de 6 días de
tratamiento se recogió una hoja de cada tratamiento y se cortó por
la mitad por el nervio medio. Una mitad se lavó con agua para
tratar de eliminar el ácido graso no incorporado. Las muestras
foliares se liofilizaron durante toda la noche, y se determinó la
composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases (CG).
Los resultados se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Las hojas tratadas con GLA contenían del 1,56 al
2,4% en peso total de GLA. El análisis de ácidos grasos mostró que
la composición lipídica de las hojas control y transgénicas era
esencialmente el mismo. Las hojas de las plantas control tratadas
con DGLA contenían un 1,2-1,9% en peso de DGLA y
cantidades traza de ARA (0,26-0,27% en peso
total).
Las hojas transgénicas sólo contenían un
0,2-0,7% en peso total de DGLA, pero los niveles de
ARA se vieron incrementados (0,74-1,1% en peso
total) indicando que el DGLA se transformó en ARA en estas
hojas.
El objeto de este experimento fue determinar si
un constructo con el promotor de napina específico de semilla haría
posible la expresión en la semilla.
Se modificó el ADNc de la Ma29 mediante PCR para
introducir sitios de clonación XhoI hacia arriba y hacia debajo de
los codones de iniciación y terminación, respectivamente, usando los
siguientes cebadores:
Se subclonó el producto del PCR en
pAMP1(GIBCOBRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para
crear el pCGN5522 y se comprobó la secuencia de la
\Delta5-desaturasa secuenciando ambas cadenas.
Para la expresión específica de semillas, la
región codificadora de la Ma29 se recortó del pCGN5522 como un
fragmento XhoI y se insertó en el sitio SalI del
casete de expresión de napina, pCGN3223, para crear el pCGN5528. Se
insertó el fragmento HindIII de pCGN5528 que contiene la
región reguladora 3' de la napina, la región codificadora de la
Ma29, y la región reguladora 3' de la napina en el sitio
HindIII del pCGN1557 para crear el pCGN5531. Se insertaron
dos copias de la unidad de transcripción de la napina en tándem.
Este constructo en tándem puede permitir una mayor expresión de las
desaturasas por loci genéticos. Se introdujo el pCGN5531 en la
variedad LP004 de Brassica napus por medio de transformación
mediada por Agrobacterium.
Se analizó la composición de ácidos grasos de
semillas maduras T2 en grupos de veinte mediante CG. La Tabla 2
muestra los resultados obtenidos con líneas independientes
transformadas comparadas con semillas LP004 no transformadas. Las
semillas transgénicas que contienen pCGN5531 contienen dos ácidos
grasos que no aparecen en las semillas control, identificados como
ácido taxoleico (5,9-18:2) y ácido pinolénico
(5,9,12-18:3), en base a su elución relativa al
ácido oleico y linoleico. Éstos serían los productos esperados de la
desaturación \Delta5 de los ácidos oleico y linoleico. No se
observaron otras diferencias en la composición de ácidos grasos en
las semillas transgénicas.
(Ejemplo de
Referencia)
En el Ejemplo 3 se describe la construcción del
pCGN5531 (\Delta5-desaturasa) y la composición de
ácidos grasos de grupos de semillas T2. Este ejemplo toma las
semillas a través de una generación más y discute vías para
maximizar los ácidos grasos desaturados en \Delta5.
El ejemplo 3 describe la composición de ácidos
grasos de grupos de semillas T2 de plantas de la variedad LP004 de
B. napus con pCGN5531 transformadas. Se hizo un análisis de
medias semillas para investigar la segregación de ácidos grasos
desaturados en \Delta5 en las semillas T2 e identificar plantas
individuales para tomar en las generaciones siguientes. Se hicieron
germinar las semillas durante la noche en oscuridad a 30 grados
sobre papel de filtro remojado. Se hizo una incisión del cotiledón
externo para hacer análisis CG y el resto de la plántula se plantó
en el suelo. En la Tabla 4 adjunta se muestran los resultados de
algunos de estos análisis. \Delta5,9-18:2 acumuló
hasta el 12% de los ácidos grasos totales y
\Delta5,9,12-18:3 acumuló hasta el 0,77% de los
ácidos grasos. Éstas y otras plantas T2 seleccionadas
individualmente se cultivaron en el invernadero para producir
semillas T3.
\newpage
Para maximizar la acumulación de \Delta5,9
18:2 en aceite de semillas, se podría introducir el constructo
pCGN5531 en una variedad de canola alta en ácido oleico. Se podría
obtener una variedad alta en ácido en oleico mediante mutación,
bajo-supresión, o supresión antisentido de las
\Delta12- y \Delta15-desaturasas u otros
co-factores necesarios.
Para maximizar la acumulación de \Delta5,9,12
18:3 en la canola, se podría introducir el constructo pCGN5531 en
una cepa de canola alta en ácido linoleico. Esto se podría lograr
cruzando plantas de pCGN5531 transformado con plantas de pCGN5542
(\Delta12-desaturasa de M. alpina)
transformado. De manera alternativa, se podrían combinar las
\Delta5- y \Delta12-desaturasas en un
ADN-T para transformación. La unidad transcriptora
constituida por la región reguladora 5' de la napina, la región
codificadora de la \Delta12-desaturasa de M.
alpina, y la región reguladora 3' de la napina se pueden
recortar de pCGN5541 como un fragmento NotI. Podrían ligarse los
ligadores NotI/XbaI e insertarse el fragmento resultante en el sitio
XbaI de pCGN5531. El plásmido resultante contendría tres unidades
transcriptoras de napina que contendrían la
\Delta12-desaturasa de M. alpina, y dos
copias de la unidad napina/\Delta5-desaturasa de
M. alpina/napina, todas orientadas en la misma dirección que
la unidad transcriptora usada para la selección del tejido
transformado.
Se obtuvo una secuencia de ácido nucleico a
partir de un clon parcial de ADNc, Ma524, que codifica una
\Delta6-desaturasa de ácido graso de
Morteriella alpina mediante secuenciación aleatoria de clones
de la biblioteca de ADNc de M. alpina. Se modificó el ADNc
del Ma524 mediante PCR para introducir sitios de clonación usando
los siguientes parámetros:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebadores permitieron la amplificación de
toda la región codificadora y añadieron los sitios XbaI y
XhoI al extremo 5' y los sitios XhoI y StuI al
extremo 3'. Se subclonó el producto del PCR en pAMP1 (GIBCOBRL)
usando el sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para crear el pCGN5535 y se
comprobó la secuencia de la \Delta6-desaturasa
secuenciando ambas cadenas.
Se prepararon constructos de expresión en
plantas para expresar la \Delta6-desaturasa de
Mortierella alpina y la
\Delta12-desaturasa de Mortierella alpina
en una célula vegetal huésped. Los constructos preparados
utilizaban regiones de iniciación de la transcripción derivadas de
genes expresados con preferencia en una semilla vegetal. En los
documentos WO 98/46763 y WO 98/46764 se describe el aislamiento de
las secuencias de ADNc que codifican para la
\Delta6-desaturasa de M. alpina y la
\Delta12-desaturasa de M. alpina.
Para la expresión específica de semillas, se
recortó la región codificadora Ma524 del pCGN5535 como un fragmento
XhoI y se insertó en el sitio SalI del casete de
expresión de napina, pCGN3223, para crear el pCGN5536. El fragmento
NotI del pCHN5536 que contiene la región reguladora 5' de la
napina, la región codificadora Ma524, y la región reguladora 3' de
la napina se insertó en el sitio NotI del pCGN1557 para crear
el pCGN5538.
El ADNc 5542, que codifica la
\Delta12-desaturasa de M. alpina, se
modificó mediante PCR para introducir sitios de clonación usando los
siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebadores permitieron la amplificación de
toda la región codificadora y añadieron un sitio BamHI al extremo
5' y los sitios KpnI y XhoI al extremo 3'. Se subclonó el producto
del PCR en pAMP1 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)
usando el sistema CloneAmp (Gibco-BRL) para crear el
pCGN5540 y se comprobó la secuencia de la
\Delta12-desaturasa secuenciando ambas
cadenas.
Se preparó un constructo de expresión
preferencial para la secuencia de ADNc de la
\Delta12-desaturasa. Se recortó la región
codificadora Ma648 del pCGN5540 como un fragmento BamHI/XhoI y se
insertó entre los sitios BgIII y XhoI del casete de expresión de
napina, pCGN3223 (descrito en el documento USPN 5.639.790), para
crear el pCGN5542.
Para expresar las secuencias de las \Delta6- y
\Delta12-desaturasas de M. alpina a partir
del mismo ADN-T, se preparó el siguiente constructo
para la expresión preferencial de semillas.
El fragmento NotI del pCGN5536 que contiene la
región de iniciación transcriptora 5' de la napina, la región
codificadora Ma524, y la región de terminación transcriptora 3' de
la napina se insertó en el sitio NotI del pCGN5542 para crear el
pCGN5544. Los casetes de expresión se orientaban de tal modo que la
dirección de transcripción de Ma524 y Ma648 y el marcador nptII es
la misma.
Para la expresión específica de semillas, se
recortó la región codificadora Ma524 del pCGN5535 como un fragmento
XhoI y se insertó en el sitio SalI del casete de
expresión de napina, pCGN3223, para crear el pCGN5536. El fragmento
NotI del pCHN5536 que contiene la región reguladora 5' de la
napina, la región codificadora Ma524, y la región reguladora 3' de
la napina se insertó en el sitio NotI del pCGN1557 para crear
el pCGN5538. Se introdujo el pCGN5538 en la variedad LP004 de
Brassica napus por medio de transformación mediada por
Agrobacterium.
Se recogieron semillas T2 en maduración de 6
casos de transformación independientes en el invernadero. Se
analizó la composición de ácidos grasos de semillas individuales
mediante CG. La Tabla 5 muestra los resultados de las semillas
LP004 control y seis líneas 5538. Todas las líneas 5538 excepto la
#8 produjeron semillas que contenían GLA. La presencia de GLA se
mantuvo en estas semillas como se espera para la población de
semillas autógamas T2. Además del GLA, la
\Delta6-desaturasa de M. alpina es capaz de
producir 18:4 (estearidónico) y otro ácido graso:
\Delta6,9-18:2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se realizaron cruces entre líneas 5544 de
Brassica productoras de GLA y variedades de canola normales
no transformadas. Se realizaron cruces entre líneas 5544 con
Quantum, Eagle, y Ebony.
Se analizó el contenido de SDA de medias
semillas F1 y se cultivaron y dejaron autopolinizarse las plantas
seleccionadas para producir semillas F2. El análisis
CG-FAME de las semillas individuales y las muestras
de medias semillas de tales cruces reveló acumulación de niveles
significativos de SDA (Tabla 6). El análisis de medias semillas de
5544-LP108-6-16 con
la variedad Eagle de canola produjo un nivel de aproximadamente el
6,3% de SDA. El análisis de semillas F2 de un cruce de
5544-LP108-12-1 con
la variedad Ebony de canola produjo niveles de SDA tan altos como
aproximadamente un 7,4% de SDA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
(Ejemplo de
Referencia)
El ejemplo 5 describía la construcción del
pCGN5538 diseñado para expresar la
\Delta6-desaturasa de M. alpina en
semillas de canola transgénica. La Tabla 4 de ese ejemplo mostraba
ejemplos de análisis de semillas individuales a partir de 6 casos
transgénicos independientes. Se produjeron cantidades significativas
de GLA, además del ácido graso \Delta6,9-18:2.
Un total de 29 plantas transgénicas
transformadas independientes con pCGN5538 del cultivar LP004 bajo en
linolénico se regeneraron y cultivaron en el invernadero. La Tabla
7 muestra la composición de ácidos grasos de grupos de 20 semillas
de semillas T2 de cada caso. Siete de las líneas contenían más del
2% del \Delta6,9-18:2 en los grupos de semillas.
Para identificar y seleccionar plantas con elevadas cantidades del
\Delta6,9-18:2 que va a tomarse para generaciones
siguientes, se hizo un análisis de media semillas. Se hicieron
germinar las semillas durante la noche en oscuridad a 30 grados
sobre papel de filtro remojado. Se hizo una incisión del cotiledón
externo para hacer análisis CG y el resto de la plántula se plantó
en el suelo. En base a los resultados del análisis de ácidos
grasos, se cultivaron plantas T2 seleccionadas en el invernadero
para producir semillas T3. Se repitió el ciclo de selección; se
analizó el \Delta6,9-18:2 de grupos de semillas
T3. Se diseccionaron y analizaron medias semillas T3, y se
cultivaron plantas T3 seleccionadas en el invernadero para producir
semillas T4. Se analizó la composición de ácidos grasos de grupos de
semillas T4. La Tabla 6 resume los resultados de este proceso para
líneas derivadas de uno de los casos transgénicos originales,
5538-LP004-25. Por tanto se han
mantenido los niveles de
\Delta-6,9-18:2 a través de 3
generaciones.
Para maximizar la cantidad de
\Delta-6,9-18:2 que se podría
producir, se podría introducir el constructo pCGN5538 en una
variedad de canola alta en ácido oleico mediante transformación o
cruzamiento. Podría obtenerse una variedad alta en oleico mediante
mutación, co-supresión, o supresión antisentido de
las \Delta12- y \Delta15-desaturasas u otros
co-factores necesarios.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> Calgene LLC
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ácidos Grasos Poliinsaturados en
Plantas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 17256/00/WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US 99/13559
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-06-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/089, 043
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-06-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para la Versión 4.0 de
Windows
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcuacuacuac uactgcagac aatggtcgct cattcctcag a
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaucaucauc augcggccgc ttacttggcc tttgcctt
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgacctgca ggaagcttgc ggccgcggat cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgaggatcc gcggccgcaa gcttcctgca gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcuacuacuac uagagctcag cgatggttgt tgctatggac
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaucaucauc augaattctt aattgatttt agatttg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcuacuacuac uactcgagca agatgggaac ggaccaagg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaucaucauc auctcgagct actcttcctt gggacggag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcuacuacuac uatctagact cgagaccatg gctgctgctc cagtgtg
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaucaucauc auaggcctcg agttactgcg ccttacccat
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcuacuacuac uaggatccat ggcacctccc aacact
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Oligoartificial
Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaucaucauc auggtacctc gagttacttc ttgaaaaaga c
\hfill41
Claims (19)
1. Un procedimiento para producir ácido
estearidónico en una semilla vegetal, comprendiendo dicho
procedimiento
cultivar una planta que tiene integrado en su
genoma un primer constructo de ADN que comprende, en la dirección de
transcripción 5' a 3', un promotor funcional en una célula de
semilla vegetal, una secuencia de ADN que codifica una
delta-seis desaturasa, y una región de terminación
de la transcripción funcional en una célula vegetal, y un segundo
constructo que comprende en la dirección de transcripción 5' a 3',
un promotor funcional en una célula de semilla vegetal, y una
secuencia de ADN que codifica una delta-15
desaturasa y cultivar dicha planta bajo condiciones mediante las
cuales se expresan dicha delta-seis desaturasa y
dicha delta-15 desaturasa.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha planta tiene un tercer constructo integrado en su
genoma, en el que dicho constructo tiene en la dirección de
transcripción 5' a 3', un promotor funcional en una célula de
semilla vegetal, y una secuencia de ADN que codifica una
delta-12 desaturasa.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha secuencia que codifica la delta-seis
desaturasa es del género Mortierella.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el promotor del primer constructo de ADN es un promotor de
napina.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el promotor del primer constructo de ADN es de la región de
iniciación de la transcripción de la subunidad 7S de la
\beta-conglicina de soja.
6. El procedimiento de la reivindicación 1,
comprendiendo dicho procedimiento también extraer aceite de dicha
semilla vegetal.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que dicho aceite comprende aproximadamente un 5 por ciento en
peso o más de ácido estearidónico.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que dicho aceite comprende aproximadamente un 10 por ciento en
peso o más de ácido estearidónico.
9. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que dicho aceite comprende aproximadamente un 15 por ciento en
peso o más de ácido estearidónico.
10. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que dicho aceite comprende aproximadamente un 20 por ciento en
peso o más de ácido estearidónico.
11. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que dicho aceite comprende aproximadamente un 25 por ciento en
peso o más de ácido estearidónico.
12. Una planta transgénica o una semilla de la
misma que tiene integrado en su genoma un primer constructo de ADN
que comprende, en la dirección de transcripción 5' a 3', un promotor
funcional en una célula de semilla vegetal, una secuencia de ADN que
codifica una delta-seis desaturasa, y una región de
terminación de la transcripción funcional en una célula vegetal, y
un segundo constructo que comprende, en la dirección de
transcripción 5' a 3', un promotor funcional en una célula de
semilla vegetal, y una secuencia de ADN que codifica una
delta-15 desaturasa, que es capaz de expresar la
delta-seis desaturasa y la delta
15-desaturasa y de producir aceite de semilla que
contenga ácido estearidónico.
13. La semilla de la planta de la reivindicación
12 que comprende aproximadamente un 5 por ciento en peso o más de
ácido estearidónico como componente de los ácidos grasos totales
encontrados en el aceite de semilla.
14. La semilla de la reivindicación 13 que
comprende aproximadamente un 10 por ciento en peso o más de ácido
estearidónico como componente de dicho aceite de semilla.
15. La semilla de la reivindicación 13 que
comprende aproximadamente un 15 por ciento en peso o más de ácido
estearidónico como componente de dicho aceite de semilla.
16. La semilla de la reivindicación 13 que
comprende aproximadamente un 20 por ciento en peso o más de ácido
estearidónico como componente de dicho aceite de semilla.
17. La semilla de la reivindicación 13 que
comprende aproximadamente un 25 por ciento en peso o más de ácido
estearidónico como componente de dicho aceite de semilla.
18. Aceite de semilla obtenido de semilla de las
reivindicaciones 13 a 17.
19. Un tejido de semilla vegetal de una planta
transgénica de la reivindicación 12 que comprende un aceite de
semilla como se define en las reivindicaciones 13 a 17.
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