ES2294003T3 - Remedios contra el cancer. - Google Patents
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Abstract
Uso de inhibidores de la sPLA2 de tipo X para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento del cáncer, en donde el inhibidor de la sPLA2 de tipo X es un compuesto representado por la fórmula: ó un éster de alquilo de C1-C6 de los mismos, su sal farmacéuticamente aceptable, o su solvato.
Description
Remedios contra el cáncer.
La presente invención se refiere a una
composición para la prevención o tratamiento del cáncer que contiene
como principio activo un inhibidor de la sPLA_{2} de tipo X
(PLA_{2} secretora).
En Cell (1996) 87, 803-809 se
describe que los inhibidores de COX-2 en una
posición posterior a la PLA_{2} en la cascada del araquidonato
son útiles para el tratamiento del cáncer rectosigmoideo. Como
método para diagnosticar un tumor incluyendo cáncer de próstata, se
describe un ensayo cuantitativo y cualitativo para detectar
proteínas sPLA_{2} o niveles de de ARNm de sPLA_{2} en WO
98/05349 (JP Accesible al público (Tokukai) No. 2001/500847). Sin
embargo, ninguno de los documentos describe que los compuestos que
tienen actividades inhibitorias contra la sPLA_{2} de tipo X son
eficaces para el tratamiento del cáncer. WO 00/28997A divulga un
método que facilita la apoptosis de células cancerosas inhibiendo la
actividad fosfolipasa. WO 99/24026A divulga composiciones para el
tratamiento de trastornos asociados con apoptosis utilizando
compuestos N-heterocíclicos de glioxilamida.
Los inventores de la presente invención
examinaron la expresión de la sPLA_{2} de tipo X en varios tipos
de tejidos patológicos humanos con un anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X. Encontraron aumentos en
la expresión de la sPLA_{2} de tipo X en varios tejidos
tumorales.
El análisis inmunohistoquímico de los tejidos
tumorales se realizó como sigue. Al principio, el anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X humana se añadió a las
secciones preparadas de tejidos adultos normales o tejidos
tumorales de pacientes con cáncer y se incubaron durante varias
horas. A continuación, para examinar la expresión de la sPLA_{2}
de tipo X en los tejidos, se observó la expresión de la sPLA_{2}
de tipo X utilizando los métodos tales como el marcaje
inmunohistoquímico para detectar las señales de la sPLA_{2} de
tipo X. Por consiguiente, las señales de la sPLA_{2} de tipo X se
detectaron en las secciones preparadas a partir de tejidos
tumorales, sugiriendo que la expresión de la sPLA_{2} de tipo X
aumenta en tejidos tumorales.
Además, los inventores de la presente invención
realizaron los experimentos para neutralizar las señales de la
sPLA_{2} de tipo X. Exactamente, antes de añadir el anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X humano a las secciones,
se incubaron las secciones con la proteína sPLA_{2} de tipo X
purificada durante varias horas. Después de lo cual, las secciones
se procesaron con los mismos procedimientos que se han descrito
anteriormente para examinar las señales de la sPLA_{2} de tipo X.
Por consiguiente, las señales de la sPLA_{2} de tipo X habían
desaparecido en las secciones preparadas a partir de tejidos
tumorales.
De este modo, se confirmó el aumento de la
expresión de la sPLA_{2} de tipo X en tejidos tumorales
humanos.
Además, los inventores de la presente invención
examinaron los efectos inhibitorios del inhibidor de la sPLA_{2}
contra la liberación de ácido oleico inducida por la sPLA_{2} de
tipo X en células tumorales. Por consiguiente, se confirmó que los
inhibidores de la sPLA_{2} bloqueaban significativamente la
liberación de ácido oleico inducida por la sPLA_{2} de tipo X en
células tumorales.
Por otra parte, se ha descrito la implicación
potencial de PGE_{2} en el desarrollo de tumores en Cancer
Research 59, 5093-5096, 1999. Después, los
inventores de la presente invención examinaron los efectos
inhibitorios de los inhibidores de la sPLA_{2} contra la
producción de PGE_{2} inducida por sPLA_{2} de tipo X en
células tumorales. Por consiguiente, se confirmó que los inhibidores
de la sPLA_{2} bloqueaban significativamente la producción de
PGE_{2} inducida por la sPLA_{2} de tipo X en células
tumorales.
Los inventores de la presente invención
alcanzaron la presente invención siguiente basada en los resultados
experimentales anteriores.
Esto es, la presente invención se refiere a lo
siguiente:
I) Uso de un inhibidor para la preparación de un
medicamento para la prevención o tratamiento del cáncer en donde el
inhibidor de la sPLA_{2} de tipo X es un compuesto representado
mediante la fórmula:
ó
\vskip1.000000\baselineskip
su sal farmacéuticamente aceptable
o su
solvato.
II) Uso según I) en donde el cáncer es un cáncer
de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago,
cáncer de riñón, cáncer de vesícula biliar, cáncer de próstata,
cáncer de páncreas, cáncer de testículo, cáncer de ovario o cáncer
de piel.
III) Uso según I) en donde el cáncer es cáncer
de colon.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se ilustra en detalle como
sigue.
Los inhibidores de la sPLA_{2} de tipo X son
compuestos que tienen actividad inhibitoria contra la sPLA_{2} de
tipo X y otras actividades opcionales tal como actividades
inhibitorias contra otras enzimas o afinidades por cualquier
receptor. Tales inhibidores incluyen cualquier compuesto que tenga
actividades más fuertes contra la sPLA_{2} de tipo X que los que
no tienen tales actividades en el ensayo de evaluación para la
misma. Especialmente, los inhibidores selectivos de la sPLA_{2}
de tipo X son preferidos como inhibidores de la sPLA_{2} de tipo
X de la presente invención. Por ejemplo, se prefieren los compuestos
cuyos valores de IC_{50} contra la sPLA_{2} de tipo X son de 1
\muM o menos en el experimento del Ejemplo 2. Los compuestos que
tienen unos valores de IC_{50} de 100 nM o menos son más
preferidos.
Un inhibidor de la sPLA_{2} de tipo X, un
compuesto que tiene actividades inhibitorias de sPLA_{2} de tipo
X, que tiene uno o más centros quirales, puede existir como un
miembro ópticamente activo. Igualmente, un compuesto que contiene
un alquenilo o alquenileno, puede ser un isómero cis o trans. Las
mezclas de isómeros R y S así como las de los isómeros cis y trans,
y las mezclas de isómeros R y S que contienen una mezcla racémica
se incluyen en el ámbito de la presente invención. Un átomo de
carbono asimétrico también puede existir en un sustituyente tal
como un grupo alquilo. Todos estos isómeros y mezclas se incluyen en
la presente invención. Se puede fabricar un estereoisómero
especificado sometiendo a la reacción estereoespecífica bien
conocida para los expertos en la materia aplicando un material de
partida previamente separado que tiene un centro asimétrico o
preparando una mezcla de estereoisómeros y separando la mezcla según
una forma bien conocida.
También se pueden utilizar como prodrogas
ésteres de alquilo de C1-C6 (por ejemplo, éster
metílico o éster etílico).
Cuando un compuesto que tiene actividades
inhibitorias de la sPLA_{2} de tipo X tiene un grupo funcional
ácido o básico, se pueden formas varias sales que tienen mayor
solubilidad en agua y propiedades fisiológicas más adecuadas que
las del compuesto original. Un ejemplo de sales farmacéuticamente
aceptables típicas incluye sales con metales alcalinos y metales
alcalinotérreos tales como litio, sodio, potasio, magnesio,
aluminio. Una sal se produce fácilmente a partir de un ácido libre
tratando el ácido en una solución con una base, o permitiendo a un
ácido estar en contacto con una resina de intercambio iónico. Las
sales de adición de los compuestos que tienen actividades
inhibitorias de la sPLA_{2} de tipo X con bases inorgánicas
relativamente no tóxicas, por ejemplo, cationes amina, amonio, y
amonio cuaternario derivado de bases nitrogenadas que tienen una
basicidad suficiente para formar una sal de los compuestos de la
presente invención se incluyen en la definición de "sales
farmacéuticamente aceptables" (por ejemplo, S.M. Berge et
al. "Pharmaceutical Salts," J. Phar. Sci., 66,
1-19 (1977)). Además, los grupos básicos de un
compuesto que tiene actividades inhibitorias de la sPLA_{2} de
tipo X se hacen reaccionar con un ácido orgánico o inorgánico
adecuado para formar sales tales como acetatos, bencenosulfatos,
benzoatos, bicarbonatos, bisulfatos, bitartratos, boratos, bromuros,
camsilatos, carbonatos, cloruros, clavulanatos, citratos, edetatos,
edisilatos, estolatos, esilatos, fluoruros, fumaratos, gluceptatos,
gluconatos, glutamatos, glicolilarsanilatos, hexilresorcinatos,
hidroxinaftoatos, yoduros, isotionatos, lactatos, lactobionatos,
lauratos, malatos, maleatos, mandelatos, mesilatos, metilbromuros,
metilnitratos, metilsulfatos, mucatos, napsilatos, nitratos,
oleatos, oxalatos, palmitatos, pantotenatos, fosfatos,
poligalacturonatos, salicilatos, estearatos, subacetatos,
succinatos, tannatos, tartratos, tosilatos, trifluoroacetatos,
trifluorometanosulfonatos, valeratos y similares.
El solvato incluye solvatos con solventes
orgánicos y/o hidratos. En caso de formar un hidrato, el compuesto
en cuestión se puede coordinar con un número adecuado de moléculas
de agua.
El término "farmacéuticamente aceptable"
significa que los soportes, diluyentes, o aditivos son compatibles
con otros ingredientes en una formulación y no son nocivos para los
receptores.
\newpage
El "cáncer" significa varios tumores
malignos originados a partir de células epiteliales en varios
tejidos, células tales como cáncer de colon, cáncer de pulmón,
cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de riñón, cáncer de la
vesícula biliar, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de
testículo, cáncer de ovario, cáncer de piel, cáncer de esófago,
cáncer de laringe, cáncer de mama o cáncer de útero y
ejemplificados. Basado en los experimentos, los inventores de la
presente invención confirmaron la expresión elevada de la sPLA_{2}
de tipo X en varios tejidos tumorales, incluyendo cáncer de colon,
cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de
riñón, cáncer de la vesícula biliar, cáncer de próstata, cáncer de
páncreas, cáncer de testículo, cáncer de ovario o cáncer de piel.
Especialmente, la presente invención es útil para la prevención o
tratamiento del cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado,
cáncer de estómago, cáncer de riñón, cáncer de la vesícula biliar,
cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de testículo, cáncer
de ovario o cáncer de piel.
El término "grupo ácido" en la presente
especificación significa un grupo orgánico que funciona como donante
de protones capaz de formar puentes de hidrógeno cuando se une a un
esqueleto básico mediante un átomo enlazador adecuado (de aquí en
adelante definido como "enlazador ácido").
La presente invención se refiere a la prevención
o tratamiento del cáncer mediante un inhibidor de la sPLA_{2} de
tipo X. Los inhibidores de la sPLA_{2} de tipo X pueden ser
conocidos y se seleccionan de los inhibidores de la sPLA_{2}
definidos en la reivindicación 1.
Además, los compuestos se pueden identificar
como inhibidores de la sPLA_{2} de tipo X mediante el
procedimiento siguiente.
Al principio, se prepara una célula que expresa
la sPLA_{2} de tipo X humana. Esto es, se inserta la secuencia
que codifica la sPLA_{2} de tipo X humana (Cupillard et
al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 15745-15752) en
un vector de expresión para células de mamífero. El vector de
expresión obtenido se transfecta en la célula huésped y se obtiene
la célula que expresa la sPLA_{2} de tipo X de forma estable.
A continuación, las células transfectadas
mencionadas anteriormente se cultivan en medio y el sobrenadante
del cultivo se utiliza para la medida de cada actividad enzimática.
Para identificar y evaluar un inhibidor de la sPLA_{2} de tipo X,
se utiliza el siguiente ensayo cromogénico. Una explicación general
de este ensayo se describe en "Analysis of Human Synovial Fluid
Phosphlipase A_{2} on Short Chain
Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of
a Spectrophotometric Assay Suitable for a Microtiterplate Reader"
(Analytical Biochemistry. 204, pp. 190-197, 1992
por Laure J. Reynolds, Lori L. Hughes y Edward A. Dennis.
Se pueden sintetizar varios compuestos de la
siguiente invención según los métodos descritos en PCT/JP00/07024,
EP-620214 (JP Accesible al Público (Tokukai) No.
95/010838, US-5578634), EP-620215
(JP Accesible al Público (Tokukai) No. 95/025850,
US-5684034), EP-675110 (JP Accesible
al Público (Tokukai) No. 95/285933, US-5654326), WO
96/03120 (JP Accesible al Público (Tokukai) No. 98/505336), WO
96/03383 (JP Accesible al Público (Tokukai) No. 98/505584), WO
98/18464 (EP839806), WO 99/51605, WO 99/59999.
La composición utilizada para el tratamiento o
prevención del cáncer según la presente invención se puede
administrar a un paciente a través de varias vías incluyendo las
vías oral, aerosol, rectal, percutánea, subcutánea, intravenosa,
intramuscular y nasal. Se puede fabricar una composición según la
presente invención combinando (por ejemplo, mezclando) una cantidad
curativamente eficaz de un compuesto de la presente invención con un
soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable. La formulación de
la presente invención se puede fabricar con el uso de ingredientes
bien conocidos y fácilmente disponibles según un método
conocido.
En caso de producir una composición de la
presente invención, los principios activos se mezclan o diluyen con
un soporte, o están contenidos en un soporte en forma de cápsula,
bolsita, papel u otro envase. En caso de que un soporte funcione
como diluyente, el soporte es un material sólido, semisólido o
líquido que funciona como medio. De acuerdo con esto, una
formulación según la presente invención se puede producir en forma
de comprimido, píldora, medicina en polvo, medicina intraoral,
agente elixir, agente suspensor, emulsionante, agente disolvente,
agente jarabe, agente aerosol (sólido en medio líquido), y pomada.
Tal formulación puede contener hasta un 10% de un principio activo.
Se prefiere formular un compuesto que tiene actividades para el
tratamiento o la prevención del cáncer antes de la
administración.
Se puede utilizar para la formulación cualquier
soporte adecuado bien conocido por los expertos en la materia. En
tal formulación, el soporte está en forma de sólido, líquido o una
mezcla de los mismos. Por ejemplo, se disuelve un compuesto que
tiene actividades inhibitorias de la sPLA_{2} de tipo X en una
solución acuosa de dextrosa al 4%/citrato sódico al 0.5% de modo
que tenga una concentración de 2 mg/mL para inyección intravenosa.
La formulación sólida incluye polvo, comprimido y cápsula. El
soporte sólido consiste en uno o más materiales que sirven también
como fragancia, lubricante, agente disolvente, suspensión,
aglutinante, desintegrador de comprimidos, cápsula. Un comprimido
para administración oral contiene un excipiente adecuado tal como
carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico junto
a un desintegrador tal como almidón de maíz, ácido algínico y/o un
aglutinante tal como gelatina, acacia y un lubricante tal como
estearato de magnesio, ácido esteárico, talco.
En una medicina en polvo, un soporte es un
sólido finamente pulverizado que se mezcla con los principios
activos finamente pulverizados. En un comprimido, los principios
activos se mezclan con un soporte que tiene el poder aglutinante
requerido en una proporción adecuada, y se solidifica en la forma y
tamaño deseados. Medicina en polvo y comprimido contienen desde
alrededor del 1 hasta alrededor del 99% en peso de los principios
activos que son compuestos nuevos según la presente invención. Un
ejemplo de soportes sólidos adecuados incluye carbonato de
magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina,
dextrina, almidón, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa,
carboximetilcelulosa sódica, cera de bajo punto de fusión, y manteca
de cacao.
Una formulación líquida axénica contiene un
agente suspensor, emulsionante, agente jarabe y agente elixir. Los
principios activos pueden estar disueltos o en suspensión en un
soporte farmacéuticamente aceptable tal como agua estéril, un
solvente orgánico estéril, una mezcla de los mismos o similares. Con
frecuencia los principios activos se pueden disolver en un solvente
orgánico adecuado tal como una solución acuosa de propilenglicol.
Cuando los ingredientes activos finamente pulverizados se dispersan
en almidón acuoso, una solución de carboximetilcelulosa sódica, o
un aceite adecuado, se pueden preparar las otras composiciones.
La dosis varía con las condiciones de la
enfermedad, vía de administración, edad, y peso corporal del
paciente. En el caso de administración intravenosa, la dosis puede
ser en general entre 0.01 hasta 10 mg/kg/h para un adulto,
preferiblemente de 0.1 a 1 mg/kg/h.
\vskip1.000000\baselineskip
Se insertó la secuencia de ADNc que codifica la
sPLA_{2} de tipo X humana (Cupillard et al., J. Biol.
Chem., 1997, 272, 15745-15752) en la región
corriente abajo del promotor de pSVL vector de expresión con el
promotor tardío del SV40 (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) que es
un vector de expresión para células de mamífero. El vector de
expresión obtenido se transfectó en las células huésped CHO con
reactivo LipofectAMINE (Gibco BRL) según las instrucciones del
fabricantes para obtener células CHO que expresaban la sPLA_{2} de
tipo X humana de forma estable. Las células transfectadas se
cultivaron en un medio \alpha-MEM con suero fetal
de ternera al 10% durante 3 días y el sobrenadante del cultivo se
utilizó para las medidas de cada actividad enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar y evaluar un inhibidor de la
sPLA_{2} de tipo X, se utilizó el siguiente ensayo cromogénico.
Este ensayo se ha aplicado para cribados de gran volumen utilizando
una placa de microtitulación de 96 pocillos. Una explicación
general de este ensayo se describe en "Analysis of Human Synovial
Fluid Phospholipase A_{2} on Short Chain
Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of a
Spectrophotometric Assay Suitable for a Microtiterplate Reader"
(Analytical Biochemistry. 204, pp 190-197, 1992 por
Laure J. Reynolds, Lori L. Hughes y Edward A. Dennis.
Se añadieron los compuestos a ensayar (o blanco
solvente) según el alineamiento de las placas que se había fijado
previamente. Se incubó la sPLA_{2} de tipo X humana (30 minutos a
40ºC (15 \mul/pocillo)) con diheptanoiltio PC (1 mM) en presencia
de Triton X-100 (0.3 mM) y ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)
(125 \muM) en tampón Tris-HCl (25 mM, pH 7.5) con
CaCl_{2} (10 mM), KCl (100 mM) y seroalbúmina bovina (1.0 mg/mL).
Se midieron los cambios en la absorbancia a 405 nm y se calcularon
las actividades inhibitorias.
Se determinó el valor de IC_{50} representando
el logaritmo de la concentración de los compuestos mencionados
anteriormente (1)-(19) respecto a sus valores de inhibición dentro
del intervalo de inhibición del 10% al 90%.
Los resultados del ensayo de inhibición de la
sPLA_{2} de tipo X se muestran en la Tabla 1 a continuación.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de colon humano y los tejidos normales correspondientes
embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc. (San Leandro,
CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en los
portaobjetos, se trataron con metanol que contenía H_{2}O_{2}
al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad de peroxidasa
endógena y se incubaron con suero normal de cabra al 5% durante 20
minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL) en PBS con
seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC. Después de
lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X no se
detectaron de forma evidente en el colon normal, pero se detectaron
con fuerza en las células tumorales en tejidos de adenocarcinoma de
colon humano. Puesto que la adición de la proteína sPLA_{2} de
tipo X produjo una supresión de las señales, se verificaron como
señales específicas para la sPLA_{2} de tipo X. Además, no hubo
señal positiva cuando se utilizó IgG preparada de conejos no
inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos sugieren que la
expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en tejidos
de cáncer colorrectal humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de pulmón humano y los tejidos normales correspondientes
embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc. (San Leandro,
CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en los
portaobjetos, se trataron con metanol que contenía H_{2}O_{2}
al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad de peroxidasa
endógena y se incubaron con suero normal de cabra al 5% durante 20
minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL) en PBS con
seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC. Después de
lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
detectaron débilmente en los neumocitos de tipo II en pulmón humano
normal. Por el contrario, las señales positivas se detectaron con
fuerza en células tumorales en los tejidos pulmonares preparados de
pacientes con cáncer de pulmón. Puesto que la adición de la
proteína sPLA_{2} de tipo X produjo una supresión de las señales,
se verificaron como señales específicas para la sPLA_{2} de tipo
X. Además, no hubo señal positiva cuando se utilizó IgG preparada
de conejos no inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos
sugieren que la expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó
mucho en tejidos de cáncer de pulmón humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de hígado humano y los tejidos normales correspondientes
embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc. (San Leandro,
CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en los
portaobjetos, se trataron con metanol que contenía H_{2}O_{2}
al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad de peroxidasa
endógena y se incubaron con suero normal de cabra al 5% durante 20
minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL) en PBS con
seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC. Después de
lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
detectaron débilmente en los lóbulos hepáticos y las células
satélites de Kupffer de hígado humano normal. Por el contrario, las
señales positivas se detectaron con fuerza en células tumorales en
los tejidos hepáticos preparados de pacientes con cáncer de hígado.
Puesto que la adición de la proteína sPLA_{2} de tipo X produjo
una supresión de las señales, se verificaron como señales
específicas para la sPLA_{2} de tipo X. Además, no hubo señal
positiva cuando se utilizó IgG preparada de conejos no inmunizados.
En conjunto, estos descubrimientos sugieren que la expresión la
proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en tejidos de cáncer de
hígado humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de estómago humano y los tejidos normales
correspondientes embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc.
(San Leandro, CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en
los portaobjetos, se trataron con metanol que contenía
H_{2}O_{2} al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad
de peroxidasa endógena y se incubaron con suero normal de cabra al
5% durante 20 minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL)
en PBS con seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC.
Después de lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X no se
detectaron de forma evidente en estómago normal, pero se detectaron
con fuerza en células tumorales en los tejidos gástricos preparados
de pacientes con cáncer de estómago. Puesto que la adición de la
proteína sPLA_{2} de tipo X produjo una supresión de las señales,
se verificaron como señales específicas para la sPLA_{2} de tipo
X. Además, no hubo señal positiva cuando se utilizó IgG preparada de
conejos no inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos sugieren
que la expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en
tejidos de cáncer de estómago humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de riñón humano y los tejidos normales correspondientes
embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc. (San Leandro,
CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en los
portaobjetos, se trataron con metanol que contenía H_{2}O_{2}
al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad de peroxidasa
endógena y se incubaron con suero normal de cabra al 5% durante 20
minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL) en PBS con
seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC. Después de
lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
detectaron débilmente en las células mesangiales glomerulares en
riñón normal. Por el contrario, las señales positivas se detectaron
con fuerza en células tumorales en el riñón preparado de pacientes
con cáncer de riñón. Puesto que la adición de la proteína
sPLA_{2} de tipo X produjo una supresión de las señales, se
verificaron como señales específicas para la sPLA_{2} de tipo X.
Además, no hubo señal positiva cuando se utilizó IgG preparada de
conejos no inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos sugieren
que la expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en
tejidos de cáncer de riñón humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de vesícula biliar humano y los tejidos normales
correspondientes embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc.
(San Leandro, CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en
los portaobjetos, se trataron con metanol que contenía
H_{2}O_{2} al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad
de peroxidasa endógena y se incubaron con suero normal de cabra al
5% durante 20 minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL)
en PBS con seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC.
Después de lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X no se
detectaron de forma evidente en tejidos normales de la vesícula
biliar, pero se detectaron con fuerza en células tumorales en los
tejidos de la vesícula biliar preparados de pacientes con cáncer de
vesícula biliar. Puesto que la adición de la proteína sPLA_{2} de
tipo X produjo una supresión de las señales, se verificaron como
señales específicas para la sPLA_{2} de tipo X. Además, no hubo
señal positiva cuando se utilizó IgG preparada de conejos no
inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos sugieren que la
expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en tejidos
de cáncer de vesícula biliar humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de próstata humano y los tejidos normales
correspondientes embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc.
(San Leandro, CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en
los portaobjetos, se trataron con metanol que contenía
H_{2}O_{2} al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad
de peroxidasa endógena y se incubaron con suero normal de cabra al
5% durante 20 minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL)
en PBS con seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC.
Después de lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X no se
detectaron de forma evidente en próstatas normales, pero se
detectaron con fuerza en células tumorales en los tejidos de
próstata preparados de pacientes de cáncer de próstata. Puesto que
la adición de la proteína sPLA_{2} de tipo X produjo una
supresión de las señales, se verificaron como señales específicas
para la sPLA_{2} de tipo X. Además, no hubo señal positiva cuando
se utilizó IgG preparada de conejos no inmunizados. En conjunto,
estos descubrimientos sugieren que la expresión la proteína
sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en tejidos de cáncer de próstata
humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de páncreas humano y los tejidos normales
correspondientes embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc.
(San Leandro, CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en
los portaobjetos, se trataron con metanol que contenía
H_{2}O_{2} al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad
de peroxidasa endógena y se incubaron con suero normal de cabra al
5% durante 20 minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL)
en PBS con seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC.
Después de lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con una solución de hematoxilina al 0.4%.
Las señales positivas representativas de la expresión de la
sPLA_{2} de tipo X se observaron como un color pardusco oscuro
del depósito de diaminobencidina. La neutralización de las señales
específicas de la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína
sPLA_{2} de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas
antes de la adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X no se
detectaron de forma evidente en páncreas normal, pero se detectaron
con fuerza en células tumorales en páncreas preparado de pacientes
con cáncer de páncreas. Puesto que la adición de la proteína
sPLA_{2} de tipo X produjo una supresión de las señales, se
verificaron como señales específicas para la sPLA_{2} de tipo X.
Además, no hubo señal positiva cuando se utilizó IgG preparada de
conejos no inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos sugieren
que la expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en
tejidos de cáncer de páncreas humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de testículo humano y los tejidos normales
correspondientes embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc.
(San Leandro, CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en
los portaobjetos, se trataron con metanol que contenía
H_{2}O_{2} al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad
de peroxidasa endógena y se incubaron con suero normal de cabra al
5% durante 20 minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL)
en PBS con seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC.
Después de lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con colorante verde de metilo al 1% en
acetato sódico 0.1 ml/L (pH 4.0). Las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
observaron como un color pardusco oscuro del depósito de
diaminobencidina. La neutralización de las señales específicas de
la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína sPLA_{2}
de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas antes de la
adición a los portaobjetos.
\newpage
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
detectaron débilmente en algunas zonas de los túbulos seminíferos
de testículos normales. Por el contrario, las señales positivas se
detectaron con fuerza en células malignas presentes en los túbulos
seminíferos y/o el epitelio de las vesículas seminales en
testículos preparados de pacientes con cáncer de testículo. Puesto
que la adición de la proteína sPLA_{2} de tipo X produjo una
supresión de las señales, se verificaron como señales específicas
para la sPLA_{2} de tipo X. Además, no hubo señal positiva cuando
se utilizó IgG preparada de conejos no inmunizados. En conjunto,
estos descubrimientos sugieren que la expresión la proteína
sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en tejidos de cáncer de testículo
humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de ovario humano y los tejidos normales correspondientes
embebidos en parafina se compraron de Biochain Inc. (San Leandro,
CA). Se eliminó la cera de las secciones de tejido en los
portaobjetos, se trataron con metanol que contenía H_{2}O_{2}
al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad de peroxidasa
endógena y se incubaron con suero normal de cabra al 5% durante 20
minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL) en PBS con
seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC. Después de
lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con colorante verde de metilo al 1% en
acetato sódico 0.1 ml/L (pH 4.0). Las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
observaron como un color pardusco oscuro del depósito de
diaminobencidina. La neutralización de las señales específicas de
la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína sPLA_{2}
de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas antes de la
adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X no se
detectaron de forma evidente en ovario normal, pero se detectaron
con fuerza en células malignas presentes en el epitelio de
folículos ováricos y/o oviductos de ovarios preparados de pacientes
con cáncer de ovario. Puesto que la adición de la proteína
sPLA_{2} de tipo X produjo una supresión de las señales, se
verificaron como señales específicas para la sPLA_{2} de tipo X.
Además, no hubo señal positiva cuando se utilizó IgG preparada de
conejos no inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos sugieren
que la expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó mucho en
tejidos de cáncer de ovario humano.
En este experimento, se utilizó en anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X que se describe en "The
Journal of Biological Chemistry Vol. 274, No. 48, pp.
34203-34211, 1999". Las preparaciones de tejidos
de cáncer de piel humana (melanoma maligno) y los tejidos normales
correspondientes embebidos en parafina se compraron de Biochain
Inc. (San Leandro, CA). Se eliminó la cera de las secciones de
tejido en los portaobjetos, se trataron con metanol que contenía
H_{2}O_{2} al 0.3% durante 30 minutos para eliminar la actividad
de peroxidasa endógena y se incubaron con suero normal de cabra al
5% durante 20 minutos. Los portaobjetos se incubaron después con un
anticuerpo anti-sPLA_{2} de tipo X (6 \mug/mL)
en PBS con seroalbúmina bovina al 0.1% durante 14 horas a 4ºC.
Después de lavar con PBS, se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo conjugado a biotina durante 30
minutos seguido por un tratamiento con un reactivo del complejo
avidina-biotina marcado con peroxidasa (Vector
Laboratories). Después de lavar, las muestras se procesaron con el
sustrato clorhidrato de diaminobencidina 200 \mug/mL disuelto en
Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7.6) con H_{2}O_{2} al
0.006% durante 10 minutos que produjo la aparición de color
dependiente de la actividad peroxidasa para observar la expresión de
la sPLA_{2} de tipo X en las preparaciones de tejido. Además, los
núcleos se contratiñeron con colorante verde de metilo al 1% en
acetato sódico 0.1 ml/L (pH 4.0). Las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
observaron como un color pardusco oscuro del depósito de
diaminobencidina. La neutralización de las señales específicas de
la sPLA_{2} de tipo X se llevó a cabo incubando el anticuerpo
anti-sPLA_{2} de tipo X con proteína sPLA_{2}
de tipo X purificada (60 \mug/mL) durante 2 horas antes de la
adición a los portaobjetos.
Por consiguiente, las señales positivas
representativas de la expresión de la sPLA_{2} de tipo X se
detectaron débilmente en los melanocitos del estrato espinoso y/o
estrato basal de epidermis de piel en piel humana normal. Por el
contrario, las señales positivas se detectaron con fuerza en
melanocitos hipertrofiados en la piel preparada de pacientes con
cáncer de piel (melanoma maligno). Puesto que la adición de la
proteína sPLA_{2} de tipo X produjo una supresión de las señales,
se verificaron como señales específicas para la sPLA_{2} de tipo
X. Además, no hubo señal positiva cuando se utilizó IgG preparadas
de conejos no inmunizados. En conjunto, estos descubrimientos
sugieren que la expresión la proteína sPLA_{2} de tipo X aumentó
mucho en tejidos de cáncer de piel (melanoma maligno) humano.
Se utilizaron el compuesto (1) y el compuesto
(19) como compuestos a ensayar.
Las líneas de células de carcinoma de colon
humano, células HT-29 (obtenidas de la ATCC) se
cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal de ternera la 10%.
Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato
(PBS), se separaron de las placas de cultivo mediante tratamiento
con solución de tripsina/EDTA y se lavaron adicionalmente con PBS.
Las células resultantes se resuspendieron en solución salina
tamponada de Hanks con seroalbúmina bovina (BSA) al 0.1% a una
densidad de 12.5x10^{6} células/mL. Se transfirieron alícuotas de
la suspensión de células (0.4 mL) a tubos de polipropileno y se
añadieron los compuestos a ensayar disueltos en una solución de
DMSO (concentración final: 10 \muM). Después de preincubar durante
10 minutos a 37ºC, se añadió enzima sPLA_{2} de tipo X humana
purificada, 100 nM (Hanasaki et al., J. Biol. Chem. (1999)
274, 34203-34211) (volumen final de 0.5 mL). Después
de incubar durante 30 minutos a 37ºC, la reacción se paró mediante
la adición de 2 mL de reactivo de Dole (heptano :
2-propanol : H_{2}SO_{4} 1 M = 10:40:1, v/v/v).
Según el método de Tojo y col. (J. Lipid Res. (1993) 34,
837-844), se extrajeron los ácidos grasos, se
marcaron con 9-antrildiazometano (Funakoshi Co.), y
se cuantificó el ácido oleico mediante cromatografía de alta
resolución de fase reversa (columna LiChroCART 125-4
Superspher 100 RP-18 (Merck). De cada dato, se
sustrajo el valor en ausencia de la sPLA_{2} de tipo X. La
cantidad de ácido oleico liberado en presencia de cada compuesto a
ensayar se expresó como el porcentaje del contenido aumentado por la
adición de la enzima sPLA_{2} de tipo X. Como se muestra en la
Tabla 2, cada compuesto a ensayar inhibió significativamente la
liberación de ácido oleico inducida por la sPLA_{2} de tipo X.
Las células HT-29 se sembraron
en placas de 24 pocillos a una densidad de 2.5x10^{5}
células/pocillo. Después de incubar durante 24 horas, las células
se lavaron con PBS y se incubaron con factor de necrosis tumoral
\alpha 30 ng/mL (R&D Systems, Inc.) en medio DMEM suplementado
con suero fetal bovino al 10% durante 18 horas. Después de lavar
con PBS, las células se preincubaron con o sin los compuestos a
ensayar (a una concentración final de 10 \muM; disueltos en DMSO)
en solución salina tamponada de Hanks con BSA al 0.1% durante 10
minutos a 37ºC, y después se estimularon con enzima sPLA_{2} de
tipo X humana purificada 100 nM en un volumen final de 0.5 mL.
Después de incubar 3 horas a 37ºC, el sobrenadante del cultivo se
recogió después de la centrifugación para eliminar las células
flotantes, y se cuantificó su contenido en PGE_{2} con un kit de
inmunoensayo de la enzima (Cayman Chemicals Co.). De cada dato, se
sustrajo el valor en ausencia de la sPLA_{2} de tipo X. La
cantidad de PGE_{2} en presencia de cada compuesto a ensayar se
expresó como el porcentaje del contenido de PGE_{2} producido por
la adición de la enzima sPLA_{2} de tipo X. Como se muestra en la
Tabla 2, cada compuesto a ensayar bloqueó significativamente la
producción de PGE_{2} inducida por la sPLA_{2} de tipo X.
En Cancer Research 59,
5093-5096, 1999 se ha descrito la implicación
potencial de PGE_{2} en la progresión de tumores. Puesto que los
compuestos en la presente invención bloquean significativamente la
producción de PGE_{2} inducida por la sPLA_{2} de tipo X, se
pueden aplicar como agentes antitumorales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se debe advertir que los siguientes Ejemplos
Formulación 1 a 8 son meras ilustraciones de la invención. El
término "principio activo" significa los compuestos que tienen
una actividad inhibitoria contra la sPLA_{2} de tipo X, las
prodrogas de los mismos, sus sales farmacéuticamente aceptables, o
sus hidratos según se define en la reivindi-
cación 1.
cación 1.
Ejemplo Formulación
1
Se preparan cápsulas de gelatina dura utilizando
los siguientes ingredientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Formulación
2
Se prepara un comprimido utilizando los
siguientes ingredientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes se mezclan y comprimen para
formar los comprimidos, pesando cada uno 665 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Formulación
3
Se prepara una solución aerosol que contiene los
siguientes componentes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla el principio activo con etanol y la
mezcla se añade a una parte del propelente 22, se enfría a -30ºC y
se transfiere a un dispositivo de llenado. La cantidad requerida se
introduce entonces en un envase de acero inoxidable y se diluye con
lo que queda del propelente. Las unidades de válvula se ajustan
entonces al envase.
\newpage
Ejemplo Formulación
4
Se preparan comprimidos, cada uno de los cuales
contiene 60 mg del principio activo, como sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
El principio activo, almidón y celulosa se pasan
a través de un tamiz U.S. de malla No. 45 (0.355 mm), y se mezclan
completamente. La solución acuosa que contiene polivinilpirrolidona
se mezcla con el polvo resultante, y la mezcla se pasa entonces a
través de un tamiz U.S. de malla No. 14 (1.4 mm). Los gránulos así
producidos se secan a 50ºC y se pasan a través de un tamiz U.S, de
malla No. 18 (1.0 mm). Se añaden después a los gránulos,
carboximetil almidón sódico, estearato de magnesio y talco,
previamente pasados a través de un tamiz U.S. de malla No. 60
(0.250 mm) que, después de mezclar, se comprimen en un maquina de
comprimidos para producir comprimidos que pesan cada uno 150 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Formulación
5
Se producen cápsulas, cada una de las cuales
contiene 80 mg del principio activo, como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan el principio activo, celulosa,
almidón y estearato de magnesio, se pasan a través de un tamiz U.S.
de malla No. 45 (0.355 mm), y se cargan en cápsulas de gelatina dura
en cantidades de 200 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Formulación
6
Se producen supositorios, ceda uno de los cuales
contiene 225 mg del principio activo, como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
El principio activo se pasa a través de un tamiz
U.S. de malla No. 60 (0.251 mm) y se resuspende en los glicéridos de
ácidos grasos saturados previamente fundidos utilizando el calor
necesario mínimo. La mezcla se vuelca entonces en un molde de
supositorio de capacidad nominal de 2 g y se deja enfriar.
\newpage
Ejemplo Formulación
7
Se preparan suspensiones, cada una de las cuales
contiene 50 mg del principio activo por dosis de 5 mL, como
sigue:
| Principio activo | 50 mg |
| Carboximetilcelulosa sódica | 50 mg |
| Jarabe | 1.25 mL |
| Solución de ácido benzoico | 0.10 mL |
| Aroma | q.v. |
| Color | q.v. |
| Agua purificada para totalizar | 5 mL |
\vskip1.000000\baselineskip
El principio activo se pasa a través de un tamiz
U.S. de malla No. 45 (0.355 mm), y se mezcla con la
carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta
uniforme. Se diluyen la solución de ácido benzoico y aroma con una
parte del agua y se añaden, con agitación. Después se añade
suficiente agua para producir el volumen requerido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Formulación
8
Se puede preparar una formulación intravenosa
como sigue:
| Ingrediente activo | 100 mg |
| Glicéridos de ácidos grasos saturados | 1000 mL |
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de los ingredientes anteriores
generalmente se administra de forma intravenosa a un sujeto a una
velocidad de 1 mL por minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aporta que los inhibidores de la sPLA_{2}
de tipo X de la reivindicación 1 son útiles en la prevención o
tratamiento del cáncer.
Claims (3)
1. Uso de inhibidores de la sPLA_{2} de tipo X
para la preparación de un medicamento para la prevención o el
tratamiento del cáncer, en donde el inhibidor de la sPLA_{2} de
tipo X es un compuesto representado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
un éster de alquilo de
C1-C6 de los mismos, su sal farmacéuticamente
aceptable, o su
solvato.
2. Uso según se reivindica en la reivindicación
1 en donde el cáncer es cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de
hígado, cáncer de estómago, cáncer de riñón, cáncer de vesícula
biliar, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de testículo,
cáncer de ovario o cáncer de piel.
3. Uso según se reivindica en la reivindicación
1 en donde el cáncer es cáncer de colon.
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