ES2294319T3 - Astrovirus de pollo tipo 2. - Google Patents
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Abstract
Un astrovirus de pollo de tipo 2 (CAstV-2) caracterizado porque el virus es el CAstV depositado con el número de entrada I-2932 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur, Paris, Francia o un CAstV inmunológicamente relacionado que es capaz de inducir antisuero que neutraliza el virus depositado.
Description
Astrovirus de pollo de tipo 2.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a un astrovirus
de pollo de tipo 2, un cultivo celular infectado con tal virus así
como a una vacuna que comprende este virus.
Se han asociado varios virus a enfermedad
entérica y retraso del crecimiento en pollos y pavos. En el caso de
pollos, el virus incluye nuestro virus de
retículo-endoteliosis, reovirus, virus de la
enfermedad de Marek, virus de la anemia del pollo, varios
enterovirus, virus de tipo enterovirus, virus de la encefalomielitis
aviar (AE) y virus de la nefritis aviar (ANV), un astrovirus.
Los astrovirus son pequeños virus sin envuelta
redondos con un diámetro típico de 28-30 nm y que
llevan un genoma de ARN de cadena positiva. Los astrovirus son
diferentes de otros virus pequeños redondos (SRV), tales como
parvovirus, circovirus, picornavirus y calicivirus, por ejemplo, con
respecto a sus respectivas estructuras morfológicas
características, visibles por microscopía electrónica.
La familia Astroviridae (véase Fields Virology,
eds.: B.N. Fields et al., 1998, Capítulo 26) se divide en
dos géneros, es decir, astrovirus de mamífero y astrovirus aviares,
habiéndose revisado los últimos de forma amplia por Koci y
Schultz-Cherry en Avian Pathology 31,
213-227, 2002. En particular, este documento revisa
la organización del genoma característica y la biología molecular de
astrovirus (aviares) y proporciona un análisis de secuencia de las
fases de lectura abiertas de los astrovirus.
Los astrovirus de pavo se han asociado con
diarrea y mortalidad aumentada en pollitos de pavo. Se han
identificado dos tipos de astrovirus de pavo (TastV),
TastV-1 y TastV-2, pero se ha visto
que estos astrovirus de pavo son genéticamente e inmunológicamente
diferentes.
Actualmente, el virus de la nefritis aviar (ANV)
aislado de pollos por Yamaguchi, et al en 1979 (Avian
Diseases 23, 571-581) se ha
(re)-clasificado como un astrovirus después del
secuenciado completo del genoma viral (Imada et al., J.
Virol 74, 8487-8493, 2000). Este virus se
asocia a una ligera disminución del crecimiento y lesiones en el
riñón pero también se ha informado de cierta mortalidad. Los
pollitos de un día son las aves más susceptibles a la enfermedad
provocada por el ANV.
Se ha demostrado que los astrovirus de pato
(DAstV) son el agente causal de la hepatitis de pato de tipo 2 en
patos. Se ha demostrado que el astrovirus de pato es
inmunológicamente diferente de los astrovirus aislados de pollos
(ANV) y pavos y de los virus que provocan DVH de tipo I y III.
El presente inventor ha identificado un nuevo
(sub)tipo de astrovirus aviares que se pueden aislar de
pollos (CastV-2) que es inmunológicamente diferente
de los astrovirus de pollo ANV conocidos (CastV-1) y
de otros astrovirus aviares.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un astrovirus de pollo de tipo 2 (CAstV-2),
caracterizado porque el virus es el CAstV depositado con el número
de entrada I-2932 en la Colección Nacional de
Cultivos de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur, de Paris,
Francia o un CastV inmunológicamente relacionado que es capaz de
inducir antisuero que neutralice el virus depositado.
Como se ha mencionado anteriormente, los
astrovirus aviares existentes son inmunológicamente diferentes y el
CastV-2 como se ha definido anteriormente también se
ha demostrado que se puede distinguir inmunológicamente de los
(astro)virus aviares conocidos previamente. El nuevo
CastV-2 se puede usar para la preparación de vacunas
de aves de corral y ensayos diagnósticos. Se puede obtener un
CastV-2 de acuerdo con la invención a partir del
Instituto de Depósito (CNCM del Instituto Pasteur) o se puede aislar
de animales infectados en el campo y se puede identificar como tal
por la reacción con antisueros específicos generados contra el virus
depositado en un ensayo inmunológico como se describe en los
ejemplos. Un ensayo de neutralización de virus es particularmente
adecuado para la identificación de un CastV-2 de
acuerdo con la presente invención.
Se acepta generalmente que existe variación
biológica en la naturaleza entre organismos del mismo tipo. Con el
propósito de esta invención el CastV depositado se considera que es
la cepa de referencia de CastV-2 con la que las
otras cepas de CastV-2 están inmunológicamente
relacionadas. El ensayo de neutralización de virus y el ensayo de
inmunofluorescencia (IF) se usan ampliamente en la técnica para
determinar la presencia o ausencia de una relación inmunológica
entre virus (aviares). Se describen ensayos típicos de
neutralización de virus y de IF en los ejemplos y también se
describen en Mockett et al. (Avian Pathology 22,
751-770, 1993), McNulty et al. (Avian
Pathology 19, 75,87, 1990) y Nersessian et al. (Am. J.
Vet. Res. 50, 1475-1480, 1989). En las
Tablas 1 y 2 se muestra que las cepas de CastV-2
forman un serogrupo homogéneo de astrovirus de pollo que es
inmunológicamente diferente de los astrovirus aviares conocidos.
Por lo tanto, se considera que un CastV
pertenece a la presente invención en el caso de que el astrovirus
aviar esté inmunológicamente relacionado con el CastV, es decir, en
caso de que sea capaz de inducir antisuero que sea capaz de
neutralizar el virus depositado en un ensayo de neutralización de
virus. Un ensayo de neutralización que se puede usar para
determinar la relación inmunológica se describe a continuación en el
Ejemplo 2.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Obviamente, el antisuero que se tiene que usar
en el ensayo de neutralización de virus debe ser de calidad
apropiada. Se describen métodos para la preparación de tal antisuero
en el Ejemplo 2.
Generalmente, un antisuero apropiado generado
contra un CastV vivo se puede preparar inoculando a pollos SPF de 3
a 4 semanas de edad por via oral una cepa de virus vivo que tiene un
título infeccioso entre 10^{2,0} - 10^{9,0} ufp/animal; más
preferiblemente entre 10^{3,0} - 10^{6,0} ufp/animal. Se puede
recoger sangre entre 3 y 4 semanas después de la infección,
preferiblemente 4 semanas después de la infección. Además, los
pollos se pueden re-infectar con la misma cepa de
virus vivo de 3 a 4 semanas después de la primera infección con
aproximadamente la misma dosis que la usada en la primera infección.
Se recoge sangre entre 2 y 4 semanas después de la segunda
infección.
Se puede obtener antisuero apropiado generado
contra CastV inactivado inoculando a pollos SPF de 3 a 4 semanas de
edad la preparación de virus inactivado y un adyuvante por vía
subcutánea o por vía intramuscular. El título infeccioso de la
preparación antes de la inactivación puede estar entre 10^{7,0} -
10^{11,0} ufp/animal; más preferiblemente entre 10^{8,0} -
10^{10,0} ufp/animal. Se puede recoger sangre entre 3 y 4 semanas
después de la inoculación, preferiblemente 4 semanas después de la
inoculación. Además, a los pollos se puede
re-inocular la preparación de virus inactivado entre
3 y 4 semanas después de una primera inoculación con la preparación
de virus vivo o inactivado. Se recoge sangre entre 2 y 4 semanas
después de la segunda inoculación.
Un antisuero de calidad apropiada comprende
típicamente un título de anticuerpos neutralizantes de \geq 256
contra e virus homólogo.
Preferiblemente, la presente invención
proporciona un astrovirus de pollo de tipo 2
(CAstV-2), caracterizado porque el virus es el
CAstV depositado con el número de entrada I-2932 en
la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del
Instituto Pastuer, Paris, Francia o un CastV relacionado
inmunológicamente que tiene un porcentaje de relación (%R) con el
virus depositado de al menos 32, más preferiblemente al menos 50,
mucho más preferiblemente al menos 70 como se ha determinado por
neutralización cruzada de virus y se ha calculado de acuerdo con el
método de Archetti y Horsefall (J. Exp. Med. 92,
441-462, 1950). Los "valores R" de
32-50 entre un virus de ensayo y el CastV depositado
indican una clara relación inmunológica entre ambos, mientras que
un "valor R" de 50-70 y al menos 70 indica
menos/ninguna diferencia inmunológica, respectivamente.
Caracterización adicional del
CAstV-2:
Tratamiento con éter e IDUR: El virus es
un agente estable resistente a éter y su crecimiento no se inhibió
por IDUR - indicando que es un virus ARN.
Ensayo de inmunofluorescencia: Cuando se
ensayaron cultivos celulares infectados usando el ensayo de
inmunofluorescencia, mostraron fluorescencia citoplásmica sin
fluorescencia nuclear. Se podría usar suero de elevado título de
anticuerpos a una dilución de >1:256 dando fluorescencia
brillante.
Ensayo de neutralización cruzada: en un
ensayo de reducción de placa, el virus se neutraliza bien con
antisuero inducido contra sí mismo observándose a menudo títulos
séricos superiores a 512. Los antisueros contra los siguientes
agentes no han mostrado neutralización cruzada.
- a)
- Adenovirus aviares (CELO, GAL, Tipton, EDS y HEV)
- b)
- Virus de la encefalomielitis aviar (AE)
- c)
- Virus de la viruela de aves de corral, pavo y palomas
- d)
- Virus de la bursitis infecciosa
- e)
- Neumovirus aviar (TRT)
- f)
- Retrovirus (virus de la leucosis aviar y de retículo-endoteliosis)
- g)
- Reovirus aviares
- h)
- Virus de la Nefritis aviar
- i)
- Virus de la anemia del pollo
Microscopia electrónica: Se colocó una
suspensión que contenía partículas virales purificadas de células
infectadas sobre rejillas de cobre recubiertas de carbono y se
sometieron a tinción negativa. El examen en un microscopio
electrónico mostró la presencia de agregados de virus pequeños
redondos con un diámetro que variaba entre 25-30
nm.
PCR-RT y determinación de
Secuencia: para obtener información de secuencia del genoma del
agente, se aisló el ARN total de virus purificados usando el kit
Rneasy (Qiagen). Para una PCR-RT se emplearon dos
cebadores derivados de una región conservada situada en ORF1 de
virus pequeños de estructura redonda (SRSV)
(Wyn-Jones et al., J. Virol. Methods
87, 99-107, 2000). El producto de PCR
obtenido tenía aproximadamente 400 pares de bases (pb) de tamaño y
la secuencia de nucleótidos determinada en ambas direcciones (~320
pb) se comparó con secuencias descritas en la base de datos de
GeneBank usando una herramienta de búsqueda de alineamiento local
básica (BLAST). Se identificó que las supuestas secuencias de
aminoácidos derivadas del producto de PCR tenían similitudes
moderadas con las poliproteínas no estructurales de astrovirus de
pavo 1 y 2 (identidades del 62%), virus de la nefritis aviar
(identidades del 55%) y astrovirus de oveja (identidades del 33%).
Esta información genética indica que el agente es un astrovirus de
pollo perteneciente a la familia Astroviridae.
Como se ha demostrado en los ejemplos, el
CastV-2 de acuerdo con la invención muestra una
composición inmunogénica que no se ha observado anteriormente. Por
lo tanto, el nuevo CastV-2 puede formar la base de
un nuevo tipo de vacuna de astrovirus aviar que puede proteger de
forma eficaz las aves de corral contra las condiciones de
enfermedad que se dan como resultado de la infección por el nuevo
CastV-2. Por lo tanto, otro aspecto esta invención
es una vacuna para el uso en la protección de aves de corral contra
enfermedad provocada por la infección por astrovirus aviar,
caracterizada porque la vacuna comprende un CastV-2
como se ha definido anteriormente, junto con un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
El CastV-2 de acuerdo con la
invención se puede incorporar en la vacuna como un virus vivo
atenuado o inactivado.
Una vacuna de acuerdo con la invención se puede
preparar por métodos convencionales tales como, por ejemplo, los
usados comúnmente para la preparación de vacunas disponibles en el
mercado vivas e inactivadas derivadas de virus patógenos para aves
de corral, tales como el virus de la bronquitis infecciosa, el virus
de la enfermedad de Marek y el virus de la bursitis infecciosa
(Veterinary Vaccinology, eds: Pastoret et al., Elsevier,
Amsterdam,
1997).
1997).
Brevemente, a un sustrato susceptible se inocula
un CastV-2 de acuerdo con la invención y se propaga
hasta que el virus se replica hasta un título infeccioso deseado
después de lo cual se recoge material que contiene
CastV-2, opcionalmente se inactiva y se mezcla con
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Se puede usar cualquier sustrato que sea capaz
de tolerar la replicación de CastV-2 para preparar
una vacuna de acuerdo con la presente invención, incluyendo
cultivos celulares (aviares) primarios, tales como células
fibroblásticas embrionarias de pollo (CEF) o células hepáticas
embrionarias de pollo (CEL). Habitualmente, las células se incuban
a 39ºC y se pueden infectar después de 24-48 horas,
momento en el cual se retira el medio de los cultivos y el virus se
inocula sobre el cultivo y se permite absorber durante
20-40 minutos. Se usa medio nuevo para
re-alimentar el cultivo, que después se incuba
durante otras 24-96 horas. En este momento, los
fluidos del cultivo celular infectado y las células infectadas se
pueden recoger de forma separada o juntos. Para liberar los virus
asociados a células, las células infectadas se someten a sonicación
durante 3 x 5 segundos. Si se desea, se pueden retirar los restos
celulares por filtración o centrifugación.
Por lo tanto, en una realización adicional, la
presente invención proporciona un cultivo celular infectado con un
CastV-2 como se ha definido anteriormente.
El nuevo CastV-2 también se
puede preparar en huevos de pollo embrionados.
La atenuación del CastV-2 se
puede obtener por pases seriados convencionales del virus en
cultivos celulares, por ejemplo, en cultivos celulares primarios
(por ejemplo, cultivos celulares de CEL) o líneas celulares
establecidas que toleren la replicación del virus. En este caso se
pueden usar niveles de pases entre 5-150,
preferiblemente entre 20-50. Obviamente, también se
pueden usar cepas atenuadas de origen natural del nuevo
CastV-2 para la preparación de una vacuna viva.
La vacuna de acuerdo con la invención que
contiene el virus vivo se puede preparar y comercializar en la forma
de una suspensión o en una forma liofilizada y contiene
adicionalmente un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable
usado habitualmente para tales composiciones. Los vehículos incluyen
estabilizadores, conservantes y tampones. Son estabilizadores
adecuados, por ejemplo, SPGA, carbohidratos (tales como sorbitol,
manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa),
proteínas (tales como suero de leche en polvo, albúmina o caseína)
o productos de degradación de los mismos. Son tampones adecuados,
por ejemplo, fosfatos de metales alcalinos. Son conservantes
adecuados timerosal, mertiolato y gentamicina. Los diluyentes
incluyen agua, tampón acuoso (tal como solución salina tamponada),
alcoholes y polioles (tal como glicerol).
Si se desea, las vacunas vivas de acuerdo con la
invención pueden contener un adyuvante. Los ejemplos de compuestos
y composiciones adecuados con actividad de adyuvante son los mismos
que los que se mencionan a continuación para una vacuna
inactivada.
Aunque es posible la administración por
inyección, por ejemplo, por vía intramuscular, por vía subcutánea o
in ovo de la vacuna viva de acuerdo con la presente
invención, la vacuna se administra preferiblemente por una vía de
aplicación en masa económica usada comúnmente para la vacunación de
aves de corral. Para la vacunación contra CastV-2,
esta vía incluye la vacunación por agua de bebida, por pulverizador
y por aerosol.
Alternativa, la presente invención proporciona
una vacuna que comprende el nuevo CastV-2 en una
forma inactivada (muerta).
El propósito de la inactivación de los virus
recogidos después de la etapa de propagación es eliminar la
reproducción de los virus. En general, esto se puede conseguir por
medios químicos o físicos bien conocidos en la técnica. Son agentes
inactivantes adecuados formaldehído y
\beta-propiolactona.
Una vacuna que contiene el
CastV-2 inactivado puede comprender, por ejemplo,
uno o más de los vehículos o diluyentes farmacéuticamente
aceptables que se han mencionado anteriormente adecuados para este
propósito.
Preferiblemente, una vacuna inactivada de
acuerdo con la invención comprende uno o más compuestos con
actividad de adyuvante. Los compuestos o composiciones adecuados
para este propósito incluyen hidróxido, fosfato u óxido de
aluminio, emulsión aceite en agua o de agua en aceite basada en, por
ejemplo, un aceite mineral tal como Bayol F® o Marcol 52® o un
aceite vegetal tal como acetato de vitamina E y saponinas.
La vacuna de acuerdo con la invención comprende
una dosificación eficaz del CastV-2 como el
componente activo, es decir, una cantidad de material de
CastV-2 inmunizante que inducirá inmunidad en las
aves vacunadas contra una exposición a un virus virulento. En este
documento, la inmunidad se define como la inducción de un nivel de
protección estadísticamente significativamente mayor en una
población de aves después de la vacunación en comparación con un
grupo no vacunado.
Típicamente, la vacuna viva de acuerdo con la
invención se puede administrar a una dosis de 10^{1} - 10^{6}
unidades formadoras de placas (ufp) por animal (dosis de 1 ml),
preferiblemente en una dosis que varía entre 10^{3} - 10^{5}
ufp por animal. Las vacunas inactivadas pueden contener el
equivalente antigénico de 10^{6} - 10^{10} ufp por animal.
Las vacunas inactivadas se administran
habitualmente por vía parenteral, por ejemplo, por vía intramuscular
o por vía subcutánea.
A pesar de que la vacuna de
CastV-2 de acuerdo con la presente invención se
puede usar de forma eficaz en pollos, también se pueden vacunar
otras aves de corral tales como pavos de forma exitosa con la
vacuna. Los pollos incluyen pollos de engorde, pollitos, pollos
reproductores y aves de puesta.
Es posible inducir una respuesta de anticuerpos
vacunando las aves parentales (por ejemplo, a las
12-16 semanas de edad para aves de reproductoras de
pollos de engorde) con o sin vacunación previa con la vacuna de
CastV-2 como aves jóvenes. Los anticuerpos
inducidos por tal régimen de vacunación son elevados y se pasan a la
progenie en la yema para proporcionar protección contra una
exposición temprana a astrovirus de campo. También es posible
vacunar aves jóvenes, en particular con una vacuna viva atenuada, de
forma temprana, preferiblemente, en el día 1 de edad, para inducir
inmunidad activa.
La invención también incluye vacunas combinadas
que comprenden, además del CastV-2 que se ha
descrito anteriormente, uno o más componentes de vacuna de otros
patógenos infecciosos para las aves de corral.
Preferiblemente, la vacuna combinada comprende
adicionalmente una o más cepas de vacuna del virus de la enfermedad
de Marek (MDV), del virus de la bronquitis infecciosa (IBV), del
virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), del virus del síndrome
de la caída de puesta (EDS), del virus de la rinotraqueítis del pavo
(TRTV) o
reovirus.
reovirus.
También se puede usar un CastV-2
de acuerdo con la invención para la preparación de ensayos
diagnósticos. El CastV-2 se puede usar como un
antígeno en inmunoensayos para la detección de anticuerpos contra
CastV-2 en muestras de animales sospechosos de
estar infectados por este virus. Como alternativa, el
CastV-2 se puede usar para generar antisueros para
usar un ensayo diagnóstico, es decir, para la detección del antígeno
de CastV-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron con PBS hisopos traqueales y
cloacales tomados de 10 pollos de engorde (5 días de edad) con
diarrea y el volumen total (0,2 ml) de fluido de cada muestra se
inoculó en cultivos de CEL. Después de 6 días se observó un efecto
citopático inducido por astrovirus en los cultivos inoculados con
una de las muestras de hisopo traqueal. Se aislaron reovirus y
adenovirus de las demás muestras. Este astrovirus se purificó en
placas tres veces, tomándose una única placa de una placa con menos
de 10 placas sobre la misma.
Se tomaron diez muestras de 1 ml de sangre
heparinizada de pollos de engorde de una semana de edad que
mostraron crecimiento desigual. Se separaron los glóbulos blancos
de las muestras después de centrifugación (usando una
centrifugación en mesa) y aproximadamente 0,1 ml de glóbulos blancos
concentrados se inocularon en el medio de cada una de las dos
placas de tejido de cultivo celular de 6 cm de hígado de embrión de
pollo de 48 horas de edad (CEL).
Después de 24 horas de incubación en atmósfera
de CO_{2} al 5% a 37ºC los glóbulos blancos junto con el medio se
vertieron de los cultivos celulares. Los cultivos se lavaron con
solución tamponada con fosfato (PBS) y se rellenó este medio de
mantenimiento.
Después de una incubación adicional de 6 días se
observó un efecto citopático inducido por astrovirus en dos de los
cultivos inoculados con los glóbulos blancos, sin aislarse otros
virus.
El virus se aisló de un grupo de intestinos
delgados (homogeneizados) (ID) de 3 pollitos de tres semanas de
edad con diarrea. Las muestras de ID se filtraron usando un filtro
basto y se diluyeron 100 veces con PBS que contenía 5 x niveles de
cultivo celular normales de penicilina y estreptomicina. Las
muestras se centrifugaron (centrifugadora de mesa) para retirar
restos de partículas y después el sobrenadante se diluyó en etapas
de base 10 hasta 10^{-6} y cada dilución se inoculó en cuatro
placas de CEL. Después de la absorción durante 40 minutos, las
placas se recubrieron con medio que contenía agar al 0,9% y se
rellenaron dos veces con medio de mantenimiento normal.
Cuatro días después se observaron placas de
reovirus típicas y ECP en diluciones hasta 10^{-3}.
Se observó una única placa en una placa con la
dilución de 10^{-4}. Esta placa se recogió y se inoculó en
cultivos nuevos de CEL donde se desarrolló un ECP de astrovirus
típico en 5 días. El virus se recogió en dos ocasiones adicionales
de la placa antes de que se estableciera un grupo de virus.
Los fluidos del cultivo celular sobrenadantes de
cultivos de CEL que mostraban un efecto citopático se retiraron y
congelaron a -70ºC.
Las células de CEL se retiraron de las placas
usando una varilla de goma y después se congelaron a -70ºC.
Cuando se titularon usando un ensayo de
titulación de placa, el sobrenadante y las células contenían virus.
El título en las células era habitualmente 10 veces mayor que el de
los fluidos de sobrenadante.
Se depositó una muestra de la cepa de
CAstV-2 VDU/As2 en la Colección Nacional de Cultivos
de Microorganismos del Instituto Pasteur, Paris, Francia (28, Rue
du Docteur Roux, f-75724 Paris Cedex 15) con el
número de entrada I-2932 el 13 de septiembre de
2002.
Se inocularon a 10 pollos SPF de dos semanas de
edad (White Leghorn) 10^{6} ufp/pollo de CastV-2
vivo por vía oral. Después de 4 semanas adicionales, a cada pollo
se inocularon por vía subcutánea 10^{9} ufp de
CastV-2 mezclado con adyuvante incompleto de Freud
(Vol. 0,5 ml/pollo).
Se recogió sangre 4 semanas después de la última
inoculación y se separó y se almacenó el suero a -20ºC. Los títulos
de neutralización séricos variaron entre 256 y 1024.
Se prepararon sueros contra otros astrovirus
aviares de acuerdo con protocoles similares.
Se usó el ensayo de reducción de placas para un
ensayo de anticuerpo de CastV-2, ANV (excepto por el
experimento de ANV descrito en la Tabla 1b), TastV y
DVH-2. Se diluyeron los antisueros con solución
salina tamponada con fosfato en etapas de base dos. Se mezcló un
volumen igual de cada dilución de antisuero (habitualmente 0,5 ml)
con volumen igual de una preparación de virus diluido para contener
aproximadamente 200 unidades formadoras de placas de 0,1 ml.
Las mezclas de antisuero/virus se incubaron
durante 40 minutos a temperatura ambiente (20-22ºC
antes de que se inoculara 0,1 ml de cada dilución en cada una de
las dos placas de petri de cultivo celular de embriones de pollo
confluentes de 6 cm de 48 horas de edad de los que se había retirado
el medio.
Después de la absorción durante 40 minutos a
38,5ºC, los cultivos se cubrieron con medio de mantenimiento de
eagle que contiene agar Bacto al 1%.
Los cultivos se incubaron a 38,5ºC en una
atmósfera de CO_{2} al 5% durante 5 días, momento en el cual se
añaden 2 ml de solución de Rojo Neutro a cada placa.
Las placas se recontaron 24 horas después y se
observaron usando luz incidente o contra un fondo blanco.
El recuento de placa medio de las placas
inoculadas con cada dilución de virus/antisuero se usó para calcular
el porcentaje de unidades formadoras de placas de virus que habían
sobrevivido la neutralización en comparación con un control de
virus y un suero control negativo.
El título de antisuero se expresa como el
recíproco de la dilución de antisuero más próxima a dar un 75% de
reducción de placas en comparación con el suero control negativo.
Todos los títulos séricos se dan como dilución final después de la
adición de los volúmenes iguales de virus.
El ensayo de neutralización de microtitulación
se usó para el ensayo de anticuerpo de ANV que se describe en la
Tabla 1b. Se mezclaron dos diluciones de base dos de suero con un
volumen igual de virus diluido en MEM para dar 200 dosis infectivas
de cultivo tisular (TCID)/0,1 ml. Después de la incubación a
temperatura ambiente durante 1 h, se colocaron 0,1 ml de cada
dilución en cuatro pocillos de placa de microtitulación de 96
pocillos y se añadieron 0,1 ml de medio de crecimiento y 3 x
10^{4} células a cada pocillo. Se incluyeron un suero de
titulación de virus y negativo en cada ensayo. Las placas se
incubaron durante 5 días a 38,5ºC en una atmósfera de CO_{2} y
después se leyeron por microscopía. El título sérico era la dilución
en la que solamente un 50% de los pocillos mostraron un ECP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se dejaron crecer células susceptibles en placas
de 24 pocillos. Cuando fueron confluentes, se infectaron con el
virus. Los cultivos infectados se fijaron entre 12 y 18 horas
después de la inoculación con alcohol metilado al 100% durante 1
hora y después se vertió. Cuando el alcohol metilado se evaporó, se
colocó un pequeño volumen de antisuero de pollo sobre las células
fijadas (suficiente para cubrir la lámina de células). Esto se
incubó después a 38,5ºC durante 45 minutos. La lámina de células se
lavó después 3-5 veces con PBS. Se colocó después
un volumen pequeño del conjugado con FITC de molécula completa de
IgG de conejo sobre la lámina de células (suficiente para cubrir la
lámina de células) a la dilución requerida. Esto se incubó después a
38,5ºC durante 45 minutos adicionales. Después, la lámina de
células se lavó de nuevo (3-5 veces). Finalmente,
se añadió una mezcla 50:50 de PBS: Glicerol (suficiente para cubrir
la lámina de células). El recipiente se almacena en oscuridad a
+4ºC hasta que se observa con un microscopio de fluorescencia. Las
células infectadas muestran fluorescencia citoplásmica.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes del uso en un ensayo de difusión en gel,
se concentró un grupo de antígenos
congelando-descongelando suspensión celular
infectada y añadiendo un volumen igual de sulfato de amonio
saturado, seguido de precipitación y centrifugación. El antígeno
concentrado se dializó en un recipiente de PBS.
Se colocó antígeno en el pocillo central (gel de
agarosa al 2%) con sueros de ensayo en los pocillos circundantes, y
se incubó durante una noche a 37ºC en un recipiente
humidificado.
Si ha tenido lugar una reacción de anticuerpo
positivo, se puede observar una línea de precipitación entre el
pocillo del antígeno y el pocillo del antisuero.
\newpage
Virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Virus
Virus
Los resultados representados en estas tablas
demuestran por un lado que las cepas de CastV-2
forman un grupo homogéneo de virus inmunológicamente relacionados
y, por el otro lado, que el CastV-2 es
inmunológicamente diferente de los demás astrovirus aviares.
Se inocularon 10^{5,6} unidades formadoras de
placas (UFP) en veinte pollos SPF de un día de un aislado de la
cepa de CastV-2 cepa a. El virus se había recogido
de placas tres veces de una dilución de 10^{-4} del virus y se
había sometido a un total de 6 pases de cultivo en CEL.
Todos los pollos inoculados mostraron diarrea y
pasaron alimento parcialmente digerido en heces. Cuando se
sacrificaron 4 pollos 5 días después de la infección, todos
mostraron algún grado de intestino delgado dilatado.
Los 17 pollos no infectados control no mostraron
tales signos y cuando se sacrificaron 5 después de 5 días, los
intestinos eran normales.
Claims (9)
1. Un astrovirus de pollo de tipo 2
(CAstV-2) caracterizado porque el virus es el
CAstV depositado con el número de entrada I-2932 en
la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del
Instituto Pasteur, Paris, Francia o un CAstV inmunológicamente
relacionado que es capaz de inducir antisuero que neutraliza el
virus depositado.
2. Un cultivo celular infectado con un
CastV-2 de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un cultivo celular de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado porque el cultivo celular es
un cultivo celular de hígado de embrión de pollo (CEL).
4. Una vacuna para usar en la protección de aves
de corral contra enfermedad provocada por infección por astrovirus
aviar, caracterizada porque la vacuna comprende un
CastV-2 de acuerdo con la reivindicación 1, junto
con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
5. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
4, caracterizada porque el CastV-2 está en
una forma viva atenuada.
6. Una vacuna de acuerdo con las
reivindicaciones 4 a 5, caracterizada porque la vacuna
comprende adicionalmente un o más componentes de vacuna de otros
patógenos infecciosos para aves de corral.
7. Una vacuna de acuerdo con las
reivindicaciones 4-6, caracterizada porque la
vacuna comprende un adyuvante.
8. Un método para la preparación del material de
antígeno de CastV-2, caracterizado porque el
CastV-2 de acuerdo con la reivindicación 1 se
propaga en un cultivo celular y se recoge posteriormente del cultivo
celular.
9. Un método para la preparación de una vacuna
de acuerdo con las reivindicaciones 4-7,
caracterizado porque el CastV-2 de acuerdo
con la reivindicación 1 se mezcla con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
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