ES2294346T3 - Rt-pcr en tiempo real novedosa para la deteccion sensible de multiples transcripciones del gen mage. - Google Patents
Rt-pcr en tiempo real novedosa para la deteccion sensible de multiples transcripciones del gen mage. Download PDFInfo
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Abstract
Una RT-PCR en tiempo real altamente sensible capaz de detectar de manera específica la expresión de más de un gen MAGE, en la que la transcripción inversa de las transcripciones de MAGE correspondientes se lleva a cabo de manera simultánea en una reacción de síntesis de ADNc individual.
Description
RT - PCR en tiempo real novedosa para la
detección sensible de múltiples transcripciones del gen MAGE.
La presente invención se refiere a un
procedimiento RT - PCR en tiempo real altamente sensible para
detectar específicamente la expresión de más de un gen MAGE. La
presente invención además se refiere a una composición de
diagnóstico para llevar a cabo tal RT - PCR en tiempo real así como
a los oligonucleótidos adecuados para la reacción de síntesis de
ADNc antes de la amplificación por PCR en tiempo real de más de un
marcador a partir de la familia del gen MAGE.
La familia del gen MAGE se describió
originalmente en pacientes de melanoma cuando los linfocitos
citolíticos específicos para el producto génico
MAGE-A1 se identificaron (van der Bruggen,
Traversari et al. 1991). Este gen se encontró posteriormente
que pertenece a un grupo de 12 genes MAGE-A humanos
localizados en la región q28 del cromosoma X y más recientemente se
describieron otros miembros de la familia caracterizada como
subfamilias MAGE-B, -C y -D (Chomez, De Backer
et al. 2001). La función biológica de los productos génicos
MAGE gene no está completamente entendida, pero se asume que los
genes juegan un papal importante en la regeneración y
diferenciación de tejidos (Old 2001).
Los miembros seleccionados de la familia de
genes MAGE (Tabla 1) se expresan frecuentemente en muchos tumores
casi independientemente del origen histológico pero son
completamente silenciosos en el tejido adulto normal con la única
excepción de células germinales testiculares (De Plaen, Arden et
al. 1994). Se han identificado varios productos génicos MAGE
como dianas prometedoras para la inmunoterapia de tumores y ya se
han usado en ensayos de vacunación. Los productos génicos MAGE-
A1, -A2, -A3, -A4, -A6, -A10 y -A12 se encuentra frecuentemente que
inducen una respuesta de células T citolíticas en pacientes con
tumores y por lo tanto son los candidatos más prometedores para
servir como indicadores específicos para el cáncer.
Recientemente, la expresión restringida de
manera excepcional de los genes MAGE-A se explotó
para desarrollar una RT - PCR jerarquizada de marcadores múltiples
sensibles y específicos de tumores basada en la amplificación
convencional independiente de MAGE- A1, -2, -3/6, -4 y -12,
respectivamente (documento WO 98/46788). Este planteamiento se
aplicó de manera sucesiva para la detección sensible de células
tumorales diseminados raros en sangre y médula ósea de diversos
pacientes con tumores con muchos tipos diferentes de cáncer (Kufer
2002). Otros han establecido procedimientos de
MAGE-PCR convencionales sensibles mediante el uso de
oligonucleótidos de consenso que coamplifican el ADNc de varios
genes diferentes de MAGE (Park, Kwon et al. 2002). Tal
pan-MAGE-PCR también puede detectar
células tumorales diseminadas raras con alta sensibilidad. Sin
embargo, no proporcionan información sobre el patrón de expresión
de genes MAGE en pacientes con cánceres individuales con una MAGE
PCR que amplifica de manera específica varios miembros diferentes
individuales de la familia
MAGE.
MAGE.
Durante la pasada década la tecnología PCR
progresó de manera sustancial mediante el desarrollo de
termocicladores rápidos y la introducción de control de
fluorescencia de productos amplificados después de cada ciclo, que
permite la cuantificación de la expresión génica con ensayos
"PCR en tiempo real de ciclo rápido" (por ejemplo,
LightCycler® System, ABI PRISM® Sequence Detection System). La
cuantificación sensible de la expresión génica por lo tanto depende
de la detección del incremento de fluorescencia durante la fase
exponencial de la PCR proporcional a la cantidad de ácidos
nucleicos en la muestra al comienzo de la reacción. La
cuantificación se basa en el ciclo umbral (valor C_{1}), el
primer ciclo con fluorescencia detectable, y se puede realizar de
una manera absoluta con patrones externos o de una manera relativa
con un gen de referencia de normalización comparativa que sirve
como calibrador interno. La determinación de un gen de referencia no
inducible es un tema crítico en la PCR en tiempo real, ya que
incluso variaciones marginales en la expresión génica variará
inevitablemente el perfil gliceraldehído-3- fosfato
deshidrogenasa (GAPDH), porfobilinógeno desaminasa (PBGD), beta2-
microglobina o beta-actina se usan frecuentemente
como calibradores internos en la PCR en tiempo real. En comparación
con la PCR de punto final convencional los ensayos en tiempo real
muestran incluso una mayor sensibilidad y precisión así como un
tiempo de vuelta más corto para el análisis rápido de los
resultados. En general la fluorescencia se puede detectar de manera
específica de secuencia mediante el uso de sondas de hibridación
o sondas TaqMan® o no específico de secuencia mediante el uso del
tinte SYBR Green I.
De manera reciente, los marcadores de MAGE se
han amplificado mediante el uso de de la técnica PCR en tiempo
real: Scanlan y colaboradores (Scanlan, Gordon et al. 2002)
expresión del gen MAGE-A3 en tejidos tumorales
mediante el diseño de una TaqMan específica de gen para medir la
cantidad de ARNm que usa un sistema de detección de secuencia ABI
7700. El grupo de Yoshioka (Yoshioka, Fujiwara et al. 2002)
desarrolló una PCR en tiempo real incluyendo de nuevo la
amplificación de ARNm de MAGE-A3 para seleccionar
células tumorales en los ganglios linfáticos reseccionados de
pacientes con cáncer. Sin embargo, hasta hoy, no existe una PCR en
tiempo real para utilizar la expresión en tiempo real de múltiples
marcadores de MAGE para la cuantificación de enfermedad tumoral
residual mínima en pacientes con cáncer que han experimentado
tratamiento exitoso de tumor primario pero están en riesgo de
desarrollar metástasis distante que crecen a partir de la siembra de
células tumorales diseminadas de manera temprana, cuya carga de
tumor se puede determinar de manera ventajosa mediante el
procedimiento de la presente invención, se necesita de manera
urgente una terapia de tumor adyuvante para prevenir la semilla de
metástasis de
crecimiento.
crecimiento.
La investigación de solamente marcadores
individuales se une para dar como resultado una pérdida notable de
sensibilidad, debido a la heterogeneidad de expresión de tumores
malignos en general y de las células tumorales diseminadas
individualmente en particular. Por estas razones un procedimiento de
RT - PCR en tiempo real de múltiples marcadores para la detección
altamente sensible de marcadores relevantes de tumores múltiples
seleccionados entre la familia de MAGE-A1, -A2,
-A3, -A4, -A6, -A10 y -A12, era altamente preferible.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención se refiere a una RT - PCR en tiempo real para la detección
específica y fiable de ARNm transcrito por células tumorales raras
a partir de más de un gen MAGE. Por otra parte, los cebadores de
la PCR descritos en la técnica anterior (Kufer 2002; Park, Kwon
et al. 2002) para los procedimientos de amplificación de
pan- o de marcadores múltiples MAGE o también se pueden aplicar
para las RT - PCR en tiempo real. Sin embargo, por otra parte, los
procedimientos para la transcripción inversa de ARNm se usan de
manera exitosa para pan- de múltiples marcadores MAGE RT - PCR no
esperados de la técnica anterior que se hacen insuficientes para
las RT - PCR en tiempo real altamente sensibles.
Ya que las RT-PCR diseñadas
para suprimir las células tumorales raras, que dependen de la
amplificación de un único gen marcador individual, son
particularmente susceptibles de pérdida de expresión o de
regulación hacia abajo conectada con la inestabilidad genómica y
heterogeneidad fenotípica de células tumorales, se requirió de
manera absoluta la detección fiable de al menos dos transcripciones
del gen MAGE diferentes por la RT-PCR en tiempo
real de la presente invención. Por lo tanto, es esencial estar
seguro de que cada miembro individual de la familia MAGE
seleccionado como un marcador para la RT - PCR en tiempo real se
convierte de manera fiable a partir de ARNm en ADNc mediante
transcripción inversa con la eficiencia reproductible. Solamente
bajo este prerrequisito el ARNm de MAGE comparadas entre sí se
pueden determinar o la cuantificación de las diferentes
transcripciones de MAGE llevadas a cabo en comparación con un
molde calibrador interno similar al ARNm de PBGD.
Como una solución de este problema técnico se ha
encontrado en la presente invención, que la transcripción inversa
de las Transcripciones de MAGE y opcionalmente del ARNm calibrador
se puede llevar a cabo de manera simultánea en una reacción de
síntesis de ADNc, usando cebadores de oligonucleótidos
seleccionados de manera alta y condiciones de reacción sofisticadas
para la transcripción inversa, que no se podría anticipar de la
técnica anterior.
De acuerdo con lo anterior la presente invención
se refiere a una RT - PCR en tiempo real altamente sensible capaz
de detector de manera específica la expresión de más de un gen MAGE,
en la que la transcripción inversa de las transcripciones de MAGE
se lleva a cabo de manera simultánea en una sola reacción de
síntesis de ADNc. La realización de la transcripción inversa
eficaz y fiable de transcripciones diferentes en una sola reacción
de la síntesis de ADNc no era tarea trivial, debido a que los
procedimientos para la transcripción inversa (RT) de dos o más
diferentes transcripciones de MAGE, que de acuerdo con la técnica
anterior conducen a la conversión fiable de cada una de las
especies individuales del ARNm de MAGE en un ADNc suficiente
detectable por las PCR convencionales altamente sensibles,
sorprendentemente fallaron para hacerlo de esta manera en
combinación con una MAGE - PCR en tiempo real altamente sensible.
Ni la transcripción inversa no específica que usa cebado de ADNc
con oligo-dT o cebado de ADNc no específico de
hexanucleótidos al azar con una combinación establecida de
oligonucleótidos mono- y dual específicos que se hibridan a las
diferentes transcripciones de MAGE, respectivamente, probó que era
suficiente para obtener productos de amplificación específicos al
nivel de alta sensibilidad deseado para cada miembro de la familia
de MAGE seleccionada como marcador para la PCR en tiempo real
posterior (Ejemplo 2). Incluso el uso de un "cebador de
pan-MAGE" para la síntesis de ADNc como se
enseña por la técnica anterior más cercana (documento WO 98/46788)
que describe una RT-PCR de MAGE de marcadores
múltiples convencional altamente sensible no no tuvo éxito en
condiciones convencionales en la transcripción inversa suficiente
de ARNm a partir de cada gen de MAGE individual usado como marcador
en la RT-PCR de MAGE de marcadores múltiples en
tiempo real correspondiente. De este modo, si se requiere, de
acuerdo con la presente invención, para identificar mediante ensayo
cuidadoso en muchas condiciones d reacción diferentes uno o más
cebadores para la transcripción inversa
(=RT-cebador), cada uno hibridándose al ARNm de
uno o más miembros diferentes de la familia de genes de MAGE. Es
esencial que el ensayo de cebadores de RT para la
RT-PCR de MAGE en tiempo real altamente sensible se
lleve a cabo en la presencia de del cóctel entero de cebadores de
RT durante la síntesis de ADNc. Esto se requiere se requiere debido
a las frecuencias interferencias entre los diferentes cebadores de
RT, que ni son predecibles a partir de las reacciones de síntesis
de ADNc con solamente un cebador de RT ni a partir de de las
enseñanzas de la técnica anterior.
Una PCR de MAGE en tiempo real, es decir, la
amplificación de PCR de ADNc de MAGE transcrito de manera inversa,
de acuerdo con la presente invención, se puede implementar o bien
mediante el uso de un tiente de AND no específico de secuencia como
Verde SYBR Green I o mediante la aplicación de sondas
fluorescentes definidos de secuencia para la detección de
amplicones específicos. Para llevar a cabo el ultimo procedimiento,
las secuencias de las moléculas de ARNm MAGE se tienen que
seleccionar para las regiones definidoras de marcador si la
detección de los parámetros de MAGE individuales se desea o áreas
específicas de pan-MAGE si la detección de varios
marcadores MAGE se desea en una sola reacción. Esta única región de
hibridación sobre la secuencia se debe localizar entre dos
oligonucleótidos usados como cebadores para la PCR y no debe ser ni
autocomplementario, monótono o repetitivo ni complementario a los
cebadores de PCR. La aplicación de las sondas TapMan requiere el
diseño de un a sola sonda fluorescente doblemente marcada, para la
aplicación de sondas de hibridación el diseño de dos
oligonucleótidos fluorescentes se necesita que se hibride en
proximidad cercana (1 a 5 bases) entre sí sobre el amplicon que
permita que la transferencia dependiente de la distancia de energía
entre los fluoróforos (transferencia de energía de resonancia de
fluorescencia). Las condiciones de reacción se tienen que evaluar
cuidadosamente y optimizar, lo que implica la adaptación de
concentraciones de cebador y sonda, temperaturas y duración de
ciclado de PCR, etc.
En una realización preferida del procedimiento
de la invención los genes MAGE que sirven como marcadores en una
RT - PCR hipersensible en tiempo real se seleccionan entre los genes
funcionales de MAGE A, B y/o C (Tabla 1). Excepto de los
pseudogenes, la expresión de los miembros de estas subfamilias de
MAGE- se restringe en gran medida a células tumorales, mientras que
son completamente silenciosas en tejido normal adulto con la sola
excepción de células germinales testiculares. De este modo la
expresión de los genes funcionales MAGE A, B y/o C se detectan por
la RT - PCR en tiempo real altamente sensible de la invención en
sangre, médula ósea, ganglios linfáticos u otros órganos
secundarios de un paciente con tumor es altamente indicativo de la
dispersión sistémica de células cancerosas a partir del tumor
primario. Debido a su naturaleza cuantitativa, la RT - PCR en
tiempo real altamente sensible de la invención es particularmente
útil para medir la carga de células de tumores diseminadas para
medir la carga de células tumorales diseminadas en pacientes
individuales, de este modo estimando el riesgo de un relapso
metastático que se origina a partir de la dispersión de células
tumorales tempranas que tiene lugar antes del tratamiento exitoso
del tumor primario. De este modo, el procedimiento de la invención
puede ayudar a decidir de manera más precisa el requerimiento de
una terapia de tumor adyuvante que es posible con procedimientos de
diagnóstico de la técnica anterior.
Además de sangre y médula ósea muchas clases de
fluidos corporales o tejidos, como orina, deposición o esputo, son
fácilmente accesibles para investigar las células malignas. La RT -
PCR de MAGE en tiempo real de la presente invención es por lo tanto
también aplicable como herramienta de selección altamente sensible
en la prevención de tumores secundarios y puede lograr la detección
temprana de neoplasia particularmente en individuos que están en
alto riesgo de desarrollar cáncer.
En una realización particularmente preferida del
procedimiento de la presente invención los genes MAGE que sirven
como marcadores en una RT - PCR en tiempo real altamente sensible
comprende MAGE-A 1, 2, 3, 4, 6, 10 y/ó 12. Estos
genes se expresan de manera lo más frecuentemente en muchos tipos
diferentes de diversos orígenes histológicos. Además, todos los
miembros de este grupo seleccionado de los genes MAGE codifican
antígenos diana para las células T citolíticas. De este modo, la
RT - PCR en tiempo real altamente sensible de la invención
proporcionará de manera ventajosa perfiles cuantitativos de
expresión de genes MAGE de pacientes con cáncer individual como
base para el diseño racional de vacunas de tumores basadas en MAGE.
Hasta ahora, solamente patrones cuantitativos de la expresión de
genes MAGE se podría obtener usando procedimientos de la técnica
anterior haciendo la elección de los productos génicos MAGE a
incluirán una vacuna tumoral más difícil.
En otra realización preferida del procedimiento
al menos un cebador para la transcripción inversa ARNm de MAGE se
selecciona entre los siguientes grupos de oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
(A)
\newpage
(B)
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores para la transcripción inversa
como se muestra en el grupo A, coinciden perfectamente con cada una
de las secuencias de ARNm de MAGE- A 1, 2, 3, 4, 6, 10 y 12. Sin
embargo, lo más sorprendentemente, a pesar de la coincidencia
perfecta, ninguno de estos cebadores de RT solos conduce a la
detección sensible de la expresión MAGE - A 1 por la
RT-PCR en tiempo real en condiciones convencionales
como se proporciona por ejemplo por el fabricante del Sistema
LightCycler. En estas condiciones recomendadas la debilidad en la
detección de MAGE - A - 1 puede solamente estar compensada, como se
encuentra sorprendentemente en la presente invención, combinando
dos cebadores del grupo A entre sí (por ejemplo, MgRT3a +
MgRT5a) o un cebador del grupo A con uno de los cebadores del
grupo B, que son monoespecíficos para la síntesis de ADNc de MAGE -
A - 1 solamente (Ejemplo 2). Dependiendo de al menos dos miembros
diferentes del grupo MAGE - A que codifica los antígenos diana para
las células T citotóxicas (es decir MAGE-A 1, 2, 3,
4, 6, 10 y 12) se han de detectar por la RT-PCR en
tiempo de real, los cebadores de RT individuales diferentes o las
combinaciones de cebadores de RT del grupo A y/o B puede ser
aplicable. Sin embargo, en cualquier caso individual de acuerdo con
la presente invención, se requiere ensayo cuidadoso del candidato
hasta el final con una elección óptima que permite la expresión de
los genes MAGE detectados por la RT-PCR en tiempo
real con un alto nivel de selectividad. Como se ha indicado
anteriormente para la RT - PCR MAGE en tiempo real altamente
sensible se ha de llevar a cabo en presencia del cóctel entero de
los cebadores de RT durante la síntesis de ADNc, con el fin de
hacer frente a las interferencias no predecibles entre los
diferentes cebadores de RT.
De acuerdo con la enseñanza de la técnica
anterior (documento WO 98/46788) el experto medio puede sin agobio
excesivo identificar la identidad de los cebadores específicos para
la síntesis de ADNc que se hibridan de manera eficaz al ARNm de
MAGE- 1, -2, -3/6, -4 y -12. Sin embargo, las series enteras de los
"cebadores pan-MAGE" como se muestra en el
grupo A no daba como resultado la síntesis de ADNc, que permitiría
la detección altamente sensible de cada ARNm de marcador
individual mediante la PCR en tiempo real como se lleva a cabo de
acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante del Sistema
LightCycler System (Roche). En cada caso ensayado la detección
altamente sensible mediante la PCR en tiempo real de al menos una
especie de ARNm a partir del grupo constituido por MAGE- 1, -2,
-3/6, -4 y -12 fallaba a pesar de de la perfecta hibridación de cada
cebador del ADNc de pan-MAGE a cada una de las
transcripciones correspondientes (ejemplo 2). Esto se diferencia
claramente de la enseñanza del documento de la técnica anterior
mencionado anteriormente con relación a una RT-PCR
de MAGE de marcadores múltiples convencional.
En una realización particularmente preferida
adicional del procedimiento de la presente invención, además de la
transcripción inversa de las Transcripciones de MAGE, la
transcripción inversa de ARNm calibrador se lleva a cabo
simultáneamente en la misma reacción de síntesis de ADNc seguido de
la amplificación por PCR de MAGE- y los ADNc calibradores. Para
preparar los resultados cuantitativos mediante análisis de
diferentes muestras de sangre, médula ósea, u otros tejidos de uno
o más pacientes de cáncer usando la RT- PCR de MAGE en tiempo real
comparable entre sí, un gen de referencia normalizador, de acuerdo
con la presente invención, se incluye preferiblemente en el
ensayo. Con el fin de ser capaz de servir como calibrador interno el
marcador de referencia normalizador lo más preferiblemente es
esencialmente un gen no inducible. Además se prefiere que el nivel
de expresión del gen de referencia sea comparable con el (los) gen
(genes) diana y constante en esencialmente las células de la
muestra. Además, de acuerdo con la presente invención, es crítico
que un cebador de ADNc específico para la transcripción inversa
(RT) del ARNm calibrador se use se use como miembro integral del
cóctel de cebadores de RT que comprende los cebadores de ADNc
específicos de MAGE para garantizar las condiciones de ensayo
iguales para ambas Transcripciones de MAGE a analizar y el marcador
de referencia.
En otra realización preferida del procedimiento
de la presente invención el gen de referencia normalizador que
sirve como calibrador interno es la porfobilinógeno desaminasa
(PBGD), gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH),
beta-2-microglobina o
beta-actina.
En una realización preferida adicional del
procedimiento de la presente invención el cebador para la
transcripción inversa del ARNm de PBGD se selecciona entre el
grupo de oligonucleótidos:
(B1)
\vskip1.000000\baselineskip
Si embargo, para cada RT-PCR de
MAGE en tiempo real, de acuerdo con la presente invención, el ensayo
cuidoso de los cebadores de R-T candidatos
específicos para PBGD del ARNm de otro gen de referencia junto con
el (los) cebador(es) de RT de MAGE se requiere hasta el
final con una elección óptima que permita la expresión de los genes
de MAGE seleccionados a medir por la RT - PCR en tiempo real en
comparación con las señales de expresión fiables a partir del gen
de referencia a un alto nivel de sensibilidad. También en este caso,
el ensayo de cebadores de RT para RT-PCR de MAGE en
tiempo real altamente sensible que incluye el cebador de RT para la
transcripción inversa del ARNm calibrador interno se ha de llevar a
cabo en la presencia de del cóctel entero de los cebadores de RT
durante la síntesis de ADNc, con el fin de hacer frente las
interferencias no predecibles entre los diferentes cebadores de
RT.
En otra realización del procedimiento de la
presente invención los cebadores de la PCR para la de ADNc de PBCG
comprenden los oligonucleótidos seleccionados entre los siguientes
grupos:
En una realización incluso más preferida del
procedimiento de la presente invención los oligonucleótidos hu__
PBGD__ se y PBGD__ 3.1_R o hu__ PBGD__ se y PBGD__ R se usan como
pares de cebadores para la amplificación por PCR de _ADNc de
PBGD.
Realmente, para introducir PBGD como calibrador
interno para la cuantificación de las transcripciones de MAGE por
RT - PCR en tiempo real altamente sensible de acuerdo con la
presente invención 24 diferentes cebadores de ADNc específicos de
PBGD se diseñaron y se ensayaron en la presencia de los cebadores de
ADNc específicos de PBGD para la transcripción inversa eficaz del
ARNm de PBGD en una RT-PCR en tiempo real específica
de PBGD. Aquellos cebadores de ADNc específicos de PBGD, que
proporcionan buenos resultados en la amplificación de PBGD
posterior por la PCR en tiempo real se ensayaron después en
combinación con los cebadores de ADNc específicos de MAGE en una
RT-PCR en de MAGE de marcador múltiple cuantitativa.
Sin embargo, se encontró que ninguna combinación de los tres
cebadores de ADNc que consistía cada uno en un pan- -MAGE- y un
cebador de ADNc específico de MAGE - A1 más un cebador de ADNc
específico de PBGD conducían a la amplificación altamente sensible
de cada marcador individual a partir del grupo constituido por las
transcripciones de MAGE-A1, -2, -3/6, - 4, -10 y
-12 por la RT-PCR en tiempo (ejemplo 3). Con el fin
de solucionar este problema dio buen resultado, que la reducción de
los cebadores de ADNc de una triple a una doble combinación era
inevitable. Para este propósito los inventores tuvieron que
inventar un protocolo de RT usando condiciones muy sofisticadas no
convencionales que comprenden concentraciones de cebador inusual y
el uso de una polimerasa altamente seleccionada para preparar un
cebador de ADNc de pan-MAGE que trabaja junto con un
cebador de ADNc de PBGD, sin perder la amplificación altamente
sensible de solamente un único marcador en la PCR en tiempo real
posterior (ejemplo 3). Eventualmente esto conduce a un protocolo
final para una RT - PCR en tiempo real de MAGE altamente sensible
cuantitativa de marcador múltiple que por ningún medio se podría
anticipar de la técnica anterior (ejemplo 5).
De acuerdo con lo anterior, una realización
preferida de la presente invención se refiere al uso de de no más
de dos oligonucleótidos (incluyendo el cebador de RT de un
calibrador interno) como cebador para la transcripción inversa en
la reacción de síntesis de ADNc de la RT - PCR de MAGE en tiempo
real de la presente invención.
En una realización más preferida del
procedimiento de la presente invención los oligonucleótidos
MgRT3a y/o Mg1_RT5a se usan como cebadores para la
transcripción inversa en la reacción de síntesis de ADNc.
En una realización adicional más preferida del
procedimiento de la presente invención los oligonucleótidos
MgRT3a y PBGD__ RT15b se usan como cebadores para la
transcripción inversa en la reacción de síntesis de ADNc.
En otra realización del procedimiento de la
presente invención la PCR de MAGE y/o del calibrador son PCR son
jerarquizadas o semi-jerarquizadas. Con el fin de
lograr la alta sensibilidad deseada para la detección de ARNm
transcrito por células tumorales raras a partir de más de un gen
MAGE, RT - PCR en tiempo real se puede ensayar como PCR
jerarquizada o semi- jerarquizada. Para este propósito una primera
ronda de amplificación de ADNc se puede llevar a cabo con un par
apropiado de cebadores de PCR o bien mediante PCR convencional o
en tiempo real. Lo más preferiblemente, esta primera ronda de PCR no
debe proceder en la fase de meseta de amplificación. De otra
manera, la cuantificación del contenido del molde en la muestra a
analizar mediante el procedimiento se la presente invención puede
llegar a a ser muy difícil o incluso imposible. Además, puede ser
preferible parar tal primera ronda de PCR en la fase lineal inicial
o media de la amplificación en lugar de proceder a la fase lineal
tardía, con el fin de evitar interferencias de un exceso de
productos de PCR preamplificados con la ronda posterior de PCR en
tiempo real. De acuerdo con lo anterior, el número de ciclos de la
PCR y las condiciones de reacción que son apropiados para tal etapa
de amplificación se tienen que optimizar cuidadosamente,
respectivamente. En particular estos parámetros se deben adaptar a
la distribución de cantidades de molde en la recolección de
muestras a analizar, para estar seguro, por otra parte, que el
nivel de alta sensibilidad del procedimiento de la invención es
suficiente para detectar MAGE en aquellas muestras que muestran una
expresión muy débil y, por otra parte, la cuantificación de MAGE en
otras muestras que muestran una expresión mayor es todavía
factible.
En una realización particularmente preferida del
procedimiento de la presente invención los cebadores de PCR se usan
de manera que comprenden pares de oligonucleótidos amplificando
específicamente solamente un sólo miembro del grupo seleccionado de
genes de MAGE genes, respectivamente. A pesar de la alta homología
entre los diferentes miembros de la familia de genes MAGE gene
family, haciendo el diseño de tales oligonucleótidos
monoespecíficos más difícil. Una RT-PCR de MAGE en
tiempo real altamente sensible para detector la expresión
individual de más de un gen MAGE es altamente preferible. De este
modo, solamente se puede obtener un perfil de expresión
cuantitativo de genes individuales MAGE de células tumorales
diseminadas raras en pacientes con cáncer individual, que puede ser
esencial para la selección de aquellos miembros de la familia MAGE a
incluir en una vacuna de tumor óptima. Además, el impacto
pronóstico de los niveles de expresión de miembros individuales de
la familia de genes MAGE puede variar con los diferentes tipos de
cáncer, que se pueden analizar con la RT - PCR en tiempo real de la
presente invención solamente cuando pares de cebadores de PCR
monoespecíficos para el ADNc de genes MAGE genes individuales se
usan de manera que no se amplifiquen de manera cruzada otros
miembros de la familia MAGE.
En otra realización del procedimiento de la
presente invención se usan los cebadores de PCR que comprenden
pares de oligonucleótidos que amplifican más de un miembro del grupo
seleccionado de genes MAGE, respectivamente (=
pan-MAGE PCR).
Después se puede llevar a cabo la amplificación
de PCR en tiempo real de transcripción inversa del ADNc de MAGE
con cebadores de consenso, como los sugeridos por Park et al.
(Park, Kwon et al. 2002), que hace uso del alto nivel de
homología de secuencia entre las diferentes transcripciones de genes
MAGE. Usando este planteamiento o similares de RT - PCR en tiempo
real pueden conducir a productos de amplificación de MAGE
derivados de las transcripciones de MAGE-A 1, -2,
-3, -4, -6 y/o 12 expresados por tan solo cinco células cancerosas
(por ejemplo de la línea celular de cáncer de colon humana (por
ejemplo, a partir de la línea celular HT-29 de
cáncer de colon humano) en 10 ml de sangre, mientras eran negativas
con sangre de donantes sanos.
Para la detección de producto(s) de
amplificación por PCR en tiempo real el procedimiento de SYBR verde
I independiente de la secuencia se puede aplicar usando el Sistema
LightCycler System; como alternativa, se pueden usar sondas
fluorescentes específicas de la secuencia, por ejemplo, TaqMan o
sondas de hibridación. Además, se pueden analizar muestras de
tejido (por ejemplo, biopsias broncoscópicas) de pacientes de cáncer
con diferentes tipos de tumores (por ejemplo, cáncer de pulmón de
células no pequeñas (NSCL) cáncer) de acuerdo con lo anterior. Para
esta realización del procedimiento de la invención es de particular
ventaja que la forma particular de síntesis de ADNc descrita por
la presente invención asegure que cada miembro individual de la
familia MAGE seleccionado como un marcador para la RT - PCR en
tiempo real altamente sensible se convierta efectivamente de ARNm a
ADNc mediante transcripción inversa con eficacia reproductible,
porque debido a la complicación de ADNc de genes diferentes de
IMAGE cae fuera de marcadores individuales en la fase de de
transcripción inversa puede fácilmente permanecer sin reconocer en
la PCR por ejemplo mediante una señal positiva derivada de
solamente un marcador afectando de esta manera la detección exitosa
de otros marcadores presumiblemente coamplificados que por supuesto
pueden haber fallado en la síntesis de ADNc suficiente aunque se
exprese.
En otra realización particularmente preferida
del procedimiento de la presente invención los cebadores de PCR
para la amplificación del ADNc de MAGE comprenden los
oligonucleótidos seleccionados entre los grupos siguientes:
(C)
\newpage
(D)
Esta realización de la invención es ventajosa
debido a que es capaz de medir la expresión individual de todos los
miembros de la subfamilia MAGE - A que codifica antígenos diana
reconocidos por linfocitos T citotóxicos, que son de este modo
relevantes para la vacunación tumoral. En el caso particular de
MAGE-A3 y 6, que son amplificados por los mismos
pares de cebadores de PCR descritos en el grupo C y D, no existe
pérdida de información relevante para el diseño de vacuna provocado
por la coamplificación, debido a que las proteínas codificadas por
MAGE-A3 y 6 son casi idénticas debido a una
homología de secuencia del 99%.
En incluso una realización más preferida del
procedimiento de la presente invención los cebadores del grupo C se
usan para una primera ronda y/o cebadores del grupo D para una
segunda ronda de la amplificación por PCR.
Esta realización de la invención es ventajosa
para llevar a cabo una RT-PCR de MAGE altamente
sensible jerarquizada o no jerarquizada.
En otra realización del procedimiento de la
presente invención un par individual o doble de cebadores PCR se
usa amplificando todos los miembros del grupo seleccionado de genes
MAGE, respectivamente. Esta realización se refiere a una RT -PCR
en tiempo real altamente sensible que detecta la expresión de más de
un gen MAGE, mediante un único par de cebadores de
pan-MAGE PCR en el caso de una PCR de una única
etapa o un par doble de cebadores pan-MAGE PCR en
el caso de una PCR jerarquizada o semijerarquizada. Debido al alto
nivel de homología de secuencias entre los diferentes genes MAGE,
los sitios de identidad de secuencia entre todos los miembros de un
grupo seleccionado de genes MAGE se puede encontrar mediante
análisis de secuencia basado en ordenador, donde tales cebadores
pan-MAGE PCR se pueden hibridar.
Como con cada par de cebadores de PCR, o bien
monoespecíficos para el ADNc de un gen MAGE individual u
oligoespecífico para los ADNc de alguno o todos los miembros de
cierto grupo de genes MAGE (= cebador pan-MAGE PCR),
las posiciones de cebador se han seleccionado de forma que se evite
la amplificación del ADN de MAGE genómico. Por ejemplo, la
amplificación de secuencias de MAGE genómicas se pueden evitar
mediante el uso de cebadores localizados en diferentes exones o
cebadores que se extienden sobre exones vecinos diferentes,
restringiendo de esta manera la hibridación a ADNc solamente.
Además, las posiciones de los cebadores de PCR se han de elegir para
que caigan dentro del (de los) segmento(s) de la(s)
transcripción(ones) de MAGE que es (son) transcritos de
manera inversa por el (los) cebador(es) de RT usado(s)
para la síntesis de ADNc.
La presente invención además se refiere a una
composición de diagnóstico que comprende uno o más cebadores de
ADNc adecuados para la transcripción inversa simultánea de más de un
diferentes transcripciones de genes y opcionalmente un ARNm
calibrador apropiado en una única reacción de síntesis de ADNc y
además de define en la reivindicación 12. La composición de
diagnóstico de la invención es particularmente útil para llevar a
cabo una diversidad de RT-PCR de MAGe en tiempo real
altamente sensible, permitiendo de esta manera la cuantificación de
la carga de célula tumoral en pacientes de cáncer que sufren de la
dispersión de células tumorales sistémicas, midiendo el contenido
de más de un tipo de ARNm de MAGE en sangre, médula ósea, ganglio
linfático u otras muestras de tejido. Además, el kit de diagnóstico
es particularmente útil para determinar los perfiles de la
expresión de den MAGE cuantitativos de células tumorales diseminadas
raras en pacientes con cáncer individual, permitiendo de esta
manera el diseño racional de una vacuna de tumor absado en MAGE. De
acuerdo con la presente invención es particularmente preferible que
al menos un cebador de ADNc de la composición de diagnóstico sea
MgRT3a, Mg1_RT5a o PBGD__RT15b, como se ha definido anteriormente
Tablas (A), (B), y (B1), respectivamente.
Finalmente la presente invención también se
refiere a un oligonucleótido seleccionado entre el siguiente grupo
de cebadores:
MgRT3a
Mg1_RT5a
PBGD__RT15b, como se ha definido anteriormente
Tablas (A), (B), y (B1), respectivamente.
De acuerdo con la presente invención, se
encontró que estos oligonucleótidos son particularmente útiles para
el cebado de manera simultánea de la transcripción inversa de ARNm
de más de un gen MAGE es una única reacción de síntesis de ADNc.
Además se ha encontrado, de acuerdo con la presente invención, (1)
que esta síntesis de ADNc de "pot individual" es esencial para
asegurar que cada miembro individual de la familia MAGE seleccionado
como un marcador para la RT-PCR en tiempo real
altamente sensible de la invención se convierte de manera fiable de
ARNm a ADNc mediante transcripción inversa con eficacia reproducible
y (2) que solamente en este requisito previo el contenido relativo
en muestras biológicas a analizar de las especies diferentes de ARNm
de MAGE comparado entre sí se puede determinar o cuantificar de las
transcripciones de MAGE diferentes llevadas a cabo en comparación
con un molde calibrador interno como el ARNm de PBGD.
\vskip1.000000\baselineskip
- "RT" o "síntesis de ADNc"
- se usa en la presente invención para la conversión de ARNm en ADN complementario (ADNc) mediante una enzima transcriptasa inversa en una reacción de transcripción inversa.
- "RT - PCR"
- se usa en la presente invención para los procedimientos que aplican una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) después de la conversión de ARNm en ADN complementario (ADNc) mediante una reacción de transcripción inversa (RT).
- "PCR convencional"
- se usa en la presente invención para los procedimientos de PCR no fluorescente que trabajan en todos los tipos de termocicladores tradicionales.
- "PCR jerarquizada"
- se usa en la presente invención para los procedimientos de PCR que comprenden dos etapas de amplificación con diferentes conjuntos de cebadores para la primera y segunda ronda de amplificación.
- "PCR semijerarquizada"
- se usa en la presente invención para procedimientos de PCR que comprenden dos etapas de amplificación con un cebador compartido para la primera y segunda ronda de amplificación.
- "PCR en tiempo real"
- se usa en la presente invención para los procedimientos de PCR basados en fluorescencia en termocicladores fotométricos con la opción de cuantificación de cantidades de molde originales. El procedimiento puede incluir etapas de preamplificación previa adicionales en un termociclador adicional para un número definido de ciclos de PCR.
- "PCR de MAGE de marcadores múltiples"
- {}\hskip0,45cm se usa en la presente invención para los ensayos de PCR que permiten la ampli- {}\hskip0,45cmficación separada de ADNc de genes individuales de MAGE diferentes.
- "pan MAGE PCR"
- se usa en la presente invención para los ensayos de PCR que permiten la amplificación separada de ADNc de diferentes genes MAGE mediante uno o más pares de cebadores de PCR de consenso cada uno de ellos capaz de coamplificar al menos dos transcripciones de genes MAGE.
- "Cebador de RT" o "cebador de síntesis e ADNc"
- {}\hskip0,45cmse usa en la presente invención para oligonucleótidos diseñados para hibridar {}\hskip0,45cmsolamente un ARNm diana definido para producir moléculas de ADNc de estas {}\hskip0,4cmtranscripciones en una reacción de transcripción inversa.
- "cebador de PCR"
- se usa en la presente invención para los oligonucleótidos diseñados para hibridarse solamente a ciertas regiones de ADNc diana para producir amplicones de una longitud específica en una reacción de PCR.
- "alta sensibilidad"
- se usa en la presente invención para la capacidad de un procedimiento de PCR para producir amplificados específicos de MAGE detectables de 5 o menos células tumorales en 2 ml de sangre entera. De manera adicional un punto de cruce por debajo de 30 ciclos de PCR se requiere para los procedimientos en tiempo real que cumplen la definición.
Chomczynski, P. y N. Sacchi
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Para información sobre las condiciones
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\bullet Roche Molecular Biochemicals
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\bullet Meuer, S., Wittwer, C., Nakagawara,
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\bullet Dietmaier, W., Wittwer, C.,
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"Genetics y Oncology". Springer Publishing
\bullet
http:_//www.roche-applied-science.com/_lightcycler-online
\bullet
http:_//www.appliedbiosystems.com/_techsupport
Figura 1: Gráfico de amplificación en tiempo
real (A) y análisis de curva de fusión (B) de las transcripciones
de MAGE-A1 en 2 ml de sangre fortalecida con números
diferentes de células Mz2-Mel como se indica usando
un protocolo de LightCycler-DNA Master SYBR Green I
después de la síntesis de ADNc cebada con oligo-dT.
Las flechas en B indican el máximo de diseminación de producto
durante el intervalo de temperatura indicado. El producto de PCR de
MAGE-A1 PCR específico muestra un máximo de fusión
a aproximadamente 88,8ºC. Los productos inespecíficos, por ejemplo,
dímeros del cebador en este caso, se pueden identificar mediante su
curva de identificación diferente. La electroforesis en gel (C)
confirma la amplificación específica de la transcripción y detección
fiable de 1 célula tumoral en n 2 ml de sangre entera.
Figura 2: Análisis de curva de fusión después de
la finalización de un protocolo convencional Light
Cycler-DNA Master SYBR Green I para MAGE- A2 (A) y
MAGE-A12 (B) después de la síntesis de ADNc con
cebado por oligo- dT. Al menos 10 células tumorales en 2 ml de
sangre se requieren para la regeneración de productos de PCR
específicos, muestras con menor número de células no dan como
resultado señales específicas con este protocolo.
Figura 3: Gráfico de amplificación en tiempo
real (A) y análisis de curva de fusión (B) de ARNm de
MAGE-A4 en 2 ml de sangre fortalecida con
diferentes números de células LB-SAR como se indica.
La primera ronda de la PCR jerarquizada se realizó con 15 ciclos.
Las muestras fortalecidas con 5 y 10 células
LB-SAR produjeron el producto de PCRR de
MAGE-A4 PCR que muestra un máximo de fusión de
aproximadamente 87,6ºC. Los productos inespecíficos obtenidos
cuando la fortaleza de 1 célula o ninguna célula se pueden
distinguir por sus diferentes curvas de fusión diferentes.
Figura 4: Gráfico de amplificación en tiempo
real (A) y análisis de curva de fusión (B) de la misma muestra de
ARN aplicada en la Figura 3 después de 20 ciclos de la primera
PCR. La extensión de preamplificación conduce a un nivel de
sensibilidad mejorada con la detección específica de los productos
de MAGE-A4 PCR cuando la célula tumoral de
LB-SAR se diluye en 2 ml de sangre. Este logro
positivo se asoció con la formación incrementada de dímeros de
cebadores en los controles negativos.
Figura 5:- Gráfico de amplificación en tiempo
real de transcripciones después de la síntesis de ADNc con una
combinación de cebadores de PCR no codificantes para
MAGE-1, -2, -3/6, -4 y -12. La aplicación de 5
oligonucleótidos específicos en la reacción de transcripción
inversa conduce a la formación de varios productos inespecíficos en
la PCR en tiempo real consecutiva, por ejemplo, dímeros de
cebadores, asociados a una deformación de la curva de
amplificación.
Figura 6: Análisis de curva de fusión de los
productos de PCR MAGE-A10 obtenidos por diferentes
combinaciones de cebadores para la preamplificación. Los productos
específicos de MAGE-A10 son detectables solamente
cuando se usa una selección de dos cebadores codificantes con un
único cebador no codificante (Mg10_anse5). Los
planteamientos con el cebador no codificante Mg10_anse4 para la
preamplificación no da como resultado señales específicas, aunque
este oligonucleótido se podía aplicar de manera exitosa como un
cebador no codificante en la PCR en tiempo real.
Los ejemplos ilustran la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera evaluación de la PCR de MAGE en
tiempo real se realizó en experimentos de dilución de células
tumorales. Para este propósito los autores fortalecieron 2 ml de
sangre entera de donantes sanos con números diferentes de células
Mz2-Mel para la amplificación de las transcripciones
MAGE-1, -2, - /6 y -12. Para evitar la degradación
del ARN cada muestra se mezcló inmediatamente con 10 ml de tampón de
extracción de ácido nucleico desnaturalizante [isotiacianato de
guanidina 4 M, 0,5% de sarcosil (sal sódica de
N-laurilsarcosina), 25 mM de citrato sódico
(pH = 7,0), 0,7% 2-mercaptoetanol]. El ARN total se aisló de acuerdo con el procedimiento de Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi 1987) y se midió de manera espectrofotométrica. El ADNc se sintetizó a partir de 1 \mug de ARN total mediante extensión con 1,6 \mug de cebador oligo-dT y 20 U de transcriptasa inversa de mieloblastosis (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) a 25ºC durante 10 min., 42ºC durante 60 min. y 99ºC durante 5 min.
(pH = 7,0), 0,7% 2-mercaptoetanol]. El ARN total se aisló de acuerdo con el procedimiento de Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi 1987) y se midió de manera espectrofotométrica. El ADNc se sintetizó a partir de 1 \mug de ARN total mediante extensión con 1,6 \mug de cebador oligo-dT y 20 U de transcriptasa inversa de mieloblastosis (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) a 25ºC durante 10 min., 42ºC durante 60 min. y 99ºC durante 5 min.
Una primera ronda de PCR para la
preamplificación se realizó se realizó en 50 \mul de reacciones
que contenían 5 \mul de ADNc, 5 \mul de tampón 10 x PCR (200
mM Tris, pH = 8,0, 500 mM KCl), 1,5 \mul de MgCl_{2} (50
\mulM), 4 \mul de cada dNTP (100 \muM) (Invitrogen,
Groningen, Netherlands), 0,2 \muM de cada uno de los cebadores de
MAGE externos, y 1,25 unidades de Platinum Taq ADN- Polimerasa
(Invitrogen) y se llevó a cabo en un Sistema GeneAmp PCR 9700
(Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos) de acuerdo con el
siguiente perfil de ciclo: activación de enzima a 95ºC durante 30
s, hibridación a 60ºC durante 45 s y extensión a 72ºC durante 15
ciclos seguido de la extensión terminal a 72ºC durante 7 min.
La cuantificación de la expresión de los genes
de MAGE se llevó a cabo usando un instrumento LightCycler y
LightCycler FastStart Master SYBR Green I Kit (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Germany). La fluorescencia inherente de
tinte SYBR Green I dye se potencia 200 veces cuando se une al surco
menor de ADN de doble cadena. El incremento en fluorescencia se
mide al final de cada ciclo e indica la cantidad de productos de PCR
generados hasta ahora (F1, canal de fluorescencia 1 para SYBR Green
1). Debido al etiquetado de cualquier producto de PCR no específico
de ADN de doble cadena, por ejemplo, dímeros de cebador,
contribuirán a la señal. Por lo tanto, los productos de PCR
resultantes en el protocolo SYBR Green I se verifican mediante un
análisis de curva de fusión: el tinte solamente se une al ADN de
doble cadena, la señal fluorescente disminuye a medida que se
alcanza el punto de fusión del dúplex de ADN. Después de la
amplificación la mezcla de reacción se somete a un análisis de
curva de fusión en línea incrementando la temperatura gradualmente
(0,1ºC/s).
La PCR en tiempo real se llevó a cabo en 15
\mul de mezcla de reacción que consistía en agua de calidad PCR
con 0,9 \mul de MgCl_{2} (25 mM), 1 \mul de cada cebador MAGE
interno (10 pmol/\mul), 1,5 \mul de FastStart DNA Master SYBR
Green 1 y 4 \mul de producto de la primera reacción de PCR. A la
desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min siguió 45 ciclos de
desnaturalización a 95ºC durante 15 s, hibridación a 60ºC durante
10 s y extensión a 72ºC durante 20 s con un descenso de temperatura
de 20ºC/s realizado en capilares LightCycler. Todas las reacciones
se realizaron por duplicado y cada ensayo incluía un control
negativo sin molde.
Los resultados de la amplificación del producto
génico MAGE-A1 se muestran en la Figura 1: el
perfil de amplificación se muestra en la Figura 1A con
fluorescencia sobre el eje Y y el número de los ciclos de PCR sobre
el eje X. El número de ciclos al que la curva de amplificación
cruza el punto de inicio de las señales de fondo se define como un
punto de cruce y se usa para la cuantificación de la cantidad de ADN
de molde en la muestra. Como se espera se requieren más ciclos de
PCR para amplificar el ADNc diana en una muestra que contiene menos
de ADNc de molde. En este ejemplo 22 ciclos son necesarios antes de
que la fluorescencia se pueda detectar en la muestra de sangre
reforzada con 100 células tumorales, los puntos de cruce para las
muestras contaminadas con 10, 5 y 1 células consecutivamente.
Después de 39 ciclos existe un incremento en fluorescencia para el
espécimen de sangre normal, presumiblemente provocado por
amplificados no específicos de dímeros del cebador.
La Figura 1B muestra los derivados negativos de
las características de la curva de fusión al final de la reacción
de PCR. Los máximos representan los puntos de fusión del producto de
PCR, es decir, la temperatura a la que el 50% del producto de PCR
de ADN se funde. Las curvas de fusión para el producto de PCR
MAGE-A1 PCR muestra un punto de de fusión
característico a 88,8ºC. Los amplificados no específicos en sangre
sana, en estos dímeros de cebadores del ejemplo, muestran una curva
diferente con un máximo a 87,5ºC, que permite la discriminación de
diferentes productos de PCR y verificación de la especificidad. La
electroforesis en gel en la Figura 1 C vuelve a confirmar la
amplificación específica del producto MAGE-A1 para 1
a 100 células tumorales en 2 ml de sangre.
La amplificación de MAGE-A2 y
-A12 no produjo señales específicas cuando se añadieron 10 células
tumorales a 2 ml de sangre. El incremento de fluorescencia con
menor número de células era debido a los productos no específicos
(véanse las Figuras 2A y 2B).
Debido a la carencia de expresión de
MAGE-A4 en células Mz2-Mel los
inventores también fortalecieron 2 ml de sangre entera de donantes
sanos con números diferentes de células LB-SAR que
expresan MAGE-4 de una manera estable. El protocolo
fue el mismo que se ha descrito anteriormente pero se usaron 2
\mul de ADNc para PCR. Los resultados de la amplificación del
producto génico MAGE-4 gene se muestran en la Figura
3. Cualesquiera muestras con menos de y células tumorales por 2 ml
no dieron como resultado la detección específica de la expresión
de MAGE (Figura 3A). Para 5 y 10 células por 2 ml la PCR en tiempo
real produce el producto génico de PCR de MAGE-4
con un punto de fusión de aproximadamente 87,6ºC, las curvas de
fusión para 0 y 1 célula revelan la amplificación de productos no
específicos (Figura 3B).
Para mejorar la sensibilidad del ensayo se
añadieron 5 ciclos al protocolo de la primera PCR. El umbral de
detección disminuyó por lo tanto hasta 1 célula de tumor / 2 ml de
sangre que produce productos de MAGE-A4 específicos
para todas las diluciones de células tumorales (Figura 4A). Sin
embargo, el incremento en ciclos de PCR se acompañó de una
formación de dímeros de cebador que provoca un máximo de fusión para
el control negativo sin un molde (Figura 4B). Una adición adicional
de ciclos de PCR para la amplificación previa era imposible debido
al alcance de la fase de meseta con impracticabilidad de
cuantificación consecutiva de la expresión génica.
Este ejemplo muestra la capacidad de detectar la
expresión de genes individuales de MAGE mediante PCR en tiempo
real, pero más claramente demuestra la dificultad para asegurar la
amplificación de todas las especies d ARNm de MAGE relevantes. La
síntesis de ADNc cebada con Oligo-dT parece preferir
moléculas de ARNm individuales con otros omitidos. Esta propiedad
conduce a la caída completa de varios parámetros con una disminución
notable en la sensibilidad para detectar las transcripciones raras.
La adición de más ciclos en en la primera ronda de PCR no puede
compensar completamente esta pérdida debido la aparición creciente
de productos no específicos. El procedimiento de PCR que usa
cebadores de MAGE de consenso después de la transcripción inversa
con oligo-dT son especialmente susceptibles por
este problema considerable, debido a que el planteamiento
"pan-MAGE" supuesto amplificaría solamente
alguna de las transcripciones de MAGE disponibles. Aunque el
protocolo estándar para la transcripción inversa que usa cebador
oligo-dT es capaz de generar la amplificación
exitosa de las transcripciones de MAGE-A1 no es
aplicable para la síntesis cuando se selecciona para la expresión de
la familia de genes entera.
Con la intención de establecer un procedimiento
para la detección sensible de todos los subtipos de ARNm de MAGE y
de manera simultánea disminuyen el fondo no específico los
inventores modificaron el protocolo de transcripción inversa
mediante el uso de una combinación de los cebadores de PCR no
codificante exterior para MAGE-1, -2, -3/6, -4 y
-12 en solución 2,5 \muM para la síntesis de ADNc. Después de la
amplificación con 20 ciclos en una primera ronda de PCR la PCR en
tiempo real reveló una deformación del gráfico de amplificación
(Figura 5). La purificación del primer producto de PCR conduce a la
reconstitución de la curva de amplificación regular, presumiendo
una sobredosificación de diferentes oligonucleótidos en la síntesis
de ADNc que provoca la interferencia de fluorescencia en la PCR en
tiempo real, aunque este planteamiento se podría mostrar para que
trabaje en la PCR convencional (Kufer 2002). La combinación de
varios cebadores no codificantes para la reacción de RT parece no
ser un planteamiento aplicable para los propósitos de los
inventores.
Esto acentúa la necesidad de un oligonucleótido
compartido específico para la transcripción inversa de todos los
ARNm de MAGE. Los autores seleccionaron las secuencias de
MAGE-A para los segmentos universales mediante una
secuencia basada en ordenador y evaluaron nueve oligonucleótidos
diferentes por su capacidad de actuar como pan-MAGE
sensible para la detección de transcripciones de
MAGE-A en una muestra de sangre de 2 ml contaminada
con 5 células tumorales (células Mz2-Mel para
MAGE-1, -2, -3/6 y -12; células para
LB-SAR MAGE-4) (Tabla 2). Los
inventores usaron standard el kit de síntesis de ADNc de 1º hebra
para RT- PCR (AMV) suministrado por Roche Molecular Biochemicals
(Mannheim, Germany) en 20 \mul con 2 \mul de tampón de reacción
10 x, 5 mM MgCl_{2}, 1 mM de mezcla dNTP, 50 unidades de
inhibidor de la ARNasa, 20 unidades de AMV transcriptasa inversa y
1 \mug de ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante Y se
añadieron cebadores de oligonucleótidos a una concentración de 2,5
\muM. La síntesis se realizó en un sistema GeneAmp PCR 9700
(Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos) durante 10 min a
25ºC, 60 min a 42ºC y 5 min a 99ºC. Solamente un oligonucleótido
se comprobó que era adecuado para la unión fiable de todos los ARNm
de MAGE-A (Tabla 3), los otros candidatos así como
Oligo-dT, hexámeros aleatorios o la combinación de
cebadores de PCR no codificantes provocó el abandono de al menos un
marcador o mostró baja sensibilidad (valores de C_{T}- >30).
Sin embargo, la transcripción de los ARNm de MAGE-A
enteras mediante este único cebador se acompañó de un punto de
cruce anterior para MAGE-A1 que conduce a una
sensibilidad escasa para este marcador relevante.
En un intento de mejorar la sensibilidad para la
detección del marcador importante MAGE-A1 se
evaluaron varios cebadores de transcripción inversa adicionales
específicos para la síntesis del ADNc de MAGE-A1 a
combinar con el cebador de pan-MAGE establecido en
el primer protocolo (Tabla 4). De Nuevo solamente una de las once
combinaciones era capaz de amplificar todas las especies de ARNm de
MAGE, las otras composiciones mostraron el abandono de al menos un
marcador (Tabla 5). Las combinaciones de cebadores que no
transcribían el ARNm de MAGE-A1 se excluyeron del
examen posterior ("no determinado" en la tabla). Mientras que
los inventores incluyeron el marcador MAGE-A10 al
protocolo como se describe en el ejemplo 4, a pesar de todo la
combinación de cebadores de RT MgRT3a y Mg1_RT5a permitió la
transcripción inversa específica de todos los ARNm de
MAGE-A y la posterior amplificación en la PCR en
tiempo real con mucha mayor sensibilidad que
oligo-dT o los hexámeros aleatorios. Este
planteamiento lleva a cabo la síntesis de ADNc de la transcripción
completa de MAGE y por lo tanto es el prerrequisito para los
ensayos de PCR sensible, independientemente de los cebadores usados
o la estrategia de PCR.
En este documento los inventores documentaron la
detección de todos los marcadores de MAGe relevantes expresados en
5 células tumorales fortalecidas en 2 ml de sangre entera. Además la
expresión de MAGE se puede cuantificar usando curvas convencionales
externas o una comparación directa de marcadores individuales.
La cuantificación fiable de la expresión génica
implica la inclusión de un calibrador interno, por ejemplo, un gen
de gobierno no regulado, para excluir las variaciones en el tamaño o
calidad de muestra. Por lo tanto los inventores quieren decir que
cuantifican la expresión de MAGE en comparación relativa con la
expresión de un gen de gobierno, por ejemplo, porfobilinógeno-
desaminasa (PBGD). Para este propósito los inventores evaluaron una
amplia variedad de cebadores de RT de PBGD RT (Tabla 6) para
integrar la transcripción inversa de ARNm de PBGD en el protocolo
de síntesis de ADNc establecido descrito en el ejemplo 2. Los
cebadores que no produjeron amplificación específica de
transcripciones de PBGD se excluyeron de la evaluación posterior.
Los inventores ensayaron 21 oligonucleótidos específicos diferentes
de PBGD en combinación con los cebadores de RT establecidos
anteriores
MgRT3a + Mg1_RT5a, pero solamente una combinación que usa el cebador PBGD__RT10b dio como resultado la generación exitosa de productos de PCR específicos de todos los marcadores de MAGE examinados y PBGD (Tabla 7). Sin embargo, la combinación de tres oligonucleótidos en la síntesis de ADNc estaba unida a una disminución notable en la sensibilidad (puntos de cruce > 30 ciclos para MAGE-2 y -12), pareciendo de esta manera que no era un planteamiento aplicable cuando se usa PCR en tiempo real posteriormente. Por lo tanto los inventores se obligaron para evaluar los protocolos posteriores con menos de tres cebadores de RT.
MgRT3a + Mg1_RT5a, pero solamente una combinación que usa el cebador PBGD__RT10b dio como resultado la generación exitosa de productos de PCR específicos de todos los marcadores de MAGE examinados y PBGD (Tabla 7). Sin embargo, la combinación de tres oligonucleótidos en la síntesis de ADNc estaba unida a una disminución notable en la sensibilidad (puntos de cruce > 30 ciclos para MAGE-2 y -12), pareciendo de esta manera que no era un planteamiento aplicable cuando se usa PCR en tiempo real posteriormente. Por lo tanto los inventores se obligaron para evaluar los protocolos posteriores con menos de tres cebadores de RT.
Para la investigación de más enzimas de
transcriptasa inversa sensibles los inventores ensayaron el único
cebador pan-MAGE MgRT3a en dos kits
adicionales para la síntesis de ADNc en un nuevo experimento con 1
\mug de ARN total a partir de 2 ml de sangre fortalecida con 5
células tumorales (células Mz2-Mel para
MAGE-1, -2, -3/6, -10, -12 y células
LB-SAR para MAGE-4). El kit
ThermoScript RT- PCR suministrado por Invitrogen (Groningen, Países
Bajos) no creaban completamente ningún ADNc de MAGE cuando los
inventores seguían el protocolo estándar de la fabricación (Tabla
8), incluso aunque el kit se diseñó para la transcripción inversa de
moldes difíciles.
De manera adicional los inventores aplicaron un
kit Omniscript RT (Qiagen, Hilden, Alemania) usando el cebado
individual de pan-MAGE MgRT3a en solución
2,5 \muM [con 2 \mul de tampón 10 X RT, dNTPs 0,5 mM cada uno,
10 unidades de inhibidor de la ARNasa (Roche) y 4 unidades de
Omniscript RT (Qiagen) durante 60 min a 37ºC y 5 min. a 93ºC] y
pudo generar ADNc amplificable de todos los ARNm de MAGE relevantes
y ARNm de PBGD. La comparación directa del kit Omniscript RT al kit
AMV anterior usado demostró una sensibilidad significativamente
mayor para la reacción de Omniscript RT sin abandonar los
parámetros individuales cuando se analizan alícuotas idénticas de
la misma preparación de ARN (Tabla 8).
Este nuevo protocolo se ensayó sobre su
compatibilidad con diversos cebadores de RT de PBGD (Tabla 6)
después del aislamiento del ARn total a partir de 2 ml de sangre
fortalecida con 10 células tumorales. La combinación que no generó
una señal de PBGD se excluyó de la evaluación adicional (citado como
"no determinado" en la tabla). Solamente uno de 32
oligonucleótidos (PBGD__RT15b) no interferían la
transcripción inversa de los ARNm de MAGE aunque de manera eficaz
media la conversión de ARNm de PBGD en ADNc (Tabla 9). El segundo
mejor candidato (PBGD__RT13a) ya no generaba los mismos
resultados cuando el umbral de sensibilidad se incrementó hasta 5
células tumorales / 2 ml de sangre. Las diferencias de punto de
cruce (C_{T}) representan los niveles variables de la expresión
de MAGE en las células tumorales con bajas cantidades de
transcripciones de MAGE-A10 y -A12 y alta cantidad
de ARNm de MAGE-A1 y -A4 en los cultivos de células
utilizados como se publica en la bibliografía (Serrano, Lethe
et al. 1999). El nivel de expresión de cada gen particular de
MAGE se puede citar como
C_{T} ^{MAGE}/C_{T} ^{PBGD} y por lo tanto equilibran las variaciones entre muestras individuales. Para la primera vez este protocolo permite el cálculo de las proporciones reales de la expresión génica de MAGE en contraste con la técnica anterior.
C_{T} ^{MAGE}/C_{T} ^{PBGD} y por lo tanto equilibran las variaciones entre muestras individuales. Para la primera vez este protocolo permite el cálculo de las proporciones reales de la expresión génica de MAGE en contraste con la técnica anterior.
En la primera evaluación de los genes MAGE se
asumió que la expresión de MAGE-A10 está solamente
presente a niveles muy bajos y por lo tanto se puede abandonar como
marcador para las condiciones cancerosas. Después de la detección
de linfocítos citolíticos específicos de MAGE-A10
(Huang LQ, Brasseur F et al. 1999) la reevaluación de los
perfiles de expresión en células tumorales se demostraron débiles
pero la transcripción frecuente del gen MAGE-A10
(Serrano, Lethe et al. 1999). Por lo tanto fue el primer
objetivo de los inventores incluir MAGE-A10 como
otro marcador sensible adicional en la RT PCR de MAGE de marcador
múltiple.
Se diseñó una selección de diferentes cebadores
codificantes y no codificantes específicos para el ADNc de
MAGE-A10 ADNc (Tabla 10) y se ensayaron para su
potencial para generar un producto de PCR de
MAGE-A10. Los inventores aislaron ARN total a
partir de 2 ml de sangre entera contaminada con células 100
Mz2-Mel y se realizó la síntesis de ADNc con los
cebadores de MAGE-RT MgRT3a y Mg1RT5a como se
describe en el ejemplo 2. La PCR s se llevó a cabo en reacciones de
50 \mul con tampón de PCR 10 X PCR (Invitrogen), mezcla dNTP 0,2
\muM cada uno (Invitrogen), 1,5 \muM de MgCl_{2}, 1,25
unidades de Platinum Taq ADN Polimerasa (Invitrogen) y 2 \mul de
ADNc durante 40 ciclos (activación de enzima inicial a 95ºC durante
3 min, desnaturalización a 95ºC durante 30 sec, hibridación a 60ºC
durante 45 sec, elongación a 72ºC durante 60 sec y extensión final
a 72ºC durante 7 min). Los productos de PCR se analizaron mediante
electroforesis en un gel de poliacrilamida al 30% y se tiñó con
bromuro de etidio. Varias combinaciones de cebadores produjeron
productos de PCR de MAGEA10 (Tabla 11A). Las combinaciones más
prometedoras se evaluaron adicionalmente para aplicación de la PCR
en tiempo real usando un Kit LightCycler FastStart SYBR Green I
Kit. La reacción se realizó en capilares con un volumen total de
15 \mul, 0,66 \muM de cebador PCR cada uno y concentración de
2,5 mM de MgCl_{2} durante 50 ciclos (activación de enzima
inicial a 95ºC durante 5 min, desnaturalización a 95ºC durante 15
sec, hibridación a 60ºC durante 10 sec y elongación a 72ºC durante
20 sec). Los resultados demostraron 6 combinaciones de cebador
exitosas para la amplificación del ARNm de MAGE-A10
en el sistema LightCycler (Tabla 11 B) que se usaron para
construir una PCR jerarquizada sensible para la detección de células
5 Mz2-Mel en 2 ml de sangre. Se ensayaron cuatro
combinaciones diferentes en una primera ronda de PCR con 20 ciclos
y análisis posterior PCR en tiempo real con el conjunto de
cebadores jerarquizados Mg10_se3 + Mg10_anse2. Todos los
experimentos que contenían Mg10_anse4 como cebador no
codificante en la primera ronda de PCR no produjo la amplificación
específica (Figura 6), por lo tanto los conjuntos de cebadores que
incluían Mg10_se5 como cebador no codificante en la primera
PCR son las únicas posibles composiciones. Los cebadores
codificantes Mg10_se1 o Mg10_se3 se pueden usar de manera exitosa
para la primera y segunda ronda de una PCR jerarquizada o
semijerarquizada.
Después de la optimización cuidadosa de las
condiciones de reacción se ensayaron muestras de sangre y médula
ósea de pacientes con cáncer próstata localizado con la
RT-PCR de MAGE en tiempo real de marcador múltiple.
Se volvió a suspender 1 ml de aspirado de médula ósea y 2 ml de
sangre se estabilizaron y se se prepararon de acuerdo al ejemplo 1.
El RNA total se volvió a suspender en 50 \mul de agua tratada con
DEPC y se utilizaron 10 \mul en la síntesis posterior de ADNc
usando el kit Omniscript RT (Qiagen, Hilden, Alemania) en 20
\mul con 2 \mul de tampón 10 x RT, 2 \mul de mezcla
suministrada de dNTP, 1 \mul de MgRT3a (50 \mumol/\mul) y
cebador PBGD__RT15b (50 \mumol/\mul), 10 unidades de ARN de
inhibidor de la ARNasa (Roche) y 4 unidades de enzima Omniscript
RT. La reacción se llevó a cabo en un Sistema GeneAmp PCR 9700
(Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos) durante 60 min a
37ºC seguido de la desnaturalización a 93ºC durante 5 min.
2 \mul del ADNc se usaron para la primera
ronda de PCR en 20 \mul de reacciones con 2 \mul de tampón 10 x
PCR, 0,6 \mul de MgCl_{2} (50 \muM), 1,6 \mul de mezcla
dNTP y 0,2 \mul de Platino Taq ADN polimerasa (todo de
Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y 0,4 \mul de cada cebador
externo de MAGE (10 \mumol/\mul) de acuerdo con el protocolo
descrito en el ejemplo 1. Para la PCR en tiempo real se prepararon
15 \mul de reacciones en capilares LightCycler con 1,5 \mul de
reactivo FastStart DNA Master SYBR Green I, 2 \mul del producto
de primera ronda de PCR y diferentes concentraciones de MgCl_{2} y
cada cebador interno de MAGE: para MAGE-A1 los
inventores usaron 2,5 mM MgCl_{2} y 1 \muM de cebadores internos
MAGE-A1, para MAGE-A2 y -A10 3 mM
MgCl_{2} y 1,2 \muM de cebadores internos
MAGE-A2 o -A10, para MAGE-A3/6 y -4
2,5 mM de MgCl_{2} y 1,2 \muM de cebadores internos de
MAGE-A3/6 o -4, y para cebadores internos de
MAGE-A12 3 mM MgCl_{2} y 0,8 \muM
MAGE-A12. La reacción se llevó a cabo durante 5 min
a 95ºC para la activación inicial de la enzima, 10 seg a 95ºC para
desnaturalización, 5 seg a 60ºC para hibridación y 10 seg a 72ºC
para elongación durante 40 ciclos. Después de la finalización de la
reacción los productos de PCR se sometieron a un análisis de curva
de fusión que se extiende desde 65ºC a 95ºC con una velocidad de
descenso de 0,1ºC/s y se confirmó mediante electroforesis sobre
gel de acrilamida al 30% en los casos
ambiguos.
ambiguos.
La amplificación de ARNm de PBGD ARNm se
realizó en una PCR en tiempo real separada en 20 \mul con 1 \mul
de ADNc, 5 mM MgCl_{2}, 0,5 \muM de cebador codificante (5'-
AGA GTG ATT CGC GTG GGT ACC - 3'), 0,5 \muM de cebador no
codificante (5'- TTG GGT GAA AGA CAA CAG CAT C-3') y
2 \mul de FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche). El protocolo
se modificó como sigue: activación inicial de la enzima durante 5
min a 95ºC, desnaturalización durante 15 seg a 95ºC, hibridación a
60ºC durante 10 seg y extensión durante 20 seg a 72ºC. después de la
finalización los productos de la PCR se sometieron a un análisis de
curva de fusión como se ha descrito antes.
En total los inventores fueron capaces de
seleccionar dos grupos de pacientes con cáncer de próstata después
de la prostatectomia radical
(a) 21 pacientes con un relapso bioquímico
después de la prostatectomía radical definida como incremento del
nivel de suero de PSA en suero > 0,5 ng/ml en la ausencia de
cualquier signo de crecimiento de tumor local. Estos pacientes
tenían un alto riesgo de desarrollar enfermedad metastático debido a
la dispersión sistémica de la diseminación de PSA que produce
células tumorales.
(b) 18 pacientes sin relapso bioquímico después
de prostatectomía radical definida como nivel en suero de PSA
< 0,5 ng/ml y la presentación de un bajo perfil de riesgo para la
dispersión sistémica de tumores ( es decir puntuación de Gleason 6
y nivel de PSA en suero antes de la operación de 20 ng/ml y fase
tumoral pT1 o pT2, pN0, R0) y supervivencia después de la operación
> 30 meses en el momento de la recogida de muestras. En estos
pacientes el desarrollo de enfermedad metastático debe ser un
episodio diferente.
En el grupo de alto riesgo los inventores pueden
identificar 14 pacientes (= 66%, Tabla 12) con la expresión de
al menos un gen MAGE en al menos una muestra (aspirados bilaterales
de médula ósea o sangre). El grupo de bajo riesgo mostró la
expresión de MAGE en muestras de 7 pacientes (= 38%, Tabla 13).
Además el número total de ensayos positivos así como el nivel de
expresión era mucho más alto en el riesgo alto que la cohorte de
bajo riesgo. Se debe poner énfasis en que el grupo de bajo riesgo
no representa un grupo verdadero "negativo" o de
"control", ya que estos pacientes también tenían una
enfermedad maligna. Debido al tiempo de supervivencia sin
enfermedad generalmente largo de los pacientes con cáncer de
próstata la detección de la expresión génica de MAGE en el grupo
de bajo riesgo se puede< interpretar como resultado positivos con
evidencia para la dispersión de tumores sistémica antes de la
manifestación clínica de enfermedad metastático en el momento
actual. La cantidad de expresión de MAGE puede añadir un valor
pronóstico adicional, pero la potencia de estos parámetros se
tienen que evaluar después de la finalización del período de
seguimiento del control. El análisis de esta cohorte proporciona
una comprobación contundente del principio para la detección
sensible y cuantificación de varios marcadores individuales
mediante la RT - PCR en tiempo real de la presente invención y el
uso ejemplificado de este procedimiento para la diagnosis temprana
de enfermedad tumoral residual mínima.
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Resultados de la RT-PCR con 40
ciclos usando ARN total aislado a partir de 2 ml de sangre
reforzada con células 100 Mz2/Mel
"(+)" - "+++" = intensidad de señal
específica, "-" = sin señal
Resultados de PCR en tiempo real con 50 ciclos
usando ARN total aislado a partir de 2 ml de sangre fortalecida
con células 100 Mz2/Mel:
Puntos de Cruce para la detección de ARNm de
MAGE-A10 ARNm mediante una RT-PCR
en tiempo real de MAGE de marcador múltiple
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- \quad
- CK-ICC = inmunoquímica de citoqueratina, BM = aspirado de médula ósea, n. a = no disponible
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- CK-ICC = inmunoquímica de citoqueratina, BM = aspirado de médula ósea, n. a = no disponible
<110> Kufer, Peter
\hskip1cm Mecklenburg, Ingo
\vskip0.400000\baselineskip
<120> RT - PCR EN TIEMPO REAL NOVEDOSA
PARA LA DETECCIÓN SENSIBLE DE MÚLTIPLES TRANSCRIPCIONES DEL GEN
MAGE
\vskip0.400000\baselineskip
<130> KUF-001 PCT/EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 03 785 684.6 (PCT/EP
2003/013415)_
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-11-28
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 02 026 584.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-11-28
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> cebador de oligonucleótido
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<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctcagtag taggagcctg t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctacagacac agtgggtcgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttggtatt agaggatagc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccgtgagga ggcaaggttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcggattga ctccagagag ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagagttcgg ccgaaggaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgggcaatg aagacccaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgaagga gaagatctgc ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggcttgca gtgctgactc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctcggtga ggaggcaag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgactctg gtcagggcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccaaggag aagatctgcc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggcttgca gtgctgactc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctgacaag agtccaggtt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctgacgct ttggagctc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccgtgagga ggcaaggttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcctgcgc acccaccaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctacagacac agtgggtcgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaggatctg acaagagtcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctgacaag agtccaggtc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggagtgtg ggcaggact
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctgacgct ttggagctc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcctcctcc acagccagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagctggtg gaagtggatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttggtatt agaggatagc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcagcaga aacctcctct g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatggaaggg aagcaacgac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagccctca tcagattgat c
\hfill21
Claims (14)
1. Una RT-PCR en tiempo real
altamente sensible capaz de detectar de manera específica la
expresión de más de un gen MAGE, en la que la transcripción inversa
de las transcripciones de MAGE correspondientes se lleva a cabo de
manera simultánea en una reacción de síntesis de ADNc
individual.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que los genes MAGE se seleccionan entre los genes funcionales de
las subfamilias de MAGE A, B y/o C, en particular en el que los
genes MAGE comprenden MAGE-A 1, 2, 3, 4, 6, 10 y/o
12.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2,
en el que al menos un cebador para la transcripción inversa de ARNm
de GAGE se selecciona entre los siguientes grupos de
oligonucleótidos:
(A)
(B)
4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que además de la
transcripción inversa de las transcripciones de MAGE la
transcripción inversa de un ARNm calibrador, en particular el ARNm
de porfobilinógeno desaminasa (PBGD),
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH), beta-2- microglobina o
beta-actina, se lleva a cabo de manera simultánea en
la misma reacción de síntesis de ADNc única seguido de la
amplificación de PCR de los ADNc de MAGE y calibrador.
\newpage
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que el cebador para la transcripción inversa del ARNm de PBGD se
selecciona entre el siguiente grupo de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
6. El procedimiento de la reivindicación 4 ó 5,
en el que los cebadores de PCR para la amplificación del ADNc de
PBGD comprenden los oligonucleótidos seleccionados entre los
siguientes grupos:
en particular en los que los
cebadores son hu_PBGD_se y PBGD_3.1_R o hu_PBGD_R se usan como pares
de cebadores para amplificación por PCR del ADNc de
PBGD.
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que en total no más de dos
oligonucleótidos diferentes, en particular MgRT3a y Mg1_RT5a o
MgRT__3a y PBGD__RT15b, se usan como cebadores para la transcripción
inversa en la síntesis de reacción de ADNc.
8. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la PCR de MAGE y/o de
calibrador son PCR jerarquizadas o semijerarquizadas.
9. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los cebadores de PCR se usan
(i) comprendiendo pares de oligonucleótidos que amplifican de
manera específica solamente un único miembro del grupo de genes de
MAGE seleccionado, respectivamente, o (II) comprendiendo pares de
oligonucleótidos de cebadores de PCR que amplifican más de un
miembro del grupo seleccionado de genes de MAGE,
respectivamente.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el procedimiento se lleva a cabo con un par único o doble de
cebadores de PCR que amplifica(n) todos los miembros del
grupo seleccionado de genes de MAGE, respectivamente.
11. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los cebadores de PCR para la
amplificación del ADNc de MAGE comprenden oligonucleótidos
seleccionados entre uno de los siguientes grupos:
(C)
(D)
En particular un cebador del grupo C para la
primera ronda y/o un cebador del grupo D para una segunda ronda de
amplificación de PCR.
12. Una composición de diagnóstico que comprende
uno o más cebadores de ADNc para la transcripción inversa simultánea
de más de una transcripción de genes MAGE y opcionalmente un ARNm
calibrador apropiado en una reacción de síntesis de ADNc individual
para llevar a cabo el procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el cebador no es el cebador
MgRT1a que tiene la secuencia 5'-CCA GCA TTT CTG CCT
TTG TGA-3', si la composición no comprende ningún
cebador adicional de ADNc.
13. La composición de diagnóstico de la
reivindicación 12, en la que al menos un cebador de ADNc es MgRT3a
como se define en la reivindicación 3 (A), Mg1_RT5a como se define
en la reivindicación 3 (B) o PBGD__RT15b como se define en la
reivindicación 5.
14. Un oligonucleótido seleccionado entre el
siguiente grupo de cebadores:
- \quad
- MgRT3a como se define en la reivindicación 3 (A)
- \quad
- Mg1_RT5a como se define en la reivindicación 3 (B)
- \quad
- PBGD__RT15b como se define en la reivindicación 5.
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