ES2873049T3 - Método, secuencias, composiciones y kit para la detección de mutaciones en el promotor del gen Htert - Google Patents

Abstract

Conjunto de cebadores y sondas para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT caracterizado porque comprende los cebadores con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y las sondas con SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Método, secuencias, composiciones y kit para la detección de mutaciones en el promotor del gen Htert

La presente invención se refiere a un método para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert. El método al que se hace referencia usa una composición de reacción que comprende cebadores para amplificación y sondas para genotipado.

Otro aspecto de esta invención se refiere a los cebadores y las sondas usados en la realización del método anteriormente mencionado con secuencias, identificadas como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6, que presentan alta especificidad por estas mutaciones, así como a composiciones que las contienen.

La presente invención se refiere además a un kit que comprende las composiciones anteriormente mencionadas para detectar las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert realizando el método de la presente invención.

El método, las secuencias génicas, las composiciones y el kit de la presente invención pueden usarse ventajosamente para detectar cantidades traza de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T, presentes en muestras biológicas debido a su alta sensibilidad y especificidad para tales mutaciones.

La presente invención, por tanto, puede aplicarse en detección temprana, identificación, detección de recurrencia o predicción y monitorización de enfermedades asociadas con esas mutaciones, tales como carcinomas de vejiga, carcinomas de tiroides, carcinoma de células escamosas, carcinomas de células basales, cáncer de piel, cánceres del sistema nervioso central y carcinoma hepatocelular, entre otros, y finalmente proporcionar la base para un entorno de tratamiento apropiado.

Por tanto, la presente invención se encuentra dentro del campo técnico de la medicina, farmacéutica, biología molecular, bioquímica y genética humana relacionada.

DESCRIPCIÓN

Método, secuencias, composiciones y kit para la detección de cambios en el promotor del gen Htert

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un método para la detección ultrasensible de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert, comprendiendo las composiciones de reacción cebadores para amplificación y sondas para genotipado, denominándose las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6, que se diseñaron para presentar una alta especificidad por estas mutaciones, así como al kit que comprende tales composiciones para realizar el método al que se hace referencia.

La presente invención puede usarse ventajosamente para detectar cantidades traza de tales mutaciones c.-124C>T y c.-146C>T presentes en muestras biológicas e in vitro debido a la alta sensibilidad del método y la especificidad de las secuencias génicas creadas, y permitiendo de ese modo la detección temprana, identificación de recurrencia o predicción y monitorización de enfermedades asociadas con esas mutaciones, tales como carcinomas de vejiga, carcinomas de tiroides, carcinoma de células escamosas, carcinomas de células basales, cáncer de piel, cánceres del sistema nervioso central y carcinoma hepatocelular, entre otros y finalmente proporcionar la base para el entorno de tratamiento apropiado.

Por tanto, la presente invención se encuentra dentro del campo técnico de la medicina, farmacéutica, biología molecular, bioquímica y genética humana relacionada.

Estado de la técnica

Las mutaciones somáticas que se producen durante la replicación del ADN que preceden a una división mitótica, están en el origen de ciertos trastornos humanos, particularmente ciertos tipos de cánceres. Se observó la presencia de la enzima telomerasa en un alto porcentaje, aproximadamente el 75-80%, de las líneas de células tumorales. Recientemente, los solicitantes han identificado mutaciones en el promotor del gen de la telomerasa que codifica esta enzima, el gen TERT, en particular, las mutaciones en las posiciones c.-124C> T y c.-146C> T (a partir del ATG inicial). Estas mutaciones se han asociado con varios tumores malignos, tales como cánceres del sistema nervioso central (43-51%), carcinomas de vejiga (59-66%), carcinomas hepatocelulares (59%), carcinomas de tiroides (10%), cánceres de piel (melanoma 29%-73%, 73% carcinoma de células basales (BCC) y carcinomas de células escamosas (CCE) 45%) y tumores del estroma gastrointestinal (GIST) (4%) [1-7].

El hecho de que estén presentes mutaciones en el promotor de la telomerasa con una frecuencia relativamente alta en ciertos cánceres las convierte en posibles biomarcadores para la detección temprana, el diagnóstico, el pronóstico, la detección de recurrencia o la predicción/monitorización de la respuesta terapéutica de los tumores, tales como tumores del sistema nervioso central, carcinomas de vejiga, carcinomas hepatocelulares, carcinomas de tiroides y cánceres de piel, entre otros. Por ejemplo, en cáncer de vejiga, las mutaciones somáticas en las posiciones c.-124C> T y c.-146C> T (a partir del ATG) del gen de la telomerasa tienen una prevalencia que alcanza el 85% y, junto con las mutaciones R248C y S249C en el gen del receptor de crecimiento de fibroblastos 3 (FGFR3) [9], son los biomarcadores más fiables del cáncer de vejiga.

Sin embargo, para el in vitro uso de muestras de líquidos biológicos (por ejemplo, orina, plasma, líquido cefalorraquídeo, citología por aspiración, entre otros), el método de detección de mutaciones en las posiciones c.-124 C> T y c.-146C> T (del ATG) del gen de la telomerasa debe tener una alta sensibilidad analítica con el fin de detectar cantidades traza de los alelos mutados, incluso cuando están “diluidos” en una muestra con mayor abundancia de alelos “de tipo natural”.

El documento WO2015153808 da a conocer métodos y composiciones útiles en la detección de algunas enfermedades, en particular cáncer, más específicamente, cáncer de tiroides, relacionados con mutaciones en las posiciones c.-124C> T y c.-146C> T del gen TERT. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en ese documento se usan para la detección de tales mutaciones mediante métodos de amplificación directa, dependientes de la secuencia, y tienen una sensibilidad limitada cuando la presencia de secuencias normales es relativamente alta en comparación con las secuencias mutantes. Por otro lado, son susceptibles a la aparición de amplificación inespecífica, por lo que no presentan alta especificidad por este tipo de mutación, lo que provoca, en su método general, que no sean suficientemente sensibles y específicos.

El documento WO2014160834 da a conocer métodos y composiciones útiles en la detección y el tratamiento de diferentes tipos de cáncer de tiroides, relacionados con mutaciones en las posiciones c.-124 C> T y c.-146 C> T del gen TERT. Sin embargo, en este documento, las secuencias de nucleótidos dadas a conocer no mostraron una alta sensibilidad ya que la presencia de secuencias normales es muy abundante en comparación con las secuencias mutantes, y el método propuesto se basa en la secuenciación del ADN usando el kit de secuenciación listo “BigDye terminator v3.1” y en un equipo ABI PRISM 3730 de Applied Biosystems, que tiene una sensibilidad limitada para detectar alelos poco comunes en la reacción. Además, la presencia de la mutación debe confirmarse mediante secuenciación en ambas direcciones, sentido y antisentido, lo que hace que el método sea poco práctico y laborioso y se aplique solo a cánceres de tiroides.

Yves Allory et al: “Telomerase Reverse Transcriptase Promoter Mutations in Bladder Cancer: High Frequency Across States, Detection in Urine, and Lack of Association with Outcome”, EUROPEAN UROLOGY, vol. 65, n.° 2, 1 de febrero de 2014 (01-02-2014), páginas 360-366, describen un ensayo SNaPshot para detectar mutantes a los que se hace referencia en la presente invención. El fragmento que comprende las mutaciones se amplifica con un par de cebadores y las mutaciones se detectan cada una con una sonda, que se usa en una reacción de extensión de un solo nucleótido. En la presente invención, se usan otros cebadores y las sondas son específicas de alelo sin extensión de un solo nucleótido.

Christian Koelsche et al: “Tert promoter hotspot mutations are recurrent in myxoid liposarcomas but rare in other soft tissue sarcoma entities”, JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH BIOMED CENTRAL LTD, LONDRES, RU, vol. 33, n.° 1, 11 de abril de 2014 (11 -04-2014), página 33, describen un método que usa PCR y secuenciación directa para detectar las mutaciones. Los cebadores y sondas usados en el método descrito en este documento son diferentes a los definidos en la presente invención.

Kun Wang et al: “Tert promoter mutations are associated with distant metastases in upper tract urotelial carcinomas and serve as urinary biomarkers detected by a sensitive castPCR”, Oncotarget, vol. 5, n.° 23, 9 de diciembre de 2014 (09-12-2014), páginas 12428-12439, describen la secuenciación de Sanger para detectar las mutaciones descritas en la presente invención. En particular, esta referencia describe un método de castPCR muy específico y sensible para detectar C228T, que usa bloqueantes y cebadores específicos de alelo y una sonda de detección.

El documento WO2015/049063, a nombre de Deutsches Krebsforschung, (2015-04-09), describe un método ampliamente usado para la detección de las dos mutaciones, que comprende una etapa de amplificación seguida de una etapa de secuenciación. Sin embargo, las combinaciones de cebador/sonda usadas en D4 son diferentes a las de la presente invención.

Los métodos descritos en la técnica para discriminar mutaciones en las posiciones c.-124C>T y c.-146C>T del gen TERT que comprenden secuenciación o extensión de una sola base tienen la desventaja de que, tas la amplificación, es necesario realizar una segunda reacción (secuenciación o SNaPshot o extensión de una sola base), planteando por tanto el problema de un alto riesgo de contaminación derivado de la manipulación de productos de amplificación cuando la discriminación no se realiza en una sola reacción.

Además, en la secuenciación o extensión de una sola base, se usan cantidades equimolares de didesoxinucleótidos y no hay sesgo hacia la detección del alelo mutante, con la desventaja de que se consumen recursos de la reacción por extensiones de los alelos de tipo natural y planteando el problema de la falta de un sesgo de la reacción hacia la detección de los alelos mutantes.

Para lograr la amplificación sesgada de los alelos mutantes, los métodos en la técnica se basan o bien en el uso de un bloqueante de la secuencia de tipo natural o bien en cebadores específicos de secuencia para la amplificación del alelo mutante con cebadores de PCR específicos de alelo.

Los métodos que usan bloqueantes de PCR para suprimir la amplificación del alelo de tipo natural, conocidos como Cast PCR, favorecen el uso de recursos de la reacción hacia la amplificación de los alelos mutantes. Sin embargo, debido a que la amplificación del alelo de tipo natural se suprime en la reacción, no hay control interno en la reacción para la amplificación de la secuencia diana específica y, en esta condición, la falta de amplificación de los alelos mutantes no puede distinguirse de la inhibición de la amplificación de la secuencia diana debido, por ejemplo, a contaminantes o impurezas. Habitualmente, cuando se realiza Cast PCR, debe realizarse una reacción con sondas para detectar el alelo de tipo natural en paralelo, en una reacción separada usando la misma muestra, para certificar que la muestra es adecuada para la amplificación. Sin embargo, esto no permite que esté presente un verdadero control endógeno en la reacción de detección de mutantes y el control endógeno y las secuencias diana no pueden detectarse dentro de una única reacción.

Los métodos basados en PCR específica de alelo usan cebadores específicos de secuencia de modo que el nucleótido en 3’ del cebador sea complementario al nucleótido mutante en la secuencia diana, inhibiendo así la posibilidad de que las ADN polimerasas extiendan los cebadores con proyecciones en 3’. Sin embargo, se sabe que, incluso en ausencia de complementariedad en 3’, las ADN polimerasas pueden extender cebadores con apareamientos erróneos y, dado que el cebador se integra en una secuencia, que luego se selecciona como diana en una nueva ronda de amplificación, esto puede generar una amplificación inespecífica exponencial.

Otros métodos, tales como la PCR en tiempo real para la discriminación alélica, comprenden la amplificación de una secuencia diana que abarca un sitio mutante específico seguido de la hibridación de los amplímeros producidos con sondas marcadas específicas de secuencia mutante y de tipo natural, que se degradan en la fase de extensión por la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa 3’-5’ para producir fluorescencia. Se emplean concentraciones equimolares de sondas para alelos de tipo natural y mutantes y esto tiene la desventaja de que no existe ningún sesgo para el uso de los recursos de la reacción a favor de la detección del alelo mutante.

Además, ningún método para discriminar mutaciones en las posiciones c.-124C> T y c.-146C> T del gen TERT conocido en la técnica puede calibrarse para un límite de detección/sensibilidad analítica deseado y esto no puede establecerse diferencialmente para uno u otro alelo en base a la composición de reacción. Esta es una desventaja de los métodos actuales, ya que se sabe que la sensibilidad analítica no necesariamente sigue a la sensibilidad clínica y puede producirse la detección de niveles muy bajos de un biomarcador en una situación subclínica y no necesariamente traducirse en una expresión clínica. Un método en el que los límites de detección analítica pudieran calibrarse para la expresión clínica tendría un valor predictivo positivo más alto y una mayor especificidad clínica, ya que se generarían pocos falsos positivos.

Por tanto, es necesario desarrollar un método con suficiente sensibilidad y especificidad que permita la detección de tales mutaciones en muestras biológicas incluso en condiciones en las que los alelos mutados están presentes en cantidades muy bajas.

La presente invención propone un método ultrasensible que permite la detección de las mutaciones c.-124 C> T y c.-146 C> T en el promotor del gen Htert, mediante el diseño de cebadores y sondas cuyas secuencias son específicas para este fin.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al conjunto de cebadores, secuencias de sondas, composiciones, kits y métodos tal como se definen en las reivindicaciones 1 a 14. Estos cebadores y sondas de ADN, debido a que tienen una alta especificidad en la detección de tales mutaciones, permiten su uso en un método para la detección de alta sensibilidad de estas mutaciones.

Las composiciones de la presente invención son aplicables a la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert, en combinaciones que permiten la detección de tanto el alelo de tipo natural de control endógeno como los alelos mutantes que van a detectarse en la misma reacción, a sensibilidades analíticas diferenciales, con sesgo hacia la detección de los alelos mutantes y con límites de detección que pueden calibrarse manipulando la composición de reacción que puede prepararse previamente o puede prepararse en el momento de la realización del método de detección de la invención.

En estas composiciones, la cantidad de ADN en la muestra de prueba puede ser bastante baja, dada la alta especificidad de los cebadores y las sondas de la presente invención diseñados para ese fin.

El kit de la presente invención tiene la ventaja de desarrollar un método ultrasensible de detección in vitro de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert, de una manera rápida y fiable, añadiendo una prueba de ADN humano de muestra para la detección de dicha mutación.

El método de la presente invención puede usarse ventajosamente para detectar cantidades traza de tales mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T presentes en muestras biológicas debido a su alta sensibilidad conferida por la secuencia genética diseñada para este fin y que tiene una alta especificidad por tales mutaciones.

Por tanto, la presente invención puede aplicarse en detección temprana, identificación, detección de recurrencia o predicción y monitorización de enfermedades asociadas con tales mutaciones, tales como carcinomas de vejiga, carcinomas de tiroides, cánceres de piel, cánceres del sistema nervioso central y carcinoma hepatocelular entre otras y finalmente proporcionar la base para el entorno de tratamiento apropiado.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un método para la detección in vitro de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T M en el promotor del gen Htert. El método de reacción al que se hace referencia usa composiciones que comprenden cebadores para amplificación y sondas para genotipado, cuyas secuencias (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6) son específicas para estas mutaciones.

Por tanto, se crean secuencias de cebador para amplificación y sondas para genotipado con el fin de construir la base para dicha reacción de amplificación, por ejemplo, un ensayo de PCR en tiempo real (RT-PCR) o PCR en tiempo digital. Se diseñaron 6 secuencias para los cebadores y las sondas, tal como se muestra en la lista de secuencias. Esto incluye las secuencias para los siguientes fines:

a. Detección de la mutación ubicada en -124 bases en el sentido de 5’ del ATG del gen hTERT

• SEQ ID NO: 1: Iniciador F

• SEQ ID NO: 2: Iniciador R

• SEQ ID NO: 3: Sonda -124C

• SEQ ID NO: 4: Sonda -124T

b. Detección de la mutación ubicada en -146 bases en el sentido de 5’ del ATG del gen hTERT

• SEQ ID NO: 1: Iniciador F

• SEQ ID NO: 2: Iniciador R

• SEQ ID NO: 5: Sonda -146C

• SEQ ID NO: 6: Sonda -146T

Las secuencias anteriores pueden prepararse mediante el método de síntesis de nucleótidos usando los nucleósidos de fosforamidita en fase sólida tal como se describe en la publicación: Beaucage, SL; Iyer, RP (1992). “Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Fosforamidite Approach”. Tetrahedron 48 (12): 2223. La síntesis puede realizarse en columnas con soporte sólido (vidrio de poro controlado o poliestireno) funcionalizado con la primera base del extremo 3’ de cada oligonucleótido. La preparación de cada oligonucleótido sigue tras varios ciclos de síntesis, consistiendo cada uno en reacciones químicas, normalmente cuatro reacciones químicas: i) liberación (destritilación), ii) acoplamiento, iii) protección y iv) oxidación. En cada ciclo, se añaden al extremo 5’ terminal de la cadena en crecimiento residuos de nucleótido correspondientes a la secuencia deseada.

Estos pueden modificarse adicionalmente en las secuencias en 5’ y 3’ de las sondas mediante la adición de fluoróforos correspondientes tales como FAM, Yakima Yellow, extintor (TAMRA), etc. conocidos por los expertos, para el fin de reacciones de amplificación e hibridación en PCR múltiplex. Por tanto, fluoróforos adecuados en la presente invención son, por ejemplo, compuestos conocidos por Alexa Fluor FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

Los nucleótidos se refieren a nucleótidos de origen natural o sintético, con la capacidad de hibridación mediante apareamiento de bases con nucleótidos complementarios, y pueden incluir, sin limitación, ADN, ARN y análogos de nucleótidos (por ejemplo ácidos nucleicos con conformación cerrada, conocidos como “ácidos nucleicos bloqueados” - LNA) o nucleótidos sin uniones de tipo fosfodiéster entre los nucleótidos (por ejemplo ácido nucleico peptídico - PNA) y ácidos nucleicos con enlaces tiodiéster, o similares para el mismo fin.

Se prepararon composiciones para la amplificación e hibridación de ADN (composiciones de PCR) añadiendo disoluciones de reactantes a la PCR, disponibles en el mercado, con diferentes secuencias de nucleótidos con SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6 en diferentes concentraciones, y agua bidestilada y agua bidesionizada.

Las disoluciones de reacción para PCR usadas varían con el tipo deseado de reacción de amplificación. Ejemplos de disoluciones de reactantes adecuadas para PCR para la realización de la presente invención son por ejemplo la disolución “TaqMan® Universal PCR Master Mix” de la empresa Thermofischer Scientific o disoluciones similares para el fin de la amplificación e hibridación de ADN.

Las concentraciones de sondas se refieren a la concentración molar de la disolución, correspondiente al número de moles de cada sonda por volumen de disolución, en donde nanoMolar (nM) corresponde a 1x10-9 moles por litro.

Se prepararon composiciones para PCR que comprendían diversas combinaciones de diferentes concentraciones de las sondas con secuencias SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6. Tal como se mencionó anteriormente, se diseñaron sondas cuyas secuencias se definen mediante SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para la detección específica de la mutación c.-124 C>T en el promotor del gen Htert mientras que las sondas SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 se diseñaron para la detección específica de la mutación c.-146 C>T en el promotor del gen Htert.

Por tanto, las composiciones de la invención para PCR pueden comprender dos conjuntos de sondas mencionadas anteriormente, es decir, las composiciones de la PCR de la invención comprenden todas las sondas con SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6 (conjunto completo c.-124 c.-146).

Ambos conjuntos de sondas están presentes en las composiciones para PCR, entonces estas composiciones son específicas para la detección de las mutaciones tanto c.-124 C>T como c.-146 C>T.

La concentración de sondas de nucleótidos de la presente invención en las disoluciones se ajusta a la PCR, con el fin de promover la sensibilidad del método de la invención en la detección de tales mutaciones. Preferiblemente, la concentración final de cada sonda se ajusta a valores de entre 400 y 1600 nM, más preferiblemente con valores de concentración final de 800 a 1600 nM y en una realización adicional preferida de la invención los valores de la concentración final de cada sonda son de aproximadamente 1600 nM.

Por tanto, es posible obtener composiciones para PCR que comprenden diferentes combinaciones de valores de concentración final de cada una de las sondas definidas por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 6.

Por tanto, en una forma preferida, las composiciones para PCR que comprenden las siguientes concentraciones de las sondas con SEQ ID NO: 3 a SEQ ID ^{n O :} 6:

i. de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 3, de 400 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 4, de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 5 y de 400 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 6,

o

ii. de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 3, de 800 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 4, de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 5 y de 800 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 6.

Las composiciones de las mezclas de reacción para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert se prepararon añadiendo ADN de la muestra biológica que iba a someterse a prueba a las composiciones mencionadas anteriormente para la PCR.

El ADN de prueba puede obtenerse de tejido, orina, ADN de tumor circulante, línea germinal u otras fuentes biológicas usando métodos convencionales conocidos en la técnica tales como los comercializados por la empresa Qiagen QIAamp® o métodos similares. La cantidad de ADN que va a someterse a prueba puede estar presente en la composición para detectar las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert, a concentraciones por debajo de 500 ng, menos de 100 ng, 50 ng y la superior a 1 ng.

El ajuste al que se hace referencia en la concentración de las sondas usadas pretende reforzar la sensibilidad analítica del método de la presente invención, demostrada por un número mínimo de alelos mutantes (ADN MUT) detectados en relación con el número de alelos “de tipo natural” (ADN TN). Se asume que el aumento en la sensibilidad analítica resulta del aumento de las concentraciones de las sondas usadas en la reacción favoreciendo la amplificación del alelo mutante.

Simultáneamente, se redujo la eficacia de la hibridación y amplificación del alelo “de tipo natural” con el fin de mantener tanto como fuera posible el equilibrio de la reacción a favor de la amplificación del alelo mutante.

Por tanto, fue posible desarrollar un método en el que diversas combinaciones de diferentes concentraciones de las sondas usadas dan lugar a condiciones que refuerzan la sensibilidad analítica y pueden detectar niveles muy bajos de alelos mutantes.

Hasta ciertos niveles, el aumento en la concentración de sonda mutada no da como resultado una detección inespecífica del alelo “de tipo natural” tal como se evidencia por la ausencia de señal de las sondas -124T y -146T cuando se usa sólo muestra de tipo ADN TN (figura 5 - paneles C y D). Por tanto, basándose en la manipulación de las concentraciones de sonda usadas, es posible calibrar la sensibilidad del método analítico al tiempo que se conserva su especificidad.

Como reflejo de este aumento de eficiencia en la detección de los alelos mutados -124T y -146T, está el aumento significativo de la sensibilidad analítica del método, que pasa a valores de detección mínimos del 1,56% para el alelo -124T y del 0,78% para el alelo -146T (figuras 6A y B, respectivamente).

Por tanto, el método de la presente invención comprende las etapas de: i) preparación de una composición para detectar las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T M en el promotor del gen Htert, tal como se describió anteriormente, ii) promoción del ADN extraído de una muestra biológica que va a someterse a prueba para la mutación, una composición para la amplificación e hibridación por PCR, también tal como se describió anteriormente, iii) amplificación e hibridación del ADN de la composición de muestra para detectar las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert mediante reacción PCR, PCR en tiempo real, RT-PCR o PCR digital o incluso reacción PCR múltiplex y iv) análisis de las curvas de amplificación así obtenidas.

La presencia de c.-124 C>T mutado y c.-146 C>T en el promotor del gen Htert de la muestra de prueba se analiza para determinar la existencia de un crecimiento exponencial de una señal de fluorescencia, que corresponde a la presencia de al menos una de las mutaciones a las que se hace referencia.

El método de la presente invención es útil en la detección de cantidades traza de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en varios líquidos biológicos, por ejemplo, orina, plasma, líquido cefalorraquídeo, citología por aspiración, entre otros, teniendo como entrada ADN obtenidos de estas diferentes fuentes. En estos ejemplos, la ventaja es ser capaz de hacer una determinación a partir de una clase menos invasiva de muestra sin tener que depender de una biopsia o cirugía.

Puede aplicarse en la vigilancia de pacientes con cáncer de vejiga por medio de un resultado de análisis basado en ADN de una muestra de orina. Esta aplicación se basa en el hecho de que la mutación c.-124C>T y c.-146C> T son altamente frecuentes en cáncer de vejiga y pueden detectarse en ADN derivado de la orina (figura 7). Para pacientes que están en vigilancia clínica debido a que tienen un 50-70% de probabilidad de recurrencia, la posibilidad de detectar la recurrencia por un análisis de orina tiene ventajas con respecto al método convencional basándose en citoscopia al ser completamente no invasivo y más conveniente para el paciente.

El método de la presente invención también puede aplicarse a la detección de otros tipos de cáncer en los que están presentes mutaciones del gen Htert y para otros fines clínicos. Un ejemplo es el análisis de aspirados con aguja fina de nódulos tiroideos con el fin de proporcionar información de pronóstico útil en la decisión de la necesidad de un tratamiento ablativo o extensión de linfadenectomía.

Otro ejemplo de aplicación de la presente invención se refiere a detección temprana, diagnóstico, pronóstico, detección de recurrencia o predicción/monitorización de la respuesta a la terapia de tumores tales como cánceres del sistema nervioso central, carcinomas de vejiga, carcinomas hepatocelulares, carcinomas de tiroides, cánceres de piel, entre otros.

La presente invención puede ser útil también para el análisis de tejido tumor o ADN circulante en el contexto de “biopsia líquida” para la posible selección y tratamiento de pacientes candidatos, respuesta y predicción al tratamiento y monitorización, por ejemplo, con inhibidores de telomerasa para el promotor del gen Htert.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Demostración de la capacidad del ensayo para detectar mutaciones en el promotor del gen Htert (TERTp) c.-124 C>T.

En esta figura, se presenta que el ensayo es específico para la detección de alelos en la posición -124. El rendimiento del ensayo se confirma sometiendo a prueba la detección de la mutación c.-124 C>T en muestras de ADN heterocigoto para la mutación c.-124 C>T (ADN HET124) y casos “de tipo natural” (ADN TN). Los resultados demuestran que la sonda específica para el alelo mutante (sonda -124 T) genera una señal en la muestra de ADN de HET-124 y no en la muestra de ADN TN y la sonda para el alelo “de tipo natural” (sonda -124 C) genera una amplificación de la señal en ambas muestras.

1 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124C (alelo “de tipo natural”) en ADN TN.

2 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124C (alelo “de tipo natural”) en ADN de HET-124.

3 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T (alelo mutante) en ADN de HET-124.

4 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T (alelo mutante) en ADN TN.

Eje X - Ciclo de amplificación

Eje Y - Cambio de fluorescencia

Figura 2: Demostración de la capacidad del ensayo para detectar mutaciones en TERTp c.-146 C>T

En esta figura, se presenta que el ensayo es específico para la detección de alelos en la posición -146. El rendimiento de la prueba en la detección de la mutación c. -146 C> T se confirma mediante el análisis de muestras de ADN heterocigoto para c.-146 mutado C>T (ADN HET146) y casos de tipo natural (ADN TN). Los resultados muestran que la sonda específica para el alelo mutante (sonda -146 T) genera una señal en la muestra de ADN de HET-146 y no en la muestra de ADN TN y que la sonda para el alelo “de tipo natural” (sonda -146 C) genera una amplificación de la señal en ambas muestras.

1 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146C (alelo “de tipo natural”) en ADN TN.

2 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T (alelo mutante) en ADN de HET-146.

3 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146C (alelo “de tipo natural”) en ADN de HET-146.

4 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T (alelo mutante) en ADN TN.

Eje X - Ciclo de amplificación

Eje Y - Cambio de fluorescencia

Figura 3: Evaluación de la especificidad analítica de las pruebas:

(A) Detección específica de la mutación TERTp c.-124 C>T

(B) Detección específica de la mutación TERTp c.-146 C>T

En esta figura, se demostró que el ensayo no tiene reactividad cruzada entre las mutaciones sometidas a prueba. Figura 3-A: La muestra de ADN heterocigoto para la mutación TERTp -146C>T no se amplifica por la sonda -124T y la única sonda que emite fluorescencia es de hecho la sonda -124C (correspondiente al alelo “de tipo natural” en la posición -124).

Figura 3-B: Por otro lado, una muestra de ADN heterocigoto para la mutación TERTp -124C>T no se amplifica por la sonda -146T y la única sonda que emite fluorescencia es de hecho la sonda -146C (correspondiente al alelo “de tipo natural” en la posición -146).

1 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124C (alelo “de tipo natural”) en ADN de HET-146.

2 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T (alelo mutante) en ADN de HET-146.

3 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146C (alelo “de tipo natural”) en ADN de HET-124.

4 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T (alelo mutante) en ADN de HET-124.

Eje X - Ciclo de amplificación

Eje Y - Cambio de fluorescencia

Figura 4: Evaluación de la sensibilidad analítica para la detección del alelo -124T (A) y -146T (B) en condiciones que imitan muestras de ADN derivadas de líquidos biológicos, en los que hay pequeñas cantidades de alelos mutados en un contexto global en donde el alelo predominante es “de tipo natural”. Se usaron muestras de ADN con la mutación c.-124C>T o muestras con la mutación c.-146C>T diluidas en serie en muestras de ADN “de tipo natural”.

Esta figura notifica la eficiencia y sensibilidad de la prueba en la detección de los alelos mutados -124T y -146T.

1 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 50% de ADN MUT124 / ADN TN.

2 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 25% de ADN MUT 124 / ADN TN.

3 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 12,5% de ADN MUT124 / ADN TN.

4 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 6,25% de ADN MUT124 / ADN TN.

5 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 3,125% de ADN MUT124 / ADN TN.

6 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 50% de ADN MUT 146 / ADN TN.

7 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 25% de ADN MUT 146 / ADN TN.

8 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 12,5% de ADN MUT146 / ADN TN.

9 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 6,25% de ADN MUT 146 / ADN TN.

Eje X - Ciclo de amplificación

Eje Y - Cambio de fluorescencia

Figura 5: Potenciación de la sensibilidad analítica en la detección del alelo -124T (A) y -146T (B).

Se usaron muestras de ADN con la mutación c.-124C>T o muestras con la mutación c.-146C>T diluidas en serie en muestras de ADN “de tipo natural” en una proporción del 25% de ADN MUT/ADN-TN.

Puede observarse que, en una condición de baja concentración de la sonda para el alelo “de tipo natural” (por ejemplo 250 nM), el uso de una concentración superior de la sonda para los alelos mutados -124T y -146T (400-800-1600 nM) da como resultado un aumento significativo de la señal de detección de los alelos mutados (paneles A y B de la figura 5, respectivamente).

En los paneles C y D de esta figura, puede observarse que, hasta ciertos niveles, el aumento en la concentración de sonda mutada no da como resultado detección inespecífica del alelo “de tipo natural” tal como se evidencia por la ausencia de señal de las sondas -124T y -146T cuando se usa solo ADN-TN como muestra.

1 - Curva de amplificación, sonda -124T (mutante) a una concentración de 400 nM.

2 - Curva de amplificación, sonda -124C (de tipo natural) a una concentración de 250 nM.

3 - Curva de amplificación, sonda -124T (mutante) a una concentración de 800 nM.

4 - Curva de amplificación, sonda -124C (de tipo natural) a una concentración de 250 nM.

5 - Curva de amplificación, sonda -124T (mutante) a una concentración de 1600 nM.

6 - Curva de amplificación, sonda -124C (de tipo natural) a una concentración de 250 nM.

7 - Curva de amplificación, sonda -146T (mutante) a una concentración de 400 nM.

8 - Curva de amplificación, sonda -146C (de tipo natural) a una concentración de 250 nM.

9 - Curva de amplificación, sonda -146T (mutante) a una concentración de 800 nM.

10 - Curva de amplificación, sonda -146C (de tipo natural) a una concentración de 250 nM.

11 - Curva de amplificación, sonda -146T (mutante) a una concentración de 1600 nM.

12 - Curva de amplificación, sonda -146C (“de tipo natural”) a una concentración de 250 nM.

13 - Curva de amplificación, sonda -124T (mutante) a una concentración de 1600 nM.

14 - Curva de amplificación, sonda -124C (“de tipo natural”) a una concentración de 250 nM.

15 - Curva de amplificación, sonda -1246T (mutante) a una concentración de 400 nM.

16 - Curva de amplificación, sonda -146C (“de tipo natural”) a una concentración de 250 nM.

Eje X - Ciclo de amplificación

Eje Y - Cambio de fluorescencia

Figura 6: Evaluación de la sensibilidad analítica para la detección del alelo -124T (A) y -146T (B) cuando se aumenta la concentración de la sonda para el alelo mutante y se disminuye la concentración de la sonda usada para el alelo “de tipo natural”. Este cambio en la composición relativa de las sondas da como resultado un aumento de la sensibilidad analítica.

Esta figura presenta el aumento de la eficiencia y sensibilidad en la detección de los alelos mutados -124T y -146T: los valores de detección mínimos llegaron a ser del 1,56% para el alelo -124T y del 0,78% para el alelo -146T.

1 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 25% de ADN MUT124 / ADN TN.

2 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 12,5% de ADN MUT124 / ADN TN.

3 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 6,25% de ADN MUT124 / ADN TN.

4 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 3,125% de ADN MUT124 / ADN TN.

5 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T al 1,56% de ADN MUT124 / ADN TN.

6 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 50% de ADN MUT 146 / ADN TN.

7 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 25% de ADN MUT 146 / ADN TN.

8 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 12,5% de ADN MUT146 / ADN TN.

9 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146T al 6,25% de ADN MUT 146 / ADN TN.

10 - Curva de amplificación obtenida con

sonda -146T al 3,125% de ADN MUT146 / ADN TN. 11 - Curva de amplificación obtenida con

sonda -146T al 1,56% de ADN MUT 124 / ADN TN. 12 - Curva de amplificación obtenida con

sonda -146T al 0,78% de ADN MUT146 / ADN TN. Eje X - Ciclo de amplificación

Eje Y - Cambio de fluorescencia

Figura 7: Demostración de la capacidad del ensayo para detectar las mutaciones de TERTp c.-124 C>T y c.-146 C>T en muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga. En esta figura, puede observarse la detección de la mutación c.-124 C>T o la mutación c.-146 C>T en muestras de orina. Los resultados muestran que, en este tipo de muestras obtenidas de pacientes con cáncer de vejiga, se detectan alelos mutados para la mutación -124 (A) o la mutación -146 (B) así como señales para los correspondientes alelos “de tipo natural”.

1 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124C (alelo “de tipo natural”) en ADN obtenido de una muestra de orina de un paciente con cáncer de vejiga.

2 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -124T (alelo mutante) en ADN obtenido de una muestra de orina de un paciente con cáncer de vejiga.

3 - Curva de amplificación obtenida con la sonda -146C (alelo “de tipo natural”) en ADN obtenido de una muestra de orina de un paciente con cáncer de vejiga.

4 - Curva de amplificación de -146T obtenida con la sonda (alelo mutante) en ADN obtenido de una muestra de orina de un paciente con cáncer de vejiga.

Eje X - Ciclo de amplificación

Eje Y - Cambio de fluorescencia

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Preparación de las secuencias de cebadores y sondas

Se prepararon dos secuencias de cebadores, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y 4 otras secuencias de las sondas, SeQ iD NO: 3 SEQ ID NO: 6 tal como sigue:

Las secuencias indicadas anteriormente se prepararon mediante el método de síntesis de nucleótidos usando el nucleósido de fosforamidita en fase sólida. La síntesis se realizó en columnas empaquetadas con el soporte sólido funcionalizado con la primera base del extremo 3’ de cada oligonucleótido. La preparación de cada oligonucleótido siguió después de varios ciclos de síntesis, consistiendo cada uno en cuatro reacciones químicas:

Desbloqueo (destritilación); acoplamiento; protección y oxidación. En cada ciclo, se añadieron etapa a etapa, al extremo 5’ terminal de la cadena en crecimiento, residuos de nucleótido correspondientes a la secuencia deseada. La concentración de las sondas se ajustó a valores de 400 a 1600 nM mediante dilución de una preparación liofilizada en agua doblemente destilada y agua doblemente desionizada.

Ejemplo 2 - Preparación de composiciones de reacción PCR

Se prepararon varias composiciones de reacciones PCR que comprende el nucleótido según secuencias con SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6 en diferentes concentraciones (por ejemplo, 400 nm, 800 nm, 1600 nM) y tal como se describe a continuación. Para fines de comparación, las disoluciones se prepararon también con una concentración alternativa de la sonda para el alelo “de tipo natural” (por ejemplo, 250 nM, 500 nM).

I - Composiciones para la detección de mutaciones ubicadas en las bases -124 en el sentido de 5 ’ del codón de iniciación ATG del gen hTERT

Composición de la invención la:

• reactivo en disolución para PCR en tiempo real “TaqMan ® Universal PCR Master Mix” a una concentración 1X;

• oligonucleótido con la secuencia: SEQ ID NO: 1, a una concentración de 900 nM;

• oligonucleótido con la secuencia: SEQ ID NO: 2, a una concentración de 900 nM;

• sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 3, a una concentración de 250 nM, que contiene modificaciones tales como la incorporación del compuesto conocido como YAKIMA YELLOW ® y tetra-metilrodamina (TAMRA) en los extremos terminales 5’ y 3’, respectivamente;

• sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 4, a una concentración de 1600 nM, que contiene modificaciones tales como la incorporación del compuesto conocido como 6-carboxi-fluoresceína (6-FAM) y tetrametil-rodamina (TAMRA) en los extremos terminales 5’ y 3’, respectivamente;

• agua bidestilada y bidesionizada.

Composición de la invención Ib:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición la pero reemplazando la concentración de sonda oligonucleotídica por la identificada como: SEQ ID NO: 4, en una concentración de 800 nM.

Composición de la invención Ic:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición Ia pero reemplazando la concentración de sonda oligonucleotídica por la identificada como: SEQ ID NO: 4, en una concentración de 400 nM.

Composición comparativa Id:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición Ia pero reemplazando la sonda oligonucleotídica por la secuencia: SEQ ID NO: 3, a una concentración de 500 nM.

II - Composiciones para la detección de mutaciones ubicadas a -146 bases en el sentido de 5 ’ del codón de iniciación ATG del gen hTERTgene

Composición de la invención IIa:

• reactivo en disolución para PCR en tiempo real “TaqMan ® Universal PCR Master Mix” a una concentración 1X;

• oligonucleótido con la secuencia: SEQ ID NO: 1, a una concentración de 900 nM;

• oligonucleótido con la secuencia: SEQ ID NO: 2, a una concentración de 900 nM;

• sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 5, a una concentración de 250 nM, que contiene modificaciones en los extremos terminales 5’ y 3’, respectivamente;

• sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 6, a una concentración de 1600 nM, que contiene modificaciones en los extremos terminales 5’ y 3’, respectivamente;

• agua bidestilada y bidesionizada.

Las modificaciones mencionadas en las secuencias de los extremos terminales 5’ y 3’ de las sondas corresponden a la adición de fluoróforos (FAM, Yakima yellow) y extintor (TAMRA), etc. conocidos por el experto.

Composición de la invención IIb:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición IIa, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO. 6 está presente a una concentración de 800 nM.

Composición de la invención I Ic:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición IIa, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 6 está presente a una concentración de 400 nM.

Composición comparativa IId:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición Ia, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 5 está presente a una concentración de 500 nM.

III Composiciones para la detección simultánea de las mutaciones ubicadas en las bases -124 y -146 en el sentido de 5’ del codón de iniciación ATG del gen hTERT:

Composición de la invención IIIa:

• reactivo en disolución para PCR en tiempo real “TaqMan ® Universal PCR Master Mix” a una concentración 1X;

• oligonucleótido con la secuencia: SEQ ID NO: 1, a una concentración final de 900 nM;

• oligonucleótido con la secuencia: SEQ ID NO: 2, a una concentración final de 900 nM;

• oligonucleótido con la secuencia: SEQ ID NO: 3, a una concentración final de 900 nM;

• sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 4, a una concentración de 1600 nM, que contiene modificaciones en los extremos terminales 5’ y 3’, respectivamente;

• sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 5, a una concentración de 250 nM, que contiene modificaciones en los extremos terminales 5’ y 3’, respectivamente;

• sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 6, a una concentración de 1600 nM, que contiene modificaciones en los extremos terminales 5’ y 3’, respectivamente

• agua bidestilada y bidesionizada.

Composición de la invención IlIb:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición IIIa, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 4 está presente en una concentración de 800 nM.

Composición de la invención IIIc:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición IIIa, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 4 está presente en una concentración de 400 nM.

Composición de la invención II Id:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición IIIa, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO. 6 está presente a una concentración de 800 nM.

Composición de la invención IIIe:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición IIIa, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 6 está presente a una concentración de 400 nM.

Composición comparativa IIIf:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición Ia, sin embargo, la sonda oligonucleotídica con la secuencia: SEQ ID NO: 3 está presente a una concentración de 500 nM.

Composición comparativa IIIg:

Esta composición se prepara de manera similar a la composición pero reemplazando Ia sonda oligonucleotídica por la secuencia: SEQ ID NO: 5, presente a una concentración de 500 nM.

Ejemplo 3 - Preparación de composiciones para detectar mutaciones

Las composiciones de las mezclas de reacción para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT se prepararon con la adición de ADN de una muestra de prueba biológica, aproximadamente 100 ng de ADN (puede usarse una cantidad menor, que oscila entre 1 ng y 500 ng) a las composiciones de PCR mencionadas anteriormente, con la concentración de las sondas con SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO: 6, ajustada a valores que oscilan entre 400 y 1600 nM, como se describió en el ejemplo previo. Las composiciones para la detección se prepararon por tanto con muestras de ADN que contenían la mutación c.124 C>T o muestras que contenían la mutación c.146 C>T “diluidas en serie” en muestras de ADN “de tipo natural”.

Asimismo, se prepararon composiciones para la detección para fines comparativos, a través de la adición de ADN de la muestra de prueba biológica a las disoluciones comparativas del ejemplo previo.

Ejemplo 4 - Método para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T ubicadas en el prom otor del gen hTERT

Para llevar a cabo el método de la presente invención, se prepararon diferentes composiciones para detectar mutaciones tal como se describió en el ejemplo previo.

En este ejemplo, se usó ADN de líneas celulares o ADN de tejido tumoral, o bien fresco o bien fijado con formalina e incrustado en parafina.

Las composiciones para la detección del ejemplo previo se sometieron a procesos de amplificación e hibridación en PCR en tiempo real y PCR digital. Las composiciones también se sometieron a ensayos simultáneos (múltiplex) usando en la misma reacción sondas para ambas mutaciones en análisis, estando las sondas etiquetadas con diferentes fluoróforos. Entre los fluoróforos más comunes, están compuestos conocidos por Alexa Fluor FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

Para llevar a cabo el método en PCR en tiempo real, se usó la máquina ABI PRISM ® 7500 Fast comercializada por Scientific ThermoFischer.

Condiciones de amplificación e hibridación:

1a fase: 1 ciclo de 10 minutos a 95°C

2a fase: 45 ciclos, que comprenden 30 segundos a 92°C, 1 minuto a 60°C, con caída de la temperatura de 0,2°C por ciclo comenzando en el ciclo 25

3a fase: 1 ciclo de 1 minuto a 57°C, con adquisición de señales

Ejemplo 5 - Método para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T ubicadas en el prom otor del gen hTERT en una muestra de orina

Se obtuvieron muestras de orina del paciente de pacientes con cáncer de vejiga en programas clínicos o de monitorización (citoscopia) para la prevención de la recurrencia del tumor. Se centrifugó la orina a una fuerza que excedía 1000 veces la fuerza gravitacional (1000 G) durante un periodo de tiempo que excedía 5 minutos para sedimentar las células epiteliales de la vejiga presentes en la orina. Se extrajo el ADN de las células sedimentadas obtenidas usando métodos comunes conocidos en la técnica tales como QlAamp® comercializado por la empresa Qiagen o métodos similares. Entre 1 y 500 ng del ADN obtenido se añadieron a las composiciones para la amplificación y detección de mutaciones preparadas tal como se describió en los ejemplos 1,2 y 3.

Las composiciones para la detección del ejemplo 3 se sometieron a procesos de amplificación e hibridación en PCR en tiempo real y PCR digital. Las composiciones se sometieron también a ensayos simultáneos (múltiplex) usando en la misma reacción sondas para ambas mutaciones en análisis, que son las sondas marcadas con diferentes fluoróforos. Entre los fluoróforos más comunes, están compuestos conocidos por Alexa Fluor FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

Para llevar a cabo el método en PCR en tiempo real, se usó la máquina ABI PRISM ® 7500 Fast comercializada por Scientific ThermoFischer.

Condiciones de amplificación e hibridación:

1 a fase: 1 ciclo de 10 minutos a 95°C

2a fase: 45 ciclos, que comprenden 30 segundos a 92°C, 1 minuto a 60°C, con caída de la temperatura de 0,2°C por ciclo comenzando en el ciclo 25

3a fase: 1 ciclo de 1 minuto a 57°C, con adquisición de señales

Usando este método, se detectaron los cambios c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT en pacientes con cáncer de vejiga tanto de bajo como de alto grado, así como en pacientes con cáncer de vejiga recurrente (figura 7).

En conclusión:

Se verificó la especificidad de las sondas, es decir, se evaluó si las sondas para la mutación c.-124 C> T (sondas con SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4) no produjeron amplificación de una muestra de ADN heterocigoto para la alteración c.-146 C> T (a Dn MUT 146) y viceversa (con las sondas con SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (figuras 3A y 3B). Luego se verificó que no existen fenómenos de detección cruzada o falsa detección entre las sondas a las que se hace referencia y las respectivas mutaciones.

En muestras de ADN derivadas de líquidos biológicos, en las que hay pequeñas cantidades de alelos mutados en un entorno dominado por alelos “de tipo natural”, la sensibilidad analítica de las sondas -124T y -146T a una concentración final de 400 nM en su respectiva capacidad de detección de mutaciones se mantiene hasta un máximo del 3,125% en el caso de la sonda -124T y del 6,25% para la sonda -146T (figuras 4a y b, respectivamente), lo que muestra claramente la alta eficacia de las sondas para la detección de mutaciones en condiciones de alta dilución de alelos “de tipo natural” y, por tanto, la ultrasensibilidad del método de la presente invención.

En condiciones que usaron el 25% de ADN MUT / ADN TN, puede observarse que, en baja concentración de la sonda para el alelo “de tipo natural” (por ejemplo, 250 nM), el uso de una mayor concentración de la sonda para los alelos mutados -124T y -146T (400-800-1600 nM) da como resultado un aumento significativo de la señal de detección de los alelos mutados (paneles A y B de la figura 5, respectivamente), lo que indica claramente que, manipulando la concentración de las sondas, es posible ajustar la sensibilidad del método de la presente invención, para detectar las mutaciones en cuestión.

Al aumento de la eficiencia de detección de los alelos mutados -124T y -146T, correspondió un aumento significativo en la sensibilidad del método analítico de la invención, pasando a valores mínimos de detección del 1,56% en el caso del alelo -124T y del 0,78% en el caso del alelo -146T (figuras 6A y B, respectivamente), lo que indica claramente que, manipulando la concentración de las sondas, es posible potenciar la sensibilidad analítica del método de la invención para detectar las mutaciones en cuestión, manteniendo su especificidad.

LISTA DE SECUENCIAS

I - Cebadores

SEQ ID NO: 1:

5'-CCACGTGCGCAGCAGGAC-3'

SEQ ID NO: 2:

5'-CCGTCCTGCCCCTTCACCTT-3'

II - Sondas específicas para las mutaciones c.-124 C>T en el prom otor del gen hTERT

SEQ ID NO: 3:

Colorante Yakima Yellow-5'-AGGGCCCGGAGGGGGCT-3'-TAMRA

SEQ ID NO: 4:

FAM-5'-AGGGCCCGGAAGGGGCT-3'-TAMRA

III - Sondas específicas para las mutaciones c.-146 C>T en el prom otor del gen hTERT

SEQ ID NO: 5:

Colorante Yakima Yellow-5'-CGGGGACCCGGGAGGGGT-3'-TAMRA

SEQ ID NO: 6:

FAM-5'-CGGGGACCCGGAAGGGGT-3'-TAMRA

Bibliografía:

1. Hayflick, L. and P.S. Moorhead, The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res, 1961. 25: págs.

585-621.

2. Blackburn, E.H., Structure and function of telomeres. Nature, 1991. 350(6319): págs. 569-73.

3. Greider, C.W., Telomerase is processive. Mol Cell Biol, 1991. 11(9): págs. 4572-80.

4. Szostak, J.W. y E.H. Blackburn, Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors. Cell, 1982. 29(1): págs. 245-55.

5. Gunes, C. y K.L. Rudolph, The role of telomeres in stem cells and cancer. Cell, 2013. 152(3): págs. 390-3 6. Murnane, J.P., Telomere dysfunction and chromosome instability. Mutat Res, 2012. 730(1-2): págs. 28-36.

7. Cesare, A.J. y R.R. Reddel, Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet, 2010. 11(5): págs. 319-30.

8. Kim, N.W., et al., Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994.

266(5193): págs. 2011-5.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Conjunto de cebadores y sondas para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT caracterizado porque comprende los cebadores con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y las sondas con SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

2. Composición para la amplificación e hibridación de ADN mediante PCR en un método in vitro de detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT en una muestra de ADN caracterizada porque comprende el conjunto de cebadores y sondas según la reivindicación 1 además de las disoluciones de reactivos para PCR.

3. Composición según la reivindicación 2, caracterizada porque al menos una sonda con SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6 está presente en la composición en una concentración final de 400 nM a 1600 nM.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizada porque al menos una sonda con SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6 está presente en la composición en una concentración final de 800 nM a 1600 nM.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada porque las sondas con SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5 están presentes en la composición en la concentración final de 250 nM a 500 nM y porque las sondas con SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 están presentes en la composición en una concentración final de 800 nM a 1600 nM.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque las sondas con SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6 están presentes en la composición en las siguientes concentraciones:

i) de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 3, de 400 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 4, de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 5 y de 400 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 6,

o

ii) de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 3, de 800 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 4, de 250 nM a 500 nM de SEQ ID NO: 5 y de 800 nM a 1600 nM de SEQ ID NO: 6.

7. Composición para su uso en un método in vitro de detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT en un sujeto, caracterizado porque comprende al menos una composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 además de una muestra de ADN humano aislada de una muestra biológica humana.

8. Composición para su uso según la reivindicación 7, caracterizada porque el ADN está presente en la composición a una concentración final de menos de 500 ng, menos de 100 ng o menos de 50 ng y más de 1 ng.

9. Kit para su uso en un método in vitro de detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT en un sujeto, caracterizado porque comprende al menos una composición según las reivindicaciones 2 a 6.

10. Kit para su uso según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además al menos una muestra de ADN que contiene la mutación c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT.

11. Método in vitro para la detección de las mutaciones c.-124 C>T y c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT en una muestra de ADN caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) preparación de una composición para la detección tal como se describe en las reivindicaciones 7 a 8, mediante la promoción de un contacto de la muestra de ADN extraída de una muestra biológica, que va a someterse a prueba para detectar la mutación a la que se hace referencia, con una composición para la amplificación e hibridación mediante PCR tal como se describe en las reivindicaciones 2 a 6,

b) amplificación e hibridación del ADN presente en la muestra mediante reacción PCR usando las composiciones según las reivindicaciones 2 a 6,

c) análisis de las curvas de amplificación obtenidas en (b) y verificación de la presencia de amplificación exponencial de una señal de fluorescencia, que corresponde a la positividad para la presencia de la mutación c.-124 C>T y la mutación c.-146 C>T en el promotor del gen hTERT en la muestra bajo análisis.

Método según la reivindicación 11, en el que el ADN se aísla de una muestra biológica seleccionada de orina, plasma, líquido cefalorraquídeo o citología por aspiración de un ser humano.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, en el que la cantidad de ADN en la muestra de ADN de la etapa (a) varía a una concentración final de menos de 500 ng, menos de 100 ng o menos de 50 ng y más de 1 ng.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que en la etapa b) las condiciones de amplificación son tal como sigue:

• 1a fase: 1 ciclo de 10 minutos a 95°C

• 2a fase: 45 ciclos, que comprenden 30 segundos a 92°C, 1 minuto a 60SC, con caída de la temperatura de 0,2°C por ciclo comenzando en el ciclo 25

• 3a fase: 1 ciclo de 1 minuto a 57°C, con adquisición de señales.