ES2294524T3

ES2294524T3 - Determinacion de fracciones libres.

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Publication number: ES2294524T3
Application number: ES04763764T
Authority: ES
Inventors: Joachim Schuhmacher; Christian Kohlsdorfer
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2003-08-16
Filing date: 2004-08-04
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2024-08-04
Also published as: EP1658499A1; DE602004009318T2; US20110143363A1; US7754496B2; ATE374947T1; EP1658499B1; US20070111208A1; DE602004009318D1; WO2005017528A1

Abstract

Procedimiento para la determinación de la fracción libre de una sustancia que comprende: (a) incubación de la sustancia con una suspensión de partículas distintas de eritrocitos que son membranas lipídicas con soporte sólido, en una solución tampón para la determinación de la distribución de la sustancia entre las partículas y dicha solución tampón; (b) incubación de la sustancia con una suspensión de partículas distinta de eritrocitos que son membranas lipídicas con soporte sólido, en plasma para la determinación de la distribución de la sustancia entre las partículas y dicho plasma; y (c) determinación de la fracción libre de la sustancia a partir de las distribuciones determinadas en (a) y (b).

Description

Determinación de fracciones libres.

Campo técnico

La invención se refiere a procedimientos para la determinación de las propiedades farmacológicas de sustancias tales como, por ejemplo, sustancias químicas. La invención se refiere también a procedimientos y kits para el uso en la determinación de la "fracción libre", f_{u}, de compuestos farmacológicamente activos en soluciones acuosas y suero. La invención se refiere también a los procedimientos anteriores en los que se utilizan partículas sólidas recubiertas con un medio lipofílico.

Antecedentes

La cuantificación de la unión a proteína de nuevas entidades químicas es una etapa de selección temprana importante y es de interés fundamental para la estimación de los márgenes de seguridad durante el desarrollo de fármacos.

Los procedimientos utilizados habitualmente para la determinación de la unión a proteína, por ejemplo, ultrafiltración o diálisis de equilibrio, son fácilmente adaptables a un alto rendimiento^{3}, pero en el caso de fármacos lipofílicos, que están fuertemente unidos a proteínas plasmáticas, su uso está limitado debido a la adsorción inespecífica. Debido al hecho de que en los últimos años se observa una tendencia a fármacos más lipofílicos^{4}, está aumentando la necesidad de nuevas técnicas que superen estos problemas y que puedan adaptarse a un alto rendimiento.

Una técnica que se diseñó especialmente para la determinación de la unión a proteína de fármacos lipofílicos está basada en la distribución de fármacos entre plasma y eritrocitos o tampón y eritrocitos, respectivamente^{5}. A continuación, esta técnica se designa como "procedimiento de reparto". Desgraciadamente, la precisión del procedimiento básico es baja en el caso de fármacos altamente unidos a proteína (concretamente, en el caso de fármacos que muestran una alta afinidad por proteínas).

Es conocida una modificación del procedimiento de reparto por el experto en la técnica^{6} que supera esa desventaja mediante la determinación de f_{u} a varias diluciones de plasma mediante regresión lineal. Otra modificación del procedimiento de reparto evita la etapa más crítica en la determinación de f_{u} mediante el reparto, el tratamiento del fármaco en medio exento de proteína^{7}.

Es conocido que el Transil® es una sustancia ampliamente utilizada para la determinación de alto rendimiento de afinidades de membrana en el descubrimiento de fármacos^{9,10}. Un experto en la técnica reconocerá que el Transil® comprende partículas de sílice sólidas que están recubiertas con fosfatidilcolina de yema de huevo.

Recientemente se ha informado de un nuevo enfoque para la determinación de las fracciones libres relativas mediante diálisis de equilibrio utilizando plasma de diferentes especies en cada cámara de diálisis^{16}. Sin embargo, la validación de este enfoque está aún pendiente. Nuestros propios experimentos utilizando este procedimiento para fármacos altamente unidos a proteínas plasmáticas (f_{u} <0,5%) no proporcionó resultados válidos (datos no
mostrados).

La técnica anterior más cercana da a conocer una modificación del procedimiento de reparto que utiliza plasma diluido de diversas especies pero sólo eritrocitos de una sola especie^{8}, evitando así la necesidad de aislar eritrocitos recientes para cada organismo de ensayo individual bajo investigación en estudios de especies cruzadas.

El nuevo procedimiento es un avance de la técnica de reparto de eritrocitos^{8} descrita anteriormente. La etapa que consume más tiempo en este procedimiento es la preparación de los eritrocitos: se obtienen mediante centrifugación de sangre reciente heparinizada y tienen que lavarse tres veces en tampón fosfato isotónico. Además, el lavado de los eritrocitos debe hacerse muy cuidadosamente para evitar la hemólisis. Sin embargo, en algunos casos, no puede evitarse completamente la hemólisis y no pueden excluirse resultados erróneos debidos a la unión de fármacos a hemoglobina. Se evitan todas estas dificultades utilizando membranas lipídicas con soporte sólido. El material está comercialmente disponible y se desarrolló especialmente para determinar afinidades de membrana en formato HTS (sistema de alto rendimiento) (como alternativa a los liposomas)^{9,10}.

Descripción de la invención

A partir del estado de la técnica anteriormente citado, el problema técnico a resolver por la presente invención es proporcionar un procedimiento nuevo y mejorado para la determinación de la fracción libre, f_{u}, de sustancias, siendo susceptible dicho procedimiento de un enfoque experimental de alto rendimiento.

Se resuelve este problema proporcionando un nuevo procedimiento que es una mejora importante del procedimiento de reparto de eritrocitos^{8} anteriormente mencionado. Está basado en la distribución de fármacos entre agua plasmática, proteínas plasmáticas y membranas lipídicas con soporte sólido (por ejemplo, Transil®). Sustituir los eritrocitos por membranas lipídicas con soporte sólido (por ejemplo, Transil®) simplifica la ejecución de los estudios de unión a proteína al repartir drásticamente, y lo hace particularmente adecuado para experimentos de alto rendimiento. Debido al peso específico aumentado del material de soporte, se consigue fácilmente la separación de fases con Transil®. Esta es una ventaja importante sobre el uso de liposomas o material RP-18 utilizado, por ejemplo, en empaquetados de columna HPLC.

Como se menciona anteriormente, es conocido que el Transil® es una sustancia ampliamente utilizada para la determinación de afinidades de membrana en el descubrimiento de fármacos^{9,10}. Sin embargo, la determinación de las afinidades de membrana es muy diferente de la determinación de la fracción libre.

El hallazgo de que los eritrocitos pueden sustituirse por membranas lipídicas con soporte sólido es muy sorprendente a la vista del hecho de que los eritrocitos son estructuras bastante complejas, siendo realmente células vivas que tienen una membrana bicapa lipídica que hospeda una amplia variedad de enzimas funcionales, canales iónicos, receptores y similares.

Es además conocido por un experto en la técnica que la ionización de la superficie de perlas de sílice tiende a tener un efecto sobre las propiedades de unión de dicha partícula^{10}. El hecho de que la inevitable ionización del soporte sólido no afecte negativamente a la determinación de la fracción libre es un hallazgo imprevisto e inesperado.

Además, el hecho de que la distribución del compuesto entre Transil® y el tampón no esté afectada por la presencia de constituyentes plasmáticos es también imprevisto. Sin embargo, esto es un prerrequisito para la aplicación de Transil® en los procedimientos de la invención.

Por las razones indicadas anteriormente, no puede considerarse obvio que las medidas realizadas con membranas con soporte sólido tales como, por ejemplo perlas de Transil®, puedan tomarse como una medida sustitutiva de los experimentos mucho más aparatosos que utilizan eritrocitos aislados recientemente.

Con fines de validación, se seleccionaron compuestos que cubrían un amplio intervalo de lipofilicidades (logP= 1,9 a 5,6) y grandes diferencias en las fracciones libres (0,02% a aprox. 35%). Los resultados de validación muestran un excelente acuerdo en f_{u} determinada mediante el procedimiento de la presente invención, mediante el procedimiento de reparto (utilizando eritrocitos como "fase estacionaria") y mediante ultrafiltración. Las fracciones libres podían determinarse exactamente con diferencias entre los diversos procedimientos menores del 20% incluso en el caso de valores de f_{u} menores de 0,1%. Las diferencias de especie de f_{u} en el caso del fármaco I, el fármaco II y el fármaco IV de la Tabla 2 fueron casi idénticas independientemente de si se determinaban mediante el procedimiento de Transil® o mediante un procedimiento clásico de reparto que utiliza eritrocitos. Por tanto, los resultados muestran que los eritrocitos pueden reemplazarse por membranas lipídicas con soporte sólido. Además, el nuevo procedimiento es aplicable para determinar fracciones libres muy bajas (f_{u} < 0,1%) y muy altas (f_{u} > 5%), dando lugar a un intervalo de aplicación mucho más amplio que los procedimientos actualmente disponibles. Puesto que la precisión y exactitud son comparables independientemente de las fracciones libres muy bajas o muy altas, el procedimiento demuestra ser especialmente adecuado para fármacos lipofílicos fuertemente unidos a proteínas plasmáticas. Para fármacos lipofílicos, la investigación de la fracción libre mediante procedimientos habituales como ultrafiltración o diálisis de equilibrio está limitada, puesto que a menudo los fármacos lipofílicos muestran adsorción no específica al dispositivo de ultrafiltración o a la membrana de diálisis.

Ha de observarse que la etapa más crítica en el caso de los fármacos lipofílicos (que tienden a adsorberse sobre superficies) es la determinación del coeficiente de reparto en el tampón. Sin embargo, como se describe a continuación, la adsorción sobre el material vítreo puede evitarse aceptando una acumulación crítica de fármacos en la fase lipídica. Aunque la precisión del procedimiento puede reducirse si el reparto está lejos de una distribución igual, la exactitud aumenta puesto que se evitan errores sistemáticos. En dichos casos, aumentan las demandas en la validación del ensayo analítico para bajas concentraciones. Por otro lado, los resultados como se obtienen mediante ese procedimiento son mucho más fiables que los obtenidos, por ejemplo, mediante ultrafiltración o diálisis de equilibrio, porque con estos procedimientos los resultados pueden estar sesgados debido a la adsorción sobre el dispositivo de ultrafiltración o sobre la membrana de diálisis. Las fracciones libres comparables obtenidas en el caso del fármaco II de la Tabla 2 utilizando este procedimiento o procedimientos convencionales demuestran que este enfoque proporciona resultados fiables.

En conclusión, los procedimientos de la invención producen resultados válidos tanto con medida de radiactividad como con procedimientos que son más habituales en el descubrimiento de fármacos, como CL-EM/EM. El procedimiento es aplicable para determinar un amplio intervalo de afinidades de membrana y las fracciones libres, pero es especialmente adecuado para el examen de las fracciones libres de fármacos fuertemente unidos a proteínas plasmáticas. El procedimiento puede adaptarse fácilmente a alto rendimiento y es por lo tanto adecuado para la determinación de la unión a proteína durante el descubrimiento de fármacos, así como para la ejecución de estudios de unión a proteína extendidos durante el desarrollo de fármacos. Finalmente, al utilizar Transil® tanto para la determinación de la afinidad de membrana como para la unión a proteína de un fármaco, pueden examinarse simultáneamente los parámetros de entrada más importantes para modelización basada en la fisiología.

Una "suspensión" con el significado de la invención es cualquier mezcla que comprenda partículas sólidas y un líquido.

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Las partículas de Transil® ha de considerarse que son un ejemplo de partículas que tienen características adecuadas. Otras partículas que tienen dichas características adecuadas pueden aplicarse fácilmente a procedimientos de esta invención.

La aplicación se refiere a procedimientos y kits como se describen en las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

Figura 1

Fármaco I de la Tabla 2: Determinación de los parámetros de unión en glicoproteína ácida \alpha1 (AGP) humana tras incubación con concentraciones de fármaco crecientes en una solución de AGP 3,15 \muM. Los datos se ajustaron a la ecuación C_{unido}= n \cdot C_{AGP} \cdot C_{u}/(K_{d}+C_{u}) utilizando Sigma Plot 2.01 (C_{unido}= concentración de fármaco unido, n= número de sitios de unión, C_{AGP}= concentración de AGP en el ensayo, C_{u}= concentración de fármaco no unido, K_{d}= constante de disociación).

Ejemplos Fármacos y reactivos

Se sintetizaron tanto los fármacos no marcados (fármacos I a IV) como marcados con ^{14}C (VI y VII), así como los compuestos de referencia para análisis en el departamento de química de Bayer AG. Los disolventes utilizados fueron de pureza HPLC. Todos los demás productos químicos fueron de pureza analítica.

Se adquirió Transil® (perlas de sílice recubiertas con fosfatidilcolina de yema de huevo) en NIMBUS Biotechnologie GmbH, Leipzig, Alemania). Este material comprende perlas de sílice porosa cubiertas con una membrana liposómica unilamelar unida no covalentemente a la perla. Se suspenden las membranas lipídicas con soporte sólido en tampón fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4). Se proporcionan por el suministrador el contenido lipídico así como el peso seco del lote respectivo. El contenido lipídico de los lotes respectivos utilizados en estos experimentos estaba entre aproximadamente 10 y 65 \mul/ml de suspensión. Para determinaciones en el formato HTS, se utilizaron placas de 96 pocillos con insertos de vidrio extraíbles (0,5 ó 1,5 ml).

Material biológico

Se utilizó plasma de ratón de ratones CD1 macho (Hsd/Win:CD1), plasma de rata de ratas Wistar macho
(Hsd/Win:WU), plasma de perro de perros Beagle hembra y plasma de mono de monos Rhesus hembra. Se obtuvo plasma humano de voluntarios caucásicos sanos. Se obtuvo plasma reunido de al menos 3 individuos después de centrifugación de muestras de sangre heparinizada reciente y se almacenaron a \leq-20ºC hasta su uso.

Estabilidad

Se ensayó la estabilidad de las sustancias de ensayo en plasma de diferentes especies antes de los estudios de unión a proteína.

Determinación de fármacos no marcados

Se realizó la determinación de los fármacos I a V en plasma después de la precipitación de proteínas con acetonitrilo. Se realizó la medida del fármaco IV en plasma mediante análisis de HPLC utilizando el mismo equipo y en condiciones cromatográficas similares a las descritas anteriormente^{8}. Todos los demás fármacos no marcados se analizaron mediante CL/EM-EM en un espectrómetro de masas en serie de triple cuadripolo API 3000 (MDS Sciex, Ontario, Canadá) funcionando en modo de control de reacción múltiple de ión positivo (MRM) utilizando procedimientos similares a los descritos en otro lugar^{11}. Se utilizó un sistema 2300 HTLC (Cohesive Technologies, Franklin, MA) como sistema de HPLC y se hizo funcionar en modo de flujo laminar.

Se realizó la cromatografía utilizando elución en gradiente. Se utilizó un automuestreador CTC HTC PAL (CTC Analytics AG, Zingen, Suiza).

Medida de la radiactividad

Se determinaron las concentraciones de radiactividad mediante procedimientos estándar como se describen
anteriormente^{12}.

Unión a proteína mediante procedimientos clásicos

Se realizaron la ultrafiltración, diálisis de equilibrio y la determinación de la fracción libre de un fármaco mediante distribución entre eritrocitos y plasma como se describe anteriormente^{8,12}.

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Ejemplo 1

Determinación de la unión a proteína mediante distribución entre plasma diluido y Transil®

Se determinó la unión a proteína de todos los fármacos mediante reparto entre plasma diluido y Transil® in vitro. Se realizaron todas las incubaciones en tubos de vidrio. Se utilizó un tampón fosfato de potasio isotónico, pH 7,4 (PBS de Dulbecco, Sigma D8534) para diluir el plasma.

El volumen de incubación total era generalmente de entre 0,3 y 1 ml. Se pipeteó el plasma diluido (150 a 980 \mul) de la especie de ensayo en tubos de vidrio y se añadió Transil® (10 a 300 \mul). Se añadió la sustancia de ensayo disuelta en un pequeño volumen de un disolvente adecuado a las suspensiones de Transil®-plasma.

El grado de dilución y el volumen de Transil® deberían elegirse con respecto al valor de f_{u} esperado. Para compuestos fuertemente unidos, debe considerarse una mayor dilución y/o mayor volumen de Transil® (véase a continuación).

Se incubaron las suspensiones de Transil®-plasma a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio durante 30 minutos. Después de la incubación, se separó el Transil® de la fase acuosa mediante centrifugación a 1.800 g durante 10 min, después de tomar alícuotas de 50 a 100 \mul para determinar las concentraciones reales en las suspensiones de Transil®-plasma.

Se determinó la concentración de radiactividad directamente después de la incubación. Se determinó la concentración de radiactividad (o la concentración de fármaco en el caso de análisis de HPLC o CL/EM-EM) en plasma después de la centrifugación.

Se realizó la determinación del reparto de Transil®/tampón (que es una medida de la afinidad de membrana, AM) de la misma manera. En el caso de altas relaciones de concentración de lípido/tampón (valores de AM_{tampón} > 20.000), se diluyeron las suspensiones de Transil® con tampón fosfato isotónico, pH 7,4 (hasta 20 veces) para evitar pipetear volúmenes menores de 10 \mul.

Ejemplo 2

Estimación de MA_{tampón} y f_{u} en plasma humano

Se calculó una estimación de la afinidad de membrana mediante un enfoque QSAR como se describe en Stahlhofen et al.^{10}. Se estimaron las fracciones libres en plasma utilizando un software con licencia desarrollado en Bayer AG (Como alternativa, pueden utilizarse otros enfoques para obtener las primeras estimaciones para AM y f_{u}, por ejemplo, el log D_{7.4} para la estimación de afinidades de membrana de compuestos neutros y estimaciones de f_{u} basadas en datos experimentales para fármacos de la misma clase de compuestos).

Cálculo de f_{u}

Se calculó la fracción libre en plasma diluido como la relación de los coeficientes de reparto para Transil®/plasma' (AM_{plasma'}) y la distribución Transil®/tampón /(AM_{tampón}).

Se realizó el cálculo de MA_{tampón} como sigue: se obtuvo la cantidad total de fármaco en el ensayo (n_{total}) utilizando la concentración total en la suspensión de Transil®-tampón y el volumen de incubación respectivo (V_{total}), la concentración en el tampón (C_{tampón}) y el volumen de las perlas de sílice (V_{\text{sílice}}), así como el volumen de lípido (V_{\text{lípido}}) según:

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1

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en la que el volumen de las perlas de sílice se obtuvo a partir del peso seco del lote respectivo de Transil® (ps_{Transil®}), el volumen de la suspensión de Transil® añadida (V_{Transil®}), el factor de dilución de Transil® (dil_{Transil®}), el vo-
lumen de lípido (V_{\text{lípido}}), la densidad del gel de sílice (\rho_{\text{sílice}}= 2,1 g/ml) y la densidad de los lípidos (\rho_{\text{lípido}}= 1 g/ml) según la ecuación 2). El peso seco así como el contenido de lípido (k) de los lotes de Transil® respectivos se proporcionaron por el suministrador en el certificado de análisis.

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2

Se calculó el volumen de lípido en el ensayo a partir del contenido de lípido del respectivo lote de Transil® y el volumen y el factor de dilución de la suspensión de Transil® añadida:

3

En un segundo experimento, se determinaron la cantidad total de suspensión de Transil®-plasma y la concentración en plasma diluido, C_{plasma}'. Se calculó el reparto entre Transil® y el plasma diluido (la afinidad de membrana aparente en plasma diluido), AMp_{plasma'} como:

4

Se calculó la fracción libre en plasma diluido (f_{u}') como la relación de los dos coeficientes de reparto:

5

Se calculó después la fracción libre de plasma no diluido a partir de los valores de f_{u} en plasma diluido y el factor de dilución a, como se describe anteriormente^{1} (por ejemplo, a= 0,1 en el caso de plasma diluido 10 veces). Ha de observarse que f_{u}' debería estar por debajo del 50% para evitar una mayor variabilidad en la fracción libre retrocalculada en plasma nativo^{8}.

6

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Ejemplo 3

Cálculo de los volúmenes óptimos de Transil® para nuevos compuestos

Las ecuaciones 1-3 puede redisponerse para calcular el volumen óptimo de Transil® para la determinación de AM para un nuevo compuesto. Los valores de AM_{tampón} calculados y las fracciones libres se utilizan como estimaciones iniciales para el cálculo. Se satisfacen las condiciones de ensayo óptimas si las cantidades de fármaco en equilibrio en la fase lipídica y en el tampón (o plasma) son iguales (n_{tampón} o n_{plasma} o n_{plasma}'= n_{\text{lípido}}= 0,5 \cdot n_{total}) (Stahlhofen et al.^{10}). Por tanto, la expresión (n_{total}/n_{\text{lípido}}-1) en la ecuación posterior es igual a 1 y el óptimo V_{Transil®} óptimo para el reparto Transil®/tampón puede calcularse como:

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7

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El cálculo del reparto de Transil®/plasma es similar al del reparto de Transil®/tampón, sólo que el valor de AM_{tampón} tiene que sustituirse por AM_{plasma}' mientras que sea cierto:

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8

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siendo a el factor de dilución de plasma, por ejemplo, a=0,1 en el caso de plasma diluido 10 veces^{8}.

Ejemplo 4

Dependencia de la concentración de la AM

La distribución es sólo independiente de la concentración de fármaco si la cantidad de lípido es mucho mayor que la cantidad de fármaco en la fase lipídica: contenido de lípido/n_{\text{lípido}} \geq 100 [mol/mol].

Se calcula la relación de contenido de lípido/n_{\text{lípido}} según:

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Mediante la redisposición de la ecuación anterior, puede calcularse la concentración de fármaco máxima que puede utilizarse en una incubación (C_{total' máx}) (suponiendo que el contenido de lípido/n_{\text{lípido}}= 100):

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Se calcula la concentración en tampón o plasma en equilibrio a partir de la concentración añadida realmente (C_{total}) como sigue:

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Se calcula después la concentración plasmática con respecto al plasma nativo a partir de la concentración plasmática en plasma diluido y el factor de dilución a (por ejemplo, a= 0,1 en el caso de plasma diluido 10 veces).

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Ejemplo 5

Comparación de fracciones libres obtenidas con el procedimiento de Transil® frente a las fracciones libres determinadas con otras técnicas

Con fines de validación, se seleccionaron fármacos con un amplio intervalo de propiedades fisicoquímicas. Se calculó que los valores de logP (pH 7,5) eran 3,6, 5,6, 1,9, 2,5, 2,6, 2,6 y 2,1 para los fármacos I a VII, respectivamente. Se determinaron las fracciones libres de los compuestos de validación mediante la distribución de los fármacos entre el plasma diluido y Transil® o mediante el procedimiento de distribución como se describe anteriormente. En el caso del fármaco V, se examinó la unión a proteína mediante ultrafiltración como procedimiento de referencia. Se determinó el reparto entre tampón y Transil® a una sola concentración de fármaco, típicamente a 200 \mug/l. Se realizaron habitualmente las comparaciones utilizando el mismo lote de plasma para evitar diferencias en la unión a proteína debido a la variabilidad de lote a lote.

Se dan en la Tabla 1 un conjunto completo de datos con los valores típicos para los volúmenes de Transil®, el factor de dilución del plasma, las concentraciones de fármaco en la suspensión y en el plasma en equilibrio.

La Tabla 2 resume los resultados obtenidos con fármacos no radiomarcados en plasma de diferentes especies a una concentración total de aproximadamente 200 \mug/l. La fracción libre del fármaco I ascendía a 0,81% y a 0,20% en plasma de rata y humano, determinada mediante el procedimiento de Transil®. Esto valores son cercanos a los determinados con el procedimiento de reparto de eritrocitos (f_{u}= 0,91 y 0,24%, respectivamente). Para el fármaco II altamente lipofílico, se determinaron fracciones libres muy bajas, pero similares, en plasma de ratón, de mono y humano (\sim0,050%). La fracción libre en plasma de rata era algo mayor (\sim0,80%). Los valores de f_{u} determinados mediante el procedimiento de reparto de eritrocitos fueron casi idénticos. En el caso del fármaco III, la comparación de las fracciones libres se realizó sólo en plasma de rata: f_{u} ascendía a 1,62% y 1,49%, determinadas mediante el reparto entre plasma y Transil® o plasma y eritrocitos. Se observó una diferencia de aproximadamente 5 veces en las fracciones libres (humana/de rata) para el fármaco IV. Se determinó que las fracciones libres eran de 4,41 ó 1,09% en plasma de rata y humano, respectivamente, mediante la distribución entre plasma y Transil®. Los correspondientes valores determinados mediante reparto entre plasma y eritrocitos fueron de 4,97 y 0,96%, respectivamente. Como último ejemplo se eligió el fármaco V, un compuesto con una fracción libre muy alta en plasma humano. En ese caso, se obtuvo el valor de referencia para f_{u} mediante ultrafiltración: la fracción libre ascendía a 39,5 y 33,3% en plasma humano, determinada mediante distribución entre plasma y Transil® o mediante ultrafiltración,
respectivamente.

En la Tabla 3, se da un resumen de resultados como se obtienen para dos fármacos marcados con ^{14}C. Se determinaron las fracciones libres a tres concentraciones de fármaco diferentes (n= 3/concentración) en 2 ó 3 días diferentes.

Se realizaron en paralelo los experimentos utilizando Transil® o el procedimiento de distribución de eritrocitos. No hubo diferencias en las fracciones libres en el intervalo de concentración ensayado, y los resultados obtenidos en días diferentes fueron casi idénticos. Por lo tanto, se enumeran los valores medios y errores estándar. En el caso del fármaco VI, se determinaron fracciones libres muy similares en plasma de rata y humano: f_{u} ascendió a aproximadamente 0,02%, determinada mediante reparto entre plasma diluido y Transil®. Los valores respectivos obtenidos con la técnica de reparto de eritrocitos fueron de aproximadamente 0,025 y 0,020% en plasma de rata y humano, respectivamente. En plasma de ratón, la fracción libre ascendió a aproximadamente 0,087%, determinada mediante ambos procedimientos. La fracción libre en plasma de perro ascendió aproximadamente a 0,041 ó 0,034%, determinada mediante el nuevo procedimiento o mediante la técnica de reparto de eritrocitos.

La fracción libre del fármaco VII examinada en plasma de ratón, rata, perro y humano utilizando el procedimiento Transil® ascendió a 2,07, 3,59, 2,07 y 1,11%, respectivamente. Los valores correspondientes utilizando la técnica de reparto de eritrocitos fueron comparables (con valores ligeramente mayores para plasma humano): f_{u} ascendió a 2,60, 3,77, 2,12 y 1,71% en plasma de ratón, rata, perro y humano, respectivamente. En el caso de plasma de perro, la variabilidad de los resultados fue algo mayor de lo habitual (coeficiente de variación: 14-31%), puesto que se utilizó el plasma de perros diferentes para investigar la variabilidad entre días.

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Ejemplo 6

Incubación en placas de 96 pocillos

El ensayo puede adaptarse fácilmente al formato de alto rendimiento como se demuestra por Loidl-Stahlhofen et al.^{9,10} para la determinación de los valores de AM_{tampón}. Para evitar la adsorción de fármacos liofílicos, deberían utilizarse placas de 96 pocillos con insertos de vidrio para todas las incubaciones. Además, se determinan las concentraciones reales en suspensiones de Transil®-tampón para controlar la adsorción. Los resultados pueden aceptarse sólo si la desviación de la concentración está por debajo del 20% de la concentración teórica.

En sílice, pueden utilizarse los valores para AM_{tampón} y f_{u} para ajustar las condiciones experimentales (V_{Transil®} y factor de dilución plasmática) para una precisión óptima. Puesto que estos valores en sílice pueden tener un alto grado de incertidumbre, se sugiere que se realicen incubaciones a 2 volúmenes de Transil® diferentes, de modo que se lleve a cabo al menos una incubación en condiciones aceptables de n_{tampón}/n_{\text{lípido}} (véase a continuación) incluso si la estimación de AM difiere considerablemente del valor verdadero. Además, se recomienda determinar los valores de AM_{tampón} al principio, puesto que los experimentos con plasma pueden diseñarse entonces más exactamente. Despreciar V_{\text{sílice}} y V_{\text{lípido}} en comparación con V_{total} conduce a una versión simplificada de la ecuación 7:

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con

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Se calcula al valor óptimo teórico de V_{Transil®} a partir de la ecuación 12 con n_{tampón}/n_{\text{lípido}}= 1. En el caso de que la AM_{tampón} verdadera sea 5 veces mayor que el valor estimado utilizado para el cálculo de V_{Transil®}, n_{tampón}/n_{\text{lípido}} es aproximadamente 0,2. Como puede observarse a partir de la ecuación 13, dicho caso no tendría un efecto relevante sobre la precisión de la determinación de la AM porque n_{tampón} se determina directamente mediante C_{tampón} y n_{total} es mucho mayor que n_{tampón}. En el otro caso de que la AM_{tampón} sea 5 veces menor que el valor estimado, n_{tampón}/n_{\text{lípido}} es aproximadamente 5, conduciendo a una pequeña diferencia entre n_{total} y n_{tampón} en el denominador de la ecuación 13. Por tanto, la consecuencia es una reducción considerable de la precisión. Por lo tanto, es recomienda realizar la determinación de la AM_{tampón} a un V_{Transil®} adicional que sea aproximadamente 5 veces mayor que el valor calculado para una distribución igual entre tampón y fase lipídica. Se sugiere no tener más de un 70% de la cantidad total en la fase tampón, conduciendo a un límite superior de n_{tampón}/n_{\text{lípido}} de aproximadamente 2,3.

De forma similar, se calcula el V_{Transil®} óptimo para la determinación de la AM_{plasma}' basándose en la f_{u} esperada, la AM_{tampón} medida y el factor de dilución de plasma para el plasma. Se sustituye la AM_{tampón} en la ecuación 12 por AM_{plasma}' como se describe en la ecuación 8. Como puede observarse a partir de la ecuación 8, una subestimación o sobreestimación da como resultado una subestimación o sobreestimación casi proporcional de la AM_{plasma}' en el caso de fracciones libres por debajo del 10%. Por lo tanto, son también válidas para f_{u} las mismas consideraciones con respecto a la precisión como se exponen anteriormente para AM_{tampón}. En consecuencia, el uso de un V_{Transil®} adicional aproximadamente 5 veces mayor está también recomendado para la determinación de la AM_{plasma}'. Como alternativa, el factor de dilución para el plasma puede aumentarse 5 veces o elegirse una combinación apropiada de dilución de plasma y volumen de Transil®.

Se da un ejemplo en la Tabla 4 de un fármaco hipotético con una fracción libre de 0,50% y una AM_{tampón} de 10.000. Aceptando una relación de n_{tampón}/n_{\text{lípido}} de 2,3, se cubre un intervalo de AM_{tampón} con los dos volúmenes de Transil® calculados de 865 a más de 100.000. Para la determinación de la AM_{plasma}', se mantiene el volumen de Transil® constante pero se aumenta 5 veces el factor de dilución, dando como resultado un intervalo de f_{u} cubierto de 0,041 a 5,0%. Ha de tenerse en cuenta que la fracción libre en el plasma diluido debería estar por debajo de aproximadamente un 50% para evitar una mayor variabilidad en los valores retrocalculados^{8}. Esta condición limita el valor superior de f_{u} que puede determinarse (véase la Tabla 4). Por lo tanto, se recomienda calcular el factor de dilución máxima para el plasma redisponiendo primero la ecuación 6 según:

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Para el cálculo del factor de dilución, se utiliza el valor superior de f_{u} (por ejemplo, 10 veces mayor que la fracción libre calculada), como se realiza en el ejemplo mostrado en la Tabla 4. Esto da como resultado un factor de dilución de aproximadamente 0,02. Esta valor se utiliza ahora para el cálculo del volumen óptimo de Transil® para una fracción libre de 0,5%.

Estos ejemplos muestran que, con el procedimiento descrito anteriormente, pueden determinarse los valores de AM_{tampón} y las fracciones libres en formato de alto rendimiento incluso si los valores verdadero y estimado difieren por un factor de 10 en ambas direcciones.

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Ejemplo 7

Determinación de la dependencia de la fracción libre de la concentración

Se realizan típicamente incubaciones en tampón o plasma (diluido) a una concentración de 200 \mug/l para asegurar que la relación de contenido de lípido/n_{\text{lípido}} (véase la ecuación 9) sea superior a 100 y la concentración en el equilibrio con respecto al plasma nativo sea al menos 10 veces menor que la concentración molar de la proteína de unión principal en el plasma. Este procedimiento es habitualmente suficiente durante el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, durante el desarrollo de fármacos, la fracción libre tiene que determinarse adicionalmente a concentraciones mucho mayores como las observadas, por ejemplo, en experimentos toxicocinéticos. Se calcula utilizando la ecuación 10 la concentración máxima que puede utilizarse en la incubación con la precondición de que la relación de contenido de lípido/n_{\text{lípido}} sea de al menos 100. Se calcula después la concentración plasmática en el equilibrio con respecto al plasma nativo según la ecuación 11 y 11a, considerando el factor de dilución del plasma. La Tabla 5 da un ejemplo de dos fármacos hipotéticos con fracciones libres de 0,10% y 0,50%, respectivamente. Los valores de AM_{tampón} se supone que son 50.000 y 10.000, respectivamente. Como puede observarse, la concentración con respecto al plasma nativo puede aumentarse aumentando la dilución de plasma: utilizando plasma no diluido en la incubación, puede alcanzarse una concentración máxima en el equilibrio de 263 \muM, mientras que se obtiene una concentración mucho más alta (393 \muM) utilizando plasma diluido 100 veces. La influencia de la dilución no es tan pronunciada en el caso del fármaco B: la concentración de equilibrio con respecto al plasma nativo aumenta de 263 a 289 \muM. Estos ejemplos demuestran que las fracciones libres pueden determinarse a concentraciones plasmática muy altas ajustando apropiadamente el factor de dilución del plasma. Sin embargo, la influencia del factor de dilución puede ser pequeña para algunas combinaciones de AM_{tampón} y fracción libre (véase el ejemplo B).

Para el fármaco I, se investigó la dependencia de f_{u} de la concentración a glicoproteína ácida \alpha1 (AGP) y se calcularon los parámetros de unión (número de sitios de unión, n, y la constante de disociación K_{d}) (véase la Fig. 1). Se estimó que la K_{d} era 0,069 \muM y n estaba cerca de 1, indicando que la AGP es una proteína de unión importante en plasma humano (suponiendo que la concentración de AGP en el plasma humano es de 16 \muM, la fracción libre calculada a partir de n y K_{d} asciende aproximadamente a 0,43%, siendo la f_{u} medida de 0,20 a 0,24%, véase la Tabla 2). Este ejemplo muestra que el procedimiento como se describe en la presente memoria evalúa correctamente la dependencia de la dosis de f_{u} y es apropiado para la determinación de los parámetros de unión.

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Ejemplo 8

Determinación de AM_{tampón} en casos de fármacos muy lipofílicos

Aunque todas las incubaciones se realizan en tubos de ensayo de vidrio, en algunos casos no puede evitarse la adsorción en incubaciones en que los fármacos se tratan en soluciones exentas de proteína. Esto se detecta por una enorme desviación de la concentración añadida y medida en la referencia. Para unos pocos fármacos, por ejemplo el fármaco II, incluso el uso de tubos silanizados o siliconizados no condujo a una mejora significativa y sólo se encontraron de 20 a 50% de las concentraciones añadidas en la referencia. Para minimizar la adsorción, el siguiente procedimiento ha resultado ser muy útil: habitualmente, los volúmenes de Transil® se ajustan para dar una distribución 1:1 del fármaco entre la fase lipídica y el tampón, como se describe en materiales y procedimientos. Aceptar relaciones de n_{tampón}/n_{\text{lípido}} mucho menores de 1 (por ejemplo, 0,1 ó 0,05) conduce a volúmenes mayores de Transil® calculados por la ecuación 12. Como se indica anteriormente, una relación n_{tampón}/n_{\text{lípido}} pequeña sigue permitiendo una determinación precisa de AM, sin embargo, aumentan los requisitos para la precisión del ensayo a bajas concentraciones. El uso de mayores volúmenes de Transil® tiene un fuerte impacto sobre la concentración máxima de fármaco (C_{total,máx}) que puede utilizarse para incubación según la ecuación 10, pero sin afectar a la concentración de tampón en el equilibrio (ecuación 11). Se da un ejemplo en la Tabla 6 de dos fármacos con afinidades de membrana de 10.000 y 100.000 respectivamente: en condiciones de incubación normales (n_{tampón}/n_{\text{lípido}}= 1), la C_{total,máx} es sólo de aproximadamente 1,2 y 0,12 \mug/ml. Pueden utilizarse concentraciones aproximadamente 5,5 veces mayores aceptando una relación de n_{tampón}/n_{\text{lípido}} de 0,1, que puede aumentarse adicionalmente aproximadamente 2 veces a una relación de n_{tampón}/n_{\text{lípido}} de 0,05. El uso de dichas altas concentraciones de fármaco tiene la ventaja de que los sitios reactivos en los tubos de vidrio se saturan y que se evita la adsorción debido a la fuerte acumulación en la fase lipídica. Con ese procedimiento, se pudo evitar completamente la adsorción incluso para fármacos críticos y determinar resultados fiables. La comparación de las fracciones libres para el fármaco II como se determinan mediante el procedimiento de Transil® o mediante la técnica de reparto de eritrocitos muestra un excelente acuerdo (véase la
Tabla 2).

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Ejemplo 9

Determinación de la f_{u} relativa entre diferentes especies

En muchos casos, es más relevante conocer las fracciones libres relativas entre diferentes especies que los valores absolutos (por ejemplo, exposición en seres humanos y exposición en animales en estudios de seguridad). Las f_{u} relativas pueden calcularse sin determinar la AM_{tampón} como sigue:

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siendo f_{u,1} y f_{u,2} las fracciones libres en la especie 1 y 2 y AM_{plasma,1} y AM_{plasma,2} los respectivos coeficientes de reparto lípido/plasma. En casos en que es necesario determinar la distribución de plasma/lípido en plasma diluido (para fármacos fuertemente unidos), puede obtenerse una aproximación muy cercana de la f_{u,rel} verdadera
mediante:

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siendo a_{1} y a_{2} los factores de dilución para plasma de las especies 1 y 2, respectivamente.

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Las consideraciones referentes a la exactitud y precisión de este procedimiento se han realizado para el procedimiento de reparto de eritrocitos descrito anteriormente^{8}.

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Ejemplo 10

Determinación de las fracciones libres en formato HTS

El siguiente procedimiento está en vigor en nuestros laboratorios para determinar fracciones libres en formato HTS: se determinan en primer lugar las afinidades de membrana en tampón a dos volúmenes de Transil® diferentes utilizando los valores de AM_{tampón} calculados para planear los experimentos descritos anteriormente. Este enfoque asegura que las afinidades de membrana pueden determinarse con certeza en un experimento con buena precisión, incluso si las afinidades calculada y medida difieren en gran medida. Las afinidades de membrana medidas en tampón se utilizan después para diseñar los experimentos en plasma diluido de la especie de interés. De nuevo, se realizan incubaciones con plasma a dos volúmenes diferentes de Transil® y/o a diluciones de plasma diferentes para cubrir un amplio intervalo de las fracciones libres posibles en un experimento.

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Ejemplo 11

Determinación de la fracción libre con unión a proteína no lineal

El procedimiento de Transil® indica también correctamente la no linealidad en la unión a proteína como se demuestra por la unión dependiente de la concentración del fármaco I en soluciones de glicoproteína \alpha1. Los parámetros de unión pudieron determinarse con buena precisión. La dependencia de f_{u} de la concentración en plasma a concentraciones relevantes como se observa, por ejemplo, en experimentos toxicocinéticos, puede realizarse hasta muy altas concentraciones de fármaco, puesto que la distribución de fármacos en las membranas lipídicas no depende de la concentración de fármaco, a condición de que la cantidad de lípidos sea mucho mayor que la cantidad de fármaco en la fase lipídica. La concentración máxima en plasma nativo (considerando el factor de dilución del plasma) que puede alcanzarse sin alterar la distribución de los lípidos depende de la afinidad de membrana y de la fracción libre del fármaco respectivo. Como se muestra anteriormente, puede aumentarse ajustando el factor de dilución del plasma. Ha de observarse que para la evaluación de la dependencia de la concentración de f_{u}, pueden ajustarse los volúmenes de Transil® según la f_{u} que se espera que funcione en condiciones de ensayo óptimas (n_{tampón}/n_{\text{lípido}} \sim1). Como guía general, la unión a proteína se considera que es independiente de la concentración a menos que se dé un exceso de al menos 10 veces de proteínas de unión libres. Suponiendo una unión 1:1 a la proteína para fármacos fuertemente unidos a proteínas plasmáticas (f_{u} <2%), se espera un aumento de 2 veces de f_{u} a una concentración que alcanza el 50% de la concentración de la proteína de unión principal. A una concentración de fármaco que alcanza un 75% de la concentración de proteína, se espera un aumento de aproximadamente 4 veces de f_{u} (véase el apéndice 1). En el caso de unión significativa de un fármaco a diferentes proteínas plasmáticas, aparece un aumento comparable de fracciones libres a concentraciones de fármaco mayores, dependiendo de las concentraciones de las proteínas de unión respectivas y de las constantes de afinidad del fármaco por las
proteínas.

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Ejemplo 12

Determinación de la dependencia del pH de la fracción libre

Como se informa por Loidl-Stahlhofen et al.^{10}, las membranas lipídicas con soporte sólido son estables hasta valores de pH altos. Por lo tanto, la dependencia del pH de la fracción libre, necesaria durante el desarrollo del fármaco, puede controlarse también.

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Ejemplo 13

Estimación del aumento de f_{u} dependiente de la concentración de fármaco en plasma suponiendo unión a una sola proteína

La unión de un fármaco a una proteína puede describirse como sigue:

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en la que C es la concentración de fármaco total, C_{u} la concentración de fármaco no unido, C_{prot} es la concentración total de proteína, n es el número de sitios de unión en la proteína y K_{d} la constante de disociación del complejo proteína-sustancia. Introducir C_{u}= C\cdotf_{u} y redisponer proporciona:

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En el caso de una fracción libre baja, el término (f_{u}-f_{u}^{2}) se aproxima a f_{u} y la expresión K_{d}-(f_{u}-1) se aproxima a K_{d}, por lo tanto la ecuación A2) se simplifica a:

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La concentración de fármaco (C_{x}) a la que se observa un aumento de f_{u} de x veces es entonces:

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Suponiendo al menos un exceso de diez veces de sitios de unión libres en la proteína, K_{d}/f_{u} es igual a n\cdotC_{prot}/(1-f_{u}) \simn\cdotC_{prot} en casos de fracciones libres pequeñas, el porcentaje de concentración de fármaco a concentración de proteína puede expresarse como:

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Por ejemplo, se observa un aumento de dos veces de la fracción libre si la concentración de fármaco es un 50% de la concentración de proteína. O se observa un aumento de x veces de la fracción libre a:

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El error en las ecuaciones A5 y A6 está sólo por debajo de aproximadamente un 10% si la f_{u} en la solución que contiene concentraciones mayores de fármaco está por debajo del 8%.

Se utilizaron las siguientes abreviaturas anteriormente:

C: concentración total de fármaco en una solución de una proteína

C_{u}: concentración de fármaco no unido en una solución de una proteína

C_{prot}: concentración total de proteína en plasma

f_{u}: fracción de fármaco libre (no unido) en una solución de una proteína

K_{d}: constante de disociación del complejo proteína-fármaco

n: número de sitios de unión en la proteína

C_{x}: concentración total de fármaco en una solución de una proteína a la que se observa un aumento de la fracción libre x veces.

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Tabla 1

Se muestra un conjunto completo de datos con los valores típicos para volúmenes de Transil®, factor de dilución de plasma, concentración de fármaco en la suspensión y en plasma en equilibrio. Las fracciones no unidas (f_{u}) de fármaco I en plasma de rata y humano se determinaron mediante reparto entre plasma diluido de la correspondiente especie y Transil®. Se midieron las concentraciones en plasma y tampón mediante CL/EM-EM. Se dan las medias aritméticas de 4-5 determinaciones y los errores estándar (entre paréntesis) (el contenido de lípido utilizado de los lotes de Transil® fue de 9,1 y 12,5 \mul/ml para ratas y hombres, respectivamente, el peso seco fue de 223 y 207 mg/ml, respectivamente).

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TABLA 1

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TABLA 3

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TABLA 5

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TABLA 6

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Abreviaturas
C	concentración total de fármaco en una solución de una proteína
C{u}	concentración de fármaco no unido en una solución de una proteína
C_{prot}	concentración total de proteína en plasma
f_{u}	fracción de fármaco libre (no unido) en una solución de una proteína
k_{d}	constante de disociación del complejo proteína-fármaco
n	número de sitios de unión en la proteína
C_{x}	\begin{minipage}[t]{137mm} concentración total de fármaco en una solución de una proteína a la que se observa un aumento de x veces de la fracción libre \end{minipage}

Referencias

Se considera que las siguientes referencias son relevantes para el objeto de la invención y se han referenciado en el texto por su número:

1. Oldenburg, K. 1995. "Current and future trends in high throughput screening for drug discovery", Ann. Rep. Med. Chem. 33: 301-311.

2. Van de Waterbeemd, H., Gifford, E. 2003. "Adment in silico modelling: towards prediction paradise?" Nature Reviews/Drug Discovery 2: 192-204.

3. Kariv, I., Cao, H, Oldenburg, K. R. 2001. "Development of a high throughput equilibrium dialysis method", J. Pharm Sci. 90: 580-587.

4. Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J., 1997. "Experimental and computational approaches to estimante solubility and permeability in drug discovery and development settings", Adv. Drug Delivery Res. 23: 3-25.

5. Garrett, E. R., Lambert, H. J., 1973. "Pharmacokinetics of trichloroethanol and metabolites and interconversions among variously referenced pharmacokinetic parameters", J. Pharm Sci. 62: 550-572.

6. Garret, E. R., Hunt, C. A., 1974. "Physicochemical properties, solubility, and protein binding of \Delta^{9}-tetrahydrocannabinol". J. Pharm. Sci. 63: 1056-1064.

7. Urien, S., Riant, P., Renouard, A., Coulomb, B, Rocher, I., Tillement, J. P., 1988. "Binding of indapamide to serum proteins and erythrocytes", Biochem. Pharmacol. 37: 2963-2966.

8. Schuhmacher, J., Bühner, K., Witt-Laido, A., 2000. "Determination of the free fraction and relative free fraction of drugs strongly bound to plasma proteins", J. Pharm. Sci. 89: 1008-1021.

9. Loidl-Stahlhofen, A., Eckert, A., Hartmann, T., Schöttner, M., 2001, "Solid-supported lipid membranes as a tool for determination of membrane affinity: High-throughput screening of a physicochemical parameter", J. Pharm. Sci. 90: 599-606.

10. Loidl-Stahlhofen, A., Hartmann, T., Schöttner, M., Röhring, C., Brodowsky, H., Schmitt, J., Kelde- nich, J., 2001. "Multilamellar liposomes and solid-supported lipid membranes (TRANSIL): Screening of lipid-water partitioning toward a high-throughput scale", Pharm. Res. 18: 1782-1788.

11. Schuhmacher, J., Zimmer, D., Tesche, F., Pickard, V., 2003. "Matrix effects during analysis of plasma samples by electrospray and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry: practical approaches to their elimination", Rapid Commun. Mass Spectrom. 17: 1950-1957.

12. Steinke W., Yamashita S., Tabei M., Ahr, H. J., Beckermann, B., Domdey-Bette, A., Göller, G., Schwarz, T., Siefert, H. M., 1996. "Cerivastatin, a new inhibitor of HMG-CoA reductase", Jpn Pharmacol. Ther. 24 (supl. 9): 1217-1237.

13. Van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Jones, B. C., 2001. "Lipophilicity in PK design: methyl, ethyl, futile", J. Comput. Aid Mol. Des. 15: 273-286.

14. Smith, D. A., Jones, B. C., Walker, D. K., 1996. "Design of drugs involving the concepts of drug metabolism and pharmacokinetics", Med. Res. Rev. 16: 279-301.

15. Poulin, P., Theil F. P., 2002. "Prediction of pharmacokinetics prior to in vivo studies. Mechanism-based prediction of volumen of distribution", J. Pharm. Sci. 91: 129-156.

16. Du. A. Y., Sweeny, D. J., Antonian, L., 2002. "Direct measurement of the free fraction ratio for two species comparison of plasma protein binding", Drug Metab. Rev. ABSTR 133: 67.

Claims

1. Procedimiento para la determinación de la fracción libre de una sustancia que comprende:

(a) incubación de la sustancia con una suspensión de partículas distintas de eritrocitos que son membranas lipídicas con soporte sólido, en una solución tampón para la determinación de la distribución de la sustancia entre las partículas y dicha solución tampón;

(b) incubación de la sustancia con una suspensión de partículas distinta de eritrocitos que son membranas lipídicas con soporte sólido, en plasma para la determinación de la distribución de la sustancia entre las partículas y dicho plasma; y

(c) determinación de la fracción libre de la sustancia a partir de las distribuciones determinadas en (a) y (b).

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha suspensión de partículas se selecciona de un grupo de suspensiones que comprende:

(a) una suspensión de partículas que tienen un núcleo sólido;

(b) una suspensión de partículas que tienen un núcleo sólido que comprenden una perla de sílice; y

(c) una suspensión de partículas que comprenden partículas de sílice sólidas que están recubiertas con fosfatidilcolina de yema de huevo.

3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dichas incubaciones de dicha sustancia con dichas suspensiones de partículas están sobre una placa que tiene múltiples cavidades o en una placa de 96 pocillos.

4. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el núcleo sólido es un núcleo sólido ferromagnético.

5. Procedimiento para la determinación de la fracción libre relativa de una sustancia en una primera especie con respecto a la fracción libre de la misma sustancia en una segunda especie, caracterizado porque utiliza membranas lipídicas con soporte sólido que comprende:

(a) determinar la afinidad de membrana en plasma (AM_{plasma}) de dicha sustancia por dicha primera especie,

(b) determinar la afinidad de membrana en plasma (AM_{plasma}) de dicha sustancia por dicha segunda especie,

(c) determinar la fracción libre relativa a partir de los resultados determinados en las etapas (a) y (b).

6. Un kit para uso en cualquiera de los procedimientos 1 a 5, que comprende una placa que tiene múltiples cavidades, una solución tampón, plasma y partículas seleccionadas de un grupo de partículas que comprende:

(a) partículas que tienen un núcleo sólido;

(b) partículas que tienen un núcleo sólido que es una perla de sílice; y

(c) partículas de sílice sólida que están recubiertas con fosfatidilcolina de yema de huevo,

en el que el kit comprende plasma de dos especies diferentes.

7. Kit de la reivindicación 6, en el que se disponen cantidades específicas de partículas dentro de dichas cavidades de dicha placa.