ES2294696T3 - Metodo de purificacion de albumina que incluye una etapa de nanofiltracion, solucion y composicion para uso terapeutico que la contiene. - Google Patents
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Abstract
Método de purificación de albúmina caracterizado por que incluye una etapa que consiste en someter una solución acuosa de albúmina, de concentración 15 g/l a 80 g/l y de pH no inferior a 7, a una nanofiltración en un rango de temperatura que va de 15°C a 55°C.
Description
Método de purificación de albúmina que incluye
una etapa de nanofiltración, solución y composición para uso
terapéutico que la contiene.
La presente invención se refiere a un método de
purificación de albúmina que incluye una etapa de nanofiltración,
una solución y una composición parpara uso terapéutico
conteniéndolo, susceptibles de ser obtenida por el método de la
invención.
La albúmina es una proteína principal del plasma
sanguíneo humana o animal. Los usos clínicos de la albúmina, como
principio activo, requieren su extracción y su purificación, que son
efectuadas clásicamente por métodos conocidos, como las de Cohn
et al (J. Am Chem. Reja., 68,.459,.1946) y Kistler et
al. (Vox Sangre, 7,.1962, 414-424), aplicables
por añadidura a una escala industrial.
EP-A-498 133,
EP-A-1 329.461 y
EP-A-1 329.460 describen soluciones
de albúmina no aseguradas WO-A-9
600.237 y Biologicals 29 (1), 2001, páginas 17-21
describen métodos de purificación de albúmina basados en la
nanofiltración.
Las necesidades de albúmina se elevan, según los
países, en aproximadamente 100-300 kg por millón de
habitantes y es por lo tanto necesario, con fines clínicos,
disponer de una albúmina libre de virus patógenos y todos los
contaminantes, fuentes de enfermedades. Así pues, la seguridad desde
el punto de vista de los virus transmisibles por transfusión está
garantizada por métodos de inactivación viral como la pasteurización
en el estado líquido de una composición de albúmina a 60ºC durante
10 horas en presencia de un estabilizante biológicamente compatible
(caprilato y/o triptofanato de sodio). Esta seguridad a nivel viral
está establecido desde hace más de 60 años y la literatura no
informa de ningún caso de transmisión probada de virus, por ejemplo
de la hepatitis B, A o C, o de VIH. No obstante, algunos autores
mencionaron algunos casos relativos con la presencia, después de
transfusión, de parvovirus B 19 en composiciones de albúmina o
productos derivados de la albúmina. Además se informó de un caso
también de una composición de albúmina que habría inducido la
enfermedad de Creutzfeld-Jacob en una paciente que
sufría un trasplante hepático (Créange A., 1995).
Algunos estudios revelaron una serie de efectos
indeseables que ocurrían posteriormente a una transfusión de
albúmina asignada a la presencia de sustancias de carácter
lipopolisacarídico (pirogenados) presentes en cantidades inferiores
al límite máximo de detección de los métodos reglamentarios, pero
pudiendo aparecer con motivo de la perfusión de grandes volúmenes
de albúmina (intercambios plasmáticos, por ejemplo).
Otros efectos secundarios están unidos a la
presencia de polímeros de albúmina que aparecen durante su
purificación y sobre todo durante la etapa de pasteurización
mencionada anteriormente. Otros - aún están unido a la presencia de
estabilizantes añadidos para impedir una desnaturalización térmica
vinculada a la pasteurización y esto especialmente en pacientes que
presentan un terreno alérgico.
Con el fin de atenuar el riesgo de presencia de
agentes infecciosos transmisibles, se propuso producir una albúmina
llamada "recombinante", según la patente US 6.210.683: el gen
de la albúmina se introduce en una célula-huésped,
levadura o bacteria, a elevado potencial de multiplicación. Esta
célula-huésped producida a su vez de la albúmina en
el medio de cultivo o en su citoplasma. Ésta es enseguida separada
por extracción y purificada. Sin embargo, se detecta a menudo la
presencia de proteínas de la célula-huésped y los
métodos de purificación deben pues ser muy resolutivos, lo que se
hace en general en detrimento del rendimiento. Así pues, el coste
de producción de una albúmina recombinante puede entonces revelarse
demasiado elevado en comparación con el generado para una
producción de albúmina a partir del plasma.
Otra posibilidad para pasar los inconvenientes
mencionados anteriormente, consiste en aplicar técnicas de
filtración en gran medida utilizadas para la retención viral y de
contaminantes químicos, bacteriológicos etc. sobre filtros
calificados para porosidades variables. Se puede citar como ejemplo
la ultrafiltración que se utilizó puntualmente en ausencia de otros
medios de eliminación viral para garantizar la seguridad biológica
de una proteína de extracción, como la hormona de crecimiento (hGH).
La técnica requiere un flujo tangencial y solo se destina a
soluciones proteínas o polipéptidos de un peso molecular inferior o
igual a 65 kDa y a escasa concentración. Esto deja subsistir una
probabilidad de paso de virus debido a la imprecisión de
fabricación de las membranas de filtración. Además se observa un
taponamiento del filtro en funcionamiento frontal consiguiendo un
paro del flujo de filtrado. El taponamiento del filtro es tanto más
rápido en cuanto que la concentración en proteína o
polipéptido
aumenta.
aumenta.
Para aumentar aún más la seguridad viral de
soluciones biológicas, es posible aplicar la nanofiltración, técnica
de elección para la retención de partículas de dimensiones
superiores o iguales a 15-20 nm aproximadamente.
Esta retención de partículas sobre filtros cualificados, se realiza
fácilmente a gran escala para soluciones acuosas o que contienen
disoluciones de baja importancia, péptidos, aminoácidos, iones
minerales o compuestos orgánicos inferiores en aproximadamente 5
kDa.
La nanofiltración de disoluciones de gran tamaño
pudo efectuarse por ejemplo para factores de la coagulación
sanguínea, el factor IX y factor XI. El artículo de
Burnouf-Radosevich et al (Vox Sangre, 67, p.
132-138, 1994 en referencia con Burnouf et
al, Vox Sangre, 57, p. 225-232, 1989 y
Burnouf-Radosevich et al, Transfusión, 22,
p. 861-867, 1992) pone de manifiesto que las
condiciones operatorias de la nanofiltración implican bajos
volúmenes de concentrados de factor IX y de factor XI
(3-4 litros) de los cuales las concentraciones en
proteínas no sobrepasan 1 g/l (respectivamente 0,21 g/l y 0,75
g/l).
Durante el proceso de la nanofiltración, se
produce en efecto una acumulación de las disoluciones de gran
tamaño sobre el filtro, lo que consigue la disminución de la
producción del filtrado hasta el taponamiento completo del
filtro.
Las soluciones técnicas para este taponamiento
que consisten en aplicar una nanofiltración tangencial, aumentando
la presión, para cambiar la dirección de los flujos, no resultan
eficaces ya que éste es progresivo e irreversible. Un desarrollo a
escala industrial se encuentra pues fuertemente comprometido, ya que
requieren la utilización de numerosos filtros y de volúmenes de
soluciones para filtrar muy importantes, lo que genera un coste
prohibitivo y duraciones de producción anormalmente mayores.
Para evitar el fenómeno de taponamiento, una
solución consiste en regular los parámetros
físicos-químico que influyen sobre el rendimiento
de recuperación de la disolución, evitando paso de contaminantes a
través del filtro. Las variaciones de estos parámetros, tales como
la fuerza iónica, la naturaleza de la disolución que debe filtrarse
y el pH de la solución para filtrar, así como las condiciones
operatorias de la filtración, tales como la producción, la presión,
han sido objeto de numerosos estudios. Aquéllas citadas por ejemplo
en las publicaciones científicas de C. Wallis et al, Ann.
Revolución. Microbiol., 33, p. 413-437, 1979 y S.
Jacobs, Methods of Biochemical Analysis, 22, p.
307-350, 1974, ponen de manifiesto que el efecto de
cada parámetro tomado individualmente puede conducir a un aumento o
a una disminución de la eficacia de retención viral y el
rendimiento de recuperación de disoluciones y que la combinación de
varios parámetros no está, de manera sistemática, en favor de una
sinergia de los efectos de mejora de las condiciones de
filtración.
Teniendo en cuenta la importancia que reviste
la albúmina a nivel clínico y de las necesidades crecientes, parece
necesario poner a disposición de los pacientes una albúmina que
presenta un grado de seguridad y tolerancia superior al de las
albúminas actualmente disponibles, optimizando al mismo tiempo las
condiciones de su producción a gran escala. A tal efecto, el
Solicitante pues procuró poner a punto un método de purificación de
la albúmina que comprendía una etapa de nanofiltración de
soluciones de albúmina concentradas que respondían a estos
objetivos. La presente invención tiene por objeto así ofrecer una
solución que corresponda a un buen compromiso entre los dos
criterios que constituyen la eficacia de retención viral y/o de
otras macromoléculas susceptibles de inducir patologías o efectos
secundarios en los pacientes, y el rendimiento de recuperación de la
albúmina, estando la importancia relativa de estos dos criterios en
función de la aplicación deseada.
Por lo tanto, la invención se refiere a un
procedimiento de purificación de albúmina caracterizado porque
comprende una etapa que consiste en someter una solución acuosa de
albúmina, de concentración 15 g/l a 80 g/l y de pH no inferior a 7,
a una nanofiltración en una gama de temperatura que va de 15ºC a
55ºC.
Así, el Solicitante encontró de manera
sorprendente que una combinación juiciosa de los valores del pH, de
la concentración de albúmina, y de la temperatura (por lo tanto de
la viscosidad) de la solución acuosa de albúmina sometida a la
etapa de nanofiltración, permitía alcanzar una optimización eficaz
del rendimiento de recuperación de albúmina y los tasas de
reducción viral, superior al límite fijado por las autoridades de
control (4 log) y de otras macromoléculas no deseables. Se puso de
relieve que la nanofiltración según las condiciones de la invención
permitía la filtración de cantidades superiores a 5 kg de albúmina
por m^{2} de filtro, definiendo así la carga proteica,
optimizándose al mismo tiempo la duración de ésta y la producción
del filtrado. Las soluciones de albúmina nanofiltradas presentan un
grado de seguridad muy elevado frente a contaminantes particulares
de tamaño por ejemplo al menos de 13 nm aproximadamente, por ejemplo
los virus, tales como los virus no envueltos los priones, los
polímeros de albúmina (tetrámeros-decámeros)
generados en etapas de su fabricación o durante la pasteurización a
60ºC, los lipopolisacáridos en micelas, los ácidos nucleicos y las
proteínas incorporadas. Las soluciones acuosas de albúmina así
obtenidas constituyen igualmente un producto intermedio que puede
ser puesto en forma farmacéutica para las aplicaciones clínicas
(véase más adelante).
En el marco de la invención, las soluciones
acuosas de albúmina representan soluciones libres de todos reactivos
aplicados en diferentes etapas clásicas de purificación o
fabricación de la albúmina, tales como, por ejemplo, el
polietilenglicol (PEG), el etanol, las sales orgánicas (caprilato de
sodio etc.) e inorgánicos. Estos diferentes reactivos son
eliminados de la solución de albúmina por tratamientos conocidos,
como la diafiltración, la ultrafiltración, la diálisis etc. Como se
indica anteriormente, la presencia de tales reactivos, ver incluso
las variaciones de su contenido respectivo de una muestra a la otra,
pueden conseguir una eficacia de retención viral y rendimiento de
recuperación de albúmina desfavorable.
Así, el Solicitante encontró además, de manera
sorprendente que la disminución de la fuerza iónica se
correlacionaba con una mejor reducción viral.
Conviene precisar que en el contexto de la
invención, las soluciones acuosas de albúmina sometidas a la
nanofiltración pueden no obstante presentar una fuerza iónica
inferior a un umbral máximo unido, en este caso, al valor del pH
básico máximo permitido. Este valor corresponde típicamente
aproximadamente a 11,5. El ajuste del pH debe en particular
realizarse de modo que la variación de la fuerza iónica generada por
la adición de un ajustador de pH en la solución acuosa de albúmina
sea apenas muy escasa, o incluso desdeñable. Tales ajustadores de
pH serán escogidos preferencialmente entre las bases fuertes de
metales alcalinos, tales como NaOH y KOH, y entre los ácidos
fuertes, tales como HCl, respetando los criterios mencionados
anteriormente. Es además, preferible evitar ajustadores de pH con
base en compuestos orgánicos, tales como bases orgánicas.
Así, a título de ejemplo, cuando las soluciones
acuosas de albúmina requieren un ajuste del pH hasta el valor cerca
de 11,5, efectuado por adición de NaOH 0,5 M, estas soluciones
obtenidas tendrán pues una fuerza iónica de aproximadamente
0,0032.
El método de la invención puede ser puesto en
práctica utilizando todo tipos de dispositivos de nanofiltración
frontal o tangencial, en particular de nanofiltración frontal,
conocidos por el experto en la técnica. Actualmente, los filtros
utilizados tienen un tamaño de poro inferior a 100 nm.
La etapa de nanofiltración según la invención
preferiblemente se efectúa sobre filtros calificados para una
porosidad de al menos 13 nm y representa, por ejemplo, los filtros
nanométricos de porosidad de 15 - 2 ó 20.2.2 nm disponibles en el
comercio, presentándose en forma de membranas dobladas, membranas
planas o fibras huecos. Como ejemplo, puede citar los nanofiltros
en celulosa regenerada como PLANOVA® 15 nm y de superficie 0,01
m^{2} (procedente de en Asahi, Japón, o los filtros a virus PALL
(Estados Unidos de América) otorgados para 20 ó 50 nm.
Se pueden utilizar todas las fuentes de materia
prima de albúmina (producto puro liofilizado, concentrado etc.) y,
en particular, aquéllas resultantes del fraccionamiento del plasma
sanguíneo humano o animal por los métodos de Cohn et al (J.
Am Chem. Reja., 68,.459,.1946) o Kistler et al. (Vox Sangre,
7,.1962, 414-424).
El pH de la solución acuosa de albuminoso se
sitúa preferiblemente en la gama de valores que van cerca de 7,8 en
aproximadamente 11,5, y, de manera más preferida, de 9 a 10,5. los
valores de pH superiores en aproximadamente 11,5 desvirtúan de
manera irreversible la albúmina.
El método de la invención se aplica
preferiblemente con soluciones acuosas de albúmina de concentración
situada en la gama que va de 40 a 60 g/l y en una gama de
temperaturas que van de 30 a 55ºC.
Según la invención, el método puede además
incluir una etapa de adición de una sal o mezcla de sales
farmacéuticamente aceptables en la solución acuosa de albúmina para
obtener una solución de fuerza iónica superior a 0.0032 y,
preferiblemente, situada en la gama que va de 0,01 a 0,55, más
preferencialmente, de 0,01 a 0,3, de manera aún más preferencial,
de 0,05 a 0,15, y, en particular, 0,1 y 0,13. Se utilizan
preferencialmente las sales de metales alcalinas y, en particular,
el cloruro de sodio presente en cantidad confiriendo a la solución
de albúmina una fuerza iónica de 0,15.
Aunque la albúmina conviene como materia prima,
su origen puede sin embargo constituir un factor que juega un papel
sobre el rendimiento de la de la nanofiltración según que contenga
o no de estabilizantes térmicos o que halla sido tratada o no por
el calor (choque térmico o pasteurización). Así pues, la utilización
en el procedimiento según la invención de una albúmina obtenida por
extracción etanólica según Cohn et al o Kistler et al
mencionadas anteriormente, y purificado por cromatografía de
intercambio de iones o afinidad, puede dar lugar a un aumento del
rendimiento de recuperación de la albúmina y/o a una disminución de
la duración de filtración.
La nanofiltración de la solución acuosa de
albúmina puede efectuarse en dos etapas sucesivas sobre
respectivamente dos filtros de porosidad decreciente.
Ventajosamente, estas dos etapas sucesivas se efectúan
respectivamente sobre filtros de porosidad 23 a 50 nm y 15 ó 20
nm.
Cuando filtros PLANOVA® 15 nm y de superficie
0,01 m^{2}, son utilizados, el método de la invención se aplica
a presiones no superiores a 1 bar, estando éste preferiblemente
situado en la gama que va de 0,2 a 0,8 bar.
El procedimiento puede incluir una etapa
posterior de tratamiento específico conocido destinado a hacer que
las soluciones acuosas de albúmina sean apropiadas para distintos
usos terapeúticos de acuerdo con la Farmacopea europea, tal como su
ajuste al pH fisiológico dado el caso, para la isotonía en el caso
de una inyección intravenosa y a una concentración salina
fisiológicamente aceptable, y/o de condicionamiento por ejemplo bajo
forma líquida o liofilizada.
La invención se refiere también a una solución
acuosa de albúmina viralmente asegurada susceptible de ser obtenida
por la aplicación del método de la invención, en la cual los lugares
de transporte y fijación de principios activos terapéuticos de la
albúmina están disponibles. Esta solución de albúmina se caracteriza
además, porque está exenta de macromoléculas de un constante de
sedimentación, según Svedberg PH et al (Ultracentrifüg, 7.o
edición, ED Steinkopff, Dresde, 1940), superior a 7 S (o sea de masa
molecular alrededor de 160 kDa). En particular, esta solución de
albúmina contiene a lo sumo un 1% de polímeros de albúmina de
importancia inferior a 100 nm, preferiblemente inferior a 20
nm.
La invención se refiere además a una composición
de albúmina parpara uso terapéutico obtenida por un tratamiento de
adaptación de la dicha solución de albúmina según la invención para
un uso clínico.
La protección, obtenida para estas composiciones
de albúmina para uso terapéutico permite suprimir la etapa de
pasteurización fuente de inconvenientes enumerados más arriba y en
consecuencia la adición de estabilizantes habituales de protección
contra los efectos térmicos, que se fijan además en los sitios de la
albúmina impidiendo por lo tanto a la albúmina fijar moléculas de
interés. La albúmina de estas composiciones según la invención
conserva pues su potencial de fijación y transporte de distintos
principios activos y reduce por esta conexión su toxicidad o
aumenta la biodisponibilidad por un efecto retraso.
Se pueden igualmente citar otras aplicaciones
para las cuales las composiciones de albúmina según la invención
pueden proponerse:
- estabilización frente a la desnaturalización y
la oxidación de proteínas de escasa concentración (inferior al g/l)
y elevada actividad específica, tales como el factor VIII, el factor
von Willebrand y su equivalente recombinante, de immunoglobulinas
específicas, anticuerpos monoclonales, vacunas (virales,
bacterianos, proteicos, ADN), de alergenos para la detección de
alergias en pacientes sensibles, de citoquinas o incluso de hormonas
peptídicas;
- excipiente para medio de propagación e
incubación para las fecundaciones "in vitro" de ovocitos
humanos; y
- proteínas estándar testigo para servir de
placebo en los estudios clínicos.
La invención se comprenderá mejor con ayuda de
los ejemplos que siguen, en referencia a los dibujos anexados,
sobre los cuales:
- la figura 1 es una ilustración de un
dispositivo de aplicación del método de la invención, y
- las figuras 2 a 6 son trazados de las
variaciones de la producción instantánea de filtración (ml/min) en
función de la duración de nanofiltración, obtenidos en función de
distintos parámetros.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Un dispositivo de filtración 1 que incluye un
filtro PLANOVA® 15 nm y de superficie 0,01 m^{2} (procedente de
Asahi, Japón) está equipado de tubos 10, 11 a la salida del
concentrado (solución antes de la filtración) y a la entrada y
salida de filtrado (solución después de filtración), en materiales
compatibles a nivel farmacéutico, con diámetros cerca de 5 mm.,
cerrados por pinzas para pinzar. El dispositivo se coloca sobre un
pedestal (no representado) en posición vertical con ayuda de
pinzas.
La entrada del filtro de 15 nm es conectada, por
el tubo 10, a un recipiente presurizable 12 cuya presión se mide
gracias a un manómetro numérico 13 conectado sobre el circuito hacia
arriba del filtro.
Antes de la utilización, se aplica una prueba de
integridad sobre el filtro de 15 nm según el procedimiento definido
por el fabricante: "prueba de fuga al aire durante la prueba de
integridad pre y post filtración de los filtros PLANOVA® 15,.35,.75
nm".
Se procede a continuación al enjuague de la
instalación. Para tal efecto, la entrada de aire comprimido 14 se
conecta sobre el tanque presurizable 12 lleno de un volumen de cerca
de 100 ml de NaCl a 9 g/l. El frasco se presuriza progresivamente
hasta obtener 0,5 bar a la entrada del filtro de 15 nm. El filtro de
15 nm es llenado purgando el aire por la salida de concentrado, sin
llenar el exterior de las fibras que constituyen el filtro. La
salida baja está abierta y se conecta a una célula de detección 15
de medida de la densidad óptica conectada a un registrador 16,
permaneciendo la alta salida filtrada permaneciendo pinzada.
El filtrado de enjuague se recoge en un
recipiente 17 sobre una balanza 18 conectada y controlada por un
microordenador 19 que registra el aumento de peso del filtrado, lo
que permite seguir la producción instantánea de filtración. El
tiempo necesario para filtrar un volumen mínimo de 40 ml a 0,5 bar
se mide, luego y de ello se deduce la producción media en ml/min.
El montaje es despresurizado progresivamente y todas las salidas son
pinzadas. Según la temperatura deseada de la nanofiltración, la
instalación puede colocarse a temperatura ambiente (alrededor 20ºC)
o en una estufa cuya temperatura de utilización esté comprendida
entre 25 y 60ºC.
Se utiliza como soluciones acuosas de albúmina
de referencia, soluciones a 20 g/l, con pH 7, que comprenden NaCl a
9 g/l. Utilizada la materia prima de albúmina, tenida en cuenta A,
excepto para los ejemplos 6 y 9 en lo sucesivo, es la obtenida por
fraccionamiento del plasma humano según Kistler et al que
haya sufrido a continuación un tratamiento de eliminación del
alcohol, diafiltración y concentración por ultrafiltración.
Conviene precisar que el fraccionamiento arriba de diversas fuentes
de plasma conduce generalmente a una albúmina, cuyas
características pueden variar debido a la naturaleza biológica de la
materia prima. Por lo tanto, ésta puede pues influir sobre la
duración de la nanofiltración, el rendimiento etc.
Se preparan soluciones acuosas de albúmina que
deben filtrarse, a partir de soluciones de referencia de más
arriba, por modificación de sus características tales como la
concentración, el pH y la fuerza iónica. Sus volúmenes se ajustan
de tal modo que obtengan las cargas proteicas requeridas. Según los
ejemplos, las concentraciones en albúmina varían de 15 g/l a 80
g/l. El ajuste del pH es efectuado por adición de NaOH o de HCl 0,5
M y el de la fuerza iónica, por adición de cloruro de sodio. Todas
las soluciones de albúmina son enseguida prefiltradas sobre filtros
de 0,2 um disponibles en el comercio.
Una vez es terminada la filtración de un volumen
predeterminado de albúmina, la entrada del filtro es cerrada. Un
volumen de agua purificada para inyección (PPI) de enjuague se
introduce en el tanque 12 vuelto a poner bajo presión y se purga
el filtro. El filtrado se recoge hasta disminución sensible de la
densidad óptica seguida sobre el registrador 16. El circuito hacia
abajo se purga a continuación con el fin de recoger el final del
filtrado.
La toma de muestras se efectúa sobre el filtrado
y se someten a controles analíticos posteriores, tales como las
dosificaciones en polímeros, el título viral etc. Se mide también la
duración de filtración necesaria de un volumen de solución de
albúmina de tal manera que se obtenga una carga proteica fijada y el
rendimiento de filtración representado por el cociente entre la
cantidad en albúmina del filtrado y la del retenido.
Después de la utilización, se aplica una prueba
de integridad sobre el filtro de 15 nm según el procedimiento
definido por el fabricante: "prueba de fuga con aire durante la
prueba de integridad pre y post filtración de los filtros PLANOVA®
15,.35,.75 nm".
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se efectúan dos pruebas preliminares destinadas
a evaluar la viabilidad de la nanofiltración, en términos de carga
proteica, de duración y rendimiento, cuando ésta es aplicada con
soluciones de albúmina A (ejemplo 1), filtradas a 20ºC y bajo una
presión de 0,5 bar. Se preparan algunos volúmenes de soluciones A
para una carga proteica de 0,5 kg/m^{2} y 1 kg/m^{2}. Los
resultados se muestran en la Tabla 1.
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Estos resultados ponen de manifiesto que según
las condiciones fijadas, la nanofiltración de soluciones de
albúmina A permite una carga proteica de 1 kg/m^{2} sin
taponamiento del filtro, y con un excelente rendimiento. Se observa
también que el hecho, de duplicar la carga proteica no implica una
duración de la nanofiltración dos veces más
importante.
importante.
Los resultados de estas pruebas incitaron al
Solicitante a prever la nanofiltración de soluciones de albúmina de
tal modo que se obtengan cargas proteicas más importantes
optimizando cuando corresponda ciertos parámetros que influían
sobre ésta.
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Ejemplo
3
La influencia del pH de las soluciones de
albúmina sobre las duraciones de filtración y los rendimientos para
obtener una carga proteica de 4 kg/m^{2} se establece
considerando, como materia prima, un lote de albúmina A. Cinco
soluciones de albúmina a 40 g/l, tenidas en cuenta A1 con A5, se
prepara en una solución de NaCl a 9 g/l luego respectivamente
ajustadas a un pH de 5,.7,.9, 9,5 y 10 por soluciones de HCl 0,5 M o
de NaOH 0,5 M, y son sometidas a una nanofiltración. Las pruebas de
nanofiltración se efectúan a 20ºC bajo una presión de 0,5 bar. La
figura 2 muestra las curvas de producción de filtración (ml/min) en
función de la duración de la nanofiltración para cada una de las
soluciones en cuestión.
El análisis de estas curvas pone de manifiesto
que para la solución A1 (pH 5), se produce una disminución rápida
de la producción y, por lo tanto, un taponamiento del filtro. Para
las soluciones A2 y A3, se constata una disminución de la
producción inicial más rápida para la solución A3, pero con
variaciones totalmente aceptables, sin la observación de un
taponamiento después de más de 25 horas de filtración. Los mejores
resultados se obtienen para las soluciones A4 y A5, es decir, a pH
9,5 y 10, con producciones iniciales respectivas más elevadas y
duraciones de filtración más escasas que para las de las soluciones
A2 y A3, pre4sentando la solución A4 una producción inicial
más
óptima.
óptima.
Ejemplo
4
En este ejemplo, el efecto conjunto del pH y la
temperatura de tal manera que obtenga una carga proteica de 4
kg/m^{2} se prueba sobre las soluciones A3 y A4, definidas en el
ejemplo 3, a 20ºC y a 30ºC. Las pruebas de nanofiltración se
efectúan bajo una presión de 0,5 bar. Las duraciones de filtración
así obtenidas se indican al Cuadro 2. La figura 3 reúne las curvas
de producción de filtración (ml/min) en función de la duración de
la nanofiltración para cada una de las soluciones en cuestión.
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A 30ºC, se obtienen las duraciones de filtración
más escasas con curvas de producción prácticamente superponibles
(soluciones A3 y A4) sin la observación de un taponamiento
progresivo del filtro. A 20ºC, las producciones de filtración son
un poco más bajas que a 30ºC.
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Ejemplo
5
Este ejemplo está destinado a mostrar la
influencia conjunta de la concentración en albúmina y de la
temperatura sobre la nanofiltración para obtener una carga proteica
de 8 kg/m^{2}, analizando las duraciones de filtración obtenidas
(Cuadro 3) y las curvas de producción (figura 4). Para esta serie de
pruebas, se considera las soluciones A4 (40 g/l), A6 (60 g/l) y A7
(80 g/l), todos tres incluyendo NaCl a 9 g/l, pH 9,5, que son
sometidas a continuación a una nanofiltración efectuado bajo una
presión de 0,5 bar.
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El análisis de los resultados de la tabla 3 y de
la figura 4 pone de manifiesto que se puede cargar el filtro por 8
kg/m^{2} sin taponamiento. En particular, las condiciones óptimas
de filtración se obtienen para la solución A4 a 30ºC. Para la
solución A6, la producción inicial de filtración a 30ºC es mayor que
a 20ºC con una duración de filtración más larga. Estos resultados
pues llevado a considerar para la solución la más concentrada A7
una temperatura de nanofiltración de 20ºC. Por consiguiente, la
duración de filtración es la más larga y la producción inicial
más
baja.
baja.
Ejemplo
6
Tres pruebas de nanofiltración son efectuadas
con soluciones preparadas a partir de dos materias primas de
albúmina diferentes. La primera representa la albúmina A y la
segunda, la albúmina A purificada por cromatografía sobre columna
intercambiadora de iones (denominada A'). Para esta serie de
pruebas, se consideran las soluciones A4 y A6 del ejemplo 5, y A' 1
(60 g/l, NaCl a 9 g/l, pH de 9,5) que se someten a continuación a
una nanofiltración efectuada a 20 y 30ºC, bajo una presión de 0,5
bar de tal modo que obtenga una carga proteica de 8 kg/m^{2} La
tabla 4 muestra las duraciones de filtración y el rendimiento. La
figura 5 muestra las curvas de producción de filtración (ml/min) en
función de la duración de la nanofiltración para cada una de las
soluciones
consideradas.
consideradas.
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La duración de la nanofiltración para A' 1 es la
más corta. Sin embargo, cuando se opera con la solución A4, se
obtiene la producción inicial más óptima.
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Ejemplo
7
El efecto de la variación de la fuerza iónica de
soluciones de albúmina sobre las duraciones de filtración y los
rendimientos se estudia para tres soluciones de albúmina A con 40
g/l, respectivamente preparadas en agua purificada para inyección
(solución A8), en una solución de NaCl a 9 g/l (solución A2; fuerza
iónica 0,15) y de NaCl a 30 g/l (solución A9; fuerza iónica 0,5),
estando todos tres a pH 7. Las pruebas de nanofiltración se
efectúan a 20ºC bajo una presión de 0,5 bar, de tal modo que se
obtiene una carga proteica constante de 4 kg/m^{2}. Los
resultados obtenidos se reúnen en la tabla 5.
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El mejor resultado en términos de máximo
aprovechamiento de la duración de filtración y el rendimiento se
obtiene para una fuerza iónica de 0,15, cerca de la correspondiendo
a la isotonía. Este resultado es confirmado por un seguimiento del
aumento de peso filtrado que permite el trazado de las variaciones
de la producción de filtración (ml/min) en función de la duración
de la nanofiltración de las soluciones estudiadas (Figura 6). En
este ejemplo, se constata que el aumento de la concentración en NaCl
hasta 30 g/l no disminuye el tiempo de filtración.
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Ejemplo
8
Este ejemplo está destinado a ilustrar la
influencia de las variaciones de la carga proteica y la presión de
la nanofiltración sobre la duración de filtración y los rendimientos
en productos obtenidos. A tal efecto, se consideran las dos
soluciones de albúmina A (Ejemplo 2) y A2 (pH 7). Los resultados
figuran en la tabla 6.
Estos resultados indican que para las soluciones
A y A2, un aumento de la presión genera duraciones de filtración
más elevadas y esto a pesar del hecho de que la solución A sea menos
concentrada que la solución A2. Los resultados obtenidos para las
soluciones A2 ponen de manifiesto que los filtros PLANOVA® 15 nm
presentan una capacidad o carga proteica de 4 kg/m^{2} y que un
aumento de presión no disminuye el tiempo de filtración.
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Ejemplo
9
Este ejemplo está destinado a mostrar la
posibilidad de aplicación de la nanofiltración a escala industrial
utilizando filtros PLANOVA® 15 nm de 1 m^{2} de superficie. La
albúmina utilizada es obtenida por fraccionamiento según el método
de Kistler et al y la hace de calidad terapéutica por
calentamiento a 60ºC durante 10 h en presencia de un estabilizante
adecuado, según las exigencias de la Farmacopea europea. La albúmina
B así obtenida se mezcla a continuación en un tampón que incluye:
0,01 M de citrato trisódico, 0,12 M de gly, 0,016 M de
L-lisina, 0,001 M de cloruro de calcio y 0,17 M de
cloruro de sodio, cuyo valor de pH es 7-7,5. La
concentración final de las soluciones de albúmina es de 20 g/l. Se
someten distintas soluciones así obtenidas, después de ser
prefiltradas sobre filtros de 0,2 Pm, a una nanofiltración descrita
en el ejemplo 1, con una temperatura ambiente y bajo una presión
de 0,5 bar. Los volúmenes de solución B percolados a través del
filtro son determinados de tal modo que se obtiene una carga
proteica de 120 g/m^{2}. Las mismas pruebas de nanofiltración se
efectúan considerando filtros de 0,01 m^{2}. La tabla 7 reúne los
resultados de duraciones de filtración y rendimiento obtenidos para
los dos filtros, y éstos constituyen los valores medios de 3
pruebas.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que
la utilización de filtros de 1 m^{2} de superficie conduce a una
duración de filtración más escasa con relación a la obtenida con
filtros de 0,01 m^{2} de superficie pero con una muy ligera
reducción del rendimiento de filtración.
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Ejemplo
10
Las mismas soluciones B y condiciones
operatorias del ejemplo 9 son retomadas con el fin de medir la
reducción del tipo de polímeros después de la nanofiltración (Tabla
8).
Conviene señalar que el tratamiento de
pasteurización de la albúmina genera polímeros cuyo tasa sigue
siendo no obstante inferior al límite del 5% preconizado por la
Farmacopea europea (4.o edición, capítulo "Solutión de albúmine
humaine", página 642). Las pruebas de nanofiltración efectuadas
sobre las dos superficies de filtros en cuestión, permiten la
reducción de la tasa de polímeros de un factor de aproximadamente
10 en los dos casos.
Ejemplo
11
Con el fin de mostrar la influencia de la
variación de las condiciones operatorias de aplicación de la
nanofiltración (superficie del filtro, presión y temperatura) y los
parámetros físicos-químico de soluciones de albúmina
(pH, composición del tampón) sobre la tasa de reducción viral, se
introdujeron algunos virus en distintas soluciones de albúmina A
(20 g/l) que se sometieron a continuación a pruebas de
nanofiltración. Las pruebas se efectúan infectando las soluciones
de albúmina por el virus bacteriófago Phi- X 174, cuyas suspensiones
se realizan según la norma AFNOR NFT 72-181
(diciembre de 1989). Este virus constituye un buen marcador del
filtro de 15 nm, siendo su tamaño comprendido entre 25 y 30 nm, lo
que corresponde a los virus no envueltos transmisibles al hombre
como el parvovirus B19 cuya inactivación por pasteurización no es
satisfactoria.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Tabla 9.
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El análisis de estos resultados muestra para las
variaciones de las condiciones operatorias que:
- la única variación de la superficie del filtro
y la de la temperatura, cualquiera que sea la solución de albúmina
en cuestión, no tienen casi influencia sobre la tasa de reducción
viral;
- un aumento de la presión de 0,5 bar a 1,0 bar
tiene una influencia desfavorable sobre la tasa de reducción viral
que sigue siendo no obstante elevado (>4 log).
Las variaciones de los parámetros
físicos-químico de las soluciones de albúmina A
ponen de manifiesto que:
- la presencia de un detergente (Tween® 80) y de
un compuesto no iónico (la sacarosa), y una variación del pH, no
tienen casi influencia sobre la tasa de reducción viral;
- en cambio, la sustitución del NaCl por una sal
bivalente, el sulfato de sodio, tiene una influencia negativa sobre
este tasa que se vuelve inferior al límite autorizado por las
autoridades de control. El mismo fenómeno se observa cuando se
aumenta la concentración en NaCl (de 0,15 M a 0,3 M) aunque la tasa
de reducción sea satisfactorio.
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Ejemplo
12
Las propiedades de la albúmina A nanofiltrada,
sin estabilizante, en el transporte y la fijación de medicamentos,
se estudiaron comparándolos con las obtenidas para dos lotes
diferentes de albúmina A pasterizada en presencia de caprilato de
sodio.
Se dispone, para tal efecto, de tres soluciones
A4 (ejemplo 3) en donde uno es nanofiltrada en las condiciones de
la invención. Éstas se ponen a continuación en forma farmacéutica en
un tampón fosfato 0,07 M, pH 7,4, de tal modo que obtengan
composiciones de albúmina, tenidas en cuenta A' 4, A''4 y A'''4, de
concentración de 2,5 g/l. Las composiciones de albúmina A''4 y
A'''4, no nanofiltradas, se pasterizaron respectivamente en
presencia de caprylato de sodio. Se toma una muestra de 1 ml de cada
una de las composiciones y allí se añade respectivamente un volumen
comprendido entre 10 ul y 1000 ul de una solución alcohólica madre
de [^{14}C]warfarina y de [^{14}C] diazepam a 0,1 M, dos
principios activos de la clase respectiva de los anticoagulantes y
neurotropos, de tal modo que se obtengan concentraciones variables
en estos principios activos en las composiciones de albúmina en
cuestión. Se homogeniza el conjunto a continuación.
El estudio de las propiedades de la albúmina en
la fijación de los dos principios activos aquí arriba se basa en la
metodología de la diálisis con equilibrio, conocida del experto en
la técnica, cuyo principio se resume a continuación. Se obtiene un
dispositivo de diálisis que implica una célula con dos
compartimentos separados por una membrana de diálisis conveniente.
Se introduce un volumen V de una mezcla albúmina/principio activo
en el compartimiento 1 y en el compartimiento 2, se introduce el
mismo volumen V de tampón de diálisis (tampón fosfata mencionado
anteriormente). Una vez alcanzado el equilibrio, al cabo de algunas
horas, el compartimiento 1 incluye el principio activo no unido y
aquel unido a la albúmina y el compartimiento 2, el principio
activo no unido. Se toman algunas muestras de cada compartimiento 1
y 2 y la radiactividad es medida por centelleo líquido. Estas
medidas permiten determinar las concentraciones respectivas como
principios activos unidos y no unidos a la
albúmina.
albúmina.
La tabla 10 da los resultados de los tasas
[^{14}C]diazepam unido a la albúmina obtenidos
considerando respectivamente las composiciones A' 4, A''4 y A'''4
en las cuales se añadieron algunos volúmenes crecientes como
principio activo. La tabla 11 presenta los resultados obtenidos en
que considera la [^{14}C]warfarina en lugar de
[^{14}C]diazepam. Los resultados representan el valor medio
de 5 pruebas.
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Los resultados ponen de manifiesto que más la
concentración en [^{14}C]diazepam aumenta en la composición
de albúmina A' 4, más la tasa de [^{14}C]diazepam unido a
la albúmina disminuye. Esto pone en evidencia la presencia en la
albúmina de un lugar o unión saturable y de una unión no
saturable.
El aumento de la concentración en
[^{14}C]diazepam en las composiciones de albúmina A''4 y
A'''4, conduce a tasas [^{14}C] de diazepam unido a la albúmina
sensiblemente constantes. El lugar de fijación definido para la
albúmina A nanofiltrada sin estabilizantes de la composición A' 4 no
es pues más funcional porque es ocupado por el
estabilizante.
estabilizante.
Los resultados indicados en este cuadro ponen de
manifiesto que los tasas de [^{14}C]warfarina unido a la
albúmina varían en función del aumento de la concentración en
[^{14}C]warfarina en las tres composiciones de albúmina en
cuestión. El lugar de fijación de la albúmina no es entonces
saturado por el estabilizante.
La comparación de los resultados que figuran en
los Cuadros 10 y 11 demuestra que la albúmina se comporta
diferentemente frente a los medicamentos en cuestión. Esto se
explicaría por la estructura de los medicamentos en cuestión en
relación con la configuración de los lugares de fijación de la
albúmina. Estos estudios permitieron igualmente determinar las
distintos constantes de unión (Ka) de los dos medicamentos sobre las
distintas albúminas A' 4, A''4 y A'''4, que figuran en la tabla
12.
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Ejemplo
13
La capacidad de estabilización del factor von
Willebrand (fvW) por la albúmina nanofiltrada fue evaluado por
pruebas de calentamiento en seco del fvW a 80ºC durante 72 horas.
Sobre la base de pruebas preliminares, se encontró que la adición
de una mezcla de excipientes juiciosamente elegidos tal como glicina
y arginina, a una solución de fvW, permitía su estabilización
durante el calentamiento en seco (80ºC, 72 horas). Aunque la
actividad del fvW (fvW:Ag) se conservaba (>82%, con relación al
fvW no calentado), su perfil multimérico en cambio no se mantenía,
lo que era observado por la desaparición de multímeros de altos
pesos moleculares (>10), responsables del efecto terapéutico
del fvW.
Para atenuar este inconveniente, se prepararon
tres soluciones de 1 g/l de fvW en presencia glicina y arginina, y
de albúmina nanofiltrada A para uso terapéutico. Las características
de las soluciones así obtenidas, A10, A11 y A12, figuran en la
tabla 13.
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Éstas se someten a continuación a una
liofilización (45 \pm 3 h) y a un calentamiento en seco definida
más arriba. Después del calentamiento, la adición de agua
purificada para inyección (PPI) en los residuos secos, permite
reconstituir las soluciones A11-A12. Se procede con
el análisis de los siguientes parámetros: aspecto de la solución,
tiempo de disolución, actividad del fvW y perfil multimérico, medido
por electroforesis. La tabla 14 presenta los resultados
obtenidos.
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Estos resultados indican que la presencia de
albúmina no sólo no induce efecto negativo sobre la estabilización
al calentamiento del fvW, lo que se traduce en un aspecto límpido de
la solución (sin partículas observables), un tiempo de
solubilización muy escaso y sobre todo, la conservación de la
actividad del fvW, pero que permite también conservar la integridad
sus de multímeros de altos pesos moleculares.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante tiene por objeto solamente ayudar al lector y no forma
parte del documento de patente europeo. Aunque el mayor cuidado se
concedió a su concepción, errores u omisiones no pueden excluirse y
la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
\bullet EP 498133 A [0002]
\bullet EP 1329461 A [0002]
\bullet EP 1329460 A [0002]
\bullet WO 9600237 A [0002]
\bullet US 6210683 B [0006]
\bulletCOHN et al. J. Am.
Chem. Soc., 1946, vol. 68, 459 [0002][0022]
\bulletKISTLER et al. Vox
Sang, 1962, vol. 7, 414-424
[0002][0022]
\bulletBiologicals, 2001, vol.
29 (1), 17-21 [0002]
\bulletBURNOUF-RADOSEVICH et al. Vox
Sang, 1994, vol. 67, 132-138 [0009]
\bulletBURNOUF et al. Vox
Sang, 1989, vol. 57, 225-232 [0009]
\bulletBURNOUF-RADOSEVICH et al.
Transfusion, 1992, vol. 22, 861-867
[0009]
\bullet C. WALLIS et al. Ann.
Rev. Microbiol, 1979, vol. 33, 413-437
[0012]
\bullet S. JACOBS. Methods of
Biochemical Analysis, 1974, vol. 22,
307-350 [0012]
\bulletSVEDBERG PH et al.
Ultracentrifüg. 1940 [0030]
\bullet solution d'albumine humaine.
Pharmacopée européenne. 642 [0061]
Claims (23)
1. Método de purificación de albúmina
caracterizado porque incluye una etapa que consiste en
someter una solución acuosa de albúmina, de concentración 15 g/l a
80 g/l y de pH no inferior a 7, a una nanofiltración en un rango de
temperatura que va de 15ºC a 55ºC.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la nanofiltración se efectúa sobre un
filtro calificado para una porosidad de al menos 13 nm.
3. Método según una de las reivindicaciones 1 y
2, caracterizado porque el pH de la solución acuosa de
albúmina se sitúa en la gama de valores que van de 7,8 a 11,5, y,
preferiblemente, de 9 a 10,5.
4. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque incluye además
una etapa de adición de una sal o mezcla de sales farmacéuticamente
aceptables en la solución acuosa de albúmina para obtener una
solución de fuerza iónica situada en la gama que va de 0,01 a
0,55.
5. Método según la reivindicación 4,
caracterizado porque la sal farmacéuticamente aceptable es
una sal de un metal alcalino.
6. Método según la reivindicación 5,
caracterizado porque la sal de un metal alcalino es el
cloruro de sodio presente en cantidad que confiere a la solución de
albúmina una fuerza iónica de 0,15.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la concentración
de la solución acuosa de albúmina se sitúa en la gama que va de 40
g/l a 60 g/l.
8. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la temperatura
de la solución acuosa de albúmina está comprendida entre 30ºC y
55ºC.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la
nanofiltración de la solución acuosa de albúmina se efectúa en dos
etapas sucesivas sobre respectivamente dos filtros de porosidad
decreciente.
10. Método según la reivindicación 9,
caracterizado porque las dos etapas sucesivas de
nanofiltración se efectúan respectivamente sobre filtros de
porosidad de 23 a 50 nm y 15 ó 20 nm.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se aplica con
filtros en celulosa regenerada de 15 nm y de superficie 0,01
m^{2}, a una presión no superior a 1 bar.
12. Método según la reivindicación 11,
caracterizado porque la presión se sitúa en la gama que va de
0,2 a 0,8 bar.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la albúmina es
obtenida por extracción etanólica y/o por purificación por
cromatografía de intercambio de iones o de afinidad.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende una
etapa posterior de tratamiento de adaptación de la solución acuosa
de albúmina para un uso terapéutico.
15. Solución acuosa de albúmina viralmente
asegurada susceptible de obtenerse por la aplicación del método
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la cual los
sitios de transporte y fijación de los principios activos
terapéuticos de la albúmina están disponibles.
16. Solución acuosa de albúmina según la
reivindicación 15, caracterizada porque contiene a lo sumo un
1% de polímeros de albúmina de importancia inferior a 100 nm.
17. solución acuosa de albúmina según la
reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque contiene a lo
sumo 1% de polímeros de albúmina de importancia inferior a 20
nm.
18. Composición de albúmina para uso terapéutico
obtenida por un tratamiento, según la reivindicación 14, de
adaptación de una solución acuosa de albúmina, según una cualquiera
de las reivindicaciones 15 a 17, para un uso clínico.
19. Utilización de una composición de albúmina
para uso terapéutico según la reivindicación 18, para la
estabilización de al menos de un miembro escogido en el grupo
constituido por las proteínas de escasa concentración y elevada
actividad específica, las immunoglobulinas específicas, los
anticuerpos monoclonales, las vacunas, los alérgenos, las
citoquinas y las hormonas peptídicas.
20. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque las proteínas representan el factor VIII
o el factor von Willebrand y su equivalente recombinante.
21. Utilización de una composición de albúmina
para uso terapéutico según la reivindicación 18, para el transporte
y la fijación de principios activos terapéuticos.
22. Utilización de una composición de albúmina
para uso terapéutico según la reivindicación 18, como excipiente
para un medio de incubación para la fecundación "in
vitro" de ovocitos humanos.
23. Utilización de una composición de albúmina
para uso terapéutico según la reivindicación 18, como proteína
normal testigo.
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