ES2202613T3 - Procedimiento de esterilizacion final de productos biologicos. - Google Patents
Procedimiento de esterilizacion final de productos biologicos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA ESTERILIZAR PRODUCTOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS, PARTICULARMENTE PRODUCTOS TERAPEUTICOS O PROFILACTICOS, Y A LAS COMPOSICIONES OBTENIDAS POR ELLOS. LOS PROCEDIMIENTOS INCLUYEN LA OBTENCION DE UNA MUESTRA SECA QUE CONTENGA UNA CANTIDAD DE TREHALOSA SUFICIENTE PARA DAR TERMOESTABILIDAD AL PRODUCTO, Y EXPONER LA MUESTRA SECA A CONDICIONES DE CALENTAMIENTO A UNA TEMPERATURA Y DURANTE UN PERIODO SUFICIENTES PARA INACTIVAR SUSTANCIALMENTE LOS VIRUS, ESPECIALMENTE LOS VIRUS ENCAPSULADOS NO LIPIDICOS. LOS PROCEDIMIENTOS DE SECADO INCLUYEN TANTO CONDICIONES DE SECADO AL AIRE AMBIENTE COMO LA LIOFILIZACION. LAS CONDICIONES DE CALENTAMIENTO INCLUYEN CUALQUIER PROCEDIMIENTO CONOCIDO EN LA TECNICA, Y CUBREN UN AMPLIO ABANICO DE TEMPERATURAS Y TIEMPOS DE CALENTAMIENTO. LAS COMPOSICIONES OBTENIDAS CONTIENEN PRODUCTOS ESTABLES Y NO CONTIENEN VIRUS INFECCIOSOS MENSURABLES, PARTICULARMENTE PARVOVIRUS.
Description
Procedimiento de esterilización final de
productos biológicos.
La presente invención se refiere al campo de la
esterilización de productos derivados de la sangre y de otras
fuentes biológicas. La invención consiste en calentar productos
biológicamente activos en presencia de trehalosa durante un periodo
de tiempo y en condiciones suficientes para destruir virus,
particularmente el parvovirus.
La eliminación completa de virus y de otros
contaminantes a partir de productos biológicamente activos es
esencial para la producción y la utilización de una amplia
diversidad de productos terapéuticos y profilácticos. En la
actualidad se están utilizando varios procedimientos.
Principalmente, éstos consisten en tratamiento térmico,
cromatografía, tratamiento con solvente-detergente
(SD) y pasteurización. Todos dichos procedimientos adolecen de
inconvenientes y ninguno ha sido satisfactorio para eliminar todos
los virus conocidos. Puede haber asimismo virus que no han sido
caracterizados todavía que no son inactivados mediante dichos
procedimientos. Para una revisión, véanse Cuthbertson et al.
(1991) Blood Separation and Plasma Fractionation,
Wiley-Liss, Inc. páginas 385-435;
Mozen (1993) J. Clin. Apheresis 8: 126-130:
Ingerslev (1994) Haemostasis 24: 311-323;
Dorner et al. (1993) Virological Safety Aspects of Plasma
Derivatives, Brown, ed., Dev. Biol. Stand., Basel, Karger,
volumen 81, páginas 137-143; Mannucci (1993) Vox
Sang. 64: 197-203; y Hamman et al. (1994) Vox
Sang. 67: 72-77.
Una amplia diversidad de productos con utilidad
terapéutica se derivan de fuentes biológicas tales como plasma y
líneas celulares. La mayor parte del plasma utilizado para
fraccionamiento en los Estados Unidos se obtiene mediante
plasmaféresis en centros de recogida distribuidos por todo el país.
Los centros proporcionan plasma a fraccionadores comerciales en los
Estados Unidos y en Europa. Se recogen aproximadamente 9 millones
de litros de plasma por año procedentes de aproximadamente 13
millones de donaciones. La Cruz Roja añade aproximadamente 800.000
litros a este número.
Los productos procedentes de plasma humano se
pueden clasificar en varios grupos: los productos de albúmina; las
inmunoglobulinas; las globulinas insolubles en frío; los productos
de coagulación; y los inhibidores de proteinasa. Los productos de
albúmina, denominados asimismo productos de la fracción V, se
utilizan principalmente para restablecer la presión osmótica
coloidal en condiciones de choque tales como quemadura, o choque
hemorrágico en el que la pérdida de fluidos constituye un problema
principal.
Las inmunoglobulinas, o "gammaglobulinas",
se aíslan a partir de la fracción II y contienen una mezcla de
anticuerpos representativos de la fuente de plasma agrupado.
Algunas de las hiperinmunoglobilinas utilizadas para una
inmunización pasiva se aislan a partir del plasma de donantes con
altos niveles de anticuerpo protector. Las globulinas insolubles en
frío incluyen fibrinógeno y el factor de von Willebrand.
Los productos de coagulación incluyen el factor
VIII antihemofílico y el complejo de factor IX utilizado para una
terapia de sustitución en las hemofilias A y B, respectivamente. Se
prepara una forma activada de complejo de factor IX denominado
complejo coagulante antiinhibidor y se utiliza para el tratamiento
de pacientes con un inhibidor de factor VIII. Los inhibidores de
proteinasa incluyen el inhibidor de proteinasa \alpha1, conocido
asimismo como antitripsina \alpha1 que se utiliza para tratar una
deficiencia congénita. La antitrombina III es un inhibidor que es
asimismo congénitamente deficiente que conduce a complicaciones
trombóticas.
Otros fluidos corporales constituyen la fuente de
productos terapéuticos. Por ejemplo, la eritropoyetina se
purificaba anteriormente a partir de sangre o de orina de pacientes
anémicos aplásticos, patente U.S. nº 4.677.195. Se ha obtenido
asimismo albúmina de alta pureza a partir de placentas humanas.
Grandgeorge y Véron (1993) Virological Safety Aspects of Plasma
Derivatives, Brown, ed. Dev. Biol. Stand. Basel, Karger,
volumen 81, páginas 237-244. La producción de
proteínas recombinantes en la leche de animales transgénicos es
ahora una realidad comercial.
Se obtienen en la actualidad numerosos productos
terapéuticos a partir de cultivos de células que expresan proteínas
recombinantes. Los cultivos de células se hacen crecer
rutinariamente en suero animal o humano. Los productos se obtienen a
partir de las células o a partir del material sobrenadante de
cultivos de células y por tanto pueden contener virus, ya sea
procedentes del medio o de las propias células. Dichos productos
obtenidos incluyen, pero sin limitarse a ellos, factores
estimuladores de colonias, anticuerpos monoclonales y derivados de
los mismos, factores de crecimiento tales como eritropoyetinas e
interleuquinas. Los factores de crecimiento solos representan una
industria de muchos millones de dólares. Para una revisión, véase
Erickson (1991) Sci. Am. febrero 1991 páginas
126-127.
Aunque el riesgo de una contaminación vírica de
proteínas derivadas de un cultivo de células es muy inferior al
asociado con productos de plasma, existe siempre el riesgo de
contaminación vírica cuando se trata de células. Por este motivo,
productos tales como anticuerpos monoclonales se someten a un
tratamiento térmico con el fin de inactivar los virus. Además, la
adición de albúmina de suero humano (HSA) para estabilizar
formulaciones de proteínas recombinantes es una práctica normal.
Los principales virus llevados por la sangre de
preocupación clínica incluyen los virus de las hepatitis B y C y
los retrovirus VIH y HTLV. Con respecto a derivados de la sangre,
se ha encontrado que los HTLVI y II y el citomegalovirus (CMB) están
asociados con células y por tanto no presentan ningún riesgo en
productos exentos de células.
A medida que se descubren nuevos virus, se
cambian los protocolos de inactivación para acomodarse a los
mismos. Por ejemplo, el descubrimiento de que el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) sobrevivía al tratamiento estándar
del factor VIII necesitó un cambio de protocolo que requería la
adición de HSA para estabilizar el producto en las nuevas
condiciones más severas. Mozen (1993).
Son conocidos procedimientos para inactivar el
VIH y los virus de la hepatitis en fracciones de plasma. Como se ha
descrito anteriormente, el calentamiento a una temperatura de 60ºC
durante 10 horas en presencia de HSA inactiva el VIH. Se encontró
que las hepatitis no A y no B (NANBH) eran inactivadas en
preparaciones de factores VIII y IX mediante calentamiento a una
temperatura de 80ºC durante 72 horas en estado liofilizado. Grupo de
estudios del UK Haemophilia Centre, Directors on Surveillance of
Virus Transmission by Concentrates (1988) Lancet 8 de
octubre, páginas 814-816.
En años recientes, se han identificado unas
cuantas enfermedades que se pueden transmitir por transfusión que,
aunque no son comunes desde la perspectiva de salud pública,
presentan repercusiones tanto reales como potenciales sobre
transfusiones en la utilización de plasma y derivados de plasma,
así como de productos celulares. Estas repercusiones incluyen la
transmisión de parvovirus (B19). Se ha encontrado que este agente
etiológico es resistente a los procedimientos actuales utilizados
para una inactivación vírica. Sherwood (1993) Brown, ed.
Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives, Dev. Biol.
Stand. Basel, Karger volumen 81, páginas 25-33.
Los procedimientos de inactivación de virus
actualmente en uso pueden causar asimismo cambios en la actividad
biológica de los productos biológicos obtenidos. La inmunogenicidad
de los productos es de una especial preocupación cuando el
tratamiento de esterilización puede inducir el desdoblamiento y/o la
agregación de proteínas. Por ejemplo, se ha encontrado que los
concentrados de factor VIII presentan evidencia de activación de
FVIII, con potencias monofásicas superiores a las bifásicas, una
generación de FXa más rápida, y un aumento de polipéptidos de peso
molecular inferior. Los procedimientos de inactivación vírica
pueden inducir asimismo cambios en los componentes no FVIII y éstos
pueden ser parcialmente responsables de la actividad inmunosupresora
de algunos de estos concentrados. Barrowcliffe (1993)
Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives Brown, ed.
Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, volumen 81, páginas
125-135.
Se han encontrado notables cambios en las
funciones del sistema inmunitario, tanto in vitro como ex
vivo en pacientes expuestos frecuentemente a productos de
procedencia biológica. En pacientes con VIH negativo, los cambios
incluyen una reducción de números y funciones de células
competentes inmunológicas tal como se determina por su respuesta a
estímulos en términos de marcadores de su renovación celular. Es
probable que estos cambios tengan lugar cuando está presente una
enfermedad vírica crónica. Además, las impurezas de proteínas
alogénicas desnaturalizadas de concentrados de factores y otros
contaminantes pueden ser asimismo responsables de una
inmunosupresión. Véase, Ingerslev (1994) para una revisión.
El parvovirus humano es un agente recientemente
descubierto al que se le asignó la denominación codificada B19.
Cossart et al. (1975) Lancet 1:72-73. Es un
virus con ADN monocatenario muy pequeño (24 nm) con un revestimiento
proteínico muy simple, pero sin ninguna envoltura exterior
lipídica. Éste causa una viremia transitoria de 1 a 2; semanas,
pero puede alcanzar títulos de virus en circulación
extraordinariamente elevados de por lo menos 10^{12} partículas
de virus por ml. Aunque el parvovirus causa normalmente una
enfermedad relativamente leve que no es con frecuencia clínicamente
evidente, que produce una erupción ligera semejante a la rubéola
conocida como quinta enfermedad o eritema infeccioso, puede causar
asimismo reacciones más graves. El parvovirus infecta las células
madre de médula ósea y esto puede causar una afección grave, con
peligro para la vida en pacientes con una anemia subyacente
preexistente. Puede tener lugar una crisis aplástica como resultado
de una interrupción aguda de la hematopoyesis en pacientes con
anemias hemolíticas congénitas y estados de inmunodeficiencia. El
parvovirus causa asimismo hidropesía fetal en mujeres embarazadas.
Por tanto el parvovirus representa un peligro de infección para los
pacientes que reciben agentes terapéuticos derivados de plasma,
particularmente en los pacientes con trastornos hemostáticos. Es
preocupante que este virus sea transmitido por algunos concentrados
a pesar de la utilización de procedimientos virucidas enérgicos y
una eliminación cromatográfica, no solamente por el riesgo de
transmisión del parvovirus, sino debido a que pueden existir otros
virus patógenos con los mismos rasgos distintivos.
Un estudio en niños con trastornos hemolíticos
encontró que el parvovirus es rápidamente infeccioso en derivados
de plasma que no han sido tratados térmicamente. En un estudio, un
pequeño grupo de niños (N=9) tratados con concentrado de factor
VIII tratado térmicamente no fueron infectados por parvovirus.
Williams et al. (1990) Vox Sang. 58:
177-181. Sin embargo, otros estudios han encontrado
que productos tratados térmicamente transmiten una infección por
parvovirus. Corsi et al. (1958) J. Med. Virol. 25:
151-153. A diferencia de la hepatitis y del VIH, el
parvovirus no se ensaya para donaciones de plasma individuales y
por tanto está presente en plasma agrupado.
Como se ha mencionado anteriormente, se han
propuesto diversos tratamientos o están en uso para la inactivación
de virus en productos terapéuticos de procedencia biológica. Para
una revisión, véase Soumela (1993) Trans. Med. Rev. VII:
42-57. El producto final se ha obtenido mediante
una combinación de etapas de separación y etapas de inactivación,
las cuales sirven para reducir la carga vírica.
Existen varios tratamientos térmicos actualmente
en uso. Se utiliza normalmente un calentamiento en solución para
productos de albúmina. Esto es conocido de otro modo como
pasteurización. Los virus son inactivados calentando las muestras
líquidas durante por lo menos 10 horas a una temperatura de 60ºC en
presencia de una pequeña cantidad de estabilizador tal como
caprilato o triptofanato. Dicho procedimiento es inadecuado para
otros productos, sin embargo, ya que la mayoría de las proteínas se
desnaturalizan en dichas condiciones. Se ha mostrado que la
pasteurización inactiva un amplio espectro de virus que incluyen
VIH, HBV, HCV, HAV, HSV, poliovirus CMV, virus de la parotiditis,
virus del sarampión y virus de la rubéola. Nowak et al.
(1993) Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,
Brown, ed., Dev. Biol. Stand. Basel, Karger, volumen 81, páginas
169-176; y Soumela (1993). En dichos estudios, no se
ensayó el parvovirus. Además, la utilización de factores de
coagulación pasteurizados ha sido asociada con la formación de
neoantígenos. Ingerslev (1994).
El calentamiento de productos secos se realiza
cuando las proteínas lábiles, liofilizadas, toleran temperaturas de
hasta 68ºC. Los procedimientos antiguos que incluían el
calentamiento a una temperatura de 60ºC se utilizaron para inactivar
los virus de la hepatitis. Véase, p.ej. la patente U.S. nº
4.456.590. Sin embargo, dichas condiciones fueron insuficientes
para inactivar el VIH tal como se evidenció por la transmisión del
virus a través de factores de coagulación purificados. Se encontró
asimismo que los productos tratados a una temperatura de 68ºC
durante 72 horas eran inseguros. Soumela (1993). Más recientemente,
se han utilizado temperaturas superiores y tiempos de calentamiento
más prolongados, tales como temperaturas de 80ºC durante 72 horas
para asegurar la inactivación de los virus de la hepatitis y el VIH.
Véase, p.ej., Knevelman et al. (1994) Vox Sang. 66:
89-95. Sin embargo, la mayoría de los agentes
activos biológicos lábiles, especialmente productos
biofarmacéuticos, no sobreviven a una exposición en condiciones de
temperatura/tiempo tan rigurosas. Otro inconveniente de dicho
procedimiento consiste en el resultado con frecuencia impredecible
con respecto a la inactivación del parvovirus. Santagostino et
al. (1994) Lancet 343: 798; y Yee et al. (1995)
Lancet 345: 794.
La inactivación con solvente/detergente (SD) de
virus se basa en la desintegración de las membranas de los virus
que presentan envolturas lipídicas. Los virus se convierten en no
infecciosos, ya sea por una desintegración estructural o por
destrucción del sitio de reconocimiento de receptores celulares.
Aunque la mayoría de los virus patógenos humanos presentan una
envoltura lipídica, el parvovirus y el HAV no la presentan y no son
inactivados mediante dicho procedimiento. Para una revisión, véase
Wieding et al. (1993) Ann. Hematol. 67:
259-266. El procedimiento SD está en uso en
numerosos países. Horowitz et al. (1993) Virological
Safety Aspects of Plasma Derivatives; Brown, ed. Dev. Biol.
Stand. Basel, Karger, volumen 81, páginas 147-161.
En un procedimiento relacionado, se han utilizado lípidos para
inactivar virus con envolturas lipídicas. Isaacs et al.
(1994) Ann. NY Acad. Sci. 724: 457-464.
Se han desarrollado otros varios procedimientos o
están en desarrollo. Por ejemplo, la esterilización en frío de
plasma se realiza exponiendo plasma a una combinación de
\beta-propiolactona y luz UV. Sin embargo, dicho
procedimiento reduce la actividad de las proteínas lábiles. Se han
propuesto diversos tratamientos químicos que incluyen la
utilización de psoralenos y UVA, BPD-MA y luz,
aunque éstos pueden estar limitados a la inactivación de virus con
envolturas lipídicas. Se ha encontrado asimismo que el caprilato y
el clorito de sodio son virucidas. Se han ensayado diversos
procedimientos de separación física que incluyen cromatografía de
afinidad; fraccionamiento con etanol frío, membranas de poros finos
y emulsiones de perfluorocarbonos. Lawrence (1993) Virological
Safety Aspects of Plasma Derivatives, Brown, ed., Dev. Biol.
Stand. Basel, Karger, vol. 81, páginas 191-197;
Burnouf (1993) id., páginas 199-209; Teh (1993)
Vox Sang. 65: 251-257; Lebing et al.
(1994) Vox Sang. 67: 117-124; DiScipio (1994)
Prot. Exp. Purif. 5: 178-186; Morgenthaler y
Omar (1993) Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,
Brown, ed., volumen 81, páginas 185-190; Erickson
(1992) Sci. Am. Septiembre páginas 163-164; y
McCreath et al. (1993) J. Chromatog. 629:
201-213.
La determinación de una inactivación de virus
satisfactoria durante la preparación de una proteína de plasma
requiere que se cumplan tres requisitos previos. En primer lugar,
el procedimiento de preparación se debe reducir a escala tan
exactamente como sea posible. En segundo lugar, se deben
seleccionar virus de ensayo relevantes para los experimentos de
impurificación. En tercer lugar, las muestras resultantes deben
ensayarse apropiadamente para determinar un virus infeccioso. El
procedimiento de dichos ensayos se describe con detalle, por
ejemplo, por Hilfenhaus et al. (1993) Brown, ed.
Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives, Dev. Biol.
Stand. Basel, Karger volumen 81, páginas 117-123.
Estas guías se han seguido en la presente memoria.
La trehalosa,
(\alpha-D-glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido),
es un disacárido no reductor de origen natural que se encontró
inicialmente que estaba asociado con la prevención del daño por
desecación en ciertas plantas y animales que pueden secarse sin
daño y pueden revivir cuando se hidratan. La trehalosa está
disponible comercialmente en la forma de dihidrato. Se ha mostrado
que la trehalosa es útil en la prevención de desnaturalización de
proteínas, virus y sustancias alimenticias durante la desecación.
Véanse las patentes U.S. nº 4.891.319; nº 5.149.653; nº 5,026,566;
Blakeley et al. (1990) Lancet 336:
854-855; Roser (julio de 1995) Trends in Food
Sci. and Tech. 166-169; Colaço et al.
(1992) Biotechnol. Internat. 345-350; Roser
(1991) BioPharm 4: 47-53; Colaço et
al. (1992) Bio/Tech. 10: 1007-1011; y
Roser et al. (mayo de 1993) New Scientist, páginas
25-28. El dihidrato de trehalosa está disponible en
formulaciones cristalinas de calidad de buenos procedimientos de
preparación (GMP). En la publicación de patente EP nº 600.730 se
describe un procedimiento para la preparación de una forma anhidra,
desecante, de trehalosa. Dicho procedimiento consiste en calentar
un jarabe de trehalosa en presencia de semillas de cristales y
recuperar la trehalosa anhidra.
La trehalosa se encuentra extensamente en
diversas especies de animales y plantas tales como bacterias,
levaduras, hongos, insectos e invertebrados. En muchos insectos,
constituye el azúcar principal de la sangre. La única fuente
principal para el hombre se encuentra en dietas de alimentos tales
como setas y productos de levaduras.
Madsarovova-Nohejlova (1973) Gastroenterol.
65: 130-133.
En la patente U.S. nº 4.879.280 se describe
trehalosa para su utilización en un sistema de diálisis peritoneal
en la que se menciona como uno de varios disacáridos como
sustitución del sistema de la técnica anterior que utilizaba
glucosa. Se menciona la trehalosa para su utilización en el sistema
de diálisis como un disacárido que no se escindirá fácilmente para
formar glucosa y por tanto se evita la elevación del nivel de
glucosa en sangre. Se ha descrito asimismo la trehalosa como
adecuada para su utilización en formulaciones parenterales
principalmente debido a que se puede esterilizar en autoclave sin
el oscurecimiento asociado con formulaciones parenterales
convencionales. Patente japonesa nº 6-70718.
La trehalosa es un componente normal de la dieta
humana y existe información disponible sobre su metabolismo.
Después de una ingestión oral, la trehalosa no es absorbida intacta
a través del tracto gastrointestinal, ya que únicamente los
monosacáridos pueden pasar a través de todo el epitelio intestinal.
Ravich y Bayless (1983) Clin. Gast.
12:335-356. La trehalosa es metabolizada por la
enzima trehalasa para formar dos moléculas de glucosa. Sacktor
(1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
60:1007-1014. La trehalasa es un constituyente
normal de la mayoría de los cuerpos de mamíferos, incluyendo seres
humanos, y ha sido identificada en suero humano, en linfocitos y en
el hígado, pero está localizada principalmente en el borde en
cepillo del tracto intestinal y en los túbulos proximales renales.
Belfiore et al. (1973) Clin. Chem. 19:
447-452; Eze (1989) Biochem. Genet. 27:
487-495; Yoshida et al (1993) Clin.
Chim. Acta 215:123-124; y Kramers y Catovsky
(1978) Brit. J. Haematol. 38: 4453-461. La
trehalasa es una proteína unida a membranas del tracto intestinal
de seres humanos y animales. Bergoz et al. (1981)
Digestion 22: 108-112; Riby y Galand (1985)
Comp. Biochem. Physiol. 82B: 821-827; y Chen
et al. (1987) Biochem. J. 247:
715-724.
Todas las referencias citadas en la presente
memoria se incorporan a la misma como referencia.
La invención se refiere a un procedimiento para
la esterilización de productos, particularmente productos
terapéuticos, derivados de fuentes biológicas. El procedimiento
incluye secar el producto en presencia de una cantidad de trehalosa
suficiente para conferir una estabilidad térmica al producto y
exponer la muestra seca a condiciones de calentamiento a una
temperatura y disolvente un periodo de tiempo suficientes para
inactivar sustancialmente el parvovirus. Los procedimientos de
secado son cualesquiera de los conocidos en la técnica e incluyen
tanto condiciones de secado ambientales, incluyendo secado por
aspersión y a vacío, y liofilización. Las condiciones de
calentamiento cubren una amplia gama de combinaciones de
temperaturas y tiempos de calentamiento.
Tal como se describe con detalle en la presente
memoria, existen numerosos procedimientos para una esterilización
final de productos biológicos derivados de la sangre. Dichos
procedimientos son bien conocidos en la técnica, tal como se
ejemplifica mediante las referencias citadas en la presente
memoria, y no necesitan ser descritos con detalle. Aunque
procedimientos de purificación rigurosos, tales como cromatografía
de afinidad de anticuerpos, pueden dar como resultado productos
biológicos exentos de virus, se ha encontrado que ninguno de los
procedimientos comercialmente factibles hacen, de una manera
regular, que los productos queden exentos de virus infecciosos,
particularmente los virus no encapsulados con lípidos. Además, un
aumento de la severidad de las condiciones de esterilización con el
fin de hacer que un producto queden exento de virus infecciosos,
presenta el inconveniente de disminuir la actividad y/o de aumentar
la inmunogenicidad del producto.
Además de productos derivados de la sangre,
existen numerosos productos biológicamente activos que se pueden
beneficiar de los procedimientos de esterilización que se
proporcionan en la presente invención. Entre éstos se incluyen, pero
sin limitarse a ellos, proteínas producidas de modo recombinante,
proteínas aisladas nativas, anticuerpos, enzimas, citoquinas y
factores de crecimiento, así como moléculas farmacéuticamente
activas tales como analgésicos, anestésicos,
anti-eméticos, antibióticos, agentes
quimioterapéuticos, hormonas, vitaminas y esteroides.
Es asimismo adecuada para su utilización en los
procedimientos reivindicados, cualquier sustancia que ha de ser
introducida asépticamente en un individuo. Entre éstas se incluyen,
pero sin limitarse a ellas, fármacos, antibióticos, agentes de
formación de imágenes médicas y reactivos para diagnósticos. De
manera importante, en el caso en el que el producto que se ha de
administrar es lábil, tal como cefalosporinas, anticuerpos
terapéuticos y eritropoyetina, la invención proporciona
composiciones estériles secas estables que se pueden rehidratar
inmediatamente antes de su utilización. La trehalosa es bien
adecuada para agentes inyectables, infusibles, etc. en el sentido de
que se desintegra para formar dos moléculas de glucosa al quedar
expuesta la trehalosa en la corriente sanguínea. La glucosa puede
causar un pequeño aumento transitorio de los niveles de azúcar en
sangre, pero esto supone poca preocupación clínica.
\newpage
La presente invención comprende procedimientos de
esterilización final de productos que necesitan ser administrados
asépticamente a un individuo. Las etapas del procedimiento incluyen
obtener una muestra seca que contiene el producto y una cantidad de
\alpha-D-glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido
(trehalosa) suficiente para conferir una sustancial estabilidad
térmica al producto; y calentar la muestra seca a una temperatura y
durante un periodo de tiempo suficientes para inactivar
sustancialmente el parvovirus. La muestra seca puede contener
además adecuados agentes reguladores del pH, adyuvantes, etc.
preferentemente, en una cantidad que proporcione una concentración
adecuada al efectuar la rehidratación.
El producto puede derivarse de una variedad de
fuentes. Preferentemente, los productos se derivan de cualquier
fuente biológica conocida, que incluye, pero sin limitarse a ellas,
sangre, plasma, suero, placenta, leche, orina, cultivos de células y
material sobrenadante de cultivos de células. Adicionalmente, el
producto puede derivarse sintéticamente, ya sea mediante síntesis
química o enzimática, o mediante la utilización de técnicas de ADN
recombinante. Los procedimientos de preparación de dichas fuentes y
los procedimientos de aislamiento de los productos son bien
conocidos en la técnica.
Típicamente, los productos aislados o derivados
de sangre, plasma y suero incluyen, pero sin limitarse a ellos,
productos de albúmina, inmunoglobulinas, productos de coagulación e
inhibidores de proteinasa. Los productos de albúmina incluyen, pero
sin limitarse a ellos, HSA, globulinas insolubles en frío y
fibrinógeno. Las inmunoglobulinas incluyen pero sin limitarse a
ellos, anticuerpos contra el tétanos, tosferina, hepatitis B, Rho
(D), varicela zóster y rabia. Los productos de coagulación incluyen,
pero sin limitarse a ellos, factor VIII antihemofílico, complejo de
factor IX y complejo de factor IX activado. Los inhibidores de
proteinasa incluyen, pero sin limitarse a ellos, inhibidor de
proteinasa \alpha-1, antitripsina
\alpha-1 y antitrombina III. Hay disponibles otras
fuentes de estos productos, por ejemplo, se puede obtener albúmina
a partir de fuentes placentarias.
Cuando la fuente biológica es un cultivo de
células o material sobrenadante de cultivo de células, los
productos incluyen, pero sin limitarse a ellos, factores
estimuladores de colonias, anticuerpos monoclonales y derivados de
los mismos, y factores de crecimiento. Los factores de crecimiento
típicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, eritropoyetina,
citoquinas e interleuquinas tanto derivados de origen natural como
recombinantes.
Cuando el producto es un agente que necesita ser
administrado asépticamente, los productos incluyen, pero sin
limitarse a ellos, analgésicos, anestésicos, agentes
quimioterapéuticos, hormona y vacunas. Los analgésicos incluyen,
pero sin limitarse a ellos, morfina, benzocaína, petidina y
demerol, los anestésicos incluyen, pero sin limitarse a ellos,
bupivicaína, atracurio y vecuronio.
Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin
limitarse a ellos, radioisótopos, alcaloides vinca tales como los
sulfatos de vinblastina, vincristina y vindesina, adriamicina,
sulfato de bleomicina, carboplatina, cisplatina, ciclofosfamida,
citarabina, dacarbazina, dactinomicina, hidrocloruro de
duanorrubicina, hidrocloruro de doxorrubicina, etópsido,
fluorouracilo, hidrocloruro de meclororetamina, melfalán,
mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, pentostatina,
pibropomano, hidrocloruro de procarbazo, estreptozotocina, taxol,
tioguanina y mostaza de uracilo.
Las hormonas adecuadas incluyen, pero sin
limitarse a ellas, estrógeno, testosterona, progesterona y análogos
sintéticos de los mismos. Las vacunas típicas incluyen, vacunas
subunitarias antigénicas tanto simples como múltiples, así como
preparaciones bacterianas y víricas inactivadas y antígenos de
cánceres. Los antibióticos típicos incluyen, pero sin limitarse a
ellos, cefalosporinas y aminoglicósidos.
Los procedimientos incluyen una primera etapa de
obtención de una muestra seca. Se puede utilizar una diversidad de
procedimientos para secar la muestra. Entre estos se incluyen, pero
sin limitarse a ellos, secado con aire, secado a vacío, secado por
aspersión y liofilización. Dichos procedimientos se ilustran con
detalle en los ejemplos presentados en la presente memoria y son
bien conocidos en la técnica. Véanse, p.ej., las patentes U.S. nº
4.891.319; nº 5.026.566; y nº 5.149.653.
Las muestras se preparan típicamente en solución
o suspensión e incluyen el producto, una cantidad suficiente de
trehalosa para conferir estabilidad térmica al producto, y
cualquier otro aditivo típico tal como adecuados agentes reguladores
del pH, adyuvantes, etc. Típicamente, la trehalosa está presente en
una cantidad del 1 al 50% en peso de la solución. Si la solución
está más diluida, los tiempos de secado pueden ser prohibitivos y,
si está más concentrada, la solución puede llegar a ser viscosa. Las
concentraciones iniciales exactas de producto, trehalosa y
cualquier aditivo necesitarán ser determinadas empíricamente, pero
esto se encuentra bien entre los conocimientos de un experto en la
materia, dados los ejemplos que se proporcionan en la presente
memoria. Preferentemente, la concentración de producto y de
trehalosa es tal, que después del secado tiene lugar una pérdida de
actividad del producto inferior a aproximadamente el 30%. Más
preferentemente, se produce una pérdida de actividad inferior al 15%
y muy preferentemente, se produce una pérdida inferior al 10%.
Una vez que se ha obtenido la muestra seca, se
somete la misma a condiciones de calentamiento a una temperatura y
una duración suficientes para inactivar los virus. Típicamente, la
muestra seca se somete a un calentamiento a 80ºC durante 72 horas
para inactivar los virus encapsulados con lípidos y a 90ºC durante
72 horas para inactivar además los virus no encapsulados con
lípidos. La combinación óptima de calor y duración del
calentamiento se determinará empíricamente. Dicha determinación se
encuentra dentro de los conocimientos de un experto en la materia,
dados los ejemplos proporcionados en la presente memoria.
Típicamente, las condiciones óptimas se determinan impurificando
una muestra de ensayo, ya sea con el virus que se ha de inactivar o
con un virus que presente características físicas similares.
Típicamente, una pérdida de cuatro log_{10} del título del virus
añadido se considera que es una "inactivación", ya que una
caída de 4 log_{10} del título de pérdida es el requisito de la
autoridad reguladora para un procedimiento de
inactivación/eliminación vírica.
El procedimiento da como resultado una sustancial
estabilidad térmica del producto. Preferentemente, el procedimiento
da como resultado una pérdida de actividad del producto inferior a
aproximadamente el 30%. Más preferentemente, el procedimiento da
como resultado una pérdida de actividad del producto inferior a
aproximadamente el 15%. Muy preferentemente, el procedimiento da
como resultado una pérdida de actividad del producto inferior a
aproximadamente el 10%.
El procedimiento proporciona muestras secas de
alta estabilidad y susceptibles de ser almacenadas durante periodos
de tiempo prolongados. Dicha estabilidad en almacenamiento está
relacionada con la humedad residual del producto esterilizado.
Preferentemente, el procedimiento produce una muestra seca que
presenta un contenido de humedad residual inferior a
aproximadamente el 4%. Más preferentemente, el contenido de humedad
residual es inferior a aproximadamente el 2%. Muy preferentemente,
el contenido de humedad residual es aproximadamente del 0,8 al
1,0%. La humedad residual se puede medir mediante una diversidad de
procedimientos, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, análisis
térmico diferencial, procedimientos termogravimétricos o valoración
culombimétrica de Karl Fisher.
El intervalo de temperaturas y tiempos de
calentamiento varía ampliamente, y el tiempo óptimo para una
muestra particular se puede determinar empíricamente dados los
conocimientos en este campo y los ejemplos proporcionados en la
presente memoria. Los resultados presentados en la presente memoria
indican que un calentamiento a aproximadamente 80ºC durante
aproximadamente 72 horas resulta eficaz, así como un calentamiento
a 90ºC durante aproximadamente 20 horas. Se pueden utilizar
periodos de tiempo más prolongados y/o temperaturas superiores con
una pérdida potencial simultánea de actividad del producto.
Preferentemente, el procedimiento da como
resultado una reducción de 4 veces el log_{10} de la infectividad
de los virus contaminantes. Se conocen varios procedimientos para
llevar a cabo dicha determinación. Muchos de éstos se han citado
anteriormente y varios otros son conocidos en la técnica. Como los
virus encapsulados con lípidos son menos resistentes a un
tratamiento térmico que los virus no encapsulados con lípidos, una
determinación de la pérdida de infectividad de un virus no
encapsulado con lípidos indica que todos los virus encapsulados con
lípidos también han sido inactivados. Los virus no encapsulados con
lípidos incluyen, pero sin limitarse a ellos, el virus de la
hepatitis A y los parvovirus. El virus no encapsulado con lípidos al
que se hace referencia en la presente invención es el
parvovirus.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.
Una solución madre de 1 mg/ml de fosfatasa
alcalina en una solución de trehalosa al 50% preparada en una
solución tampón de HEPES 25 mM que contenía bicarbonato de amonio 50
mM y HSA al 2% se impurificó con 10^{6,5} TCID 50/ml de parvovirus
canino. Partes alícuotas de 250 \mul de la formulación
impurificada se secaron a vacío o se liofilizaron en viales
farmacéuticos de vidrio Wheaton con una capacidad de 3 ml utilizando
un secador FTS o un lioflilizador Labconco.
Para el secado a vacío, la temperatura de la
estantería se ajustó inicialmente a 30ºC mientras que el vacío se
reducía de un modo escalonado a 30 mTorr, momento en el que la
temperatura de la estantería se aumentó a 60ºC y el secado se llevó
a cabo durante 12 a 16 horas adicionales. Para la liofilización,
las muestras se congelaron reduciendo la temperatura de la
estantería a -40ºC a un régimen de 5ºC por minuto y se dejó que los
viales se congelaran completamente durante 1 hora antes de que el
vacío se redujera a 10 mTorr y las muestras se secaron a una
temperatura de -40ºC durante 40 horas. A continuación, la
temperatura de la estantería se elevó a +20ºC a un régimen de
0,05ºC por minuto y las muestras se secaron a +20ºC durante 3 horas
y finalmente la temperatura de la estantería se elevó a +40ºC a un
régimen de 0,05ºC por minuto y las muestras se secaron a +40ºC
durante 2 horas adicionales. Los viales se taparon a vacío y las
muestras se mantuvieron a una temperatura de 4ºC como testigos
secos. Para la esterilización final, los viales se trataron a una
temperatura de 80ºC durante 72 horas o a 90ºC durante 20 horas en
una estufa de secado Heraeus. Se evaluaron la reducción del
log_{10} de la actividad del parvovirus y el % de reducción de la
actividad de fosfatasa alcalina.
El parvovirus se ensayó por titulación en un
cultivo de células y el punto final se determinó por aglutinación
de células sanguíneas rojas porcinas. Dicho en pocas palabras, las
muestras secas se reconstituyeron a su volumen original utilizando
agua destilada estéril y se preparó una serie de diluciones de diez
veces en medio de cultivo Eagles Minimum Essential Maintenance
(EMEM). Se preparó una suspensión de células A72 en EMEM que
contenía suero bovino fetal al 5%, mediante tripsinación de un
matraz confluente de células, y 1 ml de la suspensión de células
que contenía de 2 a 5 x 10^{3} células/ml se añadió en partes
alícuotas a los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos. Se
inocularon 100 \mul de cada dilución de muestra vírica en cuatro
pocillos replicados de la placa de cultivo de células y las placas
se incubaron durante 14 días a una temperatura de 37ºC en una
atmósfera con el 5% de CO_{2}.
Después de 14 días, el medio de cultivo de
células de cada pocillo se ensayó para determinar la actividad de
hemaglutinina utilizando células sanguíneas rojas porcinas al 1%.
Se calculó el título vírico expresado como log_{10} TCID 50/ml
utilizando la fórmula de Karber para la cuantificación del punto
final en los ensayos de infectividad del virus, a saber la fórmula
Karber = -log de intervalo de dilución - (suma de ensayos positivos)
- 0,5.
La fosfatasa alcalina se ensayó por colorimetría,
utilizando el reactivo comercial, Sigma fast^{TM} para ensayo de
sustratos de fosfatasa alcalina. Dicho en pocas palabras, se
preparó una serie de doble dilución para las muestras y se añadieron
una preparación de fosfatasa alcalina estándar (1 mg/ml) y 100 Tl
de sustrato a 100 Tl de muestra en una placa EIA y se incubaron en
la oscuridad durante 30 minutos. El desarrollo de color se leyó a
405 nm utilizando un Titertek Multiscan conectado por medio de una
interfase a un conjunto de lector de placas blandas delta y se
calculó la actividad de las muestras a partir de los valores de
absorbancia correspondientes a la sección lineal de la curva patrón.
A los testigos secos se les asignó una actividad del 100% y se
calculó el % de reducción de actividad de las muestras tratadas a
partir de estos valores.
Para todos los ensayos de virus, la reducción del
log_{10} del título de las muestras tratadas se calculó restando
el log_{10} TCID 50/ml de virus recuperado de los valores de
log_{10} TCID 50/ml de los testigos secos. Los resultados se
indican en la Tabla 1. En la Tabla 1, \geq significa que el virus
se encontraba por debajo del nivel de detección del ensayo, RIT
significa "reducción del título", HSA representa albúmina de
suero humano, * significa log_{10} TCID 50/ml de parvovirus en el
testigo seco = 6,5, ** significa actividad de fosfatasa alcalina en
el testigo seco = 100%, GPS representa
glucopiranosil-sorbitol, y n.d. representa no
determinado. Las abreviaturas son las mismas a lo largo de toda la
sección de ejemplos y en las tablas.
| Muestra | Reducción del log_{10} del título de parvovirus/% de reducción de la actividad de fosfatasa | |||
| alcalina después de la esterilización final a una temperatura de 90ºC durante 20 horas | ||||
| liofilizado | secado a vacío | |||
| Log_{10} RIT de | % de reducción de | Log_{10} RIT de | % de reducción de | |
| parvovirus * | 'fos' alc.** | parvovirus * | 'fos' alc.** | |
| trehalosa% | \geq 4,4 | 7,0 | \geq 4,0 | 0 |
| trehalosa + HSA | \geq 4,4 | 9,5 | \geq 4,0 | 0 |
| sacarosa | \geq 4,4 | 65 | \geq 4,0 | 48 |
| sacarosa + HSA | \geq 4,4 | 68 | \geq 4,0 | 56 |
| lactitol + HSA | \geq 5,6 | \geq 99 | n.d. | n.d. |
| lactosa + HSA | \geq 5,0 | 44 | n.d. | n.d. |
| sorbitol | \geq 4,0 | \geq 99 | n.d. | n.d. |
| sorbitol + HSA | \geq 4,0 | \geq 99 | n.d. | n.d. |
| GPS | \geq 4,0 | \geq 99 | n.d. | n.d. |
| GPS + HSA | \geq 4,0 | \geq 99 | n.d. | n.d. |
Una solución madre de 1 mg/ml de fosfatasa
alcalina en una solución de trehalosa al 50% preparada en una
solución tampón de HEPES 25 mM que contenía bicarbonato de amonio 50
mM y HSA al 2% se impurificó con 10^{6,5} TCID 50/ml de parvovirus
canino y se secó a vacío en un secador FTS. Se secaron 250 \mul
de formulación en viales con una capacidad de 3 ml en el secador
FTS utilizando un programa manual que alcanzó unos parámetros de
operación finales de un vacío de 30 mTorr y una temperatura de
estantería de 60ºC. Los viales se taparon a vacío y las muestras se
mantuvieron a una temperatura de 4ºC como testigos secos.
Para la esterilización final, los viales se
trataron a una temperatura de 80ºC durante 72 horas o a 90ºC
durante hasta 144 horas en una estufa de secado Heraeus. Se
evaluaron la reducción del log_{10} de la actividad del parvovirus
y el % de reducción de la actividad de fosfatasa alcalina. El
parvovirus se ensayó mediante titulación en un cultivo de células
seguido de la aglutinación de células sanguíneas rojas porcinas, tal
como se describe en el Ejemplo 1. Se calculó el título vírico
expresado como log_{10} TCID 50/ml utilizando la fórmula de
Karber tal como se describe en el Ejemplo 1. La fosfatasa alcalina
se ensayó por colorimetría, utilizando el reactivo comercial, Sigma
fast^{TM} para ensayo de sustratos de fosfatasa alcalina como en
el Ejemplo 1.
En la Tabla 2 se muestra un resumen de los
resultados obtenidos que representa la reducción del log_{10} del
título de parvovirus y el % de reducción de la actividad de
fosfatasa alcalina después de la esterilización final a una
temperatura de 80ºC durante 72 horas o a 90ºC durante 144 horas. En
la Tabla 2, * representa el log_{10} TCID 50/ml de parvovirus en
el testigo seco = 6,5, ** representa la actividad de la fosfatasa
alcalina en el testigo seco = 100%, y \geq representa por debajo
del límite de detección del ensayo.
| Tratamiento | Reducción del log_{10} del | % de reducción de la |
| título de parvovirus * | actividad de fosfatasa alcalina ** | |
| 80ºC/72 horas | 3,0 | 0 |
| 90ºC/20 horas | 3,0 | 0 |
| 90ºC/24 horas | 4,4 | 0 |
| 90ºC/48 horas | \geq 5,0 | 0,8 |
| 90ºC/72 horas | \geq 5,0 | 0 |
| 90ºC/96 horas | \geq 5,0 | 3,3 |
| 90ºC/120 horas | \geq 5,0 | 0 |
| 90ºC/144 horas | \geq 5,0 | 3,4 |
En este experimento, las mismas formulaciones que
en el Ejemplo 1 se impurificaron con tres preparaciones de virus
diferentes: poliovirus; parvovirus (virus que contenían ARN y ADN
no recubiertos, respectivamente); y virus del sarampión (virus ARN
recubiertos). Se evaluaron la reducción del log_{10} del título
del virus y el % de reducción de la actividad de fosfatasa
alcalina, tal como se ha descrito anteriormente o como se describe a
continuación. El poliovirus se ensayó utilizando un ensayo
citopático de células. Dicho en pocas palabras, se reconstituyeron
muestra secas a su volumen original utilizando agua esterilizada y
se preparó una serie de diluciones de diez veces en EMEM, y 100
\mul de las diluciones se inocularon en cinco pozos replicados de
una placa de cultivo de células de 96 pocillos que contenía una
monocapa confluente de células Vero. Las placas se incubaron
durante 7 días y se evaluó el efecto citopático inducido por virus
mediante la inspección de los pocillos utilizando un microscopio
óptico. Se calculó de nuevo el título vírico, expresado como
log_{10} TCID 50/ml de virus, utilizando la fórmula de Karber para
la cuantificación del punto final en los ensayos de infectividad de
los virus. Para todos los ensayos de virus, se calculó la reducción
del log_{10} del título de las muestras tratadas restando el
log_{10} TCID 50/ml de virus recuperado de los valores de
log_{10} TCID 50/ml de los testigos secos.
La infectividad del virus del sarampión se
determinó utilizando un ensayo de placas. Dicho en pocas palabras,
se reconstituyeron muestras secas a su volumen original utilizando
agua destilada estéril y se preparó una serie de diluciones de diez
veces en EMEM. Se inocularon 200 \mul de cada dilución en
pocillos duplicados de una placa de 6 pocillos que contenía una
monocapa confluente de células Vero. Después de la adsorción de
virus por las células durante 1 hora a una temperatura de 37ºC, se
añadieron a cada pocillo 2 ml de medio de superposición (EMEM que
contenía carboximetilcelulosa al 1% y suero bovino fetal al 5%).
Las placas se incubaron a continuación durante 7 días a una
temperatura de 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO_{2}. Se
visualizó la formación de placas inducida por virus en monocapas
celulares mediante tinción violeta Crystal.
Se contaron las placas y el virus recuperado se
cuantificó mediante calculo de unidades formadoras de placa por ml,
a saber PFU/ml = número de placas x factor de dilución x 5. Para
todos los ensayos de virus, la reducción del log_{10} del título
de las muestras tratadas se calculó restando el log_{10} PFU/ml
de virus recuperado de los valores de log_{10} PFU/ml de los
testigos secos. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3
que muestra la reducción del log_{10} del título de poliovirus,
virus del sarampión y parvovirus y el % de reducción de la
actividad de fosfatasa alcalina después de la esterilización final a
una temperatura de 80ºC durante 72 horas o a 90ºC durante 20
horas. En la Tabla 3, * representa el log_{10} TCID 50/ml de
poliovirus en el testigo seco = 4,5; ** representa el log_{10}
PFU/ml de virus del sarampión en el testigo seco = 5,10; ***
representa el log_{10} TCID/ml de parvovirus en el testigo seco =
6,5; **** representa la actividad de fosfatasa alcalina en el
testigo seco = 100%; y \geq representa por debajo del límite de
detección del ensayo.
| Tratamiento | Reducción del log_{10} del título del virus | Reducción | ||
| de la actividad de | ||||
| fos. alc. (%) **** | ||||
| Poliovirus * | Virus del sarampión ** | Parvovirus *** | ||
| 80ºC/72 horas | \geq 3,0 | \geq 4,1 | \geq 4,0 | 0 - 3 |
| 90ºC/20 horas | \geq 3,0 | \geq 4,1 | \geq 4,0 | 0 - 5 |
Se disolvió fibrinógeno (Fracción 1, Tipo
1-S, compañía Sigma Chemical) en soluciones al 10%
y al 25% de trehalosa o de sacarosa que contenían citrato de sodio
al 10% y cloruro de sodio al 15% y las soluciones se centrifugaron
para eliminar cualquier material insoluble y las concentraciones de
proteína se ajustaron a una concentración de fibrinógeno final de 5
mg/ml. Las soluciones madre de fibrinógeno se impurificaron con
10^{6,5} TCID 50/ml de parvovirus canino, y partes alícuotas de 12
ml de la solución de fibrinógeno se distribuyeron en viales de
vidrio farmacéuticos Wheaton y las muestras se secaron a vacío en
un secador FTS o se liofilizaron en un liofilizador Labconco. Para
el secado a vacío, las estanterías se enfriaron previamente a una
temperatura de 10ºC y el vacío se redujo a 30.000 mTorr. La
temperatura de las estanterías se elevó a continuación a 40ºC y el
vacío se redujo a 30.000 mTorr durante 2 minutos, a 20.000 mTorr
durante 2 minutos y a 10.000 mTorr durante 20 minutos. El vacío se
elevó a continuación a 30.000 mTorr durante 5 minutos y a
continuación se redujo a 30 mTorr y las muestras se secaron durante
una noche a una temperatura de las estanterías de 60ºC. Para la
liofilización, las muestras se congelaron a un régimen de 5ºC/min a
una temperatura de -40ºC, se mantuvieron a -40ºC durante 16 horas y
a continuación la temperatura de las estanterías se elevó a -35ºC y
las muestras se secaron a un vacío de 10 mTorr durante 80 horas. La
temperatura de las estanterías se elevó a 25ºC y las muestras se
secaron a un vacío de 10 mTorr durante 5 horas adicionales. Todos
los viales se sellaron a vacío y las muestras que se habían de
esterilizar finalmente se esterilizaron por calor calentándolas en
una estufa Heraeus a una temperatura de 90ºC durante 20 a 48
horas.
Los viales se reconstituyeron y se determinaron
la proteína soluble y la proteína coagulable. El ensayo de
coagulación para fibrinógeno consistió en una modificación del
ensayo de coagulación por trombina del National Institute of
Biological Standards. Dicho en pocas palabras, muestras de
fibrinógeno y patrones se coagularon mediante la adición de
trombina a la solución de fibrinógeno y se midieron la concentración
de proteína y el coágulo mediante solubilización del coágulo en
urea 7 M y cuantificando la absorbancia a 280 nm.
Al efectuar la adición de 3 ml de agua, todas las
preparaciones se reconstituyeron fácilmente excepto las
preparaciones de fibrinógeno/sacarosa que se habían expuesto a una
temperatura de 90ºC/20 horas. Las preparaciones de
fibrinógeno/sacarosa liofilizadas que se habían expuesto a una
temperatura de 90ºC/20 horas mostraron una coloración marrón
diferenciada. Los ensayos de proteína mostraron que la mayor parte
de la proteína se había disuelto al efectuar la reconstitución
(\sim 90%), excepto en el caso de los viales de
fibrinógeno/sacarosa a 90ºC/20 horas que mostraron una proteína muy
poco soluble. Los ensayos de coagulación mostraron que de la
proteína soluble, \sim 95% se coagulaba al efectuar la adición de
trombina. Un resumen de los resultados obtenidos se muestra en la
Tabla 4, que presenta el fibrinógeno coagulable y la reducción del
log_{10} del título de parvovirus.
| 80ºC/72 horas | 90ºC/20 horas | |||
| % coagulable | pérdida log. | % coagulable | pérdida log. | |
| Trehalosa | ||||
| Liofilizada | 87 | \geq 4 | 83 | 4,0 |
| Secada a vacío | 94 | \geq 3,75 | 89 | 3,75 |
| Sacarosa | ||||
| Liofilizada | 0 | 5 | 44 | \geq 5,0 |
| Secada a vacío | 68 | \geq 4,75 | 43 | \geq 4,75 |
Aunque la invención anteriormente expuesta se ha
descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para
propósitos de claridad y comprensión, resultará evidente para los
expertos en la materia que se pueden practicar ciertos cambios y
modificaciones. Por tanto, la descripción y los ejemplos no deberán
considerarse como limitativos del alcance de la invención, tal como
se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Claims (16)
1. Procedimiento para la esterilización final de
un producto biológicamente activo adecuado para una administración
estéril a un individuo, que comprende, calentar una muestra seca
que comprende el producto y una cantidad de
\alpha-D-
glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido
(trehalosa) suficiente para conferir una sustancial estabilidad
térmica al producto, a una temperatura y durante un periodo de
tiempo suficientes para inactivar sustancialmente el
parvovirus.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el producto biológicamente activo se obtiene a partir de una
fuente biológica seleccionada de entre el grupo que consiste en
sangre, plasma, suero, placenta, leche, orina, cultivos de células y
material sobrenadante de cultivos de células.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el producto se selecciona de entre el grupo que consiste
en productos de albúmina, inmunoglobulinas, productos de
coagulación, fibrinógeno e inhibidores de proteinasa.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que los productos de albúmina se seleccionan de entre el
grupo que consiste en HSA y globulina soluble en frío.
5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que las inmunoglobulinas se seleccionan de entre el grupo que
consiste en anticuerpos contra el tétanos, tosferina, hepatitis,
herpes, varicela zóster, lentivirus y rabia.
6. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que los productos de coagulación se seleccionan de entre el
grupo que consiste en factor VIII antihemofílico y complejo de
factor IX.
7. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que los inhibidores de proteinasa se seleccionan de entre el
grupo que consiste en inhibidor de proteinasa
\alpha-1 y antitrombina III.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el producto biológicamente activo es un analgésico.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el producto biológicamente activo es un anestésico.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el producto biológicamente activo es un agente
quimioterapéutico.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el producto biológicamente activo es una hormona.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el producto biológicamente activo es una vacuna.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustancial estabilidad
térmica da como resultado una pérdida de actividad del producto
inferior al 30%.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra seca presenta un
contenido de humedad residual inferior al 4%.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura de
calentamiento es por lo menos de 80ºC y la duración del
calentamiento es por lo menos de 72 horas.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura y la duración
del calentamiento son suficientes para dar como resultado una
reducción de la infectividad del parvovirus de por lo menos 10^{4}
veces.
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