ES2294802T3 - Hidrolasa de amidas de acidos grasos. - Google Patents

Hidrolasa de amidas de acidos grasos. Download PDF

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Abstract

LA actividad soporífica de la cis-9,10-octadecenoamida y otras amidas primarias de ácidos grasos soporíferas se neutraliza mediante hidrólisis en presencia de hidrolasa de amida de ácidos grasos (FAAH). La hidrólisis de cis-9,10-octadecenoamida por FAAH conduce a la formación de ácido oleico, un compuesto sin actividad soporífica. Se ha aislado la FAAH y se ha clonado el gen que codifica la FAAH, secuenciado y utilizado para expresar la FAAH recombinante. Se describen inhibidores de FAAH que bloquean la actividad hidrolasa.

Description

Hidrolasa de amidas de ácidos grasos.
Técnica
La invención se refiere a una enzima que cataliza una conversión hidrolítica entre amidas primarias de ácidos grasos soporíferas y sus correspondientes ácidos grasos y se denomina una hidrolasa de amidas de ácidos grasos (FAAH), a procedimientos para catalizar enzimáticamente tales conversiones, y a procedimientos para inhibir la catálisis enzimática de tales conversiones. Más particularmente, la invención se refiere a una proteína FAAH aislada según la reivindicación 1 y a su uso e inhibición.
Declaración de derechos gubernamentales
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental según una subvención de instrumentación compartida
de los Institutos Nacionales de Salud número 1 S10 RR07273-01. El gobierno tiene ciertos derechos en la inven-
ción.
Antecedentes
El sueño es un estado de comportamiento natural, periódico durante el cual el propio cuerpo descansa y se restauran sus facultades fisiológicas. Se caracteriza por una pérdida de reactividad frente al entorno. Durante el sueño, ciertos procesos fisiológicos tanto corporales como cerebrales funcionan de manera diferente a cómo lo hacen durante un estado de vigilia en alerta. El sueño normal está constituido por al menos dos estados de comportamiento bastante diferentes: sueño sincronizado, durante el cual el electroencefalograma está constituido por ondas lentas de gran amplitud, y sueño desincronizado (SD) o sueño activado caracterizado por movimientos oculares rápidos (sueño REM), en el que el patrón electroencefalográfico se caracteriza por ondas de alta frecuencia y baja amplitud. El sueño sincronizado se caracteriza adicionalmente por una respiración lenta y regular, por una tensión arterial y frecuencia cardiaca relativamente constantes, y por una predominancia de ondas delta. El sueño sincronizado está constituido habitualmente por cuatro fases, seguidas por un periodo de sueño activado. Cada ciclo dura entre 80 minutos y 120 minutos. En cambio, el sueño desincronizado se caracteriza adicionalmente por una respiración y frecuencia cardiaca irregulares, periodos de movimientos y contracciones musculares involuntarias, y un mayor umbral para despertarse. Los periodos de sueño desincronizado duran desde 5-20 minutos y se producen a intervalos de aproximadamente 90 minutos durante un sueño nocturno normal.
Los trastornos del sueño incluyen privación de sueño y sueño paroxístico, es decir, narcolepsia. No ha habido ningún procedimiento farmacológico conocido para potenciar o inhibir el inicio del sueño ni para mantener el estado de sueño o de vigilia.
El líquido cefalorraquídeo (liquor cerebrosinalis) es un líquido transparente, incoloro que circula dentro de los cuatro ventrículos del cerebro y los espacios subaracnoideos que rodean al cerebro y a la médula espinal. El líquido cefalorraquídeo se origina como un ultrafiltrado de la sangre secretado por el plexo coroideo en el tercer y cuarto ventrículos laterales. El líquido cefalorraquídeo también se denomina algunas veces neurolinfa. Tras pasar a través de los cuatro ventrículos y los espacios subaracnoideos, el líquido cefalorraquídeo se reabsorbe en gran parte dentro del sistema venoso a través de las vellosidades aracnoideas. El líquido cefalorraquídeo sirve como medio para la eliminación de catabolitos, excreciones y materiales de desecho de los tejidos bañados por él. Hasta la fecha, no se ha notificado que ningún factor derivado de líquido cefalorraquídeo se correlacione con la privación de sueño. Lo que se necesita es un procedimiento para analizar el líquido cefalorraquídeo para identificar un factor bioquímico generado por un sujeto que se correlacione con la privación de sueño.
Desde el descubrimiento fundamental de las prostaglandinas, ha habido un reconocimiento creciente del papel de los ácidos grasos y sus derivados en importantes procesos psicológicos, por ejemplo, B. Samuelsson, Les Prix Nobel 1982, págs. 153-174.
Se ha aislado la cis-9,10-octadecenoamida a partir del líquido cefalorraquídeo de gatos con privación de sueño y se ha mostrado que presenta propiedades inductoras del sueño cuando se inyecta a ratas. Se identificaron otras amidas primarias de ácidos grasos además de cis-9,10-octadecenoamida como constituyentes naturales del líquido cefalorraquídeo de gatos, ratas y hombres, lo que indica que estos compuestos componen una familia diferenciada de lípidos cerebrales. En conjunto, estos resultados enseñan que las amidas primarias de ácidos grasos representan una nueva clase de moléculas de señalización biológica que pueden emplearse para inducir el sueño en sujetos. Las amidas primarias de ácidos grasos preferidas incluyen una cadena de alquilo que tiene una insaturación y están representadas por la siguiente fórmula: NH_{2}C(O)(CH_{2})_{(6\geq n\leq 11)}CH=CH(CH_{2})_{(8\geq n\leq 5)}CH_{3}. Las amidas primarias de ácidos grasos soporíferas preferidas tienen una insaturación con una configuración cis en su cadena de alquilo. Además de cis-9,10-octadecenoamida, otras amidas primarias de ácidos grasos activas como soporífero incluyen cis-8,9-octadecenoamida, cis-11,12-octadecenoamida y cis-13,14-docosenoamida.
Deutsch et al, Biochem. Pharmacol., 46: 791 (1993) han identificado una actividad amidasa que cataliza tanto la hidrólisis como la síntesis de araquidoniletanolamida (anandamida) a partir de las fracciones subcelulares de membrana tomadas de neuroblastoma, células de glioma y homogeneizados brutos de tejidos de cerebro de rata. El estudio detectó la captación y ruptura enzimática de araquidoniletanolamida (anandamida) para dar ácido araquidónico (y viceversa) a partir de homogeneizados de tejidos procedentes de cerebro, hígado, riñón y pulmón pero no de músculos esqueléticos ni corazón de rata.
La fracción de membrana activa que presentó esta actividad amidasa se preparó homogeneizando la línea celular deseada y posteriormente sometiendo el homogeneizado bruto a una centrifugación por densidad o bien tomando los homogeneizados brutos de cerebros de rata e incubándolos directamente con anandamida.
Se sometió a ensayo la captación y degradación de araquidoniletanolamida (anandamida) mediante incubación de [^{3}H]-anandamida (NEN, NET-1073, 210 Ci/mmol) en el medio de cultivo celular. Mediante recuento por centelleo líquido de las fases acuosas y orgánicas se encontró que el ácido araquidónico y la anandamida se distribuían en la fase orgánica. Por tanto, se visualizó posteriormente el extracto orgánico del medio celular usando cromatografía en capa fina, se pulverizó con un potenciador de autorradiografía de superficie (EN^{3}HANCE, Dupont) y se expuso a una película de rayos X (Kodak X-OMAT AR) a -80ºC.
El inhibidor de serina proteasa, fluoruro de fenilmetilsulfonilo a una concentración de 1,5 mM inhibió completamente la actividad amidasa. Otros inhibidores sometidos a prueba tuvieron poco o ningún efecto sobre la actividad e incluyeron aprotinina, benzamidina, leupeptina, quimostatina y pepstatina.
En un segundo manuscrito, Deusch et al. (J. Biol Chem., 1994, 269, 22937) notifica la síntesis de varios tipos de inhibidores específicos de la hidrólisis de la anandamida y su capacidad para inhibir la ruptura de la anandamida in vitro. Se sintetizaron cuatro clases de compuestos e incluyen aciletanolamidas grasas, \alpha-cetoetanolamidas, \alpha-cetoetilésteres y trifluorometilcetonas. La clase más eficaz de compuestos fueron las trifluorometilcetonas y \alpha-cetoésteres. Los inhibidores menos potentes fueron las \alpha-cetoamidas y análogos saturados de anandamida.
Como ejemplo, cuando se incuba anandamida con células de neuroblastoma, se hidroliza rápidamente para dar araquidonato pero en presencia del inhibidor araquidoniltrifluorometilcetona, hay un aumento de 5 veces de los niveles de anandamida. El estudio deduce que los carbonilos polares tales como los que se encuentran en las trifluorometilcetonas, pueden formar hidratos estabilizados que imitan los productos intermedios tetraédricos formados durante la reacción entre el resto nucleófilo y el grupo carbonilo de la anandamida. Deutsch sugiere que el resto nucleófilo puede ser el centro activo de un hidroxilo de serina en la enzima hidrolítica.
Esta enzima se clasifica como una amidasa (EC nº 3.5) en la que la enzima actúa sobre enlaces carbono-nitrógeno distintos de los enlaces peptídicos. La actividad amidasa se inhibe mediante el inhibidor de serina proteasa, PMSF y la acción de inhibidores de trifluorometilcetona (y otros) afecta directamente a la actividad hidrolítica de la enzima. Además, Deutsch sugiere que la anandamida se rompe mediante un mecanismo que implica un grupo hidroxilo de serina de centro activo.
Lo que se necesita es una identificación de enzimas dentro del tejido cerebral que catalicen la degradación del compuesto soporífero que se encuentra en el líquido cefalorraquídeo, para mediar la actividad soporífera de estos compuestos. Lo que se necesita es una identificación de inhibidores para inhibir la actividad de enzimas que degradan compuestos soporíferos del tipo que se encuentra en el líquido cefalorraquídeo.
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Breve resumen de la invención
En el presente documento se da a conocer una enzima que degrada amidas primarias de ácidos grasos soporíferas, y se denomina hidrolasa de amidas de ácidos grasos, o FAAH. La FAAH es una de las enzimas que median la actividad de las amidas primarias de ácidos grasos, incluyendo amidas primarias de ácidos grasos soporíferas.
Tal como se da a conocer en el presente documento, la FAAH se caracteriza por una actividad enzimática para catalizar una conversión de cis-9,10-octadecenoamida en ácido oleico, entre otros sustratos, tal como se muestra en el esquema 1 a continuación, y por tanto se identificó originalmente como cis-9,10-octadecenoamidasa. Sin embargo, ahora se ha mostrado que la FAAH tiene actividad para hidrolizar una variedad de amidas primarias de ácidos grasos, y por tanto la amidasa originalmente denominada cis-9,10-octadecenoamidasa se denomina de manera más apropiada FAAH.
\newpage
Esquema 1
1
Un aspecto de la invención se refiere a una forma purificada de FAAH. La FAAH puede purificarse mediante una variedad de procedimientos, incluyendo una metodología cromatográfica. Las metodologías cromatográficas preferidas incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía eléctrica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de reparto. En la cromatografía de afinidad, un adsorbente en fase sólida contiene grupos que se unen a proteínas particulares porque se parecen a ligandos para los que las proteínas tienen una afinidad natural. En un modo preferido, el adsorbente en fase sólida contiene uno o más inhibidores de FAAH que se unen a la enzima. En la cromatografía de afinidad de anticuerpos, se emplea un inmunoadsorbente en fase sólida que tiene anticuerpos con una especificidad de unión con respecto a la FAAH. En la cromatografía eléctrica o electroforesis, la FAAH se separa de otras moléculas según su peso molecular o su punto isoeléctrico. En la cromatografía de filtración en gel, también conocida como de permeación en gel, tamiz molecular y de exclusión, la fase sólida crea una fase estacionaria de disolvente en gel y una fase móvil de disolvente excluido. La FAAH se separa según su tamaño molecular a medida que se reparte entre las fases estacionaria y móvil. Las partículas de gel se seleccionan para que tengan un tamaño de exclusión superior al de la FAAH. En la cromatografía de intercambio iónico, se emplea un intercambiador de iones en fase sólida para separar la FAAH de otras moléculas según su reparto entre fuerzas iónicas y no iónicas. En la cromatografía de reparto, se emplean fluidos inmiscibles que tienen fases estacionaria y móvil para separar la FAAH según su reparto entre las dos fases no miscibles. Las metodologías cromatográficas preferidas incluyen cromatografía en DEAE, cromatografía de afinidad sobre una fase sólida que tiene grupos Hg unidos derivatizados con un inhibidor de FAAH tal como una trifluorocetona.
En un modo preferido, se purifica una fuente en bruto de FAAH en cuatro etapas. En la primera etapa, se purifica una fuente en bruto de FAAH mediante cromatografía de intercambio usando una columna de cromatografía de DEAE para formar un primer producto de elución. En la segunda etapa, se purifica adicionalmente el producto de elución de la primera etapa mediante reparto con cromatografía de afinidad para formar un segundo producto de elución. En la tercera etapa, se purifica adicionalmente el producto de elución de la segunda etapa mediante reparto con cromatografía de afinidad de heparina para formar un tercer producto de elución. En la cuarta etapa, se purifica adicionalmente el producto de elución de la tercera etapa mediante reparto con una fase estacionaria derivatizada con un inhibidor de trifluorocetona de FAAH. El eluyente de la cuarta etapa forma la forma purificada de FAAH.
Puede aislarse FAAH a partir de cualquiera de una variedad de especies de mamíferos, incluyendo rata, ratón o ser humano, tal como se describe en el presente documento.
La hidrolasa de amidas de ácidos grasos (FAAH) se caracteriza por la inclusión de una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo constituido por:
a.) GGSSGGEGALIGSGGSPLGLGTDIGGSIRFP
(SEC ID NO 5),
b.) SPGGSSGGEGALIGS
(SEC ID NO 6),
c.) ALIGSGGSPLGLGTD
(SEC ID NO 7),
d.) GLGTDIGGSIRFPSA
(SEC ID NO 8),
e.) RFPSAFCGICGLKPT
(SEC ID NO 9),
f.) GLKPTGNRLSKSGLK
(SEC ID NO 10),
g.) KSGLKGCVYGQTAVQ
(SEC ID NO 11),
h.) QTAVQLSLGPMARDV
(SEC ID NO 12),
i.) MARDVESLALCLKAL
(SEC ID NO 13),
j.) CLKALLCEHLFTLDP
(SEC ID NO 14),
k.) FTLDPTVPPFPFREE
(SEC ID NO 15),
l.) PFREEVYRSSRPLRV
(SEC ID NO 16),
m.) RPLRVGYYETDNYTM
(SEC ID NO 17),
n.) DNYTMPSPAMRRALI
(SEC ID NO 18),
o.) RRALIETKQRLEAAG
(SEC ID NO 19),
p.) LEAAGHTLIPFLPNN
(SEC ID NO 20),
q.) FLPNNIPYALEVLSA
(SEC ID NO 21),
r.) EVLSAGGLFSDGGRS
(SEC ID NO 22),
s.) DGGRSFLQNFKGDFV
(SEC ID NO 23),
t.) KGDFVDPCLGDLILI
(SEC ID NO 24),
u.) DLILILRLPSWFKRL
(SEC ID NO 25),
v.) WFKRLLSLLLKPLFP
(SEC ID NO 26),
w.) KPLFPRLAAFLNSMR
(SEC ID NO 27),
x.) LNSMRPRSAEKLWKL
(SEC ID NO 28),
y.) KLWKLQHEIEMYRQS
(SEC ID NO 29),
z.) MYRQSVIAQWKAMNL
(SEC ID NO 30),
aa.) KAMNLDVLLTPMLGP
(SEC ID NO 31), y
ab.) PMLGPALDLNTPGR
(SEC ID NO 32).
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Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para catalizar la hidrólisis de una amida primaria de ácido graso según la reivindicación 1. En este procedimiento de hidrólisis, se combina o se pone en contacto in vitro la amida primaria de ácido graso con una cantidad catalítica de la forma purificada de FAAH según la reivindicación 1. En un modo preferido, la amida primaria de ácido graso es de un tipo que incluye una cadena de alquilo que tiene una insaturación o está representada más particularmente por la siguiente fórmula:
NH_{2}C(O)(CH_{2})_{(6\geq n\leq 11)}CH=CH(CH_{2})_{(9\geq n\leq 5)}CH_{3}.
Más particularmente, la insaturación de la cadena de alquilo puede tener una configuración cis o puede ser de manera idéntica cis-9,10-octadecenoamida, cis-8,9-octadecenoamida, cis-11,12-octadecenoamida o cis-13,14-docosenoamida.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inhibir una hidrólisis catalizada enzimáticamente de amidas primarias de ácidos grasos, tal como cis-9,10-octadecenoamida, mediante FAAH en el que la FAAH es según la reivindicación 1. En este procedimiento, se combina o se pone en contacto in vitro la FAAH según la reivindicación 1 con un inhibidor de FAAH. Los inhibidores preferidos incluyen fluoruro de fenilmetilsulfonilo, HgCl_{2} y una trifluorocetona que tiene la siguiente estructura:
2
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para determinar la actividad inhibidora de un inhibidor candidato de FAAH, en el que la FAAH es según la reivindicación 1. Así, se mezcla la FAAH según la reivindicación 1 con un inhibidor de FAAH candidato para evaluar la capacidad inhibidora en un procedimiento de selección.
En un procedimiento preferido para determinar la actividad inhibidora de un inhibidor de FAAH candidato, el procedimiento contemplado comprende cinco etapas. En la primera etapa, se forma una mezcla "A" combinando FAAH y sustrato de cis-9,10-octadecenoamida en condiciones de reacción. En la segunda etapa, se forma una mezcla "B" combinando la mezcla "A" con el inhibidor candidato. En la tercera etapa, se cuantifica la conversión de sustrato de cis-9,10-octadecenoamida en un producto de hidrólisis en la mezcla "A". En la cuarta etapa, se cuantifica la conversión de sustrato de cis-9,10-octadecenoamida en producto de hidrólisis en la mezcla "B". En la quinta etapa, se determina la actividad inhibidora del inhibidor candidato comparando las cuantificaciones de las etapas tres y cuatro.
Otro aspecto de la invención se refiere a una o más secuencias de nucleótidos que codifican parte o toda la FAAH, en las que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID NO: 35, SEC ID NO: 39 y SEC ID NO: 42. La secuencia de nucleótidos completa que codifica FAAH humana, de ratón o de rata se muestra en SEC ID NO 42, 39 ó 35, respectivamente.
La secuencia de nucleótidos parcial de FAAH de rata está representada tal como sigue:
3
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra las estructuras del agente natural, cis-9,10-octadecenoamida (1), análogos relacionados (2-6). El compuesto 6 es la estructura preferida para la amida de ácido graso C_{22} que se produce en la naturaleza.
La figura 2 ilustra la secuencia de aminoácidos parcial determinada de la FAAH de rata tal como se describe en la sección B.4.
La figura 3 ilustra una estrategia de purificación parcial que implica el aislamiento de una fracción de proteína de membrana plasmática a partir de hígado de rata usando 1) un gradiente en sacarosa de la membrana hepática seguido por 2) un lavado con carbonato de sodio 100 mM y 3) solubilización en tampón basado en Trion. Entonces se purifica la membrana plasmática de hígado aislada mediante cuatro etapas cromatográficas consecutivas: 1) columna de DEAE de intercambio iónico, 2) columna de inhibición de mercurio, 3) columna de heparina de intercambio de detergente seguido por 4) una columna de afinidad con un inhibidor de trifluorocetona. Se determinó que la proteína purificada tenía un enriquecimiento de 20-30 veces de la actividad amidasa a partir de la fracción de proteína de membrana en bruto mediante comparación visual de la intensidad de la banda de proteína purificada con la fracción de proteína en bruto. El rendimiento purificado estimado es del 10-15% a partir de la proteína de membrana plasmática de hígado en bruto.
La figura 4 ilustra la estrategia de purificación con columna de afinidad (etapa 4, figura 3) usando un inhibidor de trifluorocetona que está unido a un soporte sólido derivatizado con disulfuro (perlas de disulfuro de piridilo).
La figura 5 ilustra el protocolo sintético para la síntesis del inhibidor de trifluorocetona y la posterior unión del inhibidor al soporte sólido derivatizado con disulfuro usando perlas de disulfuro de piridilo.
La figura 6 representa un autorradiograma de una placa de cromatografía en capa fina (SiO_{2}, acetato de etilo al 55%/hexanos) que ilustra la actividad FAAH de una fracción de membrana de cerebro de rata con respecto a la hidrólisis de cis-9,10-octadecenoamida radiomarcada para dar ácido oleico y su inhibición mediante fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Número de carril, contenido: carril 1, patrón de cis-9,10-octadecenoamida; carril 2, cis-9,10-octadecenoamida con fracción soluble de cerebro de rata; carril 3, cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata; carril 4, cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata + fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM; carril 5, cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata + EDTA 5 mM; carril 6, cis-9,10-octadecenoamida con microsomas pancreáticos de rata; carril 7, cis-9,10-octadecenoamida con proteinasa K (200 mg); carril 8, patrón de ácido oleico.
La figura 7 representa un autorradiograma de una placa de cromatografía en capa fina (SiO_{2}, acetato de etilo al 55%/hexanos) que ilustra la actividad FAAH de una fracción de membrana de cerebro de rata con respecto a la hidrólisis de cis-9,10-octadecenoamida radiomarcada para dar ácido oleico y su inhibición mediante cloruro mercúrico (HgCl_{2}). Las concentraciones óptimas requeridas para la inhibición de la actividad de hidrólisis de amida se encuentran entre HgCl_{2} 50 mM y 5 mM. Los diversos carriles de la placa de CCF se identifican tal como sigue: carril 1, patrón de cis-9,10-octadecenoamida; carril 2, cis-9,10-octadecenoamida con fracción soluble de cerebro de rata; carril 3, cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata y HgCl_{2} 500 mM; carril 4, cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata y HgCl_{2} 50 mM; carril 5, cis-9,10- octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata y HgCl_{2} 5 mM; carril 6, patrón de ácido oleico. Un estudio de inhibición con HgCl_{2} típico utiliza una disolución madre de HgCl_{2} 100 mM (27 mg en 1 ml de tampón Tris (50 mM), pH 7,5) de HgCl_{2}.
La figura 8 representa una transferencia de tipo Northern de ARNm obtenido mediante procedimientos de clonación. Se muestran marcadores ribosómicos mediante las flechas, junto al carril 1, e indican bandas de 5 kb y 2 kb. La flecha junto al carril 6 apunta a una banda de 3 kb que es representativa de la enzima oleico amidasa. El carril 1 es ARN total procedente de cerebro de rata; el carril 2 es ARN total procedente de pulmón de rata; el carril 3 es ARN total procedente de riñón de rata; el carril 4 es ARN total procedente de corazón de rata; el carril 5 es ARN total procedente de hígado de rata; carril 6 es ARNm procedente de hígado de rata (el ARNm cargado en el carril 6 es de aproximadamente 500 ng); el ARN respectivo total en los carriles 1-5 fue de aproximadamente 15 \mug.
La figura 9 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos codificada deducida de la oleamida hidrolasa de rata también denominada hidrolasa de amidas de ácidos grasos o FAAH (SEC ID NO 36). La FAAH de rata codificada se abrevia de manera apropiada como rFAAH. La negrita indica el supuesto dominio de extensión transmembrana según se predice por PSORT. Las siete regiones subrayadas discontinuas indican los siete péptidos separados, cuya denominación es consecutiva, obtenidos mediante purificación por HPLC de un digesto con tripsina de la enzima. El segmento con subrayado doble es la supuesta secuencia de unión al dominio SH3.
Las figuras 10-1 a 10-5 muestran la secuencia de ADNc bicatenario continua para FAAH de rata según se describe en la sección D. La secuencia de aminoácidos codificada también se indica comenzando con el sitio de iniciación ATG que codifica metionina (M). También se muestra el codón de terminación recuadrado. Las cadenas superior e inferior de la secuencia de ADNc se indican respectivamente en SEC ID NO 35 y 37 con la secuencia de aminoácidos indicada junto con la secuencia de nucleótidos en SEC ID NO 35 y sola en SEC ID NO 36.
La figura 11 ilustra la alineación de la región de secuencia distintiva de amidasa de la FAAH de rata (SEC ID NO 36 desde el resto de aminoácido 215 hasta, e incluyendo, el 246) con otras amidasas representativas varias tal como se describe adicionalmente en la sección D1. Los restos de la secuencia distintiva que se conservan completamente entre los miembros de la familia se muestran en negrita y la posición de aminoácido relativa de la secuencia distintiva de cada miembro se proporciona mediante los números justo antes y después de la información de secuencia. Desde la parte superior hacia la inferior, las secuencias tienen los siguientes SEC ID No respectivos: 36 (desde el resto 215 hasta el 246); 47, 48, 49, 50, 51, 52 y 53.
Las figuras 12A y 12B muestran los resultados respectivos de transferencias de tipo Southern y Northern tal como se analizan con sonda con un fragmento de 800 pb interno de ADNc de FAAH de rata tal como se describe adicionalmente en la sección D.
Las figuras 13-1 a 13-4 muestran la secuencia de ADNc bicatenario continua para FAAH de ratón tal como se describe en la sección D2. También se indica la secuencia de aminoácidos codificada comenzando con el sitio de iniciación ATG que codifica metionina (M). También se muestra el codón de terminación recuadrado. Las cadenas superior e inferior de la secuencia de ADNc se indican respectivamente en SEC ID NO 39 y 41 con la secuencia de aminoácidos indicada junto con la secuencia de nucleótidos en SEC ID NO 39 y sola en SEC ID NO 40.
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Las figuras 14-1 a 14-5 muestran la secuencia de ADNc bicatenario continua para FAAH humana tal como se describe en la sección D3. También se indica la secuencia de aminoácidos codificada comenzando con el sitio de iniciación ATG que codifica metionina (M). También se muestra el codón de terminación recuadrado. Las cadenas superior e inferior de la secuencia de ADNc se indican respectivamente en SEC ID NO 42 y 44 con la secuencia de aminoácidos indicada junto con la secuencia de nucleótidos en SEC ID NO 42 y sola en SEC ID NO 43.
La figura 15A muestra la expresión de FAAH de rata recombinante en células COS-7 producidas tal como se describe en la sección E realizado mediante cromatografía en capa fina demostrando la conversión de oleamida marcada en ácido oleico tal como se describe adicionalmente en la sección F.
La figura 15B muestra la inhibición de FAAH de rata recombinante mediante trifluorometilcetona también realizada tal como se describe en la figura 15A según se describe adicionalmente en la sección F.
La figura 15C muestra los resultados de inmunotransferencia de tipo Western de FAAH de rata recombinante con anticuerpos generados contra el péptido 2 tal como se muestra en la figura 9, tal como se muestra en los cuatro carriles de la izquierda (1-4) y comparado con el péptido 2 tal como se muestra en los cuatro carriles de la derecha (5-8). Se presentan muestras de células COS-7 no transfectadas en los carriles 4 y 8, se muestran extractos de células COS-7 transfectadas con FAAH en los carriles 3 y 7, se muestra FAAH de rata purificada por afinidad en los carriles 2 y 6 y se hace correr una mezcla de extractos de células COS-7 transfectadas con FAAH y FAAH purificada por afinidad en los carriles 1 y 5. Se analizaron las proteínas con sondas de anticuerpos en ausencia (carriles 1-4) o presencia (carriles 5-8) de antígeno peptídico competidor. El extracto de células COS-7 transfectadas con FAAH, pero no el control, contenía una proteína inmunorreactiva de 60 K-65 K que se eliminó eficazmente mediante competición mediante preincubación de los anticuerpos con antígeno peptídico en exceso mientras que el péptido no competía con cantidades traza de proteína de reacción cruzada observadas en extractos de células COS-7 tanto transfectadas como no transfectadas.
La figura 16 muestra la capacidad de FAAH expresada recombinante humana para hidrolizar oleamida para dar ácido oleico, tal como se describe adicionalmente en la figura 15A con cromatografía en capa fina y en la sección F.
La figura 17 muestra los resultados de la cromatografía en capa fina que demuestran la conversión de anandamida marcada en ácido araquidónico en células COS-7 transfectadas con FAAH de rata tal como se muestra en el carril 3 pero no en células no transfectadas control (carril 2). Los patrones para CCF de anandamida y ácido araquidónico se muestran en los carriles 1 y 4, respectivamente.
Descripción detallada de la invención A. Protocolos para la inducción de sueño
Se inyectó (i.p.) cis-9,10-octadecenoamida sintética en ratas con el fin de someter a prueba su efecto sobre el comportamiento espontáneo a diferentes dosis: 1 (n=2), 2 (n=2), 5 (n=7), 10 (n=10), 20 (n=2) y 50 (n=2) mg, en las que n = número de ratas sometidas a prueba. Se inyectó a las ratas durante un periodo de oscuridad invertido (12:12) dos horas después de apagarse las luces y se les observó en sus jaulas. Con las dosis menores (1 y 2 mg), no se observó ningún efecto manifiesto sobre el comportamiento espontáneo. Sin embargo, a un umbral de 5 mg y superior hubo un efecto marcado constituido por una inducción de quiescencia motora de larga duración asociada con comportamiento sedado, con ojos cerrados, característico del sueño normal. Además, al igual que con el sueño normal, las ratas todavía respondían a estímulos auditivos con reflejos de orientación y atención sostenida hacia la fuente de estimulación. Además, el comportamiento motor se vio afectado. La latencia hasta la sedación del comportamiento tras la administración fue de aproximadamente 4 minutos y los sujetos volvían a estar activos normalmente tras 1 hora (5 mg), 2 horas (10 mg) o 2,5 horas (20 mg y 50 mg).
Se comparó cis-9,10-octadecenoamida con vehículo y los análogos sintéticos indicados en la figura 1 para estimar la especificidad estructural de su potencial de inducción de sueño. Ni el vehículo (etanol al 5% en solución salina) ni el ácido oleico (5) mostraron ningún efecto manifiesto sobre el comportamiento. La trans-9,10-octadecenoamida demostró efectos farmacológicos similares a su homólogo cis, pero fue mucho menos potente según se mide mediante el tiempo de duración comparativamente más corto para sus propiedades de inducción de sueño (a 10 mg por rata, el efecto biológico duró una hora para el isómero trans y dos horas para el isómero cis). Cuando se movió la olefina en cualquier dirección a lo largo de la cadena de alquilo (hacia las posiciones 8,9 (3) o 11,12 (4)) o se extendió la longitud de la cadena de alquilo hasta 22 carbonos (6), se observó una reducción sustancial tanto en el grado como en la duración de los efectos farmacológicos, y aunque todavía disminuyó la movilidad de las ratas, sus ojos permanecieron abiertos y su estado de alerta sólo pareció ligeramente afectado. Finalmente, estudios polisomnográficos con ratas a las que se inyecta cis-9,10-octadecenoamida muestran un aumento en el tiempo total de sueño de ondas lentas (SWS) así como la duración media de los periodos individuales de SWS en comparación con controles de vehículo. Más particularmente, se implantó a ratas Sprague-Dawley macho (300 g en el momento de la cirugía), con anestesia con halotano (al 2-3%), con un conjunto convencional de electrodos para registros del sueño. Esto incluyó dos electrodos espirales colocados en el hueso parietal por encima del hipocampo para registrar el electroencefalograma (EEG) de los sujetos y dos electrodos de alambre insertados en la musculatura del cuello para registrar el tono postural mediante la actividad electromiográfica (EMG). Se alojaron las ratas individualmente con un acceso a voluntad a alimentos y agua. Se controló el ciclo de luz-oscuridad (12:12, encendiendo la luz a las 10:00 p.m.). Una semana después de la cirugía, se habituaron las ratas a las condiciones de registro durante al menos tres días. Tras completar el periodo de habituación, las ratas recibieron 2 mililitros (i.p.) de: vehículo (etanol al 5%/solución salina), cis-9,10-octadecenoamida (10 mg) o bien ácido oleico (10 mg). Se registraron de manera continua las ratas durante cuatro horas tras la inyección i.p. (12:00 p.m.-4:00 p.m.). Se observaron las ratas para detectar cambios espontáneos en el comportamiento a través de una ventana unidireccional. Se puntuaron visualmente los registros del sueño y se determinaron cuatro fases: estado de vigilia,
sueño de ondas lentas 1 (SWS1), sueño de ondas lentas 2 (SWS2) y sueño de movimientos oculares rápidos (REM).
Estos aumentos con respecto al sueño de ondas lentas (SWS) fueron a costa de despertarse. La distribución del sueño REM no parece verse alterada. Tomados juntos, estos datos sugieren que la cis-9,10-octadecenoamida podría desempeñar un papel importante en la modulación del sueño de ondas lentas.
La visión tradicional de las moléculas lipídicas como elementos estructurales pasivos de la arquitectura celular está dando paso rápidamente a una conciencia cada vez mayor de los papeles activos que desempeñan estos agentes en la transducción de señales celulares y modificación del comportamiento celular, por ejemplo, Liscovitch et al, Cell, 77: 329 (1994). Una característica interesante de las amidas de ácidos grasos estudiadas en el presente documento es que pertenecen a una familia de moléculas sencillas en la que puede generarse una gran cantidad de diversidad simplemente variando la longitud de la cadena de alcano y la posición, estereoquímica y número de su(s) olefina(s). De manera interesante, se han notificado otras moléculas de señalización neuroactivas con modificaciones de amida en sus extremos carboxi-terminales, a partir de péptidos con extremo terminal de carboxamida para dar araquidoniletanolamida. Se dan a conocer moléculas de señalización neuroactivas que emplean péptidos con extremo terminal de carboxamida por Eipper et al, Annu. Rev. Neurosci., 15: 57 (1992). Se dan a conocer moléculas de señalización neuroactivas que emplean araquidoniletanolamida por Devane et al, Science, 258: 1946 (1992). En el presente documento se da a conocer que cis-9,10-octadecenoamida es un miembro de una nueva clase de efectores biológicos en la que variaciones sencillas de una estructura química central tienen consecuencias fisiológicas únicas.
B. Aislamiento y ensayo de fracción de proteína de membrana integral con actividad FAAH 1. Observaciones sobre la actividad lípido amidasa
Se observó actividad lípido amidasa en tejidos cerebral, hepático, pulmonar, renal y de bazo, pero no en tejido cardiaco. Se inhibe la actividad mediante PMSF 1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y HgCl 50 mM, que es una prueba para determinar la dependencia de grupo sulfhidrilo de la reacción. Ya que las fracciones no se solubilizan mediante carbonato de sodio 100 mM (pH 11,5), la muestra es aparentemente una proteína de membrana, que se ha identificado en fracciones subcelulares nucleares, microsómicas y de membrana plasmática, pero no en el citosol.
La hidrólisis catalizada por enzima de cis-9,10-octadecenoamida para dar ácido oleico mediante cis-9,10-octadecenoamida purificada y la inhibición de esta enzima mediante PMSF se dan a conocer en un autorradiograma de una placa de cromatografía en capa fina (SiO_{2}, acetato de etilo al 55%/hexanos), ilustrada en la figura 6. En cada caso, se realiza la reacción enzimática en un recipiente de reacción separado y se coloca el producto sobre una placa de CCF. Las diversas condiciones de reacción para el recipiente de reacción correspondiente a cada carril se identifican tal como sigue:
carril 1: patrón de cis-9,10-octadecenoamida;
carril 2: cis-9,10-octadecenoamida con fracción soluble de cerebro de rata;
carril 3: cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata;
carril 4: cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata + PMSF 1 mM;
carril 5: cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata + EDTA 5 mM;
carril 6: cis-9,10-octadecenoamida con microsomas pancreáticos de rata;
carril 7: cis-9,10-octadecenoamida con proteinasa K (200 mg); y
carril 8: patrón de ácido oleico.
En la figura 7, se ilustran estudios de inhibición de la hidrólisis de cis-9,10-octadecenoamida para dar ácido oleico con HgCl_{2}. Las concentraciones óptimas requeridas para la inhibición de la actividad de hidrólisis de amida se encuentran entre HgCl_{2} 50 mM y 5 mM. La hidrólisis catalizada por enzima de cis-9,10-octadecenoamida para dar ácido oleico mediante cis-9,10-octadecenoamida purificada y la inhibición de esta enzima mediante HgCl_{2} se realizan en una serie de recipientes de reacción y se colocan sobre una placa de cromatografía en placa fina (SiO_{2}, acetato de etilo al 55%/hexanos). Un estudio típico de inhibición con HgCl_{2} usa una disolución madre de HgCl_{2} 100 mM (27 mg en 1 ml de tampón Tris (50 mM), pH 7,5) de HgCl_{2}. Las diversas condiciones de reacción para los recipientes de reacción correspondientes a cada carril se identifican tal como sigue:
carril 1: patrón de cis-9,10-octadecenoamida;
carril 2: cis-9,10-octadecenoamida con fracción soluble de cerebro de rata;
carril 3: cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata y HgCl_{2} 500 mM;
carril 4: cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata y HgCl_{2} 50 mM;
carril 5: cis-9,10-octadecenoamida con fracción de membrana de cerebro de rata y HgCl_{2} 5 mM;
carril 6: patrón de ácido oleico.
Esquema 2
4
Se ha identificado una actividad enzimática única que puede degradar la supuesta molécula efectora, cis-9,10-octadecenoamida, y se da a conocer en el presente documento. Se observó mediante CCF la rápida conversión de ^{14}C-cis-9,10-octadecenoamida en ácido oleico mediante fracciones de membrana de cerebro de rata. La actividad enzimática no se vio afectada por EDTA 5 mM, pero se inhibió completamente mediante fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Sólo se observó actividad de hidrólisis de amida en trazas con fracciones solubles de cerebro de rata, mientras que los microsomas pancreáticos de rata y la proteinasa K no mostraron capacidad significativa para hidrolizar cis-9,10-octadecenoamida para dar ácido oleico.
2. Síntesis de amidas primarias de ácidos grasos
Se proporcionan protocolos preferidos para sintetizar amidas primarias de ácidos grasos a modo de ejemplo. Los protocolos sintéticos sólo se diferencian con respecto a la longitud de cadena de los materiales de partida, los rendimientos del producto y la separación de los diversos productos cis y trans. En consecuencia, se proporcionan descripciones a modo de ejemplo de protocolos sintéticos para la síntesis de cis-9,10-octadecenoamida y otras amidas primarias de ácidos grasos varias y sirven para ilustrar el protocolo sintético para toda la clase de amidas primarias de ácidos grasos.
3. Aislamiento de fracción de proteína de membrana integral de rata con actividad FAAH
El protocolo descrito en el presente documento es para aproximadamente 5-10 g de tejido. Se recoge(n) el/los hígado(s) de rata, se pesa(n) y entonces se pone(n) en NaHCO_{3} 1 mM en hielo. A continuación, se corta el hígado, se aclara (2X) con NaHCO_{3} 1 mM y se tritura con una cuchilla sobre una lámina de cera. Entonces se pone en 25 ml de bicarbonato de sodio 1 mM y se homogeneiza en un homogeneizador de tejidos durante 2 minutos en la posición 6. Posteriormente se realiza una dilución hasta 100 ml con bicarbonato de sodio 1 mM, lo que va seguido por una filtración a través de 4 capas de gasa y después a través de 8 capas. Entonces se lleva el filtrado hasta 100 ml y se divide en cuatro tubos JA-20 y se cubren con bicarbonato de sodio 1 mM. Se centrifugan los tubos a 6.000 rpm (4500 x g) durante 12 minutos a 4ºC en el rotor JA-20. Usando una pipeta Pasteur, se separa por aspiración la fase de grasa y se decanta y se guarda la fase de sobrenadante.
A continuación, se resuspende el sedimento en la fase de sobrenadante restante con una jeringuilla y una aguja. Entonces se someten 16 veces a homogeneización con Dounce fracciones de 20 ml de la resuspensión con un homogeneizador Dounce de 15 ml. Entonces se combinan las fracciones en un único tubo JA-20 y se enrasan con NaHCO_{3} 1 mM. A continuación vuelven a centrifugarse los tubos a 6.000 rpm (4500 x g) durante 15 minutos a 4ºC en un rotor JA-20 y posteriormente se separa el sobrenadante mediante vertido y se guarda. Se resuspende el sedimento y se somete a homogeneización con Dounce tal como anteriormente y entonces se enrasa hasta el volumen de 10 ml con bicarbonato de sodio 1 mM. A continuación, se añaden 20 ml de disolución de sacarosa al 67% hasta un volumen final de 30 ml y se divide la mezcla en 2 tubos. Se añaden otros 25 ml de sacarosa al 30% en la parte superior de cada tubo y se centrifugan a 27 K rpm durante 1 hora y 45 minutos a 4ºC en una ultracentrífuga. Se recogen las fracciones del gradiente en sacarosa y se pone la banda intermedia del gradiente en sacarosa (banda de membrana plasmática) en un tubo de plástico con tapón y se llena con bicarbonato de sodio 1 mM. Posteriormente se centrifuga el tubo a 17.000 rpm durante 35 minutos a 4ºC.
Se desecha el sobrenadante y se resuspenden los sedimentos (con homogeneización en Dounce) en 100 mM de carbonato de sodio. Posteriormente se mantiene esta disolución en hielo durante 1 hora y después se centrifuga a 100.000 g durante 1 hora. Se desecha el sobrenadante (proteínas de membrana periférica solubilizadas) ya que no hay actividad lípido amidasa presente en esta fracción y se resuspende el sedimento (con homogeneización en Dounce) en tampón de glicerol al 10%, Triton al 1%, fosfatidilcolina al 0,1%, Hepes 20 mM y entonces se agita durante dos horas a 4ºC. Finalmente se centrifuga la disolución a 100.000 g durante 1 hora y se purifica adicionalmente el sobrenadante así obtenido tal como sigue.
4. Purificación mediante el procedimiento de cromatografía en columna de 4 etapas
Etapa 1, columna de DEAE/intercambio iónico (figura 3). Se purifica adicionalmente el lote de sobrenadante solubilizado anterior. Se mezcla el lote de sobrenadante con resina de intercambio iónico DEAE-Sephadex (dietilaminoetil-Sephadex, comercialmente disponible de Sigma chemical company) durante 1 hora a 4ºC. La fracción que se une a la resina de DEAE, presenta la actividad lípido amidasa (nada en la fracción no retenida). Se hace pasar membrana plasmática de hígado de rata solubilizada (en BI: glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%, EDTA 1 mM, Hepes 20 mM, pH 7,2) sobre una columna de DEAE Fast Flow (Pharmacia) y se lava con 5 volúmenes de columna de BI, Triton al 0,2%. Entonces se eluye la actividad amidasa con 1 volumen de columna de NaCl de cada uno de 50 mM, 100 mM y 200 mM en BI con Triton al 0,2%.
Etapa 2, columna de Hg (figura 3). Se mezcla el eluyente anterior del intercambio con DEAE, con resina de ácido p-cloromercuriobenzoico (comercialmente disponible de BioRad chemical company) durante 1 hora a 4ºC. La fracción que se une a la resina de mercurio anterior presenta la actividad lípido amidasa (nada en la fracción no retenida), se lava con 5 volúmenes de columna de BI con Triton al 0,2%, 5 volúmenes de columna de BI con Triton al 0,2% y NaCl 150 mM, y se eluye con 1,5 volúmenes de columna BI con Triton al 0,2%, NaCl 150 mM y b-mercaptoetanol 25 mM.
Etapa 3, columna de heparina (figura 3). Se hizo pasar la actividad amidasa eluida con Hg sobre una columna de heparina (BioRad) y se lavó con 10 volúmenes de columna de BI con CHAPS al 0,7% y NaCl 150 mM (intercambio de detergente). Se realizó la elución con 1 volumen de columna de cada uno de BI con CHAPS al 0,7% y NaCl 300 mM, 400 mM, 500 mM, 650 mM y 750 mM, respectivamente, eluyendo la actividad amidasa en las dos fracciones finales.
Etapa 4, columna de afinidad (figuras 3 y 4). Se mezcló la actividad amidasa eluida con heparina con Triton X-100 para una concentración final del 0,2%, y entonces se hizo pasar sobre inhibidor de CF unido a perlas de disulfuro de piridilo activado (103: la unión del inhibidor a las perlas se describe a continuación) y se lavó con 20 volúmenes de columna de BI con Triton X-100 al 0,2%. Se realizó la elución haciendo pasar 3 volúmenes de columna de BI con Triton al 0,2% y DTT 20 mM, y dejando reposar la columna a 40ºC durante 30 h. Entonces, lavando la columna con 1,5 volúmenes de columna de BI con Triton al 0,2% y DTT 20 mM se eluyó una única proteína de 60 kD de tamaño.
Se digirió la proteína de 60 kd eluida con tripsina y se secuenciaron los péptidos tal como se describe a continuación.
Entonces se evalúa la pureza de la actividad después de este procedimiento según un protocolo de ensayo.
5. Ensayo para determinar la actividad hidrolasa de amidas de ácidos grasos:
Se usa el siguiente protocolo de cromatografía en capa fina (CCF) para someter a ensayo la actividad de hidrólisis de cis-9,10-octadecenoamida, también denominada actividad hidrolasa de amidas de ácidos grasos. En primer lugar se marca la oleamida con ^{14}C. Para lograr esto, se trató ^{14}C-ácido oleico (1-10 \muM, Moravek Biochemicals, 5-50 \muCi/\muM) en CH_{2}Cl_{2} (200 \mul, 0,005-0,05 M) a 0ºC con cloruro de oxalilo en exceso y se calentó la mezcla de reacción hasta 25ºC durante 6 horas. Entonces se concentró la mezcla de reacción bajo una corriente constante de nitrógeno gaseoso y se enfrió el residuo restante hasta 0ºC y se trató con hidróxido de amonio acuoso saturado en exceso. Tras 5 minutos, se repartió la mezcla de reacción entre EtOAc (1,5 ml) y HCl al 10% (1,0 ml). Entonces se lavó la fase orgánica con agua (1,0 ml) y se concentró bajo una corriente constante de nitrógeno gaseoso para proporcionar ^{14}C-oleamida con rendimiento cuantitativo según se evalúa mediante CCF (EtOAc al 60% en hexanos; oleamida R_{f}-0,2; ácido oleico R_{f}-0,8).
Se incubó aproximadamente 1 \muCi de ^{14}C-oleamida (actividad específica de 5-50 \muCi/\muM) en etanol a 37ºC durante 1-2 horas con 70 \mul de Tris-HCl 126 mM, pH 9,0 (la concentración final de etanol fue del 2,0%). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre acetato de etilo (1,0 ml) y HCl 0,07 M (0,6 ml). Se concentró la fase de acetato de etilo bajo una corriente constante de nitrógeno gaseoso y se resuspendió el residuo restante en 15 \mul de etanol. Entonces se usaron aproximadamente 3 \mul de esta disolución madre de etanol para el análisis mediante CCF (EtOAc al 60% en hexanos: oleamida R_{f}-0,2; ácido oleico R_{f}-0,8). Tras la exposición al disolvente, se secaron al aire las placas de CCF, se trataron con pulverización de EN^{3}HANCE (Dupont NEN) según las directrices del fabricante y se expusieron a la película a -78ºC durante 1-2 horas.
Se determinó que la proteína purificada tenía un enriquecimiento de 20-30 veces la actividad amidasa de la fracción de proteína de membrana en bruto mediante comparación visual de la intensidad de la banda de proteína purificada con la fracción de proteína en bruto. El rendimiento purificado estimado es del 10-15% (figura 3).
Esquema 3
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Esquema 4
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C. Protocolos sintéticos 1. Cis-9,10-octadecenoamida (1: figura 1)
Se trató gota a gota una disolución de ácido oleico (1,0 g, 3,55 mmol, 1,0 equiv.) en CH_{2}Cl_{2} (8,9 ml, 0,4 M) a 0ºC con cloruro de oxalilo (5,32 ml, disolución 2,0 M en CH_{2}Cl_{2}, 10,64 mmol, 3,0 equiv.). Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 4 h, se concentró a presión reducida, se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH_{4}OH acuoso saturado (2,0 ml). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre acetato de etilo (EtOAc) (100 ml) y H_{2}O (100 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 40-100%-hexanos) proporcionó 1 como un sólido blanco (0,810 g, 0,996 g teóricos, 81,3%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 6,06 (s a, 1H, NH_{2}C(O)), 5,58 (s a, 1H, NH_{2}C(O)), 5,32 (m, 2H, CH=CH), 2,16 (t, 2H, J = 7,5 Hz, CH_{2}C(O)NH_{2}), 2,02 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,61 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}C(O)NH_{2}), 1,29 (s a, 14H, protones de alquilo), 0,87 (t, 3H, CH_{3}); FABHRMS (NBA/NaI m/e 282,2804 (C_{18}H_{35}NO + H^{+} requiere 282,2797). Las regiones de los espectros que distinguen entre los isómeros cis y trans son los protones olefínicos desde \delta 5,3 hasta 5,2 y los protones alílicos desde \delta 2,0 hasta 1,8. Estas regiones identifican al compuesto natural como cis-9,10-octadecenoamida.
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2. Trans-9,10-octadecenoamida (2: figura 1)
Se trató gota a gota una disolución de ácido elaídico (1,0 g, 3,55 mmol, 1,0 equiv.) en CH_{2}Cl_{2} (8,9 ml, 0,4 M) a 0ºC con cloruro de oxalilo (5,32 ml, disolución 2,0 M en CH_{2}Cl_{2}, 10,64 mmol, 3,0 equiv.). Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 4 h, se concentró a presión reducida, se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH_{4}OH acuoso saturado (2,0 ml). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre acetato de etilo (EtOAc) (100 ml) y H_{2}O (100 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 40-100%-hexanos) proporcionó 2 como un sólido blanco. Las regiones de los espectros que distinguen entre los isómeros cis y trans son los protones olefínicos desde \delta 5,3 hasta 5,2 y los protones alílicos desde \delta 2,0 hasta 1,8. Estas regiones identifican al compuesto como trans-9,10-octadecenoamida.
3. Cis-8,9-octadecenoamida (3: figura 1)
Se trató gota a gota una disolución de 11, sintetizado a continuación, (0,130 g, 0,461 mmol, 1,0 equiv.) en CH_{2}Cl_{2} (1,5 ml, 0,31 M) a 0ºC con cloruro de oxalilo (0,69 ml, disolución 2,0 M en CH_{2}Cl_{2}, 1,38 mmol, 3,0 equiv.). Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 4 h, se concentró a presión reducida, se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH_{4}OH acuoso saturado (2,0 ml). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre acetato de etilo (EtOAc) (100 ml) y H_{2}O (100 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 40-100%-hexanos) proporcionó 3 como un sólido blanco. (0,105 g, 0,130 teóricos, 80,8%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 5,70-5,34 (m, 4H, H_{2}NC(O) y CH=CH), 2,21 (t, 2H, J = 7,5 Hz, CH_{2}C(O)NH_{2}), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,63 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}C(O)NH_{2}), 1,47-1,23 (m, 20H, protones de alquilo), 0,87 (t, 3H, RCH_{3}); FABHRMS (NBA/CSI m/e 414,1762 (C_{18}H_{35}NO + Cs^{+} requiere 414,1773).
4. Cis-11,12-octadecenoamida (4: figura 1)
Se trató gota a gota una disolución de ácido \Delta11,12-octadecenoico (1,0 g, 3,55 mmol, 1,0 equiv.) en CH_{2}Cl_{2} (8,9 ml, 0,4 M) a 0ºC con cloruro de oxalilo (5,32 ml, disolución 2,0 M en CH_{2}Cl_{2}, 10,64 mmol, 3,0 equiv.). Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 4 h, se concentró a presión reducida, se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH_{4}OH acuoso saturado (2,0 ml). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre acetato de etilo (EtOAc) (100 ml) y H_{2}O (100 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 40-100%-hexanos) proporcionó 4 como un sólido blanco.
5. Ácido oleico (5: figura 1)
Se obtuvo ácido oleico de Aldrich Chemical Company, nº CAS 112-80-1.
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6. Erucamida (6: figura 1)
Se obtuvo erucamida de Aldrich Chemical Company, nº CAS 28,057-7.
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7. 8-Hidroxi-octanoato de metilo (7: esquema 3)
Se trató gota a gota una disolución de éster monometílico de ácido subérico (1,5 g, 7,97 mmol, 1,0 equiv.) en tetrahidrofurano (THF) (32,0 ml, 0,25 M) a -20ºC con BH_{3} THF (disolución 1 M en THF, 7,97 ml, 7,97 mmol, 1,0 equiv.). Se agitó la mezcla de reacción durante la noche y posteriormente se dejó alcanzar la temperatura ambiente. Entonces se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (100 ml) y se extinguió con metanol (10 ml) y HCl al 10% (10 ml). La extracción con NaHCO_{3} (1 X 20 ml), agua (2 X 10 ml) y salmuera (1 X 10 ml), proporcionó 8-hidroxi-octanoato de metilo (7) como sólido blanco bruto.
8. 8-Bromo-octanoato de metilo (8: esquema 3)
Se trató sucesivamente una disolución de 8-hidroxi-octanoato de metilo bruto (7, 1,24 g, 7,13 mmol, 1,0 equiv.) en CH_{2}Cl_{2} (15 ml, 0,48 M) a 0ºC con CBr_{4} (3,07 g, 9,27 mmol, 1,3 equiv.) y PPh, (2,61 g, 9,98 mmol, 1,4 equiv.) y se agitó la mezcla de reacción a 4ºC durante 10 h. Entonces se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (8 x lavados de 10 ml). Se combinaron los lavados con Et_{2}O y se concentraron a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, hexanos) proporcionó 8 como un aceite transparente, incoloro (1,25 g, 1,69 g teóricos, 74,0%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 3,64 (s, 3H, C(O)OCH_{3}), 3,38 (t, 2H, J = 6,8 Hz, CH_{2}Br), 2,29 (t, 2H, J=7,4 Hz CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,83 (p, 2H, CH_{2}CH_{2}Br), 1,63 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}C(O)OCH_{3}) 1,47-1,28 (m, 6H, protones de alquilo).
9. Bromuro de 8-trifenilfosforanil-octanoato de metilo (9: esquema 3)
Se trató una disolución de 8 (1,25 g, 5,23 mmol, 1,0 equiv.) en CH_{3}CN (4,0 ml, 1,31 M) con trifenilfosfina (1,52 g, 5,75 mmol, 1,1 equiv.) y se agitó a reflujo durante 10 h. Se añadió trifenilfosfina adicional (0,685 g, 2,61 mmol, 0,5 equiv.) a la mezcla de reacción y se continuó la agitación a reflujo durante 5 h. Se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (5 x lavados de 10 ml). Entonces se solubilizó el residuo restante en el volumen mínimo de CH_{2}Cl_{2} y se concentró a presión reducida para proporcionar 9 como una espuma incolora (2,20 g, 2,61 g teóricos, 84,3%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,82-7,51 (m, 15H, ArH), 3,70-3,46 (m, 5H, CH_{3}OC(O)R y CH_{2}PPh_{3}), 2,13 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,62-1,43 (m, 6H, protones de alquilo), 1,30-1,02 (m, 4H, protones de alquilo); FABHRMS (NBA) m/ e 419,2154 (C_{27}H_{32}BrO_{2}P-Br requiere 419,2140).
10. Cis-8,9-octadecenoato de metilo (10: esquema 3)
Se trató una disolución de 9 (0,71 g, 1,42 mmol, 1,0 equiv.) en THF (7,0 ml, 0,2 M) a 25ºC con KHMDS (3,0 ml, disolución 0,5 M en THF, 1,5 mmol, 1,06 equiv.) y se agitó la mezcla de reacción a reflujo durante 1 h. Entonces se enfrió la mezcla de reacción hasta -78ºC, se trató con decilaldehído (0,321 ml, 1,71 mmol, 1,2 equiv.) se calentó hasta 25ºC y se agitó durante otros 30 min. Entonces se trató la mezcla de reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado y se repartió entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 0-2%-hexanos) proporcionó 10 como un aceite incoloro (0,290 g, 0,422 g teóricos, 68,7%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 5,34 (m, 2H, CH=CH), 3,65 (s, 3H, CH_{3}OC(O)), 2,29 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,61 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,29 (s a, 20 H, protones de alquilo), 0,86 (t, 3H, RCH_{3}).
11. Ácido cis-8,9-octadecenoico (11: esquema 3)
Se trató una disolución de 10 (0,245 g, 0,825 mmol, 1,0 equiv.) en THF-MeOH-H_{2}O (proporción 3-1-1, 4,1 ml, 0,2 M) a 0ºC con LiOH\cdotH_{2}O (0,104 g, 2,48 mmol, 3,0 equiv.). Se calentó la mezcla de reacción hasta 25ºC, se agitó durante 8 h y después se repartió entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se lavó la fase orgánica sucesivamente con HCl acuoso al 10% (100 ml) y NaCl acuoso saturado (100 ml), se secó y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 10-30%-hexanos) proporcionó 11 como un aceite incoloro (0,156 g, 0,233 g teóricos, 67,0%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 5,34 (m, 2H, CH=CH), 2,34 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}COOH), 2,01 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,61 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}COOH), 1,47-1,23 (m, 20 H, protones de alquilo), 0,87 (t, 3H, RCH_{3}).
12. 18-Hemisuccinato de cis-9,10-octadecenoamida (12: esquema 4)
Se trató sucesivamente una disolución de 18 (0,047 g, 0,160 M, 1,0 equiv) en CH_{2}Cl_{2}-CHCl_{3} (3-1, 1,60 ml, 0,1 M) con Et_{3}N (0,045 ml, 0,320 mmol, 2,0 equiv), anhídrido succínico (0,033 g, 0,320 mmol, 2,0 equiv) y DMAP (0,002 g, 0,016 mmol, 0,1 equiv), y se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 10 h. Entonces se repartió la mezcla de reacción entre CH_{2}Cl_{2} (50 ml) y H_{2}O (50 ml), y se lavó la fase orgánica sucesivamente con HCl acuoso al 10% (50 ml) y NaCl acuoso saturado (50 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 3 cm x 15 cm, MeOH al 0-10%-EtOAc) proporcionó 12 como un sólido blanco (0,051 g, 0,063 teóricos, 80,3%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 6,95 (s a, 1H, H_{2}NC(O)), 5,72 (s a, 1H, H_{2}NC(O)), 5,34 (m, 2H, CH=CH), 4,08 (t, 3H, J = 6,6 Hz, CH_{2}OC(O)R), 2,61 (m, 4H, ROC(O)CH_{2}CH_{2}COOH), 2,21 (t, 2H, J = 7,5 Hz, CH_{2}C(O)NH_{2}), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,70-1,52 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}C(O)NH_{2} y CH_{2}CH_{2}OH), 1,29 (s a, 18H, protones de alquilo); FABHRMS (NBA) m/e 398,2893 (C_{22}H_{39}NO_{5} + H^{+} requiere 398,2906).
13. 9-Bromo-nonanoato de metilo (13: esquema 4)
Se trató sucesivamente una disolución de 9-hidroxi-nonanoato de metilo (1,1 g, 5,85 mmol, 1,0 equiv) en CH_{2}Cl_{2} (30 ml, 0,2 M) a 0ºC con CBr_{4} (2,5 g, 7,54 mmol, 1,3 equiv) y PPh_{3} (2,15 g, 8,19 mmol, 1,4 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a 4ºC durante 10 h. Entonces se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (8 x lavados de 10 ml). Se combinaron los lavados con Et_{2}O y se concentraron a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, hexanos) proporcionó 13 como un aceite transparente, incoloro (1,02 g, 1,47 g teóricos, 69,5%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 3,64 (s, 3H, C(O)OCH_{3}), 3,38 (t, 2H, J = 6,8 Hz, CH_{2}Br), 2,29 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,83 (p, 2H, CH_{2}CH_{2}Br), 1,63 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}C(O)OCH_{3}) 1,47-1,28 (m, 8H, protones de alquilo).
14. Bromuro de 9-trifenilfosforanil-nonanoato de metilo (14: esquema 4)
Se trató una disolución de 13 (1,02 g, 4,06 mmol, 1,0 equiv) en CH_{3}CN (3,5 ml, 1,16 M) con trifenilfosfina (1,17 g, 4,47 mmol, 1,1 equiv) y se agitó a reflujo durante 10 h. Se añadió trifenilfosfina adicional (0,532 g, 2,03 mmol, 0,5 equiv) a la mezcla de reacción y se continuó la agitación a reflujo durante 5 h. Se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (5 x lavados de 10 ml). Entonces se solubilizó el residuo restante en el volumen mínimo de CH_{2}Cl_{2} y se concentró a presión reducida para proporcionar 14 como una espuma incolora (1,90 g, 2,08 g teóricos, 91,3%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,82-7,51 (m, 15H, ArH), 3,70-3,46 (m, 5H, CH_{3}OC(O)R y CH_{2}PPh_{3}), 2,13 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,62-1,02 (m, 12H, protones de alquilo); FABHRMS (NBA) m/e 433,2312 (C_{28}H_{34}BrO_{2}P- Br^{-} requiere 433,2296).
15. 18-T-butildifenilsililoxi-cis-9,10-octadecenoato de metilo (15: esquema 4)
Se trató una disolución de 14 (1,0 g, 1,95 mmol, 1,0 equiv) en THF (6,5 ml, 0,3 M) a 25ºC con KHMDS (3,9 ml, disolución 0,5 M en THF, 1,95 mmol, 1,0 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a reflujo durante 1 h. Entonces se enfrió la mezcla de reacción hasta -78ºC, se trató con 3 (0,93 g, 2,35 mmol, 1,2 equiv), se calentó hasta 25ºC y se agitó durante otros 30 min. Entonces se trató la mezcla de reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado y se repartió entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 0-2%-hexanos) proporcionó 15 como un aceite incoloro (0,82 g, 1,07 g teóricos, 76,30): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,67 (m, 4H, ArH), 7,41 (m, 6H, ArH), 5,34 (m, 2H, CH=CH), 3,65 (m, 5H, CH_{3}OC(O) y CH_{2}OTBDPS), 2,29 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,55 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}C(O)OCH_{3} y CH_{2}CH_{2}OTBDPS), 1,29 (s a, 18H, protones de alquilo), 1,04 (s, 9H, (CH_{3})_{3}C).
16. Ácido 18-t-butildifenilsililoxi-cis-9,10-octadecenoico (16: esquema 4)
Se trató una disolución de 5 (0,81 g, 1,47 mmol, 1,0 equiv) en THF-MeOH-H_{2}O (proporción 3-1-1, 7,3 ml, 0,2 M) a 0ºC con LiOH\cdotH_{2}O (0,188 g, 4,48 mmol, 3,0 equiv). Se calentó la mezcla de reacción hasta 25ºC, se agitó durante 8 h y entonces se repartió entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se lavó sucesivamente la fase orgánica con HCl acuoso al 10% (100 ml) y NaCl acuoso saturado (100 ml), se secó y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 10-30%-hexanos) proporcionó 16 como un aceite incoloro (0,700 g, 0,790 g teóricos, 88,7%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,67 (m, 4H, ArH), 7,41 (m, 6H, ArH), 5,34 (m, 2H, CH=CH), 3,65 (t, 3H, J = 6,5 Hz, CH_{2}OTBDPS), 2,34 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}COOH), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,65-1,50 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}COOH y CH_{2}CH_{2}OTBDPS), 1,47-1,23 (m, 18H, protones de alquilo), 1,05 (s, 9H, (CH_{3})_{3}
C); FABHRMS (NBA/CsI) m/e 669,2772 (C_{34}H_{52}O_{3}Si + Cs^{+} requiere 669,2740).
17. 18-T-butildifenilsililoxi-cis-9,10-octadecenoamida (17: esquema 4)
Se trató gota a gota una disolución de 16 (0,685 g, 1,28 mmol, 1,0 equiv) en CH_{2}Cl_{2} (4,3 ml, 0,3 M) a 0ºC con cloruro de oxalilo (1,92 ml, disolución 2 M en CH_{2}Cl_{2}, 3,84 mmol, 3,0 equiv). Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 4 h, se concentró a presión reducida, se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH_{4}OH acuoso saturado (2,0 ml). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml) y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 40-100%-hexanos) proporcionó 17 como un aceite incoloro (0,520 g, 0,684 g, 76,0%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,67 (m, 4H, ArH), 7,41 (m, 6H, ArH), 5,70-5,34 (m, 4H, H_{2}NC(O) y CH=C H), 3,65 (t, 3H, J = 6,5 Hz, CH_{2}OTBDPS), 2,21 (t, 2H, J = 7,5 Hz, CH_{2}C(O)NH_{2}), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,65-1,50 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}C(O)NH_{2} y CH_{2}CH_{2}OTBDPS), 1,47-1,23 (m, 18H, protones de alquilo), 1,05 (s, 9H, (CH_{3})_{3}C); FABHRMS (NBA/CsI m/e 668,2929 (C_{34}H_{53}O_{2}NSi + Cs^{+} requiere 668,2900).
18. 18-Hidroxi-cis-9,10-octadecenoamida (18: esquema 4)
Se trató una disolución de 17 (0,185 g, 0,345 mmol, 1,0 equiv) en THF (1,1 ml, 0,31 M) con fluoruro de tetrabutilamonio (0,69 ml, disolución 1,0 M en THF, 0,69 mmol, 2,0 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 2 h. Entonces se repartió la mezcla de reacción entre EtOAc (50 ml) y H_{2}O (50 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 3 cm x 15 cm, elución en gradiente de MeOH al 0-5%-EtOAc) proporcionó 18 como un sólido blanco (0,097 g, 0,103 g teóricos, 94,6%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 5,65-5,34 (m, 4H, H_{2}NC(O) y CH=CH), 3,62 (t, 3H, J = 6,5 Hz, CH_{2}OH), 2,21 (t, 2H, J = 7,5 Hz, CH_{2}C(O)NH_{2}), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,65-1,50 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}C(O)NH_{2} y CH_{2}CH_{2}OH), 1,29 (s a, 18H, protones de alquilo); FABHRMS (NBA) 298,2732 (C_{18}H_{35}NO_{2} + H^{+} requiere 298,2746).
19. Síntesis del compuesto 100 (figura 5)
9-T-butildifenilsililoxi-nonanoato de metilo (producto intermedio para el compuesto 100: figura 5). Se trató sucesivamente una disolución de 9-hidroxi-nonanoato de metilo (0,838 g, 4,46 mmol, 1,0 equiv: Aldrich) en CH_{2}Cl_{2} (15 ml, 0,3 M) con Et_{3}N (0,75 ml, 5,38 mmol, 1,2 equiv), t-butilclorodifenilsilano (1,28 ml, 4,93 mmol, 1,1 equiv) y DMAP (0,180 g, 1,48 mmol, 0,33 equiv), y se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 12 h. Se añadió NH_{4}Cl acuoso saturado a la mezcla de reacción y se repartió la mezcla entre CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 0-5%-hexanos) proporcionó el producto intermedio como un aceite transparente, incoloro (1,22 g, 1,831 teóricos, 64,1%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,66 (m, 4H, ArH), 7,38 (m, 6H, ArH), 3,67-3,62 (m, 5H, C(O)OCH_{3} y CH_{2}OTBDPS), 2,30 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,58 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}OTBDPS y CH_{2}CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,28 (s a, 8H, protones de alquilo), 1,05 (s, 9H, C(CH_{3})_{3}).
20. 9-Bromo-nonanoato de metilo (producto intermedio para el compuesto 100: figura 5)
Se trató sucesivamente una disolución de 9-hidroxi-nonanoato de metilo (1,1 g, 5,85 mmol, 1,0 equiv) en CH_{2}Cl_{2} (30 ml, 0,2 M) a 0ºC con CBr_{4} (2,5 g, 7,54 mmol, 1,3 equiv) y PPh_{3} (2,15 g, 8,19 mmol, 1,4 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a 4ºC durante 10 h. Entonces se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (8 x lavados de 10 ml). Se combinaron los lavados con Et_{2}O y se concentraron a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, hexanos) proporcionó el producto intermedio como un aceite transparente, incoloro (1,02 g, 1,47 g teóricos, 69,5%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 3,64 (s, 3H, C(O)OCH_{3}), 3,38 (t, 2H, J = 6,8 Hz, CH_{2}Br), 2,29 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,83 (p, 2H, CH_{2}CH_{2}Br), 1,63 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,47-1,28 (m, 8H, protones de alquilo).
21. 9-T-butildifenilsililoxi-nonanal (producto intermedio para el compuesto 100: figura 5)
Se trató gota a gota una disolución de 1 (1,25 g, 2,93 mmol, 1,0 equiv) en tolueno (9,80 ml, 3,0 M) a -78ºC con DIBAL-H (4,40 ml, disolución 1,0 M en hexanos, 4,40 mmol, 1,5 equiv). Se agitó la mezcla de reacción a -78ºC durante 30 min. Entonces se trató gota a gota la mezcla de reacción con MeOH (2 ml) y se repartió entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se lavó la fase orgánica con HCl acuoso al 10% (100 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 0-5%-hexanos) proporcionó 3 como un aceite incoloro (1,1 g, 94,9%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 9,76 (t, 1H, J = 1,8 Hz, HC(O)R), 7,67 (m, 4H, ArH), 7,40 (m, 6H, ArH), 3,65 (t, 2H, J = 6,4 Hz, CH_{2}OTBDPS), 2,41 (t de d, 2H J = 1,8 y 7,3 Hz, CH_{2}C(O)H), 1,58 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}OTBDPS y CH_{2}CH_{2}C(O)H), 1,29 (s a, 8H, protones de alquilo), 1,05 (s, 9H, (CH_{3})_{3}C); FABHRMS (NBA/CsI) m/e 529,1560 (C_{25}H_{36}O_{2}Si + Cs^{+} requiere 529,1539).
22. Bromuro de 9-trifenilfosforanil-nonanoato de metilo (producto intermedio para el compuesto 100: figura 5)
Se trató una disolución de 9-t-butildifenilsililoxi-nonanal (1,02 g, 4,06 mmol, 1,0 equiv) en CH_{3}CN (3,5 ml, 1,16 M) con trifenilfosfina (1,17 g, 4,47 mmol, 1,1 equiv) y se agitó a reflujo durante 10 h. Se añadió trifenilfosfina adicional (0,532 g, 2,03 mmol, 0,5 equiv) a la mezcla de reacción y se continuó la agitación a reflujo durante 5 h. Se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (5 x lavados de 10 ml). Entonces se solubilizó el residuo restante en el volumen mínimo de CH_{2}Cl_{2} y se concentró a presión reducida para proporcionar el producto intermedio como una espuma incolora (1,90 g, 2,08 g teóricos, 91,3%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,82-7,51 (m, 15H, ArH), 3,70-3,46 (m, 5H, CH_{3}OC(O)R y CH_{2}PPh_{3}), 2,13 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 1,62-1,02 (m, 12H, protones de alquilo); FABHRMS (NBA) m/e 433,2312 (C_{28}H_{34}BrO_{2}P - Br^{-} requiere 433,2296).
23. 18-T-butildifenilsililoxi-cis-9,10-octadecenoato de metilo (producto intermedio para el compuesto 100: figura 5)
Se trató una disolución de (1,0 g, 1,95 mmol, 1,0 equiv) en THF (6,5 ml, 0,3 M) a 25ºC con KHMDS (3,9 ml, disolución 0,5 M en THF, 1,95 mmol, 1,0 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a reflujo durante 1 h. Entonces se enfrió la mezcla de reacción hasta -78ºC, se trató con 3 (0,93 g, 2,35 mmol, 1,2 equiv), se calentó hasta 25ºC y se agitó durante otros 30 min. Entonces se trató la mezcla de reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado y se repartió entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 0-2%-hexanos) proporcionó el producto intermedio como un aceite incoloro (0,82 g, 1,07 g teóricos, 76,3%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,67 (m, 4H, ArH), 7,41 (m, 6H, ArH), 5,34 (m, 2H, CH=CH), 3,65 (m, 5H, CH_{3}OC(O) y CH_{2}OTBDPS), 2,29 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}C(O)OCH_{3}), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,55 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}C(O)OCH_{3} y CH_{2}CH_{2}OTBDPS), 1,29 (s a, 18H, protones de alquilo), 1,04 (s, 9H, (CH_{3})_{3}C).
24. Ácido 18-t-butildifenilsililoxi-cis-9,10-octadecenoico (compuesto 100: figura 5)
Se trató una disolución de 18-t-butildifenilsililoxi-cis-9,10-octadecenoato de metilo (0,81 g, 1,47 mmol, 1,0 equiv) en THF-MeOH-H_{2}O (proporción 3-1-1, 7,3 ml, 0,2 M) a 0ºC con LiOH\cdotH_{2}O (0,188 g, 4,48 mmol, 3,0 equiv). Se calentó la mezcla de reacción hasta 25ºC, se agitó durante 8 h y entonces se repartió entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml). Se lavó sucesivamente la fase orgánica con HCl acuoso al 10% (100 ml) y NaCl acuoso saturado (100 ml), se secó y se concentró a presión reducida. La cromatografía (SiO_{2}, 5 cm x 15 cm, elución en gradiente de EtOAc al 10-30%-hexanos) proporcionó 100 como un aceite incoloro (0,700 g, 0,790 g teóricos, 88,7%): RMN de ^{1}H (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta 7,67 (m, 4H, ArH), 7,41 (m, 6H, ArH), 5,34 (m, 2H, CH=CH), 3,65 (t, 3H, J = 6,5 Hz, CH_{2}OTBDPS), 2,34 (t, 2H, J = 7,4 Hz, CH_{2}COOH), 2,00 (m, 4H, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 1,65-1,50 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}COOH y CH_{2}CH_{2}OTBDPS), 1,47-1,23 (m, 18H, protones de alquilo), 1,05 (s, 9H, (CH_{3})_{3}C); FABHRMS (NBA/CsI) m/e 669,2772 (C_{34}H_{52}O_{3}Si + Cs^{+} requiere 669,2740).
25. Síntesis del compuesto 101 (figura 5)
Etapa 1. Se trató gota a gota una disolución de 100 (1,0 equiv) en CH_{2}Cl_{2} (0,3 M) a 0ºC con cloruro de oxalilo (4,0 equiv). Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 4 h, se concentró a presión reducida, se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH_{4}OH acuoso saturado (2,0 ml). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida.
Etapa 2. Se trató gota a gota una disolución del compuesto intermedio de la etapa 1 anterior (1,0 equiv) en éter (0,3 M) a 0ºC con piridina (8,0 equiv.) seguido por anhídrido trifluoroacético (6,0 equiv; Aldrich). Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 3 h, se concentró a presión reducida, se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH_{4}OH acuoso saturado (2,0 ml). Entonces se repartió la mezcla de reacción entre EtOAc (100 ml) y H_{2}O (100 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida.
Etapa 3. Se trató una disolución del compuesto intermedio de la etapa 2 anterior (1,0 equiv) en THF (0,31 M) con de fluoruro de tetrabutilamonio (disolución 1,0 M en THF, 3,0 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 3 h. Entonces se repartió la mezcla de reacción entre EtOAc (50 ml) y H_{2}O (50 ml), y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a presión reducida. Se purificó el producto mediante condiciones cromatográficas convencionales y dio el compuesto 101 con un rendimiento global del 66% para las 3 etapas.
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26. Síntesis del compuesto 102 (figura 5)
Etapa 1. Se trató una disolución de 101 (1,0 equiv.) en THF (0,1 M) con trifenilfosfina (2,0 equiv.), seguido por una disolución de azodicarboxilato de dietilo (disolución en THF 1,0, DEAD, 2,0 equiv., Aldrich) y a 0ºC durante 30 minutos. Se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (5 x lavados de 10 ml). Entonces se solubilizó el residuo restante en el volumen mínimo de CH_{2}Cl_{2} y se concentró a presión reducida.
Etapa 2. Se trató una disolución del compuesto de la etapa 1 anterior (1,0 equiv.) en THF (0,10 M) con ácido tioacético (2,0 equiv.; Aldrich) a 0ºC durante 30 minutos. Se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se lavó repetidamente con Et_{2}O (5 x lavados de 10 ml). Entonces se solubilizó el residuo restante en el volumen mínimo de CH_{2}Cl_{2} y se concentró a presión reducida. Se purificó el producto mediante condiciones cromatográficas convencionales y dio el compuesto 102 con un rendimiento global del 71% para las 2 etapas.
27. Síntesis del compuesto 103 (figuras 4 y 5)
Etapa 1. Se trató una disolución de 102 (1,0 equiv) en MeOH/agua (mezcla 2:1, concentración total 0,20 M) a 0ºC con NaOH (3,0 equiv) y se agitó durante 10 minutos, y entonces se repartió entre EtOAc (100 ml) y agua (100 ml). Se lavó sucesivamente la fase orgánica con HCl acuoso al 10% (100 ml) y NaCl acuoso saturado (100 ml), se secó y se concentró a presión reducida.
Etapa 2. Se agitó una disolución del compuesto de la etapa 1 anterior (1,0 equiv) en HCl 1 N acuoso a 0ºC hasta que la mezcla de reacción alcanzó un pH de 7,0, y entonces se repartió la mezcla entre EtOAc (100 ml) y agua (100 ml). Se lavó sucesivamente la fase orgánica con NaCl acuoso saturado (100 ml), se secó y se concentró a presión reducida.
Etapa 3. Se trató una disolución del compuesto de la etapa 2 anterior (1,0 equiv.) en NaHCO_{3} 1 mM acuoso a 25ºC con perlas de disulfuro de piridilo (1,1 equiv. Aldrich) y se agitó durante 2 horas. Posteriormente se lavaron las perlas con NaHCO_{3} saturado en exceso (3X), agua (3X) y salmuera (1X). Mediante filtración convencional se obtuvieron las perlas activadas (compuesto 103) que se empaquetaron entonces en la columna para la cromatografía de afinidad de la enzima tal como se analizó anteriormente usando este inhibidor de CF_{3} unido a perlas de disulfuro de piridilo activadas.
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D. Clonación de ADNc de cis-9,10-octadecenoamidasa 1. ADNc de cis-9,10-octadecenoamidasa obtenido a partir de ARNm de hígado de rata
Para obtener un clon de ADNc para cis-9,10-octadecenoamidasa a partir de una biblioteca de ADNc generada a partir de ARNm de hígado de rata, se diseñaron cebadores de oligonucleótidos degenerados basándose en la secuencia de restos de aminoácidos del fragmento de polipéptido de cis-9,10-octadecenoamidasa obtenido a partir de un digesto con tripsina. En resumen, se sometió la cis-9,10-octadecenoamidasa, purificada tal como se describió anteriormente, a un digesto con tripsina para formar fragmentos de polipéptido internos tal como se realizó por la Worchester Foundation, Worchester, PA. Se purificaron los fragmentos de polipéptido resultantes mediante HPLC y se seleccionaron para su microsecuenciación siete fracciones de HPLC que mostraban masas de péptidos diferenciadas según se mide mediante espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por una matriz con tiempo de vuelo (MAL-DI TOF, PerSeptive Biosystems Linear Instrument). Se microsecuenciaron siete fragmentos de polipéptido que tenían longitudes que oscilaban entre 12 restos de aminoácidos y 25 restos de aminoácidos tal como se indica en la figura 9 indicados por siete regiones subrayadas una vez discontinuas en la secuencia de restos de aminoácidos de cis-9,10-octadecenoamidasa de rata completa. Cada péptido presentaba el resto de lisina o arginina requerido en su extremo C-terminal lo que indica que el digesto tríptico se realizó con la selectividad anticipada.
Se diseñaron los cebadores de oligonucleótidos degenerados para incorporar un único sitio de restricción en los extremos 5' de los cebadores que funcionaban como cebadores directos o bien inversos. Los cebadores directos también se denominan cebadores en sentido 5', sentido o 5'. Los cebadores inversos también se denominan cebadores en sentido 3', antisentido o 3'. Se incorporaron los sitios de restricción en los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para permitir la inserción en el sitio de clonación múltiple de un vector de secuenciación tal como se describe a continuación.
Los oligonucleótidos degenerados en 5' y 3' sintetizados se diseñaron respectivamente correspondiendo a partes de los péptidos 1 y 2 secuenciados tal como se muestran en la figura 9 tal como se indica mediante las dos primeras secuencias de restos de aminoácidos subrayadas una vez discontinuas. Los nucleótidos degenerados se indican mediante códigos IUPAC N = A, C, G o T y R = A o G. La secuencia de nucleótidos del cebador degenerado en 5' correspondiente al péptido 1 fue 5'CGGAATTCGGNGGNGARGGNGC3' (SEC ID NO 3) que incorporaba un sitio de restricción EcoRI y se traduce en la secuencia de aminoácidos GGEGA (SEC ID NO 4). La secuencia de nucleótidos del cebador degenerado en 3' que correspondía al péptido 2 fue 5'CGGGATCCGGCATNGTRTARTTRTC3' (SEC ID NO 33) incorporando un sitio de restricción BamHI y se traduce en la secuencia de aminoácidos DNYTMP (SEC ID NO 34).
Para amplificar regiones de ADNc que codifican cis-9,10-octadecenoamidasa, se transcribió de manera inversa ARNm de hígado de rata para dar ADNc para usar como molde en PCR con pares de cebadores de oligonucleótidos degenerados seleccionados descritos anteriormente. Se realizó la PCR en condiciones bien conocidas por un experto habitual en la técnica teniendo cada ciclo de 40 ciclos totales las temperaturas de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 60 segundos.
De los fragmentos de PCR clonados, se seleccionaron tres para su secuenciación. Los tres fragmentos de PCR tenían 350 pares de bases (pb), 400 pb y 750 pb. La secuenciación de estos fragmentos de ADNc que codifican cis-9,10-octadecenoamidasa mostró que el fragmento de 750 pb contenía las secuencias de los fragmentos tanto de 350 pb como de 400 pb.
Entonces se marcó internamente el fragmento de ADNc de 350 pb obtenido mediante PCR y se usó como sonda para análisis de tipo Northern sobre ARNm de hígado de rata sometido a electroforesis. La sonda se hibridó a un fragmento de aproximadamente 2,5 kilobases (kb) a 3,0 kilobases (kb) de longitud, que es el tamaño esperado del ARNm de cis-9,10-octadecenoamidasa que codifica una proteína de 60 kDa.
Para aislar un clon de ADNc que codifica la proteína cis-9,10-octadecenoamidasa completa, se marcó entonces internamente la sonda de 350 pb con ^{32}P usado para examinar una biblioteca de ADNc de \lambdagt11 a partir de ARNm de hígado de rata obtenida de Clontech (Palo Alto, CA). Para examinarla, se digirió en primer lugar el fragmento de 350 pb amplificado con EcoRI y BamHI para la clonación direccional dentro de un pBluescript II SK(-) digerido de manera similar (Stratagene, La Jolla, CA). La secuencia resultante indicó que el fragmento de 350 pb codificaba los péptidos 1 y 2 a partir de los cuales se diseñaron los cebadores de oligonucleótidos degenerados lo que confirmaba la precisión de la PCR y la amplificación del clon deseado. Los procedimientos para clonar el ADNc de cis-9,10-octadecenoamidasa de esta invención son técnicas bien conocidas por un experto habitual en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausebel et al., Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1989).
Se identificaron cuatro clones positivos a partir de examinar 4,5 X 10^{5} placas. Se obtuvieron dos clones de 2,7 kb de longitud y 1 clon de 2,0 kb de longitud. La secuencia parcial de uno de los clones de 2,7 kb, denominado p60, indica que el clon contiene secuencias específicas de cis-9,10-octadecenoamidasa.
El clon de ADNc de hígado de rata denominado p60 obtenido anteriormente se ha depositado en la colección americana de cultivos tipo (ATCC) el, o antes del, 12 de junio de 1996 y se le ha asignado el número de acceso de ATCC 97605. Este depósito se realizó según las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y los reglamentos según el mismo (tratado de Budapest). Esto garantiza la conservación de un plásmido viable durante 30 años desde la fecha de cada depósito. La ATCC pondrá el plásmido a disposición según los términos del tratado de Budapest que garantiza una disponibilidad permanente e ilimitada de la progenie del plásmido al público tras la concesión de la patente estadounidense pertinente o tras abrir a consulta por el público cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que se produzca en primer lugar, y garantiza la disponibilidad de la progenie para quien el comisionado de patentes y marcas registradas de los EE.UU. determine que tiene derecho a la misma según el artículo 122 del U.S.C. 35 y las normas del comisionado conformes al mismo (incluyendo el artículo 1.14 del CFR 37 con referencia particular a 886 OG 638). El cesionario de la presente solicitud ha accedido a que si el plásmido depositado muere o se pierde o se destruye mientras se cultiva en condiciones adecuadas, se repondrá inmediatamente tras la notificación con un espécimen viable del mismo plásmido. La disponibilidad del depósito no debe interpretarse como una licencia para poner en práctica la invención en violación de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes.
En SEC ID NO 1 se enumera una secuencia de nucleótidos parcial de la cadena superior del clon de ADNc de p60 que contiene 780 nucleótidos descrita anteriormente junto con la secuencia de restos de aminoácidos deducida. La secuencia de restos de aminoácidos codificada se enumera por separado en SEC ID NO 2. Con el fin de mostrar el resto de aminoácido codificado por cada codón triplete en el listado de secuencias, se añadió un codón de terminación, TAA, en las posiciones 781 a 783 que permite que la secuencia codificante (CDS) funcione en el programa Patentin usado para preparar el listado de secuencias. En otras palabras, el codón de terminación está insertado artificialmente en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO 1 para facilitar la traducción de la secuencia codificante de ADNc en una secuencia de aminoácidos.
La posición real de la posición de nucleótidos de cis-9,10-octadecenoamidasa dentro de un clon de ADNc completo es evidente a partir de la secuencia de ADNc completa tal como se describe a continuación.
Entonces se clonaron los dos clones de ADNc positivos mayores dentro de pBluescript II SK(+) y se secuenciaron. Un clon codificó un transcrito parcialmente procesado que contenía la secuencia codificante completa de la oleamida amidasa con 200 pb adicionales de secuencia intrónica. El otro clon codificó un transcrito de oleamida amidasa completamente procesado pero había un fragmento de 300 pb que codificaba ARNr condensado al extremo 5' del clon. La fusión de los dos clones mediante un sitio de restricción HindIII solapado internamente generó la cis-9,10-octadecenoamidasa de rata de longitud completa también denominada hidrolasa de amidas de ácidos grasos abreviada como FAAH. Se secuenció el clon con cebadores de secuenciación que se sintetizaron en un sintetizador Beckman Oligo1000M.
El clon de FAAH de ADNc de rata de longitud completa, también denominado ADNc de rFAAH, contenía 2473 pb, que contenían un único marco de lectura abierto de 1,73 kb que codifica 63,3 kDa de secuencia de proteína tal como se muestra en las figuras 10-1 a 10-5. La secuencia de ADNc bicatenario de FAAH de rata está disponible mediante GenBank con el número de acceso U72497. La proteína FAAH de rata codificada también se denomina proteína rFAAH. El clon contenía 50 pb de secuencia en 5' con respecto al primer ATG que designa el inicio del marco de lectura abierto. El clon también contenía 685 pb de región no traducida en 3' entre el primer codón de terminación que indica el final del marco de lectura abierto y la cola poli(A).
En las figuras 10-1 a 10-5, el resto de aminoácido codificado está colocado directamente bajo el segundo nucleótido de un codón triplete. Por ejemplo, en el sitio de iniciación en el que ATG codifica metionina (M), el nucleótido A comienza en la posición de nucleótido 50 y el nucleótido G es el 52. La M codificada está situada bajo el nucleótido T en la posición de nucleótido 51. Por tanto, tal como se presenta en la figura, los codones tripletes indicados no son tal como se indican. Las cadenas superior e inferior de la secuencia de ADNc también se enumeran respectivamente como SEC ID NO 35 y 37. La secuencia de aminoácidos codificada se muestra con la cadena superior en SEC ID NO 35 y de nuevo sola en SEC ID NO 36.
Aunque las 50 bases de la secuencia de nucleótidos en sentido 5' del primer ATG no presentan un codón de terminación en el marco, las diversas siguientes líneas de evidencias apoyan que el ADNc de 2,47 kb codifica la secuencia de proteína oleamida hidrolasa completa: 1) el tamaño del ADNc correspondía estrechamente al tamaño previsto del transcrito de ARNm según se estima mediante transferencia de tipo Northern (figura 12B tal como se analiza a continuación); 2) la secuencia que rodea al primer ATG presenta la secuencia consenso requerida para sitios de iniciación de traducción eucariotas, en particular, hay un A presente en la posición -3 y hay un G presente en la posición +4; y 3) cuando se transfectaron transitoriamente con ADNc de oleamida hidrolasa, las células COS-7 tradujeron un producto de proteína funcional que migraba conjuntamente con oleamida hidrolasa aislada mediante afinidad en SDS-PAGE (figura 12B, carril 1 y analizado a continuación).
Las búsquedas en bases de datos con la secuencia de proteína de oleamida amidasa (FAAH) identificaron una fuerte homología con diversas secuencias de enzima amidasa a partir de organismos tan diversos como Agrobacterium tumefaciens (Klee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 1728-1732, 1984), Pseudomonas savastanoi (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 6522-6526, 1985); Aspergillus nidulans (Corrick et al., Gene, 53: 63-71, 1987), Saccharomyces cerevisiae (Chang et al., Nuc, Acids Res., 18: 7180, 1990), Caenorhabditis elegans (Wilson et al., Nature, 368: 32-38, 1994), y Gallus domesticus (Ettinger et al., Arch. Biochem. Biophys., 316: 14-19, 1995). Estas amidasas componen colectivamente una familia de enzimas recientemente definida (Mayaux et al., J. Bacteriol., 172: 6764-6773, 1990) cuyos miembros comparten todos una secuencia firma común tal como se muestra en la figura 11. Los aminoácidos codificados que comienzan en la posición 215 y se extienden hasta la 246 de la hidrolasa de amidas de ácidos grasos (oleamida hidrolasa o FAAH) de rata contienen restos que se encuentran en una familia de amidasas. La secuencia en la proteína de rata cis-9,10-octadecenoamidasa de esta invención es GGSSGGEGALIGSGGSPLGLGTDIGGSIRFPS tal como se muestra en SEC ID NO 36 en las posiciones de aminoácido 215 a 246. La alineación a lo largo de la región de secuencia firma de amidasa de la FAAH de rata con varias otras amidasas representativas revela que la secuencia firma está completamente conservada entre los miembros de la familia de amidasas. Esos aminoácidos se muestran en negrita en la figura y la posición de aminoácido relativa de la secuencia firma en cada amidasa se proporciona por los números justo antes y después de la información de secuencia. Los SEC ID NO asignados para cada una de las secuencias se enumeran en la leyenda de la figura en la breve descripción de las figuras.
Según nuestro conocimiento, una oleamida amidasa también denominada FAAH es el primer miembro de mamíferos de esta familia de enzimas que se ha caracterizado molecularmente.
Se realizaron búsquedas de perfil de hidropaticidad y de dominios transmembrana (programas TMpred y PSORT) de la secuencia de FAAH de rata, y cada búsqueda indicó un fuerte supuesto dominio transmembrana desde los aminoácidos 13-29 (negrita en la figura 9). La región de 50 aminoácidos que rodea y abarca el supuesto dominio transmembrana de la FAAH de rata no comparte homología con las secuencias de proteína de otros miembros de la familia de amidasas, lo que indica que una de las modificaciones únicas de la amidasa de rata puede ser su integración dentro de la membrana. De manera interesante, análisis adicionales de la secuencia de FAAH revelaron un segmento de poliprolina, aminoácidos 307-315 (doble subrayado en la figura 9), que contiene una correspondencia precisa desde las posiciones 310 hasta las 315 con la secuencia de unión a dominio SH3 de clase II consenso, PPLPXR (SEC ID NO 38) Feng et al, Science, 266: 1241-1246, 1994), lo que sugiere que otras proteínas pueden interaccionar con FAAH para regular su actividad (Pawson, Nature, 373: 573-580, 1995) y/o ubicación subcelular (Rotin et al, EMBO J., 13: 4440-4450, 1994).
Se realizaron análisis de transferencia de tipo Southern y Northern con un fragmento de 800 pb interno del ADNc de FAAH de rata para evaluar el número de copias genómicas y la distribución tisular de FAAH, respectivamente.
Para la transferencia de tipo Southern, se digirieron 10 \mug de ADN genómico de rata con las enzimas de restricción indicadas (100 unidades cada una) durante 12 horas y después se hicieron pasar sobre un gel de agarosa al 0,8%. En primer lugar se aisló ADN genómico de rata a partir de hígado de rata tal como sigue: se agitaron aproximadamente 500 mg de hígado de rata durante la noche a 55ºC en 2 ml de Tris 100 mM (pH 8,0), SDS al 0,2%, NaCl 200 mM y 0,2 mg/ml de proteinasa K. Entonces se centrifugó la mezcla a 15.000 rpm durante 15 minutos y se retiró el sobrenadante y se trató con un volumen igual de isopropanol. Se retiró el ADN genómico precipitado, se secó parcialmente y se resuspendió en agua calentando a 55ºC durante 4 horas. Se digirieron 10 \mug del ADN con las enzimas de restricción indicadas (100 unidades cada una) durante 12 horas y después se hicieron pasar sobre un gel de agarosa al 0,8%. Entonces se transfirió el ADN bajo presión capilar a una membrana de transferencia de hibridación GeneScreenPlus (DuPont NEN) para su uso en un análisis de transferencia de tipo Southern. Se trató la transferencia según las directrices del fabricante (Clontech) y se sometió a los siguientes lavados tras la hibridación: un lavado de 20 minutos en una disolución de SDS al 1% y 0,2 X SSC (NaCl 30 mM, citrato de sodio 3,0 mM, pH 7,0) a 25ºC, seguido por dos lavados de 20 minutos en una disolución de SDS al 0,1% y 0,2 X SSC a 65ºC y un lavado tras la hibridación adicional (SDS al 0,1%, 0,1 X SSC, pH 7,0) a 65ºC durante 1 hora. Entonces se expuso la transferencia a película de rayos X durante 12 horas a -78ºC.
Los estudios de transferencia de tipo Southern mostraron que la sonda de FAAH se hibridó principalmente a fragmentos de ADN individuales usando varios digestos de restricción diferentes del genoma de rata (figura 12A). Tal como se esperaba, se observaron dos bandas de hibridación en el ADN digerido con HindIII, ya que la sonda de FAAH contenía un sitio HindIII interno. Estos resultados son lo más coherentes con el hecho de que el gen de FAAH sea un gen de copia única.
Para los análisis de tipo Northern, se trataron las transferencias obtenidas de Clontech según las directrices del fabricante, excepto porque se realizó un lavado tras la hibridación adicional con una disolución de SDS al 0,1% y 0,1 X SSC (NaCl 15 mM, citrato de sodio 1,5 mM, pH 7,0) a 65ºC durante 1 hora para garantizar la eliminación de hibridación no específica. Se expuso la transferencia resultante a película de rayos X durante 6 horas a -78ºC.
Los análisis de transferencia de tipo Northern con la sonda de FAAH identificaron un único transcrito de ARNm principal de aproximadamente 2,5 kb de tamaño que era lo más abundante en el hígado y el cerebro, con menores cantidades presentes en el bazo, pulmón, riñón y testículos (figura 12B). Este transcrito no era detectable ni en el corazón ni en el músculo esquelético, de manera coherente con los estudios bioquímicos previamente notificados que no identificaban ninguna actividad anandamida hidrolasa en estos dos tejidos (Deutsch et al, Biochem. Pharmacol., 46: 791-796, 1993). La transferencia de tipo Northern también contenía un bajo nivel de hibridación de la sonda de ADNc de FAAH a unos pocos transcritos mayores presentes sólo en los tejidos que expresaban también el transcrito de 2,5 kb. Estos transcritos pueden ser formas no procesadas o como alternativa formas de corte y empalme del ARNm de 2,5 kb. Además, se examinó la distribución regional del transcrito de FAAH de rata en el cerebro de rata mediante análisis de tipo Northern que reveló el mayor nivel del hipocampo y el tálamo con niveles menores de transcrito detectable en otras regiones del cerebro, incluyendo bulbo olfativo, corteza, cerebelo e hipófisis. El análisis preliminar de hibridación in situ de cortes de cerebro de rata también identificó altos niveles de expresión para FAAH de rata tanto en el hipocampo como en el hipotálamo. Por último, se realizó el análisis de tipo Northern de los niveles de expresión de FAAH de ratón en diversas fases en el desarrollo embrionario del ratón en el que se observó en primer lugar la
FAAH de ratón entre los días 11 y 15 con niveles que seguían aumentando drásticamente desde el día 15 hasta el 17.
2. ADNc de cis-9,10-octadecenoamidasa obtenido a partir de ARNm de hígado de ratón
Se obtuvo el homólogo de ratón del ADNc de cis-9,10-octadecenoamidasa de rata examinando una biblioteca de ADNc positivo extendido en 5' de hígado de ratón (Clontech) usando las mismas condiciones a las descritas anteriormente para obtener el ADNc de rata con la única excepción de que se usó ADNc de rata entero (figura 10-1 a 10-5) como sonda marcada.
El homólogo resultante de ADNc bicatenario de 1959 pb de ratón y el resto de aminoácidos codificado se muestran en la figura 13-1 a 13-4 comenzando el sitio de iniciación ATG en la posición de nucleótido 7 indicada con el resto de metionina (M) recuadrado. El codón de terminación, TGA, está recuadrado de manera similar tal como se muestra en la figura 13-4 en las posiciones de nucleótido 1744 a 1746 seguido por la región sin traducir en 3'. Las cadenas superior e inferior de la secuencia de ADNc también se enumeran respectivamente como SEC ID No 39 y 41. La secuencia de aminoácidos codificada se muestra con la cadena superior en SEC ID NO 39 y de nuevo sola en SEC ID NO 40.
3. ADNc de cis-9,10-octadecenoamidasa obtenido a partir de ARNm de hígado humano
Se obtuvo de manera similar un clon de ADNc para el homólogo humano de la cis-9,10-octadecenoamidasa tal como se describió anteriormente para la rata examinando una biblioteca de ADNc positivo extendida en 5' de hígado humano (Clontech) con la excepción de que se usó todo el ADNc de rata preparado anteriormente como sonda marcada y se empleó una hibridación menos rigurosa (formamida al 25% en vez de al 50% en el tampón de hibridación recomendado por el fabricante). Las condiciones de lavado también incluyeron 2X SSC que contenía SDS al 0,1% a 50ºC en vez de 1 X SSC que contenía SDS al 0,1% a 65ºC.
El homólogo resultante de ADNc bicatenario de 2045 pb humano y el resto de aminoácidos codificado se muestran en las figuras 14-1 a 14-5 comenzando el sitio de iniciación ATG en la posición de nucleótido 36 indicada con el resto de metionina (M) recuadrado. El codón de terminación, TGA, está recuadrado de manera similar tal como se muestra en la figura 14-4 en las posiciones de nucleótido 1773 a 1775 seguido por la región no traducida en 3'. Las cadenas superior e inferior de la secuencia de ADNc también se enumeran respectivamente como SEC ID NO 42 y 44. La secuencia de aminoácidos codificada se muestra con la cadena superior en SEC ID NO 42 y de nuevo sola en SEC ID NO 43.
E. Preparación de recombinante expresado de la hidrolasa de amidas de ácidos grasos cis-9,10-octadecenoamidasa
Para preparar proteínas FAAH recombinantes para su uso en esta invención, se clonaron por separado los ADNc de rata, ratón y humano dentro del vector de expresión eucariota pcDNA3 para estudios de expresión transitoria en células COS-7.
Para preparar la proteína recombinante FAAH de rata, ratón y humana, se escindieron los ADNc de FAAH correspondientes de los vectores Bluescript II y se acoplaron por separado dentro del vector de expresión eucariota, pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Se hicieron crecer placas de 100 mm de células COS-7 a 37ºC hasta una confluencia del 70% en medio completo (DMEM con L-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio y suero bovino fetal). Entonces se lavaron las células COS-7 con medio libre de suero y se trataron con 5 ml de disolución de transfección (se preincubaron 5-6 \mug de vector FAAH-pcDNA3 con transfectamina (Gibco-BRL) durante 30 minutos en 1 ml de medio libre de suero, después se diluyeron hasta un volumen final de 5 ml con medio libre de suero). Se incubaron las células COS-7 a 37ºC durante 5 horas, momento en el que se añadieron 10 ml de medio completo a las células y se continuó la incubación a 37ºC durante 12 horas. Entonces eliminó mediante aspiración la disolución de transfección de las células COS-7, y se incubaron las células en un lote reciente de medio completo durante otras 24 horas. Se recogieron las células COS-7 con un raspador de células, se sedimentaron a baja velocidad, se lavaron dos veces con NaHCO_{3} 1 mM y se resuspendieron en 200 \mul de NaHCO_{3} 1 mM. Se sometieron las células COS-7 resuspendidas a homogeneización con Dounce 12 veces y se usaron 20 \mul del extracto celular resultante para someter a ensayo para determinar la actividad oleamida hidrolasa (el ensayo se detalló anteriormente en la sección B6) con los resultados tal como se describen a continuación en la sección F. Se prepararon células COS-7 control de manera idéntica excepto porque el vector pcDNA3 usado para la transfección contenía el ADNc de FAAH en orientación inversa.
Entonces se usan las proteínas FAAH recombinantes expresadas resultantes para rata, ser humano y ratón tal como se describe a continuación para evaluar la especificidad y actividad enzimática.
F. Especificidad de hidrolasa de amidas de ácidos grasos y actividad de las hidrolasas de amidas de ácidos grasos recombinantes expresadas
Tal como se describió anteriormente, se lisaron las células COS-7 transfectadas para generar un extracto celular para cada una de las proteínas FAAH expresadas recombinantes de rata, ratón y humana de esta invención.
Mientras que las células COS-7 no transfectadas contenían cantidades despreciables de actividad oleamida hidrolasa, las células COS-7 transfectadas con el ADNc de FAAH de rata expresaron altos niveles de actividad oleamida hidrolasa (figura 15A). El ensayo se realizó tal como se describe en la sección B en el que se evaluó la conversión de oleamida en ácido oleico mediante CCF. Tal como se muestra en la figura 15A, las células COS-7 transfectadas transitoriamente con ADNc de oleamida hidrolasa de rata en vector de expresión pcDNA 3 mostradas en el carril 3, pero no las células COS-7 no transfectadas (carril 1) ni las células transfectadas control (carril 2, transfectadas con pcDNA3 que contenía el ADNc de oleamida hidrolasa en orientación inversa), fueron eficaces para convertir la oleamida marcada en ácido oleico. Se obtuvieron resultados similares con células COS-7 transfectadas transitoriamente con oleamida hidrolasa humana tal como se muestra en la figura 16 en las que la conversión en ácido oleico sólo se observa en el carril 2 en comparación con las células COS-7 control en el carril 1.
Esta actividad enzimática, como la actividad oleamida hidrolasa de membrana de plasma de hígado de rata, se inhibió mediante trifluorometilcetona tal como se demuestra en la figura 15B, tal como se muestra en el carril 2 de la figura las células COS-7 transfectadas con oleamida hidrolasa de rata en presencia de trifluorometilcetona 50 \muM en comparación con el extracto no tratado en el carril 1.
Para confirmar la especificidad de las proteínas recombinantes expresadas, se realizaron análisis de inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos policlonales anti-FAAH solos o en presencia de péptidos de competición. Se calentaron muestras de extracto celular a partir de células COS-7 transfectadas con FAAH de rata y no transfectadas con cantidades aproximadamente iguales de proteína hasta 65ºC durante 10 minutos en tampón de carga con SDS al 2% y \beta-mercaptoetanol al 5%. Se hicieron pasar las muestras indicadas anteriormente sobre un gel de Tris-glicina en gradiente de poliacrilamida al 8-16%, y se transfirieron a nitrocelulosa para la inmunotransferencia de tipo Western. Se bloqueó la transferencia a nitrocelulosa con Blotto al 5% en TBS-Tween durante la noche a 4ºC, y después se incubó con anticuerpos policlonales generados frente a péptido 2 tal como se describió anteriormente (15 \mug/ml en TBS-Tween) generados frente a una secuencia de péptido FAAH interna durante 2 horas a 25ºC. Entonces se lavó la transferencia en TBS-Tween (0,1%), se incubó con un anticuerpo secundario-peroxidasa del rábano blanco durante 30 minutos a 25ºC, volvió a lavarse TBS-Tween y se reveló con disolución de peróxido estable y luminol/disolución potenciadora (Pierce). Se realizaron experimentos de competición de péptidos preincubando un exceso molar de 1000 veces del antígeno peptídico correspondiente al péptido 2 tal como se describió anteriormente con anticuerpos policlonales durante 30 minutos antes de la adición de anticuerpos a la transferencia.
La inmunotransferencia de tipo Western del extracto de células COS-7 transfectadas con ADNc de rata con anticuerpos policlonales generados frente a la secuencia de péptido 2 interna de FAAH mostró una banda inmunorreactiva de 60-65 kDa que migraba conjuntamente con FAAH aislada por afinidad sobre SDS-PAGE (figura 15C). El extracto de células COS-7 no transfectadas no contenía banda de proteína inmunorreactiva detectable de este tamaño. Adicionalmente, la inmunorreactividad de la proteína 60-65 kDa se eliminaba eficazmente mediante competición mediante preincubación de los anticuerpos con antígeno peptídico en exceso (figura 15C), mientras que este péptido no competía con las cantidades traza de proteína de reacción cruzada observadas en extractos de células COS-7 tanto transfectadas como no transfectadas.
Los trabajos anteriores sugieren que la actividad enzimática que hidroliza la oleamida puede ser la misma actividad que convierte la anandamida (araquidoniletanolamida) en ácido araquidónico. Por tanto, se sometieron a ensayo las células COS-7 transfectadas con el ADNc de FAAH de rata para determinar actividad anandamida hidrolasa. Para evaluar la actividad enzimática de las hidrolasas de amidas de ácidos grasos recombinantes expresadas de esta invención sobre anandamida marcada, se realizó el siguiente ensayo enzimático. Se sintetizó ^{14}C-anandamida tal como sigue: se disolvieron 12,5 \muCi (actividad específica de 50 \muCi/PM) de ácido ^{14}C-araquidónico (Moravek Biochemicals) en 100 \mul de CH_{2}Cl_{2}, se enfriaron hasta 0ºC y se trataron con cloruro de oxalilo en exceso. Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 6 horas, tiempo tras el cual se evaporó el disolvente. Se enfrió el residuo restante hasta 0ºC, se trató con un gran exceso de etanolamina y se agitó a 25ºC durante 15 minutos. Entonces se repartió la mezcla de reacción entre acetato de etilo y HCl 2 M, y se lavó la fase orgánica con agua y después se evaporó hasta la sequedad. Se diluyó la ^{14}C-anandamida resultante con anandamida no marcada hasta una actividad específica final de 5 \muCi/\muM en etanol. Se usaron aproximadamente 1 \muCi de ^{14}C-anandamida y 20 \mul de extracto de células COS-7 sometidas a homogeneización de tipo dounce para cada ensayo de anandamida hidrolasa tal como se detalló anteriormente para los ensayos de oleamida hidrolasa. En resumen, se realizaron ensayos de hidrólisis de FAAH por triplicado con sustrato 100 \muM, 35 \mug de proteína de células COS-7 transfectadas con ADNc de rata durante 5 minutos a 37ºC (excepto en el caso de amida esteárica, en el que debido a la baja solubilidad, se realizó la comparación de sustrato 20 \muM con oleamida). Se separaron los productos sobre CCF tal como se describió anteriormente, se rascaron sobre líquido de centelleo y se cuantificó la radiactividad mediante recuento de centelleo. La hidrólisis de sustrato en presencia de cantidades iguales de extracto de proteína de células COS-7 sin transfectar sirvió como control de fondo en todos los casos y se restó de las velocidades de hidrólisis de FAAH para dar los datos presentados a continuación.
Los resultados de los ensayos de anandamida mostraron que mientras que las células COS-7 no transfectadas contenían cantidades despreciables de actividad anandamida hidrolasa, las células COS-7 transfectadas producían altos niveles de actividad anandamida hidrolasa (figura 17). Por tanto, FAAH tiene la capacidad para hidrolizar tanto oleamida como anandamida, lo que indica que la amidasa puede actuar como enzima degradante general para la familia de amidas de ácidos grasos de moléculas de señalización. La promiscuidad de sustrato de la FAAH recuerda a las enzimas monoamina oxidasa que sirven para oxidar una variedad de neurotransmisores que contienen amina.
Para evaluar adicionalmente el espectro de especificidad de sustrato de la actividad hidrolítica enzimática de las proteínas expresadas recombinantes de esta invención, se sintetizaron otras amidas de ácidos grasos marcadas con ^{14}C tal como se describe en la sección B6 y anteriormente para ^{14}C-oleamida, con la excepción de anandamida tal como se describe.
Los resultados mostraron que aunque la FAAH de rata expresada recombinante cataliza la hidrólisis de oleamida y anandamida a velocidades aproximadamente iguales, la FAAH distingue entre amidas de ácidos grasos, ya que la FAAH hidroliza otras amidas de ácidos grasos representativas, incluyendo amida mirística, amida palmítica y amida esteárica, a velocidades significativamente reducidas en comparación con las observadas con oleamida o anandamida tal como se muestra en la tabla 1 a continuación. Cuando se indica en la tabla se considera que las velocidades de hidrólisis de anandamida y oleamida son el 100% de actividad FAAH con lo que se comparan otras velocidades de hidrólisis de amida de ácido graso.
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TABLA 1
7 
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Se realizan ensayos comparables con los homólogos recombinantes de ratón y humanos de la enzima de rata tal como se usó anteriormente.
Por tanto, tal como se mostró anteriormente, la enzima FAAH de rata no carecía de preferencia de sustrato, si bien es cierto que mostraba actividad frente a varios sustratos de amida. El grado en el que la FAAH mostró selectividad de sustrato se ejemplifica mejor por la diferencia de velocidad de casi veinte veces entre la hidrólisis enzimática de oleamida y amida esteárica, dos compuestos que sólo se diferencian en un único grado de insaturación en la posición \Delta9. También se confirmó este patrón con ensayos con el inhibidor trifluorometilcetona que era un inhibidor veinte veces más fuerte de FAAH que para el análogo de trifluorometilcetona correspondiente de amida esteárica. Por tanto, la FAAH favorece significativamente la cadena de alquilo curvada de la oleamida por encima de la cadena de alquilo lineal de la amida esteárica.
También se preparó un mutante de deleción para generar una forma soluble de las moléculas de FAAH de esta invención. Se creó un constructo en el que el supuesto dominio transmembrana estaba delecionado dando como resultado una FAAH truncada que comenzaba en el residuo de aminoácido 30 de la proteína codificada en vez de en el 1. Para preparar este constructo, se diseñaron los siguientes cebadores para la amplificación mediante PCR del extremo 5' de ADNc de FAAH de rata que carece de los primeros 140 pb que codifican los 30 aminoácidos amino-terminales de FAAH. Los cebadores en 5' y 3' tenían las secuencias de nucleótidos respectivas 5'GCGGTACCATGCGATG
GACCGGGCGC3' (SEC ID NO 45) que codifica los aminoácidos 30-35 y que contiene un sitio KpnI y un codón de terminación artificial y 5'GGTCTGGCCAAAGAGAGG3' (SEC ID NO 46) en la que su complemento inverso codifica los aminoácidos 199-204.
Entonces se digirió el fragmento amplificado de ADNc de FAAH de rata con dominio transmembrana delecionado con las enzimas de restricción apropiadas (KpnI y HindIII) y se clonó dentro del vector FAAH-pBluescript digerido de manera similar sustituyendo el extremo en 5' de ADNc original. Se confirmó el constructo delecionado mediante secuenciación y después se escindió y se transfirió a pcDNA3 para estudios de expresión tal como se describe en el presente documento.
Para la expresión, se separó el extracto de células COS-7 transfectadas en fracciones soluble y de membrana tal como sigue: se centrifugó el extracto a 2500 rpm durante 5 minutos a 25ºC y se transfirió el sobrenadante a un tubo de Airfuge y se centrifugó en una ultracentrífuga (206842,7 Pa (30 psi) durante 40 minutos a 4ºC) para preparar sobrenadante soluble. El sedimento contenía la fracción unida a membrana que se suspendió entonces en un volumen de NaHCO_{3} 1 mM igual al volumen del sobrenadante.
La FAAH recombinante expresada con dominio transmembrana delecionado era funcional en ensayos de expresión en células COS-7 tal como se describió anteriormente. Los homólogos con truncamiento del dominio transmembrana de ratón y humanos del ADNc de rata se prepararon de manera similar y se usaron para poner en práctica esta invención.
Teniendo en cuenta el creciente número de estudios que demuestran actividades biológicas para diversos miembros de la familia de amidas de ácidos grasos de moléculas de señalización, el descubrimiento de una familia de hidrolasas de amidas de ácidos grasos (FAAH) que tiene homología entre rata, ratón y el ser humano tal como se describe en el presente documento proporciona una invención valiosa para estudios en curso dedicados a entender la regulación, el mecanismo y la farmacología del proceso metabólico que inactiva las amidas de ácidos grasos. Además, el gen de FAAH clonado junto con potentes inhibidores de FAAH proporciona la capacidad tanto de dilucidar las rutas fisiológicas afectadas por la familia de amidas de ácidos grasos como de desarrollar enfoques sistemáticos hacia la intervención farmacológica de estos procesos biológicos.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: The Scripps Research Institute
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(B)
CALLE: 10550 North Torrey Pines Road
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(C)
CIUDAD: La Jolla
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(D)
ESTADO: California
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(E)
PAÍS: EE.UU.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 92037
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(G)
TELÉFONO: (619) 784-2937
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: (619) 784-9399
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: HIDROLASA DE AMIDAS DE ÁCIDOS GRASOS
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 54
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(v)
FORMATO LEGIBLE EN ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
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(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25
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(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-NOV-1997
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(vii)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/743,168
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-NOV-1996
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(vii)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/489,535
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-JUN-1995
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 783 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
TIPO DE CADENA: doble
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(D)
TOPOLOGÍA: lineal
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
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(iii)
HIPOTÉTICA: NO
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(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..783
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAATTCGG NGGNGARGGN GC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
500 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
501 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
502 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
503 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
504 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
505 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
506 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
507 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
508 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
509 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
510 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
511 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
512 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
513 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
514 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
515 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
516 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
517 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
518 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
519 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
520 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
521 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
522 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
523 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
524 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
525 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
526 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
527 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGGATCCGG CATNGTRTAR TTRTC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
528 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2472 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 50..1789
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 35:
13
14
15
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 579 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2472 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
529 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1959 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..1746
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
24
25
26
27
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 581 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
29
30
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1959 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2045 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 3..1775
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
34
35
36
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 590 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
39
40
41
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2045 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 44:
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCCTACCAT GCGATGGACC GGGCGC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCTGGCCA AAGAGAGG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 48:
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 819 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
51
52

Claims (19)

1. Hidrolasa de amidas de ácidos grasos (FAAH) aislada que puede hidrolizar cis-9,10-octadecenoamida, anandamida, amida mirística, amida palmítica y ácido esteárico, teniendo dicha FAAH una secuencia de restos de aminoácidos seleccionada de (i) la secuencia de restos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 36; (ii) la secuencia de restos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 40 desde el resto 3 hasta el 581, y (iii) la secuencia de restos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 43 desde el resto 12 hasta el 590.
2. La FAAH según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de restos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 36.
3. La FAAH según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de restos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 40 desde el resto 3 hasta el 581.
4. La FAAH según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de restos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 43 desde el resto 12 hasta el 590.
5. Un procedimiento para catalizar una hidrólisis de una amida primaria de ácido graso que comprende la etapa de poner en contacto in vitro la amida primaria de ácido graso con una FAAH aislada según cualquier reivindicación anterior.
6. El procedimiento para catalizar una hidrólisis de una amida primaria de ácido graso según la reivindicación 5, en el que la amida primaria de ácido graso incluye una cadena de alquilo que tiene una insaturación, en el que la insaturación está en una cadena de alquilo que tiene una configuración cis.
7. El procedimiento para catalizar una hidrólisis de una amida primaria de ácido graso según la reivindicación 5, en el que la amida primaria de ácido graso se selecciona del grupo constituido por cis-9,10-octadecenoamida, cis-9,9-octadecenoamida, cis-11,12-octadecenoamida, cis-13,14-docosenoamida y una amida primaria de ácido graso que tiene la fórmula:
HN_{2}C(O)(CH_{2})_{(6\leq n\leq 11)}CH=CH(CH_{2})_{(8\geq n\geq 5)}CH_{3}.
8. El uso in vitro de una FAAH según la reivindicación 1, para la hidrólisis de anandamida, amida mirística, amida palmítica o amida esteárica.
9. Un procedimiento para inhibir una hidrólisis catalizada enzimáticamente de una amida primaria de ácido graso por la FAAH según la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto in vitro dicha FAAH con un inhibidor de la FAAH.
10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho sustrato de amida primaria de ácido graso se selecciona del grupo constituido por cis-9,10-octadecenoamida, anandamida, amida mirística, amida palmítica y amida esteárica.
11. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha amida primaria de ácido graso es cis-9,10-octadecenoamida.
12. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho inhibidor de FAAH se selecciona del grupo constituido por fluoruro de fenilmetilsulfonilo, HgCl_{2} y una trifluorocetona que tiene la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\vskip1.000000\baselineskip
13. Un procedimiento para determinar la actividad inhibidora de un inhibidor candidato de hidrolasa de amidas de ácidos grasos (FAAH), comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:
etapa A: formar una mezcla "A" combinando FAAH según la reivindicación 1 y un sustrato de amida primaria de ácido graso en condiciones de reacción;
etapa B: formar una mezcla "B" combinando la mezcla "A" de dicha etapa A con el inhibidor candidato, después
etapa C: cuantificar la conversión de dicho sustrato de amida primaria de ácido graso en un producto de hidrólisis en la mezcla "A";
etapa D: cuantificar la conversión de dicho sustrato de amida primaria de ácido graso en producto de hidrólisis en la mezcla "B"; y después
etapa E: determinar la actividad inhibidora del inhibidor candidato comparando las cuantificaciones de dichas etapas C y D.
14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho sustrato de amida primaria de ácido graso se selecciona del grupo constituido por cis-9,10-octadecenoamida, anandamida, amida mirística, amida palmítica y amida esteárica.
15. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína hidrolasa de amidas de ácidos grasos, teniendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID NO 35, SEC ID NO 39 y SEC ID NO 42.
16. Un procedimiento para preparar una FAAH según la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento expresar un vector de expresión de ADN recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica dicha FAAH, y aislar la FAAH expresada.
17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha FAAH se aísla mediante purificación mediante un procedimiento cromatográfico seleccionado de cromatografía de afinidad, cromatografía eléctrica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de reparto.
18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha cromatografía de afinidad emplea un adsorbente en fase sólida derivatizado con un inhibidor de trifluorocetona de FAAH para adsorber la FAAH.
19. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha FAAH se aísla mediante purificación tal como sigue:
etapa A: se purifica una fuente en bruto de FAAH mediante cromatografía de intercambio usando una columna de cromatografía de DEAE para formar un primer producto de elución; después
etapa B: se purifica adicionalmente el primer producto de elución de dicha etapa A mediante elución en una columna de cromatografía de afinidad de Hg para formar un segundo producto de elución; después
etapa C: se purifica adicionalmente el segundo producto de elución de dicha etapa B mediante elución en una columna de cromatografía de afinidad de heparina para formar un tercer producto de elución; y después
etapa D: se purifica adicionalmente el producto de elución de dicha etapa C mediante elución en una columna de cromatografía de afinidad derivatizada con un inhibidor de trifluorocetona de FAAH para formar la forma purificada de FAAH.
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